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Der Western-Blot zum immunologischer Nachweis von
Proteinen
von Tim Grotjohann
VeranstalterLehrstuhl für GenetikUniversität Bielefeld
Inhaltsübersicht:
-Allgemeines zum Protein-Blot
-Wichtiges zur Proteinaufreinigung und Gelelektrophorese
-Blottingmembranen
-Gel-Blot
1) Wet-Blot
2) Semi-Dry-Blot
3) Transferpuffer
-Dot-Blot
-Färbeverfahren für transferierte Proteine
Allgemeines zum Protein-Blot
-Definition: beim Protein-Bloting werden Proteine auf eine Membran übertragen und dort einer spezifischen Nachweisreaktion unterzogen
-DOT-Blot: Proteine werden direkt auf die Membran getüpfelt
-Gel-Blot: Übertragung von Proteinen, die zuvor in einem Gel elektrophoretisch aufgetrennt wurden
-die Membran: sie dient als Trägermatrix für die Proteine, auf der diese immobilisiert sind und sich somit leichter handhaben lassen
-Western-/Immuno-Blotting: mittels einer spezifischen Antikörperreaktion lassen sich hiermit bestimmte Proteine identifizieren, die Molmassen dieser bestimmen oder auch die Spezifität eines Antikörpers bestimmen
-es gibt noch weitere Verfahren, bei denen die Fähigkeit von Proteine ausgenutzt wird, an andere Moleküle zu binden (North-Western-Blotting, South-Western-Blotting, Virus-Overlay,…)
Wichtiges zur Proteinaufreinigung und Gelelektrophorese
-Proteinaufreinigung: durch Degradierung von Proteinen können weitere Banden auf dem Gel entstehen – so kann es beim Kochen der Probe in SDS- und alkanolaminhaltigem Probenauftragspuffer zur Fragmentierung von Proteinen kommen deswegen wird eine Erhitzung auf lediglich 60°C für ca. 10-30 Minuten empfohlen
-Gelelektrophorese: Je dünner das Gel, desto effizienter ist der Transfer – deshalb sollten Gele eine Dicke von 2mm möglichst nicht überschreiten
Blottingmembranen
-Nylon:
-hohe Proteinbindekapazität
-besonders für das Blotten von sauren Proteinen oder bei Chemoluminiszenznachweisen
-benötigt spezielle Blockingreagenzien (Casein und Polyvinylpyrrolidon)
-Polyvinylidenfluorid (PVDF):
-hohe Proteinbindekapazität (bis 600µg/cm²)
-gute Resistenz gegen organische Lösungsmittel
-gutes Signal/Hintergrund-Verhältnis bei Chemolumineszenz-Detektionssystemen
Blottingmembranen
-Nitrocellulose (NC):
-Bindekapazität von 180µg/cm²
-kleine Porengröße von 0,025µm
-günstiger als PVDF
-beim Dot-Blot vorwiegend verwendet, da diese Membran eine hohe Saugfähigkeit hat
Gel-Blot
-Der Transfer muss direkt nach der Auftrennung der Proteine erfolgen
-Transfer-Methoden:
-Diffusions- und Vakuumtransfer finden eher bei der Arbeit mit nativen Gelen ihre Verwendung
-Als Standardverfahren hat sich der elektrophoretische Transfer durchgesetzt
im Folgenden werden exemplarisch die elektrophoretischen Verfahren „Wet-Blot“ uns „Semi-Dry-Blot“ vorgestellt
Gel-Blot
Wet-/Tank-Blot Semi-Dry-Blot
-Vorteile des Semi-Dry-Blots sind die höhere Transfergeschwindigkeit und die sehr viel geringere Menge an verwendetem Transferpuffer
-Der Wet-Blot hingegen ist schonender durch bessere Kühlmechanismen
3) Transferpuffer
-grundsätzlich gibt es mehrere Alternativen
-Er darf keine stark leitenden Salze enthalten, da diese zu hohen Strömen führen, was einen schlechten Transfer und eine Überhitzung der Apparatur zur Folge hat
-der Puffer muss keinen exakten pH-Wert aufweisen (alle Werte zwischen 7,3 und 11 sind akzeptabel)
-Er enthält 0- 20% Methanol, welches die Membran benetzt und so die Proteinbindung erleichtert, sowie die SDS-Bindungen lockert
Dot-Blot
-Hierbei wird auf die gelelektrophoretische Trennung verzichtet und die Proteine direkt auf die Membran getüpfelt
-Hauptanwendungsgebiete:-immunchemische Quantifizierung kleinster Proteinmengen-Detektion bestimmter Proteine aus einem Proteingemisch-Bestimmung von Nachweisgrenzen von Detektionssystemen-bei Verwendung von Proteinen mit sehr hoher/kleiner
Molmasse, oder solchen, die durch die Elektrophorese beschädigt würden, oder durch ihre hohe Ionenstärke die Trennung stören würden
-nur dann anwendbar, wenn monoklonale Antikörper oder Proben mit nur einem Protein verwendet werden
Färbeverfahren für transferierte Proteine
Die Effizienz eines Blotvorgangs lässt sich mit unspezifischen Proteinfärbemethoden bestimmen:
-Ponceau-S-Färbung:
-geeignet für NC und PVDF
-Nachweisgrenze bei 5-15ng Protein/mm²
-kolloidales Gold:
-geeignet für NC und PVDF
-Nachweisgrenze bei 0,25-1ng Protein/mm²
-benötigt abgesättigte Membran
-neigt zu irreversiblen Bindungen
-Fluorophore:
-geeignet für NC und PVDF
-Nachweisgrenze bei 0,25-1ng Protein/mm²
-benötigt aufwändige optische Ausrüstung
-Direktblau 71:
-geeignet für NC und PVDF
-Nachweisgrenze bei 0,5-1,5ng Protein/mm² (NC)
bzw. 1-3ng Protein/mm² (PVDF)
-hohe Kontrast
Färbeverfahren für transferierte Proteine
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