Eine enzymatische Mikromethode zur Bestimmung von Acetat in biologischen Medien

4. Auf Physiologie und P~thologie bezfigliche 57

der zuvor mi t 20 ml Wasser und 5 ml 25~ Sehwefelsgure versetzt wurde, destilliert man das Aceton in einen 10 ml-MeBkolben, der 1 ml Wasser enth~lt . Der DestilliervorstoB (enges Glasrohr, Skizze im Original) mul~ in das Wasser tauchen. Man destilliert, bis der Kolben zur ~ a r k e geffillt ist. 1 ml des Destillats versetzt man mi t 1 ml salzsaurer 2,4-DinitrophenylhydrazinlSsung (50 mg 2,4- Dini t rophenylhydrazin werden in einem 50 ml-MeBkolben mi t 30 ml carbonyl- freiem Methanol suspendiert, mi t 0,2 ml 38~ Salzs~ure versetzt und mi t Me- thanol auf 50 ml aufgefiillt). Man setzt die Probe ~ Std lung in ein Wasserbad yon 20 ~ C, gibt dann 5 ml methanolische Kalilauge (10 g K O H in carbonylfreiem Methanol zu 100 ml gel5st) hinzu und miBt nach 5- -10 rain die Ext ink t ion bei 550 m# gegen eine gleichartig behandel te Blindprobe. - - Berechnung. 1 , 7 2 - E / d = mg-~ Aceton (d = Schichtdicke). - - Zur Bestimmung yon Aceton]c6rpern in Blur hamolysiert man 5 ml Oxalatblut mi t 30 ml Wasser, enteiwei~t mi t 5 ml 10~ Natr iumwolframatl5sung und 5 ml 0,667 n Schwefels~ure und zentrifugiert naeh 15 min. Zu 25 ml vom klaren Fi l t ra t gibt man 10 ml Dichromat-Schwefels~ure und 15 ml Wasser, destilliert und ver fahr t welter wie oben. - - Berechnung. 17,7 �9 E /d = rag-% Aceton. H. SPECKEI~

Fiir die Bestimmung der organisehen S/iuren im Urin geben R. NOgD~_~N]~, O. GAUCt~ERY, J.-P. PC RUmSE~U, Y. TttOI~iAS und J. NORDMA~N ~ ein papier- chromatographisches Verfahren an. St5rende Substanzen werden zun~chst auf einer Anionenaustausehers~ule (0,8 cm Durchmesser, 10 cm HShe) entfernt. Sie wird mi t Dowex 2 von 0,17--0,25 mm Teilchengr51~e besehiCkt und mi t 100 ml m Natr iumformia t und 500 ml Wasser in die Formiatform fibergefiihrt. Man gibt 5 ml Harn auf die S~ule, l~[~t 50 ml Wasser (1 ml/min) naehlaufen, en t fern t das Fi] t ra t und eluiert dann mi t 6 n Ameisens~ure. Die organischen Si~uren mit Aus- nahme eines Teiles der Aconits~ure, ferner die Sulfate und Phosphate (aber nicht die Chloride), sind in den ersten 50 ml enthal ten. Nach jedem Gebrauch wird die Si~ule durch 5 ml 3 m FormiatlSsung, 100 ml Wasser und 50 ml Ameisens~ure regeneriert. Das Eluat , welches einer im Harn ausgesehiedenen Menge yon 2,00 mg Kreat in in entspricht, wird bei 100 ~ C eingedampft, der Riickstand wird in soviel Wasser gel5st, dab 100/~1 2 mg Kreat in in entspreehen. Diese 100/~1 werden auf W h a t m a m P a p i e r Nr. 1 (40 • 40 cm) bei 24 ~ C zweidimensional aufsteigend chro- matographiert . Die LSsungsmittel sind: A) ~ thano l - - Ammoniak (20 ~ B6) - - Wasser (80:5:15), ; B) P r o p a n o l - E u c a l y p t o l - Ameisenss (50:50:20) mi t etwas Wasser, um Triibungen zu entfernen. Die S~ureflecken werden mit Brom- kresolgrtin s ichtbar gemacht. Es gelang, die Rf-Werte yon 78 verschiedenen Sguren zu best immen (Beschreibung an anderer Stelle). Unte r den Flecken, die im Harn-Chromatogramm erscheinen, sind 4 unbekannte Stturen, yon denen die eine mi t diazotiertem Nitranil in wie p-Oxybenzoesgure reagiert. Im fibrigen werden nachgewiesen: Aconit-, ~-Ketoglutar-, Citronen-, Glutar-, Glykol-, Hippur-, fi-Oxy- butter-, Milch-, ~p/el-, Bernstei~- und Weinsgure. Milch- und /3-Oxybutters~ure lassen sich nicht genau voneinander t rennen. X. HnNSBERG

Eine enzymatische Mikromethode zur Bestimmung yon Aeetat in biologisehen ~edien entwiekette R. W. vo~ KORFF 2. Die Methode beruht darauf, dal~ das in Herzmuskelmitoehondrien vorhandene, aeetatakt ivierende Enzym in Gegenwart anderer Fermente aussehlie~lieh Acetat und Propionat in die entsprechende Acyl- Coenzym A (-CoA)-Verbindung iiberfiihrt, w/ihrend unter gleiehen Umst/~nden •ormiat, Butyra t , Acetoaeetat und Fluorace ta t n icht reagieren. Da andererseits

1 C. R. Acad. Sei. (Paris) 238, 2459--2461 (1954). J. biol. Chemistry 210, 539--544 (1954). Univ. Minneapolis, Minn. (USA).

58 Bericht: Spezielle analytisehe Methoden

Propyl-CoA in diesem System nicht befiihigt ist, mit 0xalacetat unter Bildung yon Citrat zu reagieren, ist die Reaktion spezifisch ftir Acetat, wenn durch vorher- gehende Destillation des Analysenmaterials Brenztraubens~ure und Na-Ionen, die stSrend wirken, ausgeschaltet werden. Das dureh Einwirkung yon Aeetyl-CoA auf Oxalacetat entstandene Citrat wird dureh Messung seiner optischen Diehte bei 340 mtt ermittelt, indem diese mit der aus L5sungen bekannten Acetatgehaltes entstandenen Reaktionsprodukte verglichen werden. Die Erfassungsgrenze fiir Acetat betr/~gt 3 ~g. Das Original enthMt ausftihrliehe experimentelle Angaben. K. S O L I ~

0be r die eharakterisierung yon Guanidinderivaten biologisehen Ursprungs dureh Elektrophorese und Chromatographie auf Papier beriehten S. LISSlTZKY, I. GAlCCIA und J . ROCHEL Die Arbeitsweise ist ~hnlich der yon J. BLASS, M. )/[AC~E- ~OEIJF und P. REBEYROTTE 2, die bei Aminen eine Elektrophorese an die Stelle der Chromatographie in zweiter Dimension setzen, da dies weniger Zeit erfordert. - - Zun~chst wird in fiblieher Weise so lange auf 30 • 30 cm-Papierbogen (Arches 302) bei 15 ~ C mit n-Butanol-Eisessig-Wasser (73:10:17) oder mit Pyridin-Isopentanol- Eisessig-Wasser (80:40:10:40) ehromatographiert, bis die LSsungsmittelfront 20 em gewandert ist (6 Std). Naeh dem Troeknen an warmer, bewegter Luft wird senkreeht zur Chromatographierriehtung nach Anfeuehten mit VeronalpufferlSsung (pH 8,6, Ionenst~irke 0,1) nach der Methode yon W. GlCASSM~N, K. HAI~NIG und D. KNEDEL 3 elektrolysiert (300 V, 0,4 mA/em, 2 Std bei 10 ~ C). Kermzeichnung der Flecken erfolgt nach dem Trocknen mit NinhydrinlSsung (e-Aminos~ure und Agmatin), Diacetyl-e-Naphthol (Guanidin und Derivate) und SAKAGUO]/I-Reagens (monosubstituierte Guanidine). Citrullin kann mit p-Dimethylaminobenzaldehyd ebenfalls gekennzeichnet werden. In der Reihenfolge zunehmender Wanderungs- weiten im elektrisehen Feld werden getrennt und eharakterisiert: Citmllin, Glyko- cyamin, Kreatin, y.Guanidobuttersiiure, Arginin, Arcain, Dimethylguanidin, Agmatin, Methylguanidin, Guanidin und Octopin. K. CRUSE

Die Isollerung yon Propionylcholin aus Rindermilz gelang J. E. GAI~DII~m~ und V. P. W]tlTTACKEt~ a mit lciilfe der Ionenaustauschchromatographie an einer S~ule aus dem Carbonshureharz Amberlite XE-97, das mit n Salzs~ure oder n Natron- lauge aktiviert und dann mit Phosphat- oder Acetatpuffer yon pE 4,3--4,5 ins Gleichgewicht gesetzt wurde. Dureh NaH~POa-LSsung wird zuerst Acetylcholin, dann Propionycholin eluiert. Die Identifizierung erfo]gt mit Hilfe der Ultrarot- spektroskopie. Das gesamte Verfahren ist in der Originalarbeit ausffihrlich be- schrieben. H. FREYT&G

Zur Feststellung der Pseudocholinesteraseaktivitiit im menschliehen Blutserum sind nach C. L. I~IAl~I)~.l~S und J . M. VAN MULKE~ 5 drei verschiedene chemische Methoden mSglich. - - 1. Man bestimmt gasvolumetr!sch die Menge Kohlens~ure, die bei der Einwirkung yon Cholinesterase auf Acetylcholin aus I-Iydrogencarbonat ffeigemacht wird. - - 2. Colorimetrisch arbeitet man dureh Bestimmung eines der Spaltprodukte des Substrates naeh genau bekannter Einwirkungsdauer. - - 3. Die acidimetrisch, Bestimmung ffihrt man durch die Einwirkung ill einer L5sung yon bekannter Pufferkapazit~t durch. Die zur Verschiebung des pH-Wertes notwendige Zeit ist ein MaI~ ftir die Aktiviti~t. - - Zu beachten ist dabei die weite Streuung, die bei normalen Personen 20% betr~igt. H. KURTENACKER

1 Experientia (Basel) 10, 379--381 (1954). CollSge de France, Paris, und Facult6 de M6decine et Pharm., Algier.

2 Bull. See. Chim. biol. 35, 953 (1953). a Dtseh. reed. Wsehr. 76, 333 (1951).

Biochemie. J. 58, 24--29 (1954). Univ. Cincinnati, Ohio (USA). 5 Pharmaeeut. Weekbl. 89, 845--848 (1954) [Holl~ndisch]. Gem.-Apoth., Haag.