Eine neue Zählmethode zur quantitativen Erfassung kleinster Mengen fetaler, in den mütterlichen...

Jg. 41, Heft 11 J. Se~rS]~IDE~ und G. A. LUDWIG: Eine neue Z~,blmethode eingeschwemmter Erythrocyten 563 1. Juni I963

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Eine neue Z~ihlmethode zur quantitativen Erfassung kleinster Mengen fetaler, in den miitterlichen Kz'eislauf eingeschwemmter Erythrocyten

Von J . SCHNEIDER und G. A. L u D w m *

Aus der Universit/~ts-:Frauenklinik ~'retburg i. Br. (Dh'ek~or: Prof. Dr. H. WI~6FEt~)

Der quan t i t a t i ve Naehweis des t t bF -Ante i l s in einer Blu tprobe war bis vor kurzem in p rax i lediglieh mi t serologisehen Methoden 1 oder mi t te l s der Alkali- denatur ierung% 3 bzw. S~wredenaturierung a m6gheh. Diese Veffahren sind zur K1/~rung einer Reihe h/~mato- logischer F ragen als R o u t i n e m e t h o d e n naeh wie vor unersetzlich. Die un tere Grenze des quan t i t a t i ven ~Nachweises yon H b F liegt jedoch mi t diesen Methoden bei e twa 1% H b F / H b A . Da es sich bei geburtshilf- l ichen Frages te l langen, insbesondere bei der Sensibiti-

* Wesentliehe Teile der vorliegenden Arbeit werden von Herrn G.A. LUDWIG als Dissertation der Medizinisehen Fakulti~t Freiburg i. Br. vorgelegt.

sierung einer rh -nega t iven Mut te r du tch ein rh-posi t ives Kind , meis tens u m E inschwemmungen yon wenigen m m 3 his m l fe ta len Blutes in den mi i t t e rhchen Kreis- lauf handel t 5, haben wir auf Grund yon Vorver- suehen 5 eine Methode entwickel t , welehe die quant i - t a t i ve Bes t im m ung fetaler in den Erwaehsenen- organismus e ingesehwemmter B lu tmengen ira Bereieh zwischen 50 m m 3 bis 50 ml a n d dari iber er laubt . Es werden hierzu die HbF-Ze l l en (fetale Erythroey~en) gegen die HbA-Zel len (Er~rthroeyten des Erwaehsenen) ausgez/ihlt. 1957 gaben K~ErHAVv.~ a n d B3~TXE s eine E lu ie rungsmethode fiir Blutauss t r iehe an, die es er- m6glicht , H b F - e n t h a l t e n d e ErythrocyCen einwandfrei

564 J. SCHNEIDER und G. A. LUDWIG: Eine neue Zi~hlmethode eingeschwemmter Erythrocyten Klinische Wochenschril i

darzustellen. Hierbei wird das H b A aus den Er- waehsenenerythrocy~en mittels eh~er auf PH 3,2 ein- gestellten PufferlSsung eluiert, so dab die leeren ErythroeytenhfiI1en zurfiekbleiben, w/~hrend das H b F aus den fetalen Erythroeyten nieht gel6st wird. Der- artig behandelte Blutausstriehe kSnnen nun mi t einem yon uns angegebenen Z~hlnetz auch bei Verteilungen yon unter l°/o0 HbF/HbA-Zellen quant i ta t iv aus- gewertet werden.

Anordnung des Z~ihlsystems. In das Okular (8faeh) eines Zeiss-Standard-l~Iikroskopes wird ein Okular-Netz-Mikrometer der Firma Leitz, Wetzlar, eingelegt, dessert Seitenla.nge 5 mm betrEgt. Es is$ darauf zu aehten, dab dieses Okularmikrometer mit dem flaehen Rand dem Kreuztiseh zugewendet liegL Das

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Abb. 1. Es handel t sich u m neun in einem Quadra t C angeordnete gleich- gro~e Quadra te B. Um den ~uBeren R a n d des Gesamtquadrates C sind vier Hilfslinien angeordnet, deren Schnitt10unkte mi t den verl~lngerten $eiten v vier kleine Quadrate A entstehen lassen. Diese Quadra te A miissen zuerst aufgesucht und eingestellt werden. Wenn man das Okular- ~nikrometeruetz bei 820facher ~ergrfBerung (Okulax 8fach, Objektiv 40fach) dutch Vor~inderung der optischen Tubusl$inge genau in ein Qua(h'at A hineinprojizieren kann, so entspricht die Ft~che yon Quadra t ~ genau dem 400fachen Inhal~ des auf den Ausstr ich projizierten Okularmikro- meternetzes ~md die F1/i~he C genau dem 3600fachen Inha l t des auf den Ausstrich projizierten Okularmikrometernetzes. Es ist ra t sam, die Justie- rung des Systems nachzukontroll ieren: Die Xante des auf den Objekttr~ger projizierten Okalarmikrometernetzes mu~ sich dutch Yerschieben des Kreuztisches exakt 20real auf der Kan te b nebeneinanderlegen lassen, als Markierungspunkte dienen die Zellen eines untergelegten Ausstrichs. Herstelhmg: Fa. Fri tz HeUige & Co., Freiburg i. Br. (Spezialanfertigung)

Okularmikrometernetz besteht aus 100 Quadraten mit einer Kantenl~nge Yon jeweils 0,5 ram, so dab jedes klein e Quadrat einen Inhalt yon 0,25 mm 2 aufweist. An/ den eluierten und gefgrbten ObjekttrEgeraussbi'ieh wird nun ein gesehliffenes Deekglas aufgelegt, an/ dessert Un~erseite ein Z~hlnetz anf- gei~tzt ist, wie es in f01gender Darstellung in etwa zehnfacher VergrSBerung wiedergegeben ist.

Naeh der besehriebeneu Just ierung wird die Z~h- lung folgendermaBen durchgefiihrt:

Das auf eine m6gliehst gleiehm/iBig ausgestriehene Stelle des Objekttr/~gers aufgelegte Deckglasz/~hlnetz wird bei 80facher VergTSBerung (Okular 8faeh, Objek- t iv 10faeh) m/~anderfSrmig nach HbF-Zellen dureh- sucht. Mit einem Quadrat B des Deekglasnetzes lassen sich nun alle Werte ermitteIn, bei denen mehr als 10--15 HbF-Zellen in dieses Quadrat fallen. Es werden dabei bei der Ausz/ihlung der eluierten ttfillen 4 ×~/a des Okularnetzes auf die Diagonale des Qua- drates verteil t und der ausgez/~hlte W e f t mit 400 multipliziert. Fallen weniger als 10--15 HbF-Zellen in das Quadrat B, so werden vier Quadrate B dureh- mustert , viermal das gauze Okularnetz auf die Diago- hale der Felder ve~¢eilt und der gefundene Wert mit 400 multipliziert. War aueh bier die untere Grenze yon 10--15 tIbF-Zellen erreieht, so wird das ganze Deekglasnetz C ~ 9 B auf die Zahl tier HbF-ZeHen untersucht, das ganze Okularnetz sechsmal auf die

Diagonale verteil t und der gefundene Wef t mit 600 multipliziert. Unser V orgehen l~Bt sich auf einer Tabelle wie folgt darstellen.

Tabelle

Auszuziihlen Auszuz/ihlen ~ult ipl ika- Hb~-Zellen in Quadra t B auf t ionsfaktor

HbF-ZeUen an Hiillen fa r Hfillen

Quadrat B 10--15 HbF-Zellen und mehr

Quadrat g 2--9 HbF-Zellen

Quadrat g weniger als 2 HbF- Zellen

l x / ~

4 x B

9 x B

4 X z/a Okularnetz

4X1 Okularnetz

6 × 1 0kularnetz

400

~t00

600

Beispiel Bei Durchmusterung eines Feldes B finden sieh

drei HbF-Zellen. Es werden nun vier Felder B ab- gesueh~, was z .B . insgesamt 15 HbF-Zellen ergibt. Nun werden vier vollst~ndige Okularmikrometer- netze, welehe fiber die Diagonale der zuvor naeh t IbF- Zellen abgesuchten Felder B einges~ellt werden, yell naeh Hfillen abgesuehC wobei die sieh in diesem Be- reich findenden HbF-Zellen mitgezi~hlt werden. Dar- auf wird die Summe der aus den vier 0kularnetz- mikrometeffeldern gezi~hlten HbA-Hfillen mi t 400 multipliziert, was z. B. den Wef t

1875 × 400---- 750000 ergibt.

15 HbF-Zellen : 750000 ~ 0,02°/0o ~- Promille- weft HbF-/HbA-Zellen.

Bei Werten fiber 1% HbF-Zellen wurden naeh Art der Retieulocytenzahlung nut zehn Okularmikro- meternetze auf einem Ausstrich auf Hfillen und fetale Zellen ausgez/~hlt.

Genauigkeit des Zghlsystems Dureh Zumischung yon Erwachsenenblut zuNabel-

schnurblut haben wir mehrere Reihen yon Nabel- schnurblutverdiinnungen hergestellt, so dab in ab- steigenden Reihen in den Mischblutproben immer weniger t tbF-Zellen enthalten waren. Jeweils eine Verdfinnnngsreihe umfaBte einen best immten prozen- tualen Bereich, so dab insgesamt alle Bereiche zwi- schen 10 nnd 0,001% H b F effaBt wurden. Von jeder Verdiinnungsblutprobe wurden zwei Ausstriehe her- gestellt, eluiert und der gleiehm~Bigere zur Answer- tung verwendet. Jeder Ausstrieh wurde viermal ge- z~hlt und daraus die Fehlerbreite s~ naeh unten- s~ehender Formel (Poisson-Approximation) bereehnet.

Dabei lag die Fehlerbreite im Durehschnitt bei ~: 15 %, Die fiber :k 23,5 %. Somit kann die Fehler- breite der Methode anf maximal :k 25 % abgeschgtzt werden.

Mit dem yon uns entwiekelten Z~b]system l~Bt sich die iibergegangene iY[enge Blur yon K i n d zu l~utSer bereehnen, soweit sie gw6Ber als 0,05 ml und kleiner ats 50 ml ist. Hierzu sollte ann'dherungsweise

fig. 4~, IIeZt n Kurze wissenschaftliehe Mitteflungen 565 1. J u n i 1963

das B lu tvo lumen der Mut te r u n d die Ery throcy ten- zah len /mm s der Mut te r u n d des Nabelschnurblu tes des Kindes b e k a n n t sein.

Z u s a m m e n ] a s s u n g . Das oben angegebene Z~hl- sys tem er laubt es eine fe to-materne Transfus ion im Bereieh yon 50 mms bis zu 50 ml mi t einer max imalen Fehlerbrei te yon ~= 25 % q u a n t i t a t i v zu erfassen. Dies entspr ieht bei e inem angenommenen mfit ter l ichen Blu tvo lumen YOn etwa 5 Liter Wer ten yon 0 ,001--1% / ibergetretenen k indl ichen Blutes. Naeh M6gliehkeit sollten anngherungsweise das B lu tvo lumen der Mutter und die Ery th rocy tenzah len pro m m s der Mut te r u n d des Nabelschnurblu tes des Kindes b e k a n n t sein.

Wit danken tterrn Dip1.-Math. J. GOWTSC~EWSKI, Inst4tut ffir mathematisehe Statistik der Universit~t Freiburg i. Br., an dieser Stelle ~fir seine ~reundliche Unterstfitzung.

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K U R Z E W I S S E N S C H A F T L I C H E M I T T E I L U N G E N

Fruetose-Intoleranz und das Verhalten der unveresterten ~etts~iuren (UFS) bei Fruetosebelastung

Von D. K ~ o ~ und E. W i T m ~

-&us der Univers i t ~ts-Kinde~kl inik ~ i n e h e n (Di rek tor : Prof . Dr.A.WISKOTT)

(Eingegangen a m 15. J a n u a r 1963)

Wir batten Gelegenheit, bei einem Kind yon 4;3 Jahren eine typische Fructose-Intoleranz ohne bekannte FMle in der weiteren Familie aufzudecken. Bei den angestellten Stoff- wechseluntersuchungen konnten die Befunde yon FRo~soI~

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ooo- ,o oo!- ,

500 - ~,0 501 xo.. I

o - o - - o ~ 7 ~ ~ I I i I 1o 2o Yo ~0 Yo /20 /8o rain 0oo

Abb. Das ¥ e r h a l t e n der unveres te r t en t~etts~uren, des anorganisehen Phospha tes u n d des Blutzuckers bei e inem K i n d m i t :Fructose-Intoleranz nach oraIer B e l a s t u a g m i t 10 g Fructose . o o Unveres te r t e Fe t t - si~uren; x . . . . . × a n o r g a n i s c h e s P h o s p h a t im Se rum; • • Blut -

zueker (i~IAGED(%I~-JI~E~SEN) ; i i - - - - - - i Blutzuekel" (Glueoseoxydase- ~ e t h o d e )

u. ~ t a r b . sowie yon WoL~ u. Mitarb. bestgtigt werden. Im Anschlu~ an eine niedrige orale Belastung mit I0 g Fructose bei 15,3 kg K6rpergewieht (0,65 m ~) kam es zu einem typi- schen Abfall der Blntglucose (Glueoseoxydasemethode) und der Blutgesamtreduktion (HAGEDORN-~:ENSEN). Parallel ging der Abfall des anorganischen Serumphosphates, bedingt durch den Anstau yon Fruetosed-Phosphat. Auf dem HShepunkt der StoffwechselstSrung trat 65 rain. nach der Fructosegabe Benommenheit und Erbrechen atff.

Wir bestimmten gleichzeitig die unveresterten Fettsguren (UFS) im Serum naeh DoL~. Es zeigt sieh, dab es durch die Blockierung des Fruetoseabbaues durch 1-PhosphoffuctMdo- lasemangel bei gleichzeitiger Blockierung des Glucosestoff- wechsels (wahrscheinlich dutch kompetitive Hemmung der 1,6-Diphosphoffuctaldolase) zu einer exzessiven Fettmobili- sierung zur Deckung des Energiebedarfes kommt. Ausdruck der Mobilisierung des Depotfettes ist der s~efle Anstieg tier unveresterten Fetts~uren hn Serum. Der se~ niedrlge Aus- gangswert ist wahrscheinlich durch psychisehe Erregung be- dingt. (10 rain. vorher war effolglos die Applikation des ver- weigerten Fructosetees dureh Magensonde versucht worden.)

Die Beobachtung zeigt erneut in eindringlicher Weise, in wie kur~er Zeit der KSrper bei Ausfall der Kohlehydratver- sorgung seinen Energiebedaff aus Depotfett zu decken vermag.

Eine ausffihrliche Darstellung des Falles effolgt gesondert. Kl im Wschr . , 4 1 . 5 a h r g .

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Selektive Einschleusung yon Evans-blue in Tumorzellen durch Heparinoid

Von ALBERT LANDSB]~RGE~

&us dem Anatomisehen Ins~itut der Universit~t Heidelberg (Direk~or: Prof , Dr , FERNER)

(Eingegangen a m 11. Mtirz 1963)

Im Rahmcn unserer Priifungen der Heparinoide, bei denen wJr im Tierversuch einen antiblastischen Effekt sowohl beim Benzpyren-Sarkom (LANDSBm~GEg 1962) als aueh beim Asei£es-Carcinom (LANDSBERGER 1963) naehweisen konnten, ste]lten wir uns die Frage naeh der Wirkungsweise dieser Substanzen. Frfihere Untersuchungen haben gezeigt, dab die Tumorzellen naeh Einwirkung yon Heparinoiden verd~mmern, w~hrend die normalen Gewebszellen nicht gesch~digt werden.

Um den Weg des Hcparinoids veffolgen und darstellen zu k6nnen, hubert wir Evans-blue zusammen mit Hepari- noid intraperitoneal injiziert. Wit verwendeten Evans-blue, well dieser Farbstoff niebt in die Zellen (ausgenommen die des retieulohistioeyt&ren Systems) eind~ngt. Afft~erdem konnte tierexperimentell festgestellt werden, dat~ der Farbstoff selbst in groBen Rosen nieht to~iseh ist (ScI~U:B~RW 1948; So~IoG, Wn~z, Vm~zAl~ 1940/41).

Der Versuch:: 1. Wit injizierten fiinf tumorkranken Ratten, deren Ge-

sehwfilste etwa kirschgroB waren, je 30 mg Evans-blue, gelSst in 2 cm a Aqua redest., intraperitoneal. Die Injektion wurde 24 Std sparer wiederholt. Naeh weiteren 24 Std entnahmen wir den narkotisierten Tieren Tumor, Leber, Milz, Lunge und Gehirn zur histologischen Untersuchung; Bei der Durch- musterung der Pr~parate konnten wir in keinem FaHe ~est- Stellen, dal~ der Farbstoff in die Tumorzellen eingedrungen war.

2. Zugleich erhielten fiinf Ticre je 30 mg Evans-blue, gelSst in 1,5 em 3 Aqua redest. Dieser LSsung gaben wit 0,5 em 3 des Heparinoids 1 hinzu. Die Injektion effoIgte eben- falls intraperitonea:l. Naeh 24 Std wiederholten wir die Iujek- tion mit gleieher Dosierung. Nach weiteren 24 Std ent- nahmen wir den narkotisierten Tieren ]hnnor, Leber, Milz, Lunge und Gehirn zur histologischen Untersuehung. Makro- skopisch konnten wir 1m Vergleieh zu den Tieren der Gruppe 1 bei Leber, Mflz, Lunge und Gehirn keinen Farbunterschied beobaehten. Das Tumorgewebe zeigte hingegen eine deutliche Blauf~rbung bei den Rat ten der Gruppe 2 im Gegensatz zu

Das Heparinoid (G31 150) stellte uns die J.l~. GeigyAG in Basel zur Verffigung, woffir wir danken.

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