- MicroRNA - Vorhersagen menschlicher Zielgene Präsentation von Sophia Bardehle Seminar Genomics, Juni 2005 betreut durch Herrn Dr. Benedikt Brors, DKFZ

- MicroRNA -- MicroRNA -

Vorhersagen menschlicher ZielgeneVorhersagen menschlicher Zielgene

Präsentation von Sophia BardehlePräsentation von Sophia BardehleSeminar Genomics, Juni 2005Seminar Genomics, Juni 2005

betreut durch Herrn Dr. Benedikt Brors, DKFZbetreut durch Herrn Dr. Benedikt Brors, DKFZ

InhaltInhalt

- miRNA Targets - Sophia Bardehle

Bedeutung der miRNA

„TargetScan“

Target - Vorhersagen

Nachweis im Experiment

Funktion von Zielgenen

News


Bedeutung der miRNABedeutung der miRNA

• endogene, ~22-nt, nicht-codierende RNA

in Pflanzen und Tierzellen

Funktionen:

molekulare Mechanismen unklar

bis 2003 miRNA Targets in Vertebraten unbekannt

(http://www.ambion.com/techlib/resources/miRNA/mirna_exp.html)


miRNA : TargetmiRNA : Target

keine perfekte W-C- Komplementarität

„miRNA seed“= konservierte 5‘ Region

3‘ UTR Sequenz der mRNA

nach Quelle 1)

„„TargetScan“TargetScan“


Algorithmus zur Vorhersage von Zielgenen

für konservierte miRNA in Wirbeltieren

Prinzip:

Identifizierung der mRNA,

die konservierte Bindung

mit „miRNA seed“

eingeht.

„„TargetScan“- MethodeTargetScan“- Methode


Grundlage:

• konservierte miRNA mehrerer Organismen(Rfam Download; Sanger Institute)

• Annotationen orthologer 3‘UTR mRNA-Sequenzen (Ensembl EnsMart)



1)Suche nach „seed-match“,d.h. perfekte W-C-Paarung einer Heptamersequenz

zwischen 3‘ UTR und 5‘ „miRNA seed“

2)„RNAfold“ liefert optimale Basenpaarung für 3‘ Ende der miRNA

nach Quelle 1)



3)Berechnung der freien Energien G der

miRNA : Target Interaktionen

G1

G2

nach Quelle 1)



4) jede UTR erhält Z-Score

n

k

T

G

i

K

eZ1

5.3=e+e=e+e=Z 20

17.0

20

21.8

T

dG-

T

dG- 21

nach Quelle 1)



5) Sortierung der Z-Scores der UTRs

Rangfolge (Rank R)

nach Quelle 1)



6) Targetvorhersage

Kriterien: - hoher Z-Score mit Z ≥ Zc

- Rank R ≤ Schwellenwert Rc

Parameter: Zc, Rc und T sind frei wählbar

T = Gewichtungsfaktor für Affinität der

Basenpaarung

Erfahrungswerte: (Analyse von Maus, Ratte,

Mensch)T= 20 Zc= 4,5 Rc= 200

„„TargetScan“- ErgebnisseTargetScan“- Ergebnisse


Analyse von miRNA : TargetInteraktionen

14.539 16.370 15.590

451Limitierung auf

konservierte, high-scoringmiRNA : TargetInteraktionen> 400 verschiedene Zielgene

nach Quelle 1)



signal

noise („false positive“)

signal:noise Verhältnis von 3.5

Ø 3,9 Targets pro miRNA

(Klasse: Mammalia)

nach Quelle 1)



Bedeutung der Bindung an die 5‘ Region der miRNA

nach Quelle 1)

„„TargetScan“- ProblemeTargetScan“- Probleme


• unvollständige Annotationen für orthologe UTRs

• reale Targets fallen durch Z-Sore/Rank-Kriterium

• Bindestellen außerhalb 3‘ UTR unbeachtet

• nur konservierte Gene in Betracht gezogen

• gleichzeitige Interaktionen verschiedener miRNAs

an einer UTR ausgeschlossen

Fazit:

reale Anzahl an Zielgenen pro miRNA ist viel

größer

Experimenteller NachweisExperimenteller Nachweis


Methode - Luciferase Assay -

• Auswahl von 3‘ UTR menschlicher Zielgene

PCR

• Klonierung in Luciferase Vektor

• PCR Selektion nach Insert: Wildtyp oder

Mutante

• Transformation des Luciferase Reporter

Plasmids

in menschliche HeLa-Zellen

• Messung der Luciferase Aktivität (Lumineszenz)

Photinus pyralis



Luciferase Reporter Vector

nach Quelle 1)



Interpretation

• Wildtype: miRNA : Target site Bindung

Luciferaseexpression ↓

geringe Lumineszenz

• Mutante: lückenhafte miRNA : Target Basenpaarung

Luciferaseexpression ↑

hohe Signale

Luciferase



Luciferaseaktivität

nach Quelle 1)



Ergebnis:

15 vermutliche Zielgene („TargetScan“)

getestet

11 Gene experimentell bestätigt

ca. 30 % der Vorhersagen sind „false

positive“

Funktionen von ZielgenenFunktionen von Zielgenen


große funktionelle Diversität

Beispiele

• TF: High-mobility-Proteine• Signaltransduktion:STAT3• Rezeptor: LDL-R• Strukturproteine: Collagen• Enzyme:G6PD• Translationsregulator:COP9

> 400 Zielgenekonserviert

zwischen Maus, Ratte

Mensch

Funktion von ZielgenenFunktion von Zielgenen


GO ID Biological Process miRNAs

all orthologous genes

no assignment/unknown130 (32%) 5737 (40%)

known biological process270 (68%) 8802 (60%)

GO:0007275 development 52 (13%) 1192 (8%)

GO:0019538 protein metabolism 60 (15%) 1788 (12%)

GO:0008151 cell growth and/or maintenance 92 (23%) 2742 (19%)

GO:0006810 transport 44 (11%) 1442 (10%)

GO:0008283 cell proliferation 23 (6%) 764 (5%)

GO:0007154 cell communication 76 (19%) 2704 (19%)

GO:0007165 signal transduction 61 (15%) 2217 (15%)

GO:0006793 phosphorus metabolism 30 (8%) 589 (4%)

GO:0009605 response to external stimulus 28 (7%) 1065 (7%)

GO:0045449 regulation of transcription 82 (21%) 1210 (8%)

GO:0006350 transcription 84 (21%) 1310 (9%)

NewsNews


TargetScanS 2005

• 5-Genome-Analyse (signal:noise ↑)

Identifizierung von 5300 meschlichen

Genen, die durch miRNA reguliert werden

(~30% des Genoms)

TargetScan Webserver

• Datenbank zur Suche nach konserv. miRNA

Targets bzw. Zielgenen

http://genes.mit.edu/targetscan/

ReferenzenReferenzen


1) Prediction of Mammalian MicroRNA Targets Benjamin P Lewis1,3, I-hung Shih2,3, Matthew W Jones-Rhoades1,2, David P Bartel1,2, Christopher B Burge1. Cell, Vol. 115 (7), December 26, 2003.

2) Conserved Seed Pairing, Often Flanked by Adenosines, Indicates that Thousands of Human Genes are MicroRNA Targets Benjamin P Lewis1,2, Christopher B Burge1, David P Bartel1,2. Cell, Vol. 120 (1), January 14, 2005.

mailto:[email protected]?subject=Regarding%20http://genes.mit.edu/TargetScan






http://www.cell.com/

ReferenzenReferenzen


3) Bartel Lab: http://web.mit.edu/biology/www/facultyareas/facresearch/bartel.shtml

4) Burge Lab: http://genes.mit.edu/burgelab/

5) I-hung_Shih-original-presentation.pdf

6) David Baulcombe (2002) "An RNA Microcosm", Science, 297: 2002-2003)

7) Ambion: http://www.ambion.com/techlib/resources/miRNA/mirna_exp.html

8) Marianthi Kiriakidou, Peter T. Nelson et al.

“A combined computational-experimental approach predicts human microRNA targets”

Documents

- MicroRNA - Vorhersagen menschlicher Zielgene Präsentation von Sophia Bardehle Seminar Genomics, Juni 2005 betreut durch Herrn Dr. Benedikt Brors, DKFZ