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Identifizierung von Proteinen Genom bekannt, Proteinsequenzen in der Datenbank abgelegt:
- Identifizierung von Proteinen mit Hilfe der Massenspektrometrie
Methode der Wahl, sehr empfindlich, in der Regel einige Femtomol eines Proteins ausreichend
- N-terminale Sequenzierung und/oder Sequenzierung von Peptiden mit Edman-Abbau, nur noch selten durchgeführt in der Regel einige picomol eines Proteins erforderlich
Genom nicht sequenziert:
Aufklärung der kompletten Primärstrukur erforderlich,
häufigste Strategie: Peptidsequenzen Oligonukleotide PCR cDNA-Klon Screenen einer Genbank Sequenzieren von cDNA-Klonen
Erstellen von Protein-/Peptidsequenzen
Edman-Abbau (erste Wahl) Massenspektrometrische Sequenzierung (de novo Sequenzierung, häufig problematisch)
Isolierung und Identifizierung von Proteinen im Mikromaßstab: 1. Anreicherung
(Methode abhängig von dem jeweiligen Protein)
- Subzelluläre Fraktionierung (z.B. Isolierung von Mitochondrien, Zellkerne durch Zentrifugation)
- Differenzielle Extraktion/Fällung - Chromatographie
1. Affinitäts-Chromatographie 2. Ionenaustausch-Chromatographie 3. Adsorptions-/Verteilungschromatographie 4. Gel Filtration
2. Trennung durch Gel-Elektrophorese (universell anwendbar)
- SDS- Gel-Elektrophorese - 2D- Gel-Elektrophorese
3. Analyse der Banden / Spots durch Massenspektrometrie
Protein-Gemisch
Trennung aufSDS-Gel/ 2D-Gel
Blot auf PVDF-Membran
N-terminale SequenzEdman-Abbau
In-Gel Verdaumit Proteasen
Extraktion der Peptide
HPLC-Trennung
Massenspektrometrie
Datenbanksuche mitMS-/MS/MS-Daten
PeptidsequenzenEdman-Abbau
Bande/Spotausschneiden
> 5 pmol
> 50 pmol<< 1pmol
Strategien zur Identifizierung/Sequenzierung vonProteinen und Peptiden
N C S NH
C
S
NH
CH C
O
NH
CH
C
O
NH
R R
H+
NH
C
S
NH CH
C
O
NH
CH
C
O
NH
R
R
+
NH
C
S
NH CH
C O
R
NH2
CH
C
O
NH
R
NH
CS
NH CH
C O
R
OH
N
CS
NH CH
C O
R
NH2
CH C
O
NH
CH
C
O
NH
R R
NH
C
S
N CH
C O
R
Edman-Abbau
+
neuer Zyklus
Base
H+
(wasserfrei)+
intermediäreRingöffnung
Phenylthiohydantoin
PTH-Aminosäure
Thiazolinon
H+-
-
+
Reagents in
Reagents out
Glass block
Glass fibrefilter disc
NH2
CH C
O
CH2
CH2
CONH
2
NH ....
NH3
CH C
O
CH2
CH2
C
O
NHNH ....
NH2
CH C
O
RNH ....
CH3
C
O
NH CH C
O
RNH ....
häufige N-terminale Blockierung von Proteinen:
Bildung von Pyroglutamat
Acetylierung/Acylierung
Frequently used enzymes for fragmentation of proteins
Enzyms (major sources) EC-number Specificity (X-↓-Y) pH optimum Enzymes of high specificity
Endoproteinase Arg-C (Clostridium histolyticum)
3.4.22.8 Arg-↓-Y 7 - 8
Endoproteinase Lys-C (Achromobacter lyticus, (Lysobacter enzymogenes)
3.4.21.50 Lys-↓-Y 8 - 9
Trypsin (Bos taurus) 3.4.21.4 Lys-↓-Y, Arg-↓-Y 7 - 9
Endoproteinase Glu-C (Staphylococcus aureus)
3.4.21.19 Glu-↓-Y, (Asp-↓-Y) * 8 (4)
Endoproteinase Asp-N (Pseudomonas fragi)
3.4.24.33 X-↓-Asp 7 - 8
Enzymes of lower specificity Major cleaved bonds:
Chymotrypsin (Bos taurus) 3.4.21.1 X = Tyr, Phe, Trp, (Leu) 7 - 9
Pepsin (sus scrofa) 3.4.23.1 X,Y = aromatic, large aliphatic aa 1.8 - 2.5
Elastase (sus scrofa) 3.4.21.36 X = Ala, uncharged, non-aromatic aa, 8 - 9
Thermolysin (Bacillus thermoproteolyticus)
3.4.24.27 Y = L, F and other aromatic or large hydrophobic aa
8
* Glu-: ammonium bicarbonate, pH 7.8, ammonium acetate, pH 4.0, Glu-, Asp-:phosphate buffer, pH 7.8, (cleavage at Asp often slow) aa = amino acid
-NH CH
C NH
O
CH C NH
O
CH2
CH2
S
CH3
Br
NC
R-NH C
HC N
H
O
CH C NH
O
CH2
CH2
S
CH3
CN+
R-Br
-NH CH
C NH
O
CH C NH
O
CH2
CH2
+
R
S
CH3
CN-NH CH
C NH
O
CH C NH
O
CH2
CH2
OH
R
-NH CH
C
OCH2
CH2
O
NH2
CH C NH
O
R
-NH CH
C
OH
CH2
CH2
O
OH
BrCN-Spaltung
-NH CH
C NH
O
CH C NH
O
CH2
CH2
S
CH3
CN+
R
OH2+
Homoserin-lacton
Homoserin
+
+
-
H+-
Reversed-Phase-Chromatographie
Derivatisierung des Kieselgels mit Silanen: Oberfläche wird unpolar
stationäre Phase mobile Phase
unpolar polar
Die Phasen sind im Vergleich zur“normalen” Chromatographie an Kieselgelumgekehrt, daher der NameReversed-Phase-Chromatogaphie(RP-Chromatogaphie)
+ ClSi OH Si
R
R
2( )CH 17 CH3 Si O Si
R
R
2( )CH 17 CH3
HCl
R
Si O
O
Si O
SiR
R2
( )CH 17 CH3
SiR
2( )CH 17 CH3
CH3 CN H O2/
Silan
Analyt
-
Theorie/Definitionen
Zeit
Det
ekto
r-S
igna
l
t0
t R1
t R2
t R2t R1t 0
Injektion
Retentionskoeffizient: k =tRn t0
n-
t0
Auflösung: R =tR2 - tR1
w1 w2-
-
w1 w2
´Bödenzahl: N = 16
tR
w
2
Bodenhöhe: H =LN
L = Säulenlänge
Selektivität: � =k 2́
k 1́
Zeit
Det
ekto
r-S
igna
l
t R2t R1t 0
Zeit
Det
ekto
r-S
igna
l
t R2t R1t 0
Zeit
Det
ekto
r-S
igna
l
t R2t R1t 0
schlechte Auflösung
gute Auflösung aufgrundhöherer Bödenzahl
gute Auflösung aufgrundhöherer Selektivität
Faktoren, die zur Peakverbreiterung führen
Eddy-Diffusion
longitudinale Diffusion
Massentransport zwischenmobiler und stationärer Phase
Totvolumina im Chromatographie-System
van Deemter-Gleichung:
h = A +Bu
C u_
uh =
+
= Flussgeschwindigkeittheoretische Bodenhöhe
A( )Bu_( )
C u( )
Eddy-Diffusion
longitudinale Diffusion
Zeit
Start
Säule
Massentransfer zwischen stationärer und mobiler Phase
- Diffusionskoeffizient des Analytenin der stationären Phase
- Diffusionskoeffizient des Analytenin der mobilen Phase
- Dicke der stationären Phase
- Flussrate
- Verteilungskoeffizient
- Partikelgröße
Verteilungsgeschwindigkeit variiert mit:
Verteilung zwischen stationärer undmobiler Phase benötigt eine gewisse Zeit
mobile Phase
stationäre Phase
Bandbreite
Bandbreite nach einiger Zeit
langsameAquilibrierung
Fluss-Richtung
Faktoren, die zur Peakverbreiterung führen
Eddy-Diffusion
longitudinale Diffusion
Massentransport zwischenmobiler und stationärer Phase
Totvolumina im Chromatographie-System
van Deemter-Gleichung:
h = A +Bu
C u_
uh =
+
= Flussgeschwindigkeittheoretische Bodenhöhe
A( )Bu_( )
C u( )
HPLC
Hochdruckgradientensystem (pro Fließmittel eine Pumpe)
Niederdruckgradientensystem
(High Pressure Liquid Chromatography,)Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
Isokratische Elution, Gradientenelution
isokratisch:
Die Zusammensetzung des Fließmittelsbleibt während der Trennung konstant
Die Zusammensetzung des Fließmittelsändert sich während der Trennung hinzu höherer Elutionskraft
Gradient:
A BC
D
A B C D
A B C D
Zeit
Abs
orpt
ion
Abs
orpt
ion
Abs
orpt
ion
Zeit
Fließmittel 2(höhere Elutionskraft)
Fließmittel 1
V
V
V
V
V
V
V
V
Funktionsweise eines Injektionsventils
Load InjectVentilstellung:
Proben-schleife
von derPumpe
zur Säule
zum Abfall-Behälter
von derPumpe
zur Säule
von der Injektions-spritze
Abs
orpt
ion
[220
nm]
Retentionszeit [min]
0.05
0.01
20 40 600
Sta
rt
Trennung tryptischer Peptide von Ferritin durchReversed-Phase-Chromatographie
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