QuantiFERON®-Gold In Tube T-SPOT.TB Test KlinFor Workshop B16 Die neuen Tuberkulose Tests Detlev...

QuantiFERON®-Gold In Tube T-SPOT.TB Test

KlinFor Workshop B16 ‚Die neuen Tuberkulose Tests‘

Detlev Schultze

Dr. med. Dipl Biol. Leitender Arzt

Institut für Klinische Mikrobiologie und Immunologie, St. Gallen

Lungen-Tuberkulose versus latente Infektion, CDC 2005

Latente Infektion

• TST oder y-Interferon positiv

• Röntgen Lunge negativ

• Keine Symptome einer Tuberkulose

• Proben ohne Erregernachweis

Lungentuberkulose

• TST oder y-Interferon positiv

• Röntgen Lunge positiv

• Husten +/- Blut im Sputum +/- B-Symptomatik

• PositivMikroskopie +/- PCR +/- Kultur aus respiratorischen Proben

Diagnostik der Lungen Tuberkulose

Identifizierung mit PCR und Gensonden

Reistenztestung

- Ethambutaol

- Pyrazinamid

- Isoniazid

- Rifampicin

Adaptiert nach Handbuch Tuberkulose, Lungenliga

CH 2007

Diagnostik der latenten Tuberkulose

Tuberculosis-Skin-Test (TST )

Interferon-Gamma Release

Assay (IGRA)

QuantiFERON-Gold In Tube

[Cellestis]

T-SPOT.TB[Oxford Immunotec])

Vergleich IGRA - TST

Interferon-Gamma Release Assay (IGRA)

In vitro Spezifische Antigene Keine Boosterung 1 Patienten Visite +

Laborkosten Minimale Test-Variabilität Resultate in 2 Tagen

Tuberculosis-Skin-Test (TST )

In vivo Weniger spezifische Antigene Boosterung 2 Patienten Visiten

höhere Test-Variabilität Resultate in 2 - 3 Tagen

ESAT 6 und CFP10 im Interferon-Gamma Release Assay (IGRA)

Mycobacterium-Genom: Region of Difference 1 (RD1)

codiert für ESX-1 Sekretionssystem zur Ausschleusung von Early Secretory Antigenic Target (ESAT-6) und Culture Filtrate Protein 10 (CFP-10) aus Mycobacterium-Zelle

vorhanden in Mycobacterium tuberculosis

→ Fähigkeit zur lokalen Ausbreitung und Lyse von Pneumocyten

Deletion aus Mycobacterium bovis Virulenz Minderung

fehlt in attenuiertem M.bovis –Stamm = Bacille Calmette-Guérin

Rekonstitution in transgenem BCG Stamm → Virulenz Erhöhung

Komplex mit CFP-10 und ESAT-6

EMBO Journal 2005 / Champion et al 2007 / Wards et al 2000 / Onyebujoh 2004

ESAT 6 und CFP 10 in ESAT 6 und CFP 10 in MycobacteriaceaeMycobacteriaceae

Environmental strains

Antigene

ESAT-6 CFP-10

M abcessus - -M avium - -M branderi - -M celatum - -M chelonae - -M fortuitum - -M gordonii - -M intracellulare - -M kansasii + +M malmoense - -M marinum + +M oenavense - -M scrofulaceum - -M smegmatis - -M szulgai + +M terrae - -M vaccae - -M xenopi - -

Tuberculosis complex

Antigene

ESAT-6

CFP-10

M tuberculosis + +M africanum + +M bovis + +BCG substrain    

gothenburg - - moreau - - tice - - tokyo - - danish - - glaxo - - montreal - - pasteur - -

T-SPOT.T-SPOT.TB TB – – Blutaufbereitung in Vacutainer CPTBlutaufbereitung in Vacutainer CPT™™ Röhrli Röhrli

Röhrli zentrifugierenRöhrli zentrifugieren

Lymphocyten Bande aufnehmenLymphocyten Bande aufnehmen

Lymphozyten zählen und waschenLymphozyten zählen und waschen

Lymphozyten in 96-PlatteLymphozyten in 96-Platte

TB Antigene zugebenTB Antigene zugeben

Übernacht Inkubation Übernacht Inkubation

Enzyme-Linked Immunospot (ELISpot) Technologie

T-SPOT.T-SPOT.TB TB – – Spot BildungSpot Bildung

Platte waschenPlatte waschen Detektionsreagenz zugeben Detektionsreagenz zugeben 60 min inkubieren60 min inkubieren Platte waschen Platte waschen Farbreagenz (Substrat) Farbreagenz (Substrat)

zugebenzugeben Spots innerhalb 7 minSpots innerhalb 7 min Platte waschen und trocknenPlatte waschen und trocknen

negativ

positiv

T-SPOT.T-SPOT.TB TB – – Spot ZählungSpot Zählung

Mit blossem Auge und VergrösserungsglasMit blossem Auge und Vergrösserungsglas

Alternativ mit automatisiertem ELISPOT imagerAlternativ mit automatisiertem ELISPOT imager

Above: Automated T-SPOT plate reader

Null TB Mitogen

Interferon-y Spiegel vor TB-Stimulation ?

T-Zellen durch ESAT-6, CFP-10, TB7.7 stimulierbar ?

T-Zellen durch Phythämagglutinin stimulierbar?

QuantiFERON®-Gold In Tube

3x1ml BlutInkubation 37ºC16-24 Stunden

Zentrifugation 5-15 min

-Interferon stabil im Kühlschrank

(+4°C) 8 Wochen

1 Blut Entnahme und Vorbereitung für Test

NULL TB Mitogen

Option 1: Versand Blutröhrchen innerhalb 16 Stunden an Labor, vor Inkubation.

Option 2: Versand Blutröhrchen innerhalb 3 Tagen an Labor, nach Inkubation

Option 3: Sammlung der Proben nach Zentrifugation, ans labor zur -Interferon Messung

QuantiFERON®-Gold In TubeQuantiFERON®-Gold In Tube

Ergebnis-berechnung

[IE/ml]

Stop Lösung und

Extinktions-Messung

Waschen und Substrat Zugabe

Inkubation 120 min Raum-Temperatur

Plasma und Konjugat

2 γ-Interferon ELISA

Positive Ergebnisse → Wiederholung im Doppel → Befund reproduziert

Durchführung 1-2 x pro Woche

QuantiFERON®-Gold In TubeQuantiFERON®-Gold In Tube

3 Befundung

QuantiFERON®-Gold In TubeQuantiFERON®-Gold In Tube

QuantiFERON®-Gold In Tube - versus - T-SPOT.TB test

QuantiFERON®-Gold In Tube - versus - T-SPOT.TB test

QuantiFERON®-Gold In Tube – Blutentnahme bis Plasmagewinnung

Blutentnahme Massnahme bei Abweichung

Röhrchen-Füllung mit Blut bis Markierung = 1 ml, Test validiert für 0.8-1.2 ml

Neues Röhrchen füllen

Transport Beachten

Lagerungsposition irrelevant vor 37°C Inkubation → erneutes 5 sec- Mischen

37°C Inkubation ? - nein

- ja

- ja + Zentrifugation

16 Stunden 17 - 27°C

72 Stunden 17 - 27°C

8 Wochen 4°C

Inkubation bei 37°C Massnahme bei Abweichung

Röhrchenposition aufrecht – Kappe nach oben Erneute Blutentnahme

Plasmagewinnung Massnahme bei Abweichung

- Zentrifugation (5-15 minutes 1‘500–2‘200 g) - Sedimenation im Röhrchen abwarten und Plasma

vorsichtig ohne Zellen abhebern

Gel hat Blutkuchen nicht vom Plasma getrennt → erneute Zentrifugation >2‘200g

QuantiFERON®-Gold In Tube Interpretation – negative Mitogen Kontrolle

Kollektiv mit unterschiedlichem Immunstatus nicht stimulierbar (%)

gesunde, immunkompetente Personen 0.3

Patienten mit Autoimmun-Erkrankungen (anti-TNF-a) 5.6

Dialyse Patienten 6.8

Präanalytik nicht beachtet → mangelnde Bildung IFN-y durch …

heftiges Schütteln der Röhrchen (5 sec) bis Schaumbildung

… geronnenes Blut

… ungelöste Antigene

Temperatur 17 - 27°C für Lagerung-/Transport

Zeitintervall Blutentnahme bis Inkubation

… Verfall der T-Zellen

Inkubation Röhrchen für 16 - 24 Stunden bei 37°C. … zu kurze Erwärmung

Vorrats-Lagerung unbenutzter Röhrchen 4-27°C für 15 Monate

… Verfall TB Antigene / Mitogen

T-Zellen durch Mitogen (Phythämagglutinin) nicht stimulierbar → IFN--y <0.5 IE/ml

ProblemProblem Beurteilung Leistung der IGRA’s im Vergleich mit TST, ohne Beurteilung Leistung der IGRA’s im Vergleich mit TST, ohne

Gold Standard für die Latente TB Infektion ? Gold Standard für die Latente TB Infektion ?

TST ist kein Gold Standard, da weder 100% sensitiv noch TST ist kein Gold Standard, da weder 100% sensitiv noch 100% spezifisch100% spezifisch

Ohne Gold Standard ist die direkte Ermittlung von Sensitivität Ohne Gold Standard ist die direkte Ermittlung von Sensitivität und Spezifität der IGRA’s und des TST unmöglichund Spezifität der IGRA’s und des TST unmöglich

HypotheseHypothese Luftübertragung von TB wahrscheinlicher mit längerer Dauer Luftübertragung von TB wahrscheinlicher mit längerer Dauer

sowie Enge des Kontaktes zu TB Patienten sowie Enge des Kontaktes zu TB Patienten

→ Exposition korreliert mit IGRA Ergebnis→ Exposition korreliert mit IGRA Ergebnis

Analytische Leistungsfähigkeit von IGRA’s von IGRA’s

SensitivitätSensitivität in Probanden in Probanden ohne TBohne TB, nach Ausmass Exposition, nach Ausmass Exposition

TST = QFN Gold in tube = TST = QFN Gold in tube = T-SPOT.T-SPOT.TB TB

Analytische Leistungsfähigkeit von IGRA’s von IGRA’s

Sensitivität Sensitivität in Probanden in Probanden mit aktiver TBmit aktiver TB TST < QFN Gold in tube < TST < QFN Gold in tube < T-SPOT.T-SPOT.TBTB

Analytische Leistungsfähigkeit von IGRA’s von IGRA’s

Spezifität Spezifität bei sehr geringem Risiko einer TB Infektionbei sehr geringem Risiko einer TB Infektion

TST < QFN Gold in tube = TST < QFN Gold in tube = T-SPOT.T-SPOT.TB TB

Analytische Leistungsfähigkeit von IGRA’s von IGRA’s

Prädiktiver WertPrädiktiver Wert Risiko für Entwicklung aktiver TB bei Patienten mit Risiko für Entwicklung aktiver TB bei Patienten mit

IGRA Ergebnissen IGRA Ergebnissen → → unbekanntunbekannt→ → langfristige Kohortenstudien notwendiglangfristige Kohortenstudien notwendig

Analytische Leistungsfähigkeit von IGRA’s von IGRA’s