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1. Zusammenfassung - fah-bonn.de und Hygiene/13843-qNMR-1.pdf · (Chromatographie, Karl-Fischer-Titration, Coulometrie) quantifiziert wurden. Die Standards zur Die Standards zur Herstellung

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1. Zusammenfassung

Bei der Bearbeitung des Projekts konnte erfolgreich der Nachweis erbracht werden, dass die

quantitative NMR (qNMR) als potenzielle primäre Untersuchungsmethode für die Evaluierung von

Phytopharmakas prinzipiell geeignet ist. An insgesamt 14 Proben von ausgesuchten, für die Analytik

pflanzlicher Arzneimittel relevanten Referenzmaterialien (Ginkgolid A, Cichoriensäure,

Chlorogensäure, Rutin Trihydrat, Pseudohypericin, Hypericin, Hyperforin, 1,8-Cineol, Ginsenosid RC,

α-Onocerin, Kawain) wurde die metrologische Qualität, und damit die Eignung für die

pharmazeutische Analytik, der quantitativen hochauflösenden 1H-NMR untersucht. Beispielhaft

wurden bei der Substanzauswahl auch Aspekte der problematischen Handhabung (licht- und

luftempfindlich, schlechtlöslich, instabil) abgedeckt. Bei allen Substanzen wurden die im Rahmen des

Projekts an die qNMR gestellten Forderungen (Varianzkoeffizient VK ≤ 2 % und Bestimmtheitsmaß r >

0,995) erfüllt. Durchgängig wurden VK < 1 % und r>0,999 erhalten. Dabei differierten die

Analysenwerte der qNMR generell um maximall 1 % zu den Referenzwerten, die mit validierten und

anerkannten Routinemethoden (Chromatographie, Karl-Fischer-Titration (KF), Coulometrie) ermittelt

wurden. Nur in wenigen Fällen (Chlorogensäure, α-Onocerin und Kawain) wurden größere

Abweichungen ermittelt, die i. a. aufgeklärt werden konnten. Es zeigte sich, dass die qualitative

Zuordnung der Signale im Spektrum (Spezifität und Selektivität) den eigentlich wichtigsten Teil der

quantitativen Analyse ausmacht. Je größer und komplexer das Molekül war, desto schwieriger wurde

diese Überprüfung. Erschwerend kam die Tatsache dazu, dass bei komplexen Verbindungen

Verunreinigungen mit sehr ähnlicher Struktur sich kaum bzw. nur in wenigen Stellen im Spektrenbild

unterschieden. Diese Problematik ist allerdings nicht NMR-spezifisch, sondern auf alle

spektroskopischen und chromatographischen Methoden übertragbar. Jedoch wo andere Methoden

versagen, weil der Analyten nicht selektiv quantifizieren werden kann, lieferte die qNMR in solchen

Fällen durch Korrektur mittels weiterer Signale im Spektrum akkurate Resultate. Ferner konnte bei

einigen Substanzen zusätzliche Verunreinigungen mit der qNMR aufgezeigt und teilweise sogar

identifiziert und quantifiziert werden, die mit chromatographischen Methoden nicht detektiert wurden.

Mittels eines organisierten und ausgewerteten nationalen Ringversuchs mit 22 Teilnehmern aus

Industrie, Forschung und universitären Einrichtungen wurde die Verallgemeinerung der laborinternen

Validierung exemplarisch an einer Substanz eindeutig belegt.

Insgesamt stellt die qNMR damit eine Bereicherung für die pharmazeutische Analytik dar. Erstmals

könnten dann aufgrund des potentiellen primären Charakters der qNMR die Ergebnisse von

Prüfungen von pflanzlichen Arzneimitteln auf das SI-System zurückgeführt werden. Die Rückführung

auf das SI-System ist international ein Nachweis von Qualität der Methoden und damit auch der

Ergebnisse von Prüfungen von pflanzlichen Arzneimitteln.

Die Bewertung des Projekts lautet daher:

„Das Ziel des Vorhabens wurde erreicht.“

1

2. Einleitung

Die Verwendung pflanzlicher Arzneimittel ("Phytopharmaka") hat in Deutschland eine lange Tradition.

Besonders international - in der Europäischen Union sowie in den USA - ist zurzeit ein wachsendes

Interesse an Phytopharmaka zu beobachten. Eine definierte und konstante Zusammensetzung ist

eine der wichtigsten Voraussetzungen für eine rationale Therapie mit Arzneimitteln. Die

pharmazeutische Qualität von pflanzlichen Arzneimitteln muss sich daher uneingeschränkt an den

Vorgaben orientieren, die für Präparate mit chemisch definierten Substanzen gelten, wenngleich die

Besonderheiten pflanzlicher Arzneimittel zu beachten sind. Um die Zusammensetzung des fertigen

Produkts hinsichtlich seiner Qualität (Reinheit und Gehalt) zu analysieren und kontrollieren, werden

pflanzliche Referenzstandards eingesetzt, die mit allgemein etablierten und anerkannten Verfahren

(Chromatographie, Karl-Fischer-Titration, Coulometrie) quantifiziert wurden. Die Standards zur

Herstellung von qualitativ hochwertigen Phytopharmaka wurden in den letzten 30 Jahren im

Wesentlichen im Bereich der deutschsprachigen Länder Europas entwickelt. Die wesentlichen

Vorgaben für die Qualitätsanalytik von Phytopharmaka wurden auf europäischer Ebene harmonisiert.

Innerhalb der „European Agency for the Evaluation of Medicinal Products (EMEA)” wurden dazu zwei

Leitlinien der “Quality Working Party (QWP)” vom “Committee for Proprietary Medicinal Products

(CPMP)” verabschiedet1. Als nationale Regularien regeln die Arzneimittelprüfrichtlinie und die

Bekanntmachung über die Zulassung von Arzneimitteln vom 31.10.96 die Qualitätsanalytik

pflanzlicher Arzneimittel.

Die Kernresonanzspektroskopie (NMR) ist eine der wichtigsten Methoden der Spektroskopie. Ihre

ausgezeichneten selektiven Eigenschaften in der Strukturanalytik haben sie in fast jedem chemisch

forschenden Labor unabkömmlich gemacht [1]. Darüber hinaus findet die hochauflösende 1H-NMR

immer mehr Anwendung in der quantitativen Analytik. Im Gegensatz zu chromatographischen

Bestimmungsverfahren besitzt die quantitative NMR-Spektroskopie (qNMR) das Potential einer

relativen primären Methode [2], wie sie vom CCQM definiert wurde [3]. Validierungen der qNMR [4, 5]

zeigen, dass die Methode den metrologischen Anforderung der pharmazeutischen Analytik genügen

kann. Es sollen daher in der vorliegenden Arbeit anhand ausgesuchter Referenzmaterialien das

Potential der qNMR für die pharmazeutische Analytik untersucht und die allgemeine Anwendbarkeit

mittels ausgearbeiteter Standardarbeitsanweisungen und eines Ringversuchs belegt werden. Darüber

hinaus soll ein vollständiges Unsicherheitsbudget erarbeitet werden, so wie es vom Leitfaden der ISO

(kurz GUM genannt) gefordert wird [6].

1 "Note for Guidance on Quality of Herbal Medicinal Products" (CPMP/QWP/2819/00) und "Note for Guidance on Specifications: Test Procedures and Acceptance criteria for Herbal Drug Preparations and Herbal Medicinal Products" (CPMP/QWP/2820/00)

2

3. Ziele und Schwerpunkte

Die vorliegende Arbeit wurde an der Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung (BAM) in der

Abteilung I „Analytische Chemie; Referenzmaterialien“ (Arbeitgruppe NMR-Spektroskopie)

durchgeführt. Das Thema dieser Arbeit entspricht dem Kompetenzbereich der Abteilung „Entwicklung,

Bereitstellung und Bewertung zuverlässiger Referenzmaterialien und -verfahren in der Analytischen

Chemie“ sowie dem Aufgabenbereich der BAM allgemein, als ein Nationales Metrologieinstitut

Deutschlands, die internationale Vergleichbarkeit der nationalen Rückführungssysteme für die SI-

Einheit in der Chemie (hier: das Mol) mit geeigneten Methoden oder Verfahren zu gewährleisten.

Das Projekt verfolgt das Ziel, die hochauflösende Flüssigkeits-NMR-Spektroskopie als eine Methode

zur Gehaltsbestimmung in der pharmazeutischen Analytik zu etablieren, und darauf aufbauend, sie als

Referenzverfahren zur Validierung anderer Methoden und zur Zertifizierung von Referenzstandards

einzusetzen. Dafür wird zur optimalen Bearbeitung eine Reihe ausgewählter, als Referenzsubstanzen

zu zertifizierende Naturstoffe untersucht, die sich an den aktuellen Aufgaben der pharmazeutischen

Industrie orientieren.

Die Schwerpunkte dieser Arbeit sind

• das Aufstellen des Unsicherheitsbudgets

• das Bereitstellen und Quantifizieren von internen Standards und

• die Bestimmung der Richtigkeit und Präzision (metrologische Qualität) NMR-

spektroskopischer quantitativer Analysen pharmazeutischer Produkte

Der Begriff metrologische Qualität beschreibt die geringste erreichbare Messunsicherheit, ein dem

Messergebnis zugeordneter Parameter, der die Streuung der Werte kennzeichnet, die

vernünftigerweise der Messgröße zugeordnet werden könnte (Definition aus dem internationalen

Wörterverzeichnis der Metrologie (VIM) [7]).

Zur Bearbeitung des ersten Schwerpunkts wird für die Anwendung der quantitativen hochauflösenden

Flüssigkeits-NMR zur Gehaltsbestimmung das vollständige Unsicherheitsbudget aufgestellt. Dieses

wird nach dem allgemeingültigen und weltweit anerkannten Leitfaden zur Ermittlung von

Messunsicherheiten erarbeitet, der von der „International Organization for Standards (ISO)“

veröffentlicht wurde. Dabei sind entsprechend der Messgleichung alle Unsicherheitsbeiträge der

Eingangsgrößen in der Messunsicherheit des Verfahrens zu berücksichtigen. Hiermit soll eine für die

Zertifizierung von pharmazeutischen Referenzmaterialen allgemeingültige Unsicherheitsbetrachtung

erarbeitet werden und deren Akzeptanz mit der nationalen Zulassungsbehörde (BfArM) sowie der

europäischen EMEA in Konsensusgesprächen abgesichert werden.

Für die Absicherung der Analysenergebnisse sind qualitätssichernde Maßnahmen erforderlich (letzten

beiden Schwerpunkte). Es wird damit begonnen, ein System von NMR Referenzmaterialien (interne

Standards) aufzubauen, die der Forderung nach metrologischer Rückführung genügen. Aufbauend

auf den Erkenntnissen der eigenen Diplomarbeit [8] und der eigenen Dissertation [9] werden

Arbeitsanweisungen erstellt und stufenweise verbessert. Zur Bearbeitung des letzten Schwerpunkts

3

sollen Substanzen analysiert werden, die in der Praxis der analytischen Qualitätskontrolle und für

Stabilitätsuntersuchungen in Deutschland Bedeutung haben. Die exemplarisch ausgewählten

Substanzen

Terpenlactone Ginkgolid A Cichoriensäure

Chlorogensäure Flavanoide Rutin Trihydrat

Hyericin Hyperforin Hyperforin-DCHA-Salz

Monoterpene 1,8-Cineol

Ginsenosid RC α-Onocerin

Phenole Kawain

sollen das für die Analytik pflanzlicher Arzneimittel relevante Naturstoffspektrum weitgehend abdecken

und auch Substanzen mit Strukturbesonderheiten beinhalten. Einige Substanzen sollen beispielhaft

problematisch in ihrer Handhabung sein (licht- und luftempfindlich, schlechtlöslich, instabil), um die

Grenzen der Methode zu evaluieren.

Alle ausgewählten Substanzen, von den Firmen HWI Analytik, Dr. Wilmar Schwabe und Bionorika zur

Verfügung gestellt, werden untersucht hinsichtlich:

• Verifizierung der chemischen Struktur

• Auswahl geeigneter Monitorsignale für die Integralauswertung

• Stabilitätsuntersuchung bei interner Standardisierung

• Präparation der Messlösungen (Präzisions-Wägungen)

• Spektroskopische Messung mit erforderlicher Breite an Wiederholungen

• Linearitätsuntersuchung

• Daten-Auswertung

• Erstellen eines Unsicherheitsbudgets.

Die Untersuchungen werden entsprechend den ICH-Richtlinien [10, 11] durchgeführt. Hierfür werden

exemplarisch an Rutin und Kawain zusätzlich zu der schon im Labor vorhanden Methodenvalidierung

weitere Validierungsschritte im Hinblick auf die Robustheit gegenüber Lösungsmittel und Qualität der

NMR-Röhrchen sowie die Vergleichspräzision zwischen unterschiedlichen Operatoren und

Zeitpunkten der Analyse und Auswertung ausgeführt.

Zur Absicherung zu im Rahmen des Projekts erarbeiteten Ergebnissen wird zum Abschluss des

Projekts ein nationaler Ringversuch (Teilnehmer: Industrie, Hochschulen, Forschungsinstitute) nach

den Grundsätzen der ISO/IEC Guide 43-1 organisiert und ausgewertet. Anhand des Ausgangs des

Ringversuches soll eine kompetente Aussage für die Güte der Gehaltsbestimmung pflanzlicher

Referenzsubstanzen mittels 1H-qNMR getroffen werden.

4

Im Verlauf dieser Arbeit werden alle auftretenden Probleme untersucht und zu deren Lösung

Arbeitsanweisungen für die praktische Laborarbeit erarbeitet. Die Ergebnisse werden in Form von

Publikationen, Vorträgen und Posterbeiträgen der Öffentlichkeit publik gemacht. Damit soll, dem

Multiplikator-Prinzip entsprechend, Prinzip und Prozedur der qNMR zur Gehaltsbestimmung von

Referenzsubstanzen in der pharmazeutischen Analytik unter Berücksichtung metrologischer

Rückführung an nationale und internationale NMR-Forschungsinstitutionen sowie klein- und

mittelständige Unternehmen weitergegeben werden.

Ein weiterer Schwerpunkt liegt in der Verallgemeinerung und der Betrachtung der wirtschaftlichen

Bedeutung der in der vorliegenden Arbeit erarbeiteten Verfahren für kleine und mittlere Unternehmen

(kmU), um sie als Referenzverfahren zu etablieren. Dazu werden die gewonnenen Ergebnisse kritisch

diskutiert und bewertet, um allgemeine Schlussfolgerungen zur Anwendbarkeit auch für komplexere

Einsatzgebiete (Pharmazie, Biochemie, etc.) zu ziehen.

5

4. Grundlagen

4.1. Pflanzliche Referenzsubstanzen

Pflanzen können in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren, Saatgut, Wuchsbedingungen und

Erntezeitpunkt unterschiedliche Inhaltsstoffmuster aufweisen. Dementsprechend können sich daraus

hergestellte Halbfertigwaren und Arzneimittel unterscheiden, obwohl sie aus demselben

Pflanzenmaterial hergestellt wurden. Es ist daher von elementarer Bedeutung, das gesamte

Herstellungsverfahren von der Aussaat bis zur Gewinnung der Halbfertigwaren zu standardisieren.

Dadurch wird so weit wie möglich sichergestellt, dass ein Phytopharmakon aus jeder Charge eine

gleichbleibende Extraktzusammensetzung und damit auch einen gleichbleibenden Wirkstoffgehalt

aufweist (Chargenkonformität). Die Überprüfung der gleich bleibenden Extraktzusammensetzung ist

schwierig, da es sich um komplexe Vielstoffgemische handelt.

Allgemein etabliert und anerkannt sind heute Verfahren, bei denen Inhaltsstoffe oder

Inhaltsstoffgruppen, so genannte Leitsubstanzen, verwendet werden, um einen Extrakt oder andere

Halbfertigprodukte sowie das fertige Produkt zu analysieren und hinsichtlich seiner Qualität zu

kontrollieren. Die bei der Bestimmung von Leitsubstanzen eingesetzten Mess- und Prüfverfahren

werden mit Hilfe von Referenzsubstanzen der Leitsubstanzen geeicht und validiert. Diese

Verbindungen werden synthetisiert oder mit aufwendigen mehrstufigen Trenn-Verfahren aus dem

Pflanzenmaterial isoliert. Hinsichtlich der Zertifizierung dieser Referenzmaterialen gelten basierend auf

den oben erwähnten Leitlinien national und auf europäischer Ebene die gleichen Anforderungen, wie

sie für Referenzsubstanzen für die Analytik chemisch definierter Wirkstoffe gelten. Diese Anforderung

sind wiederum in Leitlinien zusammengefasst; z.B.:

• ISO Guide 34 (2000) (rf. ISO G's 30, 31,35),

• WHO Technical Report 885 (1999) - Annex 3,

• (Directive 88/320/EEC GLP – Annex B),

bzw. ergeben sich aus den für den Arzneimittelbereich gültigen Leitlinien zur Validierung der

Prüfverfahren.

Solche Referenzsubstanzen werden u. a. für die Bestimmung von Identität, Reinheit und Gehalt von

Arzneidrogen, Extrakten, Drogenzubereitungen, Extraktzubereitungen sowie Fertigarzneimitteln im

Rahmen von Wareneingangsprüfungen, Standardisierungen, Normierungen, Freigabeunter-

suchungen, chargenspezifischen Kontrollen und Stabilitätstests verwendet. Sie sind daher von

zentraler Bedeutung für die Qualität pflanzlicher Arzneimittel.

Für die Zulassungsunterlagen muss für alle verwendeten Referenzsubstanzen ein umfangreiches

Dossier (Analysenzertifikat) eingereicht werden. Darin müssen Angaben zur Identität (NMR, MS, IR,

UV, u.a.), Reinheit (Wassergehalt, Restlösemittel, anorg. Verunreinigungen, org. Verunreinigungen)

sowie Gehalt gemacht werden. Die Gehaltsbestimmung wird in Anlehnung an die Vorgehensweise bei

Referenzsubstanzen für Prüfverfahren mit chemisch definierten Wirkstoffen mittels zwei – möglichst

voneinander unabhängigen – Methoden durchgeführt. Der Gehalt wird dabei basierend auf den

Ergebnissen der Reinheitsuntersuchungen und der Flächenanteile des Analyten in den verwendeten

6

chromatographischen Trennverfahren festgelegt. Dabei wird ignoriert, dass eine solche

Vorgehensweise nur dann ausreichend richtige Ergebnisse ergibt, wenn die Referenzsubstanz eine

Reinheit von > 99,5% aufweist. Bei weniger reinen Substanzen können die erhaltenen Gehalte nur

dann richtig sein, wenn die Responsefaktoren der Verunreinigungen und des Analyten identisch sind.

Das ist in den wenigsten Fällen erfüllt. Hat man beispielsweise einen 90% reine Referenzsubstanz mit

dem Responsefaktor 1 und 10% Verunreinigung mit dem Responsefaktor 2, erhält man als Ergebnis

einen (falschen) Gehalt von 81,8%, dagegen bei einer 99,7% reinen Referenzsubstanz dem

Responsefaktor 1 und 0,3% Verunreinigung mit dem Responsefaktor 2 erhält man als Ergebnis einen

Gehalt von 99,4, was im Rahmen der regulatorischen Vorgaben für die Arzneimittelprüfung

ausreichend richtig ist.

Dieses Verfahren ist also nur für ausreichend reine Referenzsubstanzen anwendbar.

Referenzsubstanzen natürlichen Ursprungs haben in der Regel einen komplexen Molekülaufbau,

weshalb sie synthetisch kaum zugänglich sind und daher aus den natürlichen Quellen isoliert werden

müssen. Diese Reinheit ist bei der Isolierung der Substanzen aus Pflanzen aber nur mit erheblichem

Aufwand erreichbar. Dazu kommt, dass im Rahmen der Isolierung eine Reinigung über

chromatographische Methoden erfolgt, wobei üblicherweise dieselben Methoden für die

darauffolgende Gehalts- und Reinheitsanalytik verwendet werden und damit Grundlage der

Zertifizierung sind. Die Gefahr ist daher groß, dass Verunreinigungen, die während der Reinigung

nicht abgetrennt werden konnten, auch bei der Reinheitsbestimmung übersehen werden. Solche

Verunreinigungen sind häufig biogenetisch verwandt mit dem Analyten und weisen sehr ähnliche

Strukturen auf, was die analytische Erfassung noch erschwert. Die Selektivität (oder Spezifität) der zur

Reinheitsbestimmung verwendeten Methode bekommt daher gerade bei Referenzsubstanzen, die aus

natürlichen Quellen isoliert und gereinigt wurden, eine zentrale Bedeutung. Referenzsubstanzen, die

aus natürlichen Quellen isoliert werden, können demzufolge heute nur in seltenen Fällen

leitlinienkonform zertifiziert werden.

Die beschriebenen chromatographischen Bestimmungsverfahren zur Gehaltsfestlegung im Rahmen

der Zertifizierung bezeichnet man sekundär, weil die ermittelten Werte immer auf einen

Referenzstandard bzw. Responsefaktoren, bezogen werden müssen. Unter Vermeidung aller

geschilderten Probleme gewährleisten "direkte" oder "relative" primäre Messmethoden, die eine

direkte Rückführung auf die SI-Einheit vermitteln [3], eine wesentlich höhere metrologischen Qualität

Diese finden jedoch zur Reinheitsbestimmung von pharmazeutischen Referenzsubstanzen bisher nur

in Ausnahmefällen Anwendung.

4.2. Quantitative NMR-Spektroskopie

Die quantitative NMR-Spektroskopie (qNMR) ist eine potentielle relative primäre Methode [2]. Ihr

Grundprinzip ist gut bekannt und in einer Reihe von Monographien beschrieben. [12 - 19]. Die

wichtigste Grundlage der quantitativen NMR-Spektroskopie ist die direkte Proportionalität von

Intensität eines Signals Ix im Spektrum und der zur Resonanzlinie beitragenden Kernanzahl Nx

7

xsx NkI ⋅= , (4.1)

wobei kS hier als Spektrometerkonstante bezeichnet wird. Die Herleitung dieser Beziehung beruht auf

der Beschreibung eines als Lorentzlinie dargestellten Signals S(ω) bei einer Frequenz ω im

Frequenzspektrum.

Für die in dieser Arbeit betrachtete 1H-Single-Pulse-NMR-Spektroskopie ist kS bei Einhaltung der

optimalen Aufnahmeparameter innerhalb eines Spektrums konstant. Beim Bezug zweier Signale in

einem Spektrum zueinander kürzt sich damit kS heraus.

4.2.1. Bestimmung von Absolutgrößen

Da die NMR-Spektroskopie eine Relativmethode ist, muss ein Standard bekannter Reinheit dazu

gewogen werden, um durch den Bezug auf diesen eine absolute Messgröße wie den Gehalt oder die

Konzentration berechnen zu können. Hierbei handelt es sich nach DKD-4 [20] um eine Ein-Punkt-

Kalibrierung. Um die metrologische Qualität des Ergebnisses des Analysenverfahrens zu bestätigen,

spielen hier zertifizierte Referenzmaterialien (ZRM) eine große Rolle [21]. Nur durch diese ist eine

Rückführung auf die SI-Einheiten und somit der Nachweis der Richtigkeit gegeben [22]. Anstelle eines

ZRMs kann auch ein auf ein ZRM zurückgeführter Standard eingesetzt werden.

4.2.1.1. Standards

In der Literatur findet sich eine Anzahl von Standards, die zu quantitativen NMR-Analysen eingesetzt

wurden. Damit eine Substanz sich als Standard für die quantitative NMR-Spektroskopie eignet, sollte

sie nach Wells und Cheung [23] folgende Eigenschaften haben: leichte Verfügbarkeit in reiner Form,

billig, stabil, löslich sowohl in organischen als auch wässrigen Lösungsmitteln, nicht-hygroskopisch,

chemisch inert, geringer Dampfdruck und möglichst wenig Resonanzlinien. Letzteres wird auch von

Griffiths und Irving [24] für einen idealen Standard gefordert. Larive [25] diskutierte den großen Vorteil

der quantitativen NMR gegenüber vielen anderen spektroskopischen Methoden, der darin besteht,

dass zur Quantifizierung kein Standard mit hohem Reinheitsgrad benötigt wird. Jeder primäre

analytische Standard könne eingesetzt werden, sofern seine Reinheit bekannt ist und seine

Verunreinigungen die Analyse nicht behindern. Als optimal für eine hohe Richtigkeit ist ein

Intensitätsverhältnis von ungefähr eins im Spektrum zwischen den auszuwertenden Signalen von

Analyt und Standard [18].

Bei der Verwendung von Standards unterscheidet man zwischen internen Standards, die der Lösung

direkt beigewogen werden, und externen Standards. Letzteres kann entweder mit einem zweiten

NMR-Röhrchen, nacheinander im selben NMR-Röhrchen oder aber mit einer im Mess-Röhrchen

befindlichen Kapillare gemeinsam erfolgen. Während interne Standards eine einfachere Handhabung

des Verfahrens und der Berechung aufweisen, wird beim zweiten Verfahren die Kontamination der

8

Analytlösung mit dem Standard vermieden. In dieser Arbeit wird wegen der einfacheren Handhabung

und daraus resultierend dem einfacheren Unsicherheitsbudget nur mit internen Standards verfahren.

Eine weitere Möglichkeit von Standards zeigten Akoka et al. [26] und Silvestre et al.[27] mit der

ERETIC-Methode (Electronic REference To access In vivo Concentrations). Hierbei wird als Standard

ein künstlich erzeugter pseudo-FID über eine zweite Senderspule elektronisch zum FID eingespeist.

Der Vorteil dieser Methode ist, dass das Signal an jede beliebige Stelle im Spektrum hingesetzt

werden kann. Nachteilig wirkt sich die schlechte Präzision aus. Über einen Zeitraum von einem Monat

betrug die Streuung der Kalibrierungen 3 %.

4.2.1.2. Gehaltsbestimmung

Generell existieren zwei Möglichkeiten der Gehaltsanalyse, die der direkten Analyse über die

Hauptkomponente und die der indirekten Analyse über die Verunreinigungen.

Bei der direkten NMR-Analyse wird die Hauptkomponente gegen einen internen Standard

ausgewertet. Der Vorteil dieser Methode ist, dass nur die eindeutige Zuordnung eines optimal

auszuwertenden Signals der Hauptkomponente notwendig ist. Die Kenntnis über die Zu-

sammensetzung bzw. die qualitative Zuordnung der Fremdsignale ist dabei allgemein nicht

erforderlich. Für die Bestimmung des relativen Gehalts der Hauptkomponente sind Analyt und

Standard einzuwiegen (mx, mStd) und die Intensität der Hauptkomponente Ix (ohne Verunreinigungen)

gegen die Intensität des Standards IStd auszuwerten. Aus dem Intensitätsverhältnis kann unter

Berücksichtigung der zur Resonanz der ausgewerteten Signale beitragenden Kernanzahl (Nx, NStd),

der Molmassen (Mx, MStd) und Einwaagen von Standard und Analyt sowie des relativen Gehalts des

Standards PStd der relative Gehalt des Analyten Px (in g/g %) wie folgt berechnet werden:

Stdx

Std

Std

x

x

Std

Std

xx P

mm

MM

NN

IIP ⋅⋅⋅⋅= . (4.2)

Im Gegensatz zur direkten Analyse sind bei der indirekten alle Verunreinigungen zu identifizieren,

deren Signale im Spektrum qualitativ zuzuordnen und quantitativ gegen einen Standard auszuwerten.

Die Berechnung des Gehalts des Analyten erfolgt dabei als Differenz zu 100%. Das Problem dabei ist,

dass nicht detektierbare Verunreinigungen (z.B. anorganische Salze für 1H- und 13C-NMR) bei der

Berechnung des relativen Gehalts nicht erfasst werden.

Für eine Analyse mit hoher Richtigkeit ist bei nicht genauer Kenntnis der enthaltenen Verun-

reinigungen die direkte Methode über die Hauptkomponente die bessere Wahl und wird deswegen in

dieser Arbeit verwendet. Nur wenn die qualitative Zusammensetzung der Substanz bekannt ist, führt

der zweite Weg ebenfalls zu einem richtigen Ergebnis.

9

4.2.1.3. Linearitätsmessungen

Zur Bestimmung der Linearität der Methode wird der experimentell bestimmte Analytengehalt dem

theoretischen Referenzwert gegenübergestellt. Der theoretische Gehalt berechnet sich aus den

gravimetrischen Einwaagen von Analyt mAnalyt und Lösungsmittel mLM sowie aus dem relativen Gehalt

des Analyten PAnalyt nach folgender Gleichung:

( ) %100)( Analyt

LMAnalyt

AnalyththeoretiscAnalyt Pmm

mm

m⋅

+= , (4.3)

der experimentell bestimmte nach:

%100)(exp Std

Analyt

Std

Std

Analyt

Analyt

Std

Std

AnalyterimentellAnalyt Pmm

MM

NN

II

mm

⋅⋅⋅⋅= . (4.4)

Hierfür ist bei der NMR-Spektroskopie die Analyse auf einen Standard mit bekanntem Reinheitsfaktor

zurückzuführen. Die Vorgehensweise entspricht dem der relativen Gehaltsbestimmung.

4.3. Unsicherheitsbudget

Die ISO/IEC 17025 [28] schreibt vor, Analysenergebnisse mit einer Messunsicherheit anzugeben.

Ferner wird durch die Definition einer primären Methode ein vollständiges Unsicherheitsbudget zur

Angabe der Messunsicherheit gefordert. Zugrunde gelegt werden dazu die Leitfäden von ISO [6], der

sogenannte GUM, und EURACHEM [29].

Die Messunsicherheit eines Verfahrens oder einer Methode setzt sich aus den

Standardunsicherheiten der Eingangsgrößen x1, x2, ..., xn zusammen, die in der kombinierten

Standardunsicherheit uc(y) einer Messgröße in Abhängigkeit von den Eingangsgrößen

y(x1,x2, ..., xn) erfasst und schließlich als erweiterte Messunsicherheit U mit dem betrachteten Grad

des Vertrauens p und dem Erweiterungsfaktor k angegeben werden.

Bei der Betrachtung der Standardunsicherheiten von Eingangsgrößen unterscheidet GUM nach

solchen, deren Werte statistisch ermittelt wurden (Typ A), und solchen, die nicht aus mehrmaligen

Beobachtungen gewonnen wurden (Typ B).

Für die Berechnung der Standardunsicherheit u(xi) nach Typ A gilt, dass sie gleich der Stan-

dardabweichung ( )ixs des aus n unabhängigen Werten gebildeten Schätzwertes ix (arithmetischer

Mittelwert) ist. Dabei kennzeichnet die Standardabweichung eines Schätzwertes die Streuung der

beobachteten Werte um den Schätzwert:

( ) ( )( )( )1

1

2,

−⋅

==∑=

nn

xxxsxu

n

kiki

ii.

(4.5)

Die Anzahl der Freiheitsgrade fi von u(xi) ist bei n Messungen gleich n-1.

10

Standardunsicherheiten vom Typ B können z.B. aus den Angaben der Hersteller, Daten von

Zertifikaten oder Kalibrierscheinen übernommen werden. Ist diese dabei als ein Vielfaches einer

Standardabweichung bzw. als erweiterte Messunsicherheit angeben, so errechnet sich die

Standardunsicherheit als Quotient aus dem angegebenen Wert und dem Multiplikationsfaktor.

Die kombinierte Standardunsicherheit uc(y) einer Messgröße y(x1,x2, ..., xn) berechnet sich für den Fall,

dass die unkorrelierten Eingangsgrößen nur als Produkte oder Quotienten in der Messgleichung

auftreten (z.B. ), als positive Quadratwurzel aus der Quadratsumme aller Un-

sicherheitsbeiträge u(x

nxxxy ⋅⋅⋅= K21

i) der n Eingangsgrößen [6]. Nach GUM erhält man damit folgende Gleichung:

( ) ( )∑=

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⋅=

n

i i

ic x

xuyyu

1

2

, (4.6)

wobei u(xi)/xi die relativen Unsicherheiten der Eingangsgrößen x1, x2, ..., xn beschreiben. Nach der

Empfehlung des GUM (genauer: nach der dort zitierten Empfehlung INC-1 (1980), Absatz 5 einer

internationalen Arbeitsgruppe zur Angabe von Unsicherheiten) ist die Messunsicherheit mit einem

Grad des Vertrauens p anzugeben, der den Bereich um das Messergebnis angibt, mit dem ein p-

entsprechender Anteil der Verteilung der Werte umfasst wird, die der gemessenen Größe

Sinnvollerweise zugeordnet werden können. Dieses zusätzliche Maß der Unsicherheit wird als

erweiterte Unsicherheit U bezeichnet. Durch Multiplikation der kombinierten Standardunsicherheit mit

einem Erweiterungsfaktor k erhält man die erweiterte Unsicherheit:

( )yukU c⋅= . (4.7)

Als Erweiterungsfaktoren werden Faktoren von k = 2 oder k = 3 allgemein verwendet, die als

Schätzwert ein Konfidenzniveau von p = 95 % bzw. p = 99 % angeben.

4.3.2. Unsicherheitsbudget für die quantitative NMR-Spektroskopie

Entsprechend der Messgleichung (4.2) sollen nun die einzelnen Unsicherheitsbeiträge der

Eingangsgrößen Intensitätsverhältnis (Integration), Anzahl der zur Resonanzlinie beitragenden Kerne

Ni, Molmasse Mi, Einwaage mi sowie relativer Gehalt PStd näher betrachtet werden:

4.3.2.1. Intensitätsverhältnis (Integration)

Generell kann aus einem NMR-Spektrum nur die Information über das Intensitätsverhältnis erhalten

werden, dessen Präzision nach Typ A durch Mehrfachmessungen zu ermitteln ist. Werden die

Messungen direkt nacheinander durchgeführt, so erhält man die Wiederholpräzision. Dagegen spricht

man von der Vergleichspräzision, wenn die Messungen z.B. zeitlich versetzt mit jeweiligen Shimmen

des Systems ausgeführt werden. Die Berechnung der Unsicherheit des Intensitätsverhältnisses erfolgt

nach Gleichung (4.5), in der nicht nur die Unsicherheit der Integration, sondern die des gesamten

11

Systems der Spektrenaufnahme (Shimmen, Aufnahme, Prozessierung, Spektrenkorrekturen und

Integration) berücksichtigt.

4.3.2.2. Anzahl der zur Resonanzlinie beitragenden Kerne N

Die Anzahl von Kernen, die zu einer Resonanzlinie beitragen, ist gemäß der Summenformel einer

Substanz eine Integergröße, sofern keine Reaktion stattfindet (z.B. Deuterierung von Protonen durch

Lösungsmittel in der 1H-NMR). Generell ist für quantitative Analyse mit der NMR-Spektroskopie die

Stabilität der auszuwertenden Signale Voraussetzung und mittels Stabilitätsuntersuchungen zu

belegen. Eine Unsicherheit ist daher nicht zu betrachten.

4.3.2.3. Molmasse

Die Standardunsicherheit der Molmasse u(Mi) wird nach Typ B ermittelt und setzt sich aus den

Unsicherheiten der Atommasse gemäß der Summenformel der betrachteten Komponente zusammen.

In der Zeitschrift „Pure and Applied Chemistry“ wird von der IUPAC regelmäßig eine Tabelle mit den

relativen Atommassen aller Elemente und deren Unsicherheiten veröffentlicht. Da sich die Molmasse

als Summe unabhängiger Eingangsgrößen berechnet, wird die Standardunsicherheit der Molmasse

nach GUM [29, Kapitel 8.2.6, Regel 1] wie folgt berechnet [30]:

( )∑=

∗=n

jji juNMu

1

2)()(.

(4.8)

Dabei gibt Nj die Anzahl der Atome des Elements j, u(j) die Standardunsicherheit der Atommasse

des Elements j und n die Anzahl der vorkommenden verschiedenen Elemente im Molekül wieder.

4.3.2.4. Einwaage

Die Standardunsicherheit einer Einwaage u(mi) wird vor allem durch die Unsicherheiten der

Wiederholbarkeit uW(mi) und die der Nichtlinearität uNichtlinearität(mi) ermittelt, die aus den

Herstellerangaben der Waage nach Typ B herangezogen werden können. Darin ist die Unsicherheit

der Ablesegenauigkeit enthalten.

Wird die Linearitätsabweichung als maximale Abweichung ∆m vom wahren Wert im Datenblatt

angegeben, so berechnet sich die Unsicherheit der Nichtlinearität in der Annahme einer

gleichmäßigen Verteilung (Rechteckverteilung) wie folgt:

( )3mmu ritätNichtlinea

∆=

. (4.9)

12

Der Vorgang einer Einwaage besteht aus zwei Wägvorgängen (Tara- und Bruttoeinwaage), wodurch

die Nichtlinearität zweimal zu berücksichtigen ist. Da diese beiden Ablesungen voneinander

unabhängig sind, geht die Standardunsicherheit der Nichtlinearität zweimal ein. Die kombinierte

Unsicherheit berechnet sich daher aufgrund unabhängiger Eingangsgrößen wie folgt:

( ) ( ) ( )2

222

322)( ⎟

⎞⎜⎝

⎛ ∆⋅+=⋅+=

mmumumumu WritätNichtlineaWi

. (4.10)

Die in dieser Arbeit ausgeführten Wägungen erfolgten mit einer Ablesegenauigkeit von

0,01 mg auf einer Mettler Toledo AX 105 Delta Range. In Tabelle 4.1 sind die Kenndaten, entnommen

aus den Herstellerblättern, sowie die daraus nach Typ B berechnete Unsicherheit aufgeführt.

Tabelle 4.1: Kenndaten aus den Herstellerangaben für die verwendeten Waagen. Ermittlung der

Einwaageunsicherheit nach Typ B.

Mettler Toledo AX 105 Delta Range

Ablesegenauigkeit 0,01 mg uW(m) Einwaage bis 60 g: 0,015 mg

∆m Innerhalb 10 g: 0,03 mg

u(m) (Gleichung (4.10)) 0,03 mg

4.3.2.5. Relativer Gehalt

Die Standardunsicherheit des relativen Gehalts eines Standards kann bei einem ZRM direkt aus dem

Zertifizierungsschein nach Typ B übernommen werden. Ist dabei ein Erweiterungsfaktor angegeben

worden, so ist die angegebene Unsicherheit durch diesen Faktor zu dividieren. Liegt bei Einsatz eines

anderen Standards keine Angabe über die Unsicherheit des relativen Gehalts vor, so ist der Gehalt

experimentell zu ermitteln und mit der Unsicherheit des eingesetzten Verfahrens zu belegen.

Zusammengefasst ergeben sich somit die nach Gleichung (4.6) aufgestellte kombinierte

Messunsicherheit für die Gehaltsanalyse zu

( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( ) 222222

//

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+⎟⎟

⎞⎜⎜⎝

⎛+⎟⎟

⎞⎜⎜⎝

⎛+⎟⎟

⎞⎜⎜⎝

⎛+⎟⎟

⎞⎜⎜⎝

⎛+⎟⎟

⎞⎜⎜⎝

⎛⋅=

Std

Std

Std

Std

Anl

Anl

Std

Std

Anl

Anl

StdAnl

StdAnlc P

Pummu

mmu

MMu

MMu

IIIIuyyu

(4.11)

13

5. Ergebnisse Im Forschungsantrag waren die folgenden drei Ziele des Projekts genannt worden:

1. Richtigkeit und Präzision NMR-spektroskopischer quantitativer Bestimmungen

pharmazeutischer Produkte

2. Unsicherheitsbudget

3. Grundlagen für über den Projektrahmen hinausweisende Arbeitsinhalte (Datenbank,

Beschaffungsstelle für ZRMs)

Die ersten beiden Punkte wurden vollständig bearbeitet und erfolgreich abgeschlossen. Ein Satz von

intern NMR-Standards wurde zusammengestellt und deren Gehalte auf ein ZRM (Benzoesäure, NIST)

zurückgeführt. 14 pharmazeutische Referenzsubstanzen wurden mittels quantitativer 1H-NMR

untersucht. Für jede Probe wurde die Methode einzeln hinsichtlich Richtigkeit und Präzision sowie

Spezifität und Selektivität evaluiert. In zwei Fällen (Kawain, Rutin) wurde die Methode zusätzlich auf

die Robustheit unterschiedlicher Lösungsmittel und Qualitäten der NMR-Röhrchen validiert sowie die

Vergleichspräzision hinsichtlich des Analysten und des Zeitpunktes der Aufnahme und Auswertung

bestimmt. Es wurden für jede Probe Arbeitsanweisungen zur Aufnahme, Prozessierung und

Auswertung von quantitativen NMR-Spektren erarbeitet, die eine Analyse mit höchster metrologischer

Qualität (Richtigkeit und Präzision) gewährleisten. Ferner wurde das vollständige Unsicherheitsbudget

aufgestellt, um die Verfahrensunsicherheit (erweiterte Messunsicherheit für ein 95 %-iges Konfidenz-

intervall (k = 2)) unter Berücksichtigung aller Eingangsparameter entsprechend der Messgleichung

(Integration, Molmassen, Einwaagen, Gehalt des internen Standards) zu ermitteln. Durch die

sorgfältige und systematische Bearbeitung der ersten beiden Punkte sind die Grundlagen für das

dritte im Projekt angestrebte Ziel geschaffen worden. Jedoch aus zeitlichen und organisatorischen

Gründen konnten weder die Datenbank zur Zertifizierung mit Beitrag der qNMR von

Referenzsubstanzen noch die Beschaffungsstelle für Referenzstandards für die qNMR aufgebaut

werden. Vor allem letzteres ist aus den Erkenntnissen, die an BAM vorliegen, ein langwieriger

Vorgang, der den Zeitrahmen des Projekts gesprengt hätte. Neben der Marktanalyse sind langwierige

Stabilitätstest sowie Belastungstest notwendig, Ferner muss die Quantifizierung mit mehreren

Methoden erfolgen oder mittels eines Ringversuchs mit Teilnehmern, die sich als zuverlässige

Laboratorien bereits an ähnlichen Ringversuchen ausgewiesen haben.

Alle Ergebnisse, verwendete Lösungsmittel und eingesetzte Standards sind probenspezifisch in

Tabelle 5.1 dargestellt.

14

Tabelle 5.1: Ergebnisse der Gehaltsbestimmung mittels qNMR.

qNMR Substanz Lieferant Lösungsmittel

(deuteriert) Interner Standard Gehalt in g/g % VK in g/g % U95 in g/g % r

Referenzwert in %

Kawain Schwabe Chloroform Benzoesäure 92,3 0,3 0,9 0,9998 98,5

Chlorogensäure Bionorika Chloroform TSP-Lösung 98,2 0,9 1,1 --. 99,03

Rutin Trihydrat Schwabe Dimethylformamid 2-Hydroxy-3,5-dinitro-benzoesäure 91,0 0,5 0,7 0,9998 90,8

Rutin Trihydrat HWI Dimethylformamid 2-Hydroxy-3,5-dinitro-benzoesäure 88,2 0,3 0,8 0,99990 88,34

Cichoriensäure HWI Deuteriumoxid Na-Acetat 92,4 0,2 0,8 0,999992 93,44

Ginkgolid A Schwabe Dimethylsulfoxid Dimethylterephthalat 99,1 0,1 0,9 0,99995 99,6

Ginkgolid A HWI Dimethylsulfoxid Dimethylterephthalat 95,1 0,3 0,9 0,99990 94,79

Ginsenosid RC HWI Dimethylformamid Sulfon 89,8 0,8 1,0 0,9994 90,65

α-Onocerin HWI Pyridin/Methylacetat Chloroform/Methanol

Sulfon Sulfon

89,588,9

0,3--

0,8--

0,9997--

96,56

1,8-Cineol HWI Dimethylsulfoxid Dimethylterephthalat 98,8 0,3 0,9 0,99991 98,5

Hypericin HWI Pyridin Sulfon-Lösung 91,0 0,9 1,0 -- 90,52

Hyperforin HWI Methanol-d4 TSP-Lösung 94,2 0,5 0,9 -- 95,19

Hyperforin-DCHA-Salz Schwabe Methanol-d4 TSP-Lösung 60,4 0,2 0,5 -- 61,2

Hyperforin-DCHA-Salz Schwabe Methanol-d4 TSP-Lösung 74,4 0,1 0,6 -- 74,2

15

Diese Resultate basieren auf der systematischen Bearbeitung der im Projektantrag aufgeführten Ziele

und Schwerpunkte. Ein Satz von speziell ausgesuchten internen NMR-Standards (Benzoesäure,

Maleinsäure, 3-Trimethylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionsäure-Natriumsalz (TSP), Natriumacetat,

Dimethylsulfon, Dimethylterephthalat, 1,3,5-Trioxan und 2-Hydroxy-3,5-dintrobenzoesäure), wurde

derart zusammengestellt, dass für den gesamten 1H-NMR Spektralbereich je nach Anforderung

(Signallage, Lösungsmittel) ein interner Standard zur Verfügung stand (Abb. 5.1). Diese internen

Standrads haben sich im Laufe des Projekt bewährt.

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1

TSP(0,0 ppm)

Benzoesäure(8,1; 7,6; 7,7 ppm)

Dimethylsulfon(3,1 ppm)

Natriumacetat(1,9 ppm)

2-Hydroxy-3,5-dinitro-benzoesäure

(8,9 ppm)

1,3,5-Trioxan(5,1 ppm)

Maleinsäure(6,4 ppm)

Dimethylterephthalat(8,1; 3,9 ppm)

Abbildung 5.1: Schematische Darstellung der Resonanzlinien der internen Standards im 1H-NMR-Spektrum.

Anfängliche Probleme hinsichtlich Langzeitstabilität und Homogenisierung des TSP, aufgrund der

hygroskopischen Eigenschaften als TSP-Lösung (TSP in D2O) verwendet, konnten eliminiert werden.

Durch Aufbewahrung der TSP-Standardlösung in Plastikgefäßen anstelle von Glasgeräten konnte die

Stabilität der Lösung kontinuierlich nachgewiesen werden. Der Wechsel des Lösungsmittelgemisches

von DMSO-d6/D2O zu Methanol-d4/D2O zur Referenzierung gegen das ZRM Benzoesäure löste das

Homogenisierungsproblem. Lediglich Na-Acetat sollte aufgrund der hygroskopischen Eigenschaft

entweder als Standardlösung in Form von Na-Acetat Trihydrat verwendet werden. Die relativen

Gehalte der internen Standards wurden mittels qNMR gegen das ZRM Benzoesäure bestimmt. Somit

ist die Rückführung der Analysenwerte auf die SI-Einheiten gewährleistet. Der potentielle primäre

Charakter der qNMR bleibt damit beim Einsatz dieser internen Standards für die Gehaltsbestimmung

erhalten.

Bei den Untersuchungen der Phytopharmakas zeige sich, dass der Übergang von Modelsystemen zu

pharmazeutischen Referenzsubstanzen immer wieder neue Anforderungen an die qNMR stellte. Trotz

der i. a. sehr gut aufgelösten 1H-Resonanzlinien (hohe Auflösung bzw. Selektivität) in den Spektren

traten folgende Probleme speziell bei komplizierten Molekülen auf:

(i) Überlagerungen von ein oder mehreren Resonanzlinien eines Analyten mit Signalen von

chemisch ähnlichen Verunreinigungen, die dann aufgrund nahezu identischer chemischer

Verschiebungen nicht im 1H-NMR-Spektrum getrennt erkennbar sind, mit der Folge, dass bei

Nichterkennen dieser Situation systematische Fehler resultieren.

(ii) Auswahl und Verfügbarkeit eines geeigneten internen Vergleichsstandards bei Vorliegen

komplexer NMR-Spektren eines Analyten, so dass keine störenden Überlagerungen der

17

Resonanzlinien des Analyten und seiner Verunreinigungen mit den Linien des gewählten

internen Standards auftreten.

(iii) Auswahl und Verfügbarkeit eines geeigneten internen Vergleichsstandards, der sich zudem im

selben Lösungsmittel wie der Analyt ohne Reaktion mit demselben lösen lässt.

(Die aufgetretenen Probleme, die teilweise die Grenzen der qNMR aufdeckten, sowie die dafür

entwickelten Lösungswege sind nachfolgend jeweils für die einzelnen Substanzen beschrieben.)

Daher wurde zur Evaluierung der Methode, aufbauend auf der laborinternen Validierung (Diplomarbeit

[8] und Dissertation [9]), eine Standardarbeitsanweisung für die Aufnahme, Prozessierung und

Auswertung erstellt und schrittweise verbessert. Spezifität und Selektivität wurden für jedes

Untersuchungsobjekt mittels 1H-NMR (teilweise auch zur Spektrenvereinfachung mit 13C-Entkopplung)

und 1H,13C-korrelierender 2D-NMR Techniken (HMQC, HMBC) sowie zur Ermittlung von Signalen von

Verunreinigungen mittels H,H-korrelierender 2D-NMR-Technik (COSY) ermittelt. Die quantitativen 1H-

NMR-Spektren wurden mit den in Tabelle 5.2 aufgelisteten Parameter-Einstellung aufgenommen und

prozessiert.

Tabelle 5.2: Standardparameter zur Aufnahme quantitativer 1H-SP-NMR-Spektren.

Parameter Bruker-Nomenklatur Wert

90°-Impuls-Stärke Pl1 5 dB

90°-Impuls-Länge P1 9 µs

Spin Rotation Keine

Messtemperatur TE 298 K

Anregungsfrequenz o1 Mitte des Spektrums

Anregungswinkel 30°

Aufnahmeverzögerung DE 5 µs

Aufnahmezeit AQ 5,4 s

Relaxationsintervall D1 30 s

Spektralweite SW 16 ppm

Filterweite FW 90000 Hz

Anzahl der Datenpunkte des FIDs TD 64 k

Anzahl der Scans ns 128

Signal-zu-Rausch-Verhältnis S/N ≥150

Line broadening lb 0,3 Hz

Anzahl der Spektrenpunkte SI 64 k

Nach der Fourier-Transformation mit vorheriger exponentieller Multiplikation des FIDs sind Phasen

und Grundlinie im Spektrum sorgfältig manuell korrigiert worden. Die Integrationsgrenzen wurden in

Abhängigkeit von den Halbwertsbreiten der auszuwertenden Signale mit einem konstanten

Integrationsfaktor multipliziert gesetzt. Nachträgliche Korrekturen der Integralzüge wurden nicht

ausgeführt. Die Berechnung des relativen Gehalts des Referenzmaterials erfolgt nach Gleichung (4.2),

18

die des theoretischen Absolutgehalts für die Linearitätsüberprüfung nach Gleichung (4.3), des

experimentellen Gehalts nach Gleichung (4.4). Das Bestimmtheitsmaß wurde unter Microsoft Excel

ermittelt (Punkt (0,0) für die Berechnung der Regressionsgerade vorgegeben)

Zur Absicherung der Akzeptanz der qNMR-Resultate bei der nationalen Zulassungsbehörde (BfArM)

und der europäischen EMEA wurden die Untersuchungen entsprechend den ICH-Richtlinien [10, 11]

durchgeführt: Bestimmung des Gehalts und der Präzision anhand von sechs unabhängigen Analysen

(sechs Einwaagen) und Überprüfung der Linearität anhand von fünf Messpunkten in relativen

Gehalten von 70 %, 85 %, 100 %, 115 % und 130 %, bezogen auf den Sollgehalt der Analysenlösung.

Zusätzlich wurden exemplarisch am Kawain und Rutin weiter Robustheitsuntersuchungen hinsichtlich

Lösungsmittel, Qualität der NMR-Röhrchen (Schott Economics, Schott Scientific), Analyst und Zeit-

punkt der Analyse und Auswertung durchgeführt und in Validierungsprotokollen (s. Anhang)

festgehalten. Diese Protokolle, die die Robustheit der qNMR für die Gehaltsbestimmung

pharmazeutischer Referenzsubstanzen belegten, wurden bei der BfArM eingereicht.

Für die Bestimmung der metrologischen Qualität (Richtigkeit und Präzision) wurde nach den

Richtlinien der ISO (GUM [6]) das komplette Unsicherheitsbudget für die Gehaltsbestimmung mit der

qNMR-Spektroskopie aufgestellt. Generell wurde für alle untersuchten Substanzen eine erweiterte

Messunsicherheit (k = 2) von ≤ 1g/g % bestimmt.

5.1. Kawain

Das 1H-Spektrum, und speziell das 13C-entkoppelte-1H-NMR-Spektrum zeigten zusätzlich eine

Vielzahl an intensiven Fremdsignalen über den gesamten Frequenzbereich. Im Vergleich zur

Hauptkomponente betrugen deren integrale Intensitäten deutlich mehr als ein Prozent, teilweise bis

10 % (Abb. 5.2).

8 7 6 5 4 3 ppm

OO

OMe

3

α

2‘5

6‘

5‘

4‘

3‘

β

6

2‘-6‘

β α

3

65

OCH3

CHCl3

Abbildung 5.2: 1H-NMR Spektrum von Kawain. Rechts vergrößerte Darstellung zur Wiedergabe der signifikanten Verunreinigungen. Eine Aussage über die Selektivität der Protonensignale des Kawains zur quantitativen Auswertung

konnte aufgrund der vielen Fremdsignale nicht aus dem 1D 1H-Spektrum gegeben werden. Es musste

daher ein 2D-COSY-Spektrum derart aufgenommen werden, dass die Korrelationssignale von

Fremdsignalen mit einer Intensität von 0,1 % relativ zu den Resonanzlinien des Kawains erkennbar

waren. Korrelationssignale von frei im Spektrum vorliegende Fremdsignale mit Resonanzlinien, die

19

ähnliche chemische Verschiebung wie die der Hauptkomponente aufwiesen, wiesen auf partielle

Überlappungen ggf. sogar vollständige Überlagerungen von Fremdsignalen und Kawainsignalen hin.

Von den insgesamt sechs Protonensignalen des Kawains war nur das Signal bei 6,26 ppm zur

quantitativen Auswertung geeignet. Die Auswertung erfolgte mittels elektronischer Integration gegen

das Protonensignal der Benzoesäure bei 8,13 ppm. Der so bestimmte Gehalt von 92,3 g/g % weicht

jedoch signifikant vom Referenzwert (94,8 g/g % mittels HPLC) ab. Laut Information von der Firma

Schwabe ist dies auf das Alter der Probe zurückzuführen.

Zudem war dem 2D-Spektrum zu entnehmen, dass die Fremdsignale bei 1,96 ppm, 2,15 ppm,

2,32 ppm, 2,53 ppm, 2,81 ppm, 2,90 ppm, 4,38 ppm und 7,24 ppm zu einer Substanz gehören, da sie

direkt miteinander koppeln.

Der Vergleich unterschiedlicher Integrationsbereiche (Setzen der Integrationsbereiche entsprechend

64x bzw. 16x der Halbwertsbreite ν1/2 der auszuwertenden Signale) zeigte keine signifikanten

Unterschiede. Ebenso führten zusätzliche Untersuchungen zur Robustheit der Methode hinsichtlich

Analyst, Qualität der NMR-Röhrchen (Schott Economics gegen Schott Scientific) und Lösungsmittel

(Chloroform-d1 gegen Dimethylformamid-d7) zu keinen signifikanten Abweichungen bezüglich

Richtigkeit und Präzision. Die verwendete qNMR-Methode ist ausreichend robust.

Der Einsatz von CDCl3 als Lösungsmittel (wie vorgegeben) führte zur Reaktion mit der Methoxy-

Gruppe (Fremdsignale im Spektrum). Dies ist auf die Bildung von HCl aus dem im geringen Maße

vorhandenen Wasser im Lösungsmittel zurückzuführen. Das für die quantitative Analyse ausgewertete

Protonensignal vom Kawain wurde dadurch jedoch nicht beeinflusst. Bei Verwendung von DMSO-d6

als Lösungsmittel blieb die Methoxy-Gruppe stabil (Abb. 5.3).

4,0 3,8 3,6 ppm

CDCl3 DMSO-d6

4,0 3,8 3,6 ppm

Abbildung 5.3: Einfluss des Lösungsmittels auf die Methoxy-Gruppe des Kavains.

5.2. Chlorogensäure

Die im 1H-NMR und 13C-entkoppelten-1H-NMR detektierten Fremdsignale im gesamten Frequenz-

bereich wiesen auf geringe Verunreinigungen hin (Intensitäten < 1% relativ zur Hauptkomponente).

20

Abbildung 5.4: 1H-NMR-Spektrum der Chlorogensäure.

Als optimal (selektiv) für die quantitative Analyse erwies sich das Protonsignal der Chlorogensäure bei

4,17 ppm. Die Auswertung dieses Signal gegen das Signal des internen Standards bei 0,00 ppm

führte zu Gehaltswerten für die drei Messungen „12h nach Ansetzung“ von 97,6 g/g % (Nr. 5),

99,0 g/g % (Nr. 6) und 97,0 g/g % (Nr. 7). Die Stabilitätsmessungen drei Tage später lieferten generell

geringere Analysenwerte: 93,2 g/g % (Nr. 5), 95,9 g/g % (Nr. 6) und 96,4 g/g % (Nr. 7). Die

abweichenden Ergebnisse der zweiten Messreihe sind auf eine Zersetzung bzw. Reaktion der

Chlorogensäure als auch des internen Standards TSP zurückzuführen. Wie in der Abb. 5.5 dargestellt,

nahmen die Signale bei 5,78 ppm und 6,75 ppm mit der Zeit an Intensität zu. Beim TSP entstanden

zudem zusätzliche Signale bei 0,05 ppm, 0,09 ppm und 0,11 ppm.

wies sich das Protonsignal der Chlorogensäure bei

4,17 ppm. Die Auswertung dieses Signal gegen das Signal des internen Standards bei 0,00 ppm

führte zu Gehaltswerten für die drei Messungen „12h nach Ansetzung“ von 97,6 g/g % (Nr. 5),

99,0 g/g % (Nr. 6) und 97,0 g/g % (Nr. 7). Die Stabilitätsmessungen drei Tage später lieferten generell

geringere Analysenwerte: 93,2 g/g % (Nr. 5), 95,9 g/g % (Nr. 6) und 96,4 g/g % (Nr. 7). Die

abweichenden Ergebnisse der zweiten Messreihe sind auf eine Zersetzung bzw. Reaktion der

Chlorogensäure als auch des internen Standards TSP zurückzuführen. Wie in der Abb. 5.5 dargestellt,

nahmen die Signale bei 5,78 ppm und 6,75 ppm mit der Zeit an Intensität zu. Beim TSP entstanden

zudem zusätzliche Signale bei 0,05 ppm, 0,09 ppm und 0,11 ppm.

0,4 0,2 0,0 -0,2 -0,4 ppm6,8 6,6 6,4 6,2 6,0 5,8 ppm

8 7 6 5 4 3 2

OH

OH

O

O

OHOH

OH

COOH

2‘

5‘6‘

β

α

2

64

β2‘

3

5 4 2,6MeOH

H2O

6‘

5‘

Abbildung 5.5: Stabilitätsmessungen an der Chlorogensäure. Schwarzes Spektrum zeigt Ausschnittsweise das

Spektrum der Messung nach 12h, das rote das nach drei Tagen.

Der Vergleichswert der Gehaltsbestimmung mit der HPLC-100%-Methode und der KF-Titration liegt

bei (99,03 ± 0,28) %. Die Instabilität der Substanz ist laut Aussage von der Fa. Bionorika auf die

Lichtempfindlichkeit der Substanz zurückzuführen. Diese Information war jedoch zum Zeitpunkt der

Analyse dem NMR-Labor nicht bekannt.

5.3. Rutin Trihydrat (Fa. Schwabe)

Obwohl das 1H-Spektrum des Rutins (Abb. 5.6) nur wenige Fremdsignale aufwies, vor allem im

aromatischen Bereich, und die Signallagen und Signalpattern dem Rutin zugeordnet werden konnten,

zeigte sich die spezifische Überprüfung als schwierig.

21

8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

6'''

1'''

1''

68

5'

6'

LM

LMLM2'

Abbildung 5.6: 1H-NMR-Spektrum des Rutin Trihydrats in DMF-d7 (Fa. Schwabe).

Aufgrund der Größe des Moleküls war es weder aus dem 1D-1H- noch aus dem 2D-H,H-NMR-

Spektrum erkennbar, das mind. eine Verunreinigung mit fast identischen chemischen Verschiebungen

der aliphatischen Protonensignale (Zuckerbaugruppe) vorlag, die lediglich Unterschiede in der

Substitution der Aromaten aufweist. Erst das intramolekulare Intensitätsverhältnis von 0,999 : 1,006

eines aliphatischen Protonensignals (5,47 ppm; H-1’’) mit einem aromatischen Protonensignal

(6,48 ppm; H-8 inklusive Verunreinigungssignal bei 6,50 ppm) sowie der signifikant zu hohe

Analysengehalt von Rutin-Trihydrat von 100,8 g/g % (Verunreinigungen vorhanden) bei Auswertung

des Signals bei 5,47 ppm waren eindeutige Indizien, dass nur die aromatischen Signale spezifisch

dem Rutin zugeordnet werden konnten. Ursache hierfür ist die Größe des Moleküls, aufgrund der

unterschiedliche Substituenten am Aromatensystem (Fremdsignale im Aromatenbereich) sich nicht

signifikant auf die chemische Verschiebung der Protonen im Zuckerbauteil des Rutins auswirken.

Demzufolge führt die Auswertung der aliphatischen Signale zu falschen Ergebnissen. Hingegen

müssen generell bei der Integration der aromatischen Protonensignale die Verunreinigungen (Imp.)

mitintegriert werden, diese Signale können also nicht selektive erfasst werden. Jedoch führt folgender

Lösungsweg zu richtigen und präzisen Analysenergebnissen: In einem ersten Schritt wird das Signal

bei 6,48 inklusive der Verunreinigung (Imp.) bei 6,50 ppm mit einem Integral erfasst und gegen das

Standardsignal integriert. Anschließend wird die Basislinie der Verunreinigung korrigiert und diese

dann gegen das Standardsignal integriert. Folgende Abbildung stellt diesen „Vierer-Schritt“

exemplarisch dar: Zudem ist zu überprüfen, ob der 13C-Satellit des Rutinsignals bei 6,26 ppm im

Integrationsbereich liegt. Wenn ja, so ist dieser ebenfalls vom Gesamtintegral abzuziehen (wenn

Integralwert vom Rutinsignal auf 1 gesetzt wurde, so ist davon 0,0055 abzuziehen).

22

1. Schritt: 2. Schritt: 3. Schritt:

Abbildung 5.7: Lösungsweg zur Auswertung von Analytensignalen mit signifikanten Verunreinigungssignalen im Integrationsbereich (Imp. = Verunreinigung).

Zusätzliche Untersuchungen zur Robustheit der Methode hinsichtlich Operator und Qualität der NMR-

Röhrchen (Schott Economics gegen Schott Scientific)) führten zu keinen signifikanten Abweichungen

bezüglich Richtigkeit und Präzision. Die verwendete qNMR-Methode ist ausreichend robust.

Mittels LC-NMR-Kopplung konnte eine Verunreinigung getrennt und identifiziert werden (in Position 3’

sitzt anstelle eines OH-Substituenten ein Proton).

5.4. Rutin Trihydrat (Fa. HWI)

Das 1H-NMR-Spektrum entsprach im Wesentlichen dem des Rutins von der Firma Schwabe, weist

jedoch mehr und intensivere Fremdsignale auf (Abb. 5.8).

Abbildung 5.8: Vergleich der beiden Rutin-Proben. Schwarz: Rutin (Fa. Schwabe), Rot: Rutin (Fa. HWI). Rutin der Fa. HWI weist deutlich mehr und z.T. intensivere Fremdsignale auf.

Die Analyse erfolgte in ähnlicher Weise wie bei der Charge der Fa. Schwabe (Kap. 5.3). Aufgrund der

bei dieser Probe vorliegenden Verunreinigungssignale erwies sich das Protonsignal bei 5,47 ppm

(H-1’’) als optimal zur Auswertung. Abweichend vom in Abb. 5.7 dargestellten Lösungsweg mussten

Signal + Imp. integrieren

Grundlinie derImp.korrígiere

Imp. integrieren

4. Schritt: Differenz

bilden

6,48 ppm Irutin= 1,000 - 0,017 - 0,0055 (13C-Sat) = 0,9775

6.50 6.45 ppm 6.50 6.45 ppm 6.50 6.45 ppm

4,1 4,0 3,9 ppm 1,25 1,00 0,755,8 5,6 ppm8,00 7,75 ppm

23

auf beiden Seiten des Analytensignals liegenden Verunreinigungssignale quantifiziert werden. Eine 13C-Satelliten-Korrektur war hier nicht notwendig.

5.5. Cichoriensäure

Das 1H-NMR-Spektrum zeigt intensive Fremdsignale sowohl im aromatischen als auch im

aliphatischen Bereich.

Abbildung 5.9: 1H-NMR-Spektrum von Cichoriensäure in D2O.

In Übereinstimmung mit dem Analysenzertifikat des Herstellers konnten Methanol und Ethanol als

Verunreinigungen identifiziert werden. Zusätzlich konnte aus dem NMR-Spektren das Fragment einer

weiteren Verunreinigung (R-CH2-CH3) nachgewiesen werden.

3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0

N a tr iu m a ce ta tM e th a n o l

E th a n o lR -C H 2-C H 3

Abbildung 5.10: Verunreinigungen im aliphatischen Bereich des 1H-NMR-Spektrum Cichoriensäure in D2O mit Na-Acetat als internen Standard.

Aufgrund der lichtempfindlichen Eigenschaften der Substanz wurden die Probenpräparation und die

Analyse selber in braunen Gefäßen durchgeführt. Für die Quantifizierung eigneten sich lediglich die

Signale der Protonen H-3’, H-3’’ und H-2’ und H-2’’. Die Gehaltsbestimmung (Gehalt von 70,2 g/g %)

erfolgte mittels Integration des Protonensignals vom Analyten bei 6,45 ppm (H-2’ und H-2’’) gegen das

Protonensignal des internen Standards (Na-Acetat) bei 1,95 ppm. Zusätzlich konnten aus denselben

Spektren der relative Gehalt von Methanol und Ethanol als Verunreinigungen zu 1,5 g/g % bzw.

24

0,08 g/g % quantifiziert werden. Alle drei Analysenwerte differierten signifikant von den Angaben im

Analysenzertifikat (Gehalt von 81,2 % sowie als Verunreinigungen 0,6 % Methanol und 0,02 %

Ethanol). Eine mögliche Ursache ist der hohe Wasseranteil in der Substanz, der die

chromatographische Analyse erschwert. Eine getrocknete, mit geringerem Wasseranteil behaftete

Probe derselben Charge wurde daher direkt bei der Firma HWI präpariert (eine Einwaage, Na-Acetat

als internen Standard, D2O als Lösungsmittel) Es zeigte sich jedoch, dass die Verwendung von Na-

Acetat in diesem Fall als internen Standard aufgrund seiner hygroskopischen Eigenschaften weniger

geeignet ist. Die Lagerung über einen längeren Zeitraum nicht über Trockenmittel (auf dem Postwege)

führte durch Aufnahme von Wasser zu einem geringeren Gehalt des internen Standards, und damit zu

einem zu hohen Analysengehalt von 118 g/g %. Die nachträgliche Referenzierung des Gehalt des

nicht über Trockenmittel gelagerten Na-Acetats mittels ZRM Benzoesäure führte schließlich zu einem

Analysenwert für Cichoriensäure von (92,4 ± 0,8) g/g %, der in guter Übereinstimmung mit dem

Referenzwert (93,4 %) steht. Daher scheint für den Einsatz als interner Standard die Herstellung einer

Standardlösung (Na-Acetat in D2O, wie im Falle des TSP) oder die Verwendung von Na-Acetat

Trihydrat, welches keine hygroskopischen Eigenschaften aufweist, geeigneter zu sein.

5.6. 1,8-Cineol

Das 1H-NMR-Spektrum zeigte nur wenige Fremdsignale. Ein unter dem Monitorsignal des Cineols bei

1,45 ppm liegende Resonanzlinie einer Verunreinigung konnten mittels COSY-Spektrum identifiziert

werden.

Abbildung 5.11: 1H-NMR von 1,8-Cineol in DMSO-d6.

Für die quantitative Auswertung erwies sich das Cineol-Signal bei 1,12 ppm als optimal. Da der

aromatische Bereich des Spektrums frei von Signalen war, wurde Dimethylterephthalat als interner

Standard verwendet. Die Durchführung der Probenpräparation (Einwaage) erwies sich aufgrund der

hohen Flüchtigkeit der Substanz als schwierig; die Analyse ergab aber akkurate und präzise Werte.

25

5.7. Ginkgolid A (Fa. Schwabe)

Das 1H-NMR-Spektrum zeigt eine Vielzahl an Verunreinigungssignalen mit Intensitäten in Höhe der 13C-Satelliten der Hauptkomponente.

8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

O

O

O

O

O

OH

O

O

OHCH3

CH3

CH3

CH3

H

Abbildung 5.12: 1H-NMR-Spektrum von Ginkgolid A in DMSO-d6.

Anhand eines Vergleichsspektrums, von der Firma Schwabe zur Verfügung gestellt, und eines 2D-

COSY-Experiments konnte Ginkgolid B als Verunreinigung identifiziert werden. Diese Verunreinigung

war im Analysenzertifikat nicht aufgeführt, wurde also mit den anerkannten Routineverfahren

(Chromatographie) nicht detektiert.

8 7 6 5 4 3 2 1 p p m

Ginkgolid B

Abbildung 5.13: Vergleich des Spektrums der Analysenprobe Ginkolid A mit dem vom Hersteller zur Verfügung

gestellten Spektrum von Ginkgolid B.

Ginkgolid C als weitere mögliche Verunreinigung konnte im Spektrum nicht nachgewiesen werden.

Für die quantitative Auswertung wurde angesichts der optimalen Lage im Spektrum das Signal bei

6,01 ppm ausgewertet. Da im Integrationsbereich ein Signal der Verunreinigung Ginkgolid B vorlag,

musste die integrale Signalfläche um den Integrationswert des Ginkgolid B Signals bei 7,4 ppm

korrigiert werden. Die Gehaltsbestimmung erfolgte gegen das Standardsignal (Dimethylterephthalat)

bei 8,07 ppm. Zusätzlich konnte aus den gleichen Spektren der Gehalt der Verunreinigung Ginkgolid

B anhand des Signals bei 7,4 ppm (Integration gegen Protonensignal des internen Standards) zu

0,4 g/g % quantifiziert werden.

26

5.8. Ginkgolid A (Fa. HWI)

Das 1H-NMR-Spektrum war dem der Probe von der Firma Schwabe ähnlich, wies jedoch andere

Fremdsignale auf. Ginkgolid B war als Verunreinigung nicht enthalten; dafür aber Aceton (intensives

Fremdsignal bei 2,1 ppm, Abb. 5.14).

2.5 2.0 ppm

Aceton

Abbildung 5.14: Verunreinigung im Ginkgolid A (Fa. HWI).

Die Gehaltsbestimmung konnte – im Gegensatz zur Probe der Fa. Schwabe – aufgrund der

Abwesenheit von Ginkgolid B direkt aus dem Verhältnis der Intensitäten der Signale bei 6,01 ppm

(Ginkgolid A) und bei 8,07 ppm (Dimethylterephthalat) ermittelt werden.

5.9. Ginsenosid RC

Die Analyse dieser Substanz erwies sich insgesamt als problematisch, konnte aber trotzdem

durchgeführt werden. So führte das Lösen des Analyten in D2O, wie vom Hersteller vorgeschlagen, zu

einem nicht quantifizierbarem 1H-NMR-Spektrum mit breiten Linien. Demgegenüber lieferte das Lösen

des Analyten in Pyridin-d5 ein hervorragend aufgelöstes 1H-Spektrum, wie ein erstes

Übersichtsspektrum mit geringer Analytenkonzentration belegte (Abb. 5.15).

Abbildung 5.15: 1H-NMR-Spektren von Ginsenosid RC, gelöst in D2O bzw. in Pyridin.

9 8 7 6 5 4 3 2 1 p p m

D2O:

9 8 7 6 5 4 3 2 1 p p m

Pyridin:

27

Signifikante Verunreinigungssignale waren weder im 1H-NMR-Spektrum noch im 2D COSY-Spektrum

erkennbar. Aufgrund des linienreichen Spektrums erwies sich jedoch die Wahl eines geeigneten

internen Standards als problematisch: dieser sollte mit keinem der Monitorsignale des Analyten und

des Lösungsmittels überlagern, sich in Pyridin lösen und nicht acide in Lösung sein (Reaktion mit OH-

Gruppen). Von der Auswahl an zur Verfügung stehenden internen Standards erfüllte nur Sulfon

(Signal bei 3,07 ppm) alle Bedingungen. Während aus dem Übersichtspektrum mit einer geringen

Analytenkonzentration sich die beiden Signale bei 5,5 ppm und 5,1 ppm für die quantitative

Auswertung als ideal erwiesen, zeigte sich in den Spektren der anschließenden Analysenlösungen

(vielfach höhere Analytenkonzentration) genau in diesem Bereich (5,33 ppm) das intensive und breite

Wassersignal (Abb. 5.16). Dieses führte dazu, dass das Analytensignal bei 5,5 ppm nun nicht mehr

auswertbar war, und das Signal bei 5,1 ppm nur unter erschwerten Bedingungen. Zur akkuraten

Auswertung dieses Signals musste die Flanke des Wassersignals mittels sorgfältiger, manueller

Grundlinienkorrektur derart korrigiert werden, dass eine gerade Grundlinie für die Integration vorlag.

Diese Vorgehensweise führte im Vergleich zu den anderen Proben zu einem höheren

Varianzkoeffizienten von VK = 0,8.

Abbildung 5.16: 1H-NMR-Spektrum mit im Gegensatz zur Abb. 5.15 höheren Analytenkonzentration.

5.10. α-Onocerin

α-Onecerin erwies sich aufgrund der schlechten Löslichkeit für die NMR-Spektroskopie als eine

schwer zu bearbeitende Substanz. Lösungsmittel, die in der chromatographischen Analyse für

Onocerin routinemäßig eingesetzt werden, konnten nicht verwendet werden, da der Analyt in der für

die NMR-Analyse benötigten Konzentration (geringere Empfindlichkeit der NMR) nicht vollständig

löslich war. Die Proben wurden daher mit einem Lösungsmittelgemisch aus Pyridin-d5/Methylacetat-d6

gelöst und unter Probenrotation und Erwärmung der Lösung auf eine Messtemperatur von 313 K

vollständige Lösung und Homogenisierung erreicht. Das 1D-1H NMR-Spektrum wies zum Teil sehr

intensive Fremdsignale über den gesamten Spektrenbereich auf. Einige Fremdsignale konnten den

folgenden Verunreinigungen zugeordnet werden: Chlorform, Diethylether, Ethylacetat, Toluol.

28

Abbildung 5.17: 1H-NMR-Spektrum des α-Onocerins in Pyridin-d5.

CH3 CH3

CH3CH2

CH2CH3

CH3 CH3

OH

OH

9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

Chloroform Ethylacetat Diethylether

Die quantitative Auswertung erfolgte mittels des Analytensignals bei 2,46 ppm gegen das Signal des

internen Standards Sulfon bei 3,08 ppm. Der relative Gehalt des α-Onocerins wurde zu 89,5 g/g %

bestimmt, weicht jedoch signifikant vom Referenzwert (96,56 %, HPLC und Coulometrie) ab. Die

hervorragende Linearität der qNMR-Methode spricht dafür, dass keine Löslichkeitsprobleme mehr

vorlagen. Auch eine zweite NMR-Analyse (Probenrotation, 313 K) in einem anderen

Lösungsmittelgemisch (Chloroform-d1/Methanol-d4 (3:1)) lieferte ein zum ersten NMR-Ergebnis

ähnliches Resultat von 88,9 g/g % relativen Gehalts. Eine Erklärung für diese signifikante Abweichung

konnte im Rahmen des Projekts nicht gefunden werden. Es ist jedoch möglich, dass ein Chromophor

bei der Chromatographie (HPLC) nicht detektiert wurde.

5.11. Hypericin

Da Hypericin licht- und luftempfindlich ist, konnte die bisherige Prozedur der Probenpräparation nicht

verwendet werden. Daher wurden bei der Firma HWI zwei Proben mit unterschiedlichen

Einwaagemengen (5,20 mg und 9,90 mg) in brauen NMR-Röhrchen unter Schutzgas vorgelegt. Um

die Kontamination mit der Luft so gering wie möglich zu halten, wurde eine Sulfon-Standardlösung

(Sulfon in Pyridin-d5, Konzentration: 0,12 g ml-1) gravimetrisch hergestellt und volumetrisch zum

Analyten dazugeben. Anschließend wurde mit Pyridin-d5 auf 4 ml Gesamtvolumen aufgefüllt. Aufgrund

der schlechten Löslichkeit erfolgten die NMR-Messungen zur vollständigen Lösung und

Homogenisierung bei 313 K und unter Probenrotation. Die Signale in den 1H-NMR-Spektren beider

Proben zeigten nur wenige zusätzliche Fremdsignale mit geringer Intensität, die jedoch so lagen, dass

keine Resonanzlinie des Analyten selektiv ausgewertet werden konnte. Mit dem im Kapitel 5.3

beschriebenen Verfahren war jedoch die Quantifizierung des Hypericins anhand des Analytensignals

bei 2,6 ppm (Abb. 5.19) möglich (Korrektur des auf der Flanke sitzenden Protonensignals einer

Verunreinigung)

29

9 8 7 6 5 4 3 ppm

Abbildung 5.18: 1H-NMR von Hypericin mit Sulfon in Pyridin.

3 ppm Abbildung 5.19: Ausschnitt der zu quantifizierenden Signale von Hypericin (+ Verunreinigung) und Sulfon.

5.12. Hyperforin und Hyperforin-DCHA-Salz:

Hyperforin und Hyperforin-DCHA-Salz enthalten als bekannte Verunreinigung Adhyperforin, das sich

strukturell nur in der Position 12 vom Hyperforin unterscheidet (Ethyl anstelle Methyl). Dies hat zur

Folge, dass im 1H-NMR-Spektrum nur die Protonen H-11 und H-12 von Hyperforin und Adhyperforin

unterschiedliche Verschiebungen aufweisen (überprüft mittels COSY-Experiments).

Abbildung 5.20: H-NMR von Hyperforin-DCHA-Salz. 1

30

Eine selektive Auswertung dieser Protonen war jedoch nicht möglich, da aufgrund der Vielzahl an

esonanzlinien des Hyperforins die Protonensignale H-12 mit H-13 sowie H-11 mit H-31 sich jeweils

e

.13. Nationaler Ringversuch

sollte der Nachweis der allgemeinen Anwendbarkeit der

qNMR in der pharmazeutischen Analytik erbracht werden. Insgesamt nahmen 22 Laboratorien

eichungen und die berechneten

Bestimmtheitsmaße sind in Anhang tabellarisch aufgelistet.

ie Ergebnisse:

R

partiell überlagerten. Lediglich die CH3-Protonen der Ethylgruppe am C-12 des Adhyperforins waren

selektiv auswertbar. Der einzige Weg, der zu richtigen Resultaten führte, war zuerst anhand des

Signals bei 0,8 ppm den Gehalt an Adhyperforin zu quantifizieren (Integration gegen Signal bei 0,00

ppm des internen Standards (TSP-Lösung)). Anschließend mussten die Intensitäten der

ausgewerteten Signale bei 0,9 ppm, 1,1 ppm, 2,4 ppm und 3,1 ppm um den entsprechend

gewichteten Anteil (Protonenanzahl zur jeweiligen Resonanzlinie) an Adhyperforin korrigiert werden.

Dabei musste berücksichtigt werden, dass unter dem Signal bei 2,4 ppm nur die Protonen H-31 des

Adhyperforins lagen, nicht aber die H-11 Protonen. Ebenso enthielt das Signal bei 1,1 ppm nur die

Adhyperforin-Protonen H-13, nicht aber die H-12. Erschwerend kam hinzu, dass unter allen

auszuwertenden Signalen die 13C-Satelliten der Nachbarsignale lagen, deren Intensitäten ebenfalls

korrigiert werden mussten. Jedoch führte diese komplizierte Auswertung zu Resultaten, die in guter

Übereinstimmung mit den Refer nzwerten aus den Analysenzertifikaten.

5

Anhand eines nationalen Ringversuchs

(Universitäten, Forschungseinrichtungen und Industrien) am Ringversuch NMR-4 teil.

Untersuchungsgegenstand war Rutin-Trihydrat der Firma Schwabe. Den Teilnehmern wurde eine

Standardarbeitsanweisung zur Gehaltsbestimmung mitgegeben sowie die im Kapitel 5.3 dargestellte

Anleitung zur Auswertung des Analytensignal. Von den 22 Teilnehmern sendeten drei Laboratorien

mehrere Messreihen (verschiedene Analysten bzw. Spektrometer) zu, so dass 25 Werte zur

Auswertung zur Verfügung standen. Ferner führten 10 Teilnehmer die Analyse derart durch, dass vom

Veranstalter Linearitätsberechnungen durchgeführt werden konnten

Die dem Veranstalter zugesandten Mittelwerte, deren Standardabw

D

Teilnehmerdaten sind in Abb. 5.21 mit Angabe der SD, in Abb. 5.22 mit Angabe der

erweiterten Messunsicherheit (k = 2) dargestellt.

Die zugesandten

31

858687888990919293949596979899

100

20 6 16 5 3 19 1 8 14 9 2 22 15 10 24 18 23 11 25 4 13 12 17 21 7

Tei l nehmer

Abbildung 5.21: Darstellung der NMR-4 Ergebnisse. Unsicherheitsbalken geben die Standardabweichung (SD)

wieder.

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

97

98

99

100

20 6 16 5 3 19 1 8 14 9 2 22 15 10 24 18 23 11 25 4 13 12 17 21 7

Teilnehmer

Rel

. Geh

alt i

n g/

g %

Abbildung 5.22: Darstellung der NMR-4 Ergebnisse. Unsicherheitsbalken geben die erweiterte Messunsicherheit

U95 (k = 2) wieder.

Insgesamt 15 der 25 abgegebenen Resultate weisen absolute Abweichungen zum Referenzwert von

weniger als 1 g/g % auf. Sie liegen damit innerhalb des im AiF-Projekt vorgegebenen

Akzeptanzbereiches. Weitere 5 Teilnehmer-Ergebnisse befinden sich innerhalb eines Bereiches von

±2 g/g % absoluter Abweichung zum Referenzwert. Aufgrund der komplexen Auswertungsweise sind

auch diese Werte akzeptabel. Größere Differenzen der Resultate zum Referenzwert, wie sie die

Mittelwerte von 5 Teilnehmern aufweisen (bis zu 6 g/g %), sind dagegen signifikant.

Bei den Laboratorien 4, 20 und 24 ist der Einfluss der Verwendung einer für diese Einwaagemengen

nicht geeigneten Waage (Einwaage auf 0,1 mg) auf die Messunsicherheit U95 sichtbar (Vergleich SD

und U95 in Abbildung 5.21 und 5.22).

Labor 17 hat die notwendigen Korrekturen der Signalintensität von Rutin aufgrund der partiellen

Überlagerung mit einem Verunreinigungssignal und einem 13C-Satellit nicht durchgeführt. Die

nachträgliche Überprüfung durch den Veranstalter ergab, dass das Ergebnis weniger als 1% vom

Referenzwert abweichen würde, hätte Labor 17 diese Korrekturen ausgeführt.

32

Labor 12 hat bei der Auswertung nicht den unter dem Analytensignal vorhandenen 13C-Satellit

berücksichtigt. Das Ergebnis liegt damit 0,55 % zu hoch. Bei korrekter Ausführung der

Arbeitsanweisung würde auch das Ergebnis dieses Teilnehmers innerhalb von ±1 g/g % absoluter

Abweichung liegen.

Die großen Unsicherheitsbalken der Ergebnisse der beiden Labore 2 und 21 in Abbildung 1 (SD > 2,5

%) lassen sich nicht mit der Messunsicherheit der NMR-Spektroskopie (i. A. SD ≤ 1 %) erklären. Es

scheinen hier voraussichtlich Probleme mit der Probenpräparation vorzuliegen.

Die vom Veranstalter berechneten Bestimmtheitsmaße r der Linearitätsbetrachtung, erhalten aus den

Daten von 10 Teilnehmern, erfüllen generell das an das Verfahren gestellte Kriterium:

r > 0,995.

Schlussfolgerung:

Die Auswertung des vierten Ringversuches NMR-4 zeigt, dass die qNMR geeignet ist, Gehaltsanaly-

sen für die pharmazeutische Analytik mit einer ausreichend geringen Messunsicherheit der Methode

durchzuführen. Von einem Großteil der Teilnehmer wurde der relative Gehalt von Rutin Trihydrat

(berechnet als Rutin wasserfrei) in der Regel mit Abweichungen zum Referenzwert von

< 99% wiedergegeben. Die Messunsicherheit der Messdaten liegt im Allgemeinen bei ≤ 1,6 %.

Als Fehlerquellen, die zu größeren Abweichungen führten, scheinen die Nicht-Einhaltung der

Messvorschrift sowie die Problematik der Probenpräparation – speziell der Einwaage und

Homogenisierung - vorzuliegen.

33

6. Wirtschaftlichen Bedeutung für kleine und mittlere Unternehmen

Wie die Ergebnisse der eigenen Untersuchungen als auch die Auswertung des Ringversuches

zeigten, kann das Verfahren zur Gehaltsbestimmung mittels qNMR, einer potentiellen primären

Methode als Referenzverfahren in der pharmazeutischen Analytik eingesetzt werden. Damit können

andere Methoden, die ggf. kostengünstiger arbeiten, kalibriert werden, wodurch das ganze System

der Reinheitsbestimmung und Zertifizierung pharmazeutischer Produkte einen innovativen

Aufschwung erhält. Somit ergibt sich ein direkter Nutzen der meist mittelständischen Hersteller und

Inverkehrbringer pflanzlicher Arzneimittel sowie der externen Prüflaboratorien, die analytische

Dienstleistungen in diesem Bereich anbieten, in Deutschland. Sie erhalten die Möglichkeit, ihre

Produkte guidelinekonform hinsichtlich der pharmazeutischen Qualität überprüfen zu können, Durch

die entfallende Notwendigkeit einer Reinigung der Referenzsubstanzen bis zu einer Reinheit von

>99,5% werden Kosten und Ressourcen gespart. Nicht unerheblich ist auch die Einsparung von

Lösungsmitteln, was unter Umweltaspekten zu berücksichtigen ist. Zudem gibt’s es den in

Deutschland ansässigen externen Prüfeinrichtungen die Möglichkeit, die Ergebnisse des Projektes die

Möglichkeit als zusätzliches Know-how in der Phytoanalytik zu nutzen und damit

Alleinstellungskriterien zu generieren.

Erstmals könnten dann die Ergebnisse von Prüfungen von pflanzlichen Arzneimitteln auf das SI-

System zurückgeführt werden, was international ein Nachweis von Qualität der Methoden ist. Vor dem

Hintergrund eines weltweit wachsenden Bedarfs an pharmazeutischen Prüfmethoden, die den

Besonderheiten pflanzlicher Arzneimittel gerecht werden, ein wichtiger Wettbewerbsvorteil für

deutsche Unternehmen.

Ein Nutzen der Forschungsergebnisse ist auf den Gebieten pharmazeutische Chemie sowie

Metrologie in der Analytischen Chemie zu erwarten. Die Weiterentwicklung des Verfahrens für den im

Antrag niedergelegten Zweck hätte auch Auswirkungen auf eine breitere Anwendung der Methode in

angrenzenden Industriebereichen. Direkte Synergie bestehen zu Anwendungsmöglichkeiten in der

Kosmetik, Lebensmittelindustrie, Bedarfsgegenstände-herstellende Industrie und chemischen

Industrie im weitesten Sinne.

34

7. Veröffentlichung der Projektergebnisse Folgende Veröffentlichungen in Form von Publikationen, Postern und Vorträgen sind bereits erfolgt:

Publikationen:

• Malz, F. und Jancke, H.: „Validation of quantitative NMR“, J. Pharm. Biomed., 2005, 813-823.

• Jancke, H, Malz, F. und Hässelbarth, W.: “Structure analytical methods for quantitative

reference applications”, Accred. Qual. Assur 10, 2005, 421-429.

• Malz, F. und Jancke, H.: “Purity assessment problem in quantitative NMR – overlapping

impurity resonance with monitor signal multipletts due to stereoisomers”, Analytical and

Bioanalytical Chemistry, accepted.

Poster:

• Malz, F. und Jancke, H.: Purity assessments of phytopharmaceuticals by qNMR, ENC,

Providence, RI, USA 10.-15.04.2005

• Malz, F. und Jancke, H.: Purity assessments of phytopharmaceuticals by qNMR, Tag der

Chemie, Berlin (FU), 8.6.2005

• Malz, F. und Jancke, H.: Validation of quantitative NMR for purity assessments of

pharmaceutical reference substances, GDCh-Fachgruppen-Jahrestagung “Magnetische

Resonanzspektroskopie, Mainz, 26.-29.9.2005

Vorträge:

• Malz, F. und Jancke, H.: „Quantitative NMR – die Lösung all unserer Probleme?“. FAH-

Informationsveranstaltung „Referenzsubstanzen für Wirkstoffe, Fertigarzneimittel,

Verunreinigungen, Konservierungsmittel und Leitsubstanzen – Anforderungen – Probleme –

Lösungsmöglichkeiten“, Bonn, 30.09.2004

• Malz, F.: „Reinheitsbestimmungen pharmazeutischer Produkte im AiF-Projekt“, Fachgruppen-

Seminar der BAM, Berlin, 22.11.2004.

• Malz, F. und Jancke, H.: „Reinheitsbestimmung pharmazeutischer Referenzsubstanzen

mittels qNMR“, GDCh-NMR-Diskussionstagung „Praktische Probleme der

Kernresonanzspektroskopie Bochum, 17.-18.1. 2005

• Malz, F. und Jancke, H.: „Validation of quantitative NMR measurements“, DPhG-

Jahrestagung, Mainz, 5.-8.10.2005

• Malz, F.: “Reinheitsbestimmung von pflanzlichen Referenzstandards mittels qNMR

(AiF-Projekt)“, Abteilungsseminar der BAM, Berlin, 31.10.2005

Weiterhin wurden die jeweils erarbeiteten Ergebnisse auf 7 Tagungen des projektbegleitenden

Ausschusses (PA) vorgestellt.

35

In der nächsten Zeit sind zwei weitere Publikationen zu folgenden Themen geplant:

• Ergebnis des Projekts , soll erscheinen in J. Pharm Biomed

• nationaler Ringversuch NMR-4, Zeitschrift noch nicht festgelegt.

Weiterhin wird im April 2006 auf der ENC (Asimolar, USA) das Projekt mit einem Posterbeitrag zum

Thema „NMR – an accurate and precise tool for purity determinations of pharmaceutical reference

materials“ publik gemacht. Auf dem FAH & DPhG Joint-Symposium "Quantitative NMR in

Pharmaceutical Analysis" sollen die Ergebnisse mittels eines Vortrages mit dem Titel „Quantitative 1H

NMR - an accurate and precise tool for assays in the pharmaceutical analysis“ der Öffentlichkeit

vorgestellt werden.

36

8. Danksagung und Förderhinweis:

Es wird den Mitgliedern des Projektbegleitenden Ausschusses (PA) für die konstruktiven Diskussionen

und Anregungen gedankt. Besonderer Dank gilt hierbei Herrn Dr. Veit (LAT) als Vorsitzender des

PA’s. Ferner wird allen Teilnehmern des nationalen Ringversuchs für ihre aufgewendete Zeit sowie

der sorgfältigen Bearbeitung der Gehaltsbestimmung gedankt.

Dieses Projekt wurde gefördert von dem Bundesministerium für Wirtschaft und Arbeit (BMWA), der

Forschungsvereinigung der Arzneimittel-Hersteller e.V. (FAH) und der Arbeitsgemeinschaft

industrieller Forschungsvereinigungen "Otto von Guericke" e.V. (AiF), (AiF-Nr.: 13843 N/1)

Berlin, den 28.03.06

______________________________ Unterschrift des Projektleiters und

Stempel der Forschungsstelle

37

9. Literaturverzeichnis [1] Maniara, G.; Rajamoorthi, K.; Rajan, S. und Stokton, G.W., Anal. Chem. 70(23),

1998, 4921-4928. [2] Jancke, H., Malz, F. und Hässelbarth, W., Accred. Qual. Assur 10, 2005, 421-429. [3] Milton, M.J., Quinn, T.J., Metrologia 38, 2001, 289-296. [4] Malz, F., Jancke, H., J. Pharm. Biomed. 2005, 813-823.. [5] Saed Al-Deen, T., Validation of Quantitative Nuclear Magnetic Resonance (QNMR)

Spectroscopy as Primary Ratio Analytical Method for Assessing the Purity of Organic Compounds: A Metrological Approach. Dissertation. Sydney 2002.

[6] ISO: Leitfaden zur Angabe der Unsicherheit beim Messen, Deutsche Übersetzung des „Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement“. Hrsg.: Deutsches Institut für Normung e. V.; 1. Auflage. Beuth Verlag GmbH: Berlin 1995.

[7] Internationales Wörterbuch der Metrologie, Deutsche Übersetzung des „Internatio-nal Vocabulary of Basic and General Terms in Metrology“. Hrsg.: Deutsches Institut für Normung e. V., 2. Auflage. Beuth Verlag GmbH: Berlin 1994.

[8] Malz, F.: Validierung der H-NMR-Spektroskopie als primäre analytische Methode.1 Diplomarbeit. Technische Universität Berlin 1999.

[9] Malz. F.: NMR als Referenzmethode für die quantitative Analytik, Dissertation, Berlin, 2003.

[10] ICH Topic Q 2 A, Validation of Analytical Methods: Definitions and Terminology, 1995

[11] ICH Topic Q 2 B, Validation of Analytical Methods: Methodology, 1997 [12] Leyden, D.E and R.H.Cox, Analytical Applications of NMR, Wiley, New York

1977. [13] Kasler, F., Quantitative Analysis by NMR Spectroscopy, Acad. Press, London 1973. [14] Sotak, H.C., C.L. Dumolin and G.C. Levy, High accuracy quantitative analysis by

carbon-13 Fourier Transform NMR spectroscopy, Topics in C-13 NMR Spectroscopy, G.C. Levy (Ed.) 1984.

[15] Rabenstein, D.L. and T.T. Nakashima, Trace Analysis: Spectroscopic Methods for Molecules, Wiley, New York, 1986.

[16] Derome, A.E., Modern NMR Techniques for Chemical Research, Pergamon Press, Elmsford New York, 1987.

[17] Field, L.D. and Sternhell, S., Analytical NMR, J.Wiley and Sons Ltd. New York 1989.

[18] Martin, M.L.; Martin, G,J, und Delpeuch, J.-J.: Practical NMR Spectroscopy. Heyden & Son: London 1980.

[19] Maciel, G.D., Nuclear Magnetic Resonance in Modern Technology, NATO ASI Series Ser. C, Vol. 447, Ch. 9, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht/ Boston/ London 1994.

[20] Deutscher Kalibrierdienst (DKD): DKD-4. Rückführung von Mess- und Prüfmitteln auf nationale Normale. Deutsche Fassung der Publikation EAL-G12, Edition 1, November 1995, „Traceability of Measuring and Test Equipment to National Standards. Physikalisch-Technische Bundesanstalt (PTB): Braunschweig 1998.

[21] Zschunke, A., Accredit. Qual. Assur. 5, 2000, 441-445. [22] Zschunke, A., GIT Labor-Fachzeitschrift 5, 2002, 533. [23] Wells, R.J. und Cheung, J., The Chemistry Preprint Server CPS: analchem/0103002,

2001. [24] Griffiths, L. und Irving, A.M., Analyst 123, 1998, 1061-1068.

39

[25] Larive, C.K.; Jayawickrama, D. und Orfi, L., Appl. Spectrosc. 51(10), 1997, 1531-1536.

[26] Akoka, S.; Barantin, L. und Trierweiler, M., Anal. Chem. 71, 1999, 2554-2557. [27] Silvestre, V.; Goupry, S.; Trierweiler, M.; Robins, R. und Akoka, S., Anal. Chem.

73, 2001, 1862-1868. [28] EN ISO/IEC 17025 : Allgemeine Anforderungen an die Kompetenz von Prüf- und

Kalibrierlaboratorien. Dreisprachige Fassung. Deutsches Institut für Normungen e.V. : Berlin 2000.

[29] EURACHEM/CITAC: Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement. 2. Auflage. Editor: Ellison, S.L.; Rosslein, M. und Williams, A.. 2000.

[30] Rösslein, M.: Messunsicherheit in der Analytischen Chemie – Einführung und Grundlagen. 3., überarbeitete und erweiterte Auflage. EMPA : St. Gallen 1999.

40

10. Anhang

10.1. Nationaler Ringversuch NMR-4

Tabelle 10.1: Teilnehmer am Ringversuch NMR-4, nach Postleitzahlen sortiert.

Herr Dr. Findeisen Universität Leipzig 04103 Leipzig

Frau Dr. Porzel Institut für Pflanzenbiochemie 06078 Halle/Saale

Herr Prof. Schlothauer Hochschule Merseburg (FH) 06217 Merseburg

Herr Dr. Malz Bundesanstalt für Materialforschung und –prüfung (BAM) 12489 Berlin

Herr Dr. Schmieder Forschungsinstitut für molekulare Pharmakologie (FMP) 13125 Berlin

Herr Dr. Gründemann Schering AG 13342 Berlin

Herr Dr. Heydenreich Universität Potsdam 14415 Potsdam

Herr Dr. Baumann Universität Rostock 18059 Rostock

Herr Dr. Preiß FhG-ITA Hannover 30625 Hannover

Herr Dr. Janick AQura GmbH 45764 Marl

Herr Dr. Freudenberger Bayer Industry Services GmbH & Co. OHG 51368 Leverkusen

Herr Dr. Konrad Bayer Industry Services GmbH & Co. OHG 51368 Leverkusen

Herr Dr. Rau Bayer Industry Services GmbH & Co. OHG 51368 Leverkusen

Frau Prof. König Universität Bonn 53115 Bonn

Herr Dr. Janick AQura GmbH 63457 Hanau

Herr Dr. Hauß Merck-KgaA 64271 Darmstadt

Herr Dr. Krack BASF-AG 67056 Ludwigshafen

Herr Dr. Engelhardt Bruker BioSpin GmbH 67287 Rheinstetten

Herr Dr. Hauer Dr. Willmar Schwabe GmbH & Co. KG 76227 Karlsruhe

Herr Opitz ALTANA Pharma AG 78467 Konstanz

Herr Dr. Zahl Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg 91058 Erlangen

Frau Prof. Holzgrabe Universität Würzburg 97074 Würzburg

Tabelle 10.2: Ergebnisse der Linearitätsbetrachtung.

Nr

Bestimmtheitsmaß r

2 0,998 5 0,9998 6 0,997 8 0,99993 9 0,99993

11 0,993 19 0,9987 22 0,998 23 0,9988 24 0,9997

Tabelle 10.3: Ergebnisse der Teilnehmer.

Rel. Gehalt in g/g % Nr Mittelwert SD U95

1 90,24 0,42 0,92 90,52 0,87 1,13 89,61 0,28 0,84 91,63 0,54 5,25 89,60 0,39 1,26 88,07 1,34 1,67 97,09 2,95 2,68 90,31 0,17 0,49 90,44 0,23 0,5

10 90,70 0,32 0,411 91,43 0,83 1,012 92,34 1,29 1,313 92,29 0,93 1,114 90,40 1,12 1,115 90,68 0,75 0,716 88,80 0,42 0,417 94,10 0,60 0,518 90,75 0,62 0,919 90,08 0,30 0,820 87,25 1,64 4,021 96,14 2,84 4,822 90,61 1,73 1,623 90,99 1,74 1,624 90,74 0,39 5,125 91,49 0,32 0,7

10.2. Geräte und Chemikalien

Gerät

NMR-Spektrometer: Bruker Avance DMX 400 (9,4 T)

Messfrequenzen: 400,14 MHz (1H), 100,62 MHz (13C)

Messkopf: 5mm TBI

Interne NMR-Standards (relativer Gehalt)

Benzoesäure SRM 350a (zertifizierter Gehalt von (99,9958 ± 0,0027) g/g %) NIST, Maleinsäure (> 99 %) Fa.

Merck, 3-Trimethylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionsäure-Natriumsalz (> 99 %) Fa. Merck, Natriumacetat

(> 99 %) Fa. Merck, Dimethylsulfon (> 99 %) Fa. Merck, Dimethylterephthalat (> 99 %) Fa. Merck,

1,3,5-Trioxan (> 99 %) Fa. Merck, 1,2,4,5,Tetramethylbenzol (> 99 %) Fa. Merck und 2-Hydroxy-3,5-

dintrobenzoesäure (> 98 %) Fa. Merck.

Deuterierte Lösungsmittel (Deuterierungsgrad)

Chloroform-d1 (> 99,8 %) Fa. Merck, Deuteriumoxid-d2 (> 99,96 %) Fa. Merck, Dimethylsulfoxid-d6

(> 99,96 %) Fa. Merck, Methanol-d4 (> 99,95 %) Fa. Merck, Dimethylformamid-d7 (> 99,5 %) Fa. Merck,

Pyridin-d5 (> 99,82 %) Fa. Chemotrade, Methylacetat-d6 (> 993 %) Akademie der Wissenschaften.

10.3. Validierungsreport Kawain

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Kavain

Validierungsreport

Gehaltsbestimmung Referenzstandard Kavain (Charge: WA 115)

MVR_Kavain_de.doc; Seite 1 von 18

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Kavain 1. ZUSAMMENFASSUNG Dieser Validierungsreport basiert auf Validierungsplan und –protokoll MVP_Kavain_01 vom 19.01.04. Parameter Ergebnis Bewertung

Spezifität/Selektivität: Zuordnung der NMR-Signale eindeutig Die verwendete Analysenmethode ist ausreichend selektiv und spezifisch

Wiederholpräzision (n = 6):

Variationskoeffizient (VK) = 0,7 % Die verwendete qNMR-Methode ist hinreichend präzise

Vergleichspräzision (2 Prüfserien à n=6):

Serie 1: VK = 0,7 % Serie 2: VK = 0,6 %

Abweichung der Mittelwerte: 0,011 % (bezogen auf den höheren Wert)

Der Unterschied zwischen VK1 und VK2 ist zufällig (F-Test)

Richtigkeit über Referenzlösung

Relative Abweichung vom Sollwert: 0,1% Die verwendete Analysenmethode führt zu richtigen Ergebnissen.

Linearität (n=6): Korrelationskoeffizient r = 0,99995

Die verwendete qNMR-Methode ist im Messbereich linear.

Range: 5 – 10 mg Analyt / g Prüflösung, entspricht 70% bis 160% der Sollkonzentration von Analyt in Prüflösung.

Robustheit: Optimierung der Aufnahmeparameter erfolgt Stabilität der Prüflösung Qualität der NMR-Röhrchen Lösungsmitteleinfluss

Die verwendete qNMR-Methode ist ausreichend robust

Die verwendete qNMR-Methode ist hinreichend valide und robust

MVR_Kavain_de.doc; Seite 2 von 18

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Kavain 2. UNTERSCHRIFTEN

Erstellung: __________________________________ Dr. F. Malz Prüfleiter Prüfung: __________________________________ Prof. Dr. C. Jäger Arbeitsgruppentleiter __________________________________ Dr. A. Thünemann Fachgruppenleiter

MVR_Kavain_de.doc; Seite 3 von 18

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Kavain INHALT Seite 1. ZUSAMMENFASSUNG............................................................................................................... 2

2. UNTERSCHRIFTEN.................................................................................................................... 3

3. EINLEITUNG ............................................................................................................................... 5

4. EXPERIMENTELLE PARAMETER: ....................................................................................... 5 4.1 VERWENDETE MATERIALIEN .................................................................................................. 5 4.2 ANGEWANDTES UNTERSUCHUNGSVERFAHREN ...................................................................... 5 4.3 EXPERIMENTELLE MESSBEDINGUNGEN .................................................................................. 6

5. VALIDIERUNGSDATEN............................................................................................................ 7 5.1 SPEZIFITÄT / SELEKTIVITÄT DER METHODE............................................................................ 7 5.2 WIEDERHOLPRÄZISION.......................................................................................................... 11 5.3 VERGLEICHSPRÄZISION ......................................................................................................... 12 5.4 RICHTIGKEIT.......................................................................................................................... 13 5.5 LINEARITÄT ........................................................................................................................... 14 5.6 ARBEITSBEREICH................................................................................................................... 14 5.7 ROBUSTHEIT .......................................................................................................................... 15

5.7.1 Stabilität der Lösungen ................................................................................................ 15 5.7.2 Robustheit der qNMR-Methode ................................................................................... 16

6. VERSIONSHISTORIE............................................................................................................... 18

MVR_Kavain_de.doc; Seite 4 von 18

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Kavain 3. EINLEITUNG

Im Rahmen des AiF-Projekts 13843 sollte die Validität der folgenden Analysenmethode überprüft werden.

Methode Gehaltsbestimmung von Referenzstandards (qNMR)

Analysenvorschrift QMH I.33

Referenzstandard Referenzstandard Kavain (Charge: WA 115)

4. EXPERIMENTELLE PARAMETER:

4.1 Verwendete Materialien

Substanz Bezeichnung, verwendete Charge

NMR-Interner Standard ZRM Benzoesäure, SRM 350a (NIST)

Lösungsmittel Chloroform-d1; Charge: S27286 927 (Merck) Dimethylformamid-d7, Charge 93161 (ICB)

4.2 Angewandtes Untersuchungsverfahren Die quantitative 1H-NMR-Spektroskopie beruht auf der Tatsache, dass die Intensität I eines Signals direkt proportional der Anzahl der zu dem Signal A gehörigen Messkerne ist.

ASA NKI = Die Konstante KS ist bei der Single-Pulse-NMR-Spektroskopie - unter Vermeidung von Sättigungseffekten - identisch für alle Signale aller Substanzen einer Messlösung, bzw. in deren Spektrum. Der relative Gehalt PX einer Verbindung X (Analyt) kann bestimmt werden, indem der Verbindung ein interner Standard zugewogen wird und die Intensitäten geeigneter Signale verglichen werden. Voraussetzung ist, dass die Molmasse M und die Struktur der untersuchten Substanzen bekannt und ihre Signale zweifelsfrei zugeordnet sind. Für die Analyse sind die Einwaage des Standards mStd, dessen relativer Gehalt PStd (in %, bei ZRM

MVR_Kavain_de.doc; Seite 5 von 18

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Kavain

aus dem Zertifikat) und die Einwaage des Analyten mX erforderlich. Die Zugabe eines Lösungsmittels hat keinen Einfluss auf das Ergebnis.

Zur Bestimmung der Linearität werden die experimentellen Gehalte den theoretischen Werten gegenübergestellt. Letztere werden aus den Einwaagen von Analyt mx und Lösungsmittel mLM unter Berücksichtigung des relativen Gehalts vom Analyten Px wie folgt berechnet:

( ) %100)( x

LMx

xtheox Pmm

mm

m⋅

+=

Der experimentelle Gehaltswert wird aus den Intensitätswerten von Analyt und internem Standard entsprechend erhalten.

Stdx

Std

Std

x

x

Std

Std

xx P

mm

MM

NN

IIP ⋅⋅⋅⋅=

%100)()exp( Std

LMx

Std

Std

x

x

Std

Std

xx Pmm

mMM

NN

II

mm

⋅+

⋅⋅⋅=

4.3 Experimentelle Messbedingungen Entsprechend der Analysenvorschrift: STAA NMR / 9.701 Standard-HR Spektrum 1H NMR STAA NMR / 9.702 Quantitative Analytik 1H NMR Die verwendeten experimentellen Parameter sind im Anhang den entsprechenden Spektren beigefügt.

MVR_Kavain_de.doc; Seite 6 von 18

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Kavain

5. VALIDIERUNGSDATEN

Die ausführliche Validierung der Methode wurde im NMR-Labor der BAM 1999 – 2003 durchgeführt (Malz, Jancke: J. Pharm Biomed 38 (2005) 833). Zusätzliche Validierungsaspekte wurden nach den Vorgaben der EU Richtlinien CPMP/ICH/281/95 und CPMP/QWP/381/95 durchgeführt. Die Auswertung erfolgte über die Software Excel.

5.1 Spezifität / Selektivität der Methode Spezifität / Selektivität der Methode wurde durch 1D- und 2D NMR-Spektren belegt. Parameter Akzeptanzkriterien Ergebnisse Selektivität der NMR-Spektroskopie

Keine Fremdsignale unter dem Monitorsignal

Keine Signalinterferenzen

MVR_Kavain_de.doc; Seite 7 von 18

Validierungsreport Version: < 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Kavain

Abbildung 1: Qualitatives Spektrum der Analysenlösung

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm

MVR_Kavain_de.doc; Seite 8 von 18

Validierungsreport Version: < 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Kavain

Abbildung 2: Prüflösung Gehalt (Analyt + NMR-Standard)

9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm

MVR_Kavain_de.doc; Seite 9 von 18

Validierungsreport Version: < 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Kavain

Abbildung 3: Reines Lösungsmittel

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm

Die Akzeptanzkriterien für Spezifität / Selektivität sind erfüllt. Die Methode ist ausreichend spezifisch und selektiv.

MVR_Kavain_de.doc; Seite 10 von 18

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Kavain

5.2 Wiederholpräzision Die Bestimmung der Präzision erfolgte über Wiederholungsanalysen (n = 6) Parameter Akzeptanzkriterien Ergebnisse

Wiederholpräzision (n = 6): Variationskoeffizient VK ≤ 2 % VK = 0,7 % (n=6)

Lsg. 1 2 3 4 5 6

Analyt 10,27 10,20 10,05 10,23 10,75 9,99 Einwaage in mg Interner Std. 10,33 10,58 10,00 10,21 10,13 10,18 NMR-Spektrum 2 3 4 5 6 7

Analyt 2,410 2,363 2,449 2,475 2,612 2,403 Intensität Interner Std. 10,000 10,000 10,000 10,000 10,000 10,000

Gehalt in g/g % 91,47 92,43 91,89 93,15 92,81 92,34 Mittelwert 92,3 g/g % SD 0,6 g/g % VK 0,7 %

Die Akzeptanzkriterien für die Wiederholpräzision sind erfüllt. Die Methode ist hinreichend präzise.

MVR_Kavain_de.doc; Seite 11 von 18

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Kavain

5.3 Vergleichspräzision

Die Vergleichspräzision wurde von einem anderen Mitarbeiter an einem anderen Tag durchgeführt (n = 6 Aufarbeitungen). Parameter Akzeptanzkriterien Ergebnisse

Vergleichspräzision (VK) der beiden Prüfserien (n = 6) in %: Variationskoeffizient VK ≤ 2 %

Serie 1: VK = 0,7 % Serie 2: VK = 0,6 %

Homogenität der Varianzen Der Unterschied zwischen VK1 und VK2 ist zufällig F-test entspricht

Abweichung der Mittelwerte in % (bezogen auf den höheren Wert) ≤ 1 % 0,011 %

Lösung Mitarbeiter 1 Mitarbeiter 2 1 91,47 g/g % 91,52 g/g %2 92,43 g/g % 92,46 g/g %3 91,89 g/g % 91,85 g/g %4 93,15 g/g % 93,11 g/g %5 92,81 g/g % 92,71 g/g %6 92,34 g/g % 92,30 g/g % Mittelwert 92,34 g/g % 92,33 g/g %SD 0,63 g/g % 0,57 g/g %VK 0,7 % 0,6% F=SD2

2/SD12 1,22

Tabellenwert (95%,5,5) 5,05

Die Akzeptanzkriterien für die Vergleichspräzision sind erfüllt. Die Methode ist hinreichend präzise unter vergleichbaren Bedingungen.

MVR_Kavain_de.doc; Seite 12 von 18

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Kavain

5.4 Richtigkeit

Die Bestimmung der Richtigkeit der Methode erfolgte über die Wiederfindung des natürlichen Protonenverhältnisses von CH2 zu CH3 der Referenzlösung Ethylbenzol in CDCl3.

Abbildung 4: NMR-Spektrum der Referenzlösung Ethylbenzol in CDCl3:

9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm

1.

24

71

.2

66

1.

28

5

2.

64

92

.6

68

2.

68

72

.7

06

3.00

3

2.00

0

Die Akzeptanzkriterien für die Richtigkeit sind erfüllt. Die Methode führt zu richtigen Ergebnissen.

MVR_Kavain_de.doc; Seite 13 von 18

Parameter Akzeptanzkriterium Ergebnis Rel. Abweichung DEV in % (Abweichung Messwert vom Referenzwert)

DEV < 1 % DEV = 0,1 %

CH2-Signal CH3-Signale soll ist soll ist

2 2 3 3,003

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Kavain 5.5 Linearität

Die Bestimmung der Linearität erfolgte durch Einwägen von 5 unterschiedlichen Konzentrationen mit Referenzmaterial im Arbeitsbereich von ca. 70 % bis 160 % der Sollkonzentration der Prüflösung. Parameter Akzeptanzkriterien Ergebnisse

Regression r r > 0,995 r = 0,99995

Vertrauensbereich des y-Achsenabschnittes (α=0.05, P=95%):

Vertrauensbereich der Kalibrierfunktion muss y = 0 einschließen.

Vertrauensbereich der Kalibrierfunktion schließt y=0 ein.

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

10,00

11,00

4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00

Theo. Gehalt in mg/g

Exp.

Geh

alt i

n m

g/g

Die Akzeptanzkriterien für die Linearität sind erfüllt. Die Methode ist im Arbeitsbereich linear.

Eine Kalibrierfunktion ist für die qNMR-Methode nicht erforderlich.

5.6 Arbeitsbereich Aus den Daten für die Linearität kann ein Arbeitsbereich von 5 – 10 mg Analyt / g Prüflösung abgeleitet werden.

MVR_Kavain_de.doc; Seite 14 von 18

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Kavain 5.7 Robustheit

5.7.1 Stabilität der Lösungen

Abbildung 5: NMR-Spektrum der Probelösung nach 3 Tagen

9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm

1.00

0

4.48

1

Relativer Gehalt: 92,1 g/g %; rel. Abweichung zum Mittelwert: 0,2 % Lagerungsbedingungen: ambiente Lagerung bei 25 °C

MVR_Kavain_de.doc; Seite 15 von 18

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Kavain

5.7.2 Robustheit der qNMR-Methode

Die Robustheit der Methode gegenüber dem verwendeten NMR-Röhrchen wurde an einem Schott 5mm Economic NMR-Röhrchen und einem Schott 5mm Scientific NMR-Röhrchen geprüft, gefüllt mit jeweils derselben Analysenlösung.

Kennzahlen Akzeptanzkriterium Resultat

Gehalt Rel Abweichung DEV der Resultate beider Messungen bezogen auf den höheren Wert: DEV < 1%

DEV = 0,04 %

Lösung 5mm Economic 5mm Scientific 12 92,26 g/g % 92,31 g/g %13 92,22 g/g % 92,22 g/g %14 92,72 g/g % 92,72 g/g %15 92,37 g/g % 92,57 g/g %16 92,22 g/g % 92,19 g/g %17 92,26 g/g % 92,23 g/g % Mittelwert 92,34 g/g % 92,38 g/g %SD 0,19 g/g % 0,22 g/g %VK 0,2 % 0,2 %

Die Robustheit der Methode gegenüber dem verwendeten Lösungsmittel wurde an Chloroform-d1 und Dimethylformamid-d7 geprüft.

Kennzahlen Akzeptanzkriterium Resultat

Gehalt Rel Abweichung DEV der Resultate beider Messungen bezogen auf den höheren Wert: DEV < 1%

DEV = 0,04 %

MVR_Kavain_de.doc; Seite 16 von 18

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Kavain

Lösung CDCl3 DMF-d7

1/12 91,47 g/g % 92,31 g/g %2/13 92,43 g/g % 92,22 g/g %3/14 91,89 g/g % 92,72 g/g %4/15 93,15 g/g % 92,57 g/g %5/16 92,81 g/g % 92,19 g/g %6/17 92,34 g/g % 92,23 g/g % Mittelwert 92,34 g/g % 92,38 g/g %SD 0,63 g/g % 0,22 g/g %VK 0,7 % 0,2 %

Generell ist eine Robustheitsüberprüfung bzgl. der Lösungsmittelcharge nicht notwendig, da eine Blindmessung des zu verwendenden Lösungsmittels vor der Analyse durchgeführt wird. Folgende Parameter wurden überprüft: Pulsstärke B0, Pulsbreite τp, Pulsdelay tpd, Akquisitionszeit tac, Relaxationsdelay td, Signal-zu-Rausch-Verhältnis S/N, Empfängerstufe RG, Temperatur T, Filterbreite und -art, Verbreiterungsfaktor lb, Nullen-Ergänzung, Phaseneinstellung, Relaxationszeit T1, Linearität, Wiederholbarkeit, Vergleichbarkeit, Magnetfeldstärke, Messkopf (Malz, Jancke: J. Pharm Biomed 38 (2005) 833).

Die Methode ist hinreichend robust.

MVR_Kavain_de.doc; Seite 17 von 18

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Kavain 6. VERSIONSHISTORIE Datum Erstellung/Änderung Durch Freigabe am Durch Version05.02.06 Erstellung des Berichts Malz 01

MVR_Kavain_de.doc; Seite 18 von 18

10.4. Validierungsreport Rutin Trihydrat

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Rutin Trihydrat

Validierungsreport

Gehaltsbestimmung Referenzstandard Rutin Trihydrat (Charge: SR04-072-D)

MVR_Rutin_01_de.doc; Seite 1 von 17

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Rutin Trihydrat 1. ZUSAMMENFASSUNG Dieser Validierungsreport basiert auf Validierungsplan und –protokoll MVP_Rutin_01 vom 20.04.04. Parameter Ergebnis Bewertung

Spezifität/Selektivität: Zuordnung der NMR-Signale eindeutig Die verwendete Analysenmethode ist ausreichend selektiv und spezifisch

Wiederholpräzision (n = 6):

Variationskoeffizient (VK) = 0,14 % Die verwendete qNMR-Methode ist hinreichend präzise

Vergleichspräzision (2 Prüfserien à n=6):

Serie 1: VK = 0,14 % Serie 2: VK = 0,3 %

Abweichung der Mittelwerte: 1 % (bezogen auf den höheren Wert)

Der Unterschied zwischen VK1 und VK2 ist zufällig (F-Test)

Richtigkeit über Referenzlösung

Relative Abweichung vom Sollwert: 0,2 % Die verwendete Analysenmethode führt zu richtigen Ergebnissen.

Linearität (n=6): Korrelationskoeffizient r = 0,9998

Die verwendete qNMR-Methode ist im Messbereich linear.

Range: 5 – 13 mg Analyt / g Prüflösung, entspricht 60% bis 130% der Sollkonzentration von Analyt in Prüflösung.

Robustheit: Optimierung der Aufnahmeparameter erfolgt Stabilität der Prüflösung Qualität der NMR-Röhrchen

Die verwendete qNMR-Methode ist ausreichend robust

Die verwendete qNMR-Methode ist hinreichend valide und robust

MVR_Rutin_01_de.doc; Seite 2 von 17

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Rutin Trihydrat 2. UNTERSCHRIFTEN

Erstellung: __________________________________ Dr. F. Malz Prüfleiter Prüfung: __________________________________ Prof. Dr. C. Jäger Arbeitsgruppentleiter __________________________________ Dr. A. Thünemann Fachgruppenleiter

MVR_Rutin_01_de.doc; Seite 3 von 17

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Rutin Trihydrat INHALT Seite 1. ZUSAMMENFASSUNG............................................................................................................... 2

2. UNTERSCHRIFTEN.................................................................................................................... 3

3. EINLEITUNG ............................................................................................................................... 5

4. EXPERIMENTELLE PARAMETER: ....................................................................................... 5 4.1 VERWENDETE MATERIALIEN .................................................................................................. 5 4.2 ANGEWANDTES UNTERSUCHUNGSVERFAHREN ...................................................................... 5 4.3 EXPERIMENTELLE MESSBEDINGUNGEN .................................................................................. 6

5. VALIDIERUNGSDATEN............................................................................................................ 7 5.1 SPEZIFITÄT / SELEKTIVITÄT DER METHODE............................................................................ 7 5.2 WIEDERHOLPRÄZISION.......................................................................................................... 11 5.3 VERGLEICHSPRÄZISION ......................................................................................................... 12 5.4 RICHTIGKEIT.......................................................................................................................... 13 5.5 LINEARITÄT ........................................................................................................................... 14 5.6 ARBEITSBEREICH................................................................................................................... 14 5.7 ROBUSTHEIT .......................................................................................................................... 15

5.7.1 Stabilität der Lösungen ................................................................................................ 15 5.7.2 Robustheit der qNMR-Methode ................................................................................... 16

6. VERSIONSHISTORIE............................................................................................................... 17

MVR_Rutin_01_de.doc; Seite 4 von 17

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Rutin Trihydrat 3. EINLEITUNG

Im Rahmen des AiF-Projekts 13843 sollte die Validität der folgenden Analysenmethode überprüft werden.

Methode Gehaltsbestimmung von Referenzstandards (qNMR)

Analysenvorschrift QMH I.33

Referenzstandard Referenzstandard Rutin Trihydrat (Charge: SR04-072-D)

4. EXPERIMENTELLE PARAMETER:

4.1 Verwendete Materialien

Substanz Bezeichnung, verwendete Charge

NMR-Interner Standard 2-Hydroxy-3,5-dinitro-benzoesäure, Charge: S3938641 346 (Merck)

Lösungsmittel Dimethylformamid-d7, Charge 93161 (ICB)

ZRM ZRM Benzoesäure, SRM 350a (NIST)

4.2 Angewandtes Untersuchungsverfahren Die quantitative 1H-NMR-Spektroskopie beruht auf der Tatsache, dass die Intensität I eines Signals direkt proportional der Anzahl der zu dem Signal A gehörigen Messkerne ist.

ASA NKI = Die Konstante KS ist bei der Single-Pulse-NMR-Spektroskopie - unter Vermeidung von Sättigungseffekten - identisch für alle Signale aller Substanzen einer Messlösung, bzw. in deren Spektrum. Der relative Gehalt PX einer Verbindung X (Analyt) kann bestimmt werden, indem der Verbindung ein interner Standard zugewogen wird und die Intensitäten geeigneter Signale verglichen werden. Voraussetzung ist, dass die Molmasse M und die Struktur der untersuchten Substanzen bekannt und ihre Signale zweifelsfrei zugeordnet sind. Für die Analyse sind die Einwaage des Standards mStd, dessen relativer Gehalt PStd (in %, bei ZRM

MVR_Rutin_01_de.doc; Seite 5 von 17

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Rutin Trihydrat

aus dem Zertifikat) und die Einwaage des Analyten mX erforderlich. Die Zugabe eines Lösungsmittels hat keinen Einfluss auf das Ergebnis.

Zur Bestimmung der Linearität werden die experimentellen Gehalte den theoretischen Werten gegenübergestellt. Letztere werden aus den Einwaagen von Analyt mx und Lösungsmittel mLM unter Berücksichtigung des relativen Gehalts vom Analyten Px wie folgt berechnet:

( ) %100)( x

LMx

xtheox Pmm

mm

m⋅

+=

Der experimentelle Gehaltswert wird aus den Intensitätswerten von Analyt und internem Standard entsprechend erhalten.

Stdx

Std

Std

x

x

Std

Std

xx P

mm

MM

NN

IIP ⋅⋅⋅⋅=

%100)()exp( Std

LMx

Std

Std

x

x

Std

Std

xx Pmm

mMM

NN

II

mm

⋅+

⋅⋅⋅=

4.3 Experimentelle Messbedingungen Entsprechend der Analysenvorschrift: STAA NMR / 9.701 Standard-HR Spektrum 1H NMR STAA NMR / 9.702 Quantitative Analytik 1H NMR Die verwendeten experimentellen Parameter sind im Anhang den entsprechenden Spektren beigefügt.

MVR_Rutin_01_de.doc; Seite 6 von 17

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Rutin Trihydrat

5. VALIDIERUNGSDATEN

Die ausführliche Validierung der Methode wurde im NMR-Labor der BAM 1999 – 2003 durchgeführt (Malz, Jancke: J. Pharm Biomed 38 (2005) 833). Zusätzliche Validierungsaspekte wurden nach den Vorgaben der EU Richtlinien CPMP/ICH/281/95 und CPMP/QWP/381/95 durchgeführt. Die Auswertung erfolgte über die Software Excel.

5.1 Spezifität / Selektivität der Methode Spezifität / Selektivität der Methode wurde durch 1D- und 2D NMR-Spektren belegt. Parameter Akzeptanzkriterien Ergebnisse Selektivität der NMR-Spektroskopie

Keine Fremdsignale unter dem Monitorsignal

Geringe, aber korrigierbare Signalinterferenzen

MVR_Rutin_01_de.doc; Seite 7 von 17

Validierungsreport Version: < 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Rutin Trihydrat

Abbildung 1: Qualitatives Spektrum der Analysenlösung

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 ppm

MVR_Rutin_01_de.doc; Seite 8 von 17

Validierungsreport Version: < 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Rutin Trihydrat

Abbildung 2: Prüflösung Gehalt (Analyt + NMR-Standard)

9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

MVR_Rutin_01_de.doc; Seite 9 von 17

Validierungsreport Version: < 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Rutin Trihydrat

Abbildung 3: Reines Lösungsmittel

9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm

Die Akzeptanzkriterien für Spezifität / Selektivität sind erfüllt. Die Methode ist ausreichend spezifisch und selektiv.

MVR_Rutin_01_de.doc; Seite 10 von 17

Validierungsreport Version:< 01>

Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Rutin Trihydrat

5.2 Wiederholpräzision Die Bestimmung der Präzision erfolgte über Wiederholungsanalysen (n = 6) Parameter Akzeptanzkriterien Ergebnisse

Wiederholpräzision (n = 6): Variationskoeffizient VK ≤ 2 % VK = 0,14 % (n=6)

Lsg. 1 2 3 4 5 6

Analyt 10,24 9,93 9,92 10,04 10,08 9,92 Einwaage in mg Interner Std. 12,77 9,97 10,16 10,71 10,62 10,11 NMR-Spektrum 11 12 13 14 15 16

Analyt 0,983 0,978 0,980 0,976 0,978 0,980 Intensität Interner Std. 7,175 5,765 5,891 6,092 6,041 5,857

Wasserfrei 91,01 90,75 90,81 91,08 90,94 90,86 Gehalt in

g/g % Trihydrat 99,07 98,78 98,85 99,15 98,99 98,90 Mittelwert 90,91 g/g % (wasserfrei) 98,96 g/g % (Trihydrat) SD 0,13 g/g % 0,14 g/g % VK 0,14 % 0,14 %

Die Akzeptanzkriterien für die Wiederholpräzision sind erfüllt. Die Methode ist hinreichend präzise.

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Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Rutin Trihydrat

5.3 Vergleichspräzision

Die Vergleichspräzision wurde von einem anderen Mitarbeiter an einem anderen Tag durchgeführt (n = 6 Aufarbeitungen). Parameter Akzeptanzkriterien Ergebnisse

Vergleichspräzision (VK) der beiden Prüfserien (n = 6) in %: Variationskoeffizient VK ≤ 2 %

Serie 1: VK = 0,14 % Serie 2: VK = 0,3 %

Homogenität der Varianzen Der Unterschied zwischen VK1 und VK2 ist zufällig F-test entspricht

Abweichung der Mittelwerte in % (bezogen auf den höheren Wert) ≤ 1 % 1 %

Lösung Mitarbeiter 1 Mitarbeiter 2 1/12 91,01 g/g % 90,29 g/g %2/13 90,75 g/g % 89,68 g/g %3/14 90,81 g/g % 90,30 g/g %4/15 91,08 g/g % 89,68 g/g %5/16 90,94 g/g % 90,07 g/g %6/17 90,86 g/g % 89,99 g/g % Mittelwert 90,91 g/g % 90,0 g/g %SD 0,13 g/g % 0,3 g/g %VK 0,14 % 0,3% F=SD2

2/SD12 4,59

Tabellenwert (95%,5,5) 5,05

Die Akzeptanzkriterien für die Vergleichspräzision sind erfüllt. Die Methode ist hinreichend präzise unter vergleichbaren Bedingungen.

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Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Rutin Trihydrat

5.4 Richtigkeit

Die Bestimmung der Richtigkeit der Methode erfolgte über die Wiederfindung des natürlichen Protonenverhältnisses von CH2 zu CH3 der Referenzlösung Ethylbenzol in CDCl3.

Abbildung 4: NMR-Spektren der Referenzlösung Ethylbenzol in CDCl3:

1.01.21.41.61.82.02.22.42.62.83.03.2 ppm

1.

22

31

.2

42

1.

26

1

2.

62

52

.6

44

2.

66

32

.6

82

3.00

6

2.00

0

Die Akzeptanzkriterien für die Richtigkeit sind erfüllt. Die Methode führt zu richtigen Ergebnissen.

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Parameter Akzeptanzkriterium Ergebnis Rel. Abweichung DEV in % (Abweichung Messwert vom Referenzwert)

DEV < 1 % DEV = 0,2 %

CH2-Signal CH3-Signale soll ist soll ist

2 2 3 3,006

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Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Rutin Trihydrat 5.5 Linearität

Die Bestimmung der Linearität erfolgte durch Einwägen von 5 unterschiedlichen Konzentrationen mit Referenzmaterial im Arbeitsbereich von ca. 60 % bis 130 % der Sollkonzentration der Prüflösung. Parameter Akzeptanzkriterien Ergebnisse

Regression r r > 0,995 r = 0,9998

Vertrauensbereich des y-Achsenabschnittes (α=0.05, P=95%):

Vertrauensbereich der Kalibrierfunktion muss y = 0 einschließen.

Vertrauensbereich der Kalibrierfunktion schließt y=0 ein.

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

10,00

11,00

12,00

13,00

5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00

Theo. Gehalt in mg/g

Exp.

Geh

alt i

n m

g/g

Die Akzeptanzkriterien für die Linearität sind erfüllt. Die Methode ist im Arbeitsbereich linear.

Eine Kalibrierfunktion ist für die qNMR-Methode nicht erforderlich.

5.6 Arbeitsbereich Aus den Daten für die Linearität kann ein Arbeitsbereich von 5 – 13 mg Analyt / g Prüflösung abgeleitet werden.

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Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Rutin Trihydrat 5.7 Robustheit

5.7.1 Stabilität der Lösungen

Abbildung 5: NMR-Spektrum der Probelösung nach 3 Tagen

5.56.06.57.07.58.08.59.09.5 ppm

5.

45

65

.4

74

6.

25

56

.2

61

6.

48

26

.4

87

6.

92

76

.9

48

7.

65

17

.6

56

7.

67

27

.6

78

7.

73

67

.7

42

8.

00

0

8.

79

1

6.506.55 ppm

1.00

0

5.73

7

0.01

7

Relativer Gehalt: 91,2 g/g %; rel. Abweichung zum Mittelwert: 0,3 % Lagerungsbedingungen: ambiente Lagerung bei 25 °C

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Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Rutin Trihydrat

5.7.2 Robustheit der qNMR-Methode

Die Robustheit der Methode gegenüber den verwendeten NMR-Röhrchen wurde an einem Schott 5mm Economic NMR-Röhrchen und einem Schott 5mm Scientific NMR-Röhrchen geprüft, gefüllt mit jeweils derselben Analysenlösung.

Kennzahlen Akzeptanzkriterium Resultat

Gehalt Rel Abweichung der Resultate beider Messungen bezogen auf den höheren Wert: DEV < 1%

DEV = 0,2 %

Lösung 5mm Economic 5mm Scientific 18 91,71 g/g % 91,10 g/g %19 91,10 g/g % 89,80 g/g %20 90,05 g/g % 90,86 g/g %21 90,15 g/g % 90,24 g/g %22 90,76 g/g % 90,99 g/g %23 91,50 g/g % 91,51 g/g % Mittelwert 90,9 g/g % 90,7 g/g %SD 0,7 g/g % 0,6 g/g %VK 0,8 % 0,7 %

Folgende Parameter wurden überprüft: Pulsstärke B0, Pulsbreite τp, Pulsdelay tpd, Akquisitionszeit tac, Relaxationsdelay td, Signal-zu-Rausch-Verhältnis S/N, Empfängerstufe RG, Temperatur T, Filterbreite und -art, Verbreiterungsfaktor lb, Nullen-Ergänzung, Phaseneinstellung, Relaxationszeit T1, Linearität, Wiederholbarkeit, Vergleichbarkeit, Magnetfeldstärke, Messkopf (Malz, Jancke: J. Pharm Biomed 38 (2005) 833). Eine Robustheitsüberprüfung bzgl. der Lösungsmittelcharge ist nicht notwendig, da eine Blindmessung des zu verwendenden Lösungsmittels vor der Analyse durchgeführt wird.

Die Methode ist hinreichend robust.

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Gehaltsbestimmung von Referenzstandard Rutin Trihydrat 6. VERSIONSHISTORIE Datum Erstellung/Änderung Durch Freigabe am Durch Version07.02.06 Erstellung des Berichts Malz 01

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