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Konzepte der Immunologiefür Naturwissenschaftler

(MOLIM-S1)

SS 2007

Humorale ImmunitätHumorale Immunität(Antikörper – Methoden & Anwendungen)

Prof. Hans-Martin JäckAbteilung für Molekulare Immunologiean der Medizinischen Klinik IIINikolaus-Fiebiger-ZentrumTel.: 09131-8535912E-Mail: HJAECK@molmed.uni-erlangen.de

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Prof. Dr. Hans-Martin JäckAbteilung für Molekulare Immunologie

an der Medizinischen Klinik III

Thema 2:

Antikörper - Anwendungen

SS 2005

HUMORALE IMMUNITÄT

• Ak/Ag-Reaktionen

• Gewinnung spezifischer AK

• Anwendungen – Diagnostik & Forschung

• Anwendungen – Therapie

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• Variable Region der H- und L-Kette definiert die Spezifität

• Konstante Region der H-Kette bestimmt die biochemischen und biologischen Eigen-schaften (Effektorfunktion)

VL

CL

VH

CH1

CH2

CH3

Antikörper sind bifunktionalAntikörper sind bifunktional

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Antikörper – Antigenreaktionen Antikörper – Antigenreaktionen

HV2 (CDR2)

Epitop – Bindungsstelle im Ag

Paratop – Bindungsstelle im AK

HV3 (CDR3)

HV1 (CDR1)

Aus Janeway: Immunobiology

Hypervariable (HV) Regionen (oder CDRs) der H- und L-Kette bilden das Paratop

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Wasserstoffbindungen Brückenbildung zwischen Sauerstoff- oder Stickstoffatomen von Antigen und Antikörper     (Ag-O - H - O-Ak oder  Ag-N - H - N-Ak)

Elektrostatische Kräfte entstehen, wenn sich positive und negative freie Ladungen auf Antigen und Antikörper gegenüber liegen

Van der Waals-Kräfte resultieren aus der Interaktion zwischen Elektronenwolken (Dipole)

Hydrophobe Wechselwirkungen basieren auf einer Verdrängung von Wasser- Molekülen durch apolare, hydrophobe Gruppen (aromatische Aminosäuren). Diese Bindungsart kann bis zu 50% der Bindungskräfte ausmachen.

WechselwirkungenWechselwirkungen

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kD = 10-5 Mol-1

Antigenbindungsstelledes Antikörpers

Epitop des Antigens B

Anziehungskräfte wirken nur über sehr kleine Distanzen

kD = 10-8 Mol-1

Antigenbindungsstelledes Antikörpers

Epitop des Antigens B

Nieder- und hochaffine AntikörperNieder- und hochaffine Antikörper

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Antigen (Antikörper generierend) Jede Substanz, die an einen Antigenrezeptor bindet. Antigenrezeptoren sind Immunglobuline und T-Zellrezeptoren

ImmunogenSubstanz, die nach Injektion oder Infektion eine Antikörperantwort auslöst

• Gut: Proteine und Kohlenhydrate• Schwach: DNA, Lipide, kurze Polypeptide• Negativ: Aminosäuren, Haptene

Hapten (Halbantigen)Kleines chemisch synthetisiertes Molekül, das an Rezeptor bindet, alleine aber keine Immunantwort auslöst. Immunogen nach Kopplung an Trägerprotein

Epitop bzw. immunogene DeterminanteDer Bereich eines Immunogens, der mit dem Antikörper interagiert (bei Proteinen: 6-8 Aminosäurereste)

Antigene – Definitionen und StrukturAntigene – Definitionen und Struktur

Aus: Kuby, Aus: Kuby, ImmunologyImmunology

B-Zell-EpitopeB-Zell-Epitope

Konformations-epitop

LinearesEpitop

Neo-Epitop

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B-Zell-Antigene - EinteilungB-Zell-Antigene - Einteilung

• Nach Herkunft Natürlich (Proteine, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren, bakt. Toxine, Zellen) Synthetisch (Haptene, Polypeptide)

• Nach chemischen Gesichtspunkten Proteine Kohlenhydrate Nukleinsäuren Konjugierte Proteine (Hapten-Protein) Polypeptide Lipide

• Nach genetischer Beziehung zwischen Spender und Empfänger Autoantigen - aus dem zu immunisierenden Individuum Isoantigen - aus einem genetisch identischen (syngenen) Spender

(Inzuchtmäuse) Alloantigen - aus einem nichtverwandeten Spender derselben Spezies (Bl6,

Balb/c) Xenoantigen - aus einem Spender einer anderen Spezies

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Vergleich von B-Zell- und T-ZellepitopenVergleich von B-Zell- und T-Zellepitopen

BZR TZR

Ag

MH

C II

MH

C I

Antigen-prozessierung

und -präsentation

Au

s Ja

ne

wa

y

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AFFINITÄT• Maß für die Stärke der Wechselwirkung

zwischen einer Ag-Bindungsstelle (Paratop) auf dem AK und einem Epitop auf dem Antigen

• Gute Affinität:

ka = 10-8 - 10-10 M-1

• Mittlere Affinität:

ka = 10-5 - 10-7 M-1

AVIDITÄT• Maß für die Stärke, mit der ein

bivalenter Antikörper an ein intaktes polyvalentes Antigen (z.B. Bakterien und Viren) bindet

• Größer als Affinität

Affinität und AviditätAffinität und Avidität

http://www-immuno.path.cam.ac.uk/~immuno/part1/lec06/lec6_97.html

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“Natürliche Antigene, wie beispielsweise Viren oder Bakterien besitzen viele gleiche Antigen- Determinanten auf ihrer Oberfläche. Wenn ein multivalentes Antigen sich mit mehr als einer Fab-Region des Antikörpers verbindet, ist die entstehende Bindungsenergie beträchtlich grösser als die Summe der beteiligten Einzelbindungen, da sämtliche Ag-Ak Bindungen gleichzeitig aufgebrochen werden müssen, wenn Ag und Ak sich wieder trennen sollen. Falls eine Fab-Stelle loslässt, ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine andere Fab-Region des Ak gerade gebunden ist, recht gross, was die Bindungsstärke mehr als nur verdoppelt. Die Kraft, die ein solcher multivalentes Ag mit einem multivalenten Ak bindet nennt man Avidität, sie ist, wie in der Abbildung dargestellt zwischen 103 und 107 mal stärker als die entsprechende Affinität. Unter physiologischen Bedingungen spielt die Avidität eine wichtigere Rolle, im Labor findet jedoch die Affinität häufiger Verwendung”. Quelle: leider verloren gegangen

Avidität (eine weitere Erklärung)Avidität (eine weitere Erklärung)

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Polyklonale Antiseren Heterogenes Gemisch von Antikörper, die ver-

schiedene Epitope auf dem Immunogen erkennen

Immunisieren von Tieren mit Antigen in komplettem Freunds Adjuvans [besteht aus Mineralöl (→ Depot-wirkung) und abgetöteten Tuberkelbazil-len→(unspezifische Aktivierung von DZ u. M)]

Immunisierungen werden mehrmals wiederholt (Boosts)

Monoklonale Antikörper homogener Antikörper, der nur ein Epitop auf dem

Immunogen erkennt Immunisierung von Maus, Ratte, Hamster, Kaninchen

oder (Mensch) Generierung von Hybridomen

Gewinnung spezifischer AntikörperGewinnung spezifischer Antikörper

Immunisierung von Labortieren mit AntigenenImmunisierung von Labortieren mit Antigenen

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Aus Kuby

Hypoxanthin

Hypoxanthin-Guanin-

Phospho-ribosyl-

transferase(HGPRT+)

Salvage Pathway

Thymidin

Thymidin-kinase (TK+)

De Novo

Nukleotide

DNA, RNA

Aminopterin blockiert De Novo Purin- und PyrimidinsyntheseMyelom

HGPRT +

Ig+

sterblich

Milz-B

HGPRT -

Ig-

unsterblich

Amin-opterin

PEG

Hybridomatechnik: Gewinnung monoklonaler AntikörperHybridomatechnik: Gewinnung monoklonaler Antikörper(Köhler und Milstein, 1976, Nobelpreis 1984)(Köhler und Milstein, 1976, Nobelpreis 1984)

HAT-Medium: Hypoxanthin, Aminopterin,

Thymidin

B-Zell/Myelom-Hybrid

Ig+

HGPRT +

unsterblich

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Durch Immunisieren z.B. eines Kaninchens mit gereinigtem Maus-IgM aus einer weißen Maus = BALB/c wird die Produktion folgender Kaninchen-Antikörper induziert.

Anti-isotypische AK(gegen Epitope in C-Regionen

der H- und L-Kette)

Antikörper gegen ImmunglobulineAntikörper gegen Immunglobuline

BALB/c

Gegen verschiedene AK-Klassen (iso)

C57Bl/6

Die konstante Region der H-Kette aus einer BALB/c-Maus (weiß) und einer C57Bl/6-Maus (schwarz) unterscheidet sich in einer Aminosäure verschiedene Allotypen codiert durch Varianten desselben Gens bzw. Allels)

BALB/c

Anti-allotypische AK(gegen ein bestimmtes Epitop

In C-Region)

Gegen verschiedene Formen eines bestimmten AK (allo)

Anti-idiotypische AK(gegen Epitope in V-Regionen

der H- und L-Kette)

Gegen eine bestimmte (private= idio) Form

eines AK

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Isolierung von VH und VL-DNA-Fragmenten aus B-Zellen mittels PCR

Klonierung der VH- und VL-Fragmente in Bakteriophagen-Vektoren

Transformation in E.coli

Isolierung spezifischer Antikörperphagen mittels Affinitätschromatographie oder ‚Panning‘ an immobilisiertem Antigen

B-Zellen aus immunisiertem

oder nicht-immuninisiertem

Tier

Phagenantikörper-Bücherei

Aus

Jan

eway

: Im

mun

obio

logy

AntikörperphagenAntikörperphagen

Klonierung in Phagenvektor

Isolierung durch Panning

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Natürlich vorkommender,

monospezifischer IgG-Antikörper

Rekombinante Manipulation

Antikörper und Antikörper (Ak)-FragmenteAntikörper und Antikörper (Ak)-Fragmente

C H1

V H

C L

V

L

CH3

CH2

F(ab’)2

Pepsin-verdau

Papain-verdau

Fab Fd(Fragment of

Domains)

DiabodyscFv(Single-chain Fragment

of Varibale regions)

Rekombinant in E.coli, Hefe und Insekten-

bzw. Säugetierzellen

BispezifischerIgG-Antikörper

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Muriner Ak

Humanisierter, chimärer Ak

Humaner Ak

Chimärer Ak

Sequenzen des Paratops (Hyper- varibale Region = CDR) im humanen Ak werden rekombinant durch entsprechende Sequenzen aus Maus-Ak ersetzt

Murine VH-Region

Humanisierte Maus-AntikörperHumanisierte Maus-Antikörper

Chimäre - feuerspeiendes Ungeheuer aus der griechischen Mythologie mit dem Kopf eines Löwen, dem Körper einer Ziege und dem Schwanz eines Drachen.

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Anwendungen von Antikörper in Anwendungen von Antikörper in Forschung und klinischer DiagnoseForschung und klinischer Diagnose

o Nachweis und Quantifizieren löslicher Moleküle

o Nachweis intrazellulärer und membrangebundener Proteine auf Einzelzellniveau

o Nachweis und Quantifizierung von Zellpopulationen innerhalb einer Zellsuspension

o Nachweis sezernierender Zellen

o Anreicherung und Isolierung definierter Zellpopulationen

o Proteinreinigung und Untersuchung von Proteinkomplexen

o Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen

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Nachweis und Quantifizierung löslicher MoleküleNachweis und Quantifizierung löslicher Moleküle

In Lösung: Heidelberger TitrationskurveIn Lösung: Heidelberger Titrationskurve

Menge der Ak-Ag-Komplexe

Antigen-Konzentration

Antikörper-Konzentration

Aus Janeway: Immunobiology

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Im Gel: Doppelimmundiffusion nach Ouchterlony Im Gel: Doppelimmundiffusion nach Ouchterlony

Antigen und Antiserum werden in Ver- tiefungen in der Agarmatrix pipettiert

Ag1 und Ag 3 haben keine gemeinsamen Epiotope, i.e., sie sind verschiedenen

Ag1 und Ag 2 besitzen identische Epiotope

Beispiel:

Antikörper Antigen

Agarmatrix Präzipitatslinie

Anfärben

Prinzip:

Aus Janeway: Immunobiology

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• Quantitativer Nachweis von Antigenen (z.B. Serum IgG)

• Antikörper wird in Agar eingegossen

• Antigen wird in Vertiefung gegebenDiffusion des Antigens

• Äquivalenzpunkt => Präzipitation

• Durchmesser des Präzipitationsrings ~ Konzentration

• Mitführen eines Ag-Standard

• Bestimmung der Ag-Konzentration aus Eichkurve

Radialer Immundiffusionstest (nach Mancini)Radialer Immundiffusionstest (nach Mancini)

Ak AgAk

Ag

Präzipitations-ring

Durch-messer

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OH N

H

H

H2O2

O N H

2 H2O

direkt „capture“indirekt

Enzym

Antigen

ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)

Qualitativer und quantitativer Nachweis löslicher Moleküle mit spez. AK

Nachweis und Quantifizierung löslicher MoleküleNachweis und Quantifizierung löslicher Moleküle

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Übliche Enzyme

Alkalische Phosphatase (AP)

Meerrettich-Peroxidase (Horseradish peroxidase = HRP)

NOHH

HNO

H

H2O2 2 H2O

Konjugiertes -Elektronensystem ➙ farbigfarblos

OP N+

O

O-

N+OO-

gelbfarblos

OH-

OHO

O-

O-

PO

O-

O-

OH++ H2O

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Schwangerschaftsnachweis durch AgglutinationsinhibitionSchwangerschaftsnachweis durch Agglutinationsinhibition

HCG • human chorionic gonadotropin

Humanes Chorion-Gonadotropin

• Schwangerschaftshormon

• Wird zuerst von Blastozyste, dann von Plazenta gebildet

• Kann bereits 6-15 Tage nach der Befruchtung im Urin nachgewiesen werden

• Verantwortlich für morgentliches Erbrechen

Aus Janeway

nicht schwanger

schwanger

Kein HCG Im Urin

HCG Im Urin

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Blutgruppennachweis durch HämagglutinationsreaktionBlutgruppennachweis durch Hämagglutinationsreaktion

Agglutination:

Verklumpung korpuskulärer Bestandteile durch Anti-körper

Aus Janeway

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Nachweis von Antigenen in und auf ZellenNachweis von Antigenen in und auf Zellen

Photoimmunfluoreszenz

Durchflusszytometrie

Analyse eines Antigens auf Einzelzellbasis

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PhotoimmunfluoreszenzPhotoimmunfluoreszenz

AK

Zelle

Fluoro-chrom

(FITC)

+ AK

+ irrelevanter AK

Aus

Jan

eway

: Im

mun

obi

olog

y

28

Durchflusszytometrische Analyse von Proteinen Durchflusszytometrische Analyse von Proteinen auf der Oberfäche von Zellenauf der Oberfäche von Zellen

Au

s Ja

new

ay, Im

mu

nob

iolo

gy

Zellgöße

Granularität

Rot

Grün

z.B.: Nachweis von CD8- und CD4-positiven T-Zellen in der Milz

FITC-anti-CD4 PE-anti-CD8

Zell-göße

Granularität

(Düse)

Photozellen

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FACS steht für Fluorescence activated cell sorting und beschreibt ein Verfahren, das in der Biologie und in der Medizin zur Anwendung kommt. Der Ausdruck "FACS" ist eine geschützte Handelsmarke der Firma Becton Dickinson. Der Name ist eigentlich irreführend, da meist keine Sortierung vorgenommen wird, sondern nur eine Messung der Eigenschaften von Zellen

Die allgemeine Bezeichnung des Verfahrens lautet Durchflusszytometrie.

Das Prinzip der Untersuchung beruht auf der Emission von optischen Signalen seitens der Zelle, wenn diese einen Laserstrahlpassiert.

Durchflusszytometrie und FACSDurchflusszytometrie und FACS

30

Durchflusszytometrische Analyse von Proteinen Durchflusszytometrische Analyse von Proteinen auf der Oberfäche von Zellenauf der Oberfäche von Zellen

Au

s Ja

new

ay, Im

mu

nob

iolo

gy

Zellgöße

Granularität

Rot

Grün

z.B.: Nachweis von CD8- und CD4-positiven T-Zellen in der Milz

Dot

plot

s

FI (FITC anti-CD8)

FI

(PE

an

ti-C

D4)

FITC-anti-CD8 PE-anti-CD4

Zel

lzah

l

His

togr

amm

Fluoreszenzintensität = FI ()

FL2-H

410

310

210

110

010

Cou

nt

200

150

100

50

0

FL1-H

410

310

210

110

010

Cou

nt

200

150

100

50

0

PE anti-CD4 FITC anti-CD8

31

Quantitativer Nachweis sezernierender ZellenQuantitativer Nachweis sezernierender Zellen

Jerne-Plaque-Assay

Durchflusszytometrie

Elispot-Assay

Bestimmung der Frequenz sezernierender Zellen

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Hemolytischer (Jerne) Plaque AssayHemolytischer (Jerne) Plaque Assay(N. Jerne, A. Nordin & C. Henry)(N. Jerne, A. Nordin & C. Henry)

Aus Kuby, 4th edition

SRBC:sheep red blood cellsPFC: plaque-forming units

Plasmazelle

Bestimmung der Frequenz AK-sezernierender Plasmazellen in einer Milzzellkultur

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Nachweis sezernierender Zellen mittels der Elispot-TechnikNachweis sezernierender Zellen mittels der Elispot-Technik

Bestimmung der Frequenz Zytokin-sezernierender Milzzellen vor und nach Stimulierung

Aus

Jan

eway

4th

edi

tion

+-

Animation unter: http://www.elispot-analyzers.de/english/elispot-animation.html

34

Durchflusszytometrischer Nachweis sezernierender ZellenDurchflusszytometrischer Nachweis sezernierender Zellen

Beispiel: Nachweis Zytokin-produzierender T-Zellpopulationen (Assay nach Milteny Biotech)

• Zellen werden mit IFN-γ Catch-Reagent beladen

• Zellen werden stimuliert IFN- wird sezerniert und von IFN--Catch abgefangen

• Gebundenes IFN- wird mit Fluorochrom-konjugierten (PE) anti- IFN- -Ak inkubiert

• Zellen können durchflusszytometrisch analysiert

• Alternativ können Zellen mit magne-tisierbaren anti-PE-Ak behandelt und IFN- sezernierende Zelle magnetisch ange-reichter werden

PE

(PE anti-IFNγ)

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Isolierung definierter ZellpopulationenIsolierung definierter Zellpopulationen

Sortierung von Zellen anhand von OberflächenproteinenSortierung von Zellen anhand von OberflächenproteinenM

agne

tisch

e M

etho

de

(MA

CS

)

Dur

chflu

sszy

tom

etrs

iche

Met

hode

(F

AC

S)

Aus Janeway: Immunobiology

36

Anreicherung sezernierter Zellen mittels der Anreicherung sezernierter Zellen mittels der FACS- oder MACS-TechnikFACS- oder MACS-Technik

Beispiel: Anreicherung Zytokin-produzierender T-Zellpopulationen (nach der FACS/MACS-Methode von Milteny Biotech)

• Zellen werden mit IFN-γ Catch-Reagent beladen

• Zellen werden stimuliert IFN- wird sezerniert und von IFN--Catch abgefangen

• Gebundenes IFN- wird mit Fluorochrom-konjugierten (PE) anti- IFN- -Ak inkubiert

• Zellen können durchflusszytometrisch analysiert

• und gleichzeitig durchflusszytometrisch sortiert werden

• Alternativ können Zellen mit magne-tisierbaren anti-PE-Ak behandelt und IFN- sezernierende Zelle magnetisch ange-reichter werden

Magnetisierbareanti-PE-AK

37

Proteinaufreinigung und Analyse von ProteinkomplexenProteinaufreinigung und Analyse von Proteinkomplexen

Aufreinigung von Proteinen mittels AffinitätschromatographieAufreinigung von Proteinen mittels Affinitätschromatographie

Aus Janeway: Immunobiology

38

Immunpräzipitation metabolisch radioaktiv-markierter PolypeptideImmunpräzipitation metabolisch radioaktiv-markierter PolypeptideM

etab

olis

che

Mar

kier

ung

IgM-produzierende Zellen

Anti-H-Ak

kD

200

97

66 45

31

St 1 2

1. Zellkultur-Überstand2. Zell-Lysat

Autoradio- oder Fluorogramm

Aus Janeway: Immunobiology

39

Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen mittels einer Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen mittels einer kombinierten Immunpräzipitations-/Westernblotanalysekombinierten Immunpräzipitations-/Westernblotanalyse

Versuch: Untersuchung des Einflusses einer IgL-Kette auf die Interaktion einer IgH-Kette mit dem Chaperon BiP

Membran

IP: anti-IgH

Zelllysate aus H+ und H+L+ Plasmalinie

Ele

ktr

op

hore

se

SDS-Polyacyl-amidgel

Elektro-transfer

anti-IgH(1)

anti-BiP(2)

Enzym-konjugierte Sekundär-antikörper

HL H

IgH

Zelllinie

BiP

40

o Immundefizienz

o Entzündung

o Autoimmunität

o Infektion

o Krebs

Anwendungen von AK in der TherapieAnwendungen von AK in der Therapie

41

Tumor- oder HIV-infizierte

Zelle

Tumorantigen oder Virales Hüllprotein

Modifizierte Antikörper als Virus- bzw- Modifizierte Antikörper als Virus- bzw- Tumortherapeutika Tumortherapeutika

kill

Killer-T-Zelle

killToxin/ Isotop

Immunotoxinoder

nativer AK

Immunotoxinoder

nativer AKTZR

Bispezifischer Antikörper

Bispezifischer Antikörper

Retuximab Anti-CD20 AK(B-Lymphome)

(http://www.prolife.de/aktuelles/38.html)

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Wirkmechanismen therapeutischer AntikörperWirkmechanismen therapeutischer Antikörper

5. Blockieren

1. Signalisieren

2. Antikörper-abhängigezellvermittelte Zyto-toxizität (ADCC)

3. Komplement-abhängigezell-vermittelte Zytotoxizität (CDC)

4. Transport zytotoxischer Substanzen

Promotionsvortrag 2007Dr. Michael SchwemmleinFAU Lehrstuhl für Genetik

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Katalytische Antikörper (Abzyme) Katalytische Antikörper (Abzyme) (Richard Lerner, San Diego, 1986; Peter Schultz, Berkely 1986)(Richard Lerner, San Diego, 1986; Peter Schultz, Berkely 1986)

ConventionalAntibody

Catalytic Antibody

Binds antigen butdoes not cleave

Is "used" up duringreaction

Binds antigen and cleaves it

Is regenerated after reaction

44L.C.Hsieh-Wilson, P.G.Schultz, and R.C.Stevens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:5363-5367 (1996).

Periodatoxidation von p-Nitro-Toluol-methyl-Sulfid zu Sulfoxid

Instabiler ÜbergangszustandHapten

(Stabiles Analog zum Übergangszustand)

Amino-phosphonsäure

45

Enzymatische Spaltung und Inaktivierung von Kokain (Landy and coworkers, New York 1993)

Cocaine Cleavage Products(inactive)(active)

NO

O O

OCH 3

H C3

HO

NO

OO

OCH 3H C3

HO

NO

OH

OOCH 3

H C3 HO

C

+

Unstable Transition State

NO

OO

OCH 3H C

3

HOP

Stable TransitionState Analog