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Funktionelle Untersuchung des 5-HT 2B Rezeptors in einem Tiermodell für Pulmonale Hypertonie mit Bezug zur Pathologie der M igräne
Dissertation zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Biologie und Biotechnologie
an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften
der Ruhr-Universität Bochum
angefertigt am
Lehrstuhl für Tierphysiologie
vorgelegt von
Ingo Bäcker
aus
Leverkusen
Bochum
Februar 2012
Functional investigation of the 5-HT 2B receptor in an animal model for pulmonary hypertension with regard to the pathology of migraine
Dissertation to obtain the degree
Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.)
at the Faculty of Biology and Biotechnology
Ruhr-University Bochum
International Graduate School of Biosciences
Ruhr-University Bochum
Department of Animal Physiology
submitted by
Ingo Bäcker
from
Leverkusen, Germany
Bochum
February 2012
Referent: Prof. Dr. Hermann Lübbert
Korreferent: Prof. Dr. Dr. Dr. med. habil. Hanns Hatt
Abkürzungsverzeichnis
IV
33P Radioisotop des Phosphors
5-HT 5-Hydroxytryptamin, Serotonin
α-SMA α-smooth muscle actin; α-Glattmuskelaktin
µ mikro
A A Ampere
A. dest destilliertes Wasser
Abb. Abbildung
ABC Avidin-Biotin-Komplex
ANO1 Anoctamin-1 (TMEM16A)
ANOVA analysis of variance, Varianzanalyse
ATP Adenosintriphosphat
B b2mg β2-microglobulin
b.i.d. bis in die; zweimal am Tag
bp Basenpaar
Bq Becquerel
BSA Rinderserumalbumin
C c centi
C Celsius
ca. zirka
cDNA complementary DNA
CGRP Calcitonin gene-related peptide
Ci Curie
CO2 Kohlenstoffdioxid
D DAB 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochloriddihydrat
dCTP Desoxy-Cytosintriphosphat
DIG Digoxiginin
DMSO Dimethysulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP 2-Desoxyribonukleotid-5-Triphosphat
Abkürzungsverzeichnis
V
E EDTA Ethylendinitrilotetraessigsäure
ERK extracellular signal-regulated kinases
EtBr Ethidiumbromid
EtOH Ethanol
ET-1 Endothelin-1
F fw forward
G g Gramm
G Gauge
H h Stunde
H20 Wasser
HE Hämatoxylin-Eosin
HPRT Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase
HPV hypoxische pulmonale Vasokonstriktion
I ICC Interstitial Cells of Cajal
IHC Immunhistochemie
i.p. intraperitoneal; in die Bauchhöhle
IUPHAR International Union of Basic and Clinical
Pharmacology
ISH in situ-Hybridisierung
i.v. intravenös
K k kilo
L l Liter
L-NAME Nitro-L-Arginin-methylester
LM Längsmuskulatur, longitudinale Muskulatur
M m Meter
m milli
M Mol/molar
M Mega
MAPK mitogen-activated protein kinase
Abkürzungsverzeichnis
VI
MCT Monocrotalin
mmHG Millimeter-Quecksilbersäule (auch:Torr)
M-MuLV moloney murine leukemia virus
MAO Monoaminooxidase
mCPP 1-(3-Chlorphenyl)piperazin
min Minute
Mio. Million
N n Stichprobenumfang
n nano
N. Nervus
NGS normal goat serum
NHS normal horse serum
NO Stickstoffmonoxid
NOS Stickstoffmonoxid-Synthase
O OD optische Dichte
O2 Disauerstoff
P p Irrtumswahrscheinlichkeit
p pico
p Partialdruck
p phosphoryliert
p.o. per os; über den Mund
PAH Pulmonalarterielle Hypertonie
PB Phosphatpuffer
PBS Phosphatpuffer-Saline
PCR Polymerase-Kettenreaktion
PDGF Platelet-derived growth factor
PFA Paraformaldehyd
pH potentia Hydrogenii
PH Pulmonale Hypertonie
Abkürzungsverzeichnis
VII
PM Plexus Myentericus, Auerbach Plexus
ppET-1 präproEndothelin-1
PPE Plasmaproteinextravasation
PVR pulmonary vascular resistance
px Pixel
R rcf relative centrifugation force
RM Ringmuskulatur, zirkuläre Muskulatur
RNA Ribonukleinsäure
rpm rounds per minute
RT Raumtemperatur
RT Reverse Transkiptase
rv reverse
RVH Rechtsventrikuläre Hypertrophie
S s Sekunde
SCF stem cell factor
SD standard deviation, Standardabweichung
SDS Natriumdodecylsulfat
SEM standard error of mean, Standardfehler
SERT Serotonintransporter
SMC smooth muscle cells; Glattmuskelzellen
SMGM smooth muscle growth medium
sq semiquantitativ
SSRI (selektiver) Serotonin-Wiederaufnahmehemmer
T TAE Tris / Essigsäure / EDTA
Taq Thermophilus aquaticus
TBS-T Tris-Buffered Saline-Tween
TE Tris / EDTA
TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
TPH Tryptophanhydroxylase
Abkürzungsverzeichnis
VIII
U U Unit; Einheit
üN über Nacht
V v Volume; Volumen
VE voll entsalzt
VEGF Vascular endothelial growth factor
vgl. vergleiche
vWF von-Willebrand Faktor
W w Weight; Gewicht
x -fach
Z z.B. zum Beispiel
ZNS zentrales Nervensyste
Inhaltsverzeichnis
IX
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................................... IV
1. Einleitung ........................................................................................................................ 13
1.1 Serotonin .................................................................................................................... 13
1.2 5-HT Rezeptoren ........................................................................................................ 14
1.2.1 5-HT2B Rezeptor ................................................................................................... 14
1.3 Migräne ....................................................................................................................... 15
1.3.1 Allgemeine Informationen und Symptomatik ......................................................... 15
1.3.2 Hypothesen zur Migräneentstehung und Bedeutung des 5-HT2B Rezeptors ......... 16
1.3.3 Tiermodelle für Migräne ........................................................................................ 17
1.4 Pulmonale Hypertonie ................................................................................................. 18
1.4.1 Aufbau der Lunge und des pulmonalen Blutgefäßsystems ................................... 18
1.4.2 Symptomatik und klinische Klassifizierung der Pulmonalen Hypertonie ................ 20
1.4.3 Physiologische Anpassung des Organismus an hypoxische Luftverhältnisse ....... 21
1.4.4 Pathophysiologie der Pulmonalen Hypertonie ...................................................... 22
1.4.5 Tiermodelle für Pulmonale Hypertonie .................................................................. 24
1.4.6 Bedeutung von 5-HT und des 5-HT2B Rezeptors in der Pulmonalen Hypertonie ... 25
1.5 Zielsetzung ................................................................................................................. 28
2. Material und Methoden ................................................................................................... 29
2.1 Material ....................................................................................................................... 29
2.1.1 Versuchstiere ....................................................................................................... 29
2.1.2 Laborgeräte .......................................................................................................... 29
2.1.3 Verbrauchsmaterial .............................................................................................. 30
Inhaltsverzeichnis
X
2.1.4 Chemikalien ......................................................................................................... 30
2.1.5 Puffer und Lösungen ............................................................................................ 33
2.1.6 Antikörper, Primer und pharmakologische Substanzen ........................................ 45
2.2 Methoden .................................................................................................................... 47
2.2.1 Tiermodell der normobaren Hypoxie ..................................................................... 47
2.2.2 Perfusion und histologische Aufarbeitung der Lunge ............................................ 47
2.2.3 Untersuchung des Herzens auf Hypertrophie des rechten Ventrikels ................... 48
2.2.4 Immunhistochemische Färbung von Gewebeschnitten der Lunge ........................ 48
2.2.5 Quantitative Auswertung der Gewebeschnitte der Lunge ..................................... 49
2.2.6 Semiquantitative Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion ................... 50
2.2.7 Western Blot ......................................................................................................... 53
2.2.8 in situ-Hybridisierung ............................................................................................ 55
2.2.9 Immunhistochemische Färbung von Gewebeschnitten des Rattenvormagen ....... 57
2.2.10 Anlegen einer Primärkultur aus Zellen des Rattenvormagen .............................. 57
2.2.11 Calcium-Imaging an Primärkulturen des Rattenvormagen .................................. 58
2.2.12 Immunzytochemische Färbungen von Primärkulturen des Rattenvormagen ...... 58
2.2.13 Vitalfärbung von Primärkulturen des Rattenvormagen ........................................ 59
3. Ergebnisse ...................................................................................................................... 60
3.1 Validierung des Tiermodells der normobaren Hypoxie ................................................ 60
3.1.1 Visualisierung glatter Muskulatur in der Lunge von Mäusen ................................. 60
3.1.2 Induktion der PH ................................................................................................... 62
3.1.3 Rechtsherzhypertrophie (RVH) nach Hypoxie-Behandlung .................................. 64
3.2 Reversibilität der Neomuskularisierung ....................................................................... 65
3.3 Bedeutung des 5-HT2B Rezeptors ............................................................................... 67
3.3.1 Pharmakologische Inaktivierung des 5-HT2B Rezeptors ........................................ 67
3.3.2 Reversibilität der Neomuskularisierung bei Blockierung des 5-HT2B Rezeptors .... 70
Inhaltsverzeichnis
XI
3.3.3 Expression des 5-HT2B Rezeptors in der Lunge von Mäusen unter Hypoxie ......... 72
3.3.4 Signaltransduktion des 5-HT2B Rezeptors unter Hypoxie ...................................... 74
3.4 Wirkungsweise von Migräne-assoziierten Pharmaka in der PH ................................... 80
3.4.1 Inhibition der Stickstoffmonoxid-Synthase durch L-NAME .................................... 80
3.4.2 Aktivierung des 5-HT1B Rezeptors durch Sumatriptan .......................................... 82
3.4.3 Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors durch mCPP ................................................... 85
3.4.4 Zusammenhang zwischen Hypoxie- und mCPP-induzierter Neomuskularisierung ...................................................................................................................................... 88
3.5 Zelluläre Lokalisation des 5-HT2B Rezeptors ............................................................... 90
3.5.1 in situ-Hybridisierung im Vormagen der Ratte....................................................... 90
3.5.2 in situ-Hybridisierung in der Lunge der Ratte ........................................................ 93
3.5.3 Immunhistochemische Färbungen im Vormagen der Ratte .................................. 94
3.5.4 Immunhistochemische Färbungen in der Lunge der Ratte ................................... 96
3.6 Primärkultur von ICC aus dem Rattenvormagen ......................................................... 97
3.6.1 Charakterisierung der Zelltypen ........................................................................... 97
3.6.1.1 Nachweis von Muskelzellen und Neuronen .................................................. 98
3.6.1.2 Nachweis von ICC ......................................................................................... 98
3.6.2 Calcium Imaging ................................................................................................. 100
4. Diskussion .................................................................................................................... 102
4.1. Induktion und Reversibilität der vaskulären Neomuskularisierung ............................ 102
4.1.1 Transfer des Tiermodells der normobaren Hypoxie auf den Organismus Maus .. 102
4.1.2 Notwendige Dauer der Hypoxiebehandlung zur Induktion der PH ...................... 103
4.1.3 Reversibilität der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung .............................. 105
4.1.4 Gemeinsamkeiten und Unterschiede zum Tiermodell der Migräne ..................... 106
4.2. Die Bedeutung des 5-HT2B Rezeptors in der Pathogenese der PH .......................... 108
4.2.1 Pharmakologische Blockierung des 5-HT2B Rezeptors während der Hypoxiebehandlung..................................................................................................... 108
Inhaltsverzeichnis
XII
4.2.2 Pharmakologische Blockierung des 5-HT2B Rezeptors nach der Hypoxiebehandlung .................................................................................................... 110
4.2.3 Expression des 5-HT2B Rezeptors unter Einfluss von Hypoxie ........................... 111
4.2.4 Die Signaltransduktion des 5-HT2B Rezeptors unter Hypoxiebedingungen ......... 112
4.3. Einsatz von Migräne-assoziierten Pharmaka im Tiermodell der PH ......................... 113
4.3.1 L-NAME und die Bedeutung von NO .................................................................. 113
4.3.2 Sumatriptan und die Bedeutung des 5-HT1B Rezeptors ..................................... 115
4.3.3 mCPP und die dauerhafte Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors ............................. 117
4.4. Zelluläre Lokalisation des 5-HT2B Rezeptors ........................................................... 119
4.4.1 Lokalisation in der Lunge ............................................................................... 119
4.4.2 Lokalisation im Magen .................................................................................... 120
4.5. Ausblick ................................................................................................................... 122
5. Zusammenfassung ....................................................................................................... 124
6. Summary ....................................................................................................................... 126
7. Literaturverzeichnis ..................................................................................................... 128
Danksagung ...................................................................................................................... 146
Lebenslauf ........................................................................................................................ 147
Veröffentlichungen ........................................................................................................... 148
Erklärung .......................................................................................................................... 149
Einleitung
13
1. Einleitung
1.1 Serotonin
Serotonin (5-Hydroxytryptamin, 5-HT) stellt eines der wichtigsten biogenen Amine für den
Organismus dar. Es fungiert sowohl als Gewebshormon in der Peripherie als auch in Form
eines Neurotransmitters im Zentralen Nervensystem (ZNS). Dadurch beeinflusst und
reguliert es unterschiedlichste vegetative Prozesse wie z.B. die Motilität des
Verdauungstrakts (Beattie & Smith, 2008) oder die Kontrolle über die vaskuläre Muskulatur
(Vanhoutte, 1989). Im ZNS spielt 5-HT unter anderem eine bedeutende Rolle bei der
Modulation von Lernen und Gedächtnis (Buhot et al., 2000) sowie Emotionen (Graeff et al.,
1996).
Die Synthese von 5-HT erfolgt in zwei Schritten aus der Aminosäure L-Tryptophan durch
Hydrolyse und Decarboxylierung, wobei die Tryptophanhydroxylase das ratenbestimmende
Enzym darstellt. (Mohammad-Zadeh et al., 2008). Der Abbau von Serotonin geschieht
ebenfalls in zwei Reaktionen. Von besonderer Bedeutung sind hier die Monoaminooxidasen
(MAO), da sie 5-HT in eine biologisch inaktive Form überführen (Shih, 2004). Der zuletzt
entstehende Metabolit 5-Hydroxyindolylessigsäure (5-HIAA) wird über den Harn
ausgeschieden.
Der Transport von 5-HT über die Zellmembran erfolgt durch den Serotonin Transporter
(SERT, 5-HTT). Nach der Bindung des Liganden am Rezeptor sorgt der SERT für die
Wiederaufnahme von 5-HT und beendet damit die biologische Wirkung des Monoamins
(Canli & Lesch, 2010). Neben Inhibitoren der MAO sind Hemmer des SERT ein Ansatzpunkt
für Pharmaka, welche einen erhöhten Serotoninspiegel erzeugen. Diese so genannten
Serotonin-Wiederaufnahmehemmer (SSRI) stellen das Mittel der Wahl bei verschiedenen
psychischen Erkrankungen wie z.B. Depressionen (Blier & de Montigny, 1994) oder
Bipolaren Störungen (Sachs et al., 2000) dar.
Der Hauptanteil des für den Körper verfügbaren 5-HT entstammt den Enterochromaffinzellen
des Gastrointestinalstrakts (GIT) und den Thrombozyten. Etwa 95% werden in diesen Zellen
synthetisiert bzw. gespeichert (Erspamer & Asero, 1952; De Ponti, 2004), wohingegen
lediglich geringe Mengen 5-HT in den Neuronen der Raphe Kerne im Hirnstamm produziert
werden (Jonnakuty & Gragnoli, 2008). Da 5-HT eine wichtige Rolle bei der Blutgerinnung
spielt, befinden sich nur äußerst geringe Mengen 5-HT gelöst im Blutplasma (de Clerk et al.,
1982). Die Blut-Hirn Schranke ist impermeabel für 5-HT, so dass es nicht über das Blut in
den neuronalen Kreislauf überführt werden kann. Daher wird die Menge von 5-Hydroxy-
Tryptophan, welches die Blut-Hirn Schranke überwinden kann, zum limitierenden Faktor des
zentralnervösen 5-HT Gehalts (Hardebow & Owman, 1980).
Einleitung
14
1.2 5-HT Rezeptoren
Bis heute sind, je nach Spezies, bis zu 14 5-HT Rezeptoren beschrieben, welche gemäß der
Klassifizierung der IUPHAR (International Union of Basic and Clinical Pharmacology) in
sieben Familien eingeteilt werden. Bei allen Serotonin Rezeptoren handelt es sich mit
Ausnahme des 5-HT3 Rezeptors um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Diese koppeln
sowohl über stimulierende (z.B. 5-HT2) als auch über inhibierende (z.B. 5-HT1) G-Proteine
(Pytliak et al., 2011).
Durch die große Anzahl und Vielfalt der 5-HT Rezeptoren kommen sie in nahezu jedem
Gewebe vor. Zudem können in einem Gewebetyp auch mehrere unterschiedliche 5-HT
Rezeptoren gefunden werden. So sind z.B. in den verschiedenen Zelltypen der Blutgefäße
5-HT Rezeptoren aus jeder Familie vertreten (Kaumann & Levy, 2006).
1.2.1 5-HT2B Rezeptor
Die Familie der 5-HT2 Rezeptoren umfasst den 5-HT2A, den 5-HT2B sowie den 5-HT2C
Rezeptor. Bislang wurde für alle drei Rezeptoren eine Kopplung über das Gq/11-Protein
beschrieben (Hoyer et al., 2002). Während dieser Signalweg für die 5-HT2A und 5-HT2C
Rezeptoren durch in vivo-Studien als gesichert gilt (Conn et al., 1986; Day et al., 2002)
konnte diese Kopplung für den 5-HT2B Rezeptor bislang nur in heterologen
Expressionssystemen gezeigt werden (Choi et al., 1994; Bonhaus et al., 1995; Jerman et al.,
2001).
Der Rezeptor wurde erstmals aus dem Gewebe des Vormagens der Ratte (Rattus
norvegicus) kloniert und als 5-HT2F Rezeptor benannt. (Foguet et al., 1992; Kursar et al.,
1992). Kurz darauf wurde die Nomenklatur geändert und der 5-HT2B Rezeptor erhielt seine
heutige Bezeichnung (Humphrey et al., 1993).
Die Funktion des 5-HT2B Rezeptors wurde schon weitaus früher im Vormagen der Ratte
beschrieben (Vane, 1957). Die zelluläre Lokalisation des 5-HT2B Rezeptors in diesem
Magenabschnitt ist bis heute jedoch nicht vollständig aufgeklärt. Allerdings wurden bisher
ausschließlich Studien veröffentlicht, welche Strukturen innerhalb der Tunica muscularis
(siehe Abb. 1.1) als Expressionsort nennen. In einer Studie wurde der 5-HT2B Rezeptor in der
glatten Muskulatur des Vormagens nachgewiesen (Duxon et al., 1997). Andere
Arbeitsgruppen fanden den Rezeptor im Plexus Myentericus (Fiorica-Howells et al., 2002;
Borman et al., 2002; Zhang et al., 2009), einer ganglionären Struktur des Enterischen
Nervensystems (ENS).
Neben der Expression im Magen wurde das Vorkommen des 5
Bereichen des GIT (Choi & Maroteaux, 1996), der Lunge (Ullmer
(Watts & Thompson, 2004), der Leber, dem Pankreas, der Milz (Bonhaus
Herzen (Monassier et al.,2008, Jaffre
sowie in Blutgefäßen verschiedenster Gewebe (Ullmer
Strukturen des ZNS sind Verbreitung und Funktionen des Rezeptors beschrieben (Choi
et al., 1997; Bonaventure et
Aufgrund seiner weiten Verbreitung im Organismus wird dem 5
Beteiligung an vielen Pathologien zugeschrieben. In der Folge wird auf die Bedeutung des
Rezeptors in den Krankheitsbildern der Migräne sowie der Pulmonalen Hypertonie
eingegangen.
1.3 Migräne
1.3.1 Allgemeine Informationen und Symptomatik
Die Migräne stellt die zweithäufigste Form der Kopfschmerzerkrankungen dar. Die Prävalenz
wird für Männer mit 6-8% beziffert, bei Frauen wird sie auf 12
2008). Mit Kosten von mehr als 27 Milliarden Euro, welche den Staaten der Europäischen
Union jährlich entstehen, gilt die Migräne als die das Gesundheitssystem am meisten
belastende neurologische Erkrankung (Andlin
Abb. 1.1: Aufbau der Tunica muscularisRadenkovic, 2005)
Die Tunica muscularis bestehtKontraktion für die Fortbewegung der Nahrung im Gastrointestinaltrakt (GIT) verantwortlich ist. Die glatte Muskulatur liegt sowohl in LängsZwischen diesen Schichten befindet sich der eingebettete, ganglionäre Struktur des Enterischen Nervensystems. Dort befinden sich unter anderem die Enterischen Neurone sowie Zelltypen sind an der Steuerung der Motilität des GIT beteiwird durch die Tela submucosavon der Tunica mucosa, der Schleimhaut, getrennt.
Neben der Expression im Magen wurde das Vorkommen des 5-HT2B Rezeptors in weiteren
hen des GIT (Choi & Maroteaux, 1996), der Lunge (Ullmer et al.
(Watts & Thompson, 2004), der Leber, dem Pankreas, der Milz (Bonhaus
,2008, Jaffre et al.,2008), der Dura mater (Schmuck
sowie in Blutgefäßen verschiedenster Gewebe (Ullmer et al., 1995) nachgewiesen. Auch in
Strukturen des ZNS sind Verbreitung und Funktionen des Rezeptors beschrieben (Choi
et al., 2002; Murray et al., 2010; MacFarlane
Aufgrund seiner weiten Verbreitung im Organismus wird dem 5-HT
Beteiligung an vielen Pathologien zugeschrieben. In der Folge wird auf die Bedeutung des
Rezeptors in den Krankheitsbildern der Migräne sowie der Pulmonalen Hypertonie
1.3.1 Allgemeine Informationen und Symptomatik
gräne stellt die zweithäufigste Form der Kopfschmerzerkrankungen dar. Die Prävalenz
8% beziffert, bei Frauen wird sie auf 12-15% geschätzt (
2008). Mit Kosten von mehr als 27 Milliarden Euro, welche den Staaten der Europäischen
Union jährlich entstehen, gilt die Migräne als die das Gesundheitssystem am meisten
belastende neurologische Erkrankung (Andlin-Sobocki et al., 2005).
Tunica muscularis in Vormagen der Ratte (verändert nach
besteht im Wesentlichen aus glatter Muskulatur, welche mit ihrer Kontraktion für die Fortbewegung der Nahrung im Gastrointestinaltrakt (GIT) verantwortlich ist. Die glatte Muskulatur liegt sowohl in Längs- als auch in Ringform vor. Zwischen diesen Schichten befindet sich der Plexus Myentericus, eine in Bindegewebe eingebettete, ganglionäre Struktur des Enterischen Nervensystems. Dort befinden sich unter anderem die Enterischen Neurone sowie Interstitial Cells of CajalZelltypen sind an der Steuerung der Motilität des GIT beteiligt. Die Tunica muscularis
Tela submucosa, einer Schicht bestehend aus lockerem Bindegewebe, , der Schleimhaut, getrennt.
Einleitung
15
Rezeptors in weiteren
al., 1995), der Niere
(Watts & Thompson, 2004), der Leber, dem Pankreas, der Milz (Bonhaus et al., 1995), im
(Schmuck et al., 1996)
, 1995) nachgewiesen. Auch in
Strukturen des ZNS sind Verbreitung und Funktionen des Rezeptors beschrieben (Choi
, 2010; MacFarlane et al., 2011).
HT2B Rezeptor eine
Beteiligung an vielen Pathologien zugeschrieben. In der Folge wird auf die Bedeutung des
Rezeptors in den Krankheitsbildern der Migräne sowie der Pulmonalen Hypertonie (PH)
gräne stellt die zweithäufigste Form der Kopfschmerzerkrankungen dar. Die Prävalenz
15% geschätzt (Diener et al.,
2008). Mit Kosten von mehr als 27 Milliarden Euro, welche den Staaten der Europäischen
Union jährlich entstehen, gilt die Migräne als die das Gesundheitssystem am meisten
in Vormagen der Ratte (verändert nach
glatter Muskulatur, welche mit ihrer Kontraktion für die Fortbewegung der Nahrung im Gastrointestinaltrakt (GIT)
als auch in Ringform vor. , eine in Bindegewebe
eingebettete, ganglionäre Struktur des Enterischen Nervensystems. Dort befinden sich Interstitial Cells of Cajal. Beide
Tunica muscularis , einer Schicht bestehend aus lockerem Bindegewebe,
Einleitung
16
Damit ein Ereignis als Migräneattacke bezeichnet werden kann, müssen verschiedene
Kriterien erfüllt sein, welche von der International Headache Society in der Klassifizierung
der Migräne veröffentlicht wurden. So muss der Kopfschmerz 4-72 h anhalten, wobei er in
der Regel unilateral lokalisiert und von pulsierendem Charakter ist. Zumeist führt die Attacke
dazu, dass physische Routineabläufe wie z.B. Gehen und Bewegen nicht erfüllt werden
können ohne dass diese die Symptome weiter verstärken. Neben Übelkeit und Erbrechen
treten häufig Phono- und Photophobie auf (Olesen et al., 2004).
5-HT nimmt eine zentrale Rolle in der Erforschung der Migräne ein (Hamel, 2007; Schwedt,
2007). So konnten Studien zeigen, dass der Serotoninspiegel im Blut vor und während einer
Migräneattacke verändert vorliegt (Anthony et al., 1967; Ferrari et al., 1989). Daher sind
auch die 5-HT Rezeptoren von großer Bedeutung. Agonisten der 5-HT1B/1D Rezeptoren, die
Triptane, stellen das Mittel der Wahl zur Behandlung akuter Migräneattacken dar. Zudem
löste die Substanz 1-(3-Chlorphenyl)piperazin (mCPP), ein partieller Agonist der 5-HT2B und
5-HT2C Rezeptoren, in Patienten Migräneattacken aus (Brewerton et al., 1988; Kalkman,
1997; Leone et al., 2000).
1.3.2 Hypothesen zur Migräneentstehung und Bedeutun g des 5-HT 2B Rezeptors
Eine von mehreren Theorien zur Entstehung der Migräne stellt die Hypothese der
neurogenen Inflammation der äußersten Hirnhaut, der Dura mater, dar. Im Zentrum der
Hypothese steht die Annahme, dass die Migräneattacke durch Reizung freier
Nervenendigungen des N. trigeminus hervorgerufen wird (Moskowitz, 1993; Johnson et al.,
1998). Daraufhin werden proinflammatorische Substanzen wie Substanz P oder das
Calcitonin gene-related peptide (CGRP) aus den Nervenendigungen freigesetzt (Edvinsson
& Goadsby, 1994; Buzzi et al., 1995).
Die Ausschüttung führt zu einer CGRP Rezeptor-vermittelten Vasodilatation meningealer
Blutgefäße (Williamson et al., 1997) und zu einer anhaltenden Reizung von freien
Nervenendigungen des N. trigeminus. Dadurch kommt es zur Ausschüttung weiterer Peptide
und zur Aktivierung von Mastzellen, welche durch Abgabe von Histamin eine Verstärkung
der Vasodilatation hervorrufen (Tani et al., 1990). Durch die Wirkung von Substanz P am
Neurokinin-1 Rezeptor entsteht eine erhöhte Permeabilität der duralen Blutgefäße (Brain &
Cox, 2006), was den Austritt der Proteine aus dem Blutplasma in das perivaskuläre Gewebe
zur Folge hat. Dieser Vorgang wird als Plasmaproteinextravasation (PPE) bezeichnet und
konnte sowohl im Menschen als auch im Tier beobachtet werden (Herbert & Holzer, 2002).
Einleitung
17
Durch die PPE und die Vasodilatation kommt es zu einer sterilen Entzündung der Dura
mater und einer verstärkten Reizung von Nozizeptoren des N. trigeminus, welcher die
Blutgefäße der Dura mater mit schmerzsensitiven Fasern innerviert (Fricke et al., 2001).
Vom N. trigeminus werden die Informationen über den Ncl. caudalis in höhere,
schmerzrelevante Hirnareale weitergeleitet und dort integriert (Link et al., 2008).
Die Mechanismen, die zur erstmaligen Reizung des N. trigeminus führen, sind Gegenstand
der derzeitigen Migräneforschung. Eine Beteiligung des 5-HT2B Rezeptors wurde allerdings
bereits schon kurz nach seiner Klonierung diskutiert (Fozard & Kalkman, 1994).
Nach Stimulation des 5-HT2B Rezeptors kommt es auf einem bisher nicht vollständig
geklärten Signalweg zur Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO) (Schmuck et al., 1996). NO
wird ebenfalls eine wichtige Rolle in der Migräneentstehung zugesprochen (Fozard, 1995;
Olesen et al., 1994; Hobbs et al., 1999). Da NO die Fähigkeit besitzt die freien
Nervenendigungen des N. trigeminus zu reizen (Schmuck et al., 1996), stellt dieser
Zusammenhang einen möglichen Entstehungsweg der Migräne dar. Weitere Hinweise für die
Beteiligung des 5-HT2B Rezeptors lieferte die Arbeitsgruppe um Johnson (2003) sowie
Arbeiten am Lehrstuhl für Tierphysiologie.
1.3.3 Tiermodelle für Migräne
Neben Tiermodellen in denen das trigeminale System elektrisch stimuliert wird, existiert auch
ein Modell in dem die Induktion der artifiziellen Migräne pharmakologisch erfolgt. Dabei
macht man sich die PPE (siehe 1.3.2) zunutze (Johnson et al., 2003). Den Tieren wird der
Azofarbstoff Evans Blue injiziert, welcher unselektiv an Plasmaproteine bindet (Gregersen,
1951) und somit als Tracer fungiert. Treten die Plasmaproteine während der PPE aus den
meningealen Blutgefäßen in das perivaskuläre Gewebe über, kann dies durch
photometrische Quantifizierung von Evans Blue nachgewiesen werden.
Die Induktion der PPE ist in diesem Modell pharmakologisch sowohl induzier- als auch
blockierbar. Die Arbeitsgruppe um Johnson konnte zeigen, dass die Injektion von mCPP
(siehe 1.3.1) eine PPE in der Dura mater von Meerschweinchen (Cavia porcellus) auslöst.
Dieser Effekt war nach vorheriger Applikation eines selektiven 5-HT2B Antagonisten nicht
mehr vorhanden. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass Nitro-L-Arginin-methylester
(L-NAME), ein Inhibitor der NO-Synthase (NOS), sowie Sumatriptan (siehe 1.3.1.) die PPE
verhindern konnten. Eine weitere Arbeitsgruppe wies nach, dass die Injektion von mCPP in
Ratten zu einer erhöhten Aktivität der Neurone im trigeminalen Nucleus caudalis (TNC)
führte, wenngleich sich dieser Befund nach Applikation des 5-HT2B Rezeptor-spezifischen
Einleitung
18
Agonisten BW723C86 nicht bestätigte (Martin & Martin, 2001). Durch diese Studien wurde
der Bezug vom Tiermodell zur Migränepathologie deutlich.
Am Lehrstuhl für Tierphysiologie konnten diese Ergebnisse bestätigt und erweitert werden.
Neben der Validierung des Tiermodells im Meerschweinchen wurde es auf die Spezies Ratte
und Maus (Mus musculus) übertragen. Hier zeigte sich ebenfalls die 5-HT2B Rezeptor-
spezifische Abhängigkeit der PPE. Diese konnte zum einen durch BW723C86 induziert, zum
anderen mit dem 5-HT2B Rezeptor-spezifischen Antagonisten BF-1 blockiert werden (Daniel
Segelcke, persönliche Mitteilung).
1.4 Pulmonale Hypertonie
Da in dieser Arbeit Aspekte des pathologischen Profils der Pulmonalen Hypertonie (PH)
untersucht wurden, wird zunächst ein Überblick über die Anatomie der Lunge sowie den
pulmonalen vaskulären Aufbau besprochen.
1.4.1 Aufbau der Lunge und des pulmonalen Blutgefäß systems
Die Lunge dient bei nahezu allen landlebenden Wirbeltieren der Aufnahme von molekularem
Sauerstoff (O2) sowie der Abgabe von Kohlendioxid (CO2) und stellt damit eines der
wichtigsten Organe des Organismus dar. Zur optimalen Funktion der Lunge müssen einige
Kriterien erfüllt werden. Bei der Ventilation der Lunge muss gewährleistet sein, dass
sämtliche Bereiche mit einer ausreichenden Menge Luft versorgt werden. Zudem muss eine
effiziente Diffusion von O2 und CO2 erfolgen können und die Perfusion des Lungengewebes
mit einer entsprechenden Menge Blut gegeben sein (Huppelsberg & Walter, 2009).
Die Lunge besteht in der Regel aus zwei Lungenhälften, die sich bei der Maus wie folgt
gliedern. Der rechte Lungenlappen baut sich aus vier Loben auf: dem kranialen, dem
medialen, dem kaudalen sowie dem akzessorischen Lobus. Die linke Hälfte der Lunge
besteht aus einem einzigen Lobus, welcher daher als linker Lobus bezeichnet wird.
Die durch Nase oder Mund eingeatmete Luft gelangt über den Rachen in die Luftröhre, die
Trachea. Diese verzweigt sich weiter kaudal in einen rechten und einen linken Ast. Ab
diesem Punkt spricht man bei den luftleitenden Strukturen von Bronchien (Abb. 1.2). Die
knorpeltragenden Hauptbronchien treten am so genannten Hilus in die Lunge ein und
verzweigen sich weiter zu feineren Abschnitten mit einem geringeren Durchmesser bis hin zu
den Bronchioli terminales. Bis zu diesem Bereich wird vom anatomischen Totraum
gesprochen, da hier kein Gasaustausch stattfindet sondern lediglich die Weiterleitung der
Einleitung
19
Atemluft erfolgt. Teile der Bronchien verfügen über glatte Muskulatur, die eine Konstriktion
der Atemwege ermöglicht. Dadurch können die Atemwege auf unterschiedliche
Anforderungen an den Luftstrom reagieren.
Die Übergangszone zu den Segmenten in denen die Atmung stattfindet beginnt mit den
Bronchioli respiratorii. Dieser verzweigen sich weiter über die Ducti alveolaris hin zur
kleinsten funktionellen Einheit der Lunge, den Alveolen. Die Lunge des Menschen besitzt
350 - 700 Mio. Alveolen auf einer Fläche von etwa 100 m² (Schmidt et al., 2007).
In den Alveolen wird die Blut-Luft-Schranke gebildet. Der Abstand zwischen luftführenden
Strukturen und Blutgefäßen beträgt hier weniger als 1 µm. Das Kapillarbett der Alveolen wird
aus der Arteria pulmonalis gespeist. Die zuführenden Gefäße verlaufen dabei unmittelbar
neben den Atemwegen. Nach dem Gasaustausch wird das sauerstoffreiche Blut über die
Lungenvene zum Herzen befördert.
Abb. 1.2: Morphologische Gliederung der Lunge des M enschen (Modell nach Weibel, aus van den Berg, 2005)
Die von kranial über die Luftröhre (Trachea) eintreffende Luft wird über die Atemwege in die Lunge geleitet. Innerhalb der luftleitenden Zone verzweigen sich die Hauptbronchien bis zu den Bronchioli terminales. Dieser Bereich wird als anatomischer Totraum bezeichnet, da hier kein Gasaustausch stattfindet. Die respirative Zone beginnt mit den Bronchioli respiratorii. Die Blut-Luft-Schranke befindet sich an dem in den Alveolen lokalisierten Kapillargeflecht. Dort wird Sauerstoff aus der Luft ins Blut transportiert und Kohlenstoffdioxid aus dem Blut in die Luft abgegeben.
Einleitung
20
Die intrapulmonalen Blutgefäße bestehen aus maximal drei Schichten: Der Tunica externa
(Adventitia), der Tunica media (Media), sowie der Tunica interna (Intima).
Als Adventitia bezeichnet man das lockere Bindegewebe, welches die Blutgefäße von außen
her stützt. Die Media, welche im Wesentlichen von glatter Muskulatur gebildet wird, tritt nicht
bei sämtlichen Blutgefäßen auf. Diese vom vegetativen Nervensystem gesteuerte
Muskulatur ermöglicht die Konstriktion und Dilatation von Blutgefäßen und spielt dadurch
eine wichtige Rolle bei der Steuerung von Blutdruck und Fließgeschwindigkeit. Neben den
meisten Arterien besitzen auch größere Venen eine Media. Kleinere Arteriolen und Venulen
sowie Kapillaren verfügen in der Regel über keine Muskulatur und bestehen ausschließlich
aus Adventitia und/oder Intima. Letztere wird aus einer Schicht Endothelzellen gebildet,
welche als Monolayer vorliegt. Sie bilden eine semipermeable Barriere gegen das Blut und
stehen über aktive und passive Transportmechanismen in ständigem Kontakt zum
Blutkreislauf. Sie nehmen durch die Sekretion von vasoaktiven Substanzen wie Endothelin-1
(ET-1) oder NO direkten Einfluss auf die Gefäßstellung und den Blutdruck.
In der Lunge liegt der systolische Wert des Blutdrucks in Ruhe mit 15-20 mmHg weit unter
dem des Körperkreislaufs (ca. 120 mmHg). Daher wird das Blutgefäßsystem der Lunge
häufig als Niederdrucksystem bezeichnet.
1.4.2 Symptomatik und klinische Klassifizierung der Pulmonalen Hypertonie
Der Begriff der Pulmonalen Hypertonie (PH) umfasst eine weitreichende Anzahl von
Lungenerkrankungen. Per Definition spricht man von PH, sofern der mittlere
Lungenblutdruck einen Wert von 25 mmHG in Ruhe oder 30 mmHG bei Belastung übersteigt
(Petkov & Doberer, 2003). Die Prävalenz der PH wird auf 25-50 Fälle / Mio. Einwohner bei
einer Inzidenz von sieben Fällen / Mio. Einwohner geschätzt (Peacock et al., 2007;
Rosenblum, 2010).
Die Erhöhung des Blutdrucks geht mit einem Anstieg des Gefäßwiderstands des pulmonalen
Blutgefäßsystems einher, was eine Verstärkung der Herzaktivität nach sich zieht. Dadurch
kommt es im Verlauf der Krankheit zur Ausbildung einer Rechtsherzhypertrophie, auch Cor
pulmonale genannt. Diese kann in schweren Fällen zur Herzinsuffizienz und damit letztlich
zum Tod führen (Mullen & Landzberg, 2010).
Bis heute sind, sofern überhaupt möglich, lediglich die Symptome der PH zu behandeln.
Dadurch wird die Lebensqualität der Patienten zwar häufig verbessert, nichtsdestoweniger
besteht großer Bedarf an neuen Behandlungsmöglichkeiten (Ghofrani et al., 2009; Anderson
et al., 2010; Murthy et al., 2010)
Einleitung
21
Eine erste klinische Klassifizierung der PH wurde 1998 beim Second World Symposium on
Pulmonary Hypertension in Evian (Frankreich) vorgenommen (Rubin et al., 1998), welche
mittlerweile während zwei weiteren Symposien überarbeitet wurde (Simonneau et al., 2004 &
2009).
Gemäß der aktuellen Klassifizierung, welche 2008 in Dana Point (USA) ausgearbeitet wurde,
werden fünf übergeordnete Gruppen der PH unterschieden:
1. Pulmonalarterielle Hypertonie (PAH)
2. Pulmonale Hypertonie bedingt durch Linksherzerkrankung
3. Pulmonale Hypertonie bedingt durch Lungenerkrankung und/oder Hypoxie
4. Chronische thromboembolische Pulmonale Hypertonie
5. Pulmonale Hypertonie aufgrund unklarer multifaktorieller Mechanismen
Von besonderer Bedeutung sind dabei die Gruppen 1 und 3, da sie zu den am besten
untersuchten Formen, sowohl beim Menschen als auch in Tiermodellen gehören.
Die Kategorie der PAH stellt die umfangreichste Gruppe innerhalb der Klassifizierung dar.
Neben der idiopathischen Form werden auch die hereditären Formen der PH zu dieser
Klasse gezählt. Zudem sind auch Drogen- und Toxin-induzierte Formen der PH dieser
Gruppe zugehörig. Die PH kann auch als Begleiterscheinung assoziiert mit anderen, nicht
ausschließlich die Lunge betreffenden Erkrankungen wie z.B. einer HIV-Infektion oder
chronischer hämolytischer Anämie auftreten. Auch diese Formen der PH werden der ersten
Gruppe zugeordnet.
Bei den Ursachen der PH-Formen der Klasse 3 handelt es sich zumeist um direkte
Lungenerkrankungen wie z.B. die chronisch obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) oder
die Interstitielle Lungenerkrankung (ILD). Aber auch Formen der PH welche durch die
Unterversorgung der Lunge mit O2 entstehen, werden zu dieser Gruppe gerechnet. Die
reduzierte Sauerstoffversorgung kann dabei temporär, z.B. durch Schlafapnoe, erfolgen, was
in der Regel nur leichte Formen der PH nach sich zieht. Ist der Organismus über einen
längeren Zeitraum hypoxischen Bedingungen ausgesetzt, z.B. durch Aufenthalt in großer
Höhe, treten schwerere Formen der PH auf.
1.4.3 Physiologische Anpassung des Organismus an hy poxische Luftverhältnisse
Der Anteil von O2 an der Atmosphäre beträgt auf Höhe des Meeresspiegels ca. 20,9%. Mit
steigender Höhe nimmt der Sauerstoffpartialdruck (pO2) kontinuierlich ab. Der O2-Gehalt liegt
Einleitung
22
in einer Höhe von 5000 m nur noch bei etwa 10%. Diese Luftbedingungen werden als
hypobare Hypoxie bezeichnet (Beall, 2007).
Im Gegensatz zum systemischen Blutkreislauf reagiert das intrapulmonale Blutgefäßsystem
nicht mit einer Vasodilatation sondern einer Vasokonstriktion auf hypoxische Luftverhältnisse
(Sommer et al., 2008). Diese physiologische Reaktion betrifft im Wesentlichen die
präkapillären Arterien (Staub, 1985) und bewirkt, dass der Blutdruck in der Lunge steigt.
Dadurch können kraniale Bereiche der Lunge, welche unter normoxischen
Ruhebedingungen kaum genutzt werden, besser durchblutet werden, wodurch das
Verhältnis von Ventilation und Perfusion verbessert wird (Aaronson et al., 2005). Dieser
Vorgang wird als hypoxische pulmonale Vasokonstriktion (HPV) bezeichnet (von Euler &
Liljestrand, 1946; Moudgil et al., 2005).
Neben dieser Anpassung kommt es unter hypoxischen Luftverhältnissen auch zu einer
verstärkten Produktion von Erythropoietin (Zhu et al., 2002). Die daraus resultierende
Zunahme von roten Blutkörperchen gewährleistet eine höhere Sauerstoffkapazität. Zudem
erhöht sich die Atemfrequenz (Easton & Anthonisen, 1988), wodurch der Partialdruck von
CO2 (pCO2) gesenkt und daher der pO2 erhöht wird (Peyraud-Waitzenegger et al., 1989).
Dieser Prozess wird als hypoxische Hyperventilation bezeichnet.
Bei diesen physiologischen Adaptionen spielt sowohl der Zeitrahmen der Hypoxie als auch
der unterversorgte Bereich der Lunge eine entscheidende Rolle. So können kurzfristige
hypoxische Episoden mittels der HPV gut kompensiert werden, wohingegen der langfristige
Aufenthalt in Hypoxie zu schwerwiegenden strukturellen (Weissmann et al., 2001) und
funktionalen (Groves et al., 1987) Veränderungen des pulmonalen Blutgefäßsystems führt.
Diese spielen in der Pathogenese der Pulmonalen Hypertonie eine wichtige Rolle.
1.4.4 Pathophysiologie der Pulmonalen Hypertonie
Während des Krankheitsverlaufs der PH kommt es neben der verstärkten Vasokonstriktion
zu morphologischen Umbauprozessen im Blutgefäßsystem der Lunge (siehe Abb. 1.3),
welche auch als vaskuläre Remodellierung bezeichnet werden. Charakteristisch ist hierbei
die Ausprägung einer Muskelschicht an arteriellen Gefäßen, welche vormals keine Media
aufwiesen. Dieser Prozess wird als Neomuskularisierung bezeichnet und wird sowohl durch
Hyperplasie als auch Hypertrophie hervorgerufen (Jeffery & Wannstall, 2001). Zusätzlich
kommt es bei bereits muskularisierten Arterien zu einer Verdickung der Media durch
Proliferation der Glattmuskelzellen (Jones et al., 1999).
Die zellulären Veränderungen bei der Hypoxie
betreffen dabei jeden Zelltyp. Es kommt zur Freisetzung vasoaktiver Substanzen aus
Endothelzellen wie z.B. Vascular endothelial g
factor (PDGF), ET-1, 5-HT sowie NO (Faller, 1999; Jeffer
2006). Zudem entstehen plexiforme Läsionen durch die fehlgeleitete Proliferation der
Endothelzellen (Cool et al., 1999).
Hypoxische Luftverhältnisse führen bei den Glattmuskelzellen der Media wie bereits
beschrieben zu verstärkter Vasokonstriktion und Proliferation. Desweiteren sekretieren sie
vermehrt Proteine der Extrazellulären Matrix
al., 1989; Poiani et al., 1990).
Die Fibroblasten der Adventitia reagieren als erster der genannten Zelltypen auf Hypoxie
(Stenmark et al., 2002). Sie weisen eine starke Proliferation auf und differenzieren
genannten Myofibroblasten. Als solche besitzen sie kontraktile Eigenschaften, wie der
Nachweis von α-Glattmuskelaktin in diesen Zellen ergab (Strauss & Rabinovitch, 2000). In
einigen Formen der PH wird auch die Beteiligung von inflammatorischen Zelle
(Makrophagen und Lymphozyten) sowie Thrombozyten diskutiert (Humbert
Hassoun et al., 2009).
Abb. 1. 3: Morphologische Veränderungen pulmonaler Blutgefä ße in der PH (verändert nach Jones et al.
Unter normalen physiologischen Bedingungen besitzen die kleinsten Blutgefäße (oben) lediglich ein Endothel mit umliegenden Fibroblasten. Unter hypoxischen Verhältnissen beginnen die Fibroblasten zu proliferieren und differenzieren schließlich zu Myofibroblasten, welche kontraktile Eigenschaften besitzen und den Glattmuskelzellen dadurch sehr ähnlich sind. In bereits muskularisierten Gefäße (unten) kommt es durch die Hypoxie zur Proliferation der Muskelzellen. Dies führt auch hier zu einer Verengung des Lumens und damit zum Anstieg des intrapulmonalen Gefäßwiderstands.
Die zellulären Veränderungen bei der Hypoxie-induzierten PH sind äußerst komplex und
betreffen dabei jeden Zelltyp. Es kommt zur Freisetzung vasoaktiver Substanzen aus
Vascular endothelial growth factor (VEGF), Platelet
sowie NO (Faller, 1999; Jeffery & Morell, 2002; Stenmark
2006). Zudem entstehen plexiforme Läsionen durch die fehlgeleitete Proliferation der
, 1999).
Hypoxische Luftverhältnisse führen bei den Glattmuskelzellen der Media wie bereits
beschrieben zu verstärkter Vasokonstriktion und Proliferation. Desweiteren sekretieren sie
vermehrt Proteine der Extrazellulären Matrix (ECM), wie z.B. Collagen und Elastin (Crouch
, 1990).
Die Fibroblasten der Adventitia reagieren als erster der genannten Zelltypen auf Hypoxie
, 2002). Sie weisen eine starke Proliferation auf und differenzieren
genannten Myofibroblasten. Als solche besitzen sie kontraktile Eigenschaften, wie der
Glattmuskelaktin in diesen Zellen ergab (Strauss & Rabinovitch, 2000). In
einigen Formen der PH wird auch die Beteiligung von inflammatorischen Zelle
(Makrophagen und Lymphozyten) sowie Thrombozyten diskutiert (Humbert
3: Morphologische Veränderungen pulmonaler Blutgefä ße in der PH et al., 1999)
Unter normalen physiologischen Bedingungen besitzen die kleinsten Blutgefäße (oben) lediglich ein Endothel mit umliegenden Fibroblasten. Unter hypoxischen Verhältnissen beginnen die Fibroblasten zu proliferieren und differenzieren schließlich zu
asten, welche kontraktile Eigenschaften besitzen und den Glattmuskelzellen dadurch sehr ähnlich sind. In bereits muskularisierten Gefäße (unten) kommt es durch die Hypoxie zur Proliferation der Muskelzellen. Dies führt auch hier zu einer Verengung des
ns und damit zum Anstieg des intrapulmonalen Gefäßwiderstands.
Einleitung
23
induzierten PH sind äußerst komplex und
betreffen dabei jeden Zelltyp. Es kommt zur Freisetzung vasoaktiver Substanzen aus
Platelet-derived growth
y & Morell, 2002; Stenmark et al.,
2006). Zudem entstehen plexiforme Läsionen durch die fehlgeleitete Proliferation der
Hypoxische Luftverhältnisse führen bei den Glattmuskelzellen der Media wie bereits
beschrieben zu verstärkter Vasokonstriktion und Proliferation. Desweiteren sekretieren sie
(ECM), wie z.B. Collagen und Elastin (Crouch et
Die Fibroblasten der Adventitia reagieren als erster der genannten Zelltypen auf Hypoxie
, 2002). Sie weisen eine starke Proliferation auf und differenzieren zu so
genannten Myofibroblasten. Als solche besitzen sie kontraktile Eigenschaften, wie der
Glattmuskelaktin in diesen Zellen ergab (Strauss & Rabinovitch, 2000). In
einigen Formen der PH wird auch die Beteiligung von inflammatorischen Zellen
(Makrophagen und Lymphozyten) sowie Thrombozyten diskutiert (Humbert et al., 2004;
3: Morphologische Veränderungen pulmonaler Blutgefä ße in der PH
Unter normalen physiologischen Bedingungen besitzen die kleinsten Blutgefäße (oben) lediglich ein Endothel mit umliegenden Fibroblasten. Unter hypoxischen Verhältnissen beginnen die Fibroblasten zu proliferieren und differenzieren schließlich zu
asten, welche kontraktile Eigenschaften besitzen und den Glattmuskelzellen dadurch sehr ähnlich sind. In bereits muskularisierten Gefäße (unten) kommt es durch die Hypoxie zur Proliferation der Muskelzellen. Dies führt auch hier zu einer Verengung des
Einleitung
24
All diese Prozesse führen zur Verengung des Lumens intrapulmonaler Blutgefäße und damit
zu einem Anstieg des Gefäßwiderstands, welchem mit erhöhter Leistung des Herzens
entgegen gearbeitet werden muss.
1.4.5 Tiermodelle für Pulmonale Hypertonie
In den ersten Tiermodellen zur Erforschung der PH wurden mitunter relativ große Spezies
wie Schweine (Sus scrofa domestica) oder Schafe (Ovis orientalis aries) eingesetzt.
Heutzutage werden in der Regel Mäuse, Ratten oder Meerschweinchen verwendet. Dabei
existieren teilweise gravierende interspezielle Unterschiede in der Ausprägung der PH
(Tucker et al., 1975). Das tibetanische Yak (Bos mutus) ist durch die Lebensweise in großer
Höhe an hypoxische Verhältnisse adaptiert, weshalb die Lunge den reduzierten O2-Gehalt
sehr gut kompensieren kann (Durmowicz et al., 1993; Groves et al., 1993). Im Gegensatz
dazu ist der Phänotyp der PH in Kälbern (Bos taurus) besonders stark ausgeprägt.
Es existiert inzwischen eine Vielzahl von Tiermodellen zur Erforschung der PH (Ryan et al.,
2011). Durch den biotechnologischen Fortschritt werden z.B. immer häufiger transgene Tiere
verwendet. Die meisten Arbeitsgruppen konzentrieren sich allerdings weiterhin auf die
beiden klassischen Modelle der PH: (i) das Monocrotalin-Modell (MCT) sowie (ii) das
Hypoxie-Modell. Wenngleich in beiden Modellen pathologische Merkmale der PH induziert
werden können, bestehen teils große Unterschiede im Prozess der Remodellierung
pulmonaler Blutgefäße (van Suylen et al., 1998).
Das MCT-Modell wird vornehmlich an Ratten des Stammes Sprague Dawley durchgeführt. In
den ersten Versuchen stellte sich heraus, dass die orale Gabe von Samen der Pflanze
Crotolaria spectabilis zur Ausprägung der PH führte (Kay et al., 1967). In der Folge wurde
das Pyrrolizidin-Alkaloid MCT als Wirkstoff isoliert (Plestina & Stoner, 1971; Huxtable, 1980;
Meyrick et al., 1980). Wird MCT in der Leber des Organismus verstoffwechselt, entsteht als
Metabolit MCT-Pyrrol (MCTP). Der genaue Mechanismus der zur Entstehung der PH nach
Gabe von MCT führt, ist bis heute jedoch nicht geklärt.
Ein Vorteil dieses Tiermodells besteht in der einfachen Handhabung der Tiere, da bereits
eine Injektion von MCT ausreichend ist, um nach etwa fünf Wochen den Phänotypen der PH
hervorzurufen (Werchan et al., 1989; Uzzaman et al., 2000). Dieser ist mit einer massiven
Verdickung der Media, die bis hin zu Okklusionen der Blutgefäße führt, sehr stark
ausgeprägt (Lee et al., 2005). Ein Nachteil besteht in der mäßigen Reproduzierbarkeit des
Phänotyps, da die Wirkung des MCTP immer abhängig vom Metabolismus des einzelnen
Versuchstieres ist. Zudem wird das MCT-Modell eher als akutes toxisches Modell
Einleitung
25
angesehen, welches direkten Schaden an den Blutgefäßen verursacht. Daher bleibt fraglich
inwiefern dieses Modell das Erscheinungsbild der PH beim Menschen widerspiegelt.
(Stenmark et al., 2009).
Die ersten Versuchsreihen, bei denen der Einfluss der Hypoxie auf Tiere beobachtet werden
sollte, wurden in großer Höhe, also natürlicher hypobarer Hypoxie, durchgeführt (Hultgren
et al., 1963). Heutzutage werden die Versuchstiere fast ausschließlich in so genannten
Hypoxie-Kammern gehalten. Um Tiere unter hypoxischen Bedingungen zu halten, sind zwei
Varianten möglich. Zum einen kann in einer Unterdruckkammer mit Hilfe einer
Vakuumpumpe hypobare Hypoxie simuliert werden. Zum anderen besteht die Möglichkeit ein
Luftgemisch aus Raumluft und Stickstoff in die Hypoxie-Kammer strömen zu lassen und so
den Gehalt des O2 zu reduzieren. Diese Variante wird als normobare Hypoxie bezeichnet.
Der genaue Mechanismus zur Entstehung der PH im Hypoxie-Modell ist bis heute ebenfalls
nicht geklärt. Es ist jedoch naheliegend, dass die vaskuläre Remodellierung durch
O2-sensitive Prozesse eingeleitet wird. So sind vor allem Transkriptionsfaktoren wie die
Hypoxia inducible factors (HIFs) von Bedeutung. Es konnte beispielsweise gezeigt werden,
dass der HIF-1 unter hypoxischen Bedingungen essentiell für die verstärkte Expression von
Erythropoietin sowie VEGF ist (Forsythe et al., 1996; Tzusuki et al., 2000). Da eine Vielzahl
von Genen über so genannten Hypoxia response elements (HRE) verfügt, sind die zellulären
Folgen der Hypoxie sehr komplex (Melillo et al., 1996; Lok & Ponka, 1999; Minchenko &
Caro, 2000).
Ein Vorteil der Hypoxiebehandlung liegt darin, dass der identische Stimulus auch beim
Menschen zur Ausprägung der PH führt. Daher sollten die im Tiermodell erzielten
Erkenntnisse mit hoher Wahrscheinlichkeit zu einem verbesserten Verständnis der
Erkrankung beim Menschen führen und die Behandlungsmöglichkeiten verbessern. Zudem
besteht im hypoxischen Tiermodell keine Speziesabhängigkeit (Ratte) wie beim MCT-Modell.
Daher wurde für diese Arbeit das Modell der normobaren Hypoxie verwendet.
1.4.6 Bedeutung von 5-HT und des 5-HT 2B Rezeptors in der Pulmonalen Hypertonie
Die Rolle von 5-HT in der Pathogenese der PH ist für die Forschung von großer Bedeutung.
Erste Hinweise auf die Beteiligung von 5-HT resultierten aus dem vermehrten Auftreten der
PH in den 1960er sowie 1980er Jahren bei Patienten, welche die Appetitzügler Aminorex
und Dexfenfluramin einnahmen (Kay et al., 1971; Abenhaim et al., 1996). Es stellte sich
heraus, dass diese Substanzen weitreichende Wirkungen innerhalb des serotonergen
Systems entfalteten (MacLean, 1999). Später wurde nachgewiesen, dass der 5-HT Gehalt
Einleitung
26
im Blut von Patienten mit PH erhöht vorliegt (Herve et al., 1995; Kéreveur et al., 2000). Es
bleibt bisher fraglich über welche Mechanismen dieser Anstieg entsteht und welche
Rezeptoren die Wirkung des 5-HT in der Pathologie der PH vermitteln.
Die Tryptophan Hydroxylase (TPH) ist das ratenbestimmende Enzym bei der 5-HT Synthese.
Bei Patienten mit PH konnte eine gesteigerte Expression der TPH nachgewiesen werden
(Dempsie & MacLean, 2008). Durch in vitro Experimente konnte gezeigt werden, dass die
Inhibition der TPH zu einer verringerten Proliferation glatter Muskelzellen (smooth muscle
cells, SMC) führte. Der Effekt der Inhibition war in SMC von Patienten mit PH größer als bei
den Zellen der Kontrollgruppe (Eddahibi et al., 2006). Zudem zeigten Mäuse, welche eine
Defizienz des TPH-Gens aufwiesen, eine starke Reduktion des Phänotyps der PH nach
Hypoxiebehandlung (Morecroft et al., 2007).
Da der SERT für die zelluläre Regulation des 5-HT Spiegels verantwortlich ist, spielt auch
dieser wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der Entstehung der PH. In Tiermodellen der PH
zeigten Mäuse, die den SERT überexprimierten (SERT+/+), eine stärkere Ausprägung der PH
als die entsprechenden Littermates (MacLean et al., 2004; Guignabert et al., 2006). Im
Gegensatz dazu konnte gezeigt werden, dass SERT-Knock Out Mäuse (SERT-/-) einen
reduzierten Phänotypen ausbildeten (Eddahibi et al., 2000).
5-HT verfügt nicht nur über vasoaktive Eigenschaften sondern stellt auch ein potentes
Mitogen dar (Egermeyer et al., 1999). Diese Prozesse werden von den Serotonin
Rezeptoren vermittelt. In der Pathologie der PH scheinen vor allem der 5-HT1B Rezeptor, der
5-HT2A sowie der 5-HT2B Rezeptor involviert zu sein (Esteve et al., 2007; MacLean, 2007).
Die genaue Bedeutung der einzelnen Rezeptoren ist bisher nicht geklärt, es wird aber auch
die Möglichkeit der Interaktion dieser Rezeptoren diskutiert (Naeije & Eddahibi, 2004).
Erstmalig wurde eine mögliche Beteiligung des 5-HT2B Rezeptors an der Pathogenese der
PH in einem hypoxischen Mausmodell gezeigt (Launay et al., 2002). Diese Arbeitsgruppe
konnte durch pharmakologische Inhibition des 5-HT2B Rezeptors den Prozess der
Neomuskularisierung blockieren. Auch bei Mäusen, die über eine genetische Ablation des
5-HT2B Rezeptors verfügten (5-HT2B-/-), kam es nicht zur Ausbildung einer neuen
Muskelschicht an den Blutgefäßen. Die Gabe von Dexfenfluramin, dessen Metabolit
Nordexfenfluramin ein agonistische Potential am 5-HT2B Rezeptor aufweist, verstärkte den
Effekt der Hypoxie. Desweiteren wurde eine gesteigerte Expression des Rezeptors nach der
Hypoxie-Behandlung festgestellt.
Innerhalb der letzten zwei Jahre wurden weitere Studien veröffentlicht, in welchen die
Funktion des 5-HT2B Rezeptors in Tiermodellen der Pulmonalen Hypertonie untersucht
wurde (Porvasnik et al., 2010; Dumitrascu et al., 2011, Zopf et al., 2011). Sämtliche
Einleitung
27
Arbeitsgruppen verwendeten das MCT-Modell in Ratten und konnten zeigen, dass die
pharmakologische Inaktivierung des 5-HT2B Rezeptors zu einer Reduktion der Pathologie der
PH (Neomuskularisierung pulmonaler Blutgefäße, RVH) führte. Zudem konnte eine
verstärkte Expression des Rezeptors nachgewiesen werden. Aus in vitro Experimenten ging
hervor, dass die Blockierung des 5-HT2B Rezeptors zu einer Verminderung der Proliferation
humaner SMC führte.
Einleitung
28
1.5 Zielsetzung
Bei der Pulmonalen Hypertonie (PH) handelt es sich um eine Erkrankung, in welcher es
durch physiologische sowie morphologische Veränderungen im Blutgefäßsystem der Lunge
zu einem Anstieg des Blutdrucks innerhalb der pulmonalen Zirkulation kommt. Die
prognostizierte Überlebensdauer für Patienten mit PH beträgt in schweren Fällen drei Jahre
ab Diagnose.
Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Auswirkungen von Pharmaka, welche im
Zusammenhang mit der Krankheit Migräne stehen, in einem Tiermodell der Pulmonalen
Hypertonie zu untersuchen.
Zwischen der Pulmonalen Hypertonie und der Migräne bestehen einige Parallelen. Die
pathologischen Prozesse beider Krankheiten betreffen vornehmlich die Blutgefäße in der
Lunge bzw. der Dura mater. Zudem scheint die Ursache im serotonergen System zu liegen.
Zur Induktion der Pulmonalen Hypertonie wurde das Tiermodell der normobaren Hypoxie
verwendet. Dieses Modell wurde bereits in vorherigen Arbeiten am Lehrstuhl für
Tierphysiologie in Meerschweinchen und Ratten etabliert und sollte in dieser Arbeit auf den
Organismus Maus übertragen werden. Als Maß für die Ausprägung des Phänotyps der
Pulmonalen Hypertonie wurde die Zunahme der Muskularisierung intrapulmonaler
Blutgefäße histologisch quantifiziert.
Bei den Analysen stand vor allem die Funktion des 5-HT2B Rezeptors im Vordergrund, da
diesem bereits eine Rolle sowohl in der Pathogenese der Migräne als auch der PH
zugesprochen wird. Daher sollten die Effekte der pharmakologischen Blockierung durch eine
Antagonisten (BF-1) sowie der Aktivierung des Rezeptors mittels eines Agonisten (mCPP)
untersucht werden.
Zusätzlich wurde die Expression des Rezeptors nach hypoxischer Behandlung der
Versuchstiere auf Veränderungen mittels semiquantitativer RT-PCR überprüft. Da die
zelluläre Lokalisation des 5-HT2B Rezeptors in der Lunge bisher noch unklar ist, sollte dies
durch in situ Hybridisierung und immunhistochemische Färbungen untersucht werden.
Zudem ist die Signaltransduktion des Rezeptors bisher nicht abschließend geklärt, so dass
hierzu proteinbiochemische Untersuchungen mittels Western Blot durchgeführt wurden.
Darüber hinaus wurden im Tiermodell der PH die Substanzen Sumatriptan, ein 5-HT1B
Rezeptor Agonist, und L-NAME, ein Inhibitor der Stickstoffmonoxid Synthase (NOS),
verabreicht, welche bereits in Patienten oder auch in Tiermodellen der Migräne positive
Effekte gezeigt haben. Dadurch konnten weitere mögliche Parallelen zwischen den beiden
Erkrankungen untersucht werden.
Material und Methoden
29
2. Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1. Versuchstiere
Für die Versuche des Hypoxie-Tiermodells wurden ausschließlich Männchen des
Mausstammes NMRI im Alter von ca. zwölf Wochen verwendet. Für die Untersuchungen des
Rattenmagens wurden Tiere des Stammes Wistar verwendet. Alle Tiere wurden von der
Firma Janvier (Le Genest Saint Isle, Frankreich) bezogen und entweder direkt in den
Versuchen oder als Zuchttiere verwendet, so dass die Nachkommen in den Versuchen
genutzt wurden. Die Stallungen unterlagen einem künstlichen Tag/Nacht-Zyklus von je zwölf
Stunden. Pelletiertes Zuchtfutter sowie Wasser wurden ad libitum zur Verfügung gestellt.
2.1.2 Laborgeräte
Aufrechtes Mikroskop Axioskop 2 Zeiss
Einbettungsapparatur Tissue Console Miles Scientific
Gefriermikrotom CM3050 Leica
Geldokumentationsgerät Gel Doc 2 Biometra
Geltrockner Modell 543 Bio-Rad
Inverses Mikroskop Zeiss
Laserscanner FLA-3000 Fujifilm
Mikrotom RM 2145 Leica
Monochromator Polychrom V TILL Photonics
Perfusionspumpe Typ 313S Watson Marlow
RoboCycler Gradient 96 Stratagene
Ultra Turrax T25 basic IKA Laboratories
Material und Methoden
30
2.1.3 Verbrauchsmaterial:
40 µm/100µm Cell Strainer BD Bioscience
Cellulose-Acetat Streifen Sartorius
Cover Slips Deckgläser Menzel
Hybond-N+ Nylonmembran Amersham Biosciences
Kanülen B. Braun Medical
Objektträger SuperFrost Plus Menzel-Gläser
Schnappdeckelgläser Kimble Glas, Inc.
Tissue Freezing Medium Jung
Küvetten UVette Eppendorf
PVDF-Membran Roth
2.1.4 Chemikalien
Standardchemikalien wurden in p.A. Qualität von verschiedenen Herstellern bezogen. Alle
weiteren Chemikalien befinden sich in der folgenden Liste.
3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochloriddihydrat (DAB) Fluka
40% Acrylamid/ Methylenbisacrylamid 37,5:1 Bio-Rad
[α-33P] dCTP Hartmann Analytic
Agarose Eurogentec
Alkohole J.T. Baker
Ameisensäure J.T.Baker
Amidoschwarz Roth
Ammoniumperoxodisulfat AppliChem
Atemkalk Intersurgical
Material und Methoden
31
ATP Sigma
BCIP Roche
Blocking-Reagenz Roche
Bromphenolblau Roth
Chloroform J.T. Baker
Collagenlösung Beckton Dickinson
Collagenase Worthington
Complete Protease Inhibitor Cocktail Roche
Coomassie AppliChem
Denhardt’s-Reagenz Sigma
Dextransulfat AppliChem
DMSO Sigma
DIG-labeling Mix Roche
EDTA Sigma
Essigsäure J.T. Baker
Essigsäureanhydrid VWR
Ethidiumbromid Roth
Euparal 3C 239 Eindeckmedium Chroma
Fluorescein Isothiocyanat Dextran Sigma
Formamid VWR
Fura-2/AM Sigma
Glycerin Riedel-de Haën
Glycin Roth
Heringssperma Sigma
HEPES Invitrogen
Material und Methoden
32
Isopentan VWR
Kalziumchlorid VWR
Ketamin Heinrich Fromm
Methylenblau Chroma
NBT Roche
Nonidet P40 AppliChem
Paraffin Sherwood Medical
Paraformaldehyd VWRTM
Phenol Roth
Precision Plus Protein All Blue Standards Bio-Rad
Proteinase K Roche
RNase Zap Invitrogen
Rinderserumalbumin Roth
Rotihistol Roth
SDS Applichem
Smart Ladder Eurogentec
Sucrose J.T. Baker
t-RNA (Hefe) Roche
T3/T7 Polymerase Roche
Taq-Polymerase Fermentas
Taq-Puffer Fermentas
TEMED Riedel-de Haën
Triethanolaminhydrochlorid Acros Organics
Trichloressigsäure J. T. Baker
Tris-base Sigma
Material und Methoden
33
Tris-HCl J.T. Baker
Triton X-100 Sigma
TRIzol Invitrogen
Trypsin Inhibitor Sigma
Tween 20 Sigma
Wasserstoffperoxid J. T. Baker
Xylazin Ceva Tiergesundheit
Xylencyanol Sigma
Kits:
Avidin Biotin Kit Vector Laboratories
Digest-All 2 Trypsin Kit Invitrogen
SMGM-2 Bullet Kit Lonza
RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit Fermentas
2.1.5 Puffer und Lösungen
Perfusion und Präparation
Perfusions-Saline:
9 g NaCl
500 ml 0,2 M PB
ad 1l A. dest
Material und Methoden
34
4% (w/v) Paraformaldehyd (PFA), pH 7,3 – 7,4
400 ml A. bidest
40 g Paraformaldehyd
bei max. 60°C unter Rühren lösen
2 x NaOH Plätzchen
Lösung filtrieren
500 ml 0,2 M PB
PH auf 7,3-7,4 einstellen
ad 1l A. dest
Immunhistochemie, Immunzytochemie und Western Blot
0,2 M Phosphatpuffer (PB), pH 7,3:
6,35 g NaH2PO4
27,34 g Na2HPO4
ad 1l A. dest
0,01 M Phosphatpuffer-Saline (PBS), pH 7,3:
50 ml 0,2 M PB
9 g NaCl
ad 1l A. dest
0,07% DAB-Gebrauchslösung:
2 ml 7% DAB-Stammlösung
ad 200 ml 0,1 M PB
kurz vor dem Gebrauch ansetzen, rühren, filtrieren
Material und Methoden
35
TDL-Puffer
50 mM HEPES, pH 7,4
150 mM NaCl
10 mM EDTA
1% Nonidet P40
0,5% Natriumdeoxycholat
0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS)
1fach Complete Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Mannheim)
2x Laemmli-Probenpuffer
25 mM Tris/HCl, pH 6,8
1% SDS
2% (v/v) Mercaptoethanol
10% (v/v) Glycerin
1,5% 0,5% Bromphenolblau-Lösung
Sammelgelpuffer
1 M Tris/HCl, pH 6,8
Trenngelpuffer
1 M Tris/HCl, pH 8,8
Laufpuffer (10x)
1,92 M Glyzin
250 mM Tris-basisch
Material und Methoden
36
Laufpuffer
100 ml 10x Laufpuffer
10 ml 10% SDS
ad 1l A. bidest
TBS-T, pH 7,6
20 mM Tris-basisch
137 mM NaCl
0,1% Tween 20
10% Polyacrylamid/SDS-Sammelgel
2,86 ml A. bidest
0,5 ml 40% Acrylamid/ Methylenbisacrylamid 37,5:1
0,52 ml Sammelgelpuffer
40 µl 10% SDS
4 µl N,N,N`,N`-Tetramethylethylendiamin (TEMED)
80 µl 10% Ammoniumperoxodisulfat (APS)
Transferpuffer
100 ml 10fach Laufpuffer
200 ml Methanol
ad 1000 ml A. bidest
Material und Methoden
37
Proteinbestimmung
Amidoschwarzlösung:
1,2 g Amidoschwarz
225 ml Methanol
225 ml A. bidest
50 ml Essigsäure
Entfärbelösung:
40% Methanol
10% Essigsäure
Eluierlösung:
800 ml Essigsäure
100 ml Ameisensäure
100 ml A. bidest
10 g Trichloressigsäure
RT-PCR
TE-Puffer (10x):
0,1 M Tris/HCl, pH 7,4
0,01 M EDTA
Material und Methoden
38
Probenpuffer:
0,025% Xylencyanol
0,025% Bromphenolblau
40% Sucrose
TAE-Puffer (50fach):
242 g Tris-base
57,1 ml Essigsäure
100 ml 0,5 M EDTA pH 8,0
in situ-Hybridisierung
10 x PBS (pH 7,4)
72 g NaCl
14,8 g Na2HPO4
4,3 g KH2PO4
800 ml A. bidest
pH auf 7,4 einstellen
ad 1 l A. bidest
1 M Tris/HCl, pH 7,0
121,1 g Tris
800 ml dH2O
pH auf 7,0 einstellen
ad 1 l A. bidest
Material und Methoden
39
0,5 M EDTA, pH 8,0
186,1g Ethylendinitrilotetraessigsäure x 2 H2O
800 ml A. bidest
20 g NaOH Plätzchen
pH auf 8,0 einstellen
ad 1 l A. bidest
Proteinase K Puffer
12,5 ml 1 M Tris/HCl, pH 7,0
2,5 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0
ad 250 ml A. bidest
100 µl Proteinase K (25 mg/ml)kurz vor der Inkubation der Schnitte hinzufügen
5 M NaOH
100 g NaOH
ad 500 ml A. bidest
Acetylierungslösung
4,6 g Triethanolaminhydrochlorid (TEA)
200 ml A. bidest
1,25 ml 5 M NaOH
ad 250 ml A. bidest
0,625 ml Essigsäureanhydrid kurz vor der Inkubation der Schnitte hinzufügen
Material und Methoden
40
1 M Na2HPO4, pH 6,5
89 g Na2HPO4 x H2O
400 ml dH2O
pH mit ortho-Phosphorsäure auf 6,5 einstellen
ad 500ml A. bidest
20 x SSC
175,3 g NaCl
88,2 g Natriumcitrat
800 ml A. bidest
pH auf 7,0 einstellen
ad 1 l A. bidest
50% Dextransulfat
50 g Dextransulfat
80 ml A. bidest
bei 50°C lösen
ad 100 ml A. bidest
2 x SSC
50 ml 20 x SSC
ad 500 ml A. bidest
Material und Methoden
41
Hybridisierungsmix
5000 µl Formamid
940 µl A. bidest
500 µl 1 M Na2HPO4 (pH 6,5)
2000 µl 20 x SSC
100 µl Hefe-tRNA (10 mg/ml)
1000 µl 50% Dextransulphat
200 µl 50 x Denhardt’s-Reagenz (Sigma)
250 µl Heringssperma (10 mg/ml, vor Zugabe 5 min kochen, dann abkühlen)
2 x SSC/ 50% Formamid
25 ml 20 x SSC
125 ml Formamid
ad 250 ml A. bidest
2 x SSC/ 50% Formamid
1,25 ml 20 x SSC
125 ml Formamid
ad 250 ml A. bidest
0,1 x SSC
2,5 ml 20 x SSC
ad 500 ml A. bidest
Material und Methoden
42
1 M Tris/HCl, pH 7,5
121,1 g Tris base
800 ml A. bidest
pH auf 7,5 einstellen
ad 1 l A. bidest
5 M NaCl
292,2 g NaCl
ad 1l A. bidest
Puffer 1, pH 7,5
100 ml 1 M Tris/HCl pH 7,5
30 ml 5 M NaCl
800 ml A. bidest
pH auf 7,5 einstellen
ad 1 l A. bidest
1 M Tris / HCl, pH 9,5
121,1 g Tris/HCl
800 ml A. bidest
pH auf 9,5 einstellen
ad 1 l A. bidest
Material und Methoden
43
1 M MgCl2
101,65 g MgCl2 x 6 H2O
ad 500ml A. bidest
Puffer 2
1 g Blocking-Reagenz
100 ml Puffer 1
Puffer 3, pH 9,5
100 ml 1 M Tris/HCl pH 9,5
20 ml 5 M NaCl
50 ml 1 M MgCl2
600 ml A. bidest
pH auf 9,5 einstellen
ad 500 ml A. bidest
Färbelösung
10 ml Puffer 3
34 µl NBT (100 mg/ml)
35 µl BCIP (50 mg/ml)
Material und Methoden
44
1 M Tris/HCl, pH 8,0
121,1 g Tris/HCl
800 ml dH2O
pH auf 8,0 einstellen
ad 1 l A. bidest
Zellkultur
Smooth Muscle Growth Medium-2
Basal Medium + Single Quots
Calcium-free Hanks‘ Solution (nach Koh et al., 1998)
125 mM NaCl
5,36 mM KCl
15,5 mM NaHCO3
0,336 mM Na2HPO4
0,44 mM KH2PO4
10 mM Glucose
2,9 mM Sucrose
11 mM Hepes
Enyzm Mix (in Calcium free Hanks’ Solution)
1,3 mg/ml Collagenase Typ II
0,5 mg/ml BSA
0,5 mg/ml Trypsin Inhibitor
0,07 mg/ml ATP
Material und Methoden
45
1 x HBSS
100 ml 10x HBSS
900ml A. bidest
steril filtrieren
2.1.6 Antikörper, Primer und Pharmakologische Subst anzen
Tab 2.1: Primärantikörper
Antigen Wirt Verdünnung Hersteller Bestellnummer
β-III Tubulin Maus 1:1000 Sigma T8660
ANO1 Kaninchen 1:250 Abcam ab53212
c-Kit Kaninchen 1:250 Santa Cruz sc-168
eNOS Kaninchen 1:1000 BD 610296
ERK (K-23) Kaninchen 1:1000 Santa Cruz sc-94
pERK (E-4) Maus 1:500 Santa Cruz sc-7383
Glattmuskelactin Maus 1:16.000 (IHC)
1:200.000 (WB) Sigma A5228
Hu C/D Maus 1:100 Invitrogen A21271
von-Willebrand-
Faktor Kaninchen 1:4000 Sigma F3520
Tab. 2.2: Seren und Sekundärantikörper
Antikörper/Serum Abkürzung Hersteller Verdünnung
biotinylierter goat anti rabbit bio-a-rb Vector Laboratories 1:300
biotinylierter horse anti mouse bio-a-ms Vector Laboratories 1:300
Peroxidase-gekoppelter sheep anti
mouse
ECL-ms GE Healthcare 1:1000
Normalserum aus Ziege NGS Vector Laboratories 7%
Normalserum aus Pferd NHS Vector Laboratories 3%
Avidin-Biotin-Komplex ABC Vector Laboratories 1:100
Material und Methoden
46
Tab. 2.3: Primer
Target Spezies Primer Sequenz Amplikon Accession
Number
5-HT2B Maus fw
rv
GGAAGCCACAGAAGACAAGC
CAGCCAAGGTGACTTCTTCC 149 bp NM_008311
ET-1 Maus fw
rv
CCAAGGAGCTCCAGAAACAG
TGTCCATCAAGGAAGAACAGG 137 bp NM_010104
HPRT Maus fw
rv
CGTGATTAGCGATGATGAACC
AATCCAGCAGGTCAGCAAAG 218 bp NM_013556
5-HT2B Ratte fw
rv
TCTCCTGATCTTCGCGGTAA
AGGGAAATGGCACAGAGATG 279 bp NM_017250
b2mg Ratte fw
rv
CCACCGAGACCGATGTATATG
GAAGATGGTGTGCTCATTGCT 199 bp NM_012512
c-Kit Ratte fw
rv
CTCCCTCATTGAGTGTGATGG
GAGTCCACGGATGTAGACACG 294 bp NM_022264
Tab. 2.4 Pharmakologische Substanzen
Substanz Abkürzung Hersteller
Adenosintriphosphat ATP AppliChem
BF-1 - Biofrontera
BW723C86 - Sigma
1-(3-Chlorphenyl)piperazin mCPP Sigma
L-NG-Nitroarginine methyl ester L-Name Sigma
Sumatriptan - Sigma
Stem Cell Factor SCF Sigma
Material und Methoden
47
2.2 Methoden
2.2.1 Tiermodell – Hypoxie
Zur Induktion der Pulmonalen Hypertonie wurden männliche Mäuse des Stammes NMRI für
einen Zeitraum von 28 Tagen in einer so genannten Hypoxiekammer gehalten. Diese
Plexiglasbox misst 90 x 30 x 65 cm (Breite x Höhe x Tiefe). Um einen Sauerstoffgehalt von
10% am Eingang der Kammer zu erreichen, wurde ein Luftgemisch aus der Umgebungsluft
und Stickstoff im Verhältnis von nahezu 1:1 hergestellt. Das Volumen des Gemisches betrug
etwa 200 l / h. Der Sauerstoffgehalt wurde permanent am Ausgang der Kammer
aufgezeichnet um aktivitätsbedingte Schwankungen sichtbar machen zu können und
sicherzustellen, dass der Sauerstoffgehalt nicht unter einen Wert von 8,5% absinkt. Am
zuleitenden Schlauch wurde der Sauerstoffgehalt mehrmals pro Woche auf den Sollwert von
10% kontrolliert.
Zur Bindung von überschüssigem CO2 wurde Atemkalk (Intersorb Plus, Intersurgical, Sankt
Augustin) verwendet. Dieser verfügte bei maximaler CO2-Bindung über eine Indikatorfärbung
und wurde bei Bedarf gewechselt. Darüber hinaus wurden in der Kammer Schalen mit
Kalziumchlorid (techn., VWR, Darmstadt) platziert, um den Gehalt der Luftfeuchtigkeit auf
50% - 70% zu halten.
Die Kammer wurde maximal einmal am Tag geöffnet, um der Tierpflege nachzukommen,
das Gewicht der Tier zu überwachen und Substanzen zu applizieren. Die Käfige der
Kontrolltiere, welche unter normoxischen Bedingungen gehalten wurden, befanden sich im
gleichen Raum.
2.2.2 Perfusion und histologische Aufarbeitung der Lunge
Zur Gewebegewinnung wurden die Tiere zuerst mit einem Gemisch aus Ketamin (0,5%,
Heinrich Fromme, Warburg) und Xylazin (0,05%, Ceva Tiergesundheit, Düsseldorf) betäubt.
Nach einer zehnminütigen Wartezeit wurden die Tiere durch starkes Kneifen der Hinterpfote
auf Schmerzunempfindlichkeit geprüft. War diese gegeben, wurde ein Fellschnitt vom
Abdomen bis auf Höhe der Speicheldrüsen durchgeführt. Diese Drüsen wurden mit Pinzetten
getrennt, so dass die Trachea sichtbar wurde. Nachdem die die Trachea umgebende
Muskulatur ebenfalls mit Pinzetten entfernt wurde, wurde die Trachea über eine eingeführte
Kanüle mit 0,9% NaCl geflutet, um ein Kollabieren der Lunge bei der späteren Eröffnung der
Brusthöhle zu vermeiden. Nach etwa 20 s wurde die Trachea abgeklemmt.
Danach wurde die Bauch- bzw. Brusthöhle geöffnet und über den Lungenkreislauf
transkardial perfundiert. Dazu wurde eine Kanüle (26 G x ½´´, B. Braun Medical,
Emmenbrücke, CH) in den rechten Ventrikel eingeführt und das linke Atrium angeschnitten,
Material und Methoden
48
um den Ablauf der Flüssigkeit zu gewährleisten. Das Blut wurde für etwa 1 min mit Saline
ausgewaschen, danach wurde der Lungenkreislauf mit eiskaltem Fixativ (4% PFA)
durchspült.
Nach etwa 10 min wurde der linke Lobus entnommen und über Nacht bei 4°C
immersionsfixiert. Nach weiteren 24 h in 0,1 M PB folgte der erste Dehydrierungsschritt in
70% EtOH. In der Folge wurde weiter entwässert (je 24 h in 98% EtOH und Isopropanol).
Darauf folgte eine Inkubation von 2 h in Isopropanol bei 60°C, welches anschließend 1:1 mit
Paraffin (Sherwood Medical, Sulzbach) aufgefüllt und über Nacht bei 60°C inkubiert wurde.
Durch das darauf folgende Ersetzen des Isopropanol-Paraffin-Gemisches durch reines
Paraffin und weiteres dreimaliges Austauschen des Paraffins nach jeweils zweistündiger
Inkubation bei 60°C, wurde dem Gewebe jegliches Iso propanol entzogen. Das Gewebe
konnte schließlich in reinem Paraffin eingebettet werden. Von den Präparaten wurden am
Mikrotom (Typ RM 2145, Leica, Wetzlar) Schnitte mit einer Stärke von 7 µm angefertigt, die
auf Objektträger aufgezogen wurden. Diese wurden entweder selbst hergestellt oder von
Frau Kathrin Schuster, Frau Petra Jergolla und Frau Renate Scholl angefertigt.
2.2.3 Untersuchung auf Hypertrophie des rechten Herzventrikels
Eine Folge der Hypoxiebehandlung und Merkmal der PH ist die Hypertrophie des rechten
Herzventrikels. Um zu überprüfen, ob bei den Tieren diese Pathologie vorlag, wurde das
Herz entnommen und mit einem Frontalschnitt in zwei Teile, so dass in jedem Gewebestück
beide Ventrikel, getrennt vom Septum, zu sehen waren. Mit einer feinen Schere wurde die
rechte Herzwand abgetrennt. Die Gewebestücke wurden mit einer Feinwaage (Sartorius
Stedim Biotech S.A., Frankreich) gewogen und das Gewicht des rechten Ventrikels in
Relation zum Gewicht des linken Ventrikels sowie des Septums gesetzt (RV/LV+S).
2.2.4. Immunhistochemische Färbung von Gewebeschnitten der Lunge
Zur Untersuchung der Muskularisierung der intrapulmonalen Blutgefäße wurden die
Gewebeschnitte mit einem Antikörper gegen Glattmuskelaktin (α-smooth muscle actin,
α-SMA, Sigma Aldrich, München) behandelt. Dafür wurden die Schnitte zunächst zweimal
10 min in Rotihistol entparaffiniert und danach in einer absteigenden Alkoholreihe (je 2 min;
dreimal Isopropanol, einmal 96%, einmal 80% und einmal 70% Ethanol) rehydriert.
Anschließend wurden die Schnitte für 15 min in 3% H2O2 (in MeOH) inkubiert. Danach
erfolgten Waschschritte in VE-H2O sowie in 0,01 M PBS für je 5 min. Daraufhin wurde eine
Trypsinlösung (0,17%, Digest All-2 Kit, Invitrogen) aufgetragen und für 10 min bei 37°C
inkubiert. Nach erneutem Waschen in 0,01 M PBS (5 min) wurde mit der Inkubation in 10%
Normalserum (normal horse serum, NHS, Vector Laboratories, Axxora, Lörrach) für 30 min
fortgefahren, wodurch unspezifische Bindestellen abgedeckt werden sollten. Nach dieser
Material und Methoden
49
Inkubation wurde der Primärantikörper (ms anti α-SMA, 1:16.000 in PBS) aufgetragen und
üN bei 4°C inkubiert.
Am nächsten Tag wurde nach dreimaligem Waschen mit 0,01 M PBS ein Biotin-gekoppelter
Sekundärantikörper gegen Immunglobuline der Maus (bio-anti ms, Vector Laboratories,
Axxora, Lörrach) in einer Verdünnung von 1:300 in (PBS) aufgetragen und 45 min inkubiert.
Gleichzeitig wurde der Avidin-Biotin-Komplex (ABC, Vector Laboratories, Axxora,
Lörrach, 1:1:100 in PBS) angesetzt. Die Schnitte wurden nach der Inkubation erneut dreimal
mit 0,01 M PBS gewaschen, der ABC aufgetragen und wiederum für 45 min inkubiert.
Anschließend wurde zunächst mit 0,01 M PBS und danach mit 0,1 M PB gewaschen. Zur
Detektion des Primärantikörpers diente eine Reaktion, bei der durch Substratzugabe
(3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid-dihydrat, DAB, Fluka) ein braunes Phenazinpolymer
gebildet wird. Die Reaktion wird durch Peroxidasen, welche an Biotin gekoppelt sind,
katalysiert und durch Wasserstoffperoxid verstärkt. Durch das Polymer werden die
Strukturen, gegen die sich der Primärantikörper richtet, sichtbar.
Es wurden zunächst 2 ml der 7%igen DAB-Stammlösung in 200 ml 0,1 M PB gelöst und
filtriert. In dieser Lösung wurden die Schnitte für 2 min vorinkubiert, bevor 66,6 µl
Wasserstoffperoxid hinzugegeben wurden und für weitere 4 min inkubiert wurde. In dieser
Zeit erfolgte die Braunfärbung. Die Reaktion wurde schließlich in eiskaltem 0,1 M PB
gestoppt. Daraufhin wurden die Schnitte dreimal mit VE-H2O gewaschen. Die
Gewebeschnitte wurden im Anschluss über eine aufsteigende Alkoholreihe (je 2 Min; einmal
70% EtOH, einmal 80% EtOH, einmal 98% EtOH und viermal Isopropanol) dehydriert und
mit Euparal eingedeckt.
2.2.5. Auswertung der immunhistochemisch gefärbten Gewebeschnitte der Lunge
Zur histologischen Auswertung wurde ein Schnitt pro Tier verwendet. Der Schnitt wurde
unter Verwendung des 2,5x Objektivs mikroskopiert (Axioskop 2, Zeiss), komplett
abfotografiert (3 CCD Color Camera, Sony; Diskus, Hilgers, Winterberg) und digital
gespeichert.
Die Bilder wurden danach mit Hilfe des Grafikprogramms GIMP 2.0 (Open Source Freeware)
weiterbearbeitet. Mit Hilfe von Dipl. Biol. Björn Röder wurden die Stempel modifiziert, welche
in seiner Diplomarbeit verwendet wurden. So wurden runde Stempel mit einem grünen und
einem roten Quadrat von je 9 px x 9 px in der Mitte erstellt. Die Stempel hatten einen
Gesamtdurchmesser von 9 px und 18 px, was einem Durchmesser von 25 µm bzw. 50 µm
im Präparat entsprach. Mit diesen Stempeln wurden α-SMA-positive Blutgefäße markiert.
Material und Methoden
50
Zudem wurden die Flächen des Hintergrunds sowie muskularisierter Atemwege blau
markiert, um sie schließlich aus der Berechnung der Gewebefläche subtrahieren zu können.
Das Zählen der Blutgefäße sowie die Kalkulation der Gewebefläche erfolgte über ein Tool,
welches von Dipl. Biol. Björn Röder geschrieben wurde und für diese Arbeit gemeinsam
modifiziert wurde. Es wurde in der Programmiersprache Python (OpenSource Freeware)
geschrieben und nutzt das Modul Python Imaging Library sowie Teile des Pakets Image
Magick (ImageMagick Studio LLC).
Das bearbeitete Bild wird im .xcf Format gespeichert. Das Programm konvertiert das Bild in
eine .bmp Datei und scannt in der Folge die Bilddatei im Abstand von 9 px, wobei es die
grünen bzw. roten Quadrate in den Stempeln erkennt und die blaue Fläche von der
Gesamtfläche subtrahiert. Man erhält somit für jedes Bild Angaben über die Anzahl der
Blutgefäße mit einem Durchmesser ≤25 µm, zwischen 26 µm - 50 µm sowie die Fläche des
untersuchten Lungengewebes in mm².
2.2.6 Semiquantitative Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
Mit Hilfe der semiquantitativen RT-PCR kann die Regulation der Genexpression innerhalb
eines Gewebes auf Ebene der mRNA untersucht werden. Hierzu wird die RNA durch die
Reverse Transkriptase in komplementäre DNA (cDNA) übersetzt. Die anschließenden PCRs
werden mit aufsteigender Konzentration der Primer durchgeführt, sodass eine Abhängigkeit
zwischen den PCR-Produkten und der Primerkonzentration hergestellt wird. Durch einen
Vergleich dieser Abhängigkeit können Unterschiede in der Genexpression analysiert werden.
Für die Gewebepräparation wurde an den Mäusen eine zervikale Dislokation vorgenommen,
der linke Lobus der Lunge entnommen und dieser in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die
Isolierung der RNA erfolgte innerhalb einer Woche nach der Präparation. Das Gewebe
wurde dazu in 1 ml Trizol (Invitrogen, Darmstadt) /50-100 mg Gewebe homogenisiert. Nach
einer Inkubation von 5 min bei RT wurden 200 µl Chloroform/ml Trizol zugegeben. Die
Proben wurden kräftig geschüttelt und für 3 min bei RT inkubiert. Darauf folgte eine
Zentrifugation für 15 min bei 12000 rcf und 4°C. Di e obere, wässrige Phase, welche die RNA
enthält, wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Zur Fällung der RNA wurden 500 µl
Isopropanol/ml Trizol zur Probe gegeben. Diese wurde für 15 s geschüttelt und für 10 min bei
RT inkubiert. Um die RNA zu pelletieren wurden die Proben für 10 min bei 12000 rcf und 4°C
zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und verworfen. Das Pellet wurde in
sterilem 70% EtOH gewaschen und auf einem Vortex gelöst. Es folgte eine Zentrifugation für
5 min bei 7500 rcf und 4°C. Der Überstand wurde abg enommen und das Pellet im
Reaktionsgefäß mit geöffnetem Deckel getrocknet (10 - 20 min bei RT). Das Pellet wurde in
A. bidest resuspendiert und anschließend für 10 min bei 60°C inkubiert und daurch gelöst.
Material und Methoden
51
Die RNA Konzentration wurde photometrisch bei 260 nm bestimmt. Dazu wurde die RNA
1:50 in TE-Puffer verdünnt. Die Proben wurden aliquotiert und bei –20°C gelagert.
Die cDNA-Synthese wurde mit Hilfe eines Kits (RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit,
(Fermentas, St. Leon-Rot) durchgeführt. Es wurden 15 µg totale RNA eingesetzt. Dann
wurden 3 µl random hexamer primer zugegeben und der Ansatz auf ein Volumen von 36 µl
mit A. bidest aufgefüllt. Der Ansatz wurde für 5 min bei 70°C inkubiert. Danach erfolgte die
Zugabe von 12 µl 5x Buffer M-MuLV RT, 3 µl RiboLock (20 U/µl) und 6 µl dNTP-Mix
(10 mM). Dieser Ansatz wurde für 5 min bei 25°C ink ubiert. Zuletzt wurden 3 µl Reverse
Transkriptase (RT) zugegeben. Beim Ansatz der Negativkontrolle wurde anstelle der RT
Wasser zugegeben (-RT).
Die folgenden Inkubationen wurden im RoboCycler (Stratagene, Santa Clara, CA, USA)
durchgeführt:
- 10 Min bei 25°C inkubieren
- 60 Min bei 42°C inkubieren
- 10 Min bei 70°C inkubieren
Nach der Reaktion wurden Aliqouts angefertigt, die bei –20°C gelagert wurden.
2 µl der hergestellten cDNA wurden pro Ansatz als Template verwendet. Pro Ansatz kamen
noch folgende Reagenzien hinzu:
- 2 µl 10x Taq-Puffer (+ (NH4)SO4 ; – MgCl2)
- 2 µl dNTP (2 mM)
- 1,5 µl MgCl2 (25 mM)
- 0,2 µl Taq-Polymerase (5 U/µl)
- 1 µl Referenz (forward) (2 pmol/µl)
- 1 µl Referenz (reverse) (2 pmol/µl)
- 9,3 µl A. bidest
- 1 µl Target (forward)
- 1 µl Target (reverse)
Für jede Probe wird eine Kontrolle (-RT; Zugabe von -RT statt cDNA) angefertigt.
Material und Methoden
52
Das Programm des Cyclers wurde wie folgt eingestellt:
1. 5 min 95°C
2. Denaturierung 45 s 95°C
Annealing 45 s 61°C
Elongation 15 s 72°C
Schritt 2 wurde 28x (ET-1) oder 35x (5-HT2B) wiederholt. Danach wurden die Ansätze bis
zum Auftragen auf das Gel bei 4°C gehalten.
Es wurden 3 g Agarose in 150 ml 1x TAE-Puffer gelöst und in einer Mikrowelle aufgekocht,
um ein Agarosegel (2%) herzustellen. Zu dieser Lösung wurden 10 µl EtBr (100 mg/ml)
gegeben und in eine Gelkammer mit aufgesetztem Kamm gegossen. Als Laufpuffer wurde
1x TAE-Puffer verwendet, der das komplette Gel bedeckte.
Bevor die Proben auf das Gel aufgetragen wurden, wurden 4 µl Probenpuffer (6x)
zugegeben. Um die Amplikongröße zu definieren, wurde ein DNA Marker aufgetragen
(Smart Ladder, Eurogentec, Köln). Das Gel lief bei einer konstanten Stromstärke von
120 mA. Die Aufnahmen der Gele wurden mit dem Programm Biodoc von Biometra
angefertigt.
Die Quantifizierung der PCR-Produkte erfolgte mit Hilfe des Computerprogramms Tina 2.09.
Die Farbe der Gelbilder wurden invertiert und die Intensität der Schwärzung der Banden
bestimmt. Dazu wurde zu jeder Primerkonzentration eine immer gleich große area of interest
verwendet und der lokale Hintergrund von jeder Bande separat abgezogen. Die Intensität der
Banden des zu untersuchenden Proteins wurde über die Intensität der Banden von HPRT
normalisiert, um das Verhältnis der Banden zu verschiedenen Primerkonzentrationen zu
erhalten. Aus den Werten ergab sich eine Ausgleichskurve. Durch Zwei-Wege ANOVA
wurde überprüft, ob sich die Genexpression im Gewebe verschiedener Versuchsgruppen
statistisch signifikant unterschied.
Modifikationen für radioaktive PCR
Die PCR wurde wie oben (siehe 2.2.6) beschrieben durchgeführt. Den Ansätzen wurden
zusätzlich 0,125 µl [α-33P] dCTP (Hartmann Analytic, Braunschweig) hinzugefügt. Dies
entsprach einer Aktivität von 1,25 µCi, bzw 46,25 KBq pro Ansatz. Das Agarosegel wurde
ohne die Zugabe von EtBr hergestellt.
Nach Beendigung der Gelelektrophorese wurde das Gel in einem Geltrockner (Bio-Rad,
München) üN getrocknet (10 h, 60°C). Während des Tr ocknungsprozesses besteht die
Gefahr, dass DNA aus dem Gel tritt. Um dies zu verhindern wurde das Gel auf einer
Nylonmembran (Amersham Hybond–N+, GE Healthcare, München) platziert. Die
Material und Methoden
53
getrockneten Gele sowie die Nylonmembranen wurden in Frischhaltefolie verpackt, die
Image-Platte aufgelegt und in der Bio Max Kassette bei 4°C gelagert. Die Expositionsdauer
richtete sich nach der Stärke der Strahlung und betrug zwei bis drei Stunden.
Die Auswertung der Image-Platte erfolgte im Laserscanner (FLA3000, Fujifilm, Düsseldorf).
Der Scan wurde mit dem Programm Bas Reader 3.14 angefertigt, die Auswertung wurde mit
dem Programm Aida Image Analyse 4.03 durchgeführt. Dies geschah analog zur
beschriebenen Auswertung mit dem Programm Tina 2.09 (s.o.).
2.2.7 Western Blot
Das Lungengewebe für die Proteinanalyse mittels Western Blot wurde wie unter 2.2.2.
beschrieben gewonnen. Allerdings wurde lediglich das Blut mit 0,9% NaCl Lösung aus dem
Lungenkreislauf gewaschen und nicht mit 4% PFA fixiert. Das native Gewebe wurde in
flüssigem Stickstoff schockgefroren und innerhalb einer Woche aufgearbeitet.
Dazu wurden die Lungen in 1 ml TDL-Puffer aufgenommen und mit Hilfe eines Ultra Turrax
(T25 basic, IKA Laboratories) homogenisiert. Nach 30 min wurden die Proben bei 12.000 rcf
für 10 min bei 4°C zentrifugiert. Von dem entstande nen Überstand wurden 500 µl
abgenommen und das Pellet verworfen. Die Überstände wurden mit 500 µl zweifach
konzentriertem Laemmli-Puffer gemischt, aliquotiert und bei -20°C gelagert.
Um die Proteinkonzentration zu ermitteln, wurde eine Proteinbestimmung mit Amidoschwarz
durchgeführt. Alle Arbeitsschritte erfolgten bei RT. Es wurden 10 µl der Proteinlösung auf
einen Celluloseacetat-Streifen (Sartorius Stedim Biotech S.A., Frankreich) aufgetragen,
wobei zur Bestimmung des Leerwerts 10 µl Laemmli Puffer verwendet wurden. Nachdem die
Proben getrocknet waren (ca. 2 min) wurde die Membran 10 min in Amidoschwarz (Carl
Roth, Karlsruhe) inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit A. bidest (je 30 s) wurde der
Streifen mit Entfärbelösung behandelt, bis die Hintergrundfärbung auf dem Streifen
verschwunden war. Der Streifen wurde getrocknet und die Bereiche, auf denen die einzelnen
Proben aufgetragen wurden, wurden aus der Membran geschnitten und in ein
Schnappdeckelglas mit 3 ml Eluierlösung überführt. Um die Teile der Streifen aufzulösen,
wurden die Gläser für 20 min auf einem Schüttler platziert. Danach wurde die Extinktion der
Proben bei 630 nm gemessen und der Messwert der Probe, die nur Laemmli-Puffer enthielt,
abgezogen. Mit Hilfe einer BSA Standardgeraden konnte nun der Proteingehalt bestimmt
werden.
Zur Proteinauftrennung wurden 10%ige Polyacrylamid-Gele mit einer Dicke von 0,75 mm
verwendet. Zwischen zwei Glassplatten wurde zuerst das Trenngel gegossenund direkt mit
A. bidest gesättigtem n-Butanol überschichtet. Nachdem das Trenngel polymerisiert war,
Material und Methoden
54
wurde das n-Butanol entfernt, das Sammelgel gegossen und der entsprechende Kamm
eingesetzt. War auch das Sammelgel polymerisiert, wurde der Kamm entfernt und das Gel in
den Puffertank gehangen. Der Tank wurde dann mit Laufpuffer gefüllt und die Proben in die
Taschen des Gels pipettiert, wobei die aufgetragene Proteinmenge 30 µg betrug. Zur
Größendetektion wurde ein Proteinmarker genutzt (Precision Plus Protein All Blue
Standards, Bio-Rad, München) Um die Proteine im Gel aufzutrennen, wurde eine
Stromstärke von 40mA für etwa 60 min angelegt. Danach wurde das Gel von den
Glasscheiben gelöst und in Transferpuffer inkubiert (10 min). Gleichzeitig wurde die
Blotmembran (PVDF-Membran, Carl Roth, Karlsruhe) für 1 min in Methanol aktiviert und
dann 10 min in Transferpuffer inkubiert. Das Blotsandwich wurde entsprechend der
Anordnung in Abb. 2.1 zusammengesetzt. Das Blotten erfolgte bei 4°C und 200 mA für
90 min.
Nach dem Blotten wurden die Bereiche der Membran, in denen sich die zu quantifizierenden
Proteine befanden, ausgeschnitten. Die restlichen Teile wurden in TBS-T Puffer überführt
und bei 4°C gelagert üN gelagert. Der andere Teil d er Membran wurde für 60 min in
Blockpuffer (BP) inkubiert. Danach wurde der BP verworfen und die Membran üN in der
Primärantikörperlösung (in BP) bei 4°C und auf eine m Schüttler inkubiert. Am nächsten Tag
wurde der Blot zunächst dreimal mit TBS-T Puffer gewaschen (2 x 5 min, 1 x 10 min) und
dann in HRP-gekoppeltem Sekundärantikörper (GE Healthcare, München) 1:1000 in BP)für
90 min bei RT und auf einem Schüttler inkubiert. Danach wurde der Blot einmal kurz in
TBS-T und dreimal in PB gewaschen (2 x 5 min, 1 x 10 min). Die Detektion des
Sekundärantikörpers erfolgte wie unter 2.2.3. beschrieben unter Verwendung der DAB-
Reaktion.
Kathode
Schwamm
Whatman
Gel
Membran
Whatman
Schwamm
Anode
Abb. 2.1: Aufbau des Blot-Sandwich
Material und Methoden
55
Dieser Teil des Blots wurde fotografiert und danach mit transparentem Klebeband mit den
restlichen Teilen zusammengefügt. Dadurch war es möglich den gesamten Blot mittels
Coomassie zu färben. Dies diente zur Quantifizierung der aufgetragenen Proteinmenge und
somit als Referenz. Die Auswertung der Blots erfolgte analog zur Auswertung der RT-PCR
(siehe 2.2.5), wobei der Wert für die zu quantifizierende Bande in Relation zum Wert der
gesamten Spur in der Coomassie-Färbung gesetzt wurde. Für eine bessere Darstellung der
Ergebnisse wurden die Gruppenwerte so normiert, dass der Wert der Kontrollgruppe den
Wert 1 erhält.
2.2.8 in situ-Hybridisierung
Mit der in situ-Hybridisierung (ISH) kann das RNA Transkript eines Proteins auf zellulärer
Ebene nachgewiesen werden. Dies sollte für den 5-HT2B Rezeptor erfolgen. Die Herstellung
der erforderlichen Plasmide erfolgte bereits in vorangegangenen Arbeiten am Lehrstuhl für
Tierphysiologie, so dass direkt mit der Sondensynthese begonnen werden konnte. Es
standen drei Plasmide mit unterschiedlichen Zielsequenzen zur Verfügung, von denen
jedoch in der Folge nur noch ein Plasmid (Plasmid 3) verwendet wurde, da mit der daraus
hergestellten Sonde die besten Ergebnisse erzielt wurden.
Alle Arbeiten erfolgten in einer möglichst RNase-freien Umgebung. Dazu wurde der
Arbeitsplatz mit RNase Zap (Sigma-Aldrich, München) gereinigt und ausschließlich sterile
Materialien verwendet.
Die ISH wurde an nativem Rattengewebe durchgeführt. Zur Betäubung der Tiere wurde ein
gemischtes Anästhetikum aus Ketamin (1,6%, Heinrich Fromme, Warburg) und Xylazin
(0,3%, Ceva Tiergesundheit, Düsseldorf) verwendet. Nachdem die Tiere nachweislich
schmerzfrei waren, wurden sie mit Hilfe einer Guillotine dekapitiert. Es wurde sowohl die
Lunge als auch der verhornte Teil des Magens (Fundus) entnommen und in Tissue-Tek
Freezing Medium (Jung, Leica, Wetzlar) eingebettet. Dazu wurde Isopentan mittels
Trockeneis auf eine Temperatur von ca. -60°C abgekü hlt und das mit Einbettmeduim
überzogene Gewebe darin für etwa 30 s eingetaucht. Das Gewebe wurde bis zur
Verwendung bei -80°C gelagert. Es wurden Gefriersch nitte mit einer Stärke von 30 µm
hergestellt (Gefriermikrotom CM3050, Leica, Wetzlar). Diese wurden entweder selbst oder
von Frau Kathrin Schuster angefertigt.
Für die Synthese der RNA-Sonden wurden die Plasmide zunächst passend zur Lage der
entsprechenden T3/T7-Primersequenzen linearisiert. Danach erfolgte die Fällung der DNA
mit Hilfe der Phenol/Chloroform Methode.
Material und Methoden
56
Die Linearisierung der DNA wurde überprüft, indem 1 µl aus dem Ansatz auf ein 1%iges
Agarosegel aufgetragen wurde und mit dem Marker verglichen wurde. Zudem konnte die
Konzentration der DNA durch einen Abgleich mit dem Marker geschätzt werden. Für die
Sondensynthese wurden 1 µg DNA. Zum Ansatz wurden noch 5x Transkriptionspuffer (4 µl),
10x DIG-Labeling Mix (2 µl), T3- bzw. T7-Polymerase (2µl), sowie 0,5 µl RNase Inhibitor
(40 U/µl) zugegeben und mit A. bidest auf 20 µl aufgefüllt (sämtliche Chemikalien: Roche,
Mannheim). Die Synthese wurde für 2 h bei 37°C durc hgeführt und durch Zugabe von 2 µl
0,5 M EDTA gestoppt. Um die nicht in die Sonden eingebauten DIG-Moleküle aus dem
Ansatz zu entfernen wurde eine Dialyse durchgeführt. Dazu wurde eine Petrischale mit
A. bidest gefüllt und ein Stück Filterpapier (0,025 µm, White VSWP, Millipore, Schwalbach)
darauf ausgelegt. Die gesamte Probe wurde auf den Filter pipettiert und dann für 15 min
dialysiert. Danach wurde die Probe wieder abgenommen, 1:1 (v/v) mit Formamid verdünnt
und bei -20°C gelagert.
Zu Beginn der ISH wurden die Gewebeschnitte aufgetaut und in PBS überführt. Darauf folgte
die Inkubation in Proteinase K (für 10 min bei 37°C . Der Verdau wurde durch eine
fünfminütige Inkubation in 4% PFA gestoppt und die Schnitte danach zweimal in A. bidest
gewaschen (5 min). Danach folgte die Inkubation in der Acetylierungslösung für 10 min bei
RT. Nach zwei weiteren Waschschritten (1x 5 min PBS, 1x 5 min A. bidest) wurde der
Hybridisierungsmix aufgetragen, der jedoch noch keine Sonden enthielt. Diese Präinkubation
erfolgte bei 45°C für 30 min. Danach wurde der Hybr idisierungsmix auf die Schnitte
gegeben, welcher die entsprechenden Sonden enthielt. Diese Inkubation erfolgte bei 45°C
üN.
Am nächsten Tag erfolgten zunächst Waschschritte in SSC. Zuerst wurde zweimal in
2x SSC für 15 min gewaschen. Die weiteren Schritte wurden bei 55°C für je 15 min
durchgeführt. Zuerst wurde 2x SSC / 50% Formamid verwendet, danach erfolgte das
Waschen mit 0,1x SSC / 50% Formamid. Zuletzt wurden die Schnitte zweimal in 0,1 SSC
gewaschen. Daraufhin erfolgte eine zweifache Inkubation in Puffer 1 für je 10 min bei RT.
Zur Blockierung unspezifischer Bindestellen wurden die Schnitte dann für 30 min in Puffer 2
inkubiert. Zuletzt wurde der Antikörper gegen DIG in einer Verdünnung von 1:2000 (in
Puffer 2) aufgetragen und dieser üN auf den Schnitten belassen (4°C).
Am folgenden Tag wurden die Schnitte zunächst in Puffer 1 überführt (2x 10 min, RT). und
danach für 10 min in Puffer 3 inkubiert. Als nächstes wurde die Färbelösung aufgetragen und
die Schnitte im Dunkeln belassen. In der Folge wurden die Schnitte alle 15 min auf eine
auftretende Färbung untersucht. Zumeist dauerte die Inkubation in der Färbelösung ca. 3 h,
Material und Methoden
57
dann war eine zufriedenstellende Färbeintensität erreicht und die Reaktion wurde in
TE-Puffer abgestoppt. Zur Lagerung wurden die Schnitte luftgetrocknet und in einem
Schnittkasten aufbewahrt. Um die Schnitte mikroskopieren zu können wurde TE-Puffer
auftragen und ein Deckglas aufgelegt.
2.2.9 Immunohistochemische Färbung von Gewebeschnitten des Fundus des Rattenmagen
Zur Gewebegewinnung wurde vorgegangen wie unter 2.2.2 beschrieben, allerdings wurden
die Ratten über den linken Herzventrikel und somit über den Körperkreislauf perfundiert. Die
Schnitte wurden in einer Stärke von 9 µm angefertigt.
Die Methode der immunhistochemischen Färbung wurde im Vergleich zur unter 2.2.2
beschriebenen Vorgehensweise dahingehend geändert, dass weder Trypsin noch H2O2 zum
Einsatz kamen. Bei Bedarf erfolgte vor dem Serumblock eine Inkubation in 0,1%
Collagenase (Typ 1, Worthington, Lakewood, NJ, USA) für 10 min bei RT. Zudem wurden
Fluoreszenz-gekoppelte Sekundärantikörper verwendet (vgl. Tab 2.2). Die Schnitte wurden
in Vectashield Mounting Medium eingedeckt.
2.2.10 Anlegen der Primärkultur des Fundus des Rattenmagen
Zur in vitro Untersuchung von Zellen des Rattenfundus wurden Primärkulturen angelegt.
Dazu wurden Tiere im Alter von 4-6 Tagen verwendet. Der Kopf wurde mit einer groben
Schere abgetrennt und das Abdomen eröffnet. Der Fundus wurde mit einer feinen Schere
herausgetrennt, in Calcium-freier Hanks Lösung aufgenommen und für 20 min bei 37°C darin
equilibriert. Danach wurde der Ansatz zentrifugiert (3 min, 163 rcf), die Enzymlösung
zugegeben und für 60 min bei 37°C inkubiert.
Die Zellen wurden später auf Collagen-beschichtete Coverslips ausgesät. Dazu wurden die
Coverslips (Thermo Scientific, Menzel, Braunschweig) mit einer Collagenlösung (1 mg/ml,
Beckton Dickinson, Heidelberg) bedeckt und für 60 min bei 37°C inkubiert. Danach wurde die
Collagenlösung abgenommen und die Coverslips wurden dreimal mit vorher auf 37°C
erwärmtem PBS gewaschen und bis zur Verwendung im Brutschrank belassen.
Der Verdauungsansatz wurde nach der Inkubation zentrifugiert (3 min, 163 rcf) und die
Enymlösung wurde abgenommen. Das Pellet wurde in Calcium-freier Hanks Lösung
gewaschen. Dieser Schritt erfolgte dreimal. Danach wurde das Gewebe trituriert, bis eine
leicht trübe Zellsuspension entstanden war. Diese wurde zuerst mit einem 100 µm Cell
Strainer, dann mit einem 40 µm Cell Strainer von Zelltrümmern befreit. Daanch wurde die
Suspension erneut zentrifugiert und in Medium (SMGM-2, Clonetics, Lonza, Köln)
aufgenommen. Diesem wurde noch SCF (10 ng/ml, Sigma Aldrich, München) sowie
Antibiotikum (0,25% Penicillin & Streptomycin, Sigma Aldrich, München) hinzugefügt. Zuletzt
Material und Methoden
58
wurden etwa 60.000 Zellen je 30 mm Coverslip ausgesät. Die Zellen wurden bei 37°C und
95% O2 gehalten. Es erfolgte täglicher Mediumwechsel, wobei vor der Zugabe des frischen
Mediums mit PBS (37°C) gewaschen wurde. Ab dem zwei ten Tag wurde kein Antibiotikum
verwendet.
2.2.11 Calcium Imaging von Primärkulturen des Fundus des Rattenmagen
Mit der Methode des Calcium Imaging kann die funktionelle Expression von Rezeptoren
überprüft werden. Als Calcium Indikator kommt die grün fluoreszierende Substanz
Fura-2/AM (Sigma Aldrich, München) zum Einsatz. Dieses bindet an freies Calcium in der
Zelle. Kommt es zum Einstrom von Calcium ins Zytoplasma erhöht sich dementsprechend
die Menge des an Calcium gebundenen Fura-2/AM. Da dieses (340 nm) ein anderes
Exitationsmaximum als freies Fura-2/AM aufweist (380 nm), kann aus der Ratio der beiden
Wellenlängen auf die Aktivierung von Rezeptoren in Folge von Ligandenbindung
geschlossen werden.
Durch Zugabe von Fura-2/AM in das Medium (Endkonzentration 5 µM) und einer
einstündigen Inkubation bei 37°C wurden die Zellen mit dem Calcium Indikator beladen.
Danach wurden die Zellen dreimal mit HBSS gewaschen. Daraufhin wurden die Zellen an
einem Zeiss Axiovert 200 mit Polychrom V Monochromator (Till Photonics, Gräfelfing)
gemessen. Dabei werden die Zellen im Abstand von 0,5 s alternierend bei 340 nm und 380
nm angeregt. Aus den Einzelwerten der Emissionen wird dann der Quotient gebildet
(340/380 nm), welcher Auskunft über die Calciumslevel innerhalb der Zelle gibt.
2.2.12 Immunzytochemische Färbung von Primärkulturen des Fundus des Rattenmagen
Die Charakterisierung der Primärkultur erfolgte immunzytochemisch. Dafür wurden die Zellen
wie unter 2.2.11 auf 10 mm Deckgläsern ausgesät und kultiviert Es wurden verschiedene
Antikörper verwendet, um die Zelltypen zu bestimmen (siehe Tab. 2.1). Die Zellen wurden
mit 4% PFA fixiert (5 min, RT) und mehrfach mit PBS gewaschen. Der Serumblock erfolgte
in 0,1% Triton-X100 (Sigma Aldrich, München) für 45-60 min (RT). Die Primärantikörper
wurden über Nacht bei 4°C inkubiert.
Am nächsten Tag wurden die Präparate zunächst dreimal in PBS gewaschen. Darauf folgte
die Inkubation im Sekundärantikörper für 45 min bei RT. Um die Zellkerne der Zellen zu
färben wurde Hoechst 33258 (Sigma Aldrich, München) verwendet. Die Konzentration betrug
10 µg/ml (in PBS) und die Inkubation erfolgte für 20 min. Nach einem erneuten Waschschritt
wurden die Deckgläser mit VectaShield Eindeckmedium (Vector Laboratories, Axxora,
Lörrach) auf Objektträger aufgezogen und bei 4°C ge lagert.
2.2.13 Vitalfärbung von Primärkulturen des Fundus des Rattenmagen
Material und Methoden
59
Neben den immuncytochemischen Färbungen wurden auch Vitalfärbungen durchgeführt.
Zum Nachweis von ICC wurde Methylenblau (Chroma, Köngen) verwendet (Mikkelsen et al.,
1988). Dazu wurden die Zellen für 45 min mit einer 50 µM Methylenblaulösung (in Calcium-
freier Hanks Lösung) bei 37°C inkubiert. Danach erf olgten drei Waschschritte in Hanks
Lösung und die Zellen wurden in Vectashield Mounting Medium (Vector Laboratories,
Axxora, Lörrach) eingedeckt.
Ergebnisse
60
3. Ergebnisse
In dieser Arbeit sollte ein Tiermodell für Pulmonale Hypertonie (PH) in dem
Modellorganismus Maus etabliert und charakterisiert werden. Besonders von Interesse
waren dabei Prozesse, die im Zusammenhang mit dem 5-HT2B Rezeptor stehen. Neben
einer bereits beschriebenen Funktion bei der Entstehung der PH (Launay et al., 2002), wird
dem Rezeptor eine wichtige Rolle in der Pathogenese der Migräne zugesprochen
(Johnson et al., 2003). Daher war es von besonderer Bedeutung, Substanzen, die in
Tiermodellen Migräne-ähnliche Symptome induzieren oder verhindern können, auf ihre
Wirkungsweise in der Entstehung der PH zu untersuchen.
Eines der Leitsymptome der PH, welches sowohl beim Menschen als auch bei Tieren auftritt,
stellt die Muskularisierung von unter nicht-pathologischen Bedingungen nicht
muskularisierten Blutgefäßen dar. Dieser Prozess wird als Neomuskularisierung bezeichnet
und wurde bereits in vorangegangenen Studien am Lehrstuhl für Tierphysiologie an
Meerschweinchen und Ratten untersucht. Die Untersuchung der vaskulären Remodellierung
sollte in dieser Arbeit auf den Modellorganismus Maus übertragen und durch
pharmakologische Studien erweitert werden.
3.1 Validierung des Tiermodells der normobaren Hypo xie
3.1.1. Visualisierung glatter Muskulatur in der Lun ge von Mäusen
Zur Detektion der Muskulatur pulmonaler Blutgefäße wurde ein Antikörper gegen einen
Subtypen des zytoskelettalen Proteins Aktin verwendet, welcher ausschließlich in glatten
Muskelzellen (smooth muscle cells, SMC) exprimiert wird (α-Glattmuskelaktin, smooth
muscle actin, SMA).
In Abb. 3.1 ist eine immunhistochemische Fluoreszenz-Doppelfärbung von Lungengewebe
der Maus zu sehen. Durch diese Methode wurden zwei Schichten der pulmonalen
Blutgefäße sichtbar gemacht. Mit dem Antikörper gegen SMA wurde die glatte Muskulatur
der Lunge gefärbt (A, grün), mit einem Antikörper gegen den von-Willebrand-Faktor (vWF)
wurde das Endothel markiert (B, rot). Wie aus Abb. 3.1 C ersichtlich wird, konnte die glatte
Muskulatur nicht nur in den Blutgefäßen der Lunge (BV), sondern auch in den Atemwegen,
den Bronchioli (BR), detektiert werden. Die Atemwege verfügen nicht wie Blutgefäße über
ein flaches Endothel sondern über ein hochprismatisches Epithel und waren daher auch
nicht immunpositiv für den vWF. In der Detaildarstellung (D) wird auch die Spezifität der
Antikörper deutlich. Das zum Lumen des Blutgefäßes orientierte Endothel (rot) wird von einer
kontinuierlichen Schicht glatter Muskulatur umschlossen (grün). Im Bronchiolus hingegen
fehlte die Endothelfärbung und die für diese Struktur cha
Muskularisierung wurde sichtbar (Pfeil).
Für die quantitative Auswertung der muskularisierten Blutgefäße war die Zuordnung der
pulmonalen Muskulatur essentiell. Die Neomuskularisierung findet hauptsächlich an kleinen
Arteriolen statt (Stenmark et al.
einem Durchmesser von bis zu 50
Gefäßremodellierung zu erwarten war. Dabei war entscheidend, dass es bei der
histologischen Auswertung zu keiner Verwechslung zwischen der Muskulatur von
Blutgefäßen und Teilen der Atemwege kommen konnte. Dies war jedoch auszuschließen, da
BV
BR
Abb. 3.1: Etablierung der Antikörperfärbung zur Vis ualisierung glatter MuskulaturLunge von Mäusen
Die Bilder zeigen die Fluoreszenz einer immunhistochemisα-Glattmuskelaktin (SMA, A) und den vonbeiden Signale wird ersichtlich, dass sowohl Blutgefäße (BV) als auch Bereich(hier: Bronchiolus, BR) glatte Muskulatur tragen. Endothel ausgekleidet sind und eine durchgängige Muskelschicht besitzen. Im Gegensatz dazu weist der Brochiolus kein von-WillebrandMuskelschicht in dieser Struktur diskontinuierlich vor (Pfeil).
fehlte die Endothelfärbung und die für diese Struktur charakteristische, diskontinuierliche
Muskularisierung wurde sichtbar (Pfeil).
Für die quantitative Auswertung der muskularisierten Blutgefäße war die Zuordnung der
Muskulatur essentiell. Die Neomuskularisierung findet hauptsächlich an kleinen
et al., 2006). Für die Lunge der Maus waren daher Blutgefäße mit
einem Durchmesser von bis zu 50 µm von Interesse, da hier der stärkste Grad der
remodellierung zu erwarten war. Dabei war entscheidend, dass es bei der
histologischen Auswertung zu keiner Verwechslung zwischen der Muskulatur von
Blutgefäßen und Teilen der Atemwege kommen konnte. Dies war jedoch auszuschließen, da
R
Abb. 3.1: Etablierung der Antikörperfärbung zur Vis ualisierung glatter Muskulatur
Die Bilder zeigen die Fluoreszenz einer immunhistochemischen Färbung mit Antikörpern gegen A) und den von-Willebrand-Faktor (vWF, B). In der Überlagerung der
beiden Signale wird ersichtlich, dass sowohl Blutgefäße (BV) als auch Bereich, BR) glatte Muskulatur tragen. Im Detail (D) sieht man, dass nur Blutgefäße von
Endothel ausgekleidet sind und eine durchgängige Muskelschicht besitzen. Im Gegensatz dazu Willebrand-Faktor immunpositives Endothel auf. Zudem l
Muskelschicht in dieser Struktur diskontinuierlich vor (Pfeil).
SMA
Ergebnisse
61
rakteristische, diskontinuierliche
Für die quantitative Auswertung der muskularisierten Blutgefäße war die Zuordnung der
Muskulatur essentiell. Die Neomuskularisierung findet hauptsächlich an kleinen
waren daher Blutgefäße mit
µm von Interesse, da hier der stärkste Grad der
remodellierung zu erwarten war. Dabei war entscheidend, dass es bei der
histologischen Auswertung zu keiner Verwechslung zwischen der Muskulatur von
Blutgefäßen und Teilen der Atemwege kommen konnte. Dies war jedoch auszuschließen, da
Abb. 3.1: Etablierung der Antikörperfärbung zur Vis ualisierung glatter Muskulatur in der
chen Färbung mit Antikörpern gegen B). In der Überlagerung der
beiden Signale wird ersichtlich, dass sowohl Blutgefäße (BV) als auch Bereiche der Atemwege Im Detail (D) sieht man, dass nur Blutgefäße von
Endothel ausgekleidet sind und eine durchgängige Muskelschicht besitzen. Im Gegensatz dazu Faktor immunpositives Endothel auf. Zudem liegt die
vWF
Ergebnisse
62
nur Blutgefäße mit einem Durchmesser von ≤50 µm über eine kontinuierliche Muskelschicht
verfügen. Bronchioli hingegen weisen in diesem Größenbereich zumeist gar keine
Muskularisierung auf, da sich die Bronchioli hier bereits zu Bronchioli terminales verzweigt
haben, welche komplett unmuskularisiert vorliegen. Selbst verhältnismäßig große
Atemwegsabschnitte mit einem Durchmesser von mehreren hundert Mikrometern (vgl. Abb.
3.1 C) zeigen lediglich eine mehrfach unterbrochene Schicht glatter Muskulatur.
Da sich die Antikörperfärbung für die Quantifizierung der vaskulären Muskulatur als geeignet
erwies, konnte mit der histologischen Untersuchung der Lungen fortgefahren werden. Dazu
wurden die Lungen immunhistochemisch gegen SMA gefärbt und muskularisierte Blutgefäße
mit einem Durchmesser ≤25 µm sowie 26 µm – 50 µm gezählt.
3.1.2 Induktion der PH
Zuerst wurde analysiert, für welchen Zeitraum die Tiere hypoxischen Bedingungen
ausgesetzt werden mussten, um die Pathologie der PH in Form der Neomuskularisierung
hervorzurufen. Dazu wurden die Tiere über einen Zeitraum von einer Woche bis zu fünf
Wochen unter hypoxischen Bedingungen (10% O2) gehalten. Als Vergleichsgruppe dienten
Tiere, die unter normoxischen Luftverhältnissen gehalten wurden. Für die Untersuchung der
Neomuskularisierung wurde die Anzahl muskularisierter Blutgefäße in einem Schnitt des
linken Lobus gezählt und auf die Fläche des Lungengewebes umgerechnet (siehe 2.2.5)
Das Ergebnis der Quantifizierung von muskularisierten Blutgefäßen mit einem Durchmesser
≤25 µm ist in Abb. 3.2 dargestellt. Es wird ersichtlich, dass die Hypoxiebehandlung bei einer
Dauer von einer oder zwei Wochen keine Auswirkung auf die Anzahl muskularisierter
Gefäße hatte. Nach drei Wochen war ein leichter, aber nicht signifikanter Anstieg zu
verzeichnen. Erst nach vier bzw. fünf Wochen des Aufenthalts in der Hypoxiekammer konnte
in den Lungen der Tiere ein signifikanter Anstieg der Anzahl muskularisierter Blutgefäße
detektiert werden (p>0,01). Es fand jedoch keine weitere Zunahme der muskularisierten
Blutgefäße nach fünf wöchiger Hypoxiebehandlung im Vergleich zur vierwöchigen
Behandlung statt.
Ergebnisse
63
In Abb. 3.3 ist das Resultat der Zählung von muskularisierten Blutgefäßen mit einem
Durchmesser von 26 µm – 50 µm zu sehen. Das Ergebnis entsprach im Wesentlichen der
vorangegangenen Quantifizierung. Auch hier zeigte sich nach einwöchiger bzw.
zweiwöchiger Hypoxiebehandlung keine Veränderung in der Anzahl muskularisierter
Blutgefäße. Bei der Tiergruppe, welche drei Wochen unter hypoxischen Bedingungen
gehalten wurde, zeigte sich eine geringe, nicht signifikante Erhöhung der Anzahl
muskularisierter Blutgefäße. Nach vier und fünf Wochen Hypoxiebehandlung konnte auch
bei den Gefäßen mit einem Durchmesser von 26 µm – 50 µm eine signifikante Zunahme der
Anzahl muskularisierter Blutgefäße festgestellt werden. Der maximale
Muskularisierungseffekt trat hier ebenfalls bereits nach vier Wochen Hypoxiebehandlung auf.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Normoxie 1 W Hypoxie
2 W Hypoxie
3 W Hypoxie
4 W Hypoxie
5 W Hypoxie
mus
kula
risie
rte
Blu
tgef
äße
(n
orm
iert
auf
Nor
mox
ie-G
rupp
e) ** **
Abb. 3.2: Untersuchung der Neomuskularisierung an G efäßen mit einem Durchmesser ≤25 µm in der Lunge von Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Hypoxie-Behandlung
Tiere, welche eine oder zwei Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, zeigten im Vergleich zur Kontrollgruppe keine erhöhte Anzahl muskularisierter Blutgefäße. Ein leichter, nicht signifikanter Anstieg war nach drei Wochen zu beobachten. Wurden die Tiere für die Dauer von vier oder fünf Wochen bei 10% O2 gehalten, zeigte sich ein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe (p<0,01, ANOVA). Der maximale Effekt der Behandlung war bereits nach vier Wochen eingetreten, da sich im Vergleich zur fünfwöchigen Hypoxiebehandlung keine Steigerung zeigte. (n≥5; ±SEM)
Ergebnisse
64
Somit konnte festgestellt werden, dass es bei den untersuchten Blutgefäßen durch die
Hypoxiebehandlung zu einer Verdopplung der Anzahl muskularisierter Blutgefäße kam. Dies
war sowohl für die kleinsten Blutgefäße mit einem Durchmesser ≤25 µm als auch für
Blutgefäße mit einem Durchmesser zwischen 26 µm – 50 µm der Fall. Dabei erwies sich eine
vierwöchige Hypoxiebehandlung als optimaler Behandlungszeitraum, da hier die maximale
Ausprägung der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung vorlag.
3.1.3 Rechtsherzhypertrophie nach Hypoxie-Behandlun g
Die verstärkte Muskularisierung der pulmonalen Blutgefäße in der Pathologie der PH führt zu
einer Zunahme des Gefäßwiderstands. Aufgrund des erhöhten Leistungsbedarfs des
Herzens kommt es zu einer Rechtsventrikulären Hypertrophie (RVH, right ventricular
hypertrophy). Diese lässt sich auch im Hypoxie-Tiermodell nachweisen und bietet die
Möglichkeit, die Auswirkungen der durch die Gefäßremodellierung veränderten
Lungenphysiologie zu untersuchen.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Normoxie 1 W Hypoxie
2 W Hypoxie
3 W Hypoxie
4 W Hypoxie
5 W Hypoxie
mus
kula
risie
rte
Blu
tgef
äße
(n
orm
iert
auf
Nor
mox
ie-G
rupp
e)
*** ***
Abb. 3.3: Untersuchung der Neomuskularisierung an G efäßen mit einem Durchmesser von 26 µm - 50 µm in der Lunge von Mäus en zu verschiedenen Zeitpunkten nach Hypoxie-Behandlung
Tiere, welche eine oder zwei Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, zeigten im Vergleich zur Kontrollgruppe keine erhöhte Anzahl muskularisierter Blutgefäße. Ein leichter, nicht signifikanter Anstieg war nach drei Wochen zu beobachten. Wurden die Tiere für die Dauer von vier oder fünf Wochen bei 10% O2 gehalten, zeigte sich ein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe (p<0,001, ANOVA). Der maximale Effekt der Behandlung war bereits nach vier Wochen eingetreten, da sich im Vergleich zur fünfwöchigen Hypoxiebehandlung keine Steigerung zeigte. (n≥5; ±SEM)
Ergebnisse
65
Das Ergebnis eines Vergleichs zwischen dem Gewicht der Herzen von Tieren, die vier
Wochen unter normoxischen bzw. hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, ist in
Abb. 3.4 dargestellt. Dabei wurde das Gewicht des rechten Ventrikels (RV) in Relation zum
Gewicht des linken Ventrikels mit dem Septum (LV+S) gesetzt. So war es möglich generelle
Gewichtsunterschiede zwischen den Herzen einzelner Tiere auszuschließen. Aus dem
errechneten Gewichtsverhältnis zeigte sich, dass durch die Hypoxiebehandlung das Gewicht
des rechten Ventrikels um etwa 50 % zugenommen hatte. Dieser Effekt ist auf die RVH
zurückzuführen. Damit konnte nachgewiesen werden, dass die in dieser Arbeit induzierte
Neomuskularisierung pathologische Prozesse im Herzen nach sich zog.
3.2 Reversibilität der Neomuskularisierung
Nachdem gezeigt werden konnte, dass es durch die Hypoxiebehandlung zur Ausbildung
neuer vaskulärer Muskelzellen kam (vgl. 3.1.2), war von Interesse, über welchen Zeitraum
diese zellulären Veränderungen bestehen blieben. Dazu wurden die Tiere einer
vierwöchigen Hypoxiebehandlung unterzogen und dann über variierende Zeiträume unter
normoxischen Luftbedingungen gehalten.
Das Ergebnis dieses Versuchs ist in Abb. 3.5 dargestellt. Da es zwischen den beiden
untersuchten Größen von Blutgefäßen (≤25 µm sowie 26 µm - 50 µm) keine signifikanten
Unterschiede gab (vgl. 3.1.2), wird in der Folge die Gesamtheit der untersuchten Blutgefäße
(≤50 µm) gezeigt.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Normoxie 4 W Hypoxie
RV
/LV
+S
***
Abb. 3.4: Untersuchung der Rechtsherzhypertrophie ( RVH) nach Hypoxie-Behandlung
Das Verhältnis zwischen dem Gewicht des rechten Ventrikels und des linken Ventrikels samt Septum nahm durch die Hypoxiebehandlung um etwa 50 % zu. Dies resultierte aus der Hypertrophie des rechten Ventrikels.(t-Test; ***: p<0,001;n=15; ±SEM)
Aus diesem Experiment ging hervor, dass zu keinem der untersuchten Zeitpunkte eine
Reversibilität der Neomuskularisierung gegeben war. Auch hier zeigte sich, dass
die Hypoxiebehandlung etwa zu einer Verdopplung der muskularisierten Blutgefäße mit
einem Durchmesser ≤50 µm gekommen war. Der folgenden Aufenthalt unter normoxischen
Bedingungen hatten darauf keinen Einfluss.
Daher konnte festgehalten werden, d
eine persistierende morphologische Differenzierung der pulmonalen Blutgefäße handelte, die
bis zu acht Wochen nach der Hypoxiebehandlung Bestand hatte.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Normoxie 4 W Hypoxie
mus
kula
risie
rte
Blu
tgef
äße
(n
orm
iert
auf
Nor
mox
ie-G
rupp
e)
Abb. 3.5: Untersuchung der Reversibilität einem Durchmesser von ≤50 µm
In der Gruppe der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurde, zeigte sich im Vergleich zur Kontrollgruppe (Blutgefäße (p=0,051, ANOVA). Desweiteren zeigte sich, dass die Rückführung der Tiere in normoxische Luftverhältnisse nicht zu einer Rückbildung der neu entstandenen Muskelschicht führte. Dies war unabhängig voGruppen konnte ein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe (p<0,05, ANOVA) nachgewiesen werden. (†:p=0,051; *:p<0,05; n=5; ±SEM)
Aus diesem Experiment ging hervor, dass zu keinem der untersuchten Zeitpunkte eine
Reversibilität der Neomuskularisierung gegeben war. Auch hier zeigte sich, dass
die Hypoxiebehandlung etwa zu einer Verdopplung der muskularisierten Blutgefäße mit
≤50 µm gekommen war. Der folgenden Aufenthalt unter normoxischen
Bedingungen hatten darauf keinen Einfluss.
Daher konnte festgehalten werden, dass es sich bei der neu entstandenen Muskelschicht um
eine persistierende morphologische Differenzierung der pulmonalen Blutgefäße handelte, die
bis zu acht Wochen nach der Hypoxiebehandlung Bestand hatte.
4 W Hypoxie
4 W Hypoxie
1 W Normoxie
4 W Hypoxie
2 W Normoxie
4 W Hypoxie
3 W Normoxie
4 W Hypoxie
4 W Normoxie
Untersuchung der Reversibilität der Neomuskularisierung von Blutgefäßen µm in der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung
In der Gruppe der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurde, zeigte sich im Vergleich zur Kontrollgruppe (Normoxie) eine erhöhte Anzahl muskularisierter Blutgefäße (p=0,051, ANOVA). Desweiteren zeigte sich, dass die Rückführung der Tiere in normoxische Luftverhältnisse nicht zu einer Rückbildung der neu entstandenen Muskelschicht führte. Dies war unabhängig vom hier untersuchten Zeitraum von bis zu acht Wochen. In diesen Gruppen konnte ein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe (p<0,05, ANOVA) nachgewiesen werden. (†:p=0,051; *:p<0,05; n=5; ±SEM)
†
Ergebnisse
66
Aus diesem Experiment ging hervor, dass zu keinem der untersuchten Zeitpunkte eine
Reversibilität der Neomuskularisierung gegeben war. Auch hier zeigte sich, dass es durch
die Hypoxiebehandlung etwa zu einer Verdopplung der muskularisierten Blutgefäße mit
50 µm gekommen war. Der folgenden Aufenthalt unter normoxischen
ass es sich bei der neu entstandenen Muskelschicht um
eine persistierende morphologische Differenzierung der pulmonalen Blutgefäße handelte, die
4 W Hypoxie
4 W Normoxie
4 W Hypoxie
8 W Normoxie
der Neomuskularisierung von Blutgefäßen mit Hypoxiebehandlung
In der Gruppe der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurde, Normoxie) eine erhöhte Anzahl muskularisierter
Blutgefäße (p=0,051, ANOVA). Desweiteren zeigte sich, dass die Rückführung der Tiere in normoxische Luftverhältnisse nicht zu einer Rückbildung der neu entstandenen Muskelschicht
m hier untersuchten Zeitraum von bis zu acht Wochen. In diesen Gruppen konnte ein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe (p<0,05, ANOVA) nachgewiesen
Ergebnisse
67
3.3 Bedeutung des 5-HT 2B Rezeptors
Sowohl in der Entstehung der Migräne als auch der PH wird dem 5-HT2B Rezeptor eine
wichtige Funktion zugesprochen (Launay et al., 2002, Johnson et al., 2003). Dies sollte in
den folgenden Versuchen mittels verschiedener Methoden überprüft werden. Darüber hinaus
sollte die Expression des Rezeptors unter hypoxischen Bedingungen geprüft sowie mögliche
Signaltransduktionswege untersucht werden.
3.3.1 Pharmakologische Inaktivierung des 5-HT 2B Rezeptors
Um die Beteiligung des 5-HT2B Rezeptors an der Entstehung der PH zu analysieren, wurde
der für diesen Rezeptor spezifische Antagonist BF-1 verwendet. Diese Substanz wurde den
Versuchstieren in drei verschiedenen Dosen (1 mg/kg, 5 mg/kg, 20 mg/kg) alle 24 h
intraperitoneal während der Hypoxiebehandlung verabreicht. Durch diesen Versuchsansatz
konnte zum einen überprüft werden, ob die Blockierung des Rezeptors eine Auswirkung auf
die Entstehung der Neomuskularisierung während Hypoxiebehandlung hatte, zum anderen,
ob eine Dosisabhängigkeit bestand.
Das Ergebnis dieses Versuchs ist in Abb. 3.6 dargestellt. Da es auch in diesem Versuch
keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden untersuchten Größen von
Blutgefäßen (≤25 µm sowie 26 µm - 50 µm) gab (vgl. 3.1.2), wird in der Folge die Gesamtheit
der untersuchten Blutgefäße gezeigt.
Aus der Abbildung wird ersichtlich, dass es in der Tiergruppe, der keine Substanz injiziert
wurde, zur Ausprägung der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung kam. Es fand im
Vergleich zur Kontrollgruppe, welche unter normoxischen Bedingungen gehalten wurde,
nahezu eine Verdopplung der muskularisierten Blutgefäße mit einem Durchmesser ≤50 µm
statt. Dieser Effekt wurde in allen Gruppen, die BF-1 erhielten, um etwa 50 % reduziert.
Durch die Blockierung des 5-HT2B Rezeptors wurde demnach der pathologische Prozess der
Neomuskularisierung zum Teil inhibiert.
Ergebnisse
68
Aus Gründen der Übersichtlichkeit ist die statistische Auswertung Tab 3.1 zu entnehmen.
Hier wird ersichtlich, dass ein signifikanter Unterschied zwischen den Tiergruppen, die BF-1
erhielten, und der Gruppe, die auch hypoxischen Bedingungen ausgesetzt war, aber keine
Substanz erhielt, bestand. Einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den
Gruppen, die BF-1 erhielten, und der Normoxie-Gruppe konnte nur bei einer Dosis von
1 mg/kg festgestellt werden. Zudem gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen den
Gruppen, denen unterschiedliche Dosen BF-1 verabreicht wurden.
Normoxie Hypoxie BF-1
[1 mg/kg]
BF-1
[5 mg/kg]
BF-1
[20 mg/kg]
Normoxie - *** * n.s. n.s.
**
n.s.
Hypoxie *** - ** **
BF-1 [1 mg/kg] * ** - n.s.
BF-1 [5 mg/kg] n.s. ** n.s. - n.s.
BF-1 [20 mg/kg] n.s. ** n.s. n.s. -
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Normoxie 4 W Hypoxie 4 W Hypoxie + BF-1 [1 mg/kg]
4 W Hypoxie + BF-1 [5 mg/kg]
4 W Hypoxie + BF-1 [20 mg/kg]
Anz
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Blu
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Abb. 3.6: Untersuchung der Beteiligung des 5-HT 2B Rezeptors an der Neomuskularisierung von Blutgefäßen mit einem Durchmesser von ≤50 µm in der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung
In der Gruppe der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, zeigte sich im Vergleich zur Kontrollgruppe (Normoxie) eine erhöhte Anzahl muskularisierter Blutgefäße. Die tägliche Applikation von BF-1 führte in allen Dosen zu einer Reduktion der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung um ca. 50 %. (Statistik siehe Tab. 3.1; n≥5; ±SEM)
Tab. 3.1: Statistische Auswertung zum Versuch ‚ Pha rmakologische Inaktivierung des 5-HT 2B Rezeptors ‘ (***: p<0,001; **: p<0,01; *: p<0,05; n .s.: nicht signifikant)
Die methodischen Kontrollen zu dieser Versuchsreihe sind in Abb. 3.7 dargestellt. Zum einen
musste ausgeschlossen werden, dass bereits das Lösungsmittel
10% DMSO in 0,9% NaCl) einen Effekt auf die Ausprägung der Neomuskularisierung hatte.
Daher wurde hypoxisch gehaltenen Tieren alle 24 h das
Außerdem musste überprüft werden, ob BF
hatte oder zu einer generellen Abnahme vaskulärer glatter Muskulatur führt
Tieren, die unter normoxischen Bedingungen gehalten wurden, die höchste Dosis BF
(20 mg/kg) verabreicht.
Aus der Abbildung geht hervor, dass weder die Injektion des
(20 mg/kg) Einfluss auf die Anzahl muskularisierter Blutgefäße in normoxisch gehaltenen
Tieren hatte. Auch bei hypoxisch gehaltenen Tieren war kein Unterschied zwischen d
Gruppe, die das Vehicle erhalten hatte, und der Gruppe, die keine Substanz erhielt,
festgestellt werden.
Daraus konnte gefolgert werden, dass die oben beschriebene Inhibition der
Neomuskularisierung in der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung durch
des 5-HT2B Rezeptors mit dem spezifischen Antagonisten BF
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Normoxie
mus
kula
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rte
Blu
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äße
(n
orm
iert
auf
Nor
mox
ie-G
rupp
e)
Abb. 3.7: Kontrollexperimente zur an der Neomuskularisierung von Blutgefäßen der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung
Es zeigte sich, dass weder die Injektion von BFVeränderung der Anzahl muskularisierter Blutgefäße hervorrief. Gleichzeitig hatte die Injektion des Vehicles keinen Einfluss auBedingungen. Der Vergleich zwischen normoxisch und hypoxisch gehaltenen Tieren zeigte erneut einen statistisch signifikanten Anstieg muskularisierter Blutgefäße in letzteren Gruppen. (ANOVA; **: p<0,01; *:p<0,05;
Die methodischen Kontrollen zu dieser Versuchsreihe sind in Abb. 3.7 dargestellt. Zum einen
musste ausgeschlossen werden, dass bereits das Lösungsmittel der Substanz (
DMSO in 0,9% NaCl) einen Effekt auf die Ausprägung der Neomuskularisierung hatte.
Daher wurde hypoxisch gehaltenen Tieren alle 24 h das Vehicle injiziert.
Außerdem musste überprüft werden, ob BF-1 nur einen Effekt auf die Neomusk
oder zu einer generellen Abnahme vaskulärer glatter Muskulatur führt
Tieren, die unter normoxischen Bedingungen gehalten wurden, die höchste Dosis BF
Aus der Abbildung geht hervor, dass weder die Injektion des Vehicle noch die von BF
mg/kg) Einfluss auf die Anzahl muskularisierter Blutgefäße in normoxisch gehaltenen
Tieren hatte. Auch bei hypoxisch gehaltenen Tieren war kein Unterschied zwischen d
erhalten hatte, und der Gruppe, die keine Substanz erhielt,
Daraus konnte gefolgert werden, dass die oben beschriebene Inhibition der
Neomuskularisierung in der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung durch
Rezeptors mit dem spezifischen Antagonisten BF-1 verursacht wurde.
Normoxie Normoxie + Vehicle
Normoxie + BF-1
[20 mg/kg]
Hypoxie
Kontrollexperimente zur Untersuchung der Beteiligung des 5- HTan der Neomuskularisierung von Blutgefäßen mit einem Durchmesser von der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung
Es zeigte sich, dass weder die Injektion von BF-1 (20 mg/kg) noch des Veränderung der Anzahl muskularisierter Blutgefäße hervorrief. Gleichzeitig hatte die
keinen Einfluss auf die Neomuskularisierung unter hypoxischen Bedingungen. Der Vergleich zwischen normoxisch und hypoxisch gehaltenen Tieren zeigte erneut einen statistisch signifikanten Anstieg muskularisierter Blutgefäße in letzteren Gruppen. (ANOVA; **: p<0,01; *:p<0,05; n≥4; ±SEM)
Ergebnisse
69
Die methodischen Kontrollen zu dieser Versuchsreihe sind in Abb. 3.7 dargestellt. Zum einen
der Substanz (Vehicle,
DMSO in 0,9% NaCl) einen Effekt auf die Ausprägung der Neomuskularisierung hatte.
1 nur einen Effekt auf die Neomuskularisierung
oder zu einer generellen Abnahme vaskulärer glatter Muskulatur führte. Dazu wurde
Tieren, die unter normoxischen Bedingungen gehalten wurden, die höchste Dosis BF-1
noch die von BF-1
mg/kg) Einfluss auf die Anzahl muskularisierter Blutgefäße in normoxisch gehaltenen
Tieren hatte. Auch bei hypoxisch gehaltenen Tieren war kein Unterschied zwischen der
erhalten hatte, und der Gruppe, die keine Substanz erhielt,
Daraus konnte gefolgert werden, dass die oben beschriebene Inhibition der
Neomuskularisierung in der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung durch Blockierung
1 verursacht wurde.
Hypoxie + Vehicle
HT2B Rezeptors einem Durchmesser von ≤50 µm in
1 (20 mg/kg) noch des Vehicles eine Veränderung der Anzahl muskularisierter Blutgefäße hervorrief. Gleichzeitig hatte die
f die Neomuskularisierung unter hypoxischen Bedingungen. Der Vergleich zwischen normoxisch und hypoxisch gehaltenen Tieren zeigte erneut einen statistisch signifikanten Anstieg muskularisierter Blutgefäße in letzteren
Ergebnisse
70
Neben der histologischen Auswertung wurden einige Tiergruppen auf die Ausprägung der
RVH untersucht (vgl. 3.1.3). Das Ergebnis ist in Abb. 3.8 dargestellt. Es zeigte sich auch
hier, dass die Injektion von BF-1 in einer Dosis von 5 mg/kg einen reduzierenden Effekt auf
die Ausprägung der Rechtsherzhypertrophie hatte. Wie schon in der histologischen
Auswertung (siehe Abb. 3.6) konnte der Hypoxie-induzierte Effekt nicht komplett blockiert
werden, jedoch wurde er um etwa 50% verringert. So bestanden für die Gruppe, welche
unter hypoxischen Bedingungen BF-1 erhielt, statistisch signifikante Unterschiede sowohl zur
normoxisch gehaltenen Kontrollgruppe, als auch zu der Gruppe, welche unter Hypoxie
gehalten wurde, aber keine Substanz erhielt.
3.3.2 Reversibilität der Neomuskularisierung bei Bl ockierung des 5-HT 2B Rezeptors
Wie unter 3.2 beschrieben, handelt es sich bei der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung
um eine stabile vaskuläre Veränderung, die zumindest über einen Zeitraum von acht
Wochen nach der Hypoxiebehandlung vorherrscht. Allerdings konnte auch gezeigt werden
(siehe 3.3.1), dass die Neuausbildung der Muskelschicht durch Behandlung mit einem
Antagonisten des 5-HT2B Rezeptors reduziert werden konnte.
Daher sollte im folgenden Experiment untersucht werden, ob durch die Blockierung des
5-HT2B Rezeptors die Reversibilität der Neomuskularisierung induziert werden konnte. Dazu
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Normoxie 4 W Hypoxie 4 W Hypoxie + BF-1 [5 mg/kg]
RV
/LV
+S
Abb. 3.8: Untersuchung der Rechtsherzhypertrophie ( RVH) nach Hypoxie-Behandlung und Gabe von BF-1
Der relative Wert für das Verhältnis zwischen dem Gewicht des rechten Ventrikels und des linken Ventrikels samt Septum nahm durch die Hypoxiebehandlung stark zu. Dies resultierte aus der Hypertrophie des rechten Ventrikels. Durch die tägliche Gabe von BF-1 (5 mg/kg) konnte dieser Effekt reduziert, jedoch nicht komplett verhindert werden. Es bestand statistische Signifikanz lediglich für den Unterschied zwischen den normoxisch und hypoxisch gehaltenen Tiergruppen. Der Mittelwert der hypoxisch gehaltenen Gruppe, welche zusätzlich BF-1 erhielt lag zwischen diesen Gruppen und wies keine statistische Signifikanz zu den anderen Tiergruppen auf. (ANOVA, n=8; ±SEM)
**
wurden die Tiere zuerst vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten. Danach
wurden sie in normoxische Luftverhältnisse überführt und erhielten in einem Rhythmus von
24 h eine Injektion (i.p.) BF-1 mit einer Dosis von 5 mg/kg.
Das Resultat dieses Versuchs ist in Abb. 3.9 dargestellt. Im Vergleich zur normoxisch
gehaltenen Gruppe entwickelte sic
Muskularisierung in Blutgefäßen mit einem Durchmesser
Dadurch zeigte sich, dass ein an die Hypoxiebehandlung anschließender vierwöchiger
Aufenthalt unter normoxischen Bedingungen bei gleichzeitiger Gabe von BF
keine Reversibilität der Neomuskularisierung hervorrufen konnte. Es konnte somit festgestellt
werden, dass lediglich eine Blockierung des 5
Hypoxiebehandlung die Ausbildu
ausgeprägte Neomuskularisierung kann durch die Injektion des Antagonisten nicht reduziert
werden.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Normoxie
mus
kula
risie
rte
Blu
tgef
äße
(n
orm
iert
auf
Nor
mox
ie-G
rupp
e)
Abb. 3.9 : Untersuchung der Reversibilität der Neomuskularis ierung von Blutgefäßen mit einem Durchmesser von Hypoxiebehandlung durch Blockierung des 5
Es zeigte sich, dass alle unter hypoxischen Bedingungen gehaltenen Tiere eine statistisch signifikant höhere Zahl muskularisierter Blutgefäße mit einem Durchmesser aufwiesen als Tiere, welche sich in normoxischen Bedingungen aufhielten (ANOVA). Auch ein sich der hypoxischen Phase anschließender Aufenthalt in normoxischer Umgebung mit zusätzlicher Gabe von BF-1 (5 mg/kg) konnte die Neomuskularisierung nicht revertieren. Somit konnte die Blockierung des 5Muskelschicht erzielen. (***: p<0,001; **:p<0,01; n
wurden die Tiere zuerst vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten. Danach
normoxische Luftverhältnisse überführt und erhielten in einem Rhythmus von
1 mit einer Dosis von 5 mg/kg.
Das Resultat dieses Versuchs ist in Abb. 3.9 dargestellt. Im Vergleich zur normoxisch
gehaltenen Gruppe entwickelte sich in allen weiteren Gruppen eine verstärkte
Muskularisierung in Blutgefäßen mit einem Durchmesser ≤50 µm.
Dadurch zeigte sich, dass ein an die Hypoxiebehandlung anschließender vierwöchiger
hen Bedingungen bei gleichzeitiger Gabe von BF
keine Reversibilität der Neomuskularisierung hervorrufen konnte. Es konnte somit festgestellt
werden, dass lediglich eine Blockierung des 5-HT2B Rezeptors während der
Hypoxiebehandlung die Ausbildung einer neuen Muskelschicht verhindern kann. Eine bereits
ausgeprägte Neomuskularisierung kann durch die Injektion des Antagonisten nicht reduziert
4 W Hypoxie 4 W Hypoxie + 4 W Normoxie
4 W Hypoxie + 4 W Normoxie + BF-1 [5 mg/kg]
***
: Untersuchung der Reversibilität der Neomuskularis ierung von Blutgefäßen einem Durchmesser von ≤50 µm in der Lunge von Mäusen nach
poxiebehandlung durch Blockierung des 5 -HT2B Rezeptors
Es zeigte sich, dass alle unter hypoxischen Bedingungen gehaltenen Tiere eine statistisch signifikant höhere Zahl muskularisierter Blutgefäße mit einem Durchmesser
als Tiere, welche sich in normoxischen Bedingungen aufhielten (ANOVA). Auch ein sich der hypoxischen Phase anschließender Aufenthalt in normoxischer Umgebung mit
1 (5 mg/kg) konnte die Neomuskularisierung nicht revertieren. konnte die Blockierung des 5-HT2B Rezeptors keine Reduktion der neu gebildeten
Muskelschicht erzielen. (***: p<0,001; **:p<0,01; n≥5; ±SEM)
Ergebnisse
71
wurden die Tiere zuerst vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten. Danach
normoxische Luftverhältnisse überführt und erhielten in einem Rhythmus von
Das Resultat dieses Versuchs ist in Abb. 3.9 dargestellt. Im Vergleich zur normoxisch
h in allen weiteren Gruppen eine verstärkte
Dadurch zeigte sich, dass ein an die Hypoxiebehandlung anschließender vierwöchiger
hen Bedingungen bei gleichzeitiger Gabe von BF-1 (5 mg/kg)
keine Reversibilität der Neomuskularisierung hervorrufen konnte. Es konnte somit festgestellt
Rezeptors während der
ng einer neuen Muskelschicht verhindern kann. Eine bereits
ausgeprägte Neomuskularisierung kann durch die Injektion des Antagonisten nicht reduziert
4 W Hypoxie + 4 W Normoxie +
1 [5 mg/kg]
: Untersuchung der Reversibilität der Neomuskularis ierung von Blutgefäßen in der Lunge von Mäusen nach
Es zeigte sich, dass alle unter hypoxischen Bedingungen gehaltenen Tiere eine statistisch signifikant höhere Zahl muskularisierter Blutgefäße mit einem Durchmesser ≤50 µm
als Tiere, welche sich in normoxischen Bedingungen aufhielten (ANOVA). Auch ein sich der hypoxischen Phase anschließender Aufenthalt in normoxischer Umgebung mit
1 (5 mg/kg) konnte die Neomuskularisierung nicht revertieren. Rezeptors keine Reduktion der neu gebildeten
Ergebnisse
72
3.3.3 Expression des 5-HT 2B Rezeptors unter Hypoxie
Nachdem nachgewiesen werden konnte, dass der 5-HT2B eine Rolle in der Entstehung der
PH spielt, sollte die Expression des Rezeptors in der Lunge der Mäuse untersucht werden. In
nahezu allen pathologischen Zuständen kommt es zur Expressionsregulierung von
Proteinen, was häufig allerdings schon auf Ebene der mRNA erfolgt. Aus diesem Grund
wurde in dieser Arbeit die Expression der mRNA des 5-HT2B Rezeptors in der Lunge von
normoxisch und hypoxisch gehaltenen Mäusen mittels der semiquantitativen Reverse
Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (sq RT-PCR) untersucht und verglichen.
Als methodische Positivkontrolle wurde die mRNA der Vorstufe (Präpro-Form) des
vasoaktiven Peptids Endothelin-1 (ET-1) analysiert. In mehreren Studien konnte eine
verstärkte Expression der mRNA von Präproendothelin-1 (ppET-1) unter Hypoxie
nachgewiesen werden (Elton et al., 1992, Li et al., 1994, Zamora et al., 1996, Nakanishi et
al., 1999). Durch diesen Vorversuch konnte zum einen kontrolliert werden, ob die
Hypoxiebehandlung erfolgreich war, zum anderen wurde geprüft, ob sich die Methode der sq
RT-PCR als geeignet zur Quantifizierung des Transkripts des 5-HT2B Rezeptors erwies.
Bei der Methode der sq RT-PCR wird die mRNA Sequenz eines Gens als Referenz
verwendet, welches unter den gegebenen Versuchsbedingungen, Normoxie und Hypoxie,
als nicht reguliert gilt. Für diesen Versuch wurde daher die Hypoxanthin-Phosphoribosyl-
Transferase (HPRT) ausgewählt (Iizuka et al.,1994, Cherin et al., 2006). Die Menge des zu
quantifizierenden PCR-Produkts wurde für die Auswertung in Relation zur Menge des PCR-
Produkts der Referenz gesetzt. Durch die Verwendung aufsteigender Primerkonzentrationen
wurde sichergestellt, dass sich die PCR nicht in der Sättigung befand und die Quantifizierung
im linearen Bereich der Reaktion erfolgte.
Abb. 3.10 zeigt die Auswertung der sq RT-PCR für das Transkript von ppET-1. Hier zeigte
sich, dass mit steigender ppET-1 Primerkonzentration auch die relative Menge des PCR-
Produkts zunahm. Ein Vergleich der beiden Gruppen (Normoxie und Hypoxie) ergab, dass
an jedem Datenpunkt die relative Menge der Produkt-DNA in den Proben der Tiere, die unter
hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, höher war als in der Kontrollgruppe. Dieser
Unterschied war statistisch signifikant (t-Test, p<0,01 bzw. p<0,001).
Somit kann man sagen, dass in den Proben der Hypoxie-Gruppe mehr Ausgangsmaterial
des Transkripts (cDNA, Template) vorlag. Die Hypoxiebehandlung führte, wie erwartet, zu
einer verstärkten Expression der mRNA von ppET-1 in den Lungen der Mäuse. Dadurch war
zum einen gesichert, dass die Hypoxiebehandlung erfolgreich war, zum anderen zeigte sich
die Methode als zur Quantifizierung des Transkripts des 5-HT2B Rezeptors geeignet.
Die Messung der Expression des mRNA Tr
zur Messung des ppET-1 Transkripts. Allerdings wurde die Methode dahingehend
modifiziert, dass während der PCR radioaktivmarkierte dCTP in die DNA eingebaut wurden
und dieses Signal auf einer Imagerplatte sich
Sensitivität der Methode, so dass auch kleinere Expressionsunterschiede sichtbar gemacht
werden konnten.
Das Ergebnis der Quantifizierung des Transkripts des 5
dargestellt. Im Gegensatz zu ppET
Gruppen. Lediglich in der höchsten Primerkonzentration (8 pmol/ml) ist eine leichte Tendenz
für eine Hochregulation des Transkripts des 5
hohe Standardabweichung ergab sich hier, wie auch für alle anderen Datenpunkte, keine
statistische Signifikanz (t-Test). Zudem bef
Primerkonzentration schon nahe der Sättigung. S
verwendeten Methode keine veränderte Expression der mRNA des 5
Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung festgestellt werden konnte.
-50
0
50
100
150
0
% I
nte
nsi
tät
HP
RT
Normoxie
Hypoxie
Abb. 3.10: Quantifizierung des ppETHypoxiebehan dlung mittels sq RT
Es zeigte sich, dass die relative Menge des ppEThypoxisch gehaltener Tiere höher war als in den Lungen der normoxisch gehalKontrolltiere. Die Normierung erfolgte gegen HPRT. Dadurch konnte die Methode der sq RT-PCR als geeignet und die Hypoxiebehandlung als gesichert erachtet werden. (***: p<0,001; **:p<0,01; t
Die Messung der Expression des mRNA Transkripts des 5-HT2B Rezeptors erfolgte analog
1 Transkripts. Allerdings wurde die Methode dahingehend
modifiziert, dass während der PCR radioaktivmarkierte dCTP in die DNA eingebaut wurden
und dieses Signal auf einer Imagerplatte sichtbar gemacht wurde. Dies erhöhte die
Sensitivität der Methode, so dass auch kleinere Expressionsunterschiede sichtbar gemacht
Das Ergebnis der Quantifizierung des Transkripts des 5-HT2B Rezeptors ist in Abb. 3.11
u ppET-1 zeigte sich hier kein Unterschied zwischen den beiden
Gruppen. Lediglich in der höchsten Primerkonzentration (8 pmol/ml) ist eine leichte Tendenz
für eine Hochregulation des Transkripts des 5-HT2B Rezeptors zu sehen. Durch die recht
hohe Standardabweichung ergab sich hier, wie auch für alle anderen Datenpunkte, keine
Test). Zudem befand sich die PCR-Reaktion in der höchsten
Primerkonzentration schon nahe der Sättigung. Somit lässt sich festhalten, dass mit der hier
verwendeten Methode keine veränderte Expression der mRNA des 5-HT
Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung festgestellt werden konnte.
1 2 4 5
ET-1 Primer [pmol/µl]
Normoxie
Hypoxie
Quantifizierung des ppET -1 Transkripts in der Lunge von Mäusen nach dlung mittels sq RT -PCR
Es zeigte sich, dass die relative Menge des ppET-1 Transkripts in den Lungen hypoxisch gehaltener Tiere höher war als in den Lungen der normoxisch gehalKontrolltiere. Die Normierung erfolgte gegen HPRT. Dadurch konnte die Methode der
PCR als geeignet und die Hypoxiebehandlung als gesichert erachtet werden. (***: p<0,001; **:p<0,01; t-Test; n=5; ±SD)
Ergebnisse
73
Rezeptors erfolgte analog
1 Transkripts. Allerdings wurde die Methode dahingehend
modifiziert, dass während der PCR radioaktivmarkierte dCTP in die DNA eingebaut wurden
tbar gemacht wurde. Dies erhöhte die
Sensitivität der Methode, so dass auch kleinere Expressionsunterschiede sichtbar gemacht
Rezeptors ist in Abb. 3.11
1 zeigte sich hier kein Unterschied zwischen den beiden
Gruppen. Lediglich in der höchsten Primerkonzentration (8 pmol/ml) ist eine leichte Tendenz
Rezeptors zu sehen. Durch die recht
hohe Standardabweichung ergab sich hier, wie auch für alle anderen Datenpunkte, keine
Reaktion in der höchsten
omit lässt sich festhalten, dass mit der hier
HT2B Rezeptors in der
6
in der Lunge von Mäusen nach
1 Transkripts in den Lungen hypoxisch gehaltener Tiere höher war als in den Lungen der normoxisch gehaltenen Kontrolltiere. Die Normierung erfolgte gegen HPRT. Dadurch konnte die Methode der
PCR als geeignet und die Hypoxiebehandlung als gesichert erachtet werden.
Ergebnisse
74
3.3.4 Signaltransduktion des 5-HT 2B Rezeptors unter Hypoxie
Die intrazellulären Signalwege, welche in Folge der Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors
auftreten, sind weitestgehend unbekannt. In bisherigen Studien wurden zumeist Zelllinien
verwendet, die nicht zwangsläufig die nativen Signalwege des Rezeptors widerspiegeln, da
sie möglichweise nicht über die nötigen Interaktionspartner verfügen.
In dieser Arbeit wurden Proteinlystate der Lunge mittels Western Blot untersucht und die
Expression verschiedener Proteine untersucht. Um Rückschlüsse auf die intrazelluläre
Kopplung des 5-HT2B Rezeptors ziehen zu können, wurde neben Tiergruppen, die unter
normoxischen und hypoxischen Luftverhältnissen gehalten wurden, eine Gruppe verwendet,
deren Tiere während der Hypoxiebehandlung Injektionen von BF-1 in einer Dosis von
5 mg/kg erhielt. Dadurch konnte die Auswirkung der Blockierung des 5-HT2B Rezeptors auf
das Zielprotein überprüft werden.
Wie unter 3.1.3 beschrieben führte die Blockade des 5-HT2B Rezeptors durch BF-1 (5mg/kg)
zu einer Verminderung der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung. Daher ist die
Aktivierung des Rezeptors essentiell für die Ausprägung der vaskulären Remodellierung.
Dementsprechend sollten die Signalwege, welche durch den 5-HT2B Rezeptor initiiert
werden, unter hypoxischen Bedingungen aktiviert sein. Gleichzeitig führt die Blockierung des
Rezeptors durch den Antagonisten dazu, dass die Signalwege gehemmt werden. Durch die
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
0 1 2 4 6 8
% I
nte
nsi
tät
HP
RT
5-HT2B Primer [pmol/µl]
Normoxie
Hypoxie
Abb. 3.11: Quantifizierung des Transkripts des 5-HT 2B Rezeptors in der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung mittels sq RT-PCR
Die sq RT-PCR ergab, dass sich die relative Menge des Transkripts des 5-HT2B Rezeptors in den Lungen hypoxisch gehaltener und normoxisch gehaltener Kontrolltiere nicht unterschied. Die Normierung erfolgte gegen HPRT. Dadurch konnte festgestellt werden, dass es zu keiner Veränderung der Expression des 5-HT2B Rezeptors auf mRNA Ebene durch die Hypoxiebehandlung kam. (t-Test; n=5; ±SD)
Verwendung der oben beschriebenen Tiergruppen, sollte daher eine Aussage über
potentielle Signaltransduktionswege möglich sein.
Von besonderem Interesse waren dabei die
eine mögliche Kopplung dieser mit dem 5
2003; Li et al., 2008). Es existieren zwei Formen der ERK
(p42 MAPK). Sie übernehmen vielfältige Aufgaben in zellulären Prozessen wie
Differenzierung und Proliferation
et al., 2011), wodurch eine Beteiligung der ERK am Prozess der Neomuskularisierung im
Einklang mit den bisher beschriebenen Funktionen stehen würde.
Um die ERK zu aktivieren, muss eine Phosphorylierung
TEY-Motivs erfolgen (Roux & Blenis, 2004)
phosphorylierten Formen (pERK) wurden Antikörper verwendet, welche zwischen
und der inaktiven Form der ERK unterschieden können.
Als methodische Positivkontrolle wurde die Expression von
beschriebenen Tiergruppen untersucht. Da die Blockierung des 5
Verminderung der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung führte (vgl. 3.3.1), sollte die
Reduktion der Expression von α
Abb. 3 .12: Blotmembran zur Quantifizierung der Expression von
Bei der Detektion von erwartet eine Bande bei 43 kDa. Die Intensität der Banden ist in den Proben der Normoxiefolgt die Gruppe, die während der Hypoxiebehandlung BF(5 mg/kg) erhielt. Am kräftigsten wirken die Banden bei den Proben der Tiere, welche während des Aufenthalts in hypoxischen Verhältnissen keine Substanz erhielten.
der oben beschriebenen Tiergruppen, sollte daher eine Aussage über
potentielle Signaltransduktionswege möglich sein.
Von besonderem Interesse waren dabei die extracellular signal-regulated kinases
eine mögliche Kopplung dieser mit dem 5-HT2B in der Literatur beschrieben ist (Nebigil
Es existieren zwei Formen der ERK: ERK1 (p44 MAPK) sowie ERK2
MAPK). Sie übernehmen vielfältige Aufgaben in zellulären Prozessen wie
Differenzierung und Proliferation (Johnson & Lapadat, 2002; Zhan et al.
wodurch eine Beteiligung der ERK am Prozess der Neomuskularisierung im
Einklang mit den bisher beschriebenen Funktionen stehen würde.
Um die ERK zu aktivieren, muss eine Phosphorylierung innerhalb des konservierten
Roux & Blenis, 2004). Zur Detektion der ERK und ihrer
phosphorylierten Formen (pERK) wurden Antikörper verwendet, welche zwischen
der ERK unterschieden können.
sche Positivkontrolle wurde die Expression von α-Glattmuskelaktin in den oben
beschriebenen Tiergruppen untersucht. Da die Blockierung des 5-HT2B Rezeptors
induzierten Neomuskularisierung führte (vgl. 3.3.1), sollte die
duktion der Expression von α-Glattmuskelaktin im Western Blot detektierbar sein.
.12: Blotmembran zur Quantifizierung der Expression von α-Glattmuskelaktin
Bei der Detektion von α-Glattmuskelaktin entstand wie erwartet eine Bande bei 43 kDa. Die Intensität der Banden ist in den Proben der Normoxie-Gruppe am schwächsten. Darauf folgt die Gruppe, die während der Hypoxiebehandlung BF-1
mg/kg) erhielt. Am kräftigsten wirken die Banden bei den der Tiere, welche während des Aufenthalts in
hypoxischen Verhältnissen keine Substanz erhielten.
Ergebnisse
75
der oben beschriebenen Tiergruppen, sollte daher eine Aussage über
regulated kinases (ERK), da
in der Literatur beschrieben ist (Nebigil et al.,
MAPK) sowie ERK2
MAPK). Sie übernehmen vielfältige Aufgaben in zellulären Prozessen wie
et al., 2003; Nagarajan
wodurch eine Beteiligung der ERK am Prozess der Neomuskularisierung im
innerhalb des konservierten
. Zur Detektion der ERK und ihrer
phosphorylierten Formen (pERK) wurden Antikörper verwendet, welche zwischen der aktiven
Glattmuskelaktin in den oben
Rezeptors zu einer
induzierten Neomuskularisierung führte (vgl. 3.3.1), sollte die
Glattmuskelaktin im Western Blot detektierbar sein.
Ergebnisse
76
Abb. 3.12 zeigt einen Ausschnitt der Blotmembran, auf welcher ein Antikörper gegen
α-Glattmuskelaktin nachgewiesen wurde. Hier wird ersichtlich, dass die Intensität der
Banden von Proben der Normoxie-Gruppe schwächer war, als in denen von Hypoxie-
behandelten Tieren. Die Banden der Proben von Tieren, welche während der
Hypoxiebehandlung BF-1 erhielten, erschienen leicht schwächer, als bei den Proben der
Tiere, die keine Substanz erhielten.
Um eine Aussage über die Expression treffen zu können, musste die Proteinmenge der
einzelnen Spuren auf den Blotmembranen bestimmt werden. Dazu wurden die kompletten
Membranen, nachdem ein Bild der zu quantifizieren Banden (hier: α-Glattmuskelaktin)
aufgenommen wurde, mit Coomassie gefärbt. Mittels des Programms TINA 2.0 konnte die
optische Dichte der Färbung auf der Membran bestimmt werden. Somit konnte die Intensität
der zu quantifizierenden Banden in Relation zur Gesamtproteinmenge einer Spur des Blots
gesetzt und dadurch normiert werden.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Normoxie 4 W Hypoxie 4 W Hypoxie + BF-1 [5 mg/kg]
Ban
deni
nten
sitä
t (n
orm
iert
auf
Nor
mox
ie-G
rupp
e) *
Abb. 3.13: Quantifizierung der Expression von α-Glattmuskelaktin in der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung und Gabe de s 5-HT2B Rezeptor Antagonisten BF-1
Der Western Blot bestätigte das Ergebnis der histologischen Auswertung (vgl. 3.3.1) dahingehend, dass die Expression von α-Glattmuskelaktin durch die Hypoxiebehandlung zunahm (Faktor ca. 1,6), und dass es durch die Blockierung des 5-HT2B.Rezeptors zu einer Reduktion der Menge von glatter Muskulatur in der Lunge kam. Ein statistisch signifikanter Unterschied bestand lediglich zwischen der Gruppe normoxisch gehaltener Tiere und der Gruppe, welche unter hypoxischen Bedingungen keine Substanz erhielt. Die Normierung erfolgte gegen eine Coomassie-Färbung der kompletten Laufspuren. (ANOVA, *: p<0,05, n=8; ±SEM)
Das Ergebnis der Quantifizierung von
geht hervor, dass sich das Ergebnis aus der
sich ein signifikanter Unterschied zwischen normoxisch und hypoxisch gehaltenen Tieren
heraus (ANOVA, p<0,05). In der Gruppe, welche zur Hypoxiebehandlung zusätzlich
Injektionen von BF-1 (5 mg/kg) erhielt, w
Vergleich zur Hypoxie-Gruppe erniedrigt, der Unterschied war jedoch nicht statistisch
signifikant. Trotzdem zeigte sich die Methode als geeignet, um die Expression von ERK
sowie pERK in den verschiedenen Tiergru
Für die Quantifizierung der Express
zwei verschiedene Antikörper eingesetzt. Beide konnten sowohl ERK 1 als auch ERK 2
detektieren. Allerdings besaß nur einer der Antikörper die Fähig
Formen zu erkennen. Somit war es möglich sowohl die inaktive Form (ERK) als auch die
aktive Form (pERK) in den verschiedenen Tiergruppen zu untersuchen.
Ein repräsentativer Ausschnitt der Blotmembran zur Detektion der ERK ist in
sehen. Mit dem verwendeten Antikörper konnten sowohl die ERK1 als auch die ERK2
nachgewiesen werden. Die ERK1
werden, die ERK2-Banden wurden auf einer Höhe von 42 kDa sichtbar. Die Intensität d
ERK1-Banden war im Vergleich zu den ERK2
einzelnen Gruppen konnten allerdings keine offensichtlichen Unterschiede festgestellt
werden.
Abb. 3.15 zeigt die Auswertung der Quantifizierung der ERK aus den Proteinlysaten der
Mäuselungen. In den Proben der Hypoxie
auch für ERK 2 eine um etwa 20% verminderte Proteinmenge im Vergleich zur
Abb. 3.14 : Blotmembran zur Quantifizierung der Expression vo n
Nach der Detektion des ERK Antikörpers waren zwei Banden sichtbar. ERK1 konnte auf einer Höhe von 44 kDa, ERK2 bei 42 kDa nachgewiesen werden. Die Intensität der ERK1Vergleich zu den ERK2-Banden etwas stärker. Zwischen den drei Gruppen konntder Blotmembran keine offensichtlichen Unterschiede festgestellt werden.
ERK1
ERK2
Das Ergebnis der Quantifizierung von α-Glattmuskelaktin ist in Abb. 3.13 abgebildet. Daraus
geht hervor, dass sich das Ergebnis aus der histologischen Auswertung bestätigte.
sich ein signifikanter Unterschied zwischen normoxisch und hypoxisch gehaltenen Tieren
heraus (ANOVA, p<0,05). In der Gruppe, welche zur Hypoxiebehandlung zusätzlich
mg/kg) erhielt, war die Expression des α-Glattmuskelaktins im
Gruppe erniedrigt, der Unterschied war jedoch nicht statistisch
signifikant. Trotzdem zeigte sich die Methode als geeignet, um die Expression von ERK
sowie pERK in den verschiedenen Tiergruppen zu untersuchen.
Für die Quantifizierung der Expression der ERK sowie der phosphorylierten Formen wurden
zwei verschiedene Antikörper eingesetzt. Beide konnten sowohl ERK 1 als auch ERK 2
detektieren. Allerdings besaß nur einer der Antikörper die Fähigkeit die phosphorylierten
Formen zu erkennen. Somit war es möglich sowohl die inaktive Form (ERK) als auch die
aktive Form (pERK) in den verschiedenen Tiergruppen zu untersuchen.
Ein repräsentativer Ausschnitt der Blotmembran zur Detektion der ERK ist in
sehen. Mit dem verwendeten Antikörper konnten sowohl die ERK1 als auch die ERK2
nachgewiesen werden. Die ERK1-Banden konnten wie erwartet bei 44
Banden wurden auf einer Höhe von 42 kDa sichtbar. Die Intensität d
Banden war im Vergleich zu den ERK2-Banden etwas stärker, zwischen den
einzelnen Gruppen konnten allerdings keine offensichtlichen Unterschiede festgestellt
zeigt die Auswertung der Quantifizierung der ERK aus den Proteinlysaten der
Mäuselungen. In den Proben der Hypoxie-behandelten Tiere konnte sowohl für die ERK1 als
auch für ERK 2 eine um etwa 20% verminderte Proteinmenge im Vergleich zur
: Blotmembran zur Quantifizierung der Expression vo n ERK
ERK Antikörpers waren zwei Banden sichtbar. ERK1 konnte auf einer Höhe von 44 kDa, ERK2 bei 42 kDa nachgewiesen werden. Die Intensität der ERK1
Banden etwas stärker. Zwischen den drei Gruppen konntder Blotmembran keine offensichtlichen Unterschiede festgestellt werden.
Ergebnisse
77
Glattmuskelaktin ist in Abb. 3.13 abgebildet. Daraus
histologischen Auswertung bestätigte. Es stellte
sich ein signifikanter Unterschied zwischen normoxisch und hypoxisch gehaltenen Tieren
heraus (ANOVA, p<0,05). In der Gruppe, welche zur Hypoxiebehandlung zusätzlich
Glattmuskelaktins im
Gruppe erniedrigt, der Unterschied war jedoch nicht statistisch
signifikant. Trotzdem zeigte sich die Methode als geeignet, um die Expression von ERK
ion der ERK sowie der phosphorylierten Formen wurden
zwei verschiedene Antikörper eingesetzt. Beide konnten sowohl ERK 1 als auch ERK 2
keit die phosphorylierten
Formen zu erkennen. Somit war es möglich sowohl die inaktive Form (ERK) als auch die
Ein repräsentativer Ausschnitt der Blotmembran zur Detektion der ERK ist in Abb. 3.14 zu
sehen. Mit dem verwendeten Antikörper konnten sowohl die ERK1 als auch die ERK2
Banden konnten wie erwartet bei 44 kDa detektiert
Banden wurden auf einer Höhe von 42 kDa sichtbar. Die Intensität der
Banden etwas stärker, zwischen den
einzelnen Gruppen konnten allerdings keine offensichtlichen Unterschiede festgestellt
zeigt die Auswertung der Quantifizierung der ERK aus den Proteinlysaten der
behandelten Tiere konnte sowohl für die ERK1 als
auch für ERK 2 eine um etwa 20% verminderte Proteinmenge im Vergleich zur
ERK Antikörpers waren zwei Banden sichtbar. ERK1 konnte auf einer Höhe von 44 kDa, ERK2 bei 42 kDa nachgewiesen werden. Die Intensität der ERK1-Banden war im
Banden etwas stärker. Zwischen den drei Gruppen konnten bei Betrachtung
Ergebnisse
78
Kontrollgruppe beobachtet werden. Aufgrund des geringen Unterschieds und der Streuung
der Messwerte war dieser Unterschied jedoch nicht statistisch signifikant (n=7, ANOVA).
Daher zeigte sich hier lediglich ein Trend für das reduzierte Vorliegen der nicht
phosphorylierten ERK Formen nach Hypoxiebehandlung. In den Proben der Tiere, welche
während der Hypoxiebehandlung BF-1 (5 mg/kg) erhielten, konnte eine mit der
Kontrollgruppe vergleichbare Menge der ERK detektiert werden.
In Abb. 3.16 ist ein repräsentativer Ausschnitt einer Blotmembran nach der Detektion mit
dem Antikörper gegen pERK dargestellt. Auch hier konnte sowohl die Form bei 44 kDa
(pERK1) als auch die Form bei 42 kDa (pERK2) nachgewiesen werden. Die Intensität der
pERK1-Banden war im Vergleich zu den pERK2-Banden wie schon bei der Detektion von
ERK etwas höher. Die Banden waren in den Proben der Hypoxie-behandelten Tiere am
stärksten, wohingegen die Banden der Proben aus den anderen Gruppen etwas schwächer
erschienen.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
Normoxie 4 W Hypoxie
4 W Hypoxie +
BF-1 [5 mg/kg]
Normoxie 4 W Hypoxie
4 W Hypoxie +
BF-1 [5 mg/kg]
ERK1 (p44) ERK2 (p42)
Ban
deni
nten
sitä
t (n
orm
iert
auf
Nor
mox
ie-G
rupp
e)
Abb. 3.15: Quantifizierung der Expression von ERK i n der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehandlung und Gabe des 5-HT 2B Rezeptorantagonisten BF-1
Der Quantifizierung der Western Blots zur Analyse der ERK zeigte, dass sowohl für ERK1 als auch ERK2 eine reduzierte Proteinmenge in den Lungenlysaten der Hypoxie-Gruppe gefunden wurde. Die Differenz zu den Proben der normoxisch gehaltenen Kontrollgruppe betrug etwa 20%, wobei keine statistische Signifikanz vorlag (ANOVA). Die Werte der Proben von den Tieren, welche unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden und BF-1 erhielten, lagen im Bereich der Werte der Kontrolltiere. Jedoch war auch hier der Unterschied zur Gruppe, die während der Hypoxiebehandlung nicht den 5-HT2B Rezeptor Antagonisten erhielt, zu gering, so dass keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt werden konnten. Somit handelte es bei der reduzierten Proteinmenge der ERK in der Hypoxie-Gruppe lediglich um einen Trend. Die Normierung erfolgte gegen eine Coomassie-Färbung der kompletten Laufspuren. (ANOVA, n=7; ±SEM)
Das Ergebnis der Quantifizierung
Resultat invertiert zur Quantifizierung der ERK (siehe Abb. 3.15). Die Proteinme
pERK war in den Proben hypoxisch gehaltener Tiere im Vergleich zur Kontrollgruppe und der
Gruppe, die während der Hypoxiebehandlung BF
Allerdings war auch hier der Unterschied nicht statistisch signifikant (n
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
Normoxie 4 W Hypoxie
pERK1 (p44)
Ban
deni
nten
sitä
t (n
orm
iert
auf
Nor
mox
ie-G
rupp
e)
pERK1
pERK2
Abb. 3.16 : Blotmembran zur Quantifizierung der Expression vo n
Nach der Detektion des pERK Antikörpers waren wie schon bei der Verwendung des ERK Antikörpers zwei Banden sichtbar. Die Intensität der ERK1Banden etwas intensiver. Bei der Betrachtung der Blot Membran schien die Intensität der Proben der Hypoxie-behandelten Gruppe im Vergleich zu den anderen Gruppen stärker zu sein.
Abb. 3.17: Quantifizierung der Expression von pHypoxiebehan dlung und Gabe des 5
Die Quantifizierung der pERK ergab, dass sowohl für pERK1 als auch pERK2 eine um etwa 20% erhöhte Proteinmenge in den Lungenlysaten der Hypoxiegefunden wurde. Dabei lag keine statistische Signifikanz vorlag (ANOVA)Tiere, welche unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden und Bder Werte der Kontrolltiere. Auch hier konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt werden konnten. Die Normierung erfolgte gegen eine Coomassie(ANOVA, n=7; ±SEM)
Das Ergebnis der Quantifizierung der pERK ist in Abb. 3.17 gezeigt. Hier verhielt sich das
Resultat invertiert zur Quantifizierung der ERK (siehe Abb. 3.15). Die Proteinme
pERK war in den Proben hypoxisch gehaltener Tiere im Vergleich zur Kontrollgruppe und der
Gruppe, die während der Hypoxiebehandlung BF-1 (5 mg/kg) erhielt, um ca. 20% erhöht.
Allerdings war auch hier der Unterschied nicht statistisch signifikant (n=7, ANOVA).
4 W Hypoxie
4 W Hypoxie +
BF-1 [5 mg/kg]
NormoxieHypoxie
pERK1 (p44) pERK2 (p42)
: Blotmembran zur Quantifizierung der Expression vo n pERK
ERK Antikörpers waren wie schon bei der Verwendung des ERK Antikörpers zwei Banden sichtbar. Die Intensität der ERK1-Banden war im Vergleich zu den ERK2Banden etwas intensiver. Bei der Betrachtung der Blot Membran schien die Intensität der Proben der
behandelten Gruppe im Vergleich zu den anderen Gruppen stärker zu sein.
Quantifizierung der Expression von p ERK in der Lunge von Mäusen nach dlung und Gabe des 5 -HT2B Rezeptorantagonisten BF-1
Quantifizierung der pERK ergab, dass sowohl für pERK1 als auch pERK2 eine um etwa 20% erhöhte Proteinmenge in den Lungenlysaten der Hypoxie-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe gefunden wurde. Dabei lag keine statistische Signifikanz vorlag (ANOVA). Die Werte der Proben der Tiere, welche unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden und BF-1 erhielten, lagen im Bereich
Auch hier konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt Die Normierung erfolgte gegen eine Coomassie-Färbung der kompletten Laufspuren.
Ergebnisse
79
der pERK ist in Abb. 3.17 gezeigt. Hier verhielt sich das
Resultat invertiert zur Quantifizierung der ERK (siehe Abb. 3.15). Die Proteinmenge der
pERK war in den Proben hypoxisch gehaltener Tiere im Vergleich zur Kontrollgruppe und der
1 (5 mg/kg) erhielt, um ca. 20% erhöht.
=7, ANOVA).
4 W Hypoxie
4 W Hypoxie +
BF-1 [5 mg/kg]
pERK2 (p42)
ERK Antikörpers waren wie schon bei der Verwendung des ERK Banden war im Vergleich zu den ERK2-
Banden etwas intensiver. Bei der Betrachtung der Blot Membran schien die Intensität der Proben der behandelten Gruppe im Vergleich zu den anderen Gruppen stärker zu sein.
in der Lunge von Mäusen nach
Quantifizierung der pERK ergab, dass sowohl für pERK1 als auch pERK2 eine um etwa 20% Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe
. Die Werte der Proben der 1 erhielten, lagen im Bereich
Auch hier konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede festgestellt Färbung der kompletten Laufspuren.
3.4. Wirkungs weise von Migräne
3.4.1 Inhibition der Stickstoffmonoxid
Die Bedeutung der endothelialen NO
bereits beschrieben (Johnson
Aktivierung des 5-HT2B Rezeptor
(NO) führt (Schmuck et al., 1996
werden, dass die Inhibition sowohl des
Plasmaproteinextravasation verhindern konnte (Daniel Segelcke, persönliche Mitteilung). Da
in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass die Blockierung des 5
verminderten Neomuskularisierung führt (siehe
Inhibition der NOS auch im Tiermodell der PH zu untersuchen.
Vorab wurde mittels Western Blot überprüft, ob unter hypoxischen Bedingungen eine
Expressionsveränderung der eNOS stattfindet. Die Auswert
Abb. 3.18 dargestellt. Daraus wird ersichtlich, dass es durch die Hypoxiebehandlung
tendenziell zu einer verstärkten Expression der eNOS kam.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Ban
deni
nten
sitä
t(n
orm
iert
auf
Nor
mox
ie-G
rupp
e)
Abb.3.18: Quantifizierung der Expression von eNOS von Mäusen nach Hypoxiebehan
Der Western Blot ergab einen Trend dafür, dass sich die relative Menge der eNOS in den Lungen hypoxisch gehaltener und normoxisch gehaltener Kontrolltiere etwa um den Faktor 2 unterschied. Somit lag eine verstärkte Expression der eNOS durch die HypoxiebehaCoomassie-Färbung der kompletten Laufspuren. (tn=9; ±SEM)
weise von Migräne -assoziierten Pharmaka in der PH
3.4.1 Inhibition der Stickstoffmonoxid -Synthase durch L-NAME
endothelialen NO-Synthase (eNOS) wurde für das Migräne
bereits beschrieben (Johnson et al., 2003). Es konnte bereits gezeigt werden, dass die
Rezeptor zu einer verstärkten Freisetzung von Stickstoffmonoxid
, 1996). Gleichzeitig konnte im Tiermodell der Migräne gezeigt
werden, dass die Inhibition sowohl des 5-HT2B Rezeptors als auch der NOS die
Plasmaproteinextravasation verhindern konnte (Daniel Segelcke, persönliche Mitteilung). Da
in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass die Blockierung des 5
Neomuskularisierung führt (siehe 3.3.1), war es von großem Interesse, die
Inhibition der NOS auch im Tiermodell der PH zu untersuchen.
Vorab wurde mittels Western Blot überprüft, ob unter hypoxischen Bedingungen eine
Expressionsveränderung der eNOS stattfindet. Die Auswertung dieses Vers
3.18 dargestellt. Daraus wird ersichtlich, dass es durch die Hypoxiebehandlung
tendenziell zu einer verstärkten Expression der eNOS kam.
Normoxie Hypoxie
Quantifizierung der Expression von eNOS in der Lunge von Mäusen nach Hypoxiebehan dlung mittels Western Blot
Der Western Blot ergab einen Trend dafür, dass sich die relative Menge der eNOS in den Lungen hypoxisch gehaltener und normoxisch gehaltener Kontrolltiere etwa um den Faktor 2 unterschied. Somit lag eine verstärkte Expression der eNOS durch die Hypoxiebehandlung nahe. Die Normierung erfolgte gegen eine
Färbung der kompletten Laufspuren. (t-Test; †: p=0,053,
Ergebnisse
80
Synthase (eNOS) wurde für das Migräne-Tiermodell
konnte bereits gezeigt werden, dass die
zu einer verstärkten Freisetzung von Stickstoffmonoxid
). Gleichzeitig konnte im Tiermodell der Migräne gezeigt
s als auch der NOS die
Plasmaproteinextravasation verhindern konnte (Daniel Segelcke, persönliche Mitteilung). Da
in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass die Blockierung des 5-HT2B zu einer
3.3.1), war es von großem Interesse, die
Vorab wurde mittels Western Blot überprüft, ob unter hypoxischen Bedingungen eine
ung dieses Versuchs ist in
3.18 dargestellt. Daraus wird ersichtlich, dass es durch die Hypoxiebehandlung
in der Lunge
Der Western Blot ergab einen Trend dafür, dass sich die relative Menge der eNOS in den Lungen hypoxisch gehaltener und normoxisch gehaltener Kontrolltiere etwa um den Faktor 2 unterschied. Somit lag eine verstärkte Expression der eNOS durch
ndlung nahe. Die Normierung erfolgte gegen eine : p=0,053,
Durch die hohe Streuung der Messwerte ergab sich nach der statistischen Prüfung keine
statistische Signifikanz (t-Test, p=0,
der Mittelwert für die Hypoxie-
hoch lag. Dies legt den Schluss nahe, dass es durch die Hypoxiebehandlung zu einer
verstärkten Expression der eNOS kam.
Um die Bedeutung der NOS
Substanz NG-Nitro-L-Arginin
10 mg/kg, 20 mg/kg) verabreicht. Dabei handelt es sich um einen nicht
Inhibitor (Kubes et al., 1991; Moore
normoxischen als auch hypoxischen Bedingungen im Rhythmus von 24 h statt.
Das Ergebnis der Auszählung muskularisierte Blutgefäße ist in Abb. 3.19 zu sehen. Hieraus
wurde ersichtlich, dass die Injektion von L
der Blutgefäße mit einem Durchmesser
die höchste Dosis L-NAME unter normoxischen Bedingungen erhalten hatte, kein
Unterschied zu der Gruppe, die keine Substanz erhalten hatte. Gleic
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Normoxie Normoxie + 20 mg/kg L-
mus
kula
risie
rte
Blu
tgef
äße
(n
orm
iert
auf
Nor
mox
ie-G
rupp
e)
Abb. 3.19: Untersuchung der Beteiligung Blutgefäßen mit einem Durchmesser von Hypoxiebehandlung durch Inhibition mittels L
In den Gruppen der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, zeigte sich im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Normoxie) eine erhöhte Anzahl muskularisierter Blutgefäße (p<0,01 bzw. p<0,05, ANOVA). Die tägliche Applikation von Lvon der Dosis weder unter normoxischen noch hypoxischen Bedingungen zu einhypoxisch bedingten Neomuskularisierung. (
Durch die hohe Streuung der Messwerte ergab sich nach der statistischen Prüfung keine
Test, p=0,053). Es war allerdings ein klarer Trend erkennbar, da
-behandelte Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe doppelt so
hoch lag. Dies legt den Schluss nahe, dass es durch die Hypoxiebehandlung zu einer
eNOS kam.
Um die Bedeutung der NOS in der PH genauer zu untersuchen, wurde den
Arginin-methylester (L-NAME) in verschiedenen Dosen (1
mg/kg) verabreicht. Dabei handelt es sich um einen nicht
, 1991; Moore et al., 1993). Die Injektion (i.p.) fand täglich sowohl unter
normoxischen als auch hypoxischen Bedingungen im Rhythmus von 24 h statt.
Das Ergebnis der Auszählung muskularisierte Blutgefäße ist in Abb. 3.19 zu sehen. Hieraus
wurde ersichtlich, dass die Injektion von L-NAME keinen Einfluss auf die Muskularisierung
der Blutgefäße mit einem Durchmesser ≤50 µm hatte. So bestand zwischen der Gruppe, die
NAME unter normoxischen Bedingungen erhalten hatte, kein
Unterschied zu der Gruppe, die keine Substanz erhalten hatte. Gleic
Normoxie + 20 mg/kg
-NAME
4 W Hypoxie 4 W Hypoxie +
1 mg/kg L-NAME
4 W Hypoxie +
10 mg/kg L-NAME
Untersuchung der Beteiligung der NOS an der Neomuskularisierung von einem Durchmesser von ≤50 µm in der Lunge von Mäusen nach
durch Inhibition mittels L -NAME
In den Gruppen der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, ich im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Normoxie) eine erhöhte Anzahl muskularisierter
Blutgefäße (p<0,01 bzw. p<0,05, ANOVA). Die tägliche Applikation von L-NAME führte unabhängig von der Dosis weder unter normoxischen noch hypoxischen Bedingungen zu einhypoxisch bedingten Neomuskularisierung. (**: p<0,01; *:p<0,05; n≥4; ±SEM)
Ergebnisse
81
Durch die hohe Streuung der Messwerte ergab sich nach der statistischen Prüfung keine
053). Es war allerdings ein klarer Trend erkennbar, da
behandelte Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe doppelt so
hoch lag. Dies legt den Schluss nahe, dass es durch die Hypoxiebehandlung zu einer
genauer zu untersuchen, wurde den Tieren die
NAME) in verschiedenen Dosen (1 mg/kg,
mg/kg) verabreicht. Dabei handelt es sich um einen nicht-selektiven NOS-
, 1993). Die Injektion (i.p.) fand täglich sowohl unter
normoxischen als auch hypoxischen Bedingungen im Rhythmus von 24 h statt.
Das Ergebnis der Auszählung muskularisierte Blutgefäße ist in Abb. 3.19 zu sehen. Hieraus
auf die Muskularisierung
50 µm hatte. So bestand zwischen der Gruppe, die
NAME unter normoxischen Bedingungen erhalten hatte, kein
Unterschied zu der Gruppe, die keine Substanz erhalten hatte. Gleichzeitig existierten
4 W Hypoxie +
10 mg/kg NAME
4 W Hypoxie +
20 mg/kg L-NAME
an der Neomuskularisierung von in der Lunge von Mäusen nach
In den Gruppen der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, ich im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Normoxie) eine erhöhte Anzahl muskularisierter
NAME führte unabhängig von der Dosis weder unter normoxischen noch hypoxischen Bedingungen zu einer Veränderung der
Ergebnisse
82
statisch signifikante Unterschiede (p<0,01 bzw. p<0,05, ANOVA) zwischen den Gruppen, die
in der Hypoxiekammer gehalten wurden und den unter normoxischen Luftverhältnissen
gehaltenen Tieren. Demnach kam es zur bereits beschriebenen Hypoxie-induzierten
Neomuskularisierung der pulmonalen Blutgefäße. Dieser Prozess war allerdings unabhängig
von der Gabe von L-NAME. Dies lässt den Schluss zu, dass die NOS keine Bedeutung für
die Entstehung der neuen vaskulären Muskelschicht hatte.
3.4.2 Aktivierung des 5-HT 1B Rezeptors durch Sumatriptan
Die am häufigsten verwendeten Medikamente zur akuten Migränebekämpfung stellen die
Triptane dar. Sie entfalten ihre Wirkung über 5-HT1B/1D Rezeptoren. Die Stimulation des
5-HT1B Rezeptors führt zu einer Vasokonstriktion duraler Blutgefäße (Tfelt-Hansen et al.,
2000). Durch Aktivierung von 5-HT1D Rezeptoren wird die Ausschüttung
proinflammatorsicher Neuropeptide reduziert (Buzzi & Moskowitz, 2005). Im Tiermodell der
Migräne vermögen Triptane die 5-HT2B-induzierte Plasmaproteinextravasation zu blockieren
(Daniel Segelcke, persönliche Mitteilung). Daher war es von Interesse, die Wirkung des
5-HT1B/D Rezeptor Agonisten im Tiermodell der PH zu erforschen. Dabei war die Wirkung an
5-HT1D Rezptoren zu vernachlässigen (Keegan et al., 2001, siehe auch 4.3.2).
Dazu wurde den Tieren Sumatriptan in einer Dosis von 1 mg/kg sowohl unter normoxischen
als auch hypoxischen Bedingungen im Abstand von 24 h injiziert (i.p.). Im Anschluss wurden
die Blutgefäße mit einem Durchmesser ≤50 µm quantifiziert.
Das Ergebnis der Zählung der muskularisierten Blutgefäße ist in Abb. 3.20 dargestellt. Da es
hier einen bedeutenden Unterschied zwischen den verschiedenen Gruppen untersuchter
Blutgefäße gab, sind die Werte für die kleinsten Blutgefäße (Durchmesser ≤25 µm) und die
etwas größeren Blutgefäße (26 µm – 50 µm) getrennt angegeben.
Abb. 3.20 A zeigt die Quantifizierung der muskularisierten Blutgefäße mit einem
Durchmesser von ≤25 µm. Daraus geht hervor, dass die Gabe von Sumatriptan unter
normoxischen Bedingungen keinen Einfluss auf die vaskuläre Muskulatur hatte. Die Anzahl
der muskularisierten Blutgefäße blieb nahezu unverändert. Anders verhielt es sich, wurden
die Tiere unter Hypoxiebedingungen gehalten. In der Gruppe, die keine pharmakologisch
aktive Substanz erhielt, zeigte sich eine Vermehrung muskularisierter Blutgefäße um den
Faktor 2,7. Erhielten die Tiere Sumatriptan stieg der Wert um den Faktor 5 im Vergleich zu
den Kontrolltieren. Die Gabe des 5-HT1B/1D Rezeptor Agonisten verstärkte somit den
Hypoxieeffekt und führte zu einer Verstärkung der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung.
Ergebnisse
83
0
1
2
3
4
5
6
7
Normoxie Normoxie + Sumatriptan
1 mg/kg
4 W Hypoxie 4 W Hypoxie + Sumatriptan
1 mg/kg
mus
kula
risie
rte
Blu
tgef
äße
(n
orm
iert
auf
Nor
mox
ie-G
rupp
e)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
Normoxie Normoxie + Sumatriptan
1 mg/kg
4 W Hypoxie 4 W Hypoxie + Sumatriptan
1 mg/kg
mus
kula
risie
rte
Blu
tgef
äße
(n
orm
iert
auf
Nor
mox
ie-G
rupp
e)
A
B
Abb. 3.20: Untersuchung der Rolle des 5-HT 1B Rezeptors im Tiermodell der Pulmonalen Hypertonie durch Gabe des spezifischen R ezeptor Agonisten Sumatriptan
(A) Blutgefäße ≤25 µm: In den Gruppen der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, zeigte sich im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Normoxie) eine erhöhte Anzahl muskularisierter Blutgefäße. Die tägliche Applikation von Sumatriptan führte unter hypoxischen Bedingungen zu einer starken Zunahme muskularisierter Blutgefäße (Faktor 5). Die Applikation des 5-HT1B/1D Rezeptor Agonisten hatte bei Tieren, die unter normoxischen Bedingungen gehalten wurden, keinen Einfluss auf die vaskuläre Muskularisierung. (B) Blutgefäße 26 µm – 50 µm: Es zeigte sich die gleiche Tendenz wie bei den kleineren Blutgefäßen, allerdings fiel der Sumatriptan-vermittelte Effekt in der Hypoxie-Gruppe etwas geringer aus (Faktor 3). Auch die Hypoxie-induzierte Neomuskularisierung war etwas schwächer (Faktor 2) (n≥6; ±SEM).
Ergebnisse
84
In Abb. 3.20 B ist das Ergebnis der Zählung der muskularisierten Blutgefäße mit einem
Durchmesser von 26 µm – 50 µm dargestellt. Hier zeigte sich im Wesentlichen der gleiche
Effekt wie bei den kleineren Blutgefäßen, allerdings war er nicht so stark ausgeprägt. So rief
Sumatriptan in der hypoxisch gehaltenen Tiergruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe eine
Neomuskularisierung um den Faktor 3 hervor, wohingegen der 5-HT1B/1D Rezeptor Agonist
keine Auswirkung auf die Muskularisierung in der Lunge von Tieren hatte, die unter
normoxischen Bedingungen gehalten wurden. Die Gruppe, welche zwar unter
Hypoxiebedingungen lebte, aber nicht Sumatriptan erhielt, wies eine verdoppelte Anzahl
muskularisierter Blutgefäße der Größe 26 µm – 50 µm im Vergleich zur Kontrollgruppe auf.
Die statistische Auswertung ist aus Gründen der Übersichtlichkeit in Tab. 3.2 gegeben.
Daraus geht hervor, dass alle beschriebenen Unterschiede zwischen den Gruppen
statistische Signifikanz aufwiesen. Die Zunahme der Muskularisierung nach
Hypoxiebehandlung und Sumatriptanapplikation zeigte im Vergleich zu den Kontrollgruppen
die höchste Signifikanz (p<0,001). Dies war für beide untersuchten Blutgefäßgrößen der Fall.
Die Differenz zur Gruppe, die ebenfalls unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurde,
jedoch keine Substanz erhielt, war ebenfalls signifikant (p<0,01 bzw. p<0,05). Während sich
für diese Hypoxie-Gruppe statistisch signifikante Unterschiede zu den beiden Normoxie-
Gruppen bestätigten (p<0,01 bzw. p<0,05), war dies für die Kontrollgruppen nicht der Fall.
Normoxie
Normoxie +
Sumatriptan Hypoxie
Hypoxie +
Sumatriptan
≤25 µm
Normoxie - n.s. ** ***
Normoxie +
Sumatriptan n.s. - ** ***
Hypoxie ** ** - **
Hypoxie +
Sumatriptan *** *** ** -
26 µm
–
50 µm
Normoxie - n.s. ** ***
Normoxie +
Sumatriptan n.s. - * ***
Hypoxie ** * - *
Hypoxie +
Sumatriptan *** *** * -
Tab. 3.2: Statistische Auswertung zum Versuch ‚Akti vierung des 5-HT 1B Rezeptors durch Sumatriptan‘ (***: p<0,001; **: p<0,01; *: p<0,05; n.s.: nicht signifikant)
Ergebnisse
85
3.4.3 Aktivierung des 5-HT 2B Rezeptors durch mCPP
Nachdem in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass die Inhibition des 5-HT2B Rezeptors
die Hypoxie-induzierte Neomuskularisierung in den Blutgefäßen der Lunge vermindern
konnte (siehe 3.3.1), sollte überprüft werden, welche Auswirkungen die dauerhafte
pharmakologische Aktivierung des Rezeptors nach sich zieht. Damit konnte zudem überprüft
werden, ob der 5-HT2B unter hypoxischen Lebensbedingungen ebenfalls dauerhaft stimuliert
wird.
Auch bei diesem Versuchsansatz besteht eine Verbindung zur Pathogenese der Migräne. Es
konnte gezeigt werden, dass die Substanz 1-(3-Chlorphenyl)piperazin (mCPP) beim
Menschen Migräne auslösen kann (Brewerton et al., 1988). Darüber hinaus löst dieses
Piperazin-Derivat im Tiermodell eine Plasmaproteinextravasation (PPE) aus (Johnson et al.,
2003; Daniel Segelcke, persönliche Mitteilung). Es konnte bereits gezeigt werden, dass
mCPP als Agonist am 5-HT2B Rezeptor wirkt (Wainscott et al., 1993; Porter et al., 1999;
Martin & Martin, 2001). Daher wurde den Tieren während der Hypoxiebehandlung täglich
mCPP i.p. in einer Dosis von 1 mg/kg injiziert.
Das Resultat der Zählung muskularisierter Blutgefäße ist in Abb. 3.21 dargestellt. Da es hier
wie schon nach Verabreichung von Sumatriptan (siehe 3.4.2) einen bedeutenden
Unterschied zwischen den verschiedenen Gruppen untersuchter Blutgefäße gab, sind die
Werte für die kleinsten Blutgefäße (≤ 25 µm) und die etwas größeren Blutgefäße
(26 µm - 50 µm) gesondert angegeben.
Abb. 3.21 A zeigt das Ergebnis der Zählung von muskularisierten Blutgefäßen mit einem
Durchmesser von ≤25 µm. Daraus geht hervor, dass die Gabe von mCPP (1 mg/kg) bereits
unter normoxischen Bedingungen einen Einfluss auf die vaskuläre Muskulatur hatte. Die
Anzahl der muskularisierten Blutgefäße befand sich auf dem Niveau der Hypoxie-Gruppe
und war im Vergleich zur Kontrollgruppe (Normoxie) etwa doppelt so hoch. In der Gruppe der
Tiere, die unter Hypoxiebedingungen gehalten wurden und zusätzlich täglich mCPP
(1 mg/kg) erhielten, zeigte sich eine Vervielfachung der muskularisierten Blutgefäße um den
Faktor 5,5. mCPP verstärkte somit die Hypoxie-induzierte Neomuskularisierung.
In Abb. 3.20 B ist das Resultat der Zählung der Blutgefäße mit einem Durchmesser von
26 µm – 50 µm dargestellt. In der Tendenz zeigte sich der gleiche Effekt wie bei den
kleineren Blutgefäßen, allerdings war die Ausprägung bei den Blutgefäßen dieser Größe
nicht so stark. Die Injektion von mCPP (1 mg/kg) führte in der hypoxisch gehaltenen
Tiergruppe im Vergleich zu der Kontrollgruppe zu einer Erhöhung der vaskulären
Muskularisierung um den Faktor 3.
Ergebnisse
86
0
1
2
3
4
5
6
7
Normoxie Normoxie + mCPP (1mg/kg)
4 W Hypoxie 4 W Hypoxie + mCPP (1mg/kg)
mus
kula
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tgef
äße
(n
orm
iert
auf
Nor
mox
ie-G
rupp
e)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
Normoxie Normoxie + mCPP (1mg/kg)
4 W Hypoxie 4 W Hypoxie + mCPP (1mg/kg)
mus
kula
risie
rte
Blu
tgef
äße
(n
orm
iert
auf
Nor
mox
ie-G
rupp
e)
A
B
Abb. 3.21: Untersuchung der Auswirkung der pharmako logischen Aktivierung des 5-HT 2B Rezeptors im Tiermodell der Pulmonalen Hypertonie d urch Gabe von 1-(3-Chlorphenyl)piperazin (mCPP)
(A) Blutgefäße ≤25 µm: In den Gruppen der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, zeigte sich im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Normoxie) eine Verdopplung muskularisierter Blutgefäße. Die tägliche Applikation von mCPP (1 mg/kg) führte sowohl unter normoxischen (Faktor 2) als auch unter hypoxischen Bedingungen (Faktor 5,5) zu einer starken Zunahme muskularisierter Blutgefäße. (B) Blutgefäße 26 µm – 50 µm: Es zeigte sich die gleiche Tendenz wie bei den kleineren Blutgefäßen, allerdings fiel der mCPP-vermittelte Effekt in der Hypoxie-Gruppe etwas geringer aus (Faktor 3,3). Somit konnte durch die Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors unter normoxischen Bedingungen ein vaskulärer Muskularisierungsgrad hervorgerufen werden, der dem nach vierwöchiger Hypoxiebehandlung entspricht. Wurde mCPP unter hypoxischen Bedingungen verabreicht, fand eine nochmals verstärkte Zunahme der vaskulären Muskulatur statt. ( n≥6; ±SEM)
Ergebnisse
87
Die Gruppe, welche unter Hypoxiebedingungen gehalten, aber nicht Sumatriptan erhielt,
wies eine verdoppelte Anzahl muskularisierter Blutgefäße im Vergleich zur Kontrollgruppe
auf. Dieser Befund zeigte sich auch in der Gruppe, welche mCPP erhielt und unter
normoxischen Bedingungen gehalten wurde.
Die statistische Auswertung ist aus Gründen der Übersichtlichkeit in Tab. 3.3 gezeigt.
Abgesehen vom Vergleich der Hypoxie-Gruppe und der Gruppe der Tiere, welche mCPP
unter normoxischen Bedingungen erhielten, waren zwischen den Gruppen statistisch
signifikante Unterschiede zu finden. Diese waren in ihrer Stärke bei den beiden untersuchten
Größen der Blutgefäße identisch. Die Zunahme der Muskularisierung nach
Hypoxiebehandlung und der Verabreichung von mCCP zeigte im Vergleich zu allen anderen
Gruppen die höchste Signifikanz (p<0,001). Zudem zeigte die Kontrollgruppe statistisch
signifikante Unterschiede sowohl zur Hypoxie-behandelten Gruppe als auch zu den Tieren,
welche mCPP unter normoxischen Bedingungen erhielten. (p<0,01). Die beiden
letztgenannten Gruppen wiesen keine statistisch signifikanten Unterschiede zueinander auf.
Normoxie
Normoxie +
mCPP Hypoxie
Hypoxie +
mCPP
≤ 25 µm
Normoxie - ** ** ***
Normoxie +
mCPP ** - n.s. ***
Hypoxie ** n.s. - ***
Hypoxie +
mCPP *** *** *** -
26 µm
–
50 µm
Normoxie - ** ** ***
Normoxie +
mCPP **. - n.s. ***
Hypoxie ** n.s. - ***
Hypoxie +
mCPP *** *** *** -
Tab. 3.3: Statistische Auswertung zum Versuch ‚ Akt ivierung des 5-HT 2B Rezeptors durch mCPP ‘ (***: p<0,001; **: p<0,01; *: p<0,05; n.s.: nicht signifikant)
Ergebnisse
88
3.4.4 Zusammenhang zwischen Hypoxie- und mCPP-induz ierter Neomuskularisierung
In dieser Arbeit konnte bestätigt werden, dass der 5-HT2B Rezeptor eine wichtige Rolle bei
der Remodellierung pulmonaler Blutgefäße spielt. Auch wenn die genaue Funktion des
Rezeptors in der Pathogenese der PH bisher nicht klar ist, liegt die Vermutung nahe, dass es
durch die Hypoxiebehandlung zu einer dauerhaften Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors
kommt, da die Blockierung des Rezeptors zu einer Reduktion der Neomuskularisierung
führte (siehe 3.3.1).
Um dies zu überprüfen, wurde ein Versuch durchgeführt, bei dem die Tiere der
Hypoxiebehandlung nicht über die kompletten vier Wochen unterzogen wurden. So wurden
die Tiere zuerst für zwei Wochen unter hypoxischen Luftverhältnissen gehalten. Nach dieser
Periode sollte es, wie unter 3.1.2 beschrieben, nicht zur Ausprägung der
Neomuskularisierung kommen. Nach der zweiwöchigen Hypoxiebehandlung wurde den
Tieren täglich mCPP in einer Dosis von 1 mg/kg i.p. injiziert, was eine dauerhafte Aktivierung
des 5-HT2B Rezeptors nach sich ziehen sollte. Die Substanz erhielten die Tiere für zwei bzw.
vier Wochen unter normoxischen Bedingungen. Dadurch sollte überprüft werden, ob die
dauerhafte Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors ausreichend ist, um die Effekte der
Hypoxiebehandlung hervorzurufen. Zudem wurde eine Tiergruppe einer vierwöchigen
Hypoxiebehandlung unterzogen und erhielt im Anschluss für weitere vier Wochen eine
tägliche Injektion mCPP (1 mg/kg). Dadurch sollte überprüft werden, ob es sich bei der
mCPP-induzierten Neomuskularisierung um einen additiven oder synergistischen Effekt in
Kombination mit der Hypoxie handelte.
Das Resultat dieses Versuchs ist in Abb. 3.22 dargestellt. Da es keinen relevanten
Unterschied in den Ergebnissen der beiden untersuchten Größen von Blutgefäßen gab, ist
hier das Ergebnis für alle Blutgefäße ≤50 µm zusammen gezeigt.
Wie in den vorangegangenen Versuchen kam es durch die vierwöchige Hypoxiebehandlung
zu einer Verdopplung der Anzahl muskularisierter Blutgefäße im Vergleich zur
Kontrollgruppe (p<0,001). Die Tiergruppe, welche nach der zweiwöchigen
Hypoxiebehandlung für weitere zwei Wochen tägliche Injektionen mCPP erhielt, zeigte keine
Ausprägung einer Neomuskularisi
dauerhafte Stimulation des
Hypoxiebehandlung nicht ausreichte, um eine Neomuskularisierung
Die beiden Tiergruppen, welche mCPP übe
zeigten die Ausprägung einer Neomuskularisierung im Vergleich zur normoxisch gehaltenen
Kontrollgruppe (p<0,001). Die Anzahl der muskularisierten Blutgefäße verdoppelte sich hier
ebenfalls und befand sich damit a
hypoxischen Luftbedingungen gehalten wurde.
0
0,5
1
1,5
2
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Normoxie
mus
kula
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rte
Blu
tgef
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orm
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auf
Nor
mox
ie-G
rupp
e)
Abb. 3.22: Quantifi zierung muskularisierter Blutgefäße mit einem Durch messer nach Variation der Dauer von Hypoxiebehandlung und der I njektion von m-Chlorphenylpiperazin (mCPP)
In der Gruppe der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, zeigte sich im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Normoxie) eine Verdopplungmuskularisierten Blutgefäße nach zweiwöchiger Hypoxiebehandlung zu keiner Veränderung der vaskulären MuskelschichtWurde mCPP (1 mg/kg) über einen Zeitraum von vier Wochen gespritzt, kam es zur Ausprägung einer Muskularisierung, die auf dem Niveau der Gruppe lag, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen erhalten. Somit kam es zu keinem additiven Effekt von Hypoxie und mCPP. ±SEM)
Wie in den vorangegangenen Versuchen kam es durch die vierwöchige Hypoxiebehandlung
opplung der Anzahl muskularisierter Blutgefäße im Vergleich zur
Kontrollgruppe (p<0,001). Die Tiergruppe, welche nach der zweiwöchigen
Hypoxiebehandlung für weitere zwei Wochen tägliche Injektionen mCPP erhielt, zeigte keine
Ausprägung einer Neomuskularisierung der Blutgefäße. Daraus lässt sich ableiten, dass die
dauerhafte Stimulation des 5-HT2B Rezeptors nach vorangegangener zweiwöchiger
t ausreichte, um eine Neomuskularisierung zu induzieren.
Die beiden Tiergruppen, welche mCPP über einen Zeitraum von vier Wochen erhielten,
zeigten die Ausprägung einer Neomuskularisierung im Vergleich zur normoxisch gehaltenen
Kontrollgruppe (p<0,001). Die Anzahl der muskularisierten Blutgefäße verdoppelte sich hier
ebenfalls und befand sich damit auf dem Niveau der Gruppe, welche vier Wochen unter
hypoxischen Luftbedingungen gehalten wurde.
Normoxie 4 W Hypoxie 2 W Hypoxie + 2 W mCPP
(in Normoxie)
2 W Hypoxie + 4 W mCPP
(in Normoxie) (in Normoxie)
zierung muskularisierter Blutgefäße mit einem Durch messer Variation der Dauer von Hypoxiebehandlung und der I njektion von
Chlorphenylpiperazin (mCPP)
der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten zeigte sich im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Normoxie) eine Verdopplung
(p<0,001). Die tägliche Applikation von mCPP nach zweiwöchiger Hypoxiebehandlung zu keiner Veränderung der vaskulären MuskelschichtWurde mCPP (1 mg/kg) über einen Zeitraum von vier Wochen gespritzt, kam es zur Ausprägung einer Muskularisierung, die auf dem Niveau der Gruppe lag, welche vier Wochen
hypoxischen Bedingungen gehalten wurde, ohne pharmakologische Substanzen zu erhalten. Somit kam es zu keinem additiven Effekt von Hypoxie und mCPP. (***: p<0,001;
Ergebnisse
89
Wie in den vorangegangenen Versuchen kam es durch die vierwöchige Hypoxiebehandlung
opplung der Anzahl muskularisierter Blutgefäße im Vergleich zur
Kontrollgruppe (p<0,001). Die Tiergruppe, welche nach der zweiwöchigen
Hypoxiebehandlung für weitere zwei Wochen tägliche Injektionen mCPP erhielt, zeigte keine
erung der Blutgefäße. Daraus lässt sich ableiten, dass die
Rezeptors nach vorangegangener zweiwöchiger
zu induzieren.
r einen Zeitraum von vier Wochen erhielten,
zeigten die Ausprägung einer Neomuskularisierung im Vergleich zur normoxisch gehaltenen
Kontrollgruppe (p<0,001). Die Anzahl der muskularisierten Blutgefäße verdoppelte sich hier
uf dem Niveau der Gruppe, welche vier Wochen unter
4 W Hypoxie + 4 W mCPP
(in Normoxie)
zierung muskularisierter Blutgefäße mit einem Durch messer ≤50 µm Variation der Dauer von Hypoxiebehandlung und der I njektion von
der Tiere, welche vier Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten zeigte sich im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Normoxie) eine Verdopplung der
. Die tägliche Applikation von mCPP (1 mg/kg) führte nach zweiwöchiger Hypoxiebehandlung zu keiner Veränderung der vaskulären Muskelschicht. Wurde mCPP (1 mg/kg) über einen Zeitraum von vier Wochen gespritzt, kam es zur Ausprägung einer Muskularisierung, die auf dem Niveau der Gruppe lag, welche vier Wochen
gehalten wurde, ohne pharmakologische Substanzen zu ***: p<0,001; n≥5;
Ergebnisse
90
Somit kam es hier nicht zu einem additiven Effekt von Hypoxie und mCPP, da maximal ein
Muskularisierungsgrad erreicht wurde, wie er durch die Haltung der Tiere unter hypoxischen
Bedingungen ohne Verwendung jeglicher Pharmaka erreicht wurde.
3.5 Zelluläre Lokalisation des 5-HT 2B Rezeptors
Nachdem in dieser Arbeit die Beteiligung des 5-HT2B Rezeptors an der Hypoxie-induzierten
Neomuskularisierung nachgewiesen werden konnte, war es von Bedeutung, zu bestimmen,
in welchen Zellen der Rezeptor lokalisiert ist. Dadurch könnte dieser Zelltyp näher
charakterisiert werden und im Hinblick auf 5-HT2B Rezeptor vermittelte Prozesse untersucht
werden. Zur zellulären Lokalisation des Rezeptors in der Lunge existieren bis heute kaum
publizierten Daten. In dieser Arbeit wurden sowohl immunhistochemische Färbungen als
auch die in situ-Hybridisierung verwendet, um sowohl die RNA des Rezeptors als auch das
Protein selbst nachzuweisen. Zudem bot sich so die Möglichkeit, die Ergebnisse beider
experimenteller Ansätze (RNA-Ebene und Protein-Ebene) zu vergleichen und auf
übereinstimmende Befunde zu prüfen.
3.5.1 in situ-Hybridisierung im Vormagen der Ratte
Der 5-HT2B Rezeptor wurde erstmals im Magen der Ratte beschrieben (siehe 1.2.1), daher
sollte dieses Organ als methodische Positivkontrolle verwendet werden, um die
Funktionalität der RNA-Sonden zu überprüfen.
Die verschiedenen Abschnitte des Magens der Ratte unterscheiden sich sowohl
morphologisch als auch funktionell recht stark voneinander. Auffällig ist der weißlich
schimmernde Teil, der Vormagen. Er verfügt über eine ausgeprägte Hornschicht, welche den
Magen vor mechanischen Verletzungen schützt und die Nahrung als erste Einheit des
Magens aufnimmt. Der folgende Abschnitt, der Fundus, weist keine Verhornung auf.
Stattdessen besitzt er die namengebenden Fundusdrüsen, welche den Magensaft
sezernieren.
Da der 5-HT2B Rezeptor im Vormagen lokalisiert ist, wurde natives Gewebe von diesem
Bereich des Magens bei ca. -60°C in Tissue-Tek Free zing Medium eingebettet. Davon
wurden 30 µm starke Gefrierschnitte angefertigt, welche in der in situ-Hybridisierung
verwendet wurden. Zur Detektion wurde die Methode der DIG-Markierung eingesetzt, so
dass Zellen, die das Transkript des 5-HT2B Rezeptor tragen, durch eine dunkle Färbung
detektierbar werden sollten. Als Kontrolle wurden Sense-Sonden verwendet. Die
Ergebnisse
91
Gewebeschnitte wurden daher entweder mit der Antisense- oder Sense-Sonde behandelt. In
beiden Fällen wurden die Schnitte dem exakt gleichen Prozedere unterzogen.
In Abb.3.23 sind mikroskopische Aufnahmen des Vormagens der Ratte zu sehen. Aufgrund
der Schnittdicke von 30 µm wiesen die Bilder der 400-fachen Vergrößerung leichte
Unschärfen auf.
Die Abb. 3.23 A und 3.23 C zeigen Schnitte des Vormagens, welche mit der
Antisense-Sonde des 5-HT2B Rezeptors hybridisiert wurden. In den Abb. 3.23 B und 3.23 D
sind Detailaufnahmen von Abb. 3.23 A und 3.23 C dargestellt. Abb. 3.23 E zeigt einen
Gewebeschnitt, der mit der Sense-Sonde behandelt wurde. Zur Visualisierung der
grundlegenden Strukturen des Vormagens wurde eine Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE)
angefertigt, welche in Abb. 3.23 F dargestellt ist.
In Abb. 3.23 A sind distinkte Zellen zu erkennen, die nach der Färbeprozedur immunpositiv
waren. Sie befanden sich in unmittelbarer Nähe zur glatten Muskulatur (gM) in einem
bindegewebsreichen Segment, welches als Plexus Myentericus (PM) oder auch Auerbach
Plexus bekannt ist. Dabei handelt es sich um eine Struktur, welche aus Ganglien aufgebaut
ist und die sich durch den kompletten Magen-Darm-Trakt zieht. In der Detaildarstellung (B)
ist zu erkennen, dass die Zellkerne nicht angefärbt waren, sondern lediglich das Zytoplasma
der Zellen (Pfeile).
Da es auf Grund der Gewebebeschaffenheit nicht möglich war definierte Querschnitte
anzufertigen, war die Schnittebene nicht regelmäßig. In Abb. 3.23 C ist jedoch ein Ausschnitt
zu erkennen, der annähernd einen Querschnitt durch die Tunica Muskularis darstellt (vgl.
Abb. 1.1). Diese besteht aus der zirkulären (Ringmuskulatur, RM) sowie der longitudinalen
Muskulatur (LM). Dazwischen eingebettet findet sich der bereits erwähnte PM. Auch hier
waren distinkte Zellen innerhalb des Plexus immunpositiv (Abb. 3.23 D).
Aus Abb. 3.23 E geht hervor, dass die Behandlung mit der Sense-Sonde keine Färbung
nach sich zog, was die Spezifität der voran beschriebenen Färbung untermauerte. Die
Übersichtsfärbung mit HE (Abb. 3.23 F) zeigt die beschriebenen Strukturen genauer. Der
Plexus Myentericus (PM) ist zwischen der zirkulären und longitudinalen Muskulatur (RM bzw.
LM) lokalisiert. Auffällig ist das im Vergleich zur Muskulatur hellgefärbte Bindegewebe,
welches den Plexus Meyentericus auszeichnet. Darüber hinaus lässt sich auf Grund der
Orientierung der Zellkerne eine Aussage über die Lage der Muskelschichten treffen, so dass
zwischen Ring- und Längsmuskulatur unterschieden werden kann.
Ergebnisse
92
Abb. 3.23: Zelluläre Lokalisation des 5-HT 2B Rezeptors im Vormagen der Ratte durch in situ-Hybridisierung
Auf den hier dargestellten Bildern ist die Anfärbung des Vormagengewebes der Ratte mit Hilfe der in situ-Hybridisierung zur Detektion des 5-HT2B Rezeptors zu sehen. Wie aus (A) zu entnehmen ist, waren distinkte Zellkörper angefärbt. Aufgrund des umliegenden Bindegewebes konnte diese Struktur als Plexus Myentericus (PM) identifiziert werden. In der glatten Muskulatur (gM) konnten keine immunpositiven Zellen detektiert werden. In der Detailaufnahme (B) ist gut zu erkennen, dass lediglich das Zytoplasma der Zellen, nicht aber der Kern (Pfeil) angefärbt war. (C) zeigt einen Ausschnitt, bei dem der Plexus Myentericus (PM) zwischen den Muskelschichten (LM bzw. RM) lokalisiert war. Die gefärbten Zellen beschränkten sich auch hier auf den Bereich des Plexus Myentericus (D). Die Behandlung der Gewebeschnitte mit der Sense-Sonde erbrachte keine zelluläre Anfärbung (E). Die in (F) dargestellte Hämatoxylin-Eosin-Färbung zeigt die Lage des Plexus Myentericus zwischen den beiden Muskelschichten. Die Orientierung der Muskelschichten lag im 90° Winkel zueinander, wie aus der Lage der Zellkerne hervorging. Daher handelte es sich hier sowohl um Längs- (LM) als auch Ringmuskulatur (RM). (Maßstäbe: F: 200 µm; A, C, E,: 100 µm; B, D: 50 µm; AS: Antisense; S: Sense; HE: Hämatoxylin-Eosin)
gM gM
LM
RM
LM
RM
PM
PM
PM
Ergebnisse
93
3.5.2 in situ-Hybridisierung in der Lunge der Ratte
Nachdem die Sonden zur Detektion des 5-HT2B Rezeptors am Kontrollgewebe des
Rattenvormagen erfolgreich getestet wurden, konnte nun das Zielgewebe, die Lunge,
verwendet werden.
Das Ergebnis dieser in situ-Hybridisierung ist in Abb. 3.24 dargestellt. Wurden die Schnitte
mit der Antisense-Sonde behandelt, zeigte sich im Bereich der Blutgefäße eine dunkle
Färbung (Abb. 3.24 A). Diese war in den Atemwegen oder dem Alveolargewebe nicht zu
sehen. Unter Verwendung einer stärkeren Vergrößerung konnte die Färbung genauer
lokalisiert werden, was in Abb. 3.24 B gezeigt ist.
Abb. 3.23: Zelluläre Lokalisation des 5-HT 2B Rezeptors in der Lunge der Ratte durch in situ-Hybridisierung
In dieser Abbildung sind Gewebeschnitte der Rattenlunge dargestellt, welche der in situ-Hybridisierung zur Lokalisation des 5-HT2B Rezeptors unterzogen wurden. Nach Verwendung der Antisense-Sonde kam es im Bereich der Blutgefäße zu einer deutlichen Färbung, wie aus (A) ersichtlich wird. Aus der Detaildarstellung (B) konnte diese Färbung als im Endothel lokalisiert bestimmt werden (Pfeile). Die Behandlung der Gewebeschnitte mit der Sense-Sonde erbrachte, wie aus (C) und (D) ersichtlich wird, keine Anfärbung im Bereich des Endothels (Maßstäbe: A, C,: 100 µm; B, D: 50 µm; AS: Antisense; S: Sense)
Ergebnisse
94
Die Färbung konnte in der innersten, zum Lumen orientierten Schicht nachgewiesen werden
(Pfeile). Somit handelte es sich bei den immunpositiven Zellen um Endothelzellen. Ein
solches Färbemuster konnte unter den Kontrollbedingungen (Sense-Sonde) nicht gefunden
werden (Abb. 3.24 C und D). Dies bestätigte die Spezifität der Färbung und spricht für die
Korrektheit der Färbung, welche durch Verwendung der Antisense-Sonde erreicht wurde.
Demnach konnte die RNA des 5-HT2B Rezeptors mittels in situ-Hybridisierung in den
Endothelzellen pulmonaler Blutgefäße nachgewiesen werden.
3.5.3 Immunhistochemische Färbungen im Vormagen der Ratte
Neben der in situ-Hybridisierung wurden immunhistochemische Färbungen durchgeführt, um
den 5-HT2B Rezeptor im Gewebe zu lokalisieren und den Zelltyp, welcher den 5-HT2B
Rezeptor exprimiert, zu bestimmen. Auch hier wurden zunächst Färbungen am Vormagen
der Ratte durchgeführt.
In Abb. 3.25 sind Gewebeschnitte des Vormagens der Ratte nach der
immunhistochemischen Färbung zu sehen. Es wurden Nachbarschnitte genutzt, wobei ein
Blutgefäß (bv) dazu diente, die identische Position in den Präparaten zu identifizieren. Nach
Verwendung des Antikörpers, welcher gegen den 5-HT2B Rezeptor gerichtet ist, zeigte sich
wie schon nach der in situ-Hybridisierung eine Färbung im Bereich des PM (Pfeile in A und
C).
Innerhalb des PM befinden sich neben den Enterischen Neuronen weitere Zelltypen. Einen
dieser Zelltypen stellen die Interstitial Cells of Cajal (ICC) dar, welche in engem Kontakt zu
den Neuronen und der glatten Muskulatur stehen (Daniel et al., 2001; Buist et al., 2010).
Eine Arbeitsgruppe konnte den 5-HT2B Rezeptor bereits in diesen Zellen im Jejunum der
Maus nachweisen (Wouters et al., 2007 & 2009).
Bisher sind zwei Marker für die ICC beschrieben: c-Kit (Epperson et al., 2000) & ANO1
(Gomez-Pinilla et al., 2009; Kashyap et al., 2011). Antikörper gegen diese beiden Proteine
wurden an Nachbarschnitten der Präparate verwendet, die mit dem Antikörper gegen den
5-HT2B Rezeptor gefärbt wurden. Das Ergebnis dieser Färbungen ist ebenfalls in Abb. 3.25
dargestellt. Abb. 3.25 B zeigt die Färbung unter Verwendung des Antikörpers gegen ANO1,
in Abb. 3.25 D ist die Färbung dargestellt, wobei das Gewebe mit dem Antikörper gegen c-Kit
behandelt wurde. Beide Antikörper konnten, wie schon der 5-HT2B Rezeptor, im Plexus
Myentericus detektiert werden. Diese Kolokalisation der Färbungen sprach dafür, dass der
5-HT2B Rezeptor im Vormagen der Ratte in ICC lokalisiert ist.
Ergebnisse
95
Abb. 3.25: Zelluläre Lokalisation des 5-HT 2B Rezeptors im Vormagen der Ratte durch immunhistochemische Färbungen
Auf den hier dargestellten Bildern ist die Anfärbung des Vormagengewebes der Ratte durch immunhistochemische Färbungen zur Detektion des 5-HT2B Rezeptors zu sehen. Es handelte sich dabei um Nachbarschnitte, das Blutgefäß (bv) diente dabei der Sicherstellung, dass es sich immer um die identische Position im Gewebe handelte. In (A) und (C) sind Schnitte zu sehen, welche mit einem Antikörper gegen den 5-HT2B Rezeptor behandelt wurden. Wie bei der in situ-Hybridisierung zeigte sich eine Anfärbung des zwischen den Muskelschichten gelegenen Plexus Myentericus (PM) (Pfeile). Ein möglicher Zelltyp, welcher für die Expression des Rezeptors in Frage kam, waren die Interstitial Cells of Cajal (ICC). Die Marker ANO1 (B) und c-Kit (D) wurden verwendet, um diese Zellen im Vormagen der Ratte zu lokalisieren. Nach Verwendung dieser beiden Antikörper zeigte sich das gleiche Färbemuster wie es zuvor durch den Antikörper gegen den 5-HT2B Rezeptor hervorgerufen wurde. Somit konnte mit dieser Methode die Expression des 5-HT2B Rezeptors im PM bestätigt werden. Zudem wurde mit den ICC der Zelltyp bestimmt. (E) und (F) zeigen die Negativkontrollen, bei welchen die Färbeprozedur ohne den Primärantikörper durchgeführt wurde. (Maßstab: 50 µm)
Ergebnisse
96
Es bestand allerdings auch die Möglichkeit, dass der 5-HT2B Rezeptor nicht nur in ICC
sondern auch in Enterischen Neuronen exprimiert wird. Daher wurde an weiteren
Nachbarschnitten eine Färbung mit dem Neuronenmarker HuC/D durchgeführt.
Ein Bild dieser immunhistochemische Färbung ist in Abb. 3.26 dargestellt. Hier zeigte sich,
dass im Bereich des Blutgefäßes (bv, vgl. Abb. 3.25) keine Neurone detektiert werden
konnten. Diese waren nur in einem weiter entfernten Gebiet des Gewebes zu finden (Pfeile).
Daher konnte die Expression des 5-HT2B Rezeptors in Neuronen ausgeschlossen werden.
3.5.4 Immunhistochemische Färbungen in der Lunge de r Ratte durch
Nachdem die Färbung mit dem Antikörper gegen den 5-HT2B Rezeptor erfolgreich etabliert
werden konnte (siehe 3.5.3), wurden immunhistochemische Färbungen an der Lunge der
Ratte durchgeführt. Zudem sollte der Zelltyp bestimmt werden, in dem der 5-HT2B Rezeptor
exprimiert wird.
Das Ergebnis der Antikörperfärbung ist in Abb. 3.27 dargestellt. Im Bereich der Blutgefäße
wurde, wie schon bei der in situ-Hybridisierung, eine Färbung festgestellt. Eine Aussage über
die genaue Lokalisation der Färbung war nur mit Hilfe einer immunhistochemischen Färbung
unter Verwendung von zwei Primärantikörpern möglich. Zur Bestimmung des Endothels
wurde erneut ein Antikörper gegen den von-Willebrand-Faktor (vWF) verwendet (vgl. 3.1.1).
Aus der Überlagerung der Färbungen gegen den 5-HT2B Rezeptor und den vWF wurde
ersichtlich, dass sich die Signale der Färbungen überschnitten, wodurch eine gelblich
erscheinende Fluoreszenz entstand. Daraus konnte geschlossen werden, dass beide
Abb. 3.26: Lokalisation von Neuronen im Vormagen de r Ratte durch immunhistochemische Färbungen
In dieser Abbildung sind immunhistochemische Färbungen des Vormagens der Ratte gezeigt. In (A) und (B) sind zum besseren Vergleich die Färbungen des 5-HT2B Rezeptors und c-Kit aus Abb. 3.26 erneut gezeigt. Daraus wird ersichtlich dass der Nachbarschnitt (C), welcher mit dem Neuronenmarker HuC/D behandelt wurde, keine Färbung im Bereich des Blutgefäßes (bv) auswies. Neurone waren allerdings in einem weiter entfernten Abschnitt des Gewebeschnitts detektierbar (Pfeile). (Maßstab: 50 µm)
Ergebnisse
97
Proteine in den gleichen Zellen nachgewiesen wurden, was für eine Expression des 5-HT2B
Rezeptors in Endothelzellen sprach.
3.6 Primärkultur von ICC aus dem Rattenvormagen
Die Signaltransduktion des 5-HT2B Rezeptors wurde bislang fast ausschließlich in stabilen
Zelllinien untersucht. Die verwendeten Zellen exprimieren den Rezeptor in nativem Zustand
nicht, so dass unklar ist, ob ein in diesen Zellen eingebrachter Rezeptor die gleichen
Proteine aktiviert, wie dies auch in den Zellen der Fall ist, die den 5-HT2B Rezeptor in
nativem Zustand besitzen.
Daher sollte eine Primärkultur von Zellen angelegt werden, die den 5-HT2B Rezeptor
exprimieren. Nachdem die Etablierung einer Kultur von Endothelzellen aus der Lunge
fehlschlug, wurde der Vormagen der Ratte verwendet, da die ICC aus diesem Gewebe den
5-HT2B Rezeptor besitzen (siehe 3.5.3).
3.6.1 Charakterisierung der Zelltypen
Nach dem Aussäen der Zellen konnte bereits nach wenigen Stunden festgestellt werden,
dass einige Zellen adhärent wurden und auf der Collagenbeschichtung anwuchsen. Da es
sich um eine heterogene Primärkultur handelte, bei der kein Selektionsmedium eingesetzt
Abb. 3.27: Zelluläre Lokalisation des 5-HT 2B Rezeptors in der Lunge der Ratte durch immunhistochemische Färbungen
In dieser Abbildung sind immunhistochemische Färbungen der Lunge der Ratte gezeigt. In (A) ist die Färbung unter Verwendung des Antikörpers gegen den 5-HT2B Rezeptor dargestellt. Eine Färbung war lediglich im Bereich der Blutgefäße zu sehen. Zur genauen Bestimmung der Rezeptor-exprimierenden Zellen wurde eine Doppelfärbung durchgeführt (B). Dabei wurde neben dem Antikörper gegen den 5-HT2B Rezeptor ein Antikörper gegen den Endothelmarker von-Willebrand-Faktor (vWF) verwendet. Aus der Überlagerung der Fluoreszenzsignale (C) wurde ersichtlich, dass die Signale in der gleichen Struktur des Blutgefäßes lagen, da eine gelbliche Färbung entstand. Somit konnte die Expression des 5-HT2B Rezeptors in der Lunge der Ratte in Endothelzellen nachgewiesen werden. (Maßstab: 50 µm)
Ergebnisse
98
wurde, wurden die Zelltypen, sofern Marker vorhanden waren, mit Hilfe von
immuncytochemischen Färbungen bestimmt.
3.6.1.1 Nachweis von Muskelzellen und Neuronen
In Abb. 3.28 ist das Ergebnis der immunzytochemischen Färbungen zu sehen. Daraus geht
hervor, dass nach drei Tagen in Kultur sowohl Muskelzellen (A) als auch Neurone (B)
vorhanden waren. Durch die Färbung gegen α-Glattmuskelaktin waren die
Zytoskelettfilamente der sich ausstreckenden Muskelzellen gut zu erkennen. Die Neurone
wiesen eine kugelförmige Morphologie auf. Zudem waren die Neurite immunpositiv für
β-III Tubulin (Pfeile). Die Kontrolle ohne Erstantikörper (C) zeigte keinerlei zelluläre
Anfärbung. Immunzytochemische Färbungen gegen den 5-HT2B Rezeptor sowie ICC
schlugen fehl (Daten nicht gezeigt).
Es fand keine genaue Bestimmung der Zellzahl statt. Es war jedoch ersichtlich, dass ein
Großteil der Zellen der Kultur aus Muskelzellen bestand, wohingegen die Menge der
Neurone sehr begrenzt war.
3.6.1.2 Nachweis von ICC
Da der Versuch der immunzytochemischen Färbung mit ICC-Markern fehl schlug, wurde
eine Vitalfärbung mit Methylenblau durchgeführt. Diese beruht auf einem bisher nicht
geklärten zellulären Transportmechanismus, es konnte jedoch gezeigt werden, dass
ausschließlich ICC diesen Farbstoff aufnehmen (Mikkelsen et al., 1988; Liu et al., 1993;
Faussone-Pellegrini & Thuneberg, 1999).
Abb. 3.28: Zelluläre Lokalisation des 5-HT 2B Rezeptors in der Lunge der Ratte durch immunhistochemische Färbungen
In dieser Abbildung sind immunzytochemische Färbungen der Primärkultur des Rattenvormagens dargestellt. Es konnten sowohl Muskelzellen (A) als auch Neurone (B) detektiert werden. Letztere zeigten Verbindungen über Neurite zu anderen Zellen (Pfeile). In der Negativkontrolle waren keine zellulären Anfärbungen zu sehen. (Maßstab: 50 µm)
Ergebnisse
99
Das Ergebnis der Vitalfärbung mit Methylenblau ist in Abb. 3.29 gezeigt. Es konnten distinkte
Zellen identifiziert werden, welche den Farbstoff aufnahmen (Pfeile). Diese Zellen waren
stets zusammen gelagert. Umliegende Zellen zeigten keine Färbung mit Methylenblau. Somit
konnten ICC in der Primärkultur des Rattenvormagens durch Färbung mit Methylenblau
nachgewiesen werden.
Neben der Vitalfärbung mit Methylenblau wurde die Primärkultur mittels RT-PCR auf den
ICC-Marker c-Kit sowie das Transkript des 5-HT2B Rezeptors untersucht.
Ein Bild der Gelelektophorese zum Nachweis der genannten Transkripte ist in Abb. 3.30
dargestellt. Es konnte sowohl das Transkript von c-Kit als auch das des 5-HT2B Rezeptors in
der Kultur nachgewiesen werden. Damit konnte bestätigt werden, dass sowohl ICC als auch
5-HT2B Rezeptor-tragende Zellen in der Kultur vorhanden waren. Mit Hilfe der hier
dargestellten Methoden war es jedoch nicht möglich zu zeigen, dass ICC den 5-HT2B
Rezeptor in vitro exprimieren.
Abb. 3.29 Nachweis von ICC in der Primärkultur des Rattenvormagens durch Vitalfärbung mit Methylenblau
In dieser Abbildung ist eine Vitalfärbung der Primärkultur des Rattenvormagens dargestellt. Es konnten mehrere Zellen detektiert werden, die den Farbstoff Methylenblau aufgenommen hatten (Pfeile). (Maßstab: 40 µm)
3.6.2 Calcium Imaging
Da es mit den bisher gezeigten Methoden nicht möglich war, die Expression
Rezeptors in ICC aus der Primärkultur des Rattenvormagens nachzuweisen, wurden die
Zellen mit Hilfe des Calcium
Zellen sowohl auf Substanzen reagieren, welche den 5
auf Liganden antworten, welche spezifisch für c
untersucht werden, ob Zellen den 5
die bereits beschriebene für ICC typische Tyrosinkinase, verfüg
Im Calcium Imaging kam die fluoreszierende Substanz Fura
Exzitation dieser Substanz erfolgt bei unterschiedlichen Wellenlängen, je nachdem, ob sie
frei (380 nm) oder an Kalzium gebunden (340
Abb. 3.31 zeigt exemplarisch
liegt. Zur Stimulation des 5
Konzentration von 10-8 M eingesetzt (Westbroek
für c-Kit wurde der stem cell factor
Es zeigte sich, dass es bei einer der beobachteten Zellen sowohl nach Stimulation mit dem
spezifischen 5-HT2B Rezeptor Agonisten als auch nach SCF Applikation zu einer
Verschiebung des Fura-2/AM Ve
Vitalitätskontrolle wurde ATP (10
Abb. 3. 30 Nachweis des 5Rattenvormagens durch RT
Aus dem hier dargestellten Bild eines Agarosegels geht hervor, dass die Transkripte des 5-HT2B Rezeptors und von centhalten waren. c-Kit fungierte hier als dadurch indirekt gezeigt werden konnte. Die Kontrollen (Kontaminationen vorlagen.
mit den bisher gezeigten Methoden nicht möglich war, die Expression
Rezeptors in ICC aus der Primärkultur des Rattenvormagens nachzuweisen, wurden die
Calcium-Imagings untersucht. Dadurch konnte überprüft werden, ob
Zellen sowohl auf Substanzen reagieren, welche den 5-HT2B Rezeptor aktiviere
auf Liganden antworten, welche spezifisch für c-Kit sind. Durch diesen Ansatz konnte
untersucht werden, ob Zellen den 5-HT2B Rezeptor exprimieren und gleichzeitig über c
die bereits beschriebene für ICC typische Tyrosinkinase, verfügten.
kam die fluoreszierende Substanz Fura-2/AM zum Einsatz. Die
Exzitation dieser Substanz erfolgt bei unterschiedlichen Wellenlängen, je nachdem, ob sie
nm) oder an Kalzium gebunden (340 nm) vorliegt.
Abb. 3.31 zeigt exemplarisch einen Graphen, dem ein Calcium Imaging-Versuch zu Grunde
liegt. Zur Stimulation des 5-HT2B Rezeptors wurde die Substanz BW723C86 in einer
M eingesetzt (Westbroek et al., 2001; Bhasin et al.
cell factor (SCF, 25 ng/ml) gewählt (Yuzawa et al., 2006).
Es zeigte sich, dass es bei einer der beobachteten Zellen sowohl nach Stimulation mit dem
Rezeptor Agonisten als auch nach SCF Applikation zu einer
2/AM Verhältnisses, also zu einer Zellantwort kam. Zur
Vitalitätskontrolle wurde ATP (10-5 M) verwendet. Es zeigte sich, dass es hier auch bei Zellen
30 Nachweis des 5 -HT2B Rezeptors und ICC in der PrimärRattenvormagens durch RT -PCR
Aus dem hier dargestellten Bild eines Agarosegels geht hervor, dass die Transkripte des Rezeptors und von c-Kit in der Gesamt-RNA der Primärkultur des Rattenvormagens
Kit fungierte hier als Marker für ICC, deren Existenz in der Kultur dadurch indirekt gezeigt werden konnte. Die Kontrollen (-RT) zeigten, dass keine Kontaminationen vorlagen.
Ergebnisse
100
mit den bisher gezeigten Methoden nicht möglich war, die Expression des 5-HT2B
Rezeptors in ICC aus der Primärkultur des Rattenvormagens nachzuweisen, wurden die
Dadurch konnte überprüft werden, ob
Rezeptor aktivieren, als auch
Kit sind. Durch diesen Ansatz konnte
Rezeptor exprimieren und gleichzeitig über c-Kit,
2/AM zum Einsatz. Die
Exzitation dieser Substanz erfolgt bei unterschiedlichen Wellenlängen, je nachdem, ob sie
Versuch zu Grunde
Rezeptors wurde die Substanz BW723C86 in einer
et al.,2004). Als Ligand
ng/ml) gewählt (Yuzawa et al., 2006).
Es zeigte sich, dass es bei einer der beobachteten Zellen sowohl nach Stimulation mit dem
Rezeptor Agonisten als auch nach SCF Applikation zu einer
rhältnisses, also zu einer Zellantwort kam. Zur
M) verwendet. Es zeigte sich, dass es hier auch bei Zellen
Rezeptors und ICC in der Primär kultur des
Aus dem hier dargestellten Bild eines Agarosegels geht hervor, dass die Transkripte des RNA der Primärkultur des Rattenvormagens
Marker für ICC, deren Existenz in der Kultur RT) zeigten, dass keine
zu einem Einstrom von Kalzium in das Zytoplasma kam, welche auf die anderen Substanzen
nicht reagierten.
Durch diesen Versuch konnte belegt werden, dass der 5
identischen Zellen exprimiert werden. Da c
wurde, konnte festgestellt werden, dass der 5
Rattenvormagens lokalisiert ist.
des 5-HT2B eignete die Kultur sich jedoch nicht, da die Zellantworten auf BW723C86 in der
gleichen Zelle nur selten reproduzierbar waren, obwohl die Zelle noch auf die
ATP reagierte. Wurde ein anderes Sichtfeld untersucht, reagierten einzelne Zellen erneut auf
BW723C86.
Abb. 3. 31 Nachweis der Expression des 5Rattenvormagens durch Calcium Imaging
Bei dem hier dargestellten Graphen handelt es sich um ein repräsentatives Calcium ImagingExperiment. Es konnte sowohl nach der Applikation von BW723C86 (10(25 ng/ml) eine Zellantwort detektiert werden. Zur Vitalitätsprüfung der Zellen wurde ATP (eingesetzt. Auf ATP reagierten auch Zellen, welche auf die zuerst genannten Substanzen nicht antworteten. c-Kit fungierte hier als Marker für ICC. Dadurch konnte gezeigt werden, dass der 5-HT2B Rezeptor in ICC in der Primärkultur des Rattenvormagens exprimiert wird.
zu einem Einstrom von Kalzium in das Zytoplasma kam, welche auf die anderen Substanzen
diesen Versuch konnte belegt werden, dass der 5-HT2B Rezeptor sowie c
identischen Zellen exprimiert werden. Da c-Kit auch hier als Marker für ICC eingesetzt
wurde, konnte festgestellt werden, dass der 5-HT2B Rezeptor in ICC in der Primärkultur des
attenvormagens lokalisiert ist. Zur näheren Untersuchung des pharmakologischen Profils
eignete die Kultur sich jedoch nicht, da die Zellantworten auf BW723C86 in der
gleichen Zelle nur selten reproduzierbar waren, obwohl die Zelle noch auf die
Wurde ein anderes Sichtfeld untersucht, reagierten einzelne Zellen erneut auf
31 Nachweis der Expression des 5 -HT2B Rezeptors in ICC in der Primärkultur des Rattenvormagens durch Calcium Imaging
er dargestellten Graphen handelt es sich um ein repräsentatives Calcium ImagingExperiment. Es konnte sowohl nach der Applikation von BW723C86 (10-8 M) als auch SCF
ng/ml) eine Zellantwort detektiert werden. Zur Vitalitätsprüfung der Zellen wurde ATP (eingesetzt. Auf ATP reagierten auch Zellen, welche auf die zuerst genannten Substanzen nicht
Kit fungierte hier als Marker für ICC. Dadurch konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor in ICC in der Primärkultur des Rattenvormagens exprimiert wird.
Ergebnisse
101
zu einem Einstrom von Kalzium in das Zytoplasma kam, welche auf die anderen Substanzen
Rezeptor sowie c-Kit in
Kit auch hier als Marker für ICC eingesetzt
Rezeptor in ICC in der Primärkultur des
Zur näheren Untersuchung des pharmakologischen Profils
eignete die Kultur sich jedoch nicht, da die Zellantworten auf BW723C86 in der
gleichen Zelle nur selten reproduzierbar waren, obwohl die Zelle noch auf die Applikation von
Wurde ein anderes Sichtfeld untersucht, reagierten einzelne Zellen erneut auf
Rezeptors in ICC in der Primärkultur des
er dargestellten Graphen handelt es sich um ein repräsentatives Calcium Imaging-M) als auch SCF
ng/ml) eine Zellantwort detektiert werden. Zur Vitalitätsprüfung der Zellen wurde ATP (10-5 M) eingesetzt. Auf ATP reagierten auch Zellen, welche auf die zuerst genannten Substanzen nicht
Kit fungierte hier als Marker für ICC. Dadurch konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor in ICC in der Primärkultur des Rattenvormagens exprimiert wird.
Diskussion
102
4. Diskussion
In dieser Arbeit wurde der Effekt von Migräne-assoziierten Pharmaka auf die Pathologie der
Pulmonalen Hypertonie (PH) untersucht. Dazu wurde das Tiermodell der normobaren
Hypoxie verwendet. Dabei war die Untersuchung der Bedeutung des 5-HT2B Rezeptors von
besonderem Interesse, da dieser sowohl in der Entstehung der PH als auch der Migräne
eine wichtige Rolle zu spielen scheint (Launay et al., 2002; Johnson et al., 2003). Als Maß
für die Ausprägung der PH wurde die Neomuskularisierung an Blutgefäßen herangezogen,
welche unter nicht pathologischen Bedingungen keine Muskulatur aufweisen. Diese
pathologischen Veränderungen wurden mit Hilfe von immunhistochemischen Färbungen
gegen α-Glattmuskelaktin analysiert.
Neben Untersuchungen zur Induktion und Reversibilität der PH, wurde den Versuchstieren
während der Hypoxie-Behandlung sowohl ein partieller Agonist (mCPP) als auch ein
spezifischer Antagonist (BF-1) des 5-HT2B Rezeptors injiziert. Zudem wurden die Tiere mit
Sumatriptan, einem Agonisten des 5-HT1B Rezeptors, sowie L-NAME, einem Inhibitor der
Stickstoffmonoxid Synthase (NOS), behandelt. Für diese beiden Substanzen wurde bereits
die Wirksamkeit im Tiermodell für Migräne beschrieben.
Weitere Analysen beschäftigten sich mit Expressionsveränderungen des 5-HT2B Rezeptors
unter hypoxischen Bedingungen und der Signaltransduktion sowie der zellulären Lokalisation
des 5-HT2B Rezeptors im Gewebe der Lunge.
4.1 Induktion und Reversibilität der vaskulären Neo muskularisierung
4.1.1 Transfer des Tiermodells der normobaren Hypox ie auf den Organismus Maus
Zu Beginn dieser Arbeit wurde das Tiermodell der normobaren Hypoxie, welches am
Lehrstuhl für Tierphysiologie bereits mit Ratten und Meerschweinchen durchgeführt wurde,
auf den Organismus Maus übertragen.
In den Spezies Ratte und Meerschweinchen wurden intrapulmonale Blutgefäße mit einem
Durchmesser <50 µm untersucht. Beim Organismus Maus wurde die Auswertung modifiziert.
Da Mäuse über eine kleinere Lunge als die Vergleichsspezies verfügen, war nicht klar, bis zu
welchem Durchmesser der Blutgefäße die Neomuskularisierung auftreten würde. Daher
wurde in der histologischen Auswertung zwischen Blutgefäßen mit einem Durchmesser
≤25 µm sowie 26 µm - 50 µm unterschieden. Dass zwischen diesen Größen physiologische
Unterschiede bestehen, zeigte sich in den Ergebnissen der Quantifizierung muskularisierter
Diskussion
103
Blutgefäße, nachdem die Konzentrationsverhältnisse des zugeleiteten Luftgemisches variiert
wurden.
In den ersten Versuchen wurde der O2-Gehalt am Ausgang der Hypoxiekammer gemessen.
Die Zuleitung des Luftgemischs erfolgte so, dass hier ein Wert von 10% O2 vorlag. Hier
stellte sich eine Zunahme der muskularisierten Blutgefäße nach der Hypoxiebehandlung
lediglich bei den Blutgefäßen ≤25 µm ein. Der Muskularisierungsgrad blieb bei den
Blutgefäßen mit einem Durchmesser zwischen 26 µm - 50 µm unverändert (Daten nicht
gezeigt).
In allen in dieser Arbeit dargestellten Versuchen wurde der O2-Gehalt des zugeführten
Luftgemisches so eingestellt, dass der O2-Gehalt am Eingang der Hypoxiekammer 10%
betrug. Da die Tiere fortwährend O2 verbrauchten und im Gegenzug CO2 abatmeten, lag die
O2-Konzentration in der Kammer unterhalb von 10%. Vergleichende Messungen ergaben,
dass ein Gradient in der O2 Konzentration von ca. 1,2% vom Eingang zum Ausgang der
Kammer vorlag. Dieser geringe Unterschied hatte jedoch einen großen Einfluss auf den
Muskularisierungsgrad der intrapulmonalen Blutgefäße. Bei den Versuchen, die mit dem
noch weiter herabgesetzten O2-Gehalt durchgeführt wurden, zeigte sich nicht nur bei den
kleinsten untersuchten Blutgefäßen (<25 µm) eine Zunahme der Muskulatur um den
Faktor 2, sondern auch bei den größeren Blutgefäßen mit einem Durchmesser von
26 µm - 50 µm (siehe Abb. 3.1 & Abb. 3.2).
4.1.2 Notwendige Dauer der Hypoxiebehandlung zur In duktion der PH
Um den Phänotypen der vaskulären Neomuskularisierung in der Maus zu erzeugen, war
eine Hypoxiebehandlung mit einer Dauer von mindestens vier Wochen notwendig (siehe
3.1.2). Bei Tieren, die drei Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, kam
es zu einem leichten, aber statistisch nicht signifikanten Anstieg im Muskularisierungsgrad
der intrapulmonalen Blutgefäße. Ein signifikanter Unterschied war erst nach vier- bzw.
fünfwöchiger Hypoxiebehandlung zu verzeichnen. Bei Tieren mit vierwöchiger
Behandlungsdauer war auch die Rechtsventrikuläre Hypertrophie (RVH) ausgeprägt (siehe
Abb. 3.4.). Dieser Befund bestätigte zusätzlich die Ausprägung der PH.
Die Dauer der notwendigen Hypoxiebehandlung kann stark variieren und ist immer abhängig
von dem verwendeten Aufbau der Hypoxiekammer, sowie der Tierspezies und des
Tierstamms. In einigen Studien wurden die Tiere lediglich einer zweiwöchigen (Eddahibi
et al., 1998) oder auch dreiwöchigen (Ozaki et al., 2001) Hypoxiebehandlung unterzogen.
Diskussion
104
Andere Arbeitsgruppen wiederum setzten die Tiere sechs (Steudel et al., 1998; Yu et al.,
1999) oder sieben (Crnkovic et al., 2011) Wochen der Hypoxie aus.
Es sind bisher einige Effekte bekannt, mit denen der Organismus innerhalb weniger Minuten
auf Hypoxie reagiert. Dazu gehören beispielsweise die hypoxische Hyperventilation oder
auch die verstärkte Ausschüttung von Erythropoietin (Piehl Aulin et al., 1998, siehe auch
1.4.3). Der genaue Zusammenhang zwischen diesen kurzfristigen Antworten und dem
Prozess der Remodellierung von Blutgefäßen, welcher vier Wochen in Anspruch nimmt, ist
bis heute noch unklar.
Es müssen zwei Klassen von Blutgefäßen unterschieden werden. Proximale Blutgefäße mit
einem relativ großen Durchmesser verfügen bereits vor den pathologischen Prozessen der
PH über eine Media mit glatter Muskulatur. Bei diesen Blutgefäßen kommt es zur
Proliferation der bereits existierenden Glattmuskelzellen (smooth muscle cells, SMC) und
damit zu einer Verdickung der bereits vorhandenen Muskelschicht (Jones et al., 1999). Eine
solche Hyperplasie innerhalb der intrapulmonalen Blutgefäße konnte in dieser Arbeit nicht
beobachtet werden. Die Dicke der Media von Blutgefäßen mit einem Durchmesser >50 µm
war bei hypoxisch behandelten Tieren im Vergleich zur Kontrollgruppe unverändert (Daten
nicht gezeigt). Die Hyperplasie der Media stellt bei Patienten ein wesentliches Merkmal der
PH dar. Es liegen Daten vor, aus denen hervorgeht, dass die Hyperplasie der Media von
5-HT induziert werden kann (Eddahibi et al., 2001; Marcos et al., 2004).
Die aus Tiermodellen erhobenen Daten sind in Bezug auf die Hyperplasie nicht eindeutig. Es
existieren Studien, in denen eine deutliche Hyperplasie der Media nachgewiesen werden
konnte (Christou et al., 2000; Minamino et al., 2001; Marcos et al., 2003). Von anderen
Arbeitsgruppen wird die Neomuskularisierung kleinerer Blutgefäße als charakteristischer
Phänotyp beschrieben (Ozaki et al., 2001; Fagan et al., 2004). Ein Vergleich dieser Studien
zeigt, dass die Dauer der Hypoxiebehandlung sowie der verwendete Tierstamm
unterschiedlich waren, so dass darin mögliche Gründe für die abweichenden Ergebnisse zu
finden sind. Im Monocrotalin-Modell (MCT, siehe 1.4.5) wird hingegen in nahezu allen
Studien eine massive Verdickung der vaskulären Muskelschicht beschrieben (Cho et al.,
2009; Revermann et al., 2011). In diesem Tiermodell besteht allerdings eine starke
Speziesabhängigkeit.
Wie bereits beschrieben, existiert an kleineren Blutgefäßen wie etwa präkapillären Arteriolen
unter normalen physiologischen Bedingungen keine Media. In der Pathogenese der PH
entsteht eine neue Muskelschicht aus einwandernden Zellen, welche sich erst zu
Glattmuskelzellen (smooth muscle cell, SMC) bzw. Glattmuskel-ähnlichen Zellen (SMC-like)
differenzieren. Dieser Prozess der Neomuskularisierung konnte in dieser Arbeit an den
Diskussion
105
Blutgefäßen mit einem Durchmesser ≤50 µm nachgewiesen werden, da es zu einer
Verdopplung der Anzahl muskularisierter Blutgefäße dieser Größe nach der
Hypoxiebehandlung kam (siehe 3.1.2).
Die Herkunft der Zellen der neuen vaskulären Muskelschicht ist bis heute nicht geklärt (Frid
et al., 2009). Möglicherweise kommt es zur Migration und/oder Differenzierung von Endothel-
assoziierten Perizyten oder intermediären Zellen der Media (Jeffery & Morrel, 2002). Eine
weitere Möglichkeit besteht darin, dass die neugebildete Muskulatur aus Myofibroblasten
hervorgeht (siehe auch 1.4.4). Fibroblasten der Adventitia differenzieren allerdings sowohl in
präkapillären Arteriolen als auch in größeren Arterien zu Myofibroblasten und sorgen mit
gesteigerter Proliferation dafür, dass das Lumen der Gefäße abnimmt und die Kontraktilität
eingeschränkt wird (Durmowicz & Stenmark, 1999). Neben residenten Zellen werden auch
im Blut zirkulierende Zellen als Ursprungsort diskutiert (Frid et al., 2006). In zuletzt genannter
Studie konnte gezeigt werden, dass eine Gruppe von mesenchymalen Vorläuferzellen
während der Hypoxiebehandlung aus dem Blut in die Gefäßwand einwanderte. Diese Zellen
differenzierten sich dort weiter und exprimierten kontraktile Proteine wie z.B.
α-Glattmuskelaktin. Auch eine Transdifferenzierung von Endothelzellen in den SMC-like
Zelltyp kann nicht ausgeschlossen werden (Arciniegas et al., 2005; Stenmark et al., 2006).
4.1.3 Reversibilität der Hypoxie-induzierten Neomus kularisierung
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass es sich bei der Hypoxie-induzierten
Neomuskularisierung um einen persistierenden Remodellierungsvorgang der
intrapulmonalen Blutgefäße handelte. Die Zunahme der muskularisierten Blutgefäße blieb
bestehen, auch wenn die Tiere nach der vierwöchigen Hypoxiebehandlung für bis zu acht
Wochen unter normoxischen Luftverhältnissen gehalten wurden (siehe 3.2).
Die Reversibilität der pathologischen Veränderungen ist bei Patienten mit PH abhängig von
der Ursache der Erkrankung. Liegt die Ursache der PH z.B. in einer linksventrikulären
Erkrankung (siehe 1.4.2), ist die Prognose sehr schlecht. In Folge einer Herztransplantation
kann sich allerdings eine Verbesserung der Pathologie zeigen. In einer Studie konnte
festgestellt werden, dass bei 80% der untersuchten Patienten der Gefäßwiderstand (PVR)
innerhalb eines Jahres auf das Normalniveau sank (Bhatia et al., 1987). Aus aktuelleren
Daten geht hervor, dass der PVR bereits nach einem Monat normalisiert vorliegen kann
(Delgardo et al., 2000). Somit handelt es sich bei dieser Form der PH nicht zwangsläufig um
irreversible vaskuläre Veränderungen. Nachdem die Ursache für die PH, in diesem Fall ein
Defekt am linken Ventrikel, entfernt wurde, normalisierte sich die Morphologie des
intrapulmonalen Blutgefäßsystems.
Diskussion
106
Bei den Formen der Pulmonalarteriellen Hypertonie (PAH, siehe 1.4.2) ist die Ursache der
PH häufig nicht klar. Selbst in Fällen der PAH mit bekannter Ursache sind in der Regel nur
die Symptome wie z.B. die Dyspnoe behandelbar. Die derzeit bei Patienten mit PH
eingesetzten Pharmaka wie Prostazyklin, ET-1 Rezeptor Antagonisten (z.B. Bosentan) oder
Inhibitoren der Phosphodiesterase-5 (PDE-5, z.B. Sildenafil) können die Progression der
Krankheit jedoch nicht verhindern. Die pathologischen Veränderungen der PH sind zum
jetzigen Stand der Forschung nicht vollständig reversibel (Moreno-Vinasco et al., 2008;
Ghofrani et al., 2009; Anderson & Newarkas, 2010; Murthy et al., 2010).
In dieser Arbeit führte die Entfernung des für die PH ursächlichen Stimulus, die Hypoxie,
nicht zu einer Reduktion der Muskularisierung. Zu diesem Versuchsansatz liegen keine
publizierten Daten aus Tiermodellen für das pulmonale Blutgefäßsystem zum Vergleich vor.
Eine Arbeitsgruppe aus Gießen (Hessen, Deutschland) um Prof. Dr. Weissmann berichtete
allerdings ebenfalls, dass der Phänotyp der Remodellierung sehr robust sei und mehrere
Wochen vorhält (Dr. Xin-Ran Zhu, persönliche Mitteilung). Es ist daher davon auszugehen,
dass die im Tiermodell beobachtete Neomuskularisierung die Charakteristik der
Remodellierung intrapulmonaler Blutgefäße im Menschen widerspiegelt.
4.1.4 Gemeinsamkeiten und Unterschiede zum Tiermode ll der Migräne
Das Tiermodell der Migräne (Johnson et al., 2003; siehe auch 1.3.3) basiert auf der Induktion
einer Plasmaproteinextravasation (PPE) in der Dura mater durch die Wirkung von
1-(3-Chlorphenyl)piperazin (mCPP) am 5-HT2B Rezeptor. Dieses Tiermodell wurde in der
Spezies des Meerschweinchens etabliert.
Am Lehrstuhl für Tierphysiologie wurde versucht, dieses Tiermodell auf die Spezies Maus zu
übertragen. Dabei zeigte sich, dass mCPP in einer Dosis von 1 µg/kg (i.v.) in der Maus, im
Gegensatz zum Meerschweinchen, keine PPE auslösen konnte. Unterzog man die Mäuse
jedoch einer vierwöchigen Hypoxiebehandlung, erzeugte mCPP in einer Dosis von 1 µg/kg
(i.v.) auch in der Maus eine verstärkte PPE (Daniel Segelcke, persönliche Mitteilung). Die
Tiere wurden durch die Hypoxiebehandlung durch einen bisher ungeklärten Mechanismus
für die Substanz mCPP sensitiviert.
Im Tiermodell der Migräne war eine Hypoxiebehandlung von mindestens vier Wochen nötig,
damit durch mCPP eine PPE in der Maus ausgelöst werden konnte (Daniel Segelcke,
persönliche Mitteilung). Dieses Ergebnis zeigt, dass eine Übereinstimmung mit der
benötigten Dauer der Hypoxiebehandlung zwischen den Tiermodellen der Pulmonalen
Diskussion
107
Hypertonie und der Migräne bestand. In beiden Tiermodellen war eine vierwöchige
Hypoxiebehandlung nötig, um den entsprechenden Phänotypen zu generieren.
Es ist bekannt, dass während der vierwöchigen Hypoxiebehandlung eine Vielzahl von
physiologischen und morphologischen Veränderungen in der Lunge der Mäuse stattfinden.
Die physiologischen Änderungen wie z.B. die Ausschüttung vasoaktiver Substanzen finden
binnen kürzester Zeit (Stenmark et al., 2006) statt, die morphologischen Veränderungen
bedürfen dagegen weitaus länger, wie auch in dieser Arbeit gezeigt werden konnte (siehe
3.1.2). Eine kurzfristige physiologische Antwort wie z.B. die Ausschüttung einer Substanz als
Ursache für die Sensitivierung gegenüber mCPP scheint daher im Tiermodell der Migräne
eher unwahrscheinlich zu sein. Vielmehr handelt es sich vermutlich auch um
Umstrukturierungen im Blutgefäßsystem in der Dura mater der Mäuse während der
Hypoxiebehandlung. Aber auch ein Zusammenspiel zwischen physiologischen und
morphologischen Prozessen wäre denkbar, da die Konzentration von 5-HT im Plasma bei
Patienten der PH erhöht vorliegt (Hervé et al., 1995). Das bedeutet, auch wenn vasoaktive
Substanzen sehr schnell freigesetzt werden, kann dies über einen längeren Zeitraum
geschehen und somit zu dauerhaften Veränderungen der Plasmakonzentration führen.
Bislang liegen jedoch keine Daten vor, die einen solchen Mechanismus beschreiben.
Ein Unterschied zwischen den beiden Tiermodellen bestand in den Ergebnissen zur
Reversibilität der Hypoxie-induzierten Effekte. Nach vierwöchigem Aufenthalt unter
normoxischen Bedingungen in Folge der Hypoxiebehandlung war die erhöhte Sensitivität
gegenüber mCPP nicht mehr gegeben (Daniel Segelcke, persönliche Mitteilung). Im
Gegensatz dazu war die Neomuskularisierung in der Lunge der Mäuse auch acht Wochen
nach der Hypoxiebehandlung weiterhin vorhanden (siehe 3.2). Dies lässt darauf schließen,
dass es sich bei den möglichen morphologischen Veränderungen in den Blutgefäßen der
Dura mater um andere Prozesse handelt, als dies in der Lunge der Fall ist. Das systemische
Blutgefäßsystem reagiert im Gegensatz zum intrapulmonalen Kreislauf nicht mit einer
Vasokonstriktion sondern mit einer Vasodilatation auf hypoxische Reize (Sommer et al.,
2008). Es ist daher wahrscheinlich, dass sich auch die pathologischen Prozesse an den
Blutgefäßen in der Entstehung beider Krankheiten unterscheiden.
Die PH ist von den Veränderungen der glatten Muskulatur geprägt, im Tiermodell der
Migräne kommt es zum induzierten Austritt von Plasmaproteinen. Die Barriere für das Blut
stellen in erster Linie die Endothelzellen dar. Möglicherweise ist dieser Zelltyp für die
Sensitivierung gegenüber mCPP verantwortlich. In in vitro Studien konnten gezeigt werden,
dass Endothelzellen aus der Aorta und der Lunge, im Gegensatz zu Glattmuskelzellen, unter
hypoxischem Stress die identischen Proteine verstärkt exprimierten (Graven et al., 1993). Es
Diskussion
108
besteht daher die Möglichkeit, dass die Endothelzellen in der Dura mater in einer ähnlichen
Weise auf die Hypoxie reagieren, wie die Endothelzellen in der Lunge.
4.2 Die Bedeutung des 5-HT 2B Rezeptors in der Pathogenese der PH
4.2.1 Pharmakologische Blockierung des 5-HT 2B Rezeptors während der
Hypoxiebehandlung
Dass der 5-HT2B Rezeptor möglicherweise eine wichtige Rolle in der Pathogenese der PH
spielt, wurde erstmals 2002 von der Arbeitsgruppe um Launay publiziert. In der Studie wurde
gezeigt, dass die Inaktivierung des 5-HT2B Rezeptors (pharmakologisch und genetisch) die
Hypoxie-induzierte Neomuskularisierung im vaskulären System der Lunge komplett
blockieren konnte (Launay et al., 2002). Dieser Befund wurde in dieser Arbeit überprüft,
indem der 5-HT2B Rezeptor durch tägliche Injektion des hochspezifischen Antagonisten BF-1
(pKi: 10.15, Beate Schmitz. persönliche Mitteilung) während der Hypoxiebehandlung
blockiert wurde. Es zeigte sich, dass es zu einer signifikanten Reduktion, nicht aber zu einer
kompletten Blockierung, der Neomuskularisierung der Blutgefäße mit einem Durchmesser
<50 µm kam. Zudem wurde die Hypertrophie des rechten Ventrikels durch die Applikation
von BF-1 vermindert (siehe 3.3.1).
Es bestehen einige Unterschiede zwischen den beiden Arbeiten, die für den abweichenden
Befund verantwortlich sein könnten. Launay et al. (2002) verwendeten Minipumpen, über die
kontinuierlich eine geringe Dosis des verwendeten Antagonisten RS127445 i.v. in das Blut
der Tiere gegeben wurde. In dieser Arbeit wurde den Mäusen täglich BF-1 in verschiedenen
Dosen (1 mg/kg - 20 mg/kg) i.p. injiziert. Die biologische Halbwertszeit von BF-1 beträgt
weniger als drei Stunden (Beate Schmitz, persönliche Mitteilung). Es wäre daher möglich,
dass die biologisch verfügbare Menge von BF-1 während der 24 h zwischen den einzelnen
Injektionen auf ein zu geringes Niveau gefallen war, um alle 5-HT2B Rezeptoren zu blockieren
und damit die Neomuskularisierung komplett zu verhindern. Dafür spricht auch, dass die
Gabe von BF-1, sofern sie lediglich alle zwei Tage erfolgte, keinen Einfluss auf die
Ausprägung der Neomuskularisierung hatte (Daten nicht gezeigt). Daher war die tägliche
Injektion von BF-1 nötig. Darüber hinaus wurden in beiden Arbeiten unterschiedliche
Tierstämme (NMRI bzw. 129/PAS) verwendet, was ebenfalls zu abweichenden Ergebnissen
führen kann.
In den letzten zwei Jahren sind weitere Studien publiziert worden, in denen beschrieben
wurde, dass die Blockierung des 5-HT2B Rezeptors zu einer Verringerung der
Neomuskularisierung intrapulmonaler Blutgefäße führte (Porvasnik et al., 2010; Dumitrascu
Diskussion
109
et al., 2011; Zopf et al., 2011). Diese Arbeitsgruppen verwendeten allerdings das MCT-
Modell in der Ratte (siehe 1.4.5).
Porvasnik et al. (2010) verwendeten die Substanz PRX08066 als Antagonist des 5-HT2B
Rezeptors. Die Gabe der Substanz erfolgte zweimal täglich p.o. in Dosen von bis zu
100 mg/kg. Selbst in dieser verhältnismäßig hohen Dosis konnte jedoch nur eine geringe
Reduktion der Neomuskularisierung erreicht werden. In der Studie von Dumitrascu et al.
(2011) wurde der partielle Antagonist des 5-HT2B Rezeptors Tergurid b.i.d. in einer Dosis von
1,2 mg/kg i.p. verabreicht. Diese Injektionen führten dazu, dass die Neomuskularisierung der
intrapulmonalen Blutgefäße nahezu komplett blockiert werden konnte. Zu dem gleichen
Ergebnis gelangte die Arbeitsgruppe um Zopf (2011). Der Antagonist C-122 inhibierte
dosisabhängig den Phänotypen der PH. Während eine Dosis von 1 mg/kg nur geringe
Auswirkungen auf die PH zeigte, verhinderte die Verabreichung von 10 mg/kg die
Neomuskularisierung der pulmonalen Blutgefäße nahezu vollständig.
Diese drei Studien zeigen, dass der 5-HT2B auch eine Rolle in der MCT-induzierten PH spielt.
Gleichzeitig traten jedoch auch Unterschiede in der Wirksamkeit der Antagonisten auf,
obwohl das identische Tiermodell verwendet wurde. Demnach nehmen die unterschiedlichen
Substanzen und deren Applikationsform einen großen Einfluss auf die Wirksamkeit
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass in allen hier diskutierten Arbeiten
nachgewiesen werden konnte, dass der 5-HT2B Rezeptor eine wichtige Komponente in der
Pathogenese der PH darstellt, da die pharmakologische Inaktivierung des Rezeptors zu
einer Reduktion oder auch kompletten Blockierung der Neomuskularisierung im
intrapulmonalen Blutgefäßsystem führte.
In dieser Arbeit konnte eine Reduktion der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung durch
die pharmakologische Blockierung des 5-HT2B Rezeptors während der Hypoxiebehandlung
erreicht werden. Daher ist davon auszugehen, dass noch andere Rezeptoren und
Substanzen an der Entstehung der PH beteiligt sind. Es existieren sehr viele Studien, in
denen mit Hilfe pharmakologischer Substanzen oder auch gentechnischer Methoden
Einfluss auf die Ausprägung der PH zu nehmen versucht wurde. Dabei kamen verschiedene
Pharmaka zum Einsatz, die eine vasodilatierende und/oder antimitogene Wirkung besitzen
(siehe auch 4.1.3). Neben den hier genannten Studien (Launay et al., 2002; Dumitrascu
et al., 2011) konnte der Phänotyp der PH auch in einer anderen Arbeit mittels Inhibition der
PDE-5 durch Sildenafil (75 mg/kg) blockiert werden (Sebkhi et al., 2003). In der Mehrzahl der
Untersuchungen konnte hingegen lediglich eine Reduktion der Neomuskularisierung gezeigt
werden. Dabei wurden unter anderem eine NO-Prodrug (Mathew et al., 1997), ein Antagonist
der 5-HT1B/1D Rezeptoren (Keegan et al., 2001), ein Inhibitor des SERT (Marcos et al., 2003),
Diskussion
110
ein Inhibitor der Rho-Kinase (Fagan et al., 2004) sowie ein HIF-Inhibitor (Abud et al., 2012)
verwendet. Desweiteren können auch die Effekte auf einzelne Parameter unterschiedlich
sein. In einer Studie kam es durch die pharmakologische Verstärkung der Hämoxigenase nur
zu einer Reduktion der MCT-induzierten Neomuskularisierung, der Rechtsventrikuläre Druck
(RVP) konnte jedoch auf Normalniveau gesenkt werden (Christou et al., 2000).
Die Variation der Erkenntnisse aus diesen Studien verdeutlicht, dass es sich bei der PH um
eine multifaktorielle Krankheit handelt. Aus diesem Grund sind inzwischen
Kombinationspräparate in der Behandlung der PH von besonderem Interesse (Clozel et al.,
2006). Die mögliche Signalkaskade der 5-HT2B Rezeptor-vermittelten Mechanismen wird an
anderer Stelle diskutiert (siehe 4.2.4).
4.2.2 Pharmakologische Blockierung des 5-HT 2B Rezeptors nach der
Hypoxiebehandlung
In einem weiteren Versuch wurde geprüft, ob die pharmakologische Blockierung des 5-HT2B
Rezeptors einen Einfluss auf die Reversibilität der Neomuskularisierung nehmen konnte. Die
neugebildete vaskuläre Muskelschicht blieb bis acht Wochen nach dem Aufenthalt in der
Hypoxiekammer bestehen (siehe 3.2). Da die Blockierung des 5-HT2B Rezeptors durch BF-1
während der Hypoxiebehandlung einen reduzierenden Effekt auf die Neomuskularisierung
hatte (siehe 3.3.1), wurde geprüft, ob die pharmakologische Inaktivierung des 5-HT2B
Rezeptors die Reversibilität der Muskularisierung positiv beeinflussen konnte. Die
Auswertung dieses Versuchs zeigte jedoch, dass die tägliche Applikation von BF-1 nach der
Hypoxiebehandlung keinen reduzierenden Effekt nach sich zog. Die erhöhte Anzahl
muskularisierter Blutgefäße war weiterhin vorhanden und nicht durch Blockierung des 5-HT2B
Rezeptors reversibel. Somit scheint der 5-HT2B Rezeptor lediglich eine Funktion in der
Entstehung der Neomuskularisierung zu besitzen, am Voranschreiten der PH jedoch nicht
beteiligt zu sein. Dafür spricht ebenfalls, dass die Stärke der Hypoxie-induzierten
Neomuskularisierung bei fünfwöchiger Hypoxiebehandlung nicht zunahm (siehe 3.1.2). Der
Phänotyp war somit nach vier Wochen bereits voll ausgeprägt. Es besteht daher die
Möglichkeit, dass die Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors zu diesem Zeitpunkt irrelevant für die
Ausprägung der PH war. In diesem Fall hätte auch die Blockierung des Rezeptors keine
Auswirkung auf die vaskuläre Muskulatur.
Es liegen bisher kaum Studien vor, in denen die Reversibilität der Neomuskularisierung nach
der Hypoxiebehandlung beschrieben wird. Im Tiermodell lässt sich der Phänotyp der PH
häufig während der Induktionsphase blockieren, nicht aber umkehren, was auch die
Problematik der Behandlung von Patienten der PH sehr gut widerspiegelt. Es existieren
Diskussion
111
allerdings auch Untersuchungen, in denen eine bereits ausgebildete Neomuskularisierung
sich wieder zurückbildete. In einer Studie wurde Imatinib, ein Antagonist des Rezeptors für
Platelet-derived growth factor (PDGF), eingesetzt. Sowohl im MCT-Modell als auch im
Hypoxie-Modell konnte die Applikation von Imatinib den bereits ausgebildeten Phänotypen
umkehren (Schermully et al., 2004). Eine weitere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass die
Behandlung der Versuchstiere mit sehr geringen Dosen von Kohlenstoffmonoxid (CO)
sowohl im MCT-Modell als auch im Hypoxie-Modell zur Reversibilität der bereits
ausgeprägten Neomuskularisierung führte (Zuckerbraun et al., 2006). Dies geschah in
Abhängigkeit von Stickstoffmonoxid (NO), da die Umkehr des Phänotyps nicht in Tieren
möglich war, bei denen die NO-Synthase (NOS) gentechnisch ausgeschaltet wurde.
Die genauen Mechanismen sind bisher allerdings weiter unklar und Gegenstand der
aktuellen Forschung. Es lässt sich daher festhalten, dass die Inaktivierung des 5-HT2B
Rezeptors nicht zur Reversibilität der Neomuskularisierung führte. Dies scheint jedoch durch
andere Signalwege möglich.
4.2.3 Expression des 5-HT 2B Rezeptors unter Einfluss von Hypoxie
In dieser Arbeit bestätigte sich der Befund, dass der 5-HT2B Rezeptor eine wichtige
Bedeutung in der Pathogenese der Hypoxie-induzierten PH besitzt (siehe 3.3.1). Aus diesem
Grund wurde untersucht, ob die Hypoxiebehandlung zu einer Veränderung der Expression
des Rezeptors führte. Diese Untersuchung erfolgte mit Hilfe der sq RT-PCR. Ein Vergleich
zwischen RNA-Proben aus der Lunge von normoxisch und hypoxisch gehaltenen Mäusen
ergab jedoch, dass nach vierwöchiger Hypoxiebehandlung keinerlei Regulationsprozesse auf
Ebene der RNA detektierbar waren.
Methodische Fehler können nahezu ausgeschlossen werden, da die Quantifizierung von
Präproendothelin-1 (ppET-1) eine verstärkte Expression des entsprechenden Transkripts
ergab (siehe Abb. 3.10). Dieses Ergebnis steht in Einklang mit Literaturdaten, da die
verstärkte Ausschüttung von ppET-1 bzw. ET-1 unter hypoxischen Bedingungen bereits
mehrfach beschrieben wurde (Elton et al., 1992; Li et al., 1994; Zamora et al., 1996; Zhang
et al., 2009).
Die Arbeitsgruppe um Launay konnte eine erhöhte Expression des 5-HT2B Rezeptors
nachweisen (Launay et al., 2002). Dieses Ergebnis beruht allerdings auf
Ligandenbindungsassays und wurde somit auf Ebene des Rezeptorproteins durchgeführt. Im
Gegensatz dazu stehen die Untersuchungen einer weiteren Studie. Dort wurde eine
reduzierte Expression des RNA-Transkripts des 5-HT2B Rezeptors im Lungengewebe von
Diskussion
112
Patienten mit der idiopathischen Form der PH (IPAH) gezeigt (Dumitrascu et al., 2011). In
Anbetracht der Unterschiede zwischen den Studien, sind die erlangten Ergebnisse kaum zu
bewerten.
Unter Umständen spielt aber auch der Zeitpunkt der Gewebeentnahme eine Rolle. Eine
weitere Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass es in den ersten zwei Wochen der
Hypoxiebehandlung zu einer verstärkten Expression von Angiopoietin-2 im Endothel
intrazerebraler Blutgefäße kam. Nach einer weiteren Woche, in der die Tiere unter
hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, fiel die Expression allerdings wieder auf das
Ausgangsniveau zurück (Pichiule & LaManna, 2002). Es ist daher möglich, dass etwaige
Regulationsprozesse des 5-HT2B Rezeptors nach der vierwöchigen Hypoxiebehandlung
bereits abgeschlossen waren, so dass diese nicht mehr detektiert werden konnten.
Da in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass der 5-HT2B Rezeptor eher eine Rolle bei der
Entstehung und nicht beim Voranschreiten der PH besitzt (siehe 4.2.2), wären weitere
Versuche sinnvoll, bei denen die Gewebeproben zu früheren Zeitpunkten der
Hypoxiebehandlung entnommen werden. Dies würde weitere Erkenntnisse zu einer
möglichen Regulation der Rezeptorexpression erbringen.
4.2.4 Die Signaltransduktion des 5-HT 2B Rezeptors unter Hypoxiebedingungen
Bisher ist die Signaltransduktion des 5-HT2B Rezeptors nur unzureichend charakterisiert.
Zumeist wurde die intrazelluläre Kopplung in heterologen Expressionssystemen untersucht
(z.B. Jerman et al., 2001). Ein Nachteil dieser Methode liegt allerdings darin, dass die
verwendeten Zellen den 5-HT2B Rezeptor im nativen Zustand nicht exprimieren. Daher wäre
es möglich, dass der Rezeptor nicht über die Proteine verschaltet ist, wie dies bei nativer
Expression der Fall wäre.
Die Pathogenese der PH ist gekennzeichnet von der Proliferation und Differenzierung von
nahezu allen vaskulären Zelltypen (siehe 1.4.4). Eine Gruppe von mitogen-activated protein
kinases (MAPK), die extracellular signal-regulated kinases (ERK), sind in vielen Pathologien
an diesen Prozessen beteiligt (Johnson & Lapadat, 2002; Zhan et al., 2003). Zudem konnte
die Aktivierung der ERK durch den 5-HT2B Rezeptor bereits gezeigt werden (Nebigil et al.,
2003; Li et al., 2008).
Die Western Blot Analysen (siehe 3.3.4) ergaben, dass es unter hypoxischen Bedingungen
tendenziell zu einer verstärkten Phosphorylierung der ERK kam. Wurde der 5-HT2B Rezeptor
pharmakologisch blockiert, war dieser Effekt nicht mehr detektierbar. Daher ist es sehr
Diskussion
113
wahrscheinlich, dass der 5-HT2B Rezeptor an der erhöhten Aktivierung der ERK unter
hypoxischen Bedingungen beteiligt war.
Die genaue Bedeutung der ERK in der Entstehung der PH ist Gegenstand der derzeitigen
Forschung. In einer Studie wurde nachgewiesen, dass Hypoxie zu einer verstärkten
Phosphorylierung der ERK führt (Jin et al., 2000). Darüber hinaus konnte durch in vitro
Experimente gezeigt werden, dass 5-HT direkt über die MAPK/ERK-Kaskade die
Proliferation pulmonaler Glattmuskelzellen (SMC) initiieren kann (Lee et al., 1999).
Fraglich bleibt weiterhin, über welche Proteine die mögliche Kopplung des 5-HT2B Rezeptors
und der ERK stattfindet. Allerdings konnte in einer Studie bereits gezeigt werden, dass die
Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors zu einer Aktivierung der GTPase Ras führte (Launay et al.,
1996). Ras wiederrum steht in direktem Zusammenhang mit der ERK-Signalkaskade und
befindet sich in dieser upstream der ERK (Pearson et al., 2001). Ein alternativer Signalweg
zur Aktivierung der ERK liegt in der Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration
(Mottet et al., 2002), welche bereits nach Stimulation des 5-HT2B Rezeptors beschrieben
wurde (Ullmer et al., 1996; Roth et al., 1998). Mögliche downstream Elemente der ERK sind
Transkriptionsfaktoren wie c-Myc oder c-Fos (Dworakowska et al., 2009). Weitere
Untersuchungen von Teilen der MAPK/ERK-Kaskade könnten Aufschluss über die genauen
Signalwege des 5-HT2B Rezeptors in der Lunge liefern.
In jedem Fall stellt die MAPK/ERK-Kaskade einen potentiellen Signalweg des 5-HT2B
Rezeptors dar. Durch die pharmakologische Blockierung 5-HT2B Rezeptors im Tiermodell der
PH könnte die Inhibition dieser Kaskade, welche nachweislich an Proliferations- und
Differenzierungsprozessen beteiligt ist, zur Reduktion der Hypoxie-induzierten
Neomuskularisierung führen.
4.3 Einsatz von Migräne-assoziierten Pharmaka im Ti ermodell der PH
4.3.1 L-NAME und die Bedeutung von NO
Das Gas NO verfügt über vasodilatierende sowie antimitogene Eigenschaften und stellt aus
diesem Grund eine wichtige Komponente in der Erforschung der PH dar (Hagan & Pepke-
Zaba, 2011). Allerdings steht NO auch im Zusammenhang mit der Pathogenese der Migräne
(siehe 1.3.2). Es wird vermutet, dass die Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors zur Freisetzung
von NO führt und dies den initialen Reiz für eine Migräneattacke darstellt. Es war daher
fraglich, ob die durch die Blockierung des 5-HT2B Rezeptors verursachte Reduktion der
Neomuskularisierung im Tiermodell der PH in Zusammenhang mit einer verminderten
Freisetzung von NO stehen kann.
Diskussion
114
Daher wurde den Versuchstieren während der Hypoxiebehandlung der NOS Inhibitor
L-NAME injiziert. Die Hemmung der NOS hatte jedoch keinen Einfluss auf die Ausprägung
der vaskulären Neomuskularisierung (siehe 3.4.1). Dadurch wurde ersichtlich, dass der
reduzierende Effekt, welcher durch die Inaktivierung des 5-HT2B Rezeptors hervorgerufen
wurde, unabhängig von NO war. Dieser Befund stellt einen gravierenden Unterschied zu den
Daten der Migräneforschung dar. Aufgrund der in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse konnte
gezeigt werden, dass die Signaltransduktion des 5-HT2B Rezeptors bei der Entstehung der
PH unabhängig von NO erfolgt.
NO sollte aufgrund seiner vasodilatierenden und antimitogenen Eigenschaften der PH
entgegen wirken. Aus diesem Grund stellen NO-Donatoren sowie die Inhalationstherapie mit
NO einen mehrfach untersuchten Behandlungsansatz der PH dar (Fagan et al., 2001; Hagan
& Pepka-Zaba, 2011; Koo et al., 2011; Lasker et al., 2011). Die in dieser Arbeit erhobenen
Daten stehen in Einklang mit dieser Theorie. Es existieren allerdings auch Hinweise darauf,
dass eine Erhöhung der NO-Konzentration zu pathologischen Prozessen führen kann
(Michelakis, 2003). Durch die Reaktion von NO mit reaktiven Sauerstoffspezies (ROS)
entsteht z.B. Peroxynitrit, welches stark toxisch wirkt und direkten Schaden an vaskulären
Zellen verursachen kann (Hampl & Herget, 2000). Zudem inhibiert Peroxynitrit die
Prostazyklin Synthase und sorgt damit für eine Reduktion des vasoaktiven und antimitogen
wirkenden Prostazyklins (Zou & Ullrich, 1996). Es scheint daher wichtig, dass die NO-
Konzentration in einem gewissen Gleichgewicht vorliegt. Diese Tatsache stellt ein Problem
bei der Behandlung von Patienten mit NO-assoziierten Pharmaka dar.
Die in dieser Arbeit durchgeführten Western Blot Analysen mit einem Antikörper gegen die
endotheliale NOS (eNOS) zeigten, dass es durch die Hypoxiebehandlung zu einer
verstärkten Expression des Proteins kam (siehe Abb 3.18). Obwohl es sich dabei lediglich
um das Enzym handelt, welches die Synthese von NO katalysiert, liegt der Schluss nahe,
dass es auch zu einer Erhöhung der NO-Konzentration als Folge der Hypoxie kam.
Interessanterweise hatte die verstärkte Expression der eNOS allerdings keinen Einfluss auf
den Phänotypen der PH. Hätte die erhöhte NO-Konzentration, die sich aus den Western Blot
Analysen ableiten ließ, einen reduzierenden Effekt auf die Hypoxie-induzierte
Neomuskularisierung, hätte die Blockierung der NOS zu einer Verstärkung des Phänotypen
führen müssen. Durch die pharmakologische Blockierung der NOS kam es jedoch nicht zu
einer Verstärkung der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung (siehe 3.4.1).
Es liegen einige Studien vor, in denen vergleichbare Quantifizierungen der eNOS
durchgeführt wurden. Durch Analysen von humanem Gewebe von Patienten mit PH als auch
durch Experimente in Tiermodellen der PH konnte zumeist eine erhöhte Expression der
eNOS nachgewiesen werden (Isaacson et al., 1994; Xue et al., 1995; Le Cras et al., 1996;
Diskussion
115
Fagan et al., 2001). Dies bestätigt die Ergebnisse, welche in dieser Arbeit erzielt wurden. Es
liegen allerdings auch Studien vor, in denen eine unveränderte (Tuder et al., 1999) sowie
eine reduzierte (Giaid & Saleh, 1995) Expression der eNOS gezeigt wurde.
4.3.2 Sumatriptan und die Bedeutung des 5-HT 1B Rezeptors
Triptane stellen das Mittel der Wahl zur Behandlung einer akuten Migräneattacke dar. In
dieser Arbeit wurde der 5-HT1B/1D Rezeptor-Agonist Sumatriptan verwendet, um die
Auswirkung der Triptane im Tiermodell der PH zu untersuchen. In der Dura mater löst
Sumatriptan über den 5-HT1B Rezeptor eine Vasokonstriktion aus und wirkt damit der
Vasodilatation während des Migräneanfalls entgegen (siehe auch 1.3). Über die Wirkung an
5-HT1D Rezeptoren verhindert Sumatriptan die Ausschüttung proinflammatorischer
Neuropeptide aus den freien Nervenendigungen des N. trigeminus (Buzzi & Moskowitz,
2005).
Es war daher fraglich, wie sich die dauerhafte Aktivierung dieses Rezeptors auf den
Phänotypen der PH auswirken würde. In bisherigen Arbeiten wurde gezeigt, dass sowohl die
pharmakologische Inaktivierung als auch die genetische Ablation des 5-HT1B Rezeptors zu
einer verringerten Ausprägung der PH führte. Die Verwendung des 5-HT1B/1D Rezeptor
Antagonisten GR127935 führte zu einer Reduktion der Hypoxie-induzierten
Neomuskularisierung. Knock-out Mäuse (5-HT1B-/-) zeigten den gleichen Effekt (Keegan
et al., 2001). Da in der Ausprägung der PH kein Unterschied zwischen den genetisch
veränderten Tieren und der Gruppe, die GR127935 erhielt, bestand, scheinen die 5-HT1D
Rezeptoren für die Entstehung der PH keine Relevanz zu besitzen. In einer später
publizierten Studie konnte gezeigt werden, dass ein Kombinationspräparat, welches sowohl
den 5-HT1B Rezeptor als auch den Serotonin Transporter (SERT) blockiert, die Hypoxie-
induzierte Neomuskularisierung nahezu komplett verhindern kann (Morecroft et al., 2010).
Dies zeigt erneut den multifaktoriellen Charakter der PH.
In dieser Arbeit führte die tägliche Applikation von Sumatriptan während der
Hypoxiebehandlung zu einer verstärkten Neomuskularisierung im Vergleich zu den Tieren,
welche unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurden, aber nicht den 5-HT1B/1D Rezeptor
Agonisten erhielten. Dieses Ergebnis zeigte, dass die Hypoxie-induzierte
Neomuskularisierung weiter verstärkt werden kann und diese nicht den maximalen
Muskularisierungsgrad darstellt (siehe 3.4.2).
Die Ausprägung der Neomuskularisierung war in der pharmakologisch behandelten
Tiergruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe in den kleinsten Blutgefäßen (≤25 µm) stärker
Diskussion
116
(Faktor 5) als in den Blutgefäßen mit einem Durchmesser von 26 - 50 µm (Faktor 3, siehe
Abb. 3.20). Dieser Befund scheint widersprüchlich, da man davon ausgeht, dass die
Neomuskularisierung dadurch entsteht, dass sich die neugebildete Muskulatur von proximal
nach distal in die Blutgefäße erstreckt. Dieser Effekt lässt sich jedoch dadurch erklären, dass
die numerische Anzahl muskularisierter Blutgefäße mit einem Durchmesser von ≤25 µm
grundsätzlich geringer ist als die der Blutgefäße mit einem größeren Durchmesser. Lediglich
der relative Anstieg in der Anzahl muskularisierter Blutgefäße war in den kleinsten
Blutgefäßen höher.
Es ist bisher nicht geklärt, durch welchen zellulären Mechanismus Sumatriptan die Hypoxie-
induzierte Neomuskularisierung verstärkt. Studien haben allerdings gezeigt, dass die
pulmonale Vasokonstriktion unter normalen physiologischen Bedingungen hauptsächlich
durch den 5-HT2A Rezeptor vermittelt wird. Unter hypoxischen Luftverhältnissen wird die
pulmonale Vasokonstriktion hingegen überwiegend über den 5-HT1B Rezeptor reguliert
(MacLean et al., 1996; Morecroft et al., 1999). Die Theorie wird dadurch bekräftigt, dass die
Expression des 5-HT1B Rezeptors, nicht aber die des 5-HT2A Rezeptors, in den pulmonalen
Arterien von Patienten mit PH erhöht vorliegt (Launay et al., 2002).
Neben der Funktion im intrapulmonalen Gefäßsystem, steuern sowohl 5-HT2A Rezeptoren
als auch 5-HT1B Rezeptoren die Vasokonstriktion in systemischen Blutgefäßen (Tanaka
et al., 2008). Wie bereits beschrieben reagieren die Blutgefäße des Körperkreislaufs mit
einer Vasodilatation auf Hypoxie, wohingegen die pulmonale Zirkulation mit einer
Vasokonstriktion antwortet (siehe 1.4.3). 5-HT1B Rezeptoren vermitteln jedoch unabhängig
von ihrer Gewebelokalisation eine Vasokonstriktion. Es bleibt unklar, warum es bei der
Entstehung der PH zu einer endogenen 5-HT1B Rezeptor-vermittelten Vasokonstriktion
kommt, während die Vasokonstriktion in der Dura mater durch die Gabe exogener Agonisten
herbeigeführt werden muss, um einen Migräneanfall zu unterdrücken. Letztlich sollte der 5-
HT1B Rezeptor in beiden Geweben unter dem Einfluss der Hypoxie aktiviert werden.
Desweiteren besteht die Frage, welche Rolle der 5-HT1B Rezeptor in der Proliferation der
glatten Muskelzellen spielt. Es konnte bereits gezeigt werden, dass die Stimulation des
Rezeptors mitogen wirken (Fanburg & Lee, 1997) und zudem die ERK aktivieren kann
(Pullarkat et al., 1998). Auch eine direkte Interaktion zwischen 5-HT1B Rezeptoren und
5-HT2B Rezeptoren wird diskutiert (Janoshazi et al., 2007).
4.3.3 mCPP und die dauerhafte Aktivierung des 5-HT 2B Rezeptors
Die Substanz mCPP wird sowohl im Menschen als auch im Tiermodell als Migräne-Induktor
beschrieben. Vermutlich wird diese Wirkung über den 5-HT2B Rezeptor vermittelt, da
Diskussion
117
Antagonisten dieses Rezeptors die im Tiermodell von mCPP verursachte
Plasmaproteinextravasation in der Dura mater blockieren können (siehe 1.3).
Bisher war unklar, ob der 5-HT2B Rezeptor durch die Hypoxie dauerhaft aktiviert wird. mCPP
wird in der Literatur als partieller Agonist des 5-HT2B Rezeptors beschrieben. Die Affinität
wird je nach verwendetem Versuchsaufbau mit einem pKi-Wert von 7,39 (Knight et al., 2004)
bis 8,49 (Rothman et al., 2000) angegeben. Um die Auswirkungen einer dauerhaften
Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors auf die Neomuskularisierung zu untersuchen, wurde den
Tieren täglich mCPP in einer Dosis von 1 mg/kg i.p. injiziert (siehe 3.4.3).
Die Auszählung der muskularisierten Blutgefäße zeigte, dass mCPP, ähnlich wie
Sumatriptan, die Hypoxie-induzierte Neomuskularisierung verstärkte. Wie schon bei der
Applikation des 5-HT1B Rezeptor Agonisten war auch hier der Effekt auf die kleinsten
Blutgefäße mit einem Durchmesser von ≤25 µm größer als auf die Gefäße mit einem
Durchmesser von 26 µm - 50 µm. Ein neuer Aspekt war jedoch, dass die tägliche Applikation
von mCPP auch in normoxisch gehaltenen Tieren zu einer Neomuskularisierung führte, die
in der Schwere der Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung entsprach.
Es ist sehr wahrscheinlich, dass der Agonismus von mCPP am 5-HT2B Rezeptor für die
verstärkte Neomuskularisierung verantwortlich ist. In anderen Studien konnte bereits gezeigt
werden, dass der Einsatz von Dexfenfluramin, dessen Metabolit Norfenfluramin ein
agonistisches Potential am 5-HT2B Rezeptor aufweist (pKi: 7,57; Fitzgerald et al., 2000), im
Hypoxie-Tiermodell ebenfalls zu einer erhöhten Muskularisierung führte (Launay et al.,
2002). In 5-HT2B-/- Mäusen trat dieser Effekt nicht auf, was zusätzlich für die Aktivierung des
5-HT2B Rezeptors als Ursache für den verstärkten Phänotypen spricht. Auch bei unter
hypoxischen Bedingungen gehaltenen Hunden führte die Applikation von Dexfenfluramin zu
einer Erhöhung des PVR (Naeije et al., 1996). Desweiteren konnte gezeigt werden, dass
Dexfenfluramin bei Ratten die Hypoxie-induzierte Rechtherzhypertrophie verstärkte
(Eddahibi et al., 2000). Im Gegensatz zu dieser Arbeit konnte allerdings in keiner dieser
Studien gezeigt werden, dass die dauerhafte Aktivierung des 5-HT2B Rezeptors bei Tieren,
welche unter normoxischen Bedingungen gehalten wurden, zur Ausprägung eines
PH-typischen Phänotypten führte. Dies könnte in den differierenden Affinitäten von
Dexfenfluramin und dem in dieser Arbeit verwendeten mCPP zu anderen Rezeptoren
begründet liegen.
mCPP weist ein breites pharmakologisches Profil unter den 5-HT Rezeptoren auf.
Abgesehen vom 5-HT2B Rezeptor besitzt mCPP die höchste Affinität am 5-HT2C Rezeptor
(pKi:7,86; Knight et al., 2004). Dieser wird jedoch nicht in Blutgefäßen exprimiert (Ullmer
et al., 1995) und befindet sich hauptsächlich in neuronalen Strukturen (Pompainano et al.,
Diskussion
118
1994). Auch am 5-HT2A Rezeptor wurde die Bindung von mCPP bereits beschrieben
(pKi:7,26, Knight et al., 2004). Dieser wird in den Blutgefäßen der Lunge exprimiert und ist
dort an der Vasokonstriktion beteiligt (siehe 4.3.2). In einer Studie wurde bereits eine
Dexfenfluramin-vermittelte Vasokonstriktion über 5-HT2A Rezeptoren gezeigt (Hong et al.,
2003). Dies wäre auch für mCPP möglich. Es bleibt daher fraglich, welche Rolle der 5-HT2A
Rezeptor in der mCPP-induzierten Neomuskularisierung spielt.
Zudem stellte sich die Frage, inwiefern die Signalwege der mCPP-induzierten und der
Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung übereinstimmen. Um dies zu überprüfen, wurden
die Versuchstiere für zwei Wochen unter hypoxischen Luftverhältnissen gehalten. Danach
erhielten sie Injektionen von mCPP unter normoxischen Bedingungen (siehe 3.4.4). Dabei
zeigte sich, dass es nicht zur Ausprägung einer Neomuskularisierung kam. Daher liegt der
Schluss nahe, dass die Signalwege der mCPP-induzierten und der Hypoxie-induzierten
Neomuskularisierung nicht übereinstimmen. Da die Herkunft der neugebildeten Muskelzellen
sowie die zellulären Mechanismen der vaskulären Remodellierung bislang ungeklärt ist, wäre
es möglich, dass unterschiedliche Zelltypen durch die verschiedenen Stimuli rekrutiert
werden (siehe 4.1.2).
Um zu überprüfen, ob es sich um einen additiven oder einen synergistischen Effekt bei der
mCPP-verstärkten Neomuskularisierung unter hypoxischen Bedingungen handelte, wurden
die Versuchstiere über variierende Zeiträume (zwei Wochen & vier Wochen) unter
hypoxischen Bedingungen gehalten und erhielten in der Folge Injektionen von mCPP unter
normoxischen Bedingungen für vier Wochen (siehe 3.4.4). Bei der Gruppe, welche nur zwei
Wochen unter hypoxischen Bedingungen gehalten wurde, kam es zur Ausprägung der
mCPP-induzierten Neomuskularisierung. Im Gegensatz dazu führte die vierwöchige Haltung
unter hypoxischen Luftverhältnissen, zur Ausprägung der Hypoxie-induzierten
Neomuskularisierung, welche durch die anschließende Applikation von mCPP nicht verstärkt
werden konnte. Daraus lässt sich folgern, dass es einen synergistischen Effekt von Hypoxie
und mCPP geben muss, der zu dem vorher beschriebenen Verstärkungsmechanismus
führte.
Synergistische Effekte von Hypoxie und verschiedenen Stimuli durch Proteine sind in der
Literatur bereits beschrieben. In in vitro Studien führte die Behandlung von Zellen mit
transforming growth factor-beta (TGF-β) unter hypoxischen Bedingungen zu einem massiven
Anstieg der Expression des vascular endothelial growth factors (VEGF). Dieser Effekt war im
Vergleich zur Einzelstimulation mit TGF-β oder Hypoxie weitaus stärker (Sánchez-Elsner
et al., 2009). Auch für platelet derived growth factor (PDGF) und Hypoxie wurden bereits
synergistische Signalwege beschrieben (Stavri et al., 1995). In welcher Form mCPP und
Hypoxie interagieren können, ist bisher nicht bekannt. Allerdings wurde bereits gezeigt, dass
Diskussion
119
sowohl mCPP (Gobbi et al., 2002; Baumann et al., 2001) als auch Hypoxie (Fanburg & Lee,
2000; siehe auch 1.4.6) auf den SERT wirken können. Daher scheint auch hier ein
synergistischer Mechanismus bei der Entstehung der Neomuskularisierung möglich.
4.4 Zelluläre Lokalisation des 5-HT 2B Rezeptors
Um zu bestimmen, in welchem Zelltyp der 5-HT2B Rezeptor in der Lunge lokalisiert ist,
wurden sowohl immunhistochemische Färbungen als auch in situ-Hybridisierungen
durchgeführt. Als methodische Positivkontrolle wurde der Vormagen der Ratte verwendet, da
der 5-HT2B Rezeptor aus diesem Gewebe kloniert wurde (Foguet et al., 1992; Kursar et al.,
1992). Um die Lokalisation des Rezeptors in der Lunge zu untersuchen, wurde ebenfalls die
Spezies Ratte verwendet.
4.4.1 Lokalisation in der Lunge
Sowohl die immunhistochemische Färbung als auch die in situ-Hybridisierung zeigten, dass
der 5-HT2B Rezeptor in den Endothelzellen der intrapulmonalen Blutgefäße exprimiert wird
(siehe 3.5.2 & 3.5.4). In der in situ-Hybridisierung war die Färbung auf die dem Lumen
zugewandte Schicht, die Endothelzellen, beschränkt (siehe Abb. 3.23). Bei der
immunhistochemischen Färbung zeigte sich in der Überlagerung der Fluoreszenzsignale
keine vollständige Kolokalisation unter Verwendung der Antikörper gegen den 5-HT2B
Rezeptor sowie den von-Willebrand-Faktor (vWF), welcher als Endothelmarker verwendet
wurde. Das teilweise Fehlen einer Kolokalisation lässt sich dadurch erklären, dass der vWF
in so genannten Weibel-Palade Körpern lokalisiert ist (Wagner et al., 1982). Dabei handelt es
sich um Zellorganellen, die im Zytoplasma lokalisiert sind. Der 5-HT2B Rezeptor stellt jedoch
ein Transmembranprotein dar, so dass die unterschiedliche intrazelluläre Lokalisation eine
Erklärung für das Erscheinungsbild der immunhistochemischen Färbung sein könnte.
Desweiteren nimmt die Anzahl der Weibel-Palade-Körper mit geringer werdendem
Gefäßdurchmesser ab. Daher ist das Verteilungsmuster der immunhistochemischen Färbung
gegen den vWF sehr heterogen. Auch dies beeinträchtigt eine Kolokalisation. Es wurden
auch andere Endothelmarker wie z.B. ein Antikörper gegen eNOS verwendet. Diese stellten
sich jedoch als ungeeignet heraus.
Die zelluläre Lokalisation des 5-HT2B Rezeptors wurde in der Lunge bisher nur in wenigen
Studien beschrieben. Mittels RT-PCR wurde allerdings die RNA des Rezeptors in
pulmonalen Arterien sowie isolierten Endothelzellen nachgewiesen (Ullmer et al., 1995). In
einer weiteren Studie wurde der 5-HT2B Rezeptor in der glatten Muskulatur der Bronchien mit
Diskussion
120
einem polyklonalen Antikörper lokalisiert (Choi & Maroteaux, 1996). Dieser Befund steht im
Kontrast zu den Ergebnissen dieser Arbeit. Allerdings wurde bisher kein funktioneller
Hinweis auf eine Expression des Rezeptors in den Atemwegen publiziert. Launay et al.
verwendeten ebenfalls einen polyklonalen Antikörper zur Detektion des 5-HT2B Rezeptors in
der Lunge. mit diesem Antikörper wurde der Rezeptor in der glatten Muskulatur der
pulmonalen Blutgefäße nachgewiesen (Launay et al., 2002). Eine Erklärung für diesen
Befund kann nicht gegeben werden. Allerdings besteht die Möglichkeit von interspezifischen
Unterschieden, wie sie für die Expression des 5-HT2B Rezeptors in der Lunge bereits
beschrieben wurden (Ullmer et al., 1995).
Die Lokalisation des 5-HT2B Rezeptors in Endothelzellen wirft die Frage auf, wie dieser
Befund im Kontext der PH zu werten ist. Zwar sind nahezu alle Zelltypen an der
Pathogenese der Krankheit beteiligt, jedoch konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die
Stimulation des 5-HT2B Rezeptors zur Ausbildung einer neuen Muskelschicht führte, die
durch die Blockierung des Rezeptors reduziert werden konnte (siehe 3.3.1). Auch eine
mögliche Induzierung von Proliferation und/oder Zelldifferenzierung über Aktivierung der
ERK (siehe 3.3.4) würde eher für die Lokalisation des Rezeptors in der glatten Muskulatur
sprechen. Da es sich bei der PH um eine multifaktorielle Krankheit handelt und bereits
mehrere Interaktionsproteine des 5-HT2B Rezeptors beschrieben wurden (siehe 4.2.4 &
4.2.3), besteht die Möglichkeit, dass der Prozess der Neomuskularisierung über einen im
Endothel lokalisierten Rezeptor initiiert wird. Die Kommunikation zwischen Endothelzellen
und glatter Muskulatur ist ebenfalls sehr komplex und es bedarf weiterer Untersuchungen,
um diese Zusammenhänge aufzuklären (Budel et al., 2001; Foubert et al., 2008; Kameritsch
et al., 2011).
4.4.2 Lokalisation im Magen
Die Lokalisation des 5-HT2B Rezeptors mittels der in situ-Hybridisierung diente als
methodische Positivkontrolle für die verwendeten RNA-Sonden. Es fand eine spezifische
Anfärbung von Strukturen des Plexus Myentericus (PM) statt (siehe 3.5.1). Bereits in
anderen Studien wurde die Expression des 5-HT2B Rezeptors im PM beschrieben (Fiorica-
Howells et al., 2002; Bormann et al., 2002; Zhang et al., 2009). Lediglich die Arbeitsgruppe
um Duxon lokalisierte den 5-HT2B Rezeptor mittels immunhistochemischer Färbungen in der
glatten Muskulatur des Magens (Duxon et al., 1996). Die Ergebnisse der in situ-
Hybridisierung dieser Arbeit stehen daher weitestgehend im Einklang mit den Literaturdaten.
Die Bestimmung des Zelltyps innerhalb des PM warf allerdings Fragen auf. Vane (1957)
konnte zeigen, dass die Applikation von 5-HT zu einer gesteigerten Kontraktion des
Diskussion
121
Vormagens der Ratte führte. Dieser Effekt wird über den 5-HT2B Rezeptor vermittelt (Baxter
et al., 1994). In einer weiteren Studie konnte gezeigt werden, dass die 5-HT-induzierte
Kontraktion des Vormagens unabhängig von neuronaler Aktivität war (Amemiya et al., 1996),
so dass Neurone nicht der Expressionsort für den 5-HT2B Rezeptor sein können.
Daher wurde in dieser Arbeit mit den Interstitial Cells of Cajal (ICC) ein weiterer Zelltyp aus
dem PM auf die Expression des 5-HT2B Rezeptors überprüft. Die ICC werden auch als
Pacemaker bezeichnet und regulieren über spontane, rhythmische Kalzium-Wellen, so
genannte slow waves, die Motilität des gesamten Gastrointestinaltrakts (GIT) (Radenkovich
et al., 2005; Sanders et al., 2006; Takaki et al., 2010; van Helden et al., 2010). Die
Expression des 5-HT2B Rezeptors konnte bereits in ICC des Jejunum nachgewiesen werden
(Wouters et al., 2007 & 2009). In vitro Experimente zeigten jedoch, dass der 5-HT2B
Rezeptor in diesem Gewebe proliferationsfördernd wirkt. Möglicherweise handelt es sich um
gewebespezifische Unterschiede in der Funktion des Rezeptors im Vergleich zum
Vormagen.
Durch immunhistochemische Färbungen konnte der 5-HT2B Rezeptor in den ICC des
Rattenvormagens lokalisiert werden (siehe 3.5.3). Das Färbemuster des 5-HT2B Rezeptors
stimmte nahezu vollständig mit dem der ICC-Marker c-kit und ANO1 überein. Da im PM
jedoch auch weitere Zelltypen wie z.B. die enterischen Neurone oder enterische Glia
vorhanden sind, war es fraglich, warum durch die immunhistochemischen Färbungen der
komplette PM immunpositiv erschien. Eine mögliche Erklärung für diesen scheinbaren
Widerspruch liefern 3D-Rekonstruktionen der ICC im PM (Lee et al., 2009). In dieser
Darstellung zeigte sich, dass ICC die enterischen Neurone und deren Fortsätze mit
blattartigen Strukturen umhüllen, und sich deshalb mit Soma und Fortsätzen über den
kompletten PM erstrecken.
Neben den histologischen Arbeiten erfolgten durch die Etablierung einer Primärkultur aus
dem Vormagen der Ratte auch funktionelle Analysen der ICC. Diese untermauerten die
histologischen Ergebnisse, da die Stimulation von c-kit und des 5-HT2B Rezeptors zu einer
Erhöhung des intrazellulären Kalziumspiegels in identischen Zellen führte (siehe 3.6.2).
Sehr auffällig war, dass in den kultivierten ICC keine slow waves detektierbar waren, obwohl
dies bereits mehrfach in vitro gezeigt wurde (Koh et al., 1998 & 2000; Parajuli et al., 2010;
Parsons & Huizinga, 2010). Es scheinen jedoch starke regionale Unterschiede innerhalb der
verschiedenen Abschnitte des Magens zu bestehen. In einer Studie konnte im Magen des
Meerschweinchens gezeigt werden, dass in Bereichen wie Antrum oder Corpus über slow
waves kommuniziert wird, wohingegen in dem Bereich, welcher dem Vormagen der Ratte
entspricht, keinerlei elektrische Spontanaktivität verzeichnet werden konnte (Hirst &
Diskussion
122
Edwards, 2006). Dagegen wurden slow waves in Präparationen des Rattenfundus
nachgewiesen (Kito et al., 2009). Es scheint daher ein funktioneller Unterschied zwischen
den einzelnen Magenabschnitten zu bestehen, der sich in der Aktivität der ICC widerspiegelt.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass durch histologische Untersuchungen sowie
in vitro Analysen der Nachweis erbracht wurde, dass der 5-HT2B Rezeptor im Vormagen der
Ratte nicht von Neuronen oder Glattmuskelzellen, sondern ICC exprimiert wird.
4.5 Ausblick
In dieser Arbeit wurden Bedeutung und Funktion des 5-HT2B Rezeptors im Tiermodell der PH
untersucht. Da dieser Rezeptor auch eine wichtige Rolle in der Migräneentstehung spielt,
wurden Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen den beiden Pathologien untersucht
und herausgearbeitet.
Die Erkenntnisse dieser Arbeit können als Grundlage für weitere Forschungsarbeiten dienen.
Besonders die Wirkung von mCPP im Tiermodell der PH sollte weiter untersucht werden.
Sowohl die synergistischen Effekte mit der Hypoxie als auch die Fähigkeit unter
normoxischen Bedingungen eine Remodellierung der pulmonalen Blutgefäße auszulösen,
bieten viele Möglichkeiten für weitere Arbeiten. Da mCPP ein relativ breites
pharmakologisches Profil besitzt, sollte untersucht werden, ob neben dem 5-HT2B Rezeptor
weitere Rezeptoren an der mCPP-induzierten Neomuskularisierung beteiligt sind. Dazu
könnte Tieren während der Hypoxiebehandlung neben mCPP auch BF-1 verabreicht
werden. Dieser Ansatz wäre besonders dadurch interessant, als die Blockierung des 5-HT2B
Rezeptors zu einer Reduktion der Neomuskularisierung führte. Eine weitere Möglichkeit
besteht in der Verwendung von BW723C86 als spezifischem Agonisten des 5-HT2B
Rezeptors.
Auch weitere Untersuchungen zur Expression des 5-HT2B Rezeptors und von Proteinen,
welche der MAPK/ERK-Signalkaskade angehören, würden weitere wichtige Erkenntnisse
liefern. Versuchsansätze, in welchen das Gewebe zu verschiedenen Zeitpunkten zu Beginn
der Hypoxiebehandlung (z.B. 1-14 Tage) entnommen wird, könnten den Zeitpunkt der 5-HT2B
Rezeptor-vermittelten Prozesse eingrenzen.
Da der 5-HT2B Rezeptor in Endothelzellen lokalisiert werden konnte, wären weitere in vitro
Experimente interessant. Zwar scheiterte die Etablierung einer Primärkultur aus der Lunge
bisher, es könnten jedoch auch Zelllinien wie HUVECs (Human Umbilical Vein Endothelial
Cells) verwendet werden. Die Kommunikation zwischen Endothelzellen und
Glattmuskelzellen könnte in Kokulturen untersucht werden. Die Proliferation und
Diskussion
123
Differenzierung glatter Muskelzellen könnte durch den Transfer von konditioniertem Medium
nach Stimulation mit 5-HT, mCPP oder BW723C86 analysiert werden.
In Bezug auf die Erforschung der Migräne zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass eher
Unterschiede als Gemeinsamkeiten zur Krankheit der PH bestehen. Trotzdem bleibt die
Frage besonders interessant, wie der 5-HT2B Rezeptor in beiden Pathologien eine wichtige
Bedeutung einnimmt, obwohl sich die Funktionsweise des Rezeptors in der Dura mater und
der Lunge stark zu unterscheiden scheint. Diese Besonderheit wird Bestandteil der weiteren
Erforschung der PH und der Migräne sein.
Zusammenfassung
124
5. Zusammenfassung
Bei der Pulmonalen Hypertonie (PH) handelt es sich um eine Erkrankung der Lunge, bei der
durch die Remodellierung pulmonaler Blutgefäße ein erhöhter Gefäßwiderstand
hervorgerufen wird. Im Verlauf der Krankheit kommt es zur Hypertrophie des rechten
Herzventrikels, welche schließlich zur Herzinsuffizienz führt.
Sowohl in der Entstehung der PH als auch der Migräne spielt der 5-HT2B Rezeptor eine
wichtige Rolle. Es wurde bereits gezeigt, dass die pharmakologische Blockierung des
Rezeptors in beiden Krankheiten zu einer Inhibition der pathologischen Prozesse führen
kann. Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Bedeutung des 5-HT2B Rezeptors sowie der
Einfluss von Migräne-assoziierten Pharmaka auf die Pathogenese der PH im Tiermodell
untersucht.
In dieser Arbeit wurde das Tiermodell der normobaren Hypoxie zur Induktion der PH in
Mäusen eingesetzt. Die histologische Quantifizierung muskularisierter Blutgefäße in der
Lunge ergab, dass eine Behandlungsdauer von vier Wochen notwendig war, um eine
Hypoxie-induzierte Neomuskularisierung in intrapulmonalen Blutgefäßen hervorzurufen.
Dieser pathologische Prozess zeigte sich als persistierend, da die Neomuskularisierung bis
zu acht Wochen nach der Hypoxiebehandlung bestehen blieb.
Es bestätigte sich in dieser Arbeit, dass die pharmakologische Blockierung des 5-HT2B
Rezeptors während der Hypoxiebehandlung mit dem spezifischen Antagonisten BF-1 eine
Reduzierung der Neomuskularisierung pulmonaler Blutgefäße bedingte. Allerdings konnte
auch gezeigt werden, dass die Inaktivierung des Rezeptors nach der Hypoxiebehandlung die
Neomuskularisierung nicht umkehren konnte. Dieser Befund spricht dafür, dass der 5-HT2B
Rezeptor zwar eine Funktion in der Entstehung der PH einnimmt, am Fortschreiten der
Pathologie jedoch unbeteiligt ist. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die
Hypoxiebehandlung die Expression des 5-HT2B Rezeptors auf RNA-Ebene nicht veränderte.
Zudem wurde mittels Western Blot die MAPK/ERK-Signalkaskade als möglicher
Signaltransduktionsweg des Rezeptors identifiziert.
Die Inhibition der NO-Synthase (NOS), welche bereits im Tiermodell der Migräne zu einer
Blockierung des Phänotyps führte, zeigte im Tiermodell der PH keine Wirkung auf die
Remodellierung der intrapulmonalen Blutgefäße. Gleichwohl war die Expression der NOS in
der Lunge nach der Hypoxiebehandlung erhört. Die Applikation von Sumatriptan, einem
akuten Anti-Migränikum und Agonisten am 5-HT1B Rezeptor, verstärkte die Hypoxie-
induzierte Neomuskularisierung. Ebenso führte mCPP, ein partieller Agonist des 5-HT2B
Rezeptors und ein bekannter Migräneinduktor, ebenfalls zur Verstärkung der Hypoxie-
induzierten Neomuskularisierung der intrapulmonale Blutgefäße. Diese Verstärkung beruhte
Zusammenfassung
125
nicht auf einem additiven, sondern einem synergistischen Effekt von Hypoxie und mCPP.
Darüber hinaus verursachte die Applikation von mCPP auch unter normoxischen
Bedingungen die Neuausbildung einer vaskulären Muskelschicht. Es konnte gezeigt werden,
dass sich die zellulären Mechanismen der mCPP-induzierten Neomuskularisierung sowie der
Hypoxie-induzierten Neomuskularisierung unterscheiden.
In weiteren Versuchen wurde die zelluläre Lokalisation des Rezeptors im Vormagen der
Ratte, dem Organ der Klonierung des Rezeptors, sowie der Lunge untersucht. Der 5-HT2B
Rezeptor konnte durch in situ-Hybridisierung, immunhistochemische Färbung sowie in vitro
Experimente in Interstitial Cells of Cajal lokalisiert werden. In der Lunge wurde der 5-HT2B
Rezeptor in Endothelzellen detektiert.
Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern neue Ansatzpunkte für die Erforschung der PH sowie der
Migräne. Zudem konnten weitere Erkenntnisse über die Lokalisation und Funktion des
5-HT2B Rezeptors gewonnen werden.
Summary
126
6. Summary
Pulmonary Hypertension (PH) is a disease affecting the lung. In the progress of PH
remodeling of the pulmonary blood vessels leads to an increase in the vascular resistance,
which finally causes right heart failure due to right ventricular hypertrophy.
The 5-HT2B receptor plays a major role in the pathogenesis of PH as well as in migraine.
Studies could show that the pharmacological inhibition of this receptor counteracts the
pathological events that occur in both conditions. In this work the role of the 5-HT2B receptor
and the impact of migraine-related pharmacological substances on PH were further
analyzed.
In this PhD work the animal model of normobaric hypoxia was used to trigger PH in mice.
The histological quantification of muscularized blood vessels in lung sections revealed that a
hypoxia treatment of four weeks was necessary to establish the hypoxia-induced
neomuscularization in the pulmonary vasculature. This effect turned out to be a persistent
morphological remodeling of the blood vessels that was not reversible up to eight weeks after
the hypoxia treatment.
Further experiments of this work confirmed that the inhibition of the 5-HT2B receptor during
the hypoxia treatment by the specific antagonist BF-1 leads to a reduction in the process of
vascular neomuscularization. However, the inactivation of the 5-HT2B receptor after the
hypoxia treatment failed to reverse the established vascular remodeling. These results
indicate that the 5-HT2B receptor exhibits a function in the onset but not in the progression of
PH. Aside from these findings the expression of the 5-HT2B receptor remained unchanged on
the RNA level after hypoxia treatment. In addition, the MAPK/ERK-pathway was identified as
a potential target for the 5-HT2B receptor mediated signaling.
The inhibition of the nitric oxide synthase (NOS), which is capable of beneficial effects in an
animal model of migraine, had no impact on the formation of the vascular remodeling in the
animal model of PH. Nonetheless, the expression of NOS was increased in the lung by the
hypoxia treatment. The application of Sumatriptan, the most widely used anti-migraine drug
and a potent agonist at 5-HT1B receptors, caused a severe enhancement of the hypoxia-
induced neomuscularization. mCPP, a partial agonist of the 5-HT2B receptor and know for its
migraine-inducing features, increased the hypoxia-induced neomuscularization as well. This
process was based on a synergistic, but not an additive effect of hypoxia and mCPP.
Furthermore, the application on mCPP under normoxic conditions caused the generation of a
new muscle layer in pulmonary blood vessels. It was apparent that the cellular mechanisms
of the hypoxia-induced neomuscularization and the mCPP-induced neomuscularization
differ.
Summary
127
In additional experiments the cellular expression of the 5-HT2B receptor was determined in
the forestomach, where the receptor has originally been cloned from, and the lung of the rat.
By means of in situ hybridization, immunohistochemical stainings and in vitro experiments
the 5-HT2B receptor was localized in Interstitial Cells of Cajal of the rat forestomach. In the
lung, the receptor was detected in endothelial cells.
The results of this PhD work present new perspectives for the research on PH and migraine.
In addition, further insights on the localization and function of the 5-HT2B receptor were
delivered.
Literaturverzeichnis
128
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Danksagung
146
Danksagung
Lebenslauf
147
Veröffentlichungen
148
Veröffentlichungen
Posterbeiträge:
Bäcker, I.; Zhu, X.; Lübbert, H.
Localization of the 5-HT2B receptor in Interstitial Cells of Cajal in the rat stomach
34. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Zellbiologie in Bonn
(30. März - 02. April 2011)
Zeitschriftenartikel:
Leichsenring, A., Bäcker, I., Wendt, W., Andriske, M., Schmitz, B., Foguet, M.,
McMahon, S., Stichel, C.C., Lübbert, H . Differential expression of Cathepsin S and X in the
spinal cord of a rat neuropathic pain model. BMC Neuroscience 2008 9:80-92
Leichsenring A., Andriske M., Bäcker I., Stichel C. C., Lübbert H. Analgesic and
antiinflammatory effects of cannabinoid receptor agonists in a rat model of neuropathic pain.
Naunyn-Schmiedeberg’s Archieves of Pharmacology 2009 379(6):627-636.
Erklärung
149
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbstständig verfasst und bei keiner anderen Fakultät
eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe. Es
handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um sechs in Wort und Bild
völlig übereinstimmende Exemplare.
Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in
keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.
Bochum, den 07. Februar 2012
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