Evidence for somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions...

Evidence for somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for

variable and constant regions

Nobumichi Hozumi

Susumu Tonegawa

Von Helen Haukamp 28.2.2011

Inhalt

• Susumu Tonegawa • Wissensstand 1976• Experimente zur Klärung der Entstehung der

Antikörper-Diversität• Ergebnisse• Diskussion • Offene Fragen • Heutiger Wissensstand • Die Schlüsselergebnisse • Quellen

Susumu Tonegawa

• Susumu Tonegawa bekam 1987 den Nobelpreis in Physiologie/Medizin

Entdeckung des genetischen Prinzips für die Generierung der Antikörper-Diversität

Quelle: http://www.brain.riken.jp/bsi-news/bsinews37/files/s_tonegawa.jpg

Was war 1976 bekannt? • Antikörper bestehen aus zwei

verbundenen Regionen

variable Region und konstante Region • Große Antikörper-Diversität

es gibt mehrere Gene führ die variable Region in der Keimbahn

• genaue Anzahl der Gene nicht bekannt, wahrscheinlich einige Gene für die konstante Region (C-Gene) und viele Gene für die variable Region (V-Gene)

V1 V2 V3 V4 C

Quelle: janeway

Experimente zur Klärung der Entstehung der Antikörper-Diversität

• Verwendete DNA:

DNA von Balb/c Maus früher Embryo (Embryo DNA)

DNA aus MOPC 321 Plasmazytomzellen (Tumor DNA)

• Schritt 1: DNA-Verdau durch selbst aufgereinigte BamH I Restrictions Endonuklease

• Schritt 2: Gießen eines 2 Liter Agarose Gels und Beladung mit je 5 mg DNA

Elektrophorese bei 4° für 3 Tage

• Schritt 3: Extraktion der DNA aus dem Agarose Gel

• Schritt 4: RNA-DNA Hybridisierung - mit MOPC 321 125I-markierter κ mRNA oder

ihrem 3`-Ende (3`-Hälfte)

- Resultierende Radioaktivität wurde gemessen

Ergebnisse

Hybridisierungsmuster der Embryo-DNA (Keimbahn-DNA) und der Tumor-DNA

Quelle: original Text

CP

M IN

HY

BR

ID

MIGRATION (cm)

MOLECULAR WEIGHT (x10-6)

Hybridisierte DNA und mRNA Moleküle weisen eine erhöhte Radioaktivität auf.

Ergebnis für die Embryo-DNA

• Zwei Fragmente zeigen Hybridisierung

1. Molekulargewicht: 6.0 (x10-6) Mr

3`-Ende 3`-Ende

κ mRNA (ganz)

κ mRNA 3`-Hälfte

2. Molekulargewicht: 3.9 (x10-6) Mr

κ mRNA (ganz)

5`-Ende

Ergebnis die Tumor-DNA

• Ein Fragment zeigt HybridisierungMolekulargewicht: 2.4 (x10-6) Mr

κ mRNA (ganz) κ mRNA 3`-

Hälfte

3`3´5´5`

V- und C-Gene sind in dem 2.4 (x10-6) Mr

DNA Fragment enthalten

Diskussion

• Die Embryo-DNA enthält zwei Fragmente die nicht in der Tumor-DNA enthalten sind

V-Gen Fragment und C-Gen Fragment Also liegen die V- und C-Gene in der Keimbahn

DNA weit voneinander entfernt

• Die Tumor DNA enthält ein Fragment das nicht in der Embryo DNA enthalten ist

V-C-Gen Fragment Also liegen die V- und C-Gene in der

differenzierten DNA nebeneinander und sind verbunden

Vκ- und Cκ-Gene sind in der Keimbahn nicht verbunden, sondern weit von einander entfernt.

Sie werden während der Reifung von Lymphozyten rekombiniert.

Quelle: original Text

Offene Fragen I• Mechanismus der Rekombination

Mögliche Rekombinations- Mechanismen von V-Genen und C- Genen:

Quelle: original Text

A)Copy-insertion

B)Excision-insertion

C)Deletion

D)Inversion

Offene Fragen II

• B-Lymphozyten exprimieren nur ein V-Gen der leichten Kette Wie wird ein bestimmtes V-Gen aktiviert?

- mögliche Erklärung: Die Aktivierung ist eng gekoppelt mit dem Zusammentreffen mit

einem C-Gen

• in einem B-Lymphozyten wird nur ein Allel exprimiert gibt es also einen Allelausschluss?

- mögliche Erklärung: ein Allel geht verloren, das andere wird verdoppelt

Heutiger Wissensstand • Mechanismus der Rekombination

Quelle: Konzepte Vorlesung

• Allelausschluss

- Ausgelöst durch Signal des B-Zell Rezeptors

- Der Zugang der Rekombinase Maschinerie zum Schwere-Kette Lokus wird verhindert

Die Schlüsselergebnisse

• Die Hybridisierungsmuster der Embryo- und der Tumor-DNA unterscheiden sich stark voneinander – Die Embryo-DNA enthält weit voneinander entfernt

liegende V- und C-Gene– Die Tumor-DNA enthält nur ein

V-C-Genesegment

Es findet eine Umlagerung der Gene während der Differenzierung der Lymphozyten statt

Quellen

• http://www.brain.riken.jp/bsi-news/bsinews37/files/s_tonegawa.jpg

• Janeway´s immuno biology • Original Text: Evidence for somatic rearrangement of

immunoglobulin genes coding for variable and constant regions

• Konzepte Vorlesung