Chemische Proteinmodifikation - Im Wettbewerb mit der Natur · 10-1 µm 100-10 nm Protein-only...

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Universität Wien Fakultät Chemie

Institut für Biologische Chemie

Prof. Dr. Christian Becker Währinger Str. 38

1090 Wien, Austria

http://biologischechemie.univie.ac.at

Biological Chemistry

Chemische Proteinmodifikation - Im Wettbewerb mit der Natur

Biological Chemistry 2

- Was sind Proteine?

- Ribosomale Proteinsynthese

- Spezifische Modifikationen & Ihre Herausforderungen

- Chemische Proteinsynthese (Historische & Aktuelle Möglichkeiten)

- Beispielsysteme

Inhalt

Biological Chemistry 3

Was sind Proteine?

Proteine = Eiweiße Makromoleküle, die linear aus Aminosäuren aufgebaut werden und unterschiedlich lang sein können (von 2 bis zu 30.000 Aminosäuren). Sehr viele Kombinationsmöglichkeiten: Kettenlänge von 100 Aminosäuren = 20100 (= 10130) Verknüpfungsmöglichkeiten

Biological Chemistry 4

- Enzyme katalysieren praktisch alle chemische Reaktionen - Hormone dienen als Signalstoffe - Rezeptoren leiten Signale in das Zellinnere weiter - Ionenkanäle leiten Ionen durch biologische Membranen,

- Transporter befördern ihr Substrat über die Membran,

- Hämoglobin transportiert Sauerstoff - Antikörper binden an Fremdstoffe - Gerüstproteine des Zytoskeletts sorgen für Form und Organisation der Zelle - Faserproteine verleihen Festigkeit - Histone verpacken die DNA - DNA- und (z.B. Polymerase, Transkriptionsfaktoren) RNA-bindende Proteine vermitteln die Replikation des Erbguts und die Expression von Genen

Funktionen von Proteinen

Biological Chemistry 5

Ribosomale Proteinsynthese

1. Transkription – Umschreiben

der DNA in mRNA durch RNA

Polymerase

2. Translation – Übersetzen der

mRNA in ein Poylpeptid mit Hilfe

der Ribosomen

(ca. 15 AS/s in Bakterien, aber nur

ca. 2 AS/s in Eukaryonten)

3. Einführung von posttranslationalen

Modifikationen, wie Glykosylierung,

Lipidierung, Acetylierung etc.

Biological Chemistry 6

Crystal Structure of Dihydrofolate Reductase-Thymidylate Synthase

from Cryptosporidium hominis

Rap-RBD complex Nassar et al. (1995) Nature 375, 554-560.

Modeled structure of ternary REP-1: RabGGTase:Rab7 complex

Proteinbiosynthese

- Proteine beliebiger Größe mit höchster Präzision - Korrekte Faltung - Menge pro Zelle variiert stark

Protein Chemistry 7

Posttranslationale Modifikationen in Proteinen

Becker, BioSpektrum 3/2011, 291-291.

Biological Chemistry 8

Warum chemische Proteinmodifikation & Synthese?

- Einführen komplexer Modifikationen / Zugang zu homogenen Proteinpräparationen

- Direkter Zugang zu Proteinen für biophysikalische und strukturelle Untersuchungen

- Freie Variation der Polypeptidkette / Proteine mit neuen Eigenschaften

- Ortspezifische Markierung von Proteinen / Active Site Modifikationen

- Entwicklung von Medikamenten auf Peptid- und Proteinbasis

- Verknüpfung von Proteinen mit anderen (Bio-) Polymeren

Biological Chemistry 9

Recombinante Expression

Chemische Synthese

Chemische Synthese - Synthese von Bausteinen - Automatische Peptidsynthese - Bioaktive Peptide

Recombinante Expression - Molekularbiologie - Proteinreinugung - Selektive Modifikation

Funktionale Proteine

Analyse Massenspektrometrie

in vitro Analyse (CD, Fluoreszenz, Lichtstreuung, Kalorimetrie)

Zell-basierte Assays

Biological Chemistry 10

Festphasensynthese von Peptiden (SPPS) - Peptide mit bis zu ~100 Aminosäuren

- Chemische Synthese vom C- zum N-Terminus

Linker O NH2

O

R1HO

HN Boc

O

R2

Kopplungs-reagenz

Linker OHN

O

R1

NH

Boc

O

R2

Reinigung,Waschen & Filtrieren

Linker OHN

O

R1

NH2O

R2Entfernender Boc-Gruppe

HOHN Boc

O

R3

Linker OHN

O

R1

NHO

R2 HN Boc

O

R3

Wiederholen

Abspaltung +Seitenkettenentschützung

Aufreinigung

Reinigung,Waschen & Filtrieren

Kopplungs-reagenz

Reinigung,Waschen & Filtrieren

Entfernender Boc-Gruppe

Biological Chemistry 11

Flüssigkeiten

Stickstoff

Vakuum

Flüssigkeiten

Durchführung der Festphasensynthese

Manuell Automatisch

Biological Chemistry 12

Reaktionseffizienz und Ausbeute

Ausbeuten pro Kopplungsschritt: 99%

Gesamtausbeute für ein Peptid aus 50 Aminosäuren: 61%

Gesamtausbeute für ein Peptid aus 100 Aminosäuren: 37%

Ausbeuten pro Kopplungsschritt: 98%

Gesamtausbeute für ein Peptid aus 50 Aminosäuren: 37%

Gesamtausbeute für ein Peptid aus 100 Aminosäuren: 13,5%

Typische Ausbeute bei modernen Kopplungsmethoden: >99,9%

Biological Chemistry 13

Größenlimitierung der Peptidsynthese

Kent, S. B. H.; Dawson, P. Annu. Rev. Biochem 2000, 69: 925-962.

Durchschnittliche Größe von Proteinen

Proteindomänen

Prot

eing

röße

Chemische Ligation

Biological Chemistry 14

My entire yearning is directed towards the first synthetic enzyme.

(Letter to Adolf v. Baeyer, 1905)

Wie es begann?

Emil Fischer (1852-1919) Nobel Prize in Chemistry 1902

H-CYIQNCPLG-NH2

Synthesis of Oxytocin

Vincent du Vigneaud (1901-1978) Nobel Prize in Chemistry 1955

1905

1953

Biological Chemistry 15

First Chemical Protein Synthesis

Synthesis of Insulin (51 aa) in 1963

Helmut Zahn (1916-2004) Panayotis Katsoyannis

Meienhofer et al., Zeitschrift für Naturforschung, 18b,1963.

Wie es begann?

1963

Biological Chemistry 16

The first synthetic enzyme:

Ribonuclease A (124 aa)

Gutte & Merrifield, JBC, 246, 1922-1941, 1971.

Bruce Merrifield (1921-2006) Nobel Prize in Chemistry 1984

Ralph Hirschmann (1922-2009)

Wie es begann?

1971

Biological Chemistry 17 Schneider & Kent, Cell 1988, 54, 363-368.

Synthetische HIV Protease (99 AS)

Steve Kent

1988

Biological Chemistry 18

Green Fluorescent Protein (GFP, 238 AS)

Nichiuchi et al. (1998) PNAS, 95:13549

Shumpei Sakakibara

1998

Biological Chemistry 19

Größenlimitierung der chemischen Proteinsynthese

- Ligationsreaktionen nicht beliebig oft nacheinander anwendbar

- Problematische Aufreinigung

- Ausbeuteverluste

- Synthese wird „unrentabel“

- Bisher keine Synthese von nicht-repeptitiven Proteinen > 250 Aminosäuren

Lösung:

Kombination von chemischer Protein- / Peptidsynthese

mit Biosynthese von Proteinen (z.B. in E. coli).

Biological Chemistry 20

Eigene Beispielsysteme

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Transmissible spongiform encephalopathies (TSE) are fatal neurodegenerative diseases Prion diseases are exceptional: Spontaneous, hereditary and transmissible forms are recognized

Size

Bacteria Virus

10-1 µm 100-10 nm

Protein-only hypotheses: Resistant to nucleic acid inactivation Sensitive to protein modifying procedures

⇒ Proteinaceous infectious particles (prion); 1982 Prusiner

Prion

Übetragbare Spongiforme Enzephalopathien (TSE)

Biological Chemistry

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Prozessierung von PrPC und Umwandlung in PrPSc

Tatzelt & Winklhofer, Amyloid-Journal of Protein Folding Disorders (2004) 11, 16212 Biological Chemistry

Protein Chemistry 23

Semisynthetischer Ansatz für membrangebundenes PrPc

octarepeats PrP90-231 ER

signal GPI

signal N181 N197

Glycan Glycan

S S

C179 C214 GPI anchor

+ lipid

anchor

Semisynthesis

recombinant PrP

PrP90-231 N181 N197

S S

C179 C214

lipid anchor PrP90-231 N181 N197

S S

C179 C214

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Aggregation von lipidiertem PrP

Proteinase K digestion

AFM

Thioflavin T Assay

+ liposomes - liposomes

Membrane-associated rPrPPalm shows an extended lag-phase.

Biological Chemistry

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Zusammenfassung

- Lipidiertes Prion Protein durch Kombination chemischer & molekularbiologischer Methoden

Homogen hergestellt werden.

- Dieses Prion Protein ermöglicht die Untersuchung der membranabhängigen Umwandlung in

eine toxische Variante des Proteins

- Komplexe Strukturen wie GPI-Anker können so in Proteine eingebracht werden und helfen

Krankheitsprozesse zu verstehen

- Nächste Schritte: In vivo Untersuchungen

Biological Chemistry

Silaffin-induzierte Biomineralisation von Kieselsäure

M. Sumper, E. Brunner, ChemBioChem 2008, 9, 1187-1194.

diatoms are unicellular algae

highly elaborate, nanopatternd cell walls

consisting mainly of hydrated SiO2

long chain polyamines and silaffin peptides

have been identified as constituents of

biosilica and to be involved in the silica

deposition process

Biological Chemistry 26

Natürliche posttranslationale Modifikationen von Silaffinen

H2N NH

HN N

H

HN N

H

HN N

H

HN N

H

HN N

H

HN N

H

HN

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

N

HO

O

NO

POHO

O

P

OHO O

O

P

OHO O

O

P

OHO O

O

P

OHO O

O

P

OHO O

O

POHO

OCH3H3C CH3H3C

CH3

HO

n = 4-9

N

NH

HN

CH3

NH3C CH3n = 4-9

N

NH

HN

CH3

NH3C CH3

OH

Chemical Structure of natSil-1A1

N. Kröger, S. Lorenz, E. Brunner, M. Sumper, Science 2002, 298, 584-586.

ε-N,N-dimethyllysine ε-N,N,N-trimethyl-δ-hydroxylysine

phosphoserine

Polyamine modified lysine (6-11 N-methylpropyleneimine units)

Biological Chemistry 27

Zusammenfassung

Synthese unterschiedlich modifizierter Silaffin-Peptide

Proof of Principle:

eGFP Verknüpfung mit Silaffin führt zur selektiven Verkapselung von GFP in Silikatmatrix

Immobilisierung biotechnologisch interessanter Proteine

Einfluß der Silaffin-Modifikationen auf die Silikat-Abscheidung

Biological Chemistry 28

Biological Chemistry 29

Alex Kravchuk

Claudia Bello

Carolin Lechner

Firouzeh Aladini

Manuel Brehs

Nam Ky Chu

Karine Farbiarz

Can Araman

Former Group Members:

Diana Olschewski Sunanda Lahiri

…

Collaborations

Financial Support CIPSM

DFG

Wacker Chemie

BMBF

Johannes Buchner (TU München)

Tilo Schwientek (Uni Köln)

Roger Goody (MPI Dortmund)

Martin Engelhard (MPI Dortmund)

Jörg Tatzelt (LMU München)

Peter Seeberger (MPI Golm)

Uni Wien

Danksagung