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Patch – Clamp – Ableitungen _____________________________________________________________
- Einführung
- Methodik
- Auswertung von Rohdaten
- Fazit / Ausblick
Einführung
- Entwicklung 1976 (Nobelpreis 1991)
Erwin NEHER Bert SAKMANN
The Nobel Prize in Physiology or Medicine for 1991 is awarded for the discoveries of the function of ion channels. The two German cell physiologists Erwin Neher and Bert Sakmann have together developed a technique that allows the registration of the incredibly small electrical currents (amounting to a picoampere - 10-12A) that passes through a single ion channel. The technique is unique in that it records how a single channel molecule alters its shape and in that way controls the flow of current within a time frame of a few millionths of a second.
Revolution !
- hohe räumliche Auflösung
Untersuchung von Einzelkanalströmen unter verschiedensten Bedingungen möglich;
damit: Größe von Einzelkanalströmen / (In-) Aktivierungskinetik, Einflüsse
Whole-Cell: SummenstromCell- Attached: physiolog. Bedingungen;EM unverändert
Outside- Out: Wirkung extrazellulärer Transmitter
Inside-Out: Wirkung intrazellulärerTransmitter (isoliertes Fragment)
Der Patch-Clamp-VerstärkerMethodik
1: Differenzialverstärker erzeugt eine Spannung, die in linearer Beziehung zur Spannungsdifferenz an beiden Eingängen steht
2: Eingangswiderstand liegt in Größenordnung von 1012 Ω
3: Spannungsabfall über Rf ist proportional zur Stromstärke zwischen 1 und 2
verwendete Zellen: Neuroblastoma-Tumorzellen der Zelllinie B35 von Rattenembryonen
Zugabe von K+-Kanal-Blockern (Ziel: Untersuchung der Na+-Kanäle)
Anvisierung der ausgewählten Zelle im LM mit der Elektrode
kurz vor Berührung: Überdruck-Erzeugung
2 Informations-Quellen über Abstand der Elektrode zur Zelle:
akustische Informationen über den Widerstand visuelle Informationen durch Eindrücken der Zellmembran aufgrund des Überdrucks
Nach hinreichender Annäherung: Erzeugung eines Unterdrucks
Ansaugen der Zellmembran (Cell-attached-Konfiguration): Gigaseal erkennbar durch flachere Stromspur Minimierung der kapazitiven Ströme notwendig
Weiter Unterdruck sorgt für Aufreißen der Zellmembran (Whole-Cell-Konfiguration) Erneute Minimierung der kapazitiven Ströme nötig
Ausführung verschiedener Messprotokolle Datenauswertung
Auswertung: von den Rohdaten zur Erkenntnis…
Welche interessanten Größen lassen sich aus den Rohdaten bestimmen ?
Messung eines (Ionenkanal-) Stroms bei vorgegebener Spannung
U = R * I I = U / R = U * g
Strom – Spannung Aktivierung Inaktivierung Refraktärität
Ergebnisse
Protokoll: Sodium 1 Haltepotential: Ruhemembranpotential bei -80 mV
Dann: 15 Spannungssprünge für jeweils 45 ms in Zehnerschritten von -60 mV bis +80 mV
Strom-Spannungs-Kurve
Der Strom wird gegen die vorgegebene Spannung aufgetragen
Es gibt 3 Phasen sowie 2 wichtige Größen
Stromspannungs-Kurve, Zelle E12
-800-700-600-500-400-300-200-100
0-70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Spannung [mV]
Str
om
[p
A]
Reihe1
3 Phasen:
Einwärtsstrom
Anstieg bis Epeak
Abfall bis Erev
Auswärtsstrom
2 wichtige Größen:
Epeak
Erev
Aktivierungskinetik
Zusammenhang zwischen Membranspannung E und Leitfähigkeit g der (Natrium-) Kanäle
INa gNa = -------------- E - Erev
gemessene Spannung ENa (50 mV) gesetzt
(nor
mie
rt)
g 1----- = --------------------------------- gmax 1 + 1 / [e^ [(E – E0.5):k]]
Boltzmann
E 0.5
E0.5 ist die Spannung, bei welcher die Hälfte aller Na+ - Kanäle
geöffnet ist (halbmaximale Gesamtleitfähigkeit !)
g 1----- = --------------------------------- gmax 1 + 1 / [e^ [(E – E0.5):k]]
k verhält sich invers zur Steilheit der Kurve (etwa zur Steigung bei E0,5)
Maß für die Spannungsabhängigkeit der Aktivierung (je kleiner k, desto größer)
g 1----- = --------------------------------- gmax 1 + 1 / [e^ [(E – E0.5):k]]
Zelle E(1/2) k
2 -0.031 0.009
-0.029 0.00825
3 -0.0469 0.0051
-0.046 0.005
4 -0.037 0.01
-0.0368 0.0122
5 -0.036 0.0078
-0.0369 0.0079
6 -0.045 0.011
7 -0.0426 0.012
Mean -0.03872 0.008825
VAR² 0.00619889 0.00254638
E10_2_7_2011
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
-0.07 -0.06 -0.05 -0.04 -0.03 -0.02 -0.01 0
E9_2_8_2111
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
-0.08 -0.07 -0.06 -0.05 -0.04 -0.03 -0.02 -0.01 0
Variabilität von E 0.5 und k : zell- und zelltypspezifische Unterschiede in Expressionsmustern verschiedener (Sub-) Kanaltypen…
Inaktivierungskinetik
Noch während der Depolarisation schließen die Nav-Kanäle wieder
Diese Inaktivierung findet mit zeitlicher Verzögerung (ms) statt und ist für Repolarisation zurück zum Ruhepotential der Zellmembran mitverantwortlich
Untersuchung der Spannungsabhängigkeit der Inaktivierung im Gleichgewichtszustand
Spannung für depolarisierende Konditionierung: -120mV bis -30mV
in Schritten von 10mV
Dauer der Depolarisation: 100ms
Auswertung:
- Steady-State-Inaktivierung mit NaInact1-Protokoll
- Stromamplituden während Spannungssprung nach Epeak auf maximalen Einwertsstrom normieren
- Auftragen von E; I /I(max); Boltzmann-Fit
E1/2 : Spannung, bei der die Hälfte der Nav-Kanäle inaktiviert sind
k : Im steilsten Bereich der Kurve ist die Spannungsabhängigkeit am größten
Idealbild einer Inaktivierungskurve
E9_NaInac_1_4_1_4_Boltzmann
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
-0.14 -0.12 -0.1 -0.08 -0.06 -0.04 -0.02 0
Spannung (V)
I /
I(m
ax)
E(0.5) -0.085
k -0.0055
E in mV I/I(max) boltzmann Δ²
-1.20E-01 0.97430824 0.99827987 0.00057464
-1.10E-01 1 0.98949616 0.00011033
-1.00E-01 0.90028672 0.93861689 0.0014692
-9.00E-02 0.7376619 0.7128141 0.00061741
-8.00E-02 0.28075044 0.2871859 4.1415E-05
-7.00E-02 0.08220838 0.06138311 0.00043369
-6.00E-02 0.04514798 0.01050384 0.00120022
-5.00E-02 0.04333555 0.00172013 0.00173184
-4.00E-02 0.04783218 0.00027961 0.00226125
-3.00E-02 0.0498849 4.5398E-05 0.00248398
-2.00E-02 0.03855515 7.3693E-06 0.00148593
-1.00E-02 0.04430696 1.1962E-06 0.001963
Beispielhafte Auswertung einer Zelle
Refraktärität
Na+-Kanäle nach AP inaktiviert
Wiederaktivierung zeitabhängig (Refraktärzeit) Schnelligkeit der Aktionspotential-Wiederholungen limitiert
absolute Refraktärzeit nach AP: weiteres AP kann unter keinen Umständen ausgelöst
werden
relative Refraktärzeit nach AP: weiteres AP kann durch starke Spannungspulse ausgelöst
werden (erhöhtes Schwellenpotential, schwächere APs)
Rec 1: zweiter Spannungspuls in 1ms-Abständen verschoben
Rec 1: Ergebnisse
Rec 1: Auswertung: I2/I1 im Zeitverlauf
Sättigungsfunktion
Rec 2: zweiter Spannungspuls in exponentiellen Abständen verschoben
Rec 2: Ergebnisse
Rec 2: Auswertung (I2/I1 im Zeitverlauf)
Sättigungsfunktion
Charakterisierung der Graphen anhand der Zeitkonstante der Natrium-Aktivierung:
Charakterisierung der Graphen anhand der Zeitkonstante der Natrium-Aktivierung:
Charakterisierung der Graphen anhand der Zeitkonstante der Natrium-Aktivierung:
Patch-Clamp: Fazit
Vorteile
- Besseres Signal-Rausch-Verhältnis als bei Intrazellulärableitungen
- Ableitungen von einzelnen Kanälen möglich
Nachteile
- Keine Ableitung von neuronalen Netzwerken möglich- Für gute Ableitungen braucht man Einiges an Übung und
Geschick
Ausblick : Planares Patch - Clamp
- keine adhärenten Zellen, sondern Zellsuspension auf einem Chip
- Zellen werden durch eine Öffnung im Chip angesaugt (Gigaseal); daraufhin wird abgeleitet
Spiel gefällig?
www.science-display.com/patchclamp.html
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