View
4
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Evolutionäre Verfahren 3 : Yeast Two Hybrid System
Biochemiepraktikum IIWS 2007/2008
15. Januar 20085. Februar 2008
AG Bernd Groner Corina HeinzAstrid Weiß
Protein-Protein Interaktionen
Protein-Protein Interaktionen sind die Basisvon vielen wichtigen zelluläre Prozessenz.B. Signaltransduktion
Apoptose
Langlebige Interaktionen (Zytoskelett)Transiente Interaktionen (Kinasen, Proteasen)
Veränderungen von Protein-Protein-Interaktionen können zu Krankheiten führenz.B. HPV16 Proteine (p53 wird degradiert)
Neue therapeutische AnsätzeInhibitorische Peptide mittels YTH-Systemz.B. gegen Stat3 und Survivin (Überexpressionin vielen Tumoren)
Analyse von Protein-Protein Interaktionen
Identifizierung => Charakterisierung => Manipulation
In vitro Methoden:
(Co-)Immunpräzipitation zwei interagierenden Proteinen im LysatAffinitätschromatographie potentieller Interaktionspartner ist immobilisiertCross-linking chemische Verknüpfung von PartnernProtein-probing markiertes Protein beweist eine BindungPhage-display Suche nach Partner in einer Bibliothek
In vivo Methoden:
Fluorescence energy transfer (FRET)Hefe-Zwei-Hybrid
Reverse-Zwei-Hybrid-SystemHefe-Tribrid-System(Dual-Bait-System)
Yeast-Two-Hybrid : Das Prinzip I
Transkriptionsfaktoren haben eine DNA-Bindedomäne (DBD) und eineTransaktivierungsdomäne (AD), die von einander getrennt werden können.
GAL4- TranskriptionsfaktorGal4-Zielgen
Fields & Song (1989): Die DBD und AD müssen nicht in einem Protein vorliegen,sondern können auch nach indirekter Assoziierung die Transkription aktivieren.
Co-Aktivatoren, HAT, RNA-Pol II
Yeast-Two-Hybrid : Das Prinzip II
Transkriptionsrepressoren haben zwar eine DNA-Bindedomäne (DBD) aber keineTransaktivierungsdomäne (AD). Sie unterdrücken die Transkription.
GAL80 Repressor
Ma & Ptashne (1988): Die AD von GAL4 kann mit der DBD von GAL80 fusioniertwerden. In dem Fall ist GAL80 kein Repressor sondern ein Aktivator. D.h. die ADbestimmt, ob es sich um einen Aktivator oder einen Repressor handelt.
Gal4-Zielgen
GAL4/GAL80- FusionGal4-Zielgen
{–}
AD
BD
{+}
Ade2His3
Gal4 RE
WProtein 1
Gal4 DBD
Wichtig:• S. cerevisiae Stämme fehlern wesentliche Enzyme für die Synthese von den
Aminosäuren Leu, Trp, His und Ade• Grundlage bilden zwei Vektoren, die für das Protein1 und 2 (bilden zusammen
den Gal4-Transkriptionsfaktor)• Transformation ermöglicht Wachstum auf Leu- und Trp-Mangelmedium• Expression der Enzyme für die Synthese von His und Ade steht unter der
Kontrolle der Gal4 response elements (RE)
Yeast-Two-Hybrid : Das Prinzip III
LGal4 ADProtein 2
Selektionsmarker
Yeast-Two-Hybrid : Hefe
Genotyp:
MATa, his3−200, trp1-901, leu2-3,112, ura3-52, gal4, gal80, ade-2,LYS2::(GAL1UAS)-HIS3, LEU2::(GAL2UAS)-ADE2, URA3::(GAL1UAS)-LacZ
MATa oder α (mating type)
His-3: IGP-dehydratase, ist an der Biosynthese von Histidin beteiligt
Ade-2: Phosphoribosylamino-imidazole-carboxylase ist an der Biosynthese vonAdenin beteiligt
Ura-3: Orotidine-5’-phosphat decarboxylase, die an der Biosynthese der Pyrimidinbase Uracil beteiligt ist
LacZ: Kann verwendet werden, um die Interaktion im ß-Gal Test nachzuweisen
DeletionModifikation
Yeast-Two-Hybrid : Arbeitsablauf
Konstruktion vom DBD-Protein1-Vektor: Bait (Köder)
Konstruktion vom AD-Protein2-Vektor: Prey (Beute)
Transformation in Hefe
Selektion von Hefe-Transformanten auf Selektionsmedium
Zurück-Isolation des Protein2-Plasmids
Sequenzierung
Charakterisierung der Interaktion
Yeast-Two-Hybrid : Der DBD-Vektor
Nach der DBD-Protein1-Konstruktion:
1. Transformation in Hefen
2. Überprüfen, ob das Fragment alsFusionsprotein exprimiert wird
3. Sicherstellen, daß das Fragment nichtvon sich aus schon als “Aktivierungs-domäne” fungiert
Hier: Survivin als Protein 1
Yeast-Two-Hybrid : Der DBD-Vektor
Überprüfen, ob das Potein1 als Fusionsprotein mit Gal4-DBD exprimiert wird.
Survivin
α-Tubulin
OD
600
0,46
8
OD
600
0,6
69
OD
600
0,44
5
OD
600
0,6
11
OD
600
0,6
80
Surv Klon1 Surv Klon2
40 kDa
50 kDa
Erfolgreiche Expression desKöderproteins in den Hefen
Expression von Gal4-DBD-cMyc-Survivin im Hefestamm AH 109 S. cerevisiae
NK
Expressionsplasmid: DBD-Protein1mit c-Myc epitope tag (pGBKT7)
Yeast-Two-Hybrid : Der DBD-Vektor
A lag-PhaseB BeschleunigungsphaseC exponentielles Wachstum (log)D limitiertes WachstumE stationäre Phase
Yeast-Two-Hybrid : Der DBD-Vektor
Sicherstellen, daß das DBD-Fragment nicht von sich aus schon als AD fungiert.
1 DD BIR
6 10 89 102
coiled coil 143DD
Bir1
Bir2
Birc
SCC
Surv
Gal4-DBD +
-Trp -Trp/-His
0 10x 100x 1000xVerdünnungen
0 10x 100x 1000xVerdünnungen
pGBK_Gal4 DBD Survivin
Gal4-Zielgen
His?
DBD-Vektor: TrpAD-Vektor: LeuInteraktion: Trp, Leu, His
Yeast-Two-Hybrid : Die AD-Vektoren (Beute)
Prey: 1. Ein zweites bekanntes Protein, oder ein Fragment dieses Proteins
2. cDNA Bank
3. Peptid Bank integriert in einem Gerüstprotein
Gal4-AD cDNA
Gal4-AD Protein2
Gal4-AD Peptid Gerüst
Subdomäne
Alle Vektoren haben einen ADH1 Promoter: hohe Expression in der frühen Log-Phase.
*
Yeast-Two-Hybrid : Transformation
Doppeltes Mangelmedium
Interaktion: dreifaches Mangelmedium
Yeast-Two-Hybrid : Kommerzielle Vektoren
TAF
Yeast-Two-Hybrid : Reporter I
Interaktionsstärke:
His-3
Ade-2
GAL1-4xUAS GAL1-TATA
GAL2-2xUAS GAL2-TATA
schwach
stark
TFTF
TAF
TFTF
Hefegene: TATA-Box (transkriptionellen Startpunkt)Upstream Activating Sequences (cis-Elemente)
Deletionen: endogene Gene für GAL4, GAL80, LEU2, TRP1, HIS3, ADE2
Promotor
Yeast-Two-Hybrid : Reporter II
LacZ oder Mel1GAL2-UAS GAL2-TATA
TAF
TFTF
Gal-Assays
Aus Flüssigkulturen
Auf Platte
Methode
Zellen lysieren
Zellen lysieren
Medium abnehmen
Kolonien auf Filter-Papier transferrierenund lysieren
Hefe umstreichen
Substrat
Zugabe von ONPG
Zugabe von CPRG
Zugabe von PNP-αGal
Filter auf X-Gal
X-α-Gal in Platte
Produkt
o-Nitrophenol (gelb)
Chlorophenolrot
p-Nitrophenol
Blaues Präzipitat
Blaues Präzipitat
Detektion
Photometer (420 nm)
Photometer (578 nm)
Photometer (410 nm)
Blaue Kolonien
Blaue Kolonien
ß-Galactosidase
oder
α-Galactosidase
Substrat
Farbe
cDNA for protein (bait) to be testedfor ability to interact with otherproteins is fused to DBD
DBDGal4 gene Bait
Bait
Bait
DBD Express thelibrary of hybridcDNAs in cells
Activation domainfused to manycDNAs
Test for the ability to activateexpression of LacZ
DBDGal1 lacZ
Gal1 lacZ
Gal1 lacZ
Übersicht : cDNA-screen
Plasmid-Rescue
Gesamt DNA Isolation
Transformation in E. coli
Bait Vektor:AmpR
Prey-Vektor:KanR
LB-Kan
HefeGal1 His3
LB-Amp
Nachprüfung der Interaktion : Mating-Assay
Mat a Mat α
Umstreichen
Variationen : Reverse-Yeast-Two-Hybrid System
AD
AD
His-3
His-3TetR
TetR
LexA operator
LexA operator
Tet operator
Tet operator
Zur Identifizierung von Molekülen/Proteinen/Mutationen, die eine Interaktion stören
Variationen : Reverse-Yeast-Two-Hybrid System
AD
DB
AD
DB
Ura-3
Ura-3
LexA operator
LexA operator
+ FOA (Fluoroorotsäure)
Fluoro-Uracil = Death
+ FOA
= Life
Zur Identifizierung von Molekülen/Proteinen/Mutationen, die eine Interaktion stören
Fluoro-Uracil: Antimetabolit, wird statt Uracil in RNA eingebaut (Cytosin / Thymin in DNA)
Übersicht : Systeme und cDNA-Banken
Erfinder
S.FieldsS. ElledgeClontech
R. Brent
S. Hollenberg
GibcoBRL
E. Golemis
R. Brent
System
Two-HybridImproved Two HybridMatchmaker
Interaction Trap
Modified Two-Hybrid
ProQuest
Dual Bait
Two Bait
DBD - AD
Gal4
LexA - B42
LexA - VP16
Gal4
LexA - B42cI - B42
LexA - B42TetR - B42
Selektion
His3, LacZHis3, Ade2, LacZHis3, Ade2, LacZ
Leu2, LacZ
His3, LacZ
His3, Ura3, LacZ
Leu2, LacZLys2, GusA
Leu2Ura3
cDNA-Bank
>51
>105
18
>105
>105
Vorteile des Hefe-Zwei-Hybrid Systems
1. In vivo
2. Es ist relativ einfach hiermit anzufangen und benötigt nicht viel Aufwand. Fürbiochemische Methoden wird oft aufgereinigtes Protein in sehr gute Qualitätbenötigt. Hier wird höchstens cDNA benötigt.
3. Hiermit können auch die schwachen Interaktionen noch detektiert werden,da mehrfache Promoterelemente vor dem Reportergen geschaltet sind, waszur Amplifikation des Signals führt.
4. Es können ganz einfache semi-quantitative Tests durchgeführt werden, umdie Affinität interpretieren zu können.
5. Nach dem Screen kann sofort die DNA des Interaktionspartners isoliertwerden.
Zu beachten : Potentielle Nachteile
1. Das Target-Protein darf keine eigene Aktivierungsdomäne besitzen.2. Die Konformation des Target-Proteins kann im Fusionsprotein geändert sein.
Wird nur eine Domäne verwendet, soll unbedingt die Bindung am gesamtenProtein untersucht werden.
3. Wird nur eine bestimmte Domänen des Target-Proteins an die DBD fusioniert(weil das Target zu groß ist oder weil es sich um ein Membranprotein handelt)dann soll beachtet werden, dass so normal nicht zugängliche Bindungsstellenvielleicht jetzt an der Oberfläche liegen.
4. Ein Protein, wovon bekannt ist, dass es das Target-Protein bindet, sollte alsPositiv-Kontrolle verwendet werden (bei Interaktion ist die Faltung der Domänekorrekt).
5. Manche post-translationale Modifikationen finden nicht statt.6. Die Fusionsproteine müssen in den Kern gelangen. Sind stärkere
Translokationssignale im Fusionsprotein vorhanden (z.B. Sekretion)?7. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass ein drittes Protein für die
Interaktion benötigt wird.8. Hefe wird als Wirt benutzt.
Nachteil: Ist die Faltung korrekt und das Protein in Hefen stabil?Vorteil: Gleicht mehr der Situation in höheren Eukaryoten als bei in vitro
Experimenten oder Systemen mit Bakterien als Wirt
Vielen Dank für Eure Aufmerksamkeit !
Recommended