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Gelelektrophorese von Proteinen

SDS-PAGE, IEF, 2D

Christina Himmler

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Gliederung

Was ist Gelelektrophorese? SDS-PAGE IEF 2D

Vor- und Nachteile der dargestellten Methoden

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Was ist Gelelektrophorese? geladene Teile (Proteine) wandern je nach

Größe und Ladung in einem elektrischen Gleichstrom-Feld

Zonenelektrophorese Verwendung eines oder mehrerer Puffer

oder pH-Gradient Apparatur bestehend aus Trenneinheit

(Kapillare, horizontale oder vertikale Kammern), Stromversorgung (500-5000V und 150-400mA) und Kühlvorrichtung

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Was ist Gelelektrophorese?

Gelelektrophorese

kontinuierlich diskontinuierlich

1 Puffer 2 Puffer

Aufteilung in Sammel- und Trenngel

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Herstellung von Gelen zur Elektrophorese Gele aus Polyacrylamid oder Agarose Poymerisation von Acrylamid mit Bisacrylamid

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Herstellung von Gelen zur Elektrophorese Porengröße abhängig von

TotalacrylamidkonzentrationTotalacrylamidkonzentration T [%]=g Acrylamid +g Bis x100 / 100mL und Vernetzungsgrad („crosslinking“)Vernetzungsgrad („crosslinking“) C [%]=g Bis x100 / (g Acrylamid +g Bis) unter Luftabschluss polymerisieren Polymerisationseffekt abhängig von

Temperatur, pH-Wert, T-Wert etc. Nachpolymerisation, daher einen Tag

stehen lassen

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GelelektrophoreseVorteile: hohe Auflösung (ca. 1-

800 kDa) Porengröße variabel chemisch inert und

stabil durchsichtig, gut

anzufärben leicht aufzubewahren

Nachteile: Monomere des

Acrylamids neurotoxisch und cancerogen

Porengröße limitiert: nur bis 800 kDa

basische Gele werden hydrolysiert, nur bedingt haltbar

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SDS-PAGESodium(Natrium)dodecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektrophorese

anionisches Detergenz, überdeckt Eigenladung von Proteinen

durch Erhitzen mit SDS-Überschuss: Auflösen der Quartär- und Tertiärstruktur

reduzierende Thiolverbindung (β-Mercaptoethanol oder DDT) spaltet Schwefelbücken zwischen Cysteinen auf

→ einheitliche Stab- bzw. ellipsoide Form Verwendung von SDS-haltigem (0,1%),

diskontinuierlichen Tris-HCl / Tris-Glycin-Puffersystem

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Disk. SDS-PAGESodium(Natrium)dodecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektrophorese

einheitlich negativ Ladung, daher gleiche Wanderungsgeschwindigkeit

Clˉ als Leit-Ion, Glycin als Folge-Ion

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Disk. SDS-PAGESodium(Natrium)dodecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektrophorese

Auftrennung der Stapel im Trenngel nur nach Molekülgröße!

Anfärben mit Coomassie-Brilliant-Blau oder Silbernitrat

Kalibrierungskurve

Bestimmung der Molekülmasse durch Vergleich mit Standardprotein

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Disk. SDS-PAGESodium(Natrium)dodecylsulfat- Polyacrylamidgel-Elektrophorese

Vorteile: auch hydrophobe und

denaturierte Proteine können aufgetrennt werden

schnelle Trennung Wanderung in eine

Richtung Trennung nach 1

Parameter: Molekulargewicht

Nachteile: irreversibles

Denaturieren der Proteine

nicht kompatibel mit nicht-ionischen Detergenzien

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IEF – Isoelektrische Fokussierung Wanderung der Proteine durch Gel mit pH-Gradient bis

zum pI Stagnation am pI Konzentrierungseffekt wirkt Diffusion entgegen

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IEF – Isoelektrische Fokussierung

Herstellung von immobilisierten pH-Gradienten:

Immobiline (Acrylamidderivate) werden in Gelmatrix einpolymerisiert, binden kovalent an Polyacrylamidnetzwerk

R: Carboxygruppe oder tertiäre

Aminogruppe

schwache Säuren oder schwache Basen kontinuierliches Verändern des

Immobilinmischungsverhältnisses während des Gießens

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IEF – Isoelektrische Fokussierung

Vorteile von Agarosegel:

schnelle Trennung über 800 kDa ungiftig

Vorteile von Polyacrylamidgel:

kaum Hintergrund-färbung

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IEF – Isoelektrische Fokussierung Vorteile: Endpunktmethode sehr genaue

Trennung; erfasst Unterschiede in einer geladenen AS

mit SDS-PAGE kombinierbar

pI einfach zu ermitteln

Nachteile: zeitaufwendig aufwendiges

Anfärben Proteine können

aggregieren, wandern nicht in das Gel ein

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2D-Gelelektrophorese

zweidimensionale Gelelektrophorese in zwei Schritten

zuerst Auftrennung mittels IEF, anschließend SDS-PAGE

elektrisches Feld um 90° gedreht

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2D-Gelelektrophorese Vorteile: gute Auftrennung nach

zwei Parametern ( pI und Molekülmasse)

hohe Auflösung für alle Proteine

universell einsetzbar schnell durchzuführen

Nachteile: schwierige

Durchführung Proteinverlust von IEF

zu SDS-PAGE

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Das war's,

danke schön!