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20.
Ingo Rechenberg
Zwischen Bionik und Biotechnologie
Wie baut man einen Biosensor ?
PowerPoint-Folien zur 3. Vorlesung Bionik II (Biosensorik / Bioinformatik)
Biotechnologie versus Bionik
Lotus Effekt
Superhydrophob
Cassie-Baxter-Effekt
Biotechnologie
Bionik
versusLotusblatt-Zellkultur
Erkundung des Effekts
Synthetisches Produkt
Biologisches Produkt
Photobiologische Wasserstoffproduktion
Heterocyste
Vegetative ZelleH O2
O 2
H2N 2
Biotechnologie
Bionik
versus
2H
BlaualgeNostoc muscorum
Unter sehr speziellen Bedingungen
2 2
COCH O
22
O H
Veg.-Zellen-Analoga Heterocysten-AnalogaKein Stickstoff!Fehlreaktion.Wasserstoffwird freigesetzt. Kohlendioxid = Container für Wasserstoff
Konstruktion eines
Schallschnelle-Vektormessgeräts
Partikel Geschwindigkeit
Biotechnologie
Bionik
versus
Technische Schaltung
Der bionische Ansatz zur Realisation einer künstlichen Nase
AC
Rezeptor
G-Protein
ATP
ATP
ATPcAMP
cAMP
cAMP cAMP cAMP
cAMP
cAMPAC = Adenylcyclase
cAMP = cyclo-Adenosinmonophosphat
Vorbild Biologie: Verstärkung durch eine Enzymkaskade Duftstoff
Was passiert, wenn ein Duftmolekül auf ein Rezeptormolekül trifft
1. Das Duftmolekül aktiviert den Rezeptor2. Der Rezeptor spaltet ein G-Protein3. Das gespaltene G-Protein aktiviert das Enzym Adenylcyclase (AC)4. Die Adenylcyclase synthetisiert die Botenmoleküle cAMP5. Das cAMP-Molekül dockt an die Ionenkanäle an6. Die Ionenkanäle öffnen sich für Natriumionen7. Der Einstrom von Natriumionen erzeugt ein elektrisches Signal
Was passiert, wenn ein Lichtquant auf ein Rhodopsinmolekül trifft
1. 11-cis Retinal wird in all-trans-Retinal umgewandelt2. Es entsteht Metarhodopsin 3. Metarhodopsin aktiviert Transducin 4. Transducin aktiviert Phosphodiesterase (PDE) 5. PDE spaltet c-GMP in 5'-GMP 6. Dadurch schließen sich Na-Kanäle 7. Es kommt zu einer Hyperpolarisation8. Messbare Spannungsänderung: - 40 mV
3 000
2 000
Molekulare Verstärkung: 6 000 000
Entwurf eines mechanischen Modells für eine Katalysatorkaskade
Ein synthetischer Einmoleküldetektor müsste auf eine Katalysatorkaskade aufbauen !
"Katalyse ist die Beschleunigung eines langsam verlaufenden chemischen Vorgangs durch die Gegenwart eines fremden Stoffes" (1894).
"Ein Katalysator ist jeder Stoff, der, ohne im Endprodukt einer chemischen Reaktion zu erscheinen, ihre Geschwindigkeit verändert. (1901)" Wilhelm Ostwald
Wilhelm Ostwald (1853-1932)
Einmolekülmessung durch Synthese einer Katalysatorkaskade
Rezeptor
Signalmolekül100
10 000
1
Katalysator
Katalysator
Katalysator
ynth e se
S
ynth e se
S
Abstraktes Modell:
„Einen Naturvorgang verstehen heißt, ihn in Mechanik zu übersetzen“
Herrmann von Helmholtz
Entwurf eines mechanischen Modells für eine Katalysatorkaskade
NS
NS
NS
oder
Mechanisches Modell eines Moleküls, das in eine andere Form umgewandelt wird (z. B. Rhodopsin in Metarhodopsin)
NS
NS
Mechanisches Enzym
Wird frei, um ein weiteres Modellmolekül zu verwinkeln
NS
NS
NS
NS
NS
NS
NS
· · ·1000
Soll jetzt einEnzym sein
· · ·1000
1000
1000 000
NS
1000 000
> 1 000
> 1 000 000
1
Schmetterlingsmoleküle
An die Stelle der Mechanik muss die Chemie treten
Bisher konnte (z. B. für ein Sprengstoffmolekül) eine solche Katalysatorkaskade nicht synthetisiert werden
Deshalb wird der biotechnologische Weg beschritten
Das sieht dann so aus:
Extreme Empfindlichkeit
Selektivität auf biologische Stoffe
Was zeichnet den Biosensor aus ?
Extreme Empfindlichkeit
Der geschichtlich erste Biosensor, der die Selektivität auf eine biologisches Substanz nutzte
Der Glukose-Biosensor
Messlösung
Plat
inan
ode
ElektronikImmobilisiertes EnzymMembran Membran
Reaktionsschritte in einem Glukose-Biosensor?
Der Glukose-Biosensor wurde bereits in den 1960er Jahren entwickeltText
Es fehlt in dem Bild die 2. Elektrode
S cha lt-kre is
S ignal- m o lekü le S ignalum form er A nzeigegerä t
S ensor
Schema eines Biosensors
Molekulare oder Nano-Formerkennung
Funktionsprinzip eines Biosensors
AnalytlösungSelektor
(Rezeptor) Effekt Transducer
Elektrode
Thermistor
Piezokristall
Verstärker
ChemischeSubstanz
Temperatur
Licht
Masse
ElektrischesPotenzial
Elek
tri s
ches
Sig
n al
Nan
o-Fo
rmer
kenn
ung
In Biosensoren benutzteImmobilisierungsmethoden
Einbau des Enzyms in eine Polymer-Matrix
Kovalente atomare Bindung des Enzyms
Enzym in semipermeabler Membran-Hülle
Van-der-Waals-Bindung (Adsorption) des Enzyms
Enzym
Technisches Substrat
Enzym-Vernetzung
Kovalent gebundene Atome teilen sich die Orbitale der Valenzelektronen
Magensäure
Kann Eiweiß spalten.Kann noch kein Eiweiß spalten !Pepsinogen: Pepsin:
Theoretische Beispiel für die Konstruktion eines Magensäure-Biosensors mit immobilisiertem Enzym
Beim Pepsinogen steckt der grüne „Proteinschlüssel“ noch nicht im großen Molekülknäuel. Das Enzym ist inaktiv! Bei Anwesenheit von Magensäure wird der grüne Schlüssel eingesteckt und so
das Enzym aufgeschlossen. Pepsinogen wird zum Eiweiß spaltenden Pepsin.
Immobilisiertes
Magensäure
Messung desEiweiß-Spaltprodukts
Eiweißspaltung
PepsinogenPepsin
Theoretische Beispiel für die Konstruktion eines Magensäure-Biosensors mit immobilisiertem Enzym
Funktionsprinzip eines Biosensors
AnalytlösungSelektor
(Rezeptor) Effekt Transducer
Elektrode
Thermistor
Piezokristall
Verstärker
ChemischeSubstanz
Temperatur
Licht
Masse
ElektrischesPotenzial
Elek
tri s
ches
Sig
n al
Nan
o-Fo
rmer
kenn
ung
G lucose O 212
Glucose-oxidase+ G luconolacton + O 2H 2OH 2+ + 7 kcal
Glucono-lactonase
G luconsäure H ++
Kalorimetrie
Am perom etrieLum ineszenz
pH-E lektrodeM OSFET
Sauerstoffe lektrodeLum ineszenz
Mögliche technische Messaufnehmer für einen Glukose-Biosensor
Zum Glukosesensor
Glukose-Sensor heute
Thermodynamik
Mikrogravimetrie Photometrie
Elektrochemie
Transducer
Kalorimetrie
Mechanik Optik
PotenziometrieAmperometrie
KonduktometrieTemperaturmessungWägung
Lumineszenz-, Farb-Messung
Voltammetrie
Potenzialdifferenz bei Strom NullStrom bei konstanter SpannungStrom mit SpannungsänderungWiderstands/ Leitfähigkeitsmessung
Zur Elektrochemie
Volt- und Amperometrie
)(redoxln c
cFzTRU
NERNSTsche Gleichung
Semipermeable Membran A gA g e- e-e-
U = SpannungR = GaskonstanteT = Absolute TemperaturF = Faraday-Konstantez = Anzahl der pro Ion übertragenen Elektronenc = Elektrolytkonzentration
U
NO3
cox = Elektrolytkonzentration auf der Seite des Oxidationsmittels
cred= Elektrolytkonzentration auf der Seite des Reduktionsmittels
Reduktion = Elektronenaufnahme, Oxidation = Elektronenabgabe in der Chemie
Hoch konzentrierte
Silbernitratlösung
Niedrig konzentrierte
Silbernitratlösung
Ag+
Ag+
Zur Elektrochemie
AgNO3 AgNO3
Weitere Beispiele für Biosensoren
Der Knoblauch-Biosensor kann die wertvollen Inhaltsstoffe des Knoblauchs in den verschiede-nen Pflanzen aufspüren.
Foto
: For
schu
ngsz
entru
m J
ülich
Biosensor für Knoblauch
Foto
: For
schu
ngsz
entru
m J
ülich
Biosensor für Zyanid
Für einen erwachsenen Menschen ist die Aufnahme von etwa 50 Milligramm Zyanid tödlich. Der Biosensor spricht bereits auf den Millionstel Teil dieser Menge an.
Das Enzym Cyanidase zerlegt das Zyanid in Amei-sensäure und Ammoniak. Dadurch ändert sich der pH-Wert der Lösung. Diese Veränderung wird von einem Halbleiterchip als elektrische Kapazitätsän-derung registriert.
Querschnitt durch einen Glukosesensor mit Containment
VerkapselungPlatinelektrode
Siliziumchip
Aktive Sensoroberfläche
Elektr. AnschlussEnzym immobilisiertin einer Matrix
SiO2
300 m µ
130 m µDurch eine kleine Öffnung des Containments stehen das Enzym und die Elektrode mit der Messlösung in Kontakt. Moleküle der Messlösung können in die Enzymmatrix hineindiffundieren, welche bei Anwesenheit des Analyten H2O2 erzeugt. Dieses wird an der Platinelektrode elektrochemisch umgesetzt.
Zum Glukosesensor
G ehäuse
Source (Quelle)
G ate (Tor)M em bran
Enzym gem isch
Drain (Senke)Isolator
Spannungsquelle S trom m essgerät
A
pn n
Referenzelektrode
Integration: Biosensor/Feldeffekttransistor (BioFET)
Als elektrische Leitung wird die gerichtete Bewegung von Ladungsträgern in einem elektrischen Feld bezeichnet. Die Leitfähigkeit wird durch die Konzentration und Beweglichkeit der wanderungsfähigen Ladungsträger bestimmt.
Kupfer
Isolatoren Halbleiter Metalle
Kunststoffe
GlasGlimmer
DiamantQuarz
Selen
Germanium
Silizium
10 10 10 10 10 10 10-16 -12 -8 -4 0 4 8
Silber
Eisen
Leitfähigkeit 1m
SiliziumBorPhosphor
p-dotiert
n-dotiert
Fähigkeit der Elektronenleitungund Löcherleitung
im dotierten Halbleiter
n-Dotierung im Siliziumkristallgitter mit Phosphorp-Dotierung im Siliziumkristallgitter mit Aluminium
Ein noch besseres Schema
Beispiel: “Dotierung” des Wassers in einem Schwimmbecken
Zur Menge des Dotierungsstoffs im Halbleiter
n-dotiert p-dotiert
+
SperrschichtDurchlass+
Bewegung der Elektronen Bewegung der LöcherBewegung der Elektronen Bewegung der Löcher
Mit Elektronen und „Löchern“ verarmte SchichtMit Elektronen und „Löchern“
angereicherte SchichtDer Minuspol "presst" Elektronen in die n-Schicht, der Pluspol der Stromquelle saugt Elektronen aus der Sperrschicht ab.
MOSFET
p-dotiert
n n
p
n-dotiert
DrainSourceGate
Der MOS-FET befindet sich im Sperrzustand (deshalb selbstsperrend genannt), wenn keine positive Span-nung zwischen Gate- und Source-Anschluß anliegt.
Metal Oxide Semi Conductor Field Effect Transistor
n n
p
SG
D
p-dotiert
n-dotiert
MOSFET
Wird zwischen Gate und Source eine positive Spannung angelegt entsteht im Substrat ein elektrisches Feld. Die Löcher im p-leitenden Substrat werden vom Gate abgestoßen. Die Zone unterhalb der gelben Isolierschicht wird mit Elektronen als freie Ladungsträger aufgefüllt. Zwischen Source und Drain bildet sich eine n-leitende Brücke. Liegt rechts die positive Spannung an kommt es zu einer Driftbewegung der Elektronen von links nach rechts.
n n
p
S DG
p-dotiert
n-dotiert
CHEMFET BIOFET
Das Gate ist Elektrode einer elektrochemischen Zelle. Ein Produkt der Enzymreaktion sei elektrodenaktiv, und zwar derart, dass sich das Gate gegenüber der Referenzelektrode positiv auflädt. Das Wegdrücken der Löcher baut unter der gelben Isolierschicht wieder ein leitende Brücke auf.
Hier findet eine Enzymreaktion statt
Zur Glucoseoxidase-Gluconolactonase-Reaktion
Signalmolekül
Rezeptor
Membran
Ionen
V Immobilisierte Enzyme
n n
p
S DG
Vergleich
Na+-Tore / BIOFET
Im weitesten Sinn ähneln sich Zellmembran und Halbleiter. Statt Poren in einer Membran zu öffnen werden Poren in einem Halbleiter durchlässig, jeweils gesteuert durch das vom Signalmolekül aktivierte Enzym. Statt mit Ionen arbeitet die Elektrotechnik aber mit Elektronen!
A
A
Bei der klassischen Elektronenröhre verhält sich das Steuergitter
wie die Membran einer Sinnes-zelle, deren Durchlässigkeit enzymatisch kontrolliert wird.
Extreme Empfindlichkeit
Selektivität auf biologische Stoffe
Was zeichnet den heutigen Biosensor aus ?
Extreme Empfindlichkeit
Es fehlt das Kaskadenprinzip !
Kalzium: Ionophore ionenselektive Elektrode
Glukose: Amperometrischer BiosensorHarnstoff: Potentiometrischer Biosensor
Amperometrischer BiosensorLactat:Hepatitis B: Chemolumineszenz Immunoassay
Piezoelektrizität Immunoassay
Candida albicans: Cholesterin: Amperometrischer BiosensorPenicillin:
Ionenselektive Glas-ElektrodeNatrium:Potentiometrischer Biosensor
Kalium: Ionenselektive Austausch-Elektrode
Sauerstoff: Fluoreszenz Quench-SensorpH-Wert: Ionenselektive Glas-Elektrode
Analyt-Detektion in der medizinischen Diagnostik
Zyanid-Biosensor
Formaldehyd-BiosensorEnzym Formaldehyd-Dismutase aus dem Bakterienstamm Pseudomonas putida J3
Anthrax-Biosensor
Harnstoff-BiosensorEnzym Urease
Enzym Cyanidase, zerlegt Zyanid in Ameisensäure und Ammoniak
Enzym ???
Enzyme für Biosensoren
Ende
www.bionik.tu-berlin.de
Das erste Messsystem, das als Biosensor bezeichnet werden kann, wurde 1962 von L.C. CLARK und C. LYONS entwickelt. Es wurde ein Messsystem beschrieben, dass die Bestimmung von Glucose im Blut während und nach Operationen ermöglicht. Dieser Biosensor bestand wahlweise aus einer Sauerstoffelektrode nach CLARK oder einer pH-Elektrode als Transduktor, vor denen zwischen zwei Membranen das Enzym Glucose-Oxidase aufgebracht war. Die Glucosekonzentration konnte als Änderung des pH-Wertes bzw. als Änderung der Sauerstoffkonzentration infolge der Oxidation der Glucose unter katalytischer Wirkung des Enzyms Glucose-Oxidase bestimmt werden.
Messlösung
Elek
trode
ElektronikImmobilisiertes EnzymMembran Membran
Reaktionsschritte in einem Glukose-BiosensorDer Glukose-Biosensor wurde bereits in den 1960er Jahren entwickelt
Messlösung
Elek
trode
ElektronikImmobilisiertes EnzymMembran Membran
Reaktionsschritte in einem Glukose-BiosensorDer Glukose-Biosensor wurde bereits in den 1960er Jahren entwickelt
Glucose O212
Glucose-oxidase+ Gluconolacton+ O2H2OH2+ + 7 kcal
Glucono-lactonase
Gluconsäure H++
MOSFET
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