Abschlussbericht für die DBU Entwicklung neuer Methoden ... · verlegter Nasenatmung und Müdigkeit (Beijer, Thorn et al. 2002). Wan (Wan und Li 1999) ... Entzündungsparametern

Abschlussbericht für die DBU Herrn Dr. Maximilian Hempel

Projekt

Entwicklung neuer Methoden für die systematische Erfassung von

gesundheitsschädlichen Schimmelpilzen AZ 19620

Sension GmbH

In Kooperation mit der Abteilung Umweltambulanz, Klinikum Augsburg

Erstellt von Dr. med. Monika Schulze

und

Dr. rer. nat. Peter Schneider

24.04.06

Im Zeitraum von Dezember 2003 bis Oktober 2005 wurden die im Folgenden erläuterten Arbeiten durchgeführt und die beschrieben Ergebnisse erzielt. Die Arbeiten erfolgten in

Anlehnung an den F&E-Plan des Antrages bei der DBU.

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Inhaltsverzeichnis: 1 ANLASS UND ZIELSETZUNG DES PROJEKTS ................................................................................... 4

2 KURZFASSUNG DES BERICHTS ............................................................................................................ 6

3 KLINISCHER BERICHT............................................................................................................................ 9 3.1 EINLEITUNG ............................................................................................................................................. 9 3.2 METHODEN .............................................................................................................................................. 9

3.2.1 Wohnbereich ................................................................................................................................... 9 3.2.1.1 Probenahme ............................................................................................................................................... 10 3.2.1.2 Analytik..................................................................................................................................................... 12

3.2.2 Klinische Untersuchungen ............................................................................................................ 16 3.2.2.1 Anamnese: ................................................................................................................................................. 16 3.2.2.2 Fragebogen: ............................................................................................................................................... 16 3.2.2.3 Körperliche Untersuchung:........................................................................................................................ 16 3.2.2.4 Laboruntersuchungen: ............................................................................................................................... 17 3.2.2.5 Allergologische Untersuchungen:.............................................................................................................. 17 3.2.2.6 Lungenfunktionsanalyse:........................................................................................................................... 17

3.3 ERGEBNISSE........................................................................................................................................... 18 3.3.1 Klinische Untersuchungen ............................................................................................................ 18 3.3.2 Wohnraumuntersuchungen............................................................................................................ 20 3.3.3 Statistische Auswertungen............................................................................................................. 22

3.3.3.1 Zusammenhänge zwischen klinischen Befunden und kulturellem Schimmelnachweis in der Wohnung .. 22 3.3.3.2 Zusammenhänge zwischen klinischen Befunden und Glucannachweis im Hausstaub .............................. 27 3.3.3.3 Zusammenhänge zwischen Staub-CFU und Glucankonzentration ............................................................ 28

3.3.4 Nachbefragung.............................................................................................................................. 33 3.4 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................................. 34

4 ELISA-ENTWICKLUNG .......................................................................................................................... 35 4.1 METHODEN ZUR ELISA-ENTWICKLUNG................................................................................................ 37

4.1.1 Herstellung von Hapten-Konjugaten für die Immunisierung ........................................................ 37 4.1.2 Gewinnung polyklonaler β-Glucan-Antikörper............................................................................. 37 4.1.3 Optimierung des ELISAs ............................................................................................................... 38

4.1.3.1 Plattenbeschichtung (Coating)................................................................................................................... 38 4.1.3.2 Austestung verschiedener Blockaden und der Plattenkonservierung......................................................... 38 4.1.3.3 Auswahl weiterer Reagenzien und Optimierung der Testbedingungen ..................................................... 39 4.1.3.4 Strategien zur Optimierung der Kit-Haltbarkeit ........................................................................................ 39

4.2 RESULTIERENDE REAGENZIENZUSAMMENSETZUNG DER ELISA-TESTS ................................................ 40 4.2.1 Herstellung der beschichteten Mikrotiterplatten........................................................................... 40 4.2.2 Darstellung der Kit-Reagenzien.................................................................................................... 42 4.2.3 Darstellung der Kit-Konzepte ....................................................................................................... 43 4.2.4 Ergebnisse und resultierende Vorschriften zur Durchführung des ELISAs zur Analytik von Staubproben .................................................................................................................................................. 45

4.2.4.1 Testdurchführung ...................................................................................................................................... 45 4.2.5 Schematische Darstellung des ELISA-Formats............................................................................. 46

4.3 ERGEBNISSE ZUR ELISA-VALIDIERUNG................................................................................................ 46 4.3.1 Charakterisierung und Validierung des ELISAs zur Erfassung von β-(1→3)-Glucanen.............. 46

4.3.1.1 Erstellung der Standardkurve .................................................................................................................... 46 4.3.1.2 Spezifität und Kreuzreaktionen zu anderen Glucanen ............................................................................... 47 4.3.1.3 Bestimmung der β-(1→3)-Glucangehalte verschiedener kultivierter Schimmelpilzspezies...................... 49

4.4 METHODEN ZUR AUFBEREITUNG VON STAUBPROBEN ........................................................................... 50 4.5 ERGEBNISSE ZUR VALIDIERUNG DER ELISA-ANALYTIK MIT STAUBPROBEN ALS MATRIX ................... 51

4.5.1 Linearität von Verdünnungsreihen................................................................................................ 52 4.5.2 Wiederfindungsmessungen mit bekannten Staubproben ............................................................... 53

4.6 MODIFIZIERTE METHODEN ZUR SAMMLUNG VON STAUBPROBEN.......................................................... 54 4.7 ERGEBNISSE ZUR METHODIK PRAKTIKABLER STAUBPROBENSAMMLUNGEN ......................................... 57 4.8 MESSUNG DER Β-(1→3)-GLUCAN-KONZENTRATIONEN VON STAUBPROBEN, DIE VON DER UMWELTAMBULANZ GESAMMELT WURDEN....................................................................................................... 58

4.8.1 Vergleich von Endotoxin- und β-(1→3)-Glucankonzentrationen ................................................. 60

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5 TESTSTREIFENENTWICKLUNG ......................................................................................................... 63 5.1 TESTSTREIFEN AUFBAU ......................................................................................................................... 63 5.2 PRINZIP DES TESTSTREIFENS.................................................................................................................. 64 5.3 METHODIK ZUR OPTIMIERUNG DES LATERAL-FLOW-TESTSTREIFENS ................................................... 65

5.3.1 Optimierung des Probenpuffers .................................................................................................... 65 5.3.2 Optimierung der Antigenlösung zur Herstellung der Fängerlinie ................................................ 65 5.3.3 Variationen in der Beschichtungskonzentration und Zusammensetzung der Beschichtungslösung für Kontrolllinie ............................................................................................................................................ 66 5.3.4 Conjugate Release Pads (CRPs) ................................................................................................... 66 5.3.5 Variationen in der Linienhöhe ...................................................................................................... 66 5.3.6 Auswahl geeigneter Membrantypen .............................................................................................. 67 5.3.7 Sample Pads .................................................................................................................................. 67

5.4 ERGEBNISSE DER TESTSTREIFENENTWICKLUNG..................................................................................... 67 5.4.1 Zusammensetzung der optimierten Lösungen nach dem gegenwärtigen Stand............................. 68

6 VALIDIERUNGSVERSUCHE MITTELS HPLC .................................................................................. 70

7 DISKUSSION.............................................................................................................................................. 72 7.1 Β-(1→3)-GLUCAN-ELISA-TEST ........................................................................................................... 72

7.1.1 Single-Spezies-Untersuchungen .................................................................................................... 72 7.1.2 Probennahme und Auswertung von Staubproben sowie klinische Bewertung der Resultate ........ 73 7.1.3 Analytik von Baumaterialien ......................................................................................................... 75 7.1.4 Geplante weitere Anwendungen des β-Glucan-ELISAs ................................................................ 76

7.2 ETABLIERUNG UND KÜNFTIGE ANWENDUNG DES β-GLUCAN-TESTSTREIFENS ...................................... 78 7.3 QUALITÄTSKONTROLLE, ERGÄNZENDE HPLC-ANALYTIK UND ERSTELLUNG VON SOPS ..................... 79

8 FAZIT .......................................................................................................................................................... 80

9 KOOPERATIONEN, ÖFFENTLICHKEITSARBEIT UND VERMARKTUNGSAKTIVITÄTEN.. 81

10 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................................... 83

11 ANHANG................................................................................................................................................. 87

Anlage 1: Protokoll Wohnraumbegehung Anlage 2: Probenahme in der Wohnung des Patienten Anlage 3: Bewertungshilfe von Staubproben Anlage 4: Berechnung von 0,95-Konfidenz- und Prognoseintervallen Anlage 5: Instructions to: SensioMold ELISA β-Glucan Enzyme Immunoassay Kit Anlage 6: Instructions to: Dust Collector zur unkomplizierten Staubprobensammlung Anlage 7: Poster zur Testentwicklung

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1 Anlass und Zielsetzung des Projekts Das gehäufte Auftreten gesundheitlicher Beschwerden in feuchten bzw. schimmeligen Wohnungen wurde in zahlreichen Studien beschrieben (Pirhonen, Nevalainen et al. 1996; Kollar, Reinhold et al. 1997; Rylander 1997; Andriessen, Brunekreef et al. 1998; Hirvonen, Ruotsalainen et al. 1999; Mücke und Lemmen 1999; Rylander 1999; Douwes, Zuidhof et al. 2000; Moriske 2001). Berichtet wird über Erkrankungen der Atemwege aber auch über allgemeine unspezifische Befindlichkeitsstörungen. Schimmelpilze wirken infektiös, allergen und entzündlich-toxisch. Echte Infektionen der Atemwege (z.B. Pneumonien) mit Schimmelpilzen stellen hauptsächlich ein Problem bei immunsupprimierten Patienten dar z.B. mit Leukämie, Lymphom, nach Organtransplantationen. Die Kolonisierung bzw. Infektion erfolgt durch Inhalation der Pilzsporen. Schimmelpilze führen zu allergischen Reaktionen vom Typ I (Rhinitis, Konjunktivitis, Asthma bronchiale) und Typ III (exogen-allergischer Alveolitis). Eine Sonderform stellt die allergische bronchopulmonale Aspergillose dar. Der Zusammenhang zwischen einer Schimmelpilzbelastung im Wohnbereich und kindlichen Atopien ist inzwischen gut belegt (Loidolt, Gailhofer et al. 1989). Mehrere Studien (Andriessen, Brunekreef et al. 1998; Garrett, Rayment et al. 1998) zeigten eine positive Korrelation zwischen einer erhöhten Raumluftkonzentration an Schimmelpilzen und kindlichem Asthma bronchiale. Von 209 asthmatischen Kindern reagierten 14% im Hauttest auf Schimmelpilze (Moriske 2001). Asthma ist die Hauptmanifestation von IgE-vermittelten Pilzallergien, da Schimmelpilzsporen mit einem Durchmesser < 10 µm direkt in den Bereich der Bronchiolen gelangen. Pilzsporen können auch obere Atemwegssymptome in Form einer Typ I Rhinitis und Konjunktivitis auslösen. Eine Untersuchung in einer HNO-Klinik bei Patienten mit Inhalationsallergien ergab eine Prävalenz von Pilzsporenallergien von 3%. Über entzündlich-toxische Wirkungen ist noch wenig bekannt. Sie werden in Zusammenhang gebracht mit Mykotoxinen, sog. MVOCs (microbial volatile organic compounds) und β-Glucanen. Beschrieben werden Atemwegsbeschwerden und unspezifische Symptome wie Müdigkeit, Kopfschmerzen, Gelenkschmerzen, Schwindel, gastrointestinale Störungen. In der Literatur ist ein Zusammenhang zwischen Schimmelpilzexposition und menschlicher Gesundheit belegt, auch unabhängig von den Allergien (Kollar, Reinhold et al. 1997; Douwes, Zuidhof et al. 2000; Chew, Douwes et al. 2001). Außer den epidemiologischen Studien konnten Untersuchungen anhand der Messung von Entzündungsparametern einen Einfluss der Schimmelpilze auf die Gesundheit nachweisen (Douwes, Doekes et al. 1996). Dharmage et al (Dharmage, Bailey et al. 2001) konnte bei Schimmelexposition in Innenräumen eine erhöhte bronchiale Hyperreagibilität zeigen. Die Zellwand von Schimmelpilzen enthält Glucane, Mannane und weitere Polysaccharide (Gehring, Douwes et al. 2001). (1-3)-beta-D-Glucane sind endotoxinähnliche Zellwandbestandteile mit entzündungsfördernden Wirkungen insbesondere von Pilzen, aber auch einigen Bakterien sowie niederen und höheren Pflanzen (Douwes, Doekes et al. 1996; Douwes, Zuidhof et al. 2000; Chew, Douwes et al. 2001; Milton, Alwis et al. 2001). Beta-verknüpfte Glucane sind die häufigste Form, die in Pilzen auftritt. Von diesen von den Pilzen

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abgeleiteten beta-D-Glucanen wird berichtet, dass sie eine Vielzahl von Aspekten der Immunantwort modulieren (Beijer, Thorn et al. 2002). Thorn (Thorn und Rylander 1998) konnte einen Zusammenhang zwischen der (1-3)-beta-D-Glucan Exposition und einem Anstieg der Allergiehäufigkeit, der Myeloperoxidase im Serum und einem Abfall des Lungenfunktionsparameters FEV1 zeigen. Gewertet wurden diese Befunde als Hinweis auf eine unspezifische Entzündung. Bei Arbeitern in der Müllabfuhr fand sich eine erhöhte Zahl von Blutlymphozyten in Abhängigkeit von der (1-3)-beta-D-Glucan-Konzentration am Arbeitsplatz sowie vermehrt Symptome im Sinne von Diarrhoe, verlegter Nasenatmung und Müdigkeit (Beijer, Thorn et al. 2002). Wan (Wan und Li 1999) fand eine enge Korrelation zwischen (1-3)-beta-D-Glucan und den Beschwerden der Betroffenen, insbesondere Müdigkeit. Rylander (Rylander 1997; 1999) untersuchte Schüler einer Schule mit einem Schimmelproblem im Vergleich zu einer Kontrollschule. In der Problemschule war die Konzentration des (1-3)-beta-D-Glucans signifikant höher, die Schüler hatten vermehrt respiratorische und allgemeine Symptome (Schleimhautirritationen, Husten, Heiserkeit, Müdigkeit, Kopfschmerzen). Hohe (1-3)-beta-D-Glucan-Konzentrationen im Hausstaub führten bei Kindern zu erhöhten Schwankungen bei der Messung des Peak-flows (PEF). Beim Personal einer Tagesstätte mit einem Schimmelproblem wurden Symptome und bronchiale Empfindlichkeit gemessen sowie der (1-3)-beta-D-Glucan-Gehalt in der Raumluft. Nach der Renovierung fielen die (1-3)-beta-D-Glucan-Konzentrationen ab und eine geringere Personenzahl wies eine bronchiale Hyperreagibilität auf. Es besteht somit eine Beziehung zwischen (1-3)-beta-D-Glucan als Indikator der Biomasse und der Symptomausprägung der Patienten (Atemwegssymptome, Müdigkeit, Kopfschmerzen). (1-3)-beta-D-Glucan ist somit ein Risikoparameter. Wie demonstriert, wird die Inhalation von (1-3)-beta-D-Glucan in Zusammenhang mit Beschwerden der oberen Atemwege und der Induktion von Entzündungsparametern gebracht. Ein Zusammenhang zwischen der Höhe der (1-3)-beta-D-Glucan-Konzentration im Umfeld und Symptomausprägung der Patienten, Entzündungsparametern und Lungenfunktion konnte, wie beschrieben, gezeigt werden. Schimmelpilzbelastungen in Innenräumen stellen somit ein ernsthaftes gesundheitliches Risiko für die betroffenen Personen dar und besitzen eine eindeutige umweltmedizinische Relevanz. Da Schimmelbelastungen in direktem Zusammenhang mit möglicherweise erforderlichen Sanierungsmaßnahmen und auch zu Fragestellungen einer gezielten und ausgewogenen Wärmedämmung stehen, sind Routineverfahren zur Abschätzung möglicher Schimmelbelastungen auch für weitere umweltrelevante Fragestellungen von hoher Bedeutung. Bislang gibt es keine einheitlichen Erfassungsmethoden und Bewertungsmaßstäbe für Schimmelbefall in Innenräumen. Insbesondere die sachgemäße Probennahme steht wiederholt in der Diskussion. Die etablierten Verfahren zur differenzierten mikrobiologischen Schimmelanalytik sind zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Für Routineuntersuchungen zur raschen und wirtschaftlichen Detektion möglicher Schimmelbelastungen wurde ein rasches und effizientes Verfahren etabliert. Die etablierte Analytik wird unterschiedlichen Anwendergruppen wie beispielsweise Fachleuten aus der Umweltmedizin kommerziell angeboten werden.

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2 Kurzfassung des Berichts In Innenräumen breiten sich Schimmelpilze zunehmend aus. Sie entstehen in besonderem Maße durch Feuchteschäden und werden durch zu strikte Isoliermaßnahmen und durch schlechtes Lüften in ihrem Wachstum begünstigt. Mehr als 80% seiner Zeit verbringt der Mensch in Innenräumen. Daher ist das Risiko an Erkrankungen, die beispielsweise durch Innenraumallergene ausgelöst werden können, auch nicht zu unterschätzen. Zu den Erkrankungen und Befindlichkeitsstörungen, die mit Schimmelpilzen in Zusammenhang gebracht werden, zählen insbesondere allergische Reaktionen sowie reizende und toxische Effekte. Nach Angaben des Arbeitskreises „Gesundes Wohnen“ werden mikrobiologisch belastete Wohnungen nicht ausreichend untersucht. Dies ist jedoch die Voraussetzung, um das Schadensausmaß einer Belastung abschätzen zu können. Hierfür stehen eine ganze Reihe mikrobiologischer Untersuchungsverfahren zur Verfügung. Diese Verfahren sind jedoch ausgesprochen arbeitsintensiv und erfordern ein hohes Maß an Fachkenntnissen. Deshalb sollte zusätzlich ein Verfahren entwickelt, validiert und kommerziell verfügbar gemacht werden, das für den Routineanwendung geeignet ist und die Analytik auch einer größeren Stichprobenzahl erlaubt. Schimmelwachstum in der Wohnung sollte aus präventivmedizinischen Gründen vermieden werden. Aufgabe der Forschung ist es, die Bedeutung von Schimmelnachweis hinsichtlich der menschlichen Gesundheit zu klären. Die Messung von Schimmelkonzentrationen durch mikrobiologische Methoden erlaubt bisher keinen Rückschluss auf gesundheitliche Wirkungen. Grundvoraussetzung ist deshalb ein methodisch zuverlässiger Schimmelnachweis im Innenraum. Im Rahmen dieses Forschungsprojektes wurde der Schimmelnachweis nach bisher empfohlenen kulturellen Verfahren der Mikrobiologie durchgeführt (Leitfaden zur Vorbeugung, Untersuchung, Bewertung und Sanierung von Schimmelpilzwachstum in Innenräumen des Umweltbundesamtes; Schimmelpilze in Innenräumen – Nachweis, Bewertung, Qualitätsmanagement des Arbeitskreises „Qualitätssicherung – Schimmelpilze in Innenräumen“ am Landesgesundheitsamt Baden-Württemberg). Für den methodisch zuverlässigen Nachweis wurde mit β-Glucan eine Komponente ausgewählt, die in Schimmelpilzen, bzw. Schimmelsporen praktisch ubiquitär vorkommt und daher als Marker für Schimmelpilzwachstum herangezogen werden kann. Zudem besitzt β-Glucan eine eindeutige gesundheitliche Relevanz. Mit β-Glucan wird neben keimfähigem auch nicht mehr keimfähiges Material nachgewiesen, was aufgrund der möglichen Wirkungen auch nicht mehr keimfähigen Materials auf die Gesundheit durchaus vorteilhaft ist. Ein ELISA zum Nachweis von β-Glucanen als gesundheitsrelevantem Marker für Schimmelpilze (Schimmelpilze, Schimmelpilzsporen, keimfähiges und nicht keimfähiges Material) wurde etabliert, optimiert und validiert. Es steht ein sensitiver, hochspezifischer und robuster ELISA-Test zur Verfügung. Optimierungsschritte zur ausreichenden Lagerfähigkeit aller einzelnen Kit-Bestandteile sind abgeschlossen. Die Konzeption des Test-Kits ist fertig gestellt und steht als Prototyp zur Verfügung.

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Ein Verfahren zur Bestimmung von Staubproben ist etabliert. Dabei geht es um eine sachgemäße Probennahme, Probenaufarbeitung und Probenanalytik. Staubproben aus Wohnräumen von 100 Patienten wurden sachkundig genommen, aufgearbeitet, im ELISA analysiert und mikrobiologisch kultiviert. Personen, die gesundheitliche Störungen durch Schimmel in der Wohnung vermuteten, wurden in der Umweltambulanz internistisch und allergologisch untersucht. Die Ergebnisse der klinischen Untersuchungen wurden statistisch auf Zusammenhänge mit dem Nachweis von Schimmel in der Wohnung überprüft. Die Probennahme wurde für die Zielsetzung einer breiten und praktikablen Anwendbarkeit des ELISA-Test-Kits zur Bestimmung von Staubproben vereinfacht und standardisiert. Hierfür wurden Maßnahmen zur Erleichterung der Extraktion und insbesondere zur unkomplizierten Probennahme erarbeitet. Die Probennahme stellt bei nahezu allen Tagungen einen zentralen Diskussionspunkt dar. Dieser Problematik wird durch die beschriebene Standardisierung mit Hilfe von definierten Verfahren zur Sammlung von Staub begegnet. Neben der Vereinfachung des Verfahrens zur unkomplizierten Sammlung von Staubproben (s. Anlage 6) wurde auch die Bestimmung von stärker kontaminierten und weniger stark kontaminierten Baumaterialien exemplarisch erprobt. Da in der Baubiologie Bedarf an schnellen und wirtschaftlichen Testmöglichkeiten besteht, soll die Beurteilung von Baumaterialien auf Schimmelpilzbelastung künftig weiter validiert und angeboten werden. Die β-Glucananalytik könnte im Bereich von Gebäudesanierungen künftig eine wichtige Rolle spielen. Während des Förderzeitraums hat die β-Glucananalytik in Staubproben eine zentrale Rolle gespielt. Die Analytik soll auf unterschiedliche Materialien und Oberflächen bedarfsorientiert ausgeweitet werden. Die Etablierung von Lateral-Flow-Teststreifen ist noch nicht abgeschlossen, doch konnten erste Prototypen hergestellt werden. Die Optimierung und Validierung der Lateral-Flow-Tests, sowie die Anpassung an die jeweils spezifischen Applikationen, wird über den Förderzeitraum hinaus weiter verfolgt werden. Ein Technologietransfer, der mit einem US-amerikanischen Unternehmen vereinbart wurde, bietet Grundlagen für die bestmögliche Technologie und Unabhängigkeit von externen Patentansprüchen. Für die geplante Produktion der etablierten Nachweissysteme wird es erforderlich sein, ein entsprechendes Qualitätsmanagement verfügbar zu haben. Einige der Voraussetzungen dafür, wie die Erstellung von SOPs, ist in weiten Zügen erstellt. Da im Rahmen von Zertifizierungen wie ISO 9000 oder für eine CE-Kennzeichnung unabhängige Kontrollmethoden zur Verifizierung erforderlich sein werden, wurden die methodischen Vorraussetzungen für eine entsprechende β-Glucan-HPLC-Analytik geschaffen. Zusammenfassend wurden folgende Arbeiten durchgeführt: Entwicklung eines ELISAs zum Nachweis von β-Glucan

- Gewinnung β-Glucan-spezifischer Antikörper - Darstellung unterschiedlicher Protein-Glucan-Konjugate - Optimierung des ELISA-Tests - Etablierung geeigneter Puffersysteme - Stabilisierung der Reagenzein

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Etablierung und Optimierung der Probenahme und der Probenvorbereitung

- Etablierung der Gewinnung von Staubproben in Innenräumen - Methodenmodifizierungen zur praktikablen Gewinnung von Staubproben - Vorversuche zur Anwendung der ELISA-Analytik für weitere Probentypen

(zusätzlich zu den Staubproben) - Etablierung und Optimierung der Probenvorbereitung

Darstellung eines ELISA-Kit-Prototypen zur Staubanalytik

- Etablierung eines konfektionierten ELISA-Test-Kits - Erstellung einer Anleitung (Anlage 5) zum Test-Kit und zur Sammlung von

Staubproben (Anlage 6) - Vorarbeiten zur Erstellung von SOPs für die geplante Produktion - Vorabeiten für eine ergänzende HPLC-Analytik zur Validierung

Pantientenbezogene Untersuchungen

- Etablierung der mikrobiologischen Schimmelpilzanalytik am Klinikum mit Technologietransfer vom LGA Baden-Württemberg

- Klinische Untersuchungen von 100 Patienten mit spezifischen Symptomen - Mikrobiologiosche Untersuchungen von Staubproben auf Schimmelbelastung der

100 Patienten - β-Glucan-Analytik mit dem etablierten ELISA der Staubproben der 100 Patienten - Statistische Auswertung des gesamten Datenmaterials

Arbeiten zur Etablierung eines Anti-β-Glucan-Teststreifens

- Herstellung von Goldkonjugaten für einen Lateral-Flow-Teststreifen - Etablierung eines vorläufigen Prototypen, der bezüglich seiner Empfindlichkeit

noch weiter zu optimieren ist Produktvermarktung

- Knüpfung von verschiedenen, teilweise internationalen Kontakten zur Produktvermarktung sowie Vorbereitung der Produktpräsentation in Netzwerken.

- Ausrichtung und Besuche verschiedener fachspezifischer Veranstaltungen mit Vorträgen und Posterpräsentationen

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3 Klinischer Bericht Klinikum Augsburg, Umweltambulanz

3.1 Einleitung Die gesundheitliche Bedeutung von Schimmelbefall im Wohnraum soll untersucht werden. Dazu werden Personen, die vermeintlich durch Schimmel krank sind, klinisch abgeklärt. Voraussetzung ist ein methodisch korrekter Nachweis von Schimmel in der Wohnung. Hierzu werden die derzeit anerkannten Methoden herangezogen. Nach derzeitigem Stand der Wissenschaft sind die kulturellen Methoden am besten überprüft. Ein standardisiertes Messverfahren zum Schimmelnachweis im Innenraum steht für den umweltmedizinischen Bereich nicht zur Verfügung. Untersucht werden Pilzkulturen aus Luft und Staubproben sowohl quantitativ als auch qualitativ. Da es kein Verfahren zum Nachweis von Schimmelpilzen gibt, das einen eindeutigen Nachweis in allen Situationen erbringt, wird parallel zu den kulturellen Verfahren die entnommene Staubprobe aus dem Wohnraum durch die Firma Sension mittels eines neuen immunologischen Verfahrens untersucht. Die klinische Diagnostik beinhaltet internistische und allergologische Spezialuntersuchungen, die zur Abklärung möglicher allergischer, irritativer oder toxischer Wirkungen von Pilzen zur Verfügung stehen. Patienten, die in der Umweltambulanz vorstellig werden und bei denen Verdacht auf eine Schimmelpilzproblematik besteht, werden im Rahmen des Projektes untersucht. Ist in der Wohnung tatsächlich Schimmel nachweisbar, wird der Patient der schimmelbelasteten Gruppe zugeordnet. Die Beschwerden dieser Patienten werden verglichen mit den Patienten, die sich zwar krank fühlen, bei denen aber objektiv kein Schimmel in der Wohnung nachweisbar ist.

3.2 Methoden Die Untersuchungen gliedern sich in 2 Bereiche:

• Wohnbereich • Klinische Untersuchungen

3.2.1 Wohnbereich Die Untersuchung des Wohnraums setzt sich aus einer Ortsbegehung mit Besichtigung der Räumlichkeiten und Erhebung physikalischer Faktoren sowie der eigentlichen Probenahme von repräsentativen Staub- und Luftproben zusammen. Die Bearbeitung der Proben erfolgt im Labor des Klinikums Augsburg.

Zur Untersuchung des Wohnbereichs wird vor Begehung durch die Umweltambulanz ein Termin mit dem Patient vereinbart. Der Patient wird wie folgt informiert:

- Der zu untersuchende Raum muss mit einem Teppichboden bzw. einem Teppich

ausgelegt sein. Wenn kein Teppichbelag vorhanden ist, kann auch ein Teppich od.

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Läufer mit mindestens 1 m² aus einem anderen Raum für die Zeit der Beprobung in das Zimmer gelegt werden. Dieser sollte jedoch vorher gründlich abgesaugt werden.

- 7 Tage vor dem vereinbarten Untersuchungstermin dürfen keine Reinigungsarbeiten

mehr in dem zu untersuchenden Raum durchgeführt werden (Staubwischen, Staubsaugen, etc.). Die Fenster müssen 6 – 8 Std. vor dem Termin geschlossen sein.

- Am Untersuchungstag wird der Patient vor der Abfahrt nochmals kontaktiert um

sicher zu stellen, daß die geforderten Maßnahmen eingehalten wurden und somit der Termin auch eingehalten werden kann.

- Falls sich der Patient nicht an die vorgegebenen Maßnahmen hielt, wird ein neuer

Termin vereinbart und der Patient nochmals darauf hingewiesen, dass ohne Einhaltung der verlangten Maßnahmen eine Beprobung der Räume nicht stattfinden kann.

Zum geplanten Zeitpunkt fahren zwei Mitarbeiter der Umweltambulanz zur Wohnung des Patienten.

3.2.1.1 Probenahme Ortsbegehung Eine genaue Wohnraumanamnese wird erhoben, die Baudaten, Lüftungsverhalten, Beobachtungen der Bewohner im zeitlichen Verlauf beinhalten. Die Betroffenen besichtigen mit den Mitarbeitern der Umweltambulanz die auffälligen Stellen. Physikalische Parameter (Feuchtigkeit, Temperatur) werden in den zu beprobenden Räumlichkeiten aufgenommen.

Abbildung 1: Sichtbarer Schimmelfleck an Schrankhinterwand.

Diese sowie die weiteren Schritte werden in einem Probenahmeprotokoll festgehalten (Anlage 1). In einem zweiten Schritt erfolgt die eigentliche Probenahme, die im Detail in Anlage 2 beschrieben ist. Routinemäßig werden in jeder Wohnung Luft- und Staubproben durchgeführt.

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Luftprobe: Der Raum mit fraglichem Schimmelbefall und die Außenluft werden beprobt mittels eines Luftkeimsammlers (RCS, Fa Biotest), der auf dem Impaktionsprinzip beruht. Ein voreingestelltes Luftvolumen wird angesaugt. Die Pilzsporen gelangen so auf ein im Gerät befindliches Nährmedium. Die Probe im Raum wird in ca. 1,20 m Höhe entnommen, die Außenluft ca. 1 m außerhalb des beprobten Raumes.

Abbildung 2: Vorbereitung des Luftkeimsammlers

Staubprobe: Im fraglich schimmelbefallenen Raum wird eine repräsentative Stelle ausgesucht. Gesaugt wird der Teppichboden oder ein Teppich, da hier eine höhere Staubdichte zu erwarten ist. Verwendet wird ein Industriestaubsauger, der freundlicherweise vom Landesgesundheitsamt Baden-Württemberg zur Verfügung gestellt worden ist. Die beprobte Fläche beträgt 1 m2.Der Filterhalter enthält einen Gelatinefilter, an dem sich der gesammelte Staub abschlägt. Der Filterhalter ist desinfizierbar und wird nach jeder Anwendung aufbereitet.

Abbildung 3: Staubsammlung

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Abklatschprobe Bei sichtbarem Schimmelbefall wird zusätzlich eine Abklatschprobe der betroffenen Stellen angefertigt. Ein Nährmedium wird leicht gegen die Oberfläche der befallenen Stelle angedrückt.

Abbildung 4: Sichtbare Schimmelecke zwischen Fenster und Türe an Hauswand

3.2.1.2 Analytik

Am gleichen Tag erfolgt die Aufarbeitung. Im Labor werden folgende Untersuchungen durchgeführt:

Staub:

a) Die Staubprobe wird mit dem 100-fachen ihres Gewichtes mit einer 0,9% NaCl / 0,01% Tween 80 Lsg. versetzt und 30 min. geschüttelt bzw. gerührt (Magnetrührer). Dabei löst sich die Gelatine auf. Jeweils 100 µl der erhaltenen Suspension und weiterer Verdünnungen von 1:10, 1:100 (1:1000) werden auf jeweils zwei DG 18-Agar Platten und jeweils zwei Malzextraktplatten ausgespatelt.

b) Als Bebrütungstemperatur wird 25° +/- 3° C eingestellt

c) Schimmelpilze können sich gegenseitig in ihrem Wachstum behindern. Daher sollten auf Platten, die ausgewertet werden sollen, nicht mehr als 100 KBE pro Platte vorhanden sein. Spezielle Gattungen wie z. B. Chrysonila, Botrytis, Mucor, Rhizopus, Trichoderma und auch die Spezies Aspergillus niger können die Platte sehr schnell überwuchern. Ich solchen Fällen sind rechtzeitig Subkulturen anzulegen.

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d) Bestimmung der Gesamt-KBE

Zur Bestimmung der Gesamt-KBE werden je nach Wachstum die Kolonien in der Regel ab dem 3. Tag täglich ausgezählt. Mindestens 10, besser 20 KBE und höchstens 100 KBE pro Platte sollen ausgezählt werden. Hier lassen sich die Kolonien oft am besten quantifizieren. Zur Bewertung kommt die Auszählung mit der höchsten Anzahl KBE, bei der noch keine Sekundärsporen auftreten. Je nach Belastung des Objekts, den zu erwartenden Schimmelpilzen und vor allem dem gewählten Nährmedium kann die Bebrütungszeit bis zu 10 Tagen und länger dauern. Zur Bestimmung der Gesamt-KBE-Zahl wird in der Regel das Ergebnis der DG-18 Platten verwendet. Schimmelpilze die auf DG-18 nicht kultiviert werden können, wie z. B. Stachybotrys chartarum oder Chaetomium spp. werden auf Malzextrakt kultiviert, ausgezählt und zu der auf der DG-18 Platte ermittelten KBE-Zahl zur Gesamt-KBE-Zahl zusammengeführt.

Abbildung 5: Auswertung der Kulturplatten im Labor

e) Differenzierung

• Die Differenzierung der Schimmelpilzspezies erfolgt aufgrund der Morphologie des makroskopischen und mikroskopischen Bildes.

Abbildung 6: Verschiedene Pilzkolonien auf Kulturplatte

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Indikatororganismen sind auch bei geringer Anzahl zu differenzieren und zu quantifizieren. Die Schimmelpilzspezies müssen in allen Verdünnungsstufen ausgewertet werden und in die Beurteilung mit einfließen. Dazu ist in den niedrigen und hohen Verdünnungsstufen eine semiquantitative Bewertung zur Quellenauffindung unabdingbar.

Abbildung 7: Aspergillus fumigatus

• Als Methode zum mikroskopischen Nachweis wird das Klebefilmpräparat genutzt. Die Präparation kann mit Baumwollblau bzw. Lactophenolblau angefärbt werden.

Abbildung 8: Kulturplatte

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^ Abbildung 9: Mikroskopische Darstellung

• Die Differenzierung erfolgt mit Hilfe mehrerer Handbücher über Differenzierungsschlüssel

Luft:

Die Luftkeimindikatoren für Innen- und Außenluft werden bei 25 +/- 3 °C bebrütet. Die Auszählung erfolgt makroskopisch. Eine Berechnung der Koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Kubikmeter (m³) findet nach folgender Gleichung statt:

)(1000l) 200 bzw. (100men Sammelvolu teseingestell

dikatorLuftkeimin pro KBE/ 3 LitermKBE ×=

Aufgrund des makroskopischen und mikroskopischen Befundes werden die Pilze weiter differenziert.

Abklatsch:

Die Abklatschprobe wird bei 25 +/- 3 °C kultiviert.

Je nach Wachstum werden die Kolonien ab dem dritten Tag täglich ausgezählt. Die Bebrütungszeit kann bis zu 10 Tagen dauern. Gewachsene Kolonien werden auf DG18 u. Malzextrakt-Platten isoliert.

Die Differenzierung erfolgt mikroskopisch.

Nach Auswertung der Kulturen werden die Ergebnisse schriftlich der Umweltambulanz vorgelegt.

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3.2.2 Klinische Untersuchungen

Die Patienten stellten sich zum vereinbarten Termin in der umweltmedizinischen Ambulanz vor. Hier wurden folgende Untersuchungen durchgeführt:

3.2.2.1 Anamnese:

Jetzige Beschwerden, frühere Erkrankungen, Sozialanamnese (einschließlich einer genauen Beschreibung des Lebensumfeldes).

Abbildung 10: Gespräch mit Patient

3.2.2.2 Fragebogen:

Der Patient füllte einen Fragebogen aus, in dem eingehende Angaben zu Beschwerden, Lebensgewohnheiten, Ernährungsgewohnheiten, Lebensumfeld, Wohnbereich, Arbeitsbereich, Krankheitsanamnese, bisherigen Behandlungen und Arztbesuche erhoben werden.

3.2.2.3 Körperliche Untersuchung:

Es wurde ein Ganzkörperstatus durchgeführt. Schwerpunktmäßig wurden die oberen und unteren Atemwege und Hautbefunde erfasst.

16

3.2.2.4 Laboruntersuchungen: Bestimmt wurden Blutsenkungsgeschwindigkeit, C-reaktives Protein, Kleines Blutbild, Differentialblutbild, Elektrophorese.

3.2.2.5 Allergologische Untersuchungen:

Bei jedem Patienten wurden Hauttestungen in Form eines Prick-Testes durchgeführt auf: Schimmelpilze (Alternaria alternata, Aspergillus fumigatus, Cladosporium herbarum, Penicillium notatum, Penicillium expansum), Hausstaubmilben und Katzenhaare, bei Vorhandensein eines Haustieres entstprechende Tierhaare, ab 1/05 zusätzlich Aureobasidium pullulans, Mucor mucedo, Botrytis cinerea.

Zusätzlich wurden Blutuntersuchungen durchgeführt hinsichtlich Allergie: Gesamt IgE, Eosinophiles kationisches Protein, Tryptase, spez. IgE Antikörper auf Schimmelpilze: Gruppe Schimmel (Penicillium notatum, Cladosporium herbarum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Alternaria tenuis) und Hausstaubmilbe, ab 5/04 (50. Teilnehmer) zusätzlich Mucor racemosus, Rhizopus nigricans, Phoma betae.

Abbildung 11: Hauttest

3.2.2.6 Lungenfunktionsanalyse:

Da Schimmelpilze zu Lungenfunktionseinschränkungen führen können wurde bei jedem Patienten eine Spirometrie, Flussvolumenkurve, zentrale Atemwegswiederstände mittels Occlusionsmethode und Blutgasanalyse durchgeführt.

17

Abbildung 12: Lungenfunktionsanalyse

3.3 Ergebnisse

3.3.1 Klinische Untersuchungen

Das Kollektiv setzte sich aus 37 Männern und 63 Frauen zusammen. Das Durchschnittsalter lag bei 47 Jahren (22 – 79 Jahre). S. Abbildung 13

Altersgruppe männlich weiblich20-29 3 630-39 8 1140-49 7 2350-59 10 1060-69 7 870-79 2 5

0

5

10

15

20

25

20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79A lt ersg rup p e

männlichweiblich

Abbildung 13: Alters- und Geschlechtsverteilung der Patienten

Folgende Erkrankungen des allergischen Formenkreises waren anamnestisch bekannt: 17 Asthma bronchiale, 16 Heuschnupfen, 12 Neurodermitis.

Folgende Beschwerden wurden von den Patienten angegeben (absteigende Reihenfolge):

Beschwerden Zahl der Patienten Prozent %

Kopfschmerzen 57 57%

18

Augenreizungen 53 53 %

Schnupfen 53 53%

Kurzatmigkeit 48 48 %

Hautreizungen 46 46%

Infektähnliche Symptome 46 46%

Tabelle 1: Klinische Beschwerden der Patienten (anamnestische Angabe)

Bei den klinischen Untersuchungen zeigten sich folgende Auffälligkeiten:

Untersuchung Zahl der Patienten Prozent %

Körperliche Untersuchung 58 58%

Entzündungsparameter 35 35%

Gesamt IgE 17 17%

Spirometrie 6 6%

spez. IgE Schimmel 4 4%

Prick-Test Schimmel 1 1%

Tabelle 2: Erhobene Befunde der Patienten (klinische Untersuchung) Bei der körperlichen Untersuchung waren die meisten Auffälligkeiten im Bereich der oberen Atemwege (geröteter Rachen) nachweisbar. Die Entzündungsparameter wurden als auffällig beurteilt, wenn einer der folgenden Werte erhöht war: Blutsenkung, C-reaktives Protein, Elektrophorese, Leukozyten.

Folgende Tabelle zeigt die Ergebnisse der in-vitro Allergiediagnostik.

Patienten

Nummer

Pilz Spezifisches IgE

KU/l (Ref. < 0,34)

RAST-Klasse

53 Cladosporium herbarum

Alternaria tenuis

3

1,6

2

2

59 Rhizopus nigricans 1,3 2

87 Rhizopus nigricans 0,63 1

90 Aspergillus fumigatus

Alternaria tenuis

Rhizopus nigricans

0,46

6,5

0,38

1

3

1

19

Tabelle 3: In-vitro Allergiediagnostik

Aufgeführt sind die 4 Patienten mit erhöhten IgE-Antikörpern gegenüber mindestens einem Pilz.

Die Häufigkeit der Gesamt-IgE Erhöhungen lag im Bevölkerungs-durchschnitt. Spezifische IgE-Antikörper auf Schimmelpilze waren bei 4 Patienten nachweisbar, im Hauttest (Pricktest) wies ein Patient eine eindeutig positive Reaktion auf.

Die Lungenfunktionsanalyse wurde als auffällig beurteilt, wenn eine der folgenden Untersuchungen pathologische Werte zeigte: FVC, FEV1, zentrale Atemwegswiederstände, periphere Flussparameter, Blutgase.

3.3.2 Wohnraumuntersuchungen

Die Bewertung von Schimmel in der Wohnung wurde auf Grund des Leitfadens „Schimmelpilze in Innenräumen – Nachweis, Bewertung, Qualitätsmanagement“ des Landesgesundheitsamtes Baden-Württemberg vorgenommen (Anlage 3). In die Bewertung bezüglich des Vorhandenseins von Schimmel gingen die Ergebnisse der Wohnrauminspektion sowie die kulturelle Bewertung von Luft, Staub und Abklatschproben ein. Es wurde, wie im Leitfaden beschrieben, die Einteilung in:

• Innenraumquelle unwahrscheinlich • Innenraumquelle nicht auszuschließen • Innenraumquelle wahrscheinlich

getroffen, in Abhängigkeit von den jahreszeitlichen Schwankungen.

Folgende Befunde wurden erhoben:

Kein Schimmelnachweis

Schimmelnachweis Schimmel

nicht auszuschließen*

Zahl der Patienten 23 36 41

Tabelle 4: Schimmelnachweis im Wohnraum

*Hinweis für Innenraumquelle, weitere Quellensuche und ggf. Sanierung empfohlen

Bewertungshilfe „Schimmelpilze in Innenräumen“, LGA Baden-Württemberg

Die häufigsten kultivierbaren Pilze im Hausstaub sind in nachfolgender Tabelle dargestellt. Die Häufigkeit unterliegt jahreszeitlichen Schwankungen und ist in absteigender Reihenfolge aufgeführt:

20

Sommer Winter

- Penicillium spp. - Penicillium spp. - Aspergillus spp. - Cladosporium spp. - Cladosporium spp. - Aspergillus spp. - Alternaria spp. - Fusarium spp. - Fusarium spp. - Alternaria spp.

Tabelle 5: Häufigkeit der kultivierten Pilze in jahreszeitlicher Abhängigkeit

Penicillium spp.: Die Gattung Penicillium kommt im gemäßigten Klima insbesondere im Boden vor, kann aber diverse Materialien befallen. Penicillien sind die wichtigsten Lebensmittelverderber. Sie können Allergien und selten Pilzinfektionen auslösen. Die häufigsten Arten sind P. expansum, P. brevicompactum, P. chrysogenum, P. glabrum.

Aspergillus spp.: Aspergillen sind häufige und hinsichtlich der gesundheitlichen Relevanz sehr wichtige Schimmelpilze. Die über 100 bekannten Arten sind ubiquitäre Bewohner des Erdbodens, kommen aber auch in Baumaterialien, Lebensmitteln und Pflanzen vor. Viele Arten produzieren Mykotoxine, können Infektionen und Allergien verursachen. Der medizinisch wichtigste Vertreter ist Aspergillus fumigatus, der thermotolerant ist und aufgrund dessen in Wohnungen bei Erwärmung gute Wachstumsbedingungen vorfindet (z.B. Topfpflanzen über Heizkörpern, Müll). Aspergillus fumigatus kann bei abwehrgeschwächten Personen zu schweren Organmykosen führen. Weitere häufig vorkommende Arten sind A. niger, A. flavus, A. ochraceus, A. terreus, A. restrictus, A. nidulans.

Cladosporium spp.: Cladosporium kommt weltweit auf abgestorbenen Pflanzen und organischen Materialien vor. Cladosporium herbarum ist der häufigste Vertreter der europäischen Luftsporenflora. Er bildet große Mengen an Sporen, die mit dem Wind sehr weit fliegen können. Allergien können ausgelöst werden.

Alternaria spp.: Alternaria gehört zu den Schwärzepilzen und braucht zum Wachstum relativ viel Feuchtigkeit. Die etwa 40 Arten sind verbreitete Materialzerstörer und Lebensmittelverderber. Medizinisch am bedeutsamsten ist Alternaria alternata, der häufig Allergien auslöst.

Fusarium spp.: Fusarien sind weltweit verbreitet und insbesondere am Abbau von Pflanzen beteiligt. Fusarien bilden typischerweise Toxine.

Cladosporium und Alternaria kommen in großer Zahl in der Außenluft vor, deshalb sind ihre Konzentrationen größeren jahreszeitlichen Schwankungen unterworfen. Die Konzentrationen von Aspergillus spp. und Penicillium spp. gelten als relativ stabil im Jahresverlauf.

21

3.3.3 Statistische Auswertungen

In der Literatur sind Zusammenhänge zwischen klinischen Beschwerden und Schimmel-vorkommen beschrieben.

3.3.3.1 Zusammenhänge zwischen klinischen Befunden und kulturellem Schimmelnachweis in der Wohnung

Geprüft wurden klinische Merkmale der Patienten sowie Laborparameter in Bezug auf das Vorhandensein von Schimmel (Ja/Nein/Möglich) im Wohnbereich.

Für vier verschiedene Patientenbeschwerden ergaben sich, separat geprüft, Abhängigkeiten. Es waren dies die folgenden Beschwerden:

• Beschwerden im Nasenbereich (Ja/Nein) • BKS (verändert/nicht verändert) • Gesamt IgE (verändert/nicht verändert) • Schimmel (spez. IgE) (verändert/nicht verändert)

Es wurden also jeweils zwei qualitative Merkmale miteinander verglichen, was jeweils zur Betrachtung einer (2x3)-Kontingenztafel führte. Bei diesen – jeweils größer als (2x2) – Kontingenztafeln ( (2 x 3) – 2 Zeilen, 3 Spalten) wurde eine Teststatistik (χ2-Teststatistik) benutzt, die unter der zu testenden Nullhypothese (Unabhängigkeit zwischen „Vorhandensein der Beschwerde“ und „Schimmelpilznachweis“) asymptotisch χ2-verteilt ist mit (2-1)*(3-1) = 2 Freiheitsgraden. Dieser Test wird im Folgenden mit χ2-Test bezeichnet. Ein Problem bei diesem Test ist also, dass die Teststatistik unter der zu testenden Nullhypothese nur approximativ χ2-verteilt ist. Eine grobe Faustregel besagt nun, dass man bei der χ2-Teststatistik mit einer zufriedenstellenden Annäherung rechnen kann, wenn in jeder Zelle mindestens fünf Beobachtungen vorliegen. Ist diese Faustregel verletzt, so sollte zumindest die „Yarnold-Regel“ (siehe Hartung: „Statistik – Lehr- und Handbuch der angewandten Statistik“, Seite 439) erfüllt sein, welche folgendes besagt (n ist dabei die Anzahl der Summe aller Zellen, in unseren Beispielen war stets n = 100):

„Ist n0 die Anzahl der Zellen in der Kontingenztafel mit Häufigkeit kleiner oder gleich fünf, so sollten alle Häufigkeiten mindestens 5 * n0/n sein, damit die Verteilung der χ2-Teststatistik ausreichend genau durch die χ2-Verteilung beschrieben wird.“

Da in der Praxis das Ergebnis „möglich“ beim Merkmal „Schimmelpilznachweis“ mit größter Wahrscheinlichkeit als ein „JA“ zu interpretieren ist, präsentieren wir auch noch die Ergebnisse für den Fall, dass man die „möglich“-Ergebnisse zu „JA“ nimmt. In diesen Fällen ergeben sich dann (2x2)-Kontingenztafeln. Bei diesen (2x2)-Kontingenztafeln wurde jeweils der sogenannte exakte Test von R.A. Fisher angewandt. Die Anwendung dieses Tests ist in diesen Situationen das Beste, was man machen kann, er ist allerdings nur für (2x2)-Kontingenztafeln konzipiert.

22

Bei den genannten Tests handelt es sich um sogenannte Niveau-α-Signifikanztests. Bei derartigen Niveau-α-Signifikanztests ist grundsätzlich zu beachten, dass nur der Fehler 1.Art (Entscheidung für die Alternativhypothese H1, obwohl in Wirklichkeit die Nullhypothese H0 richtig ist) durch α beschränkt wird, nicht jedoch der Fehler 2.Art (Entscheidung für H0, obwohl H1 richtig wäre). Ergibt sich aufgrund des Tests eine Entscheidung zugunsten H1, so kann man also sagen, dass die Gültigkeit von H1 statistisch erwiesen ist und die Irrtumswahrscheinlichkeit höchstens α beträgt (das Experiment hat in diesem Fall dann also einen signifikanten Widerspruch zur Gültigkeit von H0 ergeben). Liefert der Test dagegen eine Entscheidung für H0, so ist diese rein formal zu sehen (ohne Überzeugungskraft – die Gültigkeit von H0 ist nun also keineswegs statistisch erwiesen). Man kann in diesem Fall lediglich sagen, dass das Experiment keinen signifikanten Widerspruch zur Gültigkeit von H0 ergeben hat („es spricht nichts dagegen“ – jedenfalls nicht signifikant). Sollen mögliche signifikante Unterschiede auch tatsächlich als solche erkannt werden, so wären in diesem Fall weitere Untersuchungen bzw. weitere Tests nötig. Wir testeten stets zum 5%-Niveau (also α = 0.05). (a) „Beschwerden im Nasenbereich“ und „Schimmelpilznachweis“

(2x3)-Tafel:

Beschwerden im

Nasenbereich ↓

Schimmel-pilznachweis →

Nein

Ja

Möglich

Zeilensumme

Nein 13 8 5 26 Ja 10 28 36 74 Spaltensumme 23 36 41 100

Unter Beschwerden im Nasenbereich wurden verlegte Nasenatmung, Niesen, Schnupfen und chronische Nasennebenhöhlenentzündungen zusammengefasst.

Die Durchführung des χ2-Testes ergab, dass zum 5%-Niveau signifikante Zusammenhänge bzw. Abhängigkeiten gesichert sind. Bei Patienten mit Beschwerden im Nasenbereich ist daher signifikant häufiger ein Schimmelpilznachweis (in der Wohnung) feststellbar. Bei diesen war in 37,84 % der Fälle ein Schimmelpilznachweis eindeutig feststellbar, in 48,65 % der Fälle wurde ein solcher als möglich eingestuft. Bei den Patienten ohne derartige Beschwerden war in 30,77 % der Fälle ein Schimmelpilznachweis eindeutig feststellbar, in 19,23 % der Fälle wurde ein solcher als möglich eingestuft. Unter den Patienten, bei denen ein eindeutiger Schimmelpilznachweis feststellbar war, hatten 77,78 % Beschwerden im Nasenbereich, bei Patienten mit Schimmelpilznachweis „möglich“ waren dies sogar 87,80 %, bei Patienten mit Schimmelpilznachweis „Nein“ hingegen nur 43,48 %.

(2x2)-Tafel:

Beschwerden im


Nein

Ja

Zeilensumme

23

Nasenbereich ↓

Nein 13 13 26 Ja 10 64 74 Spaltensumme 23 77 100

Der exakte Test von R.A. Fisher ergab, dass auch hier im oben beschriebenen Sinne zum 5%-Niveau signifikante Zusammenhänge bzw. Abhängigkeiten gesichert sind (Bestätigung des obigen qualitativen Resultates).

(b) „BKS“ und „Schimmelpilznachweis“ (2x3)-Tafel:

BKS ↓


Nein

Ja

Möglich

Zeilensumme

Nicht verändert 23 31 40 94 Verändert 0 5 1 6 Spaltensumme 23 36 41 100

Die Durchführung des χ2-Testes ergab hier zwar signifikante Zusammenhänge bzw. Abhängigkeiten zum 5%-Niveau, jedoch ist dieses Resultat mit äußerster Vorsicht zu genießen, da weder die oben erwähnte Faustregel noch die ebenfalls erwähnte Yarnold-Regel erfüllt sind (siehe die rote Markierung). Die Zellhäufigkeiten sind für eine verlässliche Aussage nicht groß genug. Bei Patienten mit BKS-Resultat „verändert“ war in 83,33 % der Fälle ein Schimmelpilznachweis eindeutig feststellbar, in 16,67 % der Fälle wurde ein solcher als möglich eingestuft. Bei den Patienten mit BKS-Resultat „nicht verändert“ war in 32,98 % der Fälle ein Schimmelpilznachweis eindeutig feststellbar, in 42,55 % der Fälle wurde ein solcher als möglich eingestuft. Unter den Patienten, bei denen ein eindeutiger Schimmelpilznachweis feststellbar war, hatten 13,89 % ein verändertes BKS-Resultat, bei Patienten mit Schimmelpilznachweis „möglich“ waren dies hingegen nur 2,44 % und bei Patienten mit Schimmelpilznachweis „Nein“ sogar nur 0 %.

(2x2)-Tafel:

BKS ↓


Nein

Ja

Zeilensumme

Nicht verändert 23 71 94 Verändert 0 6 6 Spaltensumme 23 77 100

24

Der exakte Test von R.A. Fisher ergab zum 5%-Niveau keine signifikanten Zusammenhänge bzw. Abhängigkeiten (bzw. es war keine klare Entscheidung möglich). Man müsste hier schon eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 20 % zulassen, um behaupten zu können, dass unter den Patienten mit BKS-Ergebnis „verändert“ der Anteil der Patienten mit Schimmelpilznachweis „signifikant“ höher ist als dies unter den Patienten mit BKS-Ergebnis „Nicht verändert“ der Fall ist. Ebenso verhält es sich, was den Anteil der Patienten mit BKS-Ergebnis „verändert“ unter den Patienten mit und ohne Schimmelpilznachweis anbelangt (auch hier α=0.2 für „Signifikanz“ erforderlich).

(c) „Gesamt IgE“ und „Schimmelpilznachweis“ (2x3)-Tafel:

Gesamt IgE ↓


Nein

Ja

Möglich

Zeilensumme


Die Durchführung des χ2-Testes ergab, dass zum 5%-Niveau signifikante Zusammenhänge bzw. Abhängigkeiten gesichert sind. Die oben angesprochene Faustregel ist zwar verletzt, aber zumindest ist die schwächere Yarnold-Regel erfüllt, sodass man das Resultat jedenfalls unter diesem Aspekt als akzeptabel bezeichnen kann. Bei Patienten mit Gesamt-IgE-Resultat „verändert“ war in 64,71 % der Fälle ein Schimmelpilznachweis eindeutig feststellbar, in 17,65 % der Fälle wurde ein solcher als möglich eingestuft. Bei den Patienten mit Gesamt-IgE -Resultat „nicht verändert“ war in 30,12 % der Fälle ein Schimmelpilznachweis eindeutig feststellbar, in 45,78 % der Fälle wurde ein solcher als möglich eingestuft. Unter den Patienten, bei denen ein eindeutiger Schimmelpilznachweis feststellbar war, hatten 30,56 % ein verändertes Gesamt-IgE-Resultat, bei Patienten mit Schimmelpilznachweis „möglich“ waren dies hingegen nur 7,32 % und bei Patienten mit Schimmelpilznachweis „Nein“ waren es 13,04 %.

(2x2)-Tafel:

Gesamt IgE ↓


Nein

Ja

Zeilensumme


Der exakte Test von R.A. Fisher ergab zum 5%-Niveau keine signifikanten Zusammenhänge bzw. Abhängigkeiten. Man müsste hier schon eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 42 % zulassen, um behaupten zu können, dass unter den

25

Patienten mit Gesamt-IgE-Ergebnis „verändert“ der Anteil der Patienten mit Schimmelpilznachweis „signifikant“ höher ist als dies unter den Patienten mit Gesamt-IgE -Ergebnis „Nicht verändert“ der Fall ist. Ebenso verhält es sich, was den Anteil der Patienten mit Gesamt-IgE-Ergebnis „verändert“ unter den Patienten mit und ohne Schimmelpilznachweis anbelangt (auch hier α=0.42 für „Signifikanz“ erforderlich).

(d) „Schimmel (spez. IgE)“ und „Schimmelpilznachweis“ (2x3)-Tafel:

Schimmel (spez. IgE)

↓


Nein

Ja

Möglich

Zeilensumme


Die Durchführung des χ2-Testes ergab hier zwar signifikante Zusammenhänge bzw. Abhängigkeiten zum 5%-Niveau, jedoch ist dieses Resultat mit äußerster Vorsicht zu genießen, da weder die oben erwähnte Faustregel noch die ebenfalls erwähnte Yarnold-Regel erfüllt sind (siehe die rote Markierungen). Die Zellhäufigkeiten sind für eine verlässliche Aussage nicht groß genug. Bei Patienten mit „Schimmel (spez. IgE)“-Resultat „verändert“ war in 100 % der Fälle ein Schimmelpilznachweis eindeutig feststellbar. Bei den Patienten mit „Schimmel (spez. IgE)“-Resultat „nicht verändert“ war in 33,33 % der Fälle ein Schimmelpilznachweis eindeutig feststellbar, in 42,71 % der Fälle wurde ein solcher als möglich eingestuft. Unter den Patienten, bei denen ein eindeutiger Schimmelpilznachweis feststellbar war, hatten 11,11 % ein verändertes „Schimmel (spez. IgE)“-Resultat, bei Patienten mit Schimmelpilznachweis „möglich“ und „nein“ waren dies jeweils 0 %.

(2x2)-Tafel:

„Schimmel (spez. IgE)“

↓


Nein

Ja

Zeilensumme


26

Der exakte Test von R.A. Fisher ergab zum 5%-Niveau keine signifikanten Zusammenhänge bzw. Abhängigkeiten (bzw. es war keine klare Entscheidung möglich). Man müsste hier schon eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 35 % zulassen, um behaupten zu können, dass unter den Patienten mit „Schimmel (spez. IgE)“-Ergebnis „verändert“ der Anteil der Patienten mit Schimmelpilznachweis „signifikant“ höher ist als dies unter den Patienten mit „Schimmel (spez. IgE)“-Ergebnis „Nicht verändert“ der Fall ist. Ebenso verhält es sich, was den Anteil der Patienten mit „Schimmel (spez. IgE)“-Ergebnis „verändert“ unter den Patienten mit und ohne Schimmelpilznachweis anbelangt (auch hier α=0.35 für „Signifikanz“ erforderlich).

Fazit: Auch unter dem Aspekt, dass die „möglich“-Resultate wohl ziemlich sicher ein „JA“ bedeuten, das nur nicht ganz zweifelsfrei nachgewiesen werden konnte, kann man zum 5%-Niveau eigentlich nur hinsichtlich der Beschwerden im Nasenbereich von wirklich signifikanten Zusammenhängen mit dem Merkmal „Schimmelpilznachweis“ sprechen. Allerdings sind aber auch bei den übrigen Merkmalen – auch dies zeigte unsere Auswertung – diesbezügliche Tendenzen zu erkennen. Somit konnte gezeigt werden, dass Personen, bei denen Schimmel in der Wohnung nachweisbar ist, auch häufiger unter Schnupfen leiden, häufiger eine erhöhte Blutsenkungsgeschwindigkeit als Hinweis für eine mögliche entzündliche Reaktion aufweisen und häufiger Hinweise für eine mögliche Allergie liefern.

3.3.3.2 Zusammenhänge zwischen klinischen Befunden und Glucannachweis im Hausstaub

Die vier genannten Patientenbeschwerden, für die sich aufgrund statistischer Tests eine Abhängigkeit zum kulturellen Schimmelnachweis in der Wohnung zeigte, wurden jeweils separat mit dem quantitativen Merkmal „Glucankonzentration“ (pro m2) verglichen. Es waren dies die folgenden Beschwerden:

• Beschwerden im Nasenbereich (Ja/Nein) • BKS (verändert/nicht verändert) • Gesamt IgE (verändert/nicht verändert) • Schimmel (spez. IgE) (verändert/nicht verändert)

Entsprechend dem „Vorhandensein“ bzw. „Nichtvorhandensein“ der jeweiligen Beschwerde wurden die 100 Patienten in zwei Kollektive (Gruppen) aufgeteilt. Wir haben zwei verschiedene Testverfahren benutzt und das qualitative Resultat war bei beiden jeweils dasselbe, nämlich keine signifikanten Zusammenhänge. Da in der Literatur (Gehring) die Auffassung vertreten wurde, dass die Glucankonzentrationsmessungen am besten durch eine Lognormalverteilung beschrieben werden könnten, haben wir die Daten logarithmiert und auf diese logarithmierten Daten den entsprechenden t-Test angewandt. Zur Sicherheit haben wir aber auch zusätzlich einen Test angewandt, der keine speziellen Verteilungsannahmen voraussetzt (verteilungsfrei), nämlich den Wilcoxon-Rangsummentest (auch Mann-Whitney-U-Test gennant), der auf signifikante Verteilungsunterschiede hin prüft.

27

Beide Tests ergaben bei allen vier Merkmalen keine signifikanten Zusammenhänge zur Glucankonzentration.

3.3.3.3 Zusammenhänge zwischen Staub-CFU und Glucankonzentration Die Zahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) als Ergebnis der mikrobiologischen Verfahren wurde auf Zusammenhang mit der Glucankonzentration, bestimmt durch immunologische Methoden, untersucht. Die Einzelergebnisse sind in Abbildung 30 aufgeführt.

(a) Betrachtung des Korrelationskoeffizienten

Da beide Merkmale quantitativ sind, existiert der Korrelationskoeffizient und wir können hierfür Schätzungen berechnen, z.B. den Pearsonschen („gewöhnlichen“) Korrelations-koeffizienten rp oder den Spearmanschen Rangkorrelationskoeffizienten rs. rs entsteht dadurch, dass man in die Formel für rp statt der tatsächlichen Beobachtungen die entsprechenden Rangzahlen (hier von 1 bis 100) einsetzt. Für den tatsächlichen Korrelationskoeffizienten K zweier Zufallsvariabler X (hier Staub-CFU) und Y (hier Glucankonzentration) gilt stets -1 <= K <= 1. Falls X und Y voneinander unabhängig sind, so gilt K=0 (Unkorreliertheit). Es existiert genau dann ein linearer Zusammenhang zwischen X und Y, wenn entweder K=-1 oder K=1 ist. rp ist hinsichtlich Anwendung und Interpretation vor allem bei Normalverteilungs-annahme geeignet. So ist z.B. bei Verwendung von rp die Normalverteilungsannahme Voraussetzung für die Anwendbarkeit der dazugehörigen Signifikanztests. Da davon im vorliegenden Fall nicht ausgegangen werden kann, benutzen wir den (verteilungsfreien) rs und die dazu gehörigen Signifikanztests. Ist rp=1 oder rp=-1, so liegen alle Punkte auf einer Geraden, wobei überhaupt rp lineare Zusammenhänge zwischen X und Y misst bzw. in gewisser Weise den Grad der Linearität zwischen X und Y angibt. Je verstreuter die Punkte liegen, desto näher liegt rp bei 0. Allerdings kann rp unter Umständen auch 0 sein, wenn ein starker nichtlinearer Zusammenhang zwischen X und Y besteht. rs basiert wie gesagt nur auf Rangzahlen und nimmt beispielsweise auch schon dann den Wert 1 an, wenn die Beobachtungen streng monoton wachsend sind, auch wenn kein linearer Zusammenhang besteht. In diesem Fall würde dann also der wahre, aber unbekannte Korrelationskoeffizient K von rs überschätzt. In unserem Fall ergaben sich folgende Werte: rp = 0,1256 rs = 0,2334 Für Signifikanzüberprüfungen benutzten wir also den (verteilungsfreien) Spearmanschen Rangkorrelationskoeffizienten rs und die dazu gehörigen Signifikanztests. Wir

28

betrachteten zwei Testprobleme, nämlich ein zweiseitiges und ein einseitiges. Bei der zweiseitigen Fragestellung lauten Nullhypothese H0 und Alternativhypothese H1 wie folgt: H0: X und Y sind unabhängig, also insbesondere unkorreliert gegen H1: X und Y sind nicht unabhängig und die Korrelation ist entweder positiv oder negativ Das Testergebnis ergab zum 5%-Niveau einen signifikanten Widerspruch zur Gültigkeit von H0, d.h. die Gültigkeit von H1 ist statistisch erwiesen und die Irrtumswahrscheinlichkeit ist höchstens 5 %. Somit haben wir eine signifikante Korrelation zum Niveau 0,05. Steht von VORNHEREIN fest, dass ein etwaiger Zusammenhang zwischen X und Y nur zu einer positiven Korrelation führen kann, so ist es legitim, nur die folgende einseitige Fragestellung zu betrachten: H0’: X und Y sind unabhängig, also insbesondere unkorreliert gegen H1’: Zwischen X und Y besteht eine Abhängigkeit in Form einer positiven Korrelation Das Testergebnis ergab hier sogar schon zum 2,5%-Niveau einen signifikanten Widerspruch zur Gültigkeit von H0’, d.h. die Gültigkeit von H1’ ist statistisch erwiesen (unter der obigen Voraussetzung) und die Irrtumswahrscheinlichkeit ist höchstens 2,5 %. Somit haben wir eine signifikant positive Korrelation zum Niveau 0,025.

(b) Frage: Lässt sich der Zusammenhang in einer bestimmten Form darstellen? Unter der Annahme, dass die x-Werte (Staub-CFU) fehlerfrei gemessen wurden (feste Effekte, keine Zufallsschwankungen), wollen wir einen funktionalen Zusammenhang zwischen y (Glucankonzentration) und x schätzen. Dies führt uns zu einem klassischen Regressionsmodell mit Einflussgröße x als unabhängige Variable und Zielgröße y, welche eine Zufallsvariable ist und von x abhängt? Die Frage ist nur, wie diese Abhängigkeit beschaffen ist! Nach Angaben der Literatur, dass die Glucankonzentrationsmessungen am besten durch eine Lognormalverteilung beschrieben werden könnten, haben wir alle Daten logarithmiert (also sowohl die x-Werte als auch die y-Werte) in der Hoffnung, so zu normalverteilten Daten zu gelangen, bei denen dann die verwendeten Schätzverfahren – wie der Kleinste-Quadrate-Schätzer – noch bessere Gütemerkmale aufweisen. Zudem können bei Bedarf dann bei der Berechnung von Konfidenzbereichen (Bereichsschätzungen, Intervallschätzungen) bzw. beim Testen von Hypothesen über die unbekannten Parameter usw. die bekannten Verfahren benutzt werden. Darüber hinaus vermuteten bzw. hofften wir, hinsichtlich der logarithmierten Daten einen linearen Zusammenhang, also eine Regressionsgerade als Schätzfunktion, unterstellen zu können, wobei der geschätzte Funktionswert an einer Stelle x zu interpretieren ist als der mittlere Wert (Erwartungswert), der für die Zielgröße y zu erwarten ist unter dem

29

Wert x der Einflussgröße. Darüber hinaus unterstellten wir, dass alle Beobachtungen für y (bei jedem Wert x der Einflussgröße) die gleiche (unbekannte und daher zu schätzende) Varianz besitzen.

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

8 9 10 11 12 13 14 15 16

x

y

Abbildung 14: Grafische Darstellung mit Geradenanpassung

x = Nat. Logarithmus Staub-CFU (Einflussgröße) y = Nat. Logarithmus Glucankonzentration (Zielgröße) Geradengleichung: y = - 0,2938387835 + 0,1001130077 * x Hinsichtlich der logarithmierten Daten berechneten wir unter den obigen Voraussetzungen mit Hilfe der Methode der Kleinsten Quadrate die Regressionsgerade – siehe hierzu die Abbildung 14 „Grafische Darstellung mit Geradenanpassung“). An der grafischen Darstellung erkennt man schon rein optisch, dass die Werte eigentlich recht gleichmäßig um die Gerade streuen und der lineare Regressionsansatz so durchaus seine Berechtigung hatte. Geht man also daher nun davon aus, dass der wahre funktionale Zusammenhang durch eine Gerade beschrieben wird (im Sinne des Erwartungswertes – siehe oben), so haben wir also durch die mit Hilfe der Methode der Kleinsten Quadrate ermittelte Regressionsgerade eine Schätzung für die „wahre“ Gerade erhalten. Zusätzlich bildeten wir die normierten Residuen (d) nach folgender Formel: d = (beobachteter Wert – Schätzwert) / geschätzte Standardabweichung d. Beob. Diese normierten Residuen stellten wir dann grafisch dar, wobei an der horizontalen Achse die Schätzwerte (für die Beobachtungen) aufgetragen wurden und an der vertikalen

30

Achse die normierten Residuen – siehe hierzu die Abbildung 15 „Residualanalyse für die logarithmierten Beobachtungen“. Dort zeigt sich, dass die Residuen recht gleichmäßig um die Nullachse verteilt sind, d.h. der lineare Ansatz ist auch hier – beurteilt in den Residuen – sehr gut.

-3

-2

-1

0

1

2

3

4

0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4

y_i^

d_i

Abbildung 15: Residualanalyse für logarithmierte Beobachtungen Natürlicher Logarithmus Glucankonzentration: d_i = Normierte Residuen (y_i’ – y_i^) / s, y_i’ = beobachtete Werte, y_i^ = geschätzte Werte, s = geschätzte Standard abweichung der Beobachtungen

31

Histogramm über die relativen beobachteten Häufigkeiten

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

-2,1744373

-1,4496249

-0,7248124

-1,554E-15

0,72481243

1,44962486

2,17443729

2,89924971

Abbildung 16: Anpassungstest an eine Normalverteilung

Natürlicher Logarithmus Glucankonzentration: Normierte Residuen (y_i’ – y_i^) / s

Das Experiment hat – zum Niveau 0,05 – keinen signifikanten Widerspruch zur Gültigkeit der Normalverteilungshypothese ergeben

Wenn hinsichtlich der logarithmierten Daten unsere Modellannahmen – einschließlich der Normalverteilungsannahme – richtig sind, so müssten – so unsere Überlegungen – die normierten Residuen approximativ unabhängig standardnormalverteilt (N(0,1)-verteilt) sein. Ein Anpassungstest an eine Normalverteilung (zum 5%-Niveau – siehe Abbildung 16) ergab keinen signifikanten Widerspruch zur Gültigkeit der Normalverteilungshypothese, sodass auch diese Annahme nicht unbegründet ist, zumal auch noch das in Anlage 4 zusätzlich graphisch dargestellte Histogramm über die relativen beobachteten Häufigkeiten (dieser normierten Residuen) nicht wirklich unsymmetrisch wirkt (ist allerdings nur eine optische Hilfestellung). Darüber hinaus ergaben im Hinblick auf die normierten Residuen die üblichen Schätzverfahren für Mittelwert, Varianz und Standardabweichung die folgenden Schätzwerte (und diese sind approximativ genau die Werte von N(0,1)): Mittelwert: -0,00000000000000156097357262297 Varianz: 0,989898989898989 Standardabweichung: 0,994936676326182

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Wie bereits erwähnt, ist die ermittelte Regressionsgerade als Schätzfunktion für „mittlere Werte“ und als Schätzung für die „wahre“ zugrunde liegende Gerade zu interpretieren. Auch wenn diese Schätzung eine gute ist (unter Normalverteilungsannahme sogar die sog. „gleichmäßig beste erwartungstreue Schätzung“), so sind hier natürlich Varianzen zu berücksichtigen, so dass wir hinsichtlich des Erwartungswertes von y bei gegebenem x (E[y|x]) nicht nur an „Punktschätzungen“, sondern auch an Bereichsschätzungen (Intervallschätzungen) interessiert sind, welche den tatsächlichen mittleren Wert mit möglichst großer Wahrscheinlichkeit (95 %) enthalten (Konfidenzbereiche). Dies kann man nicht nur für ein ganz bestimmtes x separat machen, sondern auch für alle x gleichzeitig (simultan), wodurch die Intervalle – geringfügig, wie sich zeigte – größer wurden. Darüber hinaus waren wir auch an Prognoseschätzungen (mit Trefferwahrscheinlichkeit 95 %) für eine künftige Beobachtung an einer fest vorgegebenen Stelle x interessiert (also für die konkrete Beobachtung selbst und nicht „nur“ für den „mittleren Wert“). Diese Intervalle waren dann deutlich größer als die Intervallschätzungen für die „mittleren Werte“. Nachdem der Anwender wohl nicht so sehr an den logarithmierten Daten interessiert sein dürfte, sondern an den ursprünglichen, haben wir die im logarithmierten Modell gewonnene Schätzfunktion sowie die weiteren oben erwähnten

Berechnungen auf das ursprüngliche Modell zurücktransformiert. Eine Schätzfunktion für die Zielgröße y in Abhängigkeit von der Einflussgröße x ist dann gegeben durch:

η(x) = a * xb (mittlerer Wert für y unter dem Wert x)

mit a = 0,745396651991778 und b = 0,100113007700041 Für die weiteren Berechnungen und Grafiken verweisen wir auf die Anlage 4 „Berechnung von 0.95-Konfidenz- und Prognoseintervallen“. Zusammenfassend lässt sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Glucankonzentration und der Zahl der koloniebildenden Einheiten im Hausstaub feststellen.

3.3.4 Nachbefragung

Die Patienten mit möglichem oder wahrscheinlichem Schimmelbefall der Wohnung wurden circa 6 Monate nach Studienteilnahme angeschrieben und hinsichtlich ihrer gesundheitlichen Beschwerden und Sanierungsmaßnahmen befragt.

Von den 77 versandten Fragebögen wurden 45 (58%) beantwortet zurückgesandt.

8 Patienten (10%) gaben an, in eine andere Wohnung umgezogen zu sein oder waren „unbekannt verzogen“ Es ist davon auszugehen, dass ein weiterer Anteil der unbeantworteten Fragebögen durch Umzüge zu erklären ist.

Zum Schimmelbefall der Wohnung wurden folgende Aussagen getroffen:

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Anzahl Personen

%

Sichtbarer Schimmel weiterhin vorhanden 20 26

Schimmelbefallene Räume saniert 29 38

- Durch Fremdfirma 6 8

- Selber mit chemischen Mitteln entfernt 18 23

- Selber mechanisch entfernt 10 13

Kein sichtbarer Schimmel vorhanden 11 14

Tabelle 6: Angaben zum Schimmelbefall in der Wohnung im Rahmen der Nachbefragung

Die gesundheitlichen Beschwerden wurden von den Betroffenen wie folgt bewertet:

Gesundheitliche Beschwerden Anzahl Personen

%

- Unverändert 19 25

- Rückläufig 15 19

- Zunehmend 4 5

- Nicht mehr vorhanden (beschwerdefrei) 8 10

Tabelle 7: Angaben zu gesundheitlichen Beschwerden der Betroffenen im Rahmen der Nachbefragung

Die Fragebögen wurden zum Teil unvollständig beantwortet. Dadurch lässt sich die Differenz zur Gesamtzahl der Befragten erklären.

3.4 Zusammenfassung Die Auswertung der 100 untersuchten Patienten konnte einen Zusammenhang zwischen gesundheitlichen Beschwerden und Schimmelnachweis in der Wohnung zeigen und bestätigt damit Beobachtungen epidemiologischer Studien. Der Schimmelnachweis wurde kulturell erbracht nach derzeit anerkannten Methoden. Ein statistischer Test konnte einen Zusammenhang zwischen kulturellem Schimmelwachstum und Glucannachweis im Staub erbringen.

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4 ELISA-Entwicklung Sension GmbH Die ELISA (Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay) – Analytik ist insbesondere im klinisch diagnostischen Bereich seit langem fest etabliert. Die Technologie beruht auf der spezifischen Erkennung des zu bestimmenden Analyten durch Antikörper. Die Antikörper gegen den zu bestimmenden Analyten werden durch Immunisierung gewonnen. Bei relativ kleinen Analyten, wie β-Glucan, werden vorzugsweise kompetitive Assays eingesetzt. Dabei kompetitiert im hier vorgestellten β-Glucan-ELISA-Test das freie Glucan aus Standard- oder Probelösung mit einer konstanten Menge Glucan-Protein-Konjugat, das auf der Mikrotiterplattenoberfläche immobilisiert wurde. Der eigentliche Nachweis erfolgt dann über einen enzymmarkierten Sekundärantikörper. Das Enzym setzt dabei ein chromogenes Substrat um. Gemessen wird die Farbintensität in einem Mikrotiterplatten-Reader. Die Resultate werden über eine spezielle Software ausgewertet. ELISAs sind besonders dann die Methodik der Wahl, wenn die nachzuweisenden Substanzen in einer Routineanalytik hochsensitiv zu detektieren sind. Da Schimmelpilzbelastungen eine zunehmende Problematik darstellen, und die etablierten Nachweis- bzw. Kulturverfahren zeitaufwändig und kostenintensiv sind, wurde ein Routineverfahren zur Feststellung von Schimmelpilzbelastungen entwickelt. Ein ELISA zur quantitativen Bestimmung von β-(1→3)-Glucanen, welche als Marker für Schimmelpilzbelastungen und als gesundheitsrelevante Komponente beschrieben ist (Chew, Douwes et al. 2001; Gehring, Douwes et al. 2001), wurde aufgebaut. Methodische Grundlage war die Arbeit von Douwes et al. (Douwes, Doekes et al. 1996). Der Test und die Probenvorbereitung von Staubproben wurden optimiert, charakterisiert und validiert. Der Stellenwert und die Einordnung des analytischen Verfahrens zu Fragestellungen möglicher Belastungen ist in Abbildung 17 dargestellt.

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Problematik von Schimmelpilzbelastungen

Problematik von Schimmelpilzbelastungen

Sammlung von Staubproben in Wohnungen

Sammlung von Staubproben in Wohnungen

Etablierung einer Schimmelpilz-Routineanalytik in Staubproben

Etablierung einer Schimmelpilz-Routineanalytik in Staubproben

Kontrollierte Gebäudesanierung

Kontrollierte Gebäudesanierung

Bekämpfung der Patientenbeschwerden

Bekämpfung der Patientenbeschwerden

Gezielte Begutachtung von Bausubstanz

Gezielte Begutachtung von Bausubstanz

Verhinderung von Umweltschäden z.B. unnötiger Einsatz von

Fungiziden

Verhinderung von Umweltschäden z.B. unnötiger Einsatz von

Fungiziden

Abbildung 17: Einordnung des β-(1→3)-Glucan-ELISA in die analytischen Aufgabenstellungen zur Quantifizierung möglicher Schimmelpilzbelastungen in Innenräumen.

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4.1 Methoden zur ELISA-Entwicklung Bei der Etablierung eines ELISA-Tests sind grundsätzlich verschiedene Testformate möglich. Dabei sind Testqualitätsmerkmale wie Sensitivität, Reproduzierbarkeit, Wirtschaftlichkeit bei der Kit-Herstellung im größeren Maßstab und Anwenderfreundlichkeit (kurze Inkubationszeiten, unkomplizierte Probenvorbereitung) von Bedeutung. Spezielle, nicht kommerziell verfügbare Schlüsselreagenzien sind erforderlich. Diese müssen hergestellt, im System erprobt und aufeinander abgestimmt werden. Die Antikörper stellen das wichtigste Element dar und determinieren weitgehend die Sensitivität und die Spezifität des Tests.

4.1.1 Herstellung von Hapten-Konjugaten für die Immunisierung Da β-Glucane nicht ausreichend hochmolekular sind, um eine Immunantwort und die Antikörperproduktion auslösen zu können, gelten sie als Hapten und mussten zunächst kovalent an ein hochmolekulares Trägermolekül gekoppelt werden. Dazu wurde Laminarin durch reduktive Aminierung mittels Borsäure und Cyanoborohydrid während einer 24-stündigen Inkubation bei 50°C an Bovines Serum Albumin (BSA) gekoppelt (Douwes, Doekes et al. 1996). Die mehrstufige Kopplungsreaktion bestand aus mehreren Einzelreaktionen, die sich jeweils nur schwer auf einen erfolgreichen Reaktionsumsatz überprüfen ließen. Nach mehreren Arbeitsschritten wie Sephadex-Säulenreinigung und Zentrifugation, sowie Filtration zur quantitativen Entfernung des präzipitierten Materials (denaturiertes Protein und weitere feinsuspendierte Präzipitate), wurden unkonjugierte und weitere niedermolekulare Komponenten durch Dialyse entfernt. Es wurde eine Reihe dieser Konjugate in modifizierten Verfahren der Kopplungsreaktionen hergestellt. Eines der resultierenden Konjugate wurde nach Prüfung durch Elektrophorese zur Immunisierung ausgewählt. Es konnte in der Elektrophorese nachgewiesen werden, dass sich ein hochmolekulares Konjugat gebildet hatte und das ursprüngliche BSA-Signal kaum noch nachweisbar war. Bei dem hochmolekularen Produkt handelte es sich, wie schließlich auch durch die erfolgreiche Immunisierung aufgezeigt werden konnte, um das gewünschte β-Glucan-BSA-Konjugat.

4.1.2 Gewinnung polyklonaler β-Glucan-Antikörper Nach Prüfung mehrerer Präimmunseren auf die Abwesenheit unspezifischer Bindungen wurden zwei ausgewählte Kaninchen mit dem erhaltenen Reaktionsprodukt zur Gewinnung polyklonaler Antikörper immunisiert. Die Seren wurden im Laufe der Immunisierung wiederholt auf ihre Bindungsfähigkeit gegenüber β-(1→3)-Glucan in Bindungstests geprüft. Hierzu wurden verschiedene Konzentrationen von Laminarin eingesetzt. Die Antikörper können demnach in Serumverdünnungen (Verdünnung der Rohseren) im Bereich von 1:75.000 eingesetzt werden. Die Seren beider immunisierter Kaninchen Anti-Lam-1 und Anti-Lam-2 zeigten vergleichbare Qualitäten. Nach dem Nachweis entsprechend günstiger Antikörper-Titer wurden die Seren gewonnen. Somit steht zunächst ausreichend Antikörpermaterial für die ELISA-Entwicklung und -Produktion zur Verfügung.

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4.1.3 Optimierung des ELISAs Auf Grundlage der gewonnen Antikörper konnte ein kompetitives ELISA-Testsystem etabliert werden, bei dem β-(1→3)-Glucan (Laminarin) als Kompetitor zu freien β-Glucanen in den zu analysierenden Proben oder Standards auf der Mikrotiterplatte immobilisiert wird. Anti-Laminarin-Antikörper werden gemeinsam mit dem β-(1→3)-Glucan aus Standard oder Probe zur Kompetition inkubiert. Die Signalerzeugung erfolgt schließlich über die nacheinander folgende Inkubation von Anti-Kaninchen-IgG-HRP und Peroxidasesubstrat, sowie den entsprechenden Waschschritten. Die Etablierung dieses Systems, die Auswahl und Aufarbeitung (Reinigung) der produzierten Antiseren und die Optimierung der Assaybedingungen sind im Folgenden beschrieben:

• Optimierung eines geeigneten Assayformats • Auswahl und Erprobung von Pufferlösungen und weiterer Reagenzien • Optimierung der Inkubationszeiten • Optimierung der Konzentrationen der individuellen Reagenzien

Die Zielsetzung besteht in der Erzielung möglichst

• hoher Testsensitivität • hoher Spezifität (geringer Kreuzreaktionen) • hoher Reproduzierbarkeit • geringem Testhintergrund • rascher und praktikabler Testdurchführung

4.1.3.1 Plattenbeschichtung (Coating) Zur Optimierung der Plattenbeschichtung wurden Experimente mit verschiedenen Konzentrationen und Typen von Laminarin, sowie Modifikationen der Puffersysteme beim Coaten der ELISA-Mikrotiterplatten erprobt. Folgende Parameter wurden variiert:

• Puffersysteme • Einsatz verschiedener Gelatinetypen zur Stabilisierung der beschichteten Platten • Konzentration und Typen von Laminarin • Einsatz von antimikrobiellen Wachstumshemmern

4.1.3.2 Austestung verschiedener Blockaden und der Plattenkonservierung Blockaden der Mikrotiterplatten nach dem Coating dienen insbesondere zur Reduzierung des Hintergrundsignals im Test durch Absättigung unspezifischer Bindungsstellen auf der Mikrotiterplatte. Sie sollen zudem eine gute Lagerfähigkeit der Platten gewährleisten, die gerade bei kommerziell genutzten Kits von größter Wichtigkeit sind.

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Zur Optimierung der Plattenvorbereitung wurden verschiedene Blockade-Lösungen ausgetestet. Es wurden unterschiedliche Kombinationen an Basispufferlösungen, wie PBS (Phosphate Buffered Saline) oder TBS (Tris Buffered Saline) mit verschiedenen Proteinen, wie Milchpulver und Gelatinelösungen, sowie einem geeigneten Coatingschutz zur Langzeitkonservierung der Platten erprobt. Gelatine mit einem hohen Zuckeranteil soll die Glucane, die zum Coating verwendet wurden, stabilisieren. Laktose dient dem Coatingschutz der Reagenzien während des Trocknungsvorgangs zur Plattenkonservierung. Es gibt unterschiedliche kommerzielle Puffer, die einige der gewünschten Eigenschaften in sehr vorteilhafter Weise in sich vereinen. Eine Reihe dieser Reagenzien, insbesondere die der Firma BioFX (Ma, USA), wurden für unsere Zwecke erprobt und evaluiert. Einige Puffer zeigten positive Einflüsse auf die Assayeigenschaften (niedriger Hintergrund, gute Testsensitivität). Untersuchungen ergaben nach Kenntnisstand des letzten Berichtes noch keine ausreichende Langzeitstabilität der beschichteten Platten. Es stellte sich heraus, dass ein Einfrieren der gewaschenen, gecoateten Platten ohne Aktivitätsverluste möglich ist. Diese Art der Konservierung ist im Rahmen einer angestrebten unkomplizierten Vermarktung mit Versand jedoch nicht als ideal zu bewerten. Zur Verbesserung der Langzeitstabilität wurden deshalb unterschiedliche Kombinationen an Blockadereagenzien, insbesondere auch der erwähnten kommerziellen Reagenzien erprobt, wobei die Platten nach dem Coaten grundsätzlich getrocknet (2 Stunden, 37°C), unter Vakuum eingeschweißt und anschließend bei 4-8°C gelagert wurden.

4.1.3.3 Auswahl weiterer Reagenzien und Optimierung der Testbedingungen

Art, Qualität und Konzentrationen der individuellen Reagenzien bestimmen die Eigenschaften des ELISAs. Auf die Gewinnung der Antikörper wurde in Abschnitt 4.1.2 (Seite 37) detailliert eingegangen. Auf weitere Reagenzien wie Sekundärantikörper-Enzymkonjugat, Substratlösung und weitere Hilfsreagenzien wurde auf Grundlage der Erfahrungswerte von bereits etablierten Assaysystemen zurückgegriffen. Die spezifische Eignung im β-Glucan-Assay wurde geprüft. Die Konzentrationen der Reagenzien wurden in zweidimensionalen Titerbestimmungen feinoptimiert. Die Inkubationszeiten wurden bezüglich der Kriterien Sensitivität, Reproduzierbarkeit und Anwenderfreundlichkeit eingestellt. Dies ist deshalb relativ komplex, weil die Reagenzien mit den verwendeten Puffern und weiteren Variablen abzustimmen sind.

4.1.3.4 Strategien zur Optimierung der Kit-Haltbarkeit Um die Langzeitstabilität des ELISA-Systems gewährleisten zu können, müssen auch alle verwendeten Reagenzien, insbesondere Immunseren, Standard- und Substratlösungen mit stabilisierenden Reagenzien behandelt und die Rezepturen bezüglich der resultierenden Assayeigenschaften und Haltbarkeit erprobt werden.

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Zur Überprüfung der Haltbarkeit des Anti-β-Glucan Antikörpers wurde dieser in verschiedenen Verdünnungsstufen bei 4-8°C aufbewahrt und wiederholt getestet. Auch hierfür wurden verschiedene stabilisierende Pufferlösungen erprobt. Auch die Lagerung in bestimmten Puffern nach Lyophilisierung wurde getestet. Der Einsatz unterschiedlicher Supplemente, die die Langzeitstabilität gewährleisten sollen, wurde geprüft. Eine große Rolle spielen auch hier Hemmstoffe gegen mikrobielles Wachstum. Kontaminationen von Reagenzien sind in Test-Kits grundsätzlich zu vermeiden. Es versteht sich von selbst, dass die mögliche Kontamination der Lösungen durch Schimmelpilzwachstum und damit durch β-Glucane, unter allen Umständen durch den Einsatz eines geeigneten Wachstumshemmers zu verhindern ist. Vergleichbar mit der Stabilisierung der Anti-β-Glucan-Antikörper ist auch die Stabilität des markierten Sekundärantikörper-Konjugats (Anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase-Konjugat) sicherzustellen. Bei dieser Lösung geht es neben der Stabilisierung des Antikörpers auch um die Stabilisierung der konjugierten Peroxidase. Somit wurden proteinstabilisierende Komponenten, peroxidasestabilisierende Komponenten, sowie wachstumshemmende Zusätze erprobt. Als Substratlösung werden kommerziell verfügbare, bereits erprobte “ready-to-use“-Reagenzien bevorzugt.

4.2 Resultierende Reagenzienzusammensetzung der ELISA-Tests Die im Folgenden aufgeführten Rezepturen sind das Resultat der Optimierungsarbeiten bei der Auswahl und Erprobung der Methoden in der Reagenzienentwicklung.

4.2.1 Herstellung der beschichteten Mikrotiterplatten Das kompetitive Assayformat mit der Immobilisierung von β-(1→3)-Glucan auf der Mikrotiterplatte und einer Kompetition des immobilisierten Glucans mit Glucan aus Standard oder Probe, erbrachte Resultate, die allen gegenwärtigen Anforderungen gerecht werden. Alternative Formate mit immobilisierten Antikörpern und einer Kompetition mit freiem β-Glucan und einem synthetisierten β-Glucan-Peroxidasekonjugat wurden erprobt, erbrachten aber zunächst keine besseren Resultate (zu schwache Signalerzeugung). Es ist zu vermuten, dass das synthetisierte Peroxidase-Konjugat keine ausreichenden Bindungs- oder Aktivitätseigenschaften besitzt, oder keine ausreichende Kopplung von Glucan an das Reporterenzym gelungen ist. Allerdings soll dieser Ansatz trotzdem weiterverfolgt werden, da bei diesem Testformat häufig eine Erhöhung der Sensitivität erzielt werden kann, die für weitere geplante Anwendungen (siehe Diskussion) erforderlich sein wird. Für den optimierten β-(1→3)-Glucan-Assay werden Materialien und Puffer verwendet, die im Folgenden erläutert sind. Da es sich um Rezepturen handelt, die das Firmen-Know-How der Firma Sension betreffen und teilweise auch noch in weiteren Produkten des Unternehmens Verwendung finden, sind die Beschreibungen der Lösungen nicht vollständig wiedergegeben. .

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Materialien und Puffer: Mikrotiterplatten: NUNC-Maxisorp Coatingpuffer: modfizierter PBS-Puffer, pH 7,5 mit Hemmsubstanz gegen das Wachstum von Mikroorganismen. Blockade-Puffer: modifizierter PBS-Puffer mit Detergens und Gelatine; pH 7,5 Als Alternative zu dem beschriebenen Blockadepuffer kommen ausgewählte modifizierte Puffer von BioFX in Frage. Bewährt haben sich ausschließlich Puffer, die Gelatine enthielten, wobei sich bei der Erprobung verschiedener Gelatinetypen letztendlich nur wenige als geeignet erwiesen haben. Da die kommerziellen Puffer sich in den Resultaten nur unwesentlich von dem angegebenen Puffer unterscheiden, wird zunächst der bei uns entwickelte Puffer eingesetzt. Es ist dennoch günstig, auch alternative Methoden zur Verfügung zu haben (beispielsweise wenn die angegebene Gelatine sich in einer neuen Lot plötzlich als nicht mehr qualitativ ausreichend erweisen würde). Waschpuffer: modifizierter PBS-Puffer mit Detergens Arbeitsprotokoll für Coating und Blockade: Stocklösung von Laminarin (von Laminaria digitata) 1 mg/mL H2O dest. herstellen und 2 h (120°C, 1 bar) autoklavieren. Aus dieser Lösung wird die Laminarin-Coatinglösung in einer Konzentration von 2 µg/mL PBTG hergestellt. Coating: 200 µL/Well; 18 h bei 6°C. Nach dem Coating werden die Platten gewaschen: Waschvorgang: (3x) mit Waschpuffer im Mikrotiterplattenwaschgerät. Blockade: 300 µL/well Blockadepuffer; 2h bei RT Anschließend werden die beschichteten Platten zur Lagerung vorbereitet: Leeren der Platten, sorgfältiges Ausklopfen zur Entfernung möglicher Flüssigkeitsrückstände. 0,5 h Trocknen bei 37°C. Einschweißen unter Vakuum in Aluminium-Verbundfolie und Lagerung bei 4-8°C. Alternativ lassen sich die Platten nach dem Ausklopfen auch direkt im Assay verwenden. Zur Langzeitstabilisierung der Reagenzien ist der Einsatz von antimikrobiellen Wachstumshemmen erforderlich. Real Time Stabilitätstest zur Bestätigung der Haltbarkeit der Platten sind Gegenstand noch laufender Arbeiten. Zur Gewährleistung der Qualität soll der unkontrollierte Eintrag mikrobieller Belastungen in die Reagenzien, welcher Art auch immer, möglichst

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ausgeschlossen werden. Aus diesem Grund wird beispielsweise das für die Puffer eingesetzte entionisierte Wasser vor dessen Verwendung sterilfiltriert. Der Einsatz käuflichen, besonders hochwertigen, keimfreien Wassers zu Produktionszwecken wäre eine Alternative. Erfahrungsgemäß sollte eine Mindesthaltbarkeit der Platten von 6 Monaten, besser von einem Jahr, bei einer Lagertemperatur von 4-8° C erzielt werden.

4.2.2 Darstellung der Kit-Reagenzien Anti-β-Glucan Antikörper: Entsprechend der beschriebenen Herstellung (4.1.2, Seite 37) per Definition: Antikörper Anti-Lam-1 und Anti-Lam-2. Vergleichbare Antikörper sind nach unserem Kenntnisstand kommerziell nicht verfügbar. Sie wurden durch Immunisierung gewonnen und stehen somit in ausreichender Menge auch für Produktionszwecke zur Verfügung. Die hier dargestellten Ergebnisse wurden mit dem Antikörper Anti-Lam-1 erzielt. Der Antikörper Anti-Lam-2 wurde jedoch ebenfalls getestet und besitzt vergleichbare Eigenschaften. Bei Bedarf können auf der Grundlage des hergestellten β-(1→3)-Glucan-Konjugats jederzeit weitere Antikörper nachproduziert werden. Der Antikörper Anti-Lam-1 wird gegenwärtig als Rohserum eingesetzt. Die Reinigung der Antikörper durch Ammoniumsulfatfällung erbrachte zunächst keine Verbesserungen der Resultate. Anti-Lam-1 wird im Assay in einer Verdünnung von 1:75.000 in Verdünnungspuffer eingesetzt. Im Kit wird der Antikörper in konzentrierter Form zur Weiterverdünnung oder ggf. lyophilisiert enthalten sein. Verdünnungspuffer:

für die Standardlösungen, die Probenlösungen und den Antikörper Anti-Lam-1: PBS-Puffer mit Tween, Gelatine und einem Wachstumshemmer

Sekundär-Antikörper-Enzym-Konjugat: Anti-Rabbit-IgG-POD (Sigma, A-0545) Der Sekundärantikörper wird im Assay in einer Verdünnung von 1:5.000 in Verdünnungspuffer eingesetzt. Im Kit wird der Antikörper in konzentrierter Form zur Weiterverdünnung enthalten sein. Puffer für die Lagerung des Sekundär-Antikörper-Enzym-Konjugats im Kit: PBS-Puffer mit Tween, Gelatine und einem Wachstumshemmer

Enzym-Substratlösung:

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TMB 1 Component HRP Microwell-Substrate; TMBW-1000-01 (BioFX; Owing Mills, MD)

Stopplösung:

Schwefelsäure (4N) Standardlösungen:

Stocklösung: 1 mg/mL Laminarin (Laminarin from Laminaria digitata) in H2O dest. Vor der Anwendung 2 h autoklavieren. Die Standardlösungen wurden in Verdünnungspuffer (hier Standard-verdünnungspuffer) für die Assays in den angegebenen Konzentrationen hergestellt und sollen auch für Untersuchungen im Haus weiter eingesetzt werden. Der kommerzielle SensioMold ELISA-Kit soll folgende 8 Standardlösungen enthalten.

200.000 ng/mL 20.000 ng/mL 5.000 ng/mL 1.250 ng/mL

156,25 ng/mL 39,1 ng/mL

9,8 ng/mL 0 ng/mL

Im Rahmen der geplanten Zertifizierung ist die Herstellung aller Reagenzien in Standard Operation Procedures (SOPs) dokumentiert und stellt die Grundlage der geplanten zertifizierten Produktion der ELISA-Kits dar. Modifizierte Test-Kits von β-(1→3)-Glucan für weitere Anwendungen in der Umweltanalytik, der medizinischen Diagnostik und der Lebensmitteltechnologie werden ebenfalls unter GMP-Bedingungen hergestellt werden. Die beschriebenen Materialien und Reagenzien sind im SensioMold ELISA-Test-Kit (siehe Abbildung 18, Seite 44) enthalten.

4.2.3 Darstellung der Kit-Konzepte Die Anwendung der ELISA-Testkits ist in zwei Varianten vorgesehen:

1. Der SensioMold ELISA-Kit wird im Paket mit dem SensioMold Probennahme-Kit in Kombination vermarktet.

2. Der SensioMold Probennahme-Kit (siehe Abbildung 19, Seite 44) wird vertrieben. Die

damit gesammelten Proben können an unser Analyselabor geschickt und mittels des etablierten ELISA analysiert werden.

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Abbildung 18: SensioMold ELISA-Test-Kit zur quantitativen Bestimmung von β-Glucan

als Marker für Schimmelpilzbefall

Abbildung 19: SensioMold Probennahmekit zur Sammlung von Staubproben mittels eines

handelsüblichen Staubsaugers.

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4.2.4 Ergebnisse und resultierende Vorschriften zur Durchführung des ELISAs zur Analytik von Staubproben

Im Folgenden sind die Handhabung und die daraus resultierenden Vorschriften zum β-Glucan-ELISA beschrieben.

4.2.4.1 Testdurchführung Immunreaktion 1:

Unmittelbar aufeinander folgend Zugabe von 100 µl Standard- bzw. Probelösung und 100 µl Anti-Lam-1 (1:75.000 in PBTG) je Well. In dieser Phase kompetitieren die immobilisierten β-(1→3)-Glucane des Laminarins mit dem β-(1→3)-Glucan aus Standard und Probe um die freien Bindungsstellen des Anti-Lam-1-Antikörpers. Inkubation: 90 min (falls möglich in langsamer Stufe auf einem Schüttler) bei RT

Waschen: Platte dreimal waschen (Waschpuffer; Waschgerät)

Immunreaktion 2: Zugabe von 200 µl Anti-Rabbit-IgG-POD (1:5.000 in PBTG) als markierter Sekundärantikörper. Inkubation: 60 Minuten (ggf. auf dem Schüttler) bei RT

Waschen: Platte dreimal waschen (Waschpuffer; Waschgerät)

Substratumsetzung: Signalerzeugung durch Zugabe von 100 µl TMB-Substrat je Well

Abstoppen: Zugabe von 50 µl Stoppreagenz je Well

Auswertung:

Die Auswertung erfolgt im ELISA-Reader bei 450 nm.

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4.2.5 Schematische Darstellung des ELISA-Formats

Schritt Reagenz µl / Well Zeit [h] Temp.[°C]

Coating Laminarin [2 µg / ml] 200 18 4

Waschen Waschpuffer 3 x 300

Blockade Blockade-Puffer PBTG 300 0,5 RT

1.Immunreakt. Anti-Lam1 (1:75.000 in PBTG) +

Probe 100 + 100 1,5 RT

Waschen Waschpuffer 3 x 300 RT

2.Immunreakt. Anti-Rabbit-IgG-POD (1:5000 in

PBTG) 200 1 RT

Waschen Waschpuffer 3 x 300 RT

Substrat TMB 100 0,25 RT

Abstoppen 4N Schwefelsäure 50

Auswertung ELISA-Reader bei 450nm

Abbildung 20: Schematische Darstellung des ELISA-Formats. Die vom Anwender durchzuführenden Arbeitsschritte sind grau unterlegt dargestellt. Das ELISA-Format erfordert 2 Waschschritte auf Seiten des Anwenders. Der Assay ist in weniger als drei Stunden durchführbar.

4.3 Ergebnisse zur ELISA-Validierung

4.3.1 Charakterisierung und Validierung des ELISAs zur Erfassung von β-(1→3)-Glucanen

4.3.1.1 Erstellung der Standardkurve Der ELISA in der beschriebenen Konzeption resultierte in einer gut reproduzierbaren Standardkurve. Im kommerziellen Test-Kit werden nur acht Standards eingesetzt (siehe 4.2.2, Seite 42f.). Die Sensitivität ist mehr als ausreichend für alle bisher erprobten Anwendungen, besonders für die Messung von Staubproben. Die Nachweisgrenze liegt bei ca. 40 ng/mL (β-Glucan/Verdünnungspuffer). Bei der verwendeten Aufarbeitung von Staubproben, entspricht dies einer Nachweisgrenze von 40 ng β-Glucan / 10 mg Staub oder 4 µg

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β-Glucan / g Staub. Die Nachweisgrenze lässt sich problemlos nach unten korrigieren, wenn die Staubprobe in einem entsprechend geringeren Volumen an Pufferlösung gelöst wird. Probleme durch mögliche Matrixeffekte einer größeren Staubmenge sind bisher nicht aufgetreten. Die relativ hohe Sensitivität erlaubt hohe Probenverdünnungen der Staubproben, so dass mögliche Matrixeffekte der bisher eingesetzten aktuellen Matrices problemlos ausgedünnt werden könnten. Der geringe Testhintergrund, die gute Reproduzierbarkeit und die relativ steile Standardkurve gewährleisten einen qualitativ hochwertigen Test.

Laminarin-Standardkurve

0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,82,0

0 1 10 100 1000 10000 100000

Laminarin [ng/ml]

OD

Standardkurve

Abbildung 21: Standardkurve von Laminarin, die durch Einsetzen bekannter Konzentrationen an Laminarin im beschriebenen ELISA-Format erstellt wurde. Die Nachweisgrenze liegt bei ca. 20 – 40 ng/ml Probelösung.

4.3.1.2 Spezifität und Kreuzreaktionen zu anderen Glucanen eingesetzte Konzentrationen Laminarin [ng/ml] Dextran [ng/mL] Mannan [ng/mL]

CR Laminarin 100 % per Definition

Gemessene Konz. Dextran Bez. auf Laminarin- Standard [ng/ml]

CR Dextran [%]

Gemessene Konz. Mannan Bez. auf Laminarin Standard [ng/ml]

CR Mannan [%]

20000 100 9,0 <1 62,1 <1 2500 100 16,9 <1 15,0 <1

Abbildung 22: Kreuzreaktionen zu anderen relevanten Glucanen (Dextran (Alpha(1,6)(1,3)(1,4)(1,2)-Glucan) und Mannan (Alpha(1,2)(1,3)(1,6)-Glucan).

Bei der Bestimmung der Spezifität kommt es darauf an, vor allem relevante Zuckerspezies auf mögliche Kreuzreaktivitäten mit dem produzierten Antikörper Anti-Lam-1 zu prüfen. Dieser Prüfung müssen insbesondere weitere Glucane unterzogen werden, welche dem β-(1→3)-Glucan, wie es durch das Laminarin repräsentiert wird, chemisch-strukturell besonders nahe

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stehen. Derartige Glucane sind das Dextran (Alpha(1,6)(1,3)(1,4)(1,2)-Glucan) und das Mannan (Alpha(1,2)(1,3)(1,6)-Glucan. Keines dieser strukturverwandten Moleküle, ebenso wie weitere getestete Zuckerverbindungen zeigten Kreuzreaktivitäten. Besonders hervorzuheben ist, dass auch untersuchtes Endotoxin keinerlei Kreuzreaktivität aufwies. Dies ermöglicht eine klare Abgrenzung von bestehenden Endotoxinnachweisen, die auf der Technologie des LAL-Tests beruhen (Foto, Plett et al. 2004). LAL-basierte Tests erkennen Endotoxine und β-Glucan gleichermaßen. Da mit dem hier beschriebenen ELISA-Test ein hochspezifisches Testsystem für β-(1→3)-Glucan zur Verfügung steht, ist die Einsatzmöglichkeit des Tests in einigen Bereichen, die vom LAL-Test bedient werden, wahrscheinlich. Die Spezifität des ELISAs ist exzellent. Mit Problemen durch etwaige weitere kreuzreagierende Substanzen ist nicht zu rechnen. Es sei jedoch angemerkt, dass β-Glucane auch, allerdings in sehr geringen Mengen, in bestimmten Pflanzengeweben (Apikalmeristem, Plasmodesmen, Wundreperaturgewebe) vorkommen können. Größere Konzentrationen in pflanzlichen Materialien sind bedingt durch Pilzhyphen, die häufig pflanzliche Materialien durchsetzen, gelegentlich nachweisbar. Es ist nicht gänzlich auszuschließen, dass Anwendungsfelder, beispielsweise im Lebensmittelbereich, dadurch eingeschränkt sein könnten.

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4.3.1.3 Bestimmung der β-(1→3)-Glucangehalte verschiedener kultivierter Schimmelpilzspezies

Die von Herrn Dr. Gabrio, (LGA, BW) zur Verfügung gestellten Suspensionen verschiedener Schimmelpilzspezies waren in 0,85%iger NaCl mit 0,01% Tween 80 resuspendiert. Nach der Probenvorbereitung entsprechend unserer Vorschrift wurden die Suspensionen im ELISA-Test gemessen. Die entsprechende Verdünnung zur Anpassung der Probe an den Messbereich des Assays wurde durch Verdünnungsreihen ermittelt. Die ELISA-Analytik ergab folgende β-(1→3)-Glucan-Werte für die einzelnen Suspensionen:

Name µg β-(1→3)-Glucan/ml Suspension n s VK%

Aspergillus flavus* 8,05 2 0,15 1,86Aspergillus fumigatus* 4,15 2 0,06 1,43Aspergillus niger* 48,52 2 3,94 8,12Aspergillus versicolor* 5,78 2 0,32 5,61Aspergillus ochraceus* 23,88 3 2,37 9,91Alternaria alternata* 1,58 2 0,04 2,79Aureobasidium pullulans 58,87 2 6,48 11,01Botrytis cinerea 1,01 2 0,03 2,49Chaetomium globosum 7,73 2 0,27 3,55Cladosporium cladosporides 8,63 3 0,88 10,25Cladosporium herbarium* 5,04 2 0,10 2,06Emericella nidulans 31,11 2 1,34 4,30Eurotium amstelodami* 1,37 3 0,03 2,37Eurotium herbariorum* 2,09 2 0,00 0,01Mucor genevensis* 10,20 2 1,24 12,11Mucor plumbeus* 2,76 2 0,16 5,80Penicillium brevicompactum 6,52 2 0,25 3,78Penicillium chrysogenum* 12,60 2 1,26 10,00Penicillium digitatum* 13,24 2 1,02 7,71Penicillium expansum* 12,47 3 0,92 7,39Penicillium glabrum* 58,82 3 0,45 7,67Penicillium olsonii* 13,23 3 1,26 9,50Phoma glomerata 9,00 2 0,49 5,40Phialophora fastigiata 5,30 3 0,26 4,87Rhodotorula minuta 0,58 2 0,04 6,34Stachybotrys chartarum 1,63 3 0,05 3,22Ulochladium chartarum 2,04 2 0,05 2,67

Abbildung 23: Bestimmung der β-Glucangehalte verschiedener kultivierter Schimmelpilzspezies in µg β-Glucan/ml Pilzsuspension. Die mit * gekennzeichneten Gattungen kommen in Innenräumen besonders häufig vor (Umweltbundesamt 2000).

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Die Erkennung der verschiedenen aufgeschlossenen Sporenspezies unterscheidet sich erheblich. Ein Grund dafür könnten die verschiedenen Größen der Sporen und unterschiedliche Oberflächenstrukturen sein, die für den Aufschluss unterschiedlicher Mengen an β-(1→3)-Glucan verantwortlich sein könnten. Grundsätzlich ist festzustellen, dass alle eingesetzten Sporenspezies vom ELISA erkannt wurden. Von den erfahrungsgemäß in Innenräumen besonders häufig anzutreffenden Sporen, weisen unter den analysierten Spezies lediglich die Sporen von Eurotium amstelodami bzw. Eurotium herbariorum und Alternaria alternata eine vergleichsweise schwache Erkennung aus. Auch die gute Reproduzierbarkeit bei Wiederholungsmessungen ist festzustellen. Ob Spezies, die in der Messung einen höheren Glucangehalt aufweisen, auch eine diesbezügliche höhere gesundheitliche Glucanbelastung (beispielsweise in der mit Glucanen in Zusammenhang stehenden entzündlichen Wirkung) aufweisen, ist uns nicht bekannt. Bei den aus Staubproben kultivierten Sporen der Umweltambulanz wurden immer Mischungen aus verschiedenen Spezies nachgewiesen. Es ist mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit davon auszugehen, dass sich bei der β-(1→3)-Glucanbestimmung im ELISA die analytische Antwort der Sporen mit stärkerer und geringerer Erkennung im Test großteils gegenseitig ausgleichen und damit die Resultate verschiedener Messungen, beruhend auf unterschiedlichen Spezies, gut vergleichbar sind.

4.4 Methoden zur Aufbereitung von Staubproben Jede Probenmatrix ist dem analytischen System, in diesem Falle dem ELISA, spezifisch anzupassen. Die in den Arbeiten primär benutzte und analysierte Probenmatrix waren Staubproben. Diese stellen eine sehr komplexe und inhomogene Probenmatrix dar (Koistinen, Edwards et al. 2004). Zur Aufarbeitung der Proben für den ELISA wurden verschiedene Puffer und Aufschlussmethoden, wie z.B. Autoklavieren, erprobt. Weitere Probenmatrices, wie potenziell befallene Baumaterialien, sowie einige Lebensmittel (insbesondere Fruchtsäfte) wurden auf mögliche Matrixeffekte im ELISA getestet. Die Probenvorbereitung für die ELISA-Analytik mittels Autoklavieren ist mit einem gewissen Aufwand verbunden und setzt zudem die Verfügbarkeit eines Autoklaven voraus. Es wurde deshalb versucht, diesen Arbeitsschritt durch ein einfacheres und praktikableres Verfahren zu ersetzen. Dabei wurden eine ganze Reihe mechanischer, chemischer und physikalischer Aufschlussverfahren erprobt und miteinander kombiniert. Es wurde versucht, den Aufschluss der Staubproben durch Methoden wie Ultraschallbehandlung, Aufkochen, auch unter kräftigem Rühren und durch den Einsatz von Detergenzien (z.B. SDS, N-Lauroylsarkosin, Triton-X 100) und weiterer Reagenzien (z.B. EDTA), die für vergleichbare Anwendungen in der Mikrobiologie und der Molekularbiologie eingesetzt werden (Felix 1982; Naglak, Hettwer et al. 1990), zu bewerkstelligen. Alle von der Umweltambulanz gesammelten Staubproben von Teppichflächen (aus einem Quadratmeter Teppich durch Staubsaugen mit einem Industriesauger) waren nach dem Saugen auf einem Gelatinefilter als Trockensubstanz konzentriert. Sie wurden dann mit dem 100-fachen ihres Gewichtes mit einer 0,9% NaCl / 0,01% Tween 80 Lösung versetzt und 30 min. geschüttelt bzw. gerührt (Magnetrührer). Dabei löste sich die Gelatine des Filters vollständig auf .

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Sension erhielt die Proben der Umweltambulanz in dieser aufbereiteten und suspendierten Form. Die Suspensionen enthielten recht unterschiedliche Volumina an Lösung. Diese waren bedingt durch die beträchtlichen Masseunterschiede der gesammelten Staubmengen. Die Staubmasse wurde durch Wägung der Gelatinefilter bestimmt und dann in den entsprechenden Volumina an Lösung aufgenommen. Die Staubmengen lagen meist in der Größenordnung 0,5 mg - 10 mg / m2. Die von der Umweltambulanz aufbereitete Suspension wurde zum Zellaufschluss und zur Freisetzung der Glucane für 2 Stunden autoklaviert. Nach dem Absetzen der Schwebstoffe wurde die Probe im Verhältnis 1:10 mit PBTG verdünnt und direkt im ELISA gemessen. In einigen Fällen war der Verdünnungsfaktor nach der Erstmessung an den Messbereich des ELISAs anzupassen.

4.5 Ergebnisse zur Validierung der ELISA-Analytik mit Staubproben als Matrix

Die Staubproben, die von der Umweltambulanz nach der Methodik des LGA Baden-Württemberg (Landesgesundheitsamt Baden-Württemberg 2001) gesammelt wurden, sind jeweils zur mikrobiologischen Analytik durch die Umweltambulanz und für die ELISA-Analytik durch Sension aufgeteilt worden. Der Rest der Suspensionen wurde als Rückstellmuster bei -28°C für weitere ggf. noch folgende Untersuchungen aufbewahrt und stehen für eventuelle weitere Analysen zur Verfügung. Die im ELISA ermittelten β-(1→3)-Glucan-Konzentrationen wurden jeweils auf die Staubmenge bezogen. Demnach entspricht bei einer Probenverdünnung von 1:10, wie sie in der Regel eingesetzt wird, das Volumen von 1 ml Suspension einer Menge von 1 mg Staub. Die Nachweisgrenze für β-Glucan liegt demnach bei 40 ng Glucan / mg Staub oder 40 µg Glucan / g Staub. Diese Nachweisgrenze ließe sich bei Bedarf verbessern, wenn die Probe vor der ELISA-Analytik nicht weiter verdünnt wird oder bereits bei der Suspension der Probe ein geringeres Volumen verwendet würde. Zur Überprüfung der Probenvorbereitung von Staubproben für die ELISA-Analytik wurden in Anlehnung an Douwes et al. (Douwes, Zuidhof et al. 2000) Staubproben aufbereitet und im ELISA gemessen. Es wurden Untersuchungen zur Wiederfindung und zur Linearität von Probenverdünnungen durchgeführt. Für die Aufarbeitung wurde, wie von Douwes et al. empfohlen, das Autoklavieren als die effektivste Methode zum möglichst quantitativen Aufschluss der Glucane aus der Staubmatrix verwendet. Das Autoklavieren erhöht die Ausbeute an Glucanen um das Vielfache (ca. Faktor 100), im Vergleich zu einem Aufschluss ohne diesen Schritt. Sie ist gegenwärtig für eine quantitative Analytik noch unverzichtbar. Das Autoklavieren bewirkt offensichtlich einen noch wesentlich effizienteren Aufschluss bzw. eine effizientere Lyse. Bei einem derart hohen Faktor ist das Autoklavieren demnach selbst dann geboten, wenn die Sensitivität des ELISAs die Detektion noch geringerer Konzentrationen erlaubt, da die Reproduzierbarkeit des Aufschlusses bei einer zu niedrigen Ausbeute häufig nicht gewährleistet ist. Diese Annahme hat sich in Experimenten auch bestätigt.

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Der Einsatz physikalischer Methoden (aufkochen, Ultraschallbehandlung, heftiges rühren) erbrachte bislang keine signifikant höheren Ausbeuten beim Aufschluss. Höhere Ausbeuten konnten durch den Einsatz starker Detergenzien erzielt werden. Dabei ist allerdings darauf zu achten, dass die Anwesenheit der Detergenzien mit dem ELISA nicht interferiert. Ein relativ effizienter, wenn auch noch nicht quantitativer Aufschluss wurde schließlich durch den Einsatz des Detergens N-Lauroyl-Sarkosin (1%-Lösung) erzielt. Nach dem Einsatz von N-Lauroyl-Sarkosin zum Zellwandaufschluss der in den Staubproben enthaltenen Schimmelpilze bzw. Sporen, waren die gemessenen β-(1→3)-Glucan-Konzentrationen jedoch immer noch etwa um den Faktor 3-5 geringer, als nach dem Aufschluss durch Autoklavieren. Damit konnte zwar die Ausbeute im Vergleich zu unbehandelten Proben erhöht, jedoch noch nicht der vermutlich quantitative Aufschluss, der durch Autoklavieren bewerkstelligt wird, erreicht werden. Es konnte somit bislang kein Verfahren etabliert werden, wodurch das Autoklavieren ersetzt werden konnte. Es sind zwar nach dem Einsatz von Detergenzien β-(1→3)-Glucane in erhöhten Konzentrationen nachweisbar, grundsätzlich aber signifikant weniger als nach Aufschluss durch Autoklavieren. Es werden auch künftig, also über den Förderzeitraum hinaus, Versuche unternommen werden, um das Autoklavieren durch eine praktikablere und weniger aufwändige Methode zu ersetzen. Für Analysen ohne quantitative Ansprüche, beispielsweise für bestimmte Anwendungen des Teststreifens, könnte der Aufschluss mit bestimmten Detergenzien jedoch ausreichend sein. Da nicht jedem Labor ein Autoklav bzw. eine ELISA-Ausrüstung zur Verfügung stehen, ist es zweckmäßig, unsere Analytik in zwei Ausführungen anzubieten. Laboratorien mit der kompletten beschriebenen Ausrüstung haben die Möglichkeit, den ELISA-Kit mit Probennahme-Kit anzuwenden. Als Alternative ist für die Anwendung des Probennahmekits alleine keinerlei Laboratoriumsausstattung erforderlich. Die Proben können dann zur Dienstleistungsanalytik direkt in unser Labor eingeschickt und durch uns analysiert werden. Damit kann eine ELISA-Analytik angeboten werden, die als Dienstleistungsanalytik eingeschickter Staubproben in unserem Hause eingesetzt wird. Entsprechend ausgestattete Laboratorien können den Kit zur Probenvorbereitung und zur ELISA-Analytik selbst anwenden..

4.5.1 Linearität von Verdünnungsreihen Zur Überprüfung der Methodik zur Probenvorbereitung (Aufschluss durch Autoklavieren) wurden gesammelte Staubproben nach deren Aufarbeitung im ELISA analysiert. Die erstellten Verdünnungsreihen der Proben spiegeln sich in den ELISA-Resultaten gut wieder. Diese Linearität indiziert störungsfreie Messungen ohne den Einfluss unerwünschter Matrixeffekte.

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4.5.2 Wiederfindungsmessungen mit bekannten Staubproben Eine Probe wurde nach der beschriebenen Probenvorbereitung mit dem beschriebenen ELISA gemessen. Davon wurden Aliquots genommen, mit Standards gespiked und im ELISA bestimmt. Die Messungen ergaben sehr gute Wiederfindungen der β-(1→3)-Glucane im ELISA:

Wiederfindungsmessung [β-Glucan/PBTG] [β-Glucan/PBTG] [β-Glucan/PBTG] [ng/ml] Istwert [ng/ml] Sollwert [ng/ml] Wiederfindung(%) Probe + 1250 ng/ml 3018 2121 2134 99,4Probe + 2500 ng/ml 3018 2659 2759 96,4Probe + 5000 ng/ml 3018 3921 4009 97,8Probe + 10000 ng/ml 3018 6680 6509 97,4

Abbildung 24: Wiederfindungsmessung mit Hilfe bekannter Staubproben (ng β-Glucan/PBTG-Puffer).

Zu der Extraktlösung einer Staubprobe (Probe), für die mit Hilfe des ELISAs 3018 ng/ml Glucan bestimmt worden waren, wurden definierte Mengen an β-Glucan (1250 -10000 ng/ml als Spikes zugegeben. Bei der Gegenüberstellung von Soll- und Istwerten ist zu berücksichtigen, dass die Lösungen jeweils im Verhältnis identischer Volumina vermischt wurden, wodurch die Spikelösung bzw. die Probelösung jeweils im Verhältnis 1:2 verdünnt wurden. Der Vergleich der Istwerte und der Sollwerte resultierte in sehr guten Wiederfindungen. Dies indiziert einen Assay, der im Fall von Staubproben frei ist von Matrixeffekten, sowie eine hohe Testpräzision besitzt.

Wiederfindung

010002000300040005000600070008000

Probe +1250 ng/ml

(1:1)

Probe + 2500 ng/ml

(1:1)

Probe + 5000 ng/ml

(1:1)

Probe +10000 ng/ml

(1:1)

ng ß

-Glu

can/

ml P

BTG

-Puf

fer

[ß-Glucan/PBTG]Istwert [ng/ml][ß-Glucan/PBTG]Sollwert [ng/ml]

Abbildung 25: Graphische Darstellung der Wiederfindung von β-Glucan in Staubproben. Die Überlagerung der Soll- und Istwerte spiegelt die exzellente Wiederfindung gespiketer Glucane in einer Staubprobe wieder.

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4.6 Modifizierte Methoden zur Sammlung von Staubproben Die Sammlung der Proben der Umweltambulanz erfolgte nach der Methodik, wie sie vom LGA Baden-Württemberg übernommen wurde. Dabei wurden die Proben auf definierten Teppichflächen mit Hilfe eines Industriestaubsaugers gesaugt und im Staubsauger auf einem Gelatinefilter gesammelt. Der Filter mit Staub wurde wie beschrieben aufbereitet und der ELISA-Analyse zugeführt. Da die angesprochenen Proben unter durchgehend konstanten Bedingungen gesammelt und aufbereitet werden mussten, konnten neue Verfahren zur Sammlung der Proben in diese Messreihe nicht integriert werden. Das Probennahmeverfahren, das dabei verwendet wurde, ist erprobt und zur Sammlung von Staubproben auf Oberflächen, insbesondere von Teppichen, allgemein akzeptiert. Allerdings ist diese Methodik unter Einsatz eines speziellen Industriestaubsaugers mit einem Test-Kit, das den Anspruch einer breiten Anwendung verfolgt, nicht zu vereinbaren. Probensammlung und Probenaufbereitung sollten für einen effizienten und unkomplizierten ELISA so einfach wie möglich konzipiert sein. Andererseits sind gerade die Ansprüche an die Probennahme den intensiv diskutierten Anforderungen bezüglich einer repräsentativen Probennahme anzugleichen. Bezüglich dieser vielfältigen und hohen Anforderungen wurden unterschiedliche methodische Modifikationen erprobt. Die Beschaffenheit der jeweiligen Träger der Staubpartikel (Teppiche etc.) ist ausgesprochen divers und deren Einfluss auf die ELISA-Messergebnisse naturgemäß nicht einheitlich. Die Staubmenge in einem langflorigen Teppich ist beispielsweise höher, als bei kurzflorigen Unterlagen. Ebenso spielen die Natur der Faser und weitere Faktoren wie der Standort des Teppichs (Räumlichkeit, Frequentierung etc.) eine Rolle. Deshalb bestand unsere Zielsetzung auch darin, die Technik zur Probennahme zu vereinfachen und zu standardisieren. Auf die Ausführungen in „Schimmelpilze in Innenräumen“ (Landesgesundheitsamt Baden-Württemberg 2001; Mücke 2001) sei hingewiesen.

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Potenziell Schimmelpilzbelastete

Teppichfläche

Potenziell Schimmelpilzbelastete

Teppichfläche

Probennahme durch Einsatz spezieller Industriestaubsauger

Staubprobe(ca. 0,5 bis 10 mg pro m2)

Staubprobe(ca. 0,5 bis 10 mg pro m2)

Wägung

Suspendierung des Staubs 1:100 (w/v) mit Puffer+ 30 min Schütteln

(0,1g Staub ergibt 10ml Probelösung)

Suspendierung des Staubs 1:100 (w/v) mit Puffer+ 30 min Schütteln

(0,1g Staub ergibt 10ml Probelösung)

Mikrobiologische Analytik(Klinikum Augsburg)

Mikrobiologische Analytik(Klinikum Augsburg)

Bestimmung des β-(1→3)-Glucan Gehaltes

mittels ELISA-Analytik

Bestimmung des β-(1→3)-Glucan Gehaltes

mittels ELISA-Analytik

Abbildung 26: Schematische Darstellung der β-Glucan-Bestimmung aus Staubproben, die von der Umweltambulanz gesammelt und der mikrobiologischen Analytik sowie der ELISA-Analytik zugeführt wurden.

Die zunächst erprobte Strategie zur Vereinfachung der Probennahme bestand darin, dass kleine Tuchflächen (5 x 5 cm), die künftig einen Bestandteil des Kits zur Probennahme darstellen sollten, in den zu prüfenden Räumlichkeiten ausgelegt wurden. Die Praktikabilität dieser Methodik in Kombination mit der vergleichsweise einfachen ELISA-Analytik sollte es erlauben, eine Anzahl dieser definierten Flächen, je nach Bedarf, auszulegen, die Menge an gefangenem Staub zu bestimmen und das gesamte Tuch mit dem Staub zu analysieren. Bei der Etablierung dieser Methode kam es zunächst darauf an, geeignete Tuchmaterialien zu finden und zu testen. Sie mussten geeignet sind, Staub festzuhalten und durften gleichzeitig keinen negativen Einfluss auf den ELISA, bedingt durch eventuell extrahierte Substanzen, die in den Tüchern enthalten sein könnten, haben. Eine Reihe von verschiedenen Tüchern wurde mit Hilfe einer Staubprobe, die in Verbindung mit verschiedenen Tuchtypen analysiert wurde, auf ihre Eignung getestet. Diese Probe wurde in gleicher Weise, wie die Staubproben, die von der Umweltambulanz gesammelt wurde, behandelt: Es wurden 2 g der Tuchprobe (5 x 5 cm) mit durchschnittlich 10 mg Staub (identische Probe für alle Tuchtypen) belegt und mit der 1000-fachen Menge Extraktionspuffer (0,9%-iger NaCl + 0,01% Tween 80) im Vergleich zur eingesetzten Staubmenge versetzt, geschüttelt und wie üblich (2h, 120°C, 1 bar) autoklaviert. Dieser Ansatz wurde direkt als Probe auf die Mikrotiterplatten zur ELISA-Analytik gebracht. Die relativ hohe Menge an Extraktionspuffer

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ist erforderlich, da eine quantitative Extraktion nur möglich ist, wenn auch dem Saugverhalten der Tuchproben Rechnung getragen wird. Die erprobten Tuchmaterialien werden in der folgenden Tabelle aufgeführt und dem Analysenwert der Staubprobe alleine (also ohne Tuchmaterial) als Sollgröße gegenübergestellt. Tuch-Art Staubprobe

[ng/ml] [β-Glucan/ Extraktionspuffer ]

Konz. Tuch alleine [ng/ml] [β-Glucan/ Extraktionspuffer ]

Konz. Tuch +Probe [ng/ml] [β-Glucan/ Extraktionspuffer]

Spontex-Staub-AS 2796 1195 2067 Staubtuch 2796 24770 21839 Microfaser Glanztuch

2796 7 2664

Tuch Microfaser extra dünn

2796 27 6662

Microfaser-Staubtuch

2796 14 5097

Tuch weiß 2796 540 3405 Standardfaser 2796 15 4471 Abbildung 27: Überprüfung verschiedener Tuchmaterialien auf Extrahierbarkeit und mögliche Matrixeffekte im ELISA. Das Microfaser-Glanztuch zeigte keinerlei Matrixeffekte ohne Staub. Die Tücher wurden mit 10 mg Staub belegt und die Probenvorbereitung wie beschrieben durchgeführt.

Als prinzipiell geeignet erwies sich das „Microfaser Glanztuch“. Das Tuch zeichnet sich durch eine hohe Staubaufnahmekapazität aus, wobei sich der Staub bei der Probenvorbereitung wieder vollkommen ablösen lässt. Durch mehrfache Messungen zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit wurde die Eignung des Tuches für die beschriebene Anwendung zunächst bestätigt: Staubprobe [ng/ml] [β-Glucan/PBTG]

Microfaser Glanztuch [ng/ml] [β-Glucan/PBTG]

Tuch + Staubprobe [ng/ml] [β-Glucan/PBTG]

2945 < 40 2774 2945 5,6 2833 2945 < 40 2901

Abbildung 28: Mehrfachbestimmung zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Messungen mit dem Microfasertuch.

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4.7 Ergebnisse zur Methodik praktikabler Staubproben-sammlungen

Die beschriebene Methodik zur Staubsammlung auf der Grundlage von Tuchoberflächen wurde über einen bestimmten Zeitraum in die Probensammlungen der Umweltambulanz mit aufgenommen. Allerdings musste festgestellt werden, dass teilweise im Rahmen der Handhabung Tuchfasern verloren gehen können. Dieser Faktor wirkt sich auf die Masse des Tuchmaterials aus und beeinflusst somit die Staubmassenbestimmung so massiv, dass gerade bei kleineren Staubmengen eine exakte Massenbestimmung nicht mehr gewährleistet ist. Es wurde festgestellt, dass einige Tücher nach der Staubsammlung eine geringere Masse hatten als vorher. Die gesammelte Staubmenge hatte eine geringere Masse als die verlorenen Fusselteile. Aus diesem Grund musste von der Methodik der Auslegung definierter Tuchflächen Abstand genommen werden. Es wurden in Folge weitere unterschiedliche Methoden zur Staubsammlung erprobt. Filter sowie weitere Materialien (verschiedenen Membrantypen, Papierfilter, Papierflächen, Plastikgefäße) in unseren Räumlichkeiten ausgelegt und analysiert. Keine der erprobten Optionen führte zu brauchbaren Resultaten. Membranen trockneten aus und wurden rissig. Elektrostatische Aufladungen beeinflussten die Menge des festgehaltenen Staubs, oder die Materialien hielten den Staub nicht fest. Schließlich führten umfangreiche Recherchen zu speziellen Staubkollektoren, die zur Sammlung und Analyse im Zusammenhang mit Belastungen durch Hausstaubmilben entwickelt wurden und sich in jeden handelsüblichen Staubsauger integrieren lassen (siehe Abbildung 29).

Abbildung 29: Mitest Dust Collector (Quelle:

http://www.inbio.com/Mitest_Dust_Collector.html)

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Die Methodik mit diesen Kollektoren wurde erst relativ spät entdeckt und konnte somit nicht mehr in die Studie zur Analytik der Staubproben, die von der Umweltambulanz gesammelt wurden, integriert werden. Da diese Staubkollektoren vom Hersteller für weitgehend vergleichbare Anforderungen entwickelt wurden (Sammlung von Staub zum Nachweis von Hausstaubmilbenallergenen), bietet sich die Anwendung dieses Werkzeuges an. Die Filter werden nur zum Einmalgebrauch verwendet, wodurch sich Kreuzkontaminationen vermeiden lassen. Damit ist das Staubsammelsystem ideal in unsere Methodik integrierbar. Gehring et al. Bestätigen Korrelationen von Hausstaubmilbenallergenen, Endotoxinen und β-Glucan im Hausstaub (Gehring, Douwes et al. 2001).

4.8 Messung der β-(1→3)-Glucan-Konzentrationen von Staubproben, die von der Umweltambulanz gesammelt wurden

Die von der Umweltambulanz im Rahmen der Studie erhaltenen Staubproben wurden nach der Methodik des LGA/BW (Landesgesundheitsamt Baden-Württemberg 2001) gesammelt und mikrobiologisch, sowie parallel mit dem β-(1-3)-Glucan ELISA analysiert. Die Probennahme und die Probenaufbereitung sind im Berichtsteil der Umweltambulanz detailliert beschrieben .

S Untersuchungs- datum Alter Geschlecht Glucankonzen-

tration pro m2

Staub-CFU

pro m2

1 10.07.2003 63 w 3,480 9380 2 01.08.2003 44 w 9,010 117480 3 18.07.2003 42 m 3,240 143820 4 18.07.2003 51 w 4,630 88690 5 26.08.2003 73 w 3,040 468050 6 05.09.2003 68 m 2,240 153340 7 28.08.2003 79 w 1,060 19260 8 11.09.2003 42 w 2,110 282348 9 12.09.2003 35 w 3,110 82748

10 18.09.2003 71 m 6,200 247900 11 25.09.2003 26 w 1,830 8710 12 07.10.2003 69 m 2,680 67275 13 09.10.2003 65 m 2,570 98120 14 10.10.2003 34 w 2,580 116888 15 29.10.2003 46 w 2,040 90630 16 07.11.2003 73 w 1,460 123004 17 05.11.2003 56 m 2,810 34254 18 11.11.2003 50 w 3,560 36729 19 13.11.2003 55 w 2,680 36520 20 21.11.2003 40 w 3,040 35280 21 05.11.2003 64 w 3,050 37500 22 27.11.2003 44 w 1,250 41168 23 02.12.2003 73 w 2,930 151857 24 16.12.2003 40 w 3,260 595091 25 09.01.2004 40 m 2,570 72000

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tration pro m2

Staub-CFU pro m2

26 13.01.2004 59 w 2,420 778440 27 16.01.2004 43 w 4,000 23112 28 02.01.2004 32 w 2,770 270800 29 23.01.2004 32 w 1,860 3634 30 27.01.2004 32 w 2,850 31152 31 28.01.2004 61 w 0,890 4422 32 29.01.2004 29 w 2,850 66669 33 11.02.2004 50 w 2,920 20705 34 07.02.2004 43 m 3,080 1216264 35 18.02.2004 46 w 5,490 266955 36 19.02.2004 23 w 8,190 187000 37 02.03.2004 55 m 1,720 107712 38 03.03.2004 34 w 2,750 45248 39 04.03.2004 64 m 3,560 275464 40 09.03.2004 41 w 2,850 33864 41 17.03.2004 55 w 2,660 265860 42 18.03.2004 40 w 4,230 1970746 43 03.03.2004 31 m 2,530 67872 44 25.03.2004 51 m 4,050 124712 45 26.03.2004 30 m 2,510 533450 46 20.04.2004 46 w 3,810 1675040 47 27.04.2004 71 m 2,470 167475 48 29.04.2004 65 w 2,140 98040 49 06.05.2004 47 w 1,860 46800 50 25.05.2004 40 w 5,650 868173 51 19.05.2004 79 w 1,230 15720 52 27.05.2004 62 w 3,060 270479 53 24.06.2004 51 m 3,720 498004 54 30.06.2004 37 m 2,120 736250 55 16.07.2004 55 m 1,010 638676 56 28.07.2004 41 w 4,040 252338 57 26.07.2004 33 w 1,310 119548 58 12.08.2004 65 m 2,330 720228 59 14.09.2004 33 m 0,880 180686 60 15.09.2004 45 w 2,790 7272600 61 16.09.2004 43 m 2,110 266090 62 23.09.2004 49 w 2,530 331678 63 08.10.2004 31 w 0,770 52160 64 28.10.2004 61 m 2,770 137223 65 29.10.2004 37 m 3,200 212602 66 12.11.2004 41 w 2,540 107060 67 23.11.2004 44 w 3,050 324688 68 24.11.2004 22 w 2,250 193177 69 25.11.2004 35 m 1,950 76686 70 03.12.2004 25 w 1,010 72137 71 30.11.2004 64 w 5,390 125936 72 02.12.2004 67 w 4,900 6277102 73 07.12.2004 52 w 2,710 67626 74 15.12.2004 47 w 2,990 56066 75 21.12.2004 42 w 1,300 62988 76 04.01.2005 44 m 0,800 32670 77 12.01.2005 38 w 1,570 83300

59


tration pro m2

Staub-CFU pro m2

78 11.01.2005 41 w 0,770 167375 79 14.01.2005 64 m 10,240 225976 80 18.01.2005 53 m 2,040 178648 81 19.01.2005 63 w 2,250 414510 82 27.01.2005 26 w 0,930 157542 83 28.01.2005 22 m 2,860 3394500 84 02.02.2005 32 m 1,030 321114 85 01.02.2005 56 m 2,210 870570 86 03.02.2005 50 m 2,860 148452 87 15.02.2005 24 m 1,030 275544 88 05.02.2005 52 w 1,020 32648 89 25.02.2005 33 w 3,020 1070150 90 01.03.2005 50 m 2,910 1590433 91 03.03.2005 32 w 2,870 396770 92 09.03.2005 40 w 2,110 98212 93 06.04.2005 58 w 3,060 51972 94 17.03.2005 47 w 2,260 179252 95 18.03.2005 40 m 2,370 716412 96 04.04.2005 51 m 2,030 127542 97 07.04.2005 51 w 4,090 128304 98 03.05.2005 48 m 2,880 663336 99 19.04.2005 31 m 3,200 116865 100 25.04.2005 29 m 1,370 213405

Abbildung 30: Ergebnisse der Messungen der β-(1→3)-Glucan-Konzentration (immunologische Methode mittels ELISA) und der koloniebildenden Einheiten (kulturelle Methgode) gemessen in Staubproben aus Teppichen pro qm jedes Patienten.

Wie in den Auswertungen der klinischen Ausführungen beschrieben, konnte die Auswertung der 100 untersuchten Patienten einen Zusammenhang zwischen gesundheitlichen Beschwerden und Schimmelnachweis in der Wohnung zeigen. Dies bestätigt damit Beobachtungen epidemiologischer Studien. Der Schimmelnachweis wurde kulturell erbracht nach derzeit anerkannten Methoden. Ein statistischer Test konnte einen Zusammenhang zwischen kulturellem Schimmelwachstum und Glucannachweis im Staub erbringen. Nach einer ersten ELISA-Analytik der Staubproben wurden Aliquots des verbleibenden Probenmaterials wieder tiefgefroren. Nach ca. 1 Monat wurden die Proben stichprobenartig nachgemessen. Keine auffälligen Unterschiede der Glucankonzentrationen zwischen den Messungen wurden festgestellt. Die Proben sind daher auch nach längerer Zeit noch für weitere Probenaufarbeitungen verwendbar.

4.8.1 Vergleich von Endotoxin- und β-(1→3)-Glucankonzentrationen ß-Glucane sind Bestandteile von Schimmelpilzsporen und besitzen in vieler Hinsicht mit Endotoxinen vergleichbare Eigenschaften. Endotoxine sind bei der Lyse gramnegativer Bakterien freiwerdende Toxine und somit ebenfalls ein Indikator für mikrobielle Kontaminationen. Deshalb ist die Korrelation zwischen Endotoxin und

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β-Glucankonzentration von Interesse (Gehring, Douwes et al. 2001). Endotoxine stellen Lipopolysaccharide dar und sind Bestandteil der Zellmembranen gramnegativer Bakterien. Sie besitzen Eigenschaften, die die menschliche Gesundheit erheblich beeinträchtigen. Mit unterschiedlicher Symptomausprägung. Zu diesen Symptomen zählen akute Effekte wie Fieberschübe ebenso wie Husten und allergische Effekte. Auch beim Endotoxinnachweis spielt die Staubexposition und damit die Staubanalytik eine wichtige Rolle. Die Tatsache, dass der überaus geläufige und breit angewendete LAL-Test (Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test), der speziell für den empfindlichen Nachweis von Endotoxinen eingesetzt wird, auch auf ß-Glucan reagiert, ist ein weiteres Kriterium der gemeinsamen Eigenschaften von ß-Glucanen und Endotoxinen (Harrison, Tsuji et al. 1979; Devleeschouwer, Cornil et al. 1985; Naqvi, Mirza et al. 2004; Matuszewska, Miks et al. 2005). Es kann darüber hinaus angenommen werden, dass sich gesundheitliche Auswirkungen von Endotoxinen und ß-Glucan, bei gleichzeitiger Exposition gegenseitig verstärken. Dies kann insofern eine wichtige Rolle spielen, da gramnegative Bakterien und Schimmelpilze häufig miteinander vergesellschaftet auftreten. Aus diesem Grund ist es durchaus sinnvoll, Endotoxine und ß-Glucan parallel nachzuweisen, bzw. einander analytisch gegenüberzustellen um ein kompletteres Spektrum zu erhalten. Da der LAL-Test auf Endotoxine und auch ß-Glucan anspricht, kann der ß-Glucan-ELISA auch ein anlytisches Werkzeug zur besseren Differenzierung zwichen Endotoxinen und ß- Glucan bei ergänzender Anwendung des LAL-Tests beitragen. In Kooperation mit dem Institut für Arbeits- und Umweltmedizin des Klinikums der Universität München wurden deshalb vorbehandelte Staubproben, die von der Universität München zur Verfügung gestellt wurden, entsprechend unserer Methodik auf den β-(1→3)-Glucan-Gehalt untersucht, wobei durch parallele Bestimmungen des Endotoxin-Gehaltes (durch das Institut für Arbeits- und Umweltmedizin der Universität München) tatsächlich eine positive Korrelation, allerdings auf der Basis einer sehr geringen Stichprobenanzahl aufgezeigt werden konnte. Dies indiziert einerseits mögliche Zusammenhänge in der Belastung und unterstreicht andererseits die Notwendigkeit der Testverfahren gegen β-Glucan und Ensotoxine. Es ist deshalb zu überlegen, inwieweit für eine aussagekräftige Analytik künftig etablierte Verfahren zur Endotoxinbestimmung parallel mit der ß-Glucanbestimmung angeboten werden sollen.

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Staubprobe Endotoxin (EU/mg Staub)

(EU=Endotoxin Units) 1,3-ß Glucan (mg/g Staub)

1 24.7 2,81

2 22,7 2,46

3 25,7 2,53

1 90,1 3,90 2 51,7 3,32

3 73,1 3,74

Abbildung 31: Vergleich von Endotoxin- und β-(1→3)-Glucankonzentrationen in Staubproben, die von der Universität München zur Verfügung gestellt wurden. Die Endotoxinkonzentrationen wurden an der Universität München bestimmt.

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5 Teststreifenentwicklung Schnellteststreifen werden in vielen Bereichen, besonders im klinischen Bereich immer häufiger eingesetzt. Die Umsätze für Schnellteststreifen wachsen jährlich um ca. 25%. Sie bieten die Vorteile einer unkomplizierten vor Ort Anwendung und können auch von nicht speziell ausgebildeten Personen problemlos ausgeführt werden.

5.1 Teststreifen Aufbau Die bei der Etablierung der Teststreifen eingesetzten Funktionselemente sind in Abbildung 32, die immunchemische Konzeption in Abbildung 33 dargestellt.

Capture Line

Backing Card

Absorbant Paper Membrane Sample Pad

Conjugate Release Pad

Tape

Control Line

Abbildung 32: Aufbau eines Lateral-Flow-Teststreifen Die zu analysierende Probe wird auf das Probenfeld (sample pad) aufgetragen und durch den Kapillarfluss, welcher durch das Adsorbant Paper vermittelt wird, entlang des Teststreifens zum so genannten Conjugate Release Pad transportiert, welches das farbige kolloide Goldpartikel-Antikörper-Konjugat enthält. Da die optische Signalerzeugung in hohem Maße von der Qualität der Goldkonjugate abhängt, fällt diesen eine Schlüsselrolle zu. Die Synthese ist sehr komplex und erfordert viel Erfahrung und Kenntnisse. Aus diesem Grund wurden die Anti-Laminarin-Antikörper-Gold-Konjugate in Kooperation mit der Firma Bioassay Works, MD, USA durchgeführt, die in diesem Bereich über jahrzehntelange Erfahrung verfügt. Die enge Zusammenarbeit mit dieser Firma ermöglichte uns den Zugriff auf Goldkonjugate höchster Qualität, welche nahezu frei von Aggregatbildungen sind und somit die Gefahr unspezifischer Hintergrundsignale außerordentlich minimieren. Die im Rahmen der Goldkonjugatsynthese angewandten biochemischen Methoden modifizieren die vorgereinigten Antikörper derart, dass sie in den Eigenschaften Löslichkeit, Ladungsdichte und Hydrophobizität auf die zu konjugierenden Goldpartikel abgestimmt sind. Die Goldkonjugate werden schließlich auf dem Conjugate-Release-Pad, einem Glasfasermaterial immobilisiert. Spezielle Zusätze ermöglichen, dass sich die Goldkolloide wieder vom Material ablösen und im kapillaren Strom weiter transportiert werden können.

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Eine zentrale Funktion nimmt die Membran ein, auf der Laminarin-Konjugat (Fängerlinie) und Anti-Kaninchen-IgG (Kontrolllinie) immobilisiert werden. Die Immobilisierung, also das Aufbringen der Reagenzien, erfolgt mittels eines speziellen Bioprinters, durch den die exakte Dosierung der Biochemikalien, und somit eine gleich bleibende Qualität der Testlinien sichergestellt werden kann. Die Membran des Testsstreifens ist für die Testqualitätsmerkmale von zentraler Bedeutung. Deshalb ist die Erprobung verschiedener Membranmaterialien erforderlich. Die Auswahl einer geeigneten Membran orientiert sich an verschiedenen Grundmaterialien (Nitrocellulose, Nylon, Celluloseacetat), die sich in verschiedenen Eigenschaften, wie z.B. die Porengröße voneinander unterscheiden. Durch optimale Auswahl der Membranmaterialien für die jeweiligen Testanforderungen kann somit gezielt die Assaysensitivität gesteigert und Störeffekte minimiert werden. Dabei muss jedoch auch auf die Kompatibilität der Membranmaterialien mit den Analyten bzw. den Konjugaten geachtet werden. Die Goldkonjugate werden auf dem Conjugate-Release-Pad, einem Glasfasermaterial immobilisiert. Spezielle Zusätze ermöglichen, dass die Goldkolloide beim kapillaren Fluss vom Material wieder gelöst werden können.

5.2 Prinzip des Teststreifens Wie beim ELISA resultiert eine negative Probe mit einem positiven Signal und umgekehrt. Die Kontrolllinie (Control Line) besteht aus immobilisiertem Anti-Kaninchen-IgG, das wirtsspezifisch den Anti-β-Glucan-Antikörper erkennt. Damit entsteht in jedem Fall, also bei β-Glucan-positiven wie -negativen Proben, ein optisch auswertbares Signal. Dieses Signal indiziert die Funktionsfähigkeit des Tests bei jeder individuellen Anwendung (Positivkontrolle). Befinden sich also β-Glucane in einer Probe, interagieren diese mit dem goldkonjugierten Anti-Laminarin-Antikörper und besetzen so dessen antigene Bindungsstellen. Der Goldpartikel-Antikörper-Komplex kann somit nicht mehr an das auf der Fängerlinie (Capture Line) der Membran immobilisierte β-Glucan-Protein-Konjugat binden, wodurch dort keine Färbung auftreten kann. Bei Proben ohne β-Glucan immobilisiert der goldkonjugierte Antikörper mit seinen dann freien Bindungsstellen an der Fängerlinie. Es kommt folglich nur bei negativen Proben zu einem Signal in Form einer roten Linie (siehe Abbildung 33).

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anti-Wirt IgG Ab

Hapten-Konjugat

anti-Analyt Ab-Konjugat

mit Analyt ohne Analyt

Abbildung 33: Funktionsprinzip eines kompetitiven Teststreifens

5.3 Methodik zur Optimierung des Lateral-Flow-Teststreifens Im Einzelnen wurden unter anderem die folgenden Modifikationen von Puffersystemen und Reagenzien erprobt:

5.3.1 Optimierung des Probenpuffers Der Probenpuffer hat Einfluss auf die Fließgeschwindigkeit, das Fließverhalten und die Signalstärke auf den Teststreifen. Es wurden bislang unter anderem folgende Puffer getestet.

• PBS (Probenverdünnungspuffer ohne Gelatine, pH 7,5), 0,05% Tween 20 • PBS, 0,5% Tween 20 • TBS, (20 mM Tris, 0,9% NaCl, pH 8,2), 1% Fischgelatine, 0,5% Tween 20

5.3.2 Optimierung der Antigenlösung zur Herstellung der Fängerlinie Bei manuellem Aufbringen der Fängerlinie ist eine genaue Justierung des Auftragsvolumens nicht sicher gestellt. Die Richtwerte zur Orientierung betragen ca. 1-2 µL/cm, in Abhängigkeit zum verwendeten Membransystem. Im Vergleich zum Auftrag mit dem Bioprinting-Gerät, können so etwa doppelt so hohe Konzentrationen des aufzubringenden Reagenz auf der Membran entstehen. Die optimale Konzentration des Laminarin-BSA-Konjugats für die Fängerlinie wird derzeit noch evaluiert, da bei zu hohen Proteinkonzentrationen verstärkt unspezifische Wechselwirkungen auftreten können. Da die Laminarinkonzentration im Konjugat nicht eindeutig definiert werden kann, wird zur Vereinfachung mit definierten Verdünnungen des

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Konjugats gearbeitet. Verdünnungen des Konjugats im Bereich 1:2 – 1:10 wurden erprobt. Die optimale Verdünnung des Konjugats ist noch einzustellen. Von den getesteten Beschichtungslösungen erwiesen sich der Einsatz eines Puffers mit geringerer Salzkonzentration, der Zusatz von Ethanol und die Verwendung einer geringen Menge an Detergens als am besten geeignet. Durch die Zugabe von Ethanol kommt es zu klareren, weniger verschwommenen Linien.

5.3.3 Variationen in der Beschichtungskonzentration und Zusammensetzung der Beschichtungslösung für Kontrolllinie

Durch Erhöhung der Beschichtungskonzentration kann eine Erhöhung der Signalstärke auf dem Teststreifen erreicht werden. Allerdings ist die Aufnahmekapazität der Membranen für Proteine limitiert. Der Anti-Kaninchen-Antikörper wird als Kontroll-Linie in der Konzentration von 2 mg/mL auf die Membran aufgetragen. Die Verwendung von Zusätzen wie Ethanol, bestimmten Proteinen, und geringe Mengen an Detergens sollen sich positiv auf die Linienschärfe und Signalintensität auswirken.

5.3.4 Conjugate Release Pads (CRPs) Die Zusammensetzung der Lösungen für die CRPs hat den größten Einfluss auf die Freisetzung des Goldkonjugates vom Pad und damit auf die anschließende Signalstärke und Sensitivität. Daher wurden weitere Modifikationen in der Zusammensetzung der CRP-Lösungen durchgeführt (Abbildung 34). Pad Nr. Zucker Polymer Protein Detergens Lösungsmittel 1 3% Sucrose 0,01% FG PBS 2 3% Sucrose 0,01% FG Phosphat-Puffer

(Pi-Puffer) 3 3% Sucrose Pi-Puffer 4 3% Sucrose 0,2% PVA 0,2% Tween 20 Pi-Puffer 5 3% Sucrose 0,2% PVA 0,01% FG 0,2% Tween 20 Pi-Puffer 6 3% Sucrose 0,2% PVA 0,01% FG 0,2% Tween 20 H2O dest. Abbildung 34: Lösungen für die Herstellung der Conjugate Release Pads Da nach Angaben des Herstellers der Goldkonjugate diese auch direkt dem Probenpuffer beigegeben werden können, wurde diese Möglichkeit zunächst angewendet.

5.3.5 Variationen in der Linienhöhe Je weiter die Testlinie von der Basis der Membran entfernt ist, umso höher ist die Sensitivität, da die Signalstärke von der Fließlänge abhängt. Andererseits steigt damit auch der Zeitaufwand für einen Test. Die Einstellung der Testlinie auf eine Höhe von 1,4 cm, die Kontrolllinie auf 1,8 cm, jeweils an der Membranbasis wurde zunächst festgelegt.

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5.3.6 Auswahl geeigneter Membrantypen Die ersten Testansätze wurden auf Membranen durchgeführt, die sich bei anderen Anwendungen als geeignet erwiesen hatten. Die besten Resultate zeigten dabei Membranen der Hersteller Millipore und Sartorius (Millipore HiFlow Plus HF13504, Sartorius Mylar Supported CN). Diese Membranen sind durch mittlere Fließgeschwindigkeit ausgewiesen. Die Sensitivität eines Tests lässt sich durch Einsatz von Membranen mit niedrigerer Fließgeschwindigkeit erhöhen. Das Risiko unspezifischer Bindungen und damit falsch positiver Signale ist dabei allerdings erhöht. Als weitere Membranen wurden erprobt:

• Whatmann Immunopure FP • Sartorius CN 200 • Sartorius CN 140 • Sartorius CN 140 (quer zur Stripe-Richtung geschnitten) • Sartorius CN 90 • Millipore HiFlow Plus 07504 • Predator (Pall)

Die Membranen wurden nach Beschichtung über Nacht bei RT getrocknet und anschließend unter Vakuum in Alufolie eingeschweißt und bis zur Herstellung der Teststreifen bei 4 °C gelagert.

5.3.7 Sample Pads Als Sample Pads wurde Papier von Schleicher & Schuell (Nr. 470) verwendet. Es wurde unbehandelt eingesetzt. Die Behandlung des Sample Pads spielt eine nur untergeordnete Rolle. Teilweise kann bei unspezifischen Bindungen der Einsatz von Detergenz im Pad eine Verbesserung erzielen, was aber ebenso zu einer Signalminderung führen kann. Daher wurde zunächst auf Zusätze im Sample Pad verzichtet.

5.4 Ergebnisse der Teststreifenentwicklung Es wurden jeweils 200 µl Probe in ein Eppendorfgefäß gegeben. Als Probe wurden unterschiedliche Konzentrationen an Laminarin in Probenpuffer sowie eine Negativkontrolle (ohne Laminarin) eingesetzt. Die Teststreifen wurden für 10 min in die Probe gestellt, bis die Flüssigkeitssäule den Teststreifen kapillar durchlaufen hatte. Anschließend wurden die Teststreifen bei RT getrocknet. Lateral Flow-Assays sind Testsysteme, die qualitative, ggf. auch semiquantitative Resultate erbringen. Für die Erzielung quantitativer Messwerte sind laboranalytische Verfahren, wie sie mit der ELISA-Technologie etabliert wurde, vorzuziehen. Schnellteststreifen bieten allerdings den Vorteil einer unkomplizierten, preiswerten und laborunabhängigen Anwendung. Die Auswertung der Messungen der Staubproben mit Hilfe des ELISA verdeutlichte klar die Notwendigkeit einer quantitativen Analytik. Dies lässt den Schluss zu, dass die Anwendung

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der Lateral-Flow-Tests mit qualitativen Resultaten zur Einordnung der Proben in definierte Konzentrationsbereiche, wie sie offensichtlich erforderlich ist, in dieser Ausführung nicht herangezogen werden kann. Es existieren allerdings Instrumente, mit denen eine semiquantitative Auswertung bewerkstelligt werden kann. Da jedoch zügig weitere Anwendungsfelder mit unterschiedlichem Anforderungsprofil erschlossen werden sollen, ist die Etablierung des Teststreifens auf jeden Fall sinnvoll. Er kann auch dazu beitragen, dass weitere Anwendungen, auch für den ELISA-Kit, leichter erschlossen werden können. Zu erprobende Anwendungen im Wohnbereich, die Prüfung von Baumaterialien, die Überprüfung von Kulturflüssigkeiten im klinischen Bereich oder die klinische Diagnostik selbst können derartige Bereiche darstellen. Die Methodenentwicklung zur Etablierung des Anti-β-Glucan-Teststreifens ergab die im Folgenden angegebene Vorgehensweise und Rezepturen. Der Teststreifen ist noch nicht optimiert. Die Resultate zeigen allerdings, dass auf Grundlage der verfügbaren Reagenzien ein Signal auf dem Teststreifen erzielt werden konnte (Abbildung 35). Auch die Funktionsfähigkeit der Kontrolllinie konnte gezeigt werden. Optimierungsarbeiten zur Erzielung einer ausreichenden Sensitivität, weiteren Testeigenschaften wie einer ausreichenden Signalstärke, einer zufrieden stellenden optischen Ansprechbarkeit und die Anpassung an relevante Probenmatrices sind Gegenstand weiterer Arbeiten.

Abbildung 35: Beim Teststreifen ohne Analyt ist eine zweite Linie erkennbar (siehe Pfeil), während diese bei Zugabe eines Analyten nicht vorhanden ist.

5.4.1 Zusammensetzung der optimierten Lösungen nach dem gegenwärtigen Stand

Die Beschichtungslösung setzt sich wie folgt zusammen:

PBS, 10mM, pH 7,0 2% Ethanol 0,005% Triton X-100

Für die Fängerlinie: BSA-Laminarinkonjugat aus der Stocklösung der Immunisierung im

Verhältnis 1:2 in Beschichtungslösung

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Für die Kontrolllinie: Anti-Kaninchen-IgG 2 mg/mL in Beschichtungslösung Konjugat: Anti-Lam 1-Goldkonjugat von Bioassay Works (verschiedene Mengen) Probenpuffer: PBS (Probenverdünnungspuffer ohne Gelatine, pH 7,5), 0,05%

Tween 20 Membran: Millipore HiFlow Plus 07504 CRP: Glasfaser Pad 8980 von Ahlstrom mit 3% Sucrose, 0,2% Polyvinyl-

alkohol, 0,2% Tween in Pi-Puffer Sample Pad: Papier von Schleicher & Schuell (Nr. 470) In ersten Versuchen konnte mit unterschiedlichen Kombinationen an Materialien und Reagenzien keinerlei Signal, mit Ausnahme des Erscheinens der Kontrolllinie erzielt werden. Diese Fehlversuche lagen darin begründet, dass das immobilisierte Laminarin auf der Fängerlinie vom Kapillarfluss gelöst wird. Auch waren erste Chargen der Goldkonjugate qualitativ nicht ausreichend. Als Konsequenz dessen wurde mit einem Laminarin-BSA-Konjugat anstatt mit Laminarin beschichtet. Damit ist eine funktionierende Immobilisierung gewährleistet. Andererseits ist die Menge des immobilisierten Laminarins dadurch erheblich geringer, was die gegenwärtig noch zu schwache Siganlstärke bewirkt. Tatsächlich ist die Signalstärke auf der Fängerlinie nur in Ansätzen erkennbar. Die noch nicht optimale Qualität der abgebildeten Teststreifen ist auf noch erforderliche Optimierungsarbeiten zurückzuführen, die jedoch über den Förderzeitraum hinaus fortgesetzt werden.

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6 Validierungsversuche mittels HPLC Im Rahmen der geplanten Zertifizierung der Testherstellung und –durchführung nach ISO 9000 bzw. zur Erlangung des CE-Zeichens ist es meist erforderlich,, ein zweites unabhängiges technisch-analytisches Verfahren zur Validierung etabliert zu haben. Aus diesem Grund wurden Anstrengungen unternommen, β-(1→3)-Glucan mittels der HPLC-Analytik nachzuweisen. Um Aussagen über in der Probe enthaltene Inhaltsstoffe treffen zu können, ist es essenziell, dass diese mit der C18-Säule der HPLC interagieren und somit Retention erfahren. Da die Inhaltsstoffe jedoch ebenfalls mit dem Laufmittel interagieren, muss eine geeignete Kombination von Laufmitteln in optimalem Verhältnis zueinander eingesetzt werden. Da das β-Glucan Laminarin nur wasserlöslich ist, wurden ausschließlich Lösungsmittel eingesetzt, welche mit Wasser mischbar sind (z.B. THF, Methanol, Acetonitril) um durch wässrige Lösemittel eine Präzipitation des Laminarins im Säulengang zu vermeiden. Relativ gute Retention konnte mit den Laufmitteln Wasser/ Methanol, sowie Wasser/Acetonitril gegeben. Da der verschleißförderne Druck auf die Säule bei Einsatz von Acetonitril deutlich geringer ist, wird künftig dieses als Laufmittel eingesetzt. Da bei isokratischem Lösungsmittelverhältnis die Retention entweder viel zu schwach (< 1-2 min), oder viel zu stark (>30 min) ausfiel, wurde versucht, eine vernünftige Retention mittels eines Gradienten zu erreichen. Da bei unterschiedlichen Lösungsmittelverhältnissen auch die Absorption der Lösungsmittel eine Rolle spielt, musste die Absorptionswellenlänge für den UV-Detektor optimiert werden. Dabei stellte sich eine Detektionswellenlänge von 260 nm als geeignet heraus, da bei dieser Wellenlänge zwar Laminarin absorbiert, Acetonitril jedoch nur noch geringe Hintergrundsignale gibt (siehe Abbildung 36).

70

0 5 10 15

Time (min)

0

50

100

mAU

Abbildung 36: β-Glucan-Signal unter Einsatz der HPLC nach 8 min; der Hügel zwischen 9-14 min ist auf Absorption des Lösungsmittels Acetonitril zurückzuführen.

Folgende Bedingungen stellten sich als geeignet heraus: Säule: Eurospher-100 (C18) Eluenten: A) Wasser, B) Acetonitril Gradient: 2 min 80% A, in 5 min auf 30% A, 2 min 30% A, in 2 min auf 80 %A, 2 min 80% A halten Flussrate: 1 ml/min Temperatur: 25 °C Detektion: 260 nm Injektionsvolumen: 20 µl Es ist jedoch anzumerken, dass die Staubprobenmatrix vor dem Einsatz in der HPLC-Analytik noch intensiver Vorreinigungsschritte bedarf, um den Säulengang nicht zu verstopfen. Zudem sind auch dort einzelne Bestandteile enthalten, die ebenfalls bei 260 nm absorbieren. Es wird deshalb vorgeschlagen, das Laminarin bzw. die enthaltenen β-Glucane zu derivatisieren, um das Absorptionsspektrum des Laminarins auf über 300 nm zu erweitern. Bei Wellenlängen oberhalb des UV-Bereichs sind lösliche Verunreinigungen mangels Absorption weniger störend. Um die Signalstärke noch weiter zu optimieren, wäre eine Detektion mittels Fluoreszenz dienlich, bei der es unterschiedliche Wellenlängen für Anregung und Emission gibt. Da diese Methodik allerdings sehr teure Zusatzgeräte benötigt, wurde dieser Ansatz zunächst nicht weiter verfolgt.

71

7 Diskussion

7.1 β-(1→3)-Glucan-ELISA-Test Es wurde eine ELISA-Analytik zur quantitativen Bestimmung von β-(1→3)-Glucan etabliert, die den gestellten Anforderungen, auch kommerziellen Anforderungen, bezüglich Sensitivität, Spezifität und Reproduzierbarkeit in vollem Umfang genügen sollte. Die Untersuchungen zur Spezifität ergaben keinerlei Kreuzreaktivität strukturverwandter Glucane oder anderer Verbindungen. Besonders die Tatsache, dass Endotoxine nicht erkannt werden, eröffnet zusätzliche Möglichkeiten für mehrere Anwendungen, da gängige Endotoxintests sowohl Endotoxine, als auch Glucane erkennen. Unsere Resultate bestätigen zudem ein stabiles, kaum fehleranfälliges Testsystem. Der Einsatz stabilisierender Reagenzien resultierte in einem ELISA-Test-Kit, der aus Gesichtspunkten der Lagerfähigkeit und der Anwenderfreundlichkeit als kommerzieller Test-Kit eingesetzt werden kann. Das Konzept des ELISA-Kits und des Kits zur Staubprobennahme von Oberflächen ist erstellt und Prototypen der Test-Kits sind verfügbar. Die Probenvorbereitung von Staubproben für den ELISA wurde optimiert und validiert. Das Verfahren beinhaltet allerdings noch den relativ umständlichen Arbeitsschritt des Autoklavierens zum vollständigen Aufschluss der Probe. Dieser Prozess ist relativ umständlich und auch abhängig von der individuellen Geräteausstattung der einzelnen Anwender. Es wurde deshalb versucht, einen quantitativen Aufschluss durch chemische Verfahren, die in der Mikrobiologie und der Molekularbiologie etabliert sind, zu ersetzen. Auch physikalische Verfahren wie Ultraschallbehandlung, Aufkochen unter starkem Rühren, sowie Kombinationen verschiedener Methoden führten zu keinen so hohen Ausbeuten, wie sie durch Autoklavieren erzielt werden, vergleichbar gewesen wären. Somit muss dieser Arbeitsschritt zunächst beibehalten werden. Es sollen aber weitere Anstrengungen unternommen werden, den Aufschluss der Sporen zu vereinfachen. Als Konsequenz aus diesen Resultaten soll künftigen Anwendern die Option geboten werden, Staubproben zu sammeln und selbst, nach entsprechender Probenvorbereitung die Tests, im SensioMold ELISA-Kit selbst zu bestimmen und auszuwerten. Alternativ können Proben zur β-Glucan-Analytik an unser Labor eingeschickt werden. Für beide Optionen wurde ein Probennahme-Kit etabliert, der mit gängigen Staubsaugern kompatibel ist und speziell zur Sammlung von Staubproben konzipiert wurde. Damit stehen zwei Verfahrensmodifikationen zur Verfügung, auf deren Grundlage Staubproben auf ihren β-Glucan-Gehalt bestimmt werden können.

7.1.1 Single-Spezies-Untersuchungen Single-Spezies-Untersuchungen suspendierter Reinkulturen ergaben, dass alle untersuchten Spezies vom ELISA detektiert wurden. Allerdings wurden auch zum Teil erhebliche Unterschiede zwischen individuellen Spezies nachgewiesen. In einem Gespräch mit der Gruppe von Dr. Gabrio am LGA Baden-Württemberg wurde argumentiert, dass die Sporengröße und auch die Oberflächenstruktur der Sporen erhebliche Unterschiede im Glucangehalt nach sich ziehen können. Die gute Reproduzierbarkeit der Messwerte nach dem

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Aufschluss indiziert ebenfalls einen quantitativen Aufschluss von β-(1→3)-Glucan aus den Sporen.

7.1.2 Probennahme und Auswertung von Staubproben sowie klinische Bewertung der Resultate

„Schimmelpilze, die schwere gesundheitliche Schäden verursachen, werden immer zahlreicher“ erklärte Samson (Utrecht) auf der Jahrestagung der Deutschsprachigen Mykologischen Gesellschaft (MYK 2002) in München. Pilze in Innenräumen und an Arbeitsplätzen können zu schweren gesundheitlichen Beeinträchtigungen führen (Klinkhammer). Deshalb wird eine extensive Forschung gefordert. In einer Übersichtsarbeit zu „Vorkommen, Ursachen und gesundheitlichen Aspekten von Feuchteschäden in Wohnungen“ (Brasche, Heinz et al. 2003) veröffentlicht im Bundesgesundheitsblatt – Gesundheitsforschung – Gesundheitsschutz 2003 wurden 5530 zufällig ausgewählte Wohnungen begutachtet und 12132 Bewohner hinsichtlich allergischen Erkrankungen befragt. 1213 (21,9%) der untersuchten Wohnungen wiesen sichtbare Feuchteschäden (inklusive Schimmelpilz) und 513 (9,3%) Schimmelpilzschäden auf. Ein Zusammenhang zwischen den Schadensmerkmalen und der Prävalenz selbstberichteter allergischer und respiratorischer Erkrankungen konnte nachgewiesen werden. Das Vorhandensein von Feuchteschäden insgesamt erhöhte das Risiko, an Asthma zu erkranken, um 50%. Zahlreiche weitere Studien konnten einen Zusammenhang zwischen Beschwerden der oberen Atemwegen speziell, aber auch allgemeinen Beschwerden zeigen. In unserem Projekt wurde ein selektiertes Kollektiv von Personen untersucht, die sich krank fühlen und aufgrund subjektiver Einschätzung Schimmelschäden im Haus haben. Dadurch war ein hoher Anteil an Wohnungen mit tatsächlichem Schimmelbefall zu erwarten. Schimmel wurde durch objektive Messungen in 77% der Wohnungen eindeutig oder vermutlich nachgewiesen. Da in 23% der Wohnungen eine Innenraumquelle für Schimmel weitgehend ausgeschlossen werden konnte, bestand im Rahmen des Projektes die Möglichkeit, diese 2 Patientengruppen hinsichtlich gesundheitlicher Beschwerden zu vergleichen. Die anamnestischen Angaben der Patienten und die Ergebnisse objektiver klinischer Untersuchungsmethoden wurden in Bezug auf Schimmelbefall der Wohnung durch statistische Methoden auf Zusammenhänge untersucht. Allergische Reaktionen lassen sich durch klassische allergologische Tests (Hauttestungen, Immunologische Tests) nachweisen. Eine eindeutige Diagnose einer Schimmelpilzallergie ist allerdings immer noch schwierig. Ein Grund dafür ist die Tatsache, dass mehr als 100000 Schimmelpilzarten bekannt sind und einzelne Spezies bis zu 30 Allergene aufweisen. Für baubiologisch relevante Schimmelpilze existieren allerdings relativ wenige kommerzielle Antigene (Hoc). In unserem Kollektiv wiesen 4% der Patienten eine Schimmelpilzsensibilisierung auf. Damit liegen wir im statistischen Durchschnitt, in der Literatur wird angegeben, dass mit Hilfe der heute verfügbaren Nachweisverfahren bei rund 5% der Bevölkerung eine Sensibilisierung gegen Schimmelpilze festzustellen ist. Interessant ist die Feststellung unserer Studie, dass alle Patienten mit Sensibilisierungen auf Pilze in schimmelbelasteten Wohnungen hausten. Dies war statistisch berechnet ein signifikanter Zusammenhang. Daraus könnte man schlussfolgern, dass eine Schimmelexposition in der Wohnung die Sensibilisierungsrate fördert, wie auch o.g. Studie zeigen konnte.

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Zunehmend wird erkannt, dass Schimmelpilze außer allergischen auch entzündlich-reizende Wirkungen ausüben. Das erklärt die viel häufiger auftretenden Beschwerden der Patienten, auch bei fehlender Allergie. Diese entzündlich-toxischen Wirkungen unterscheiden sich häufig nicht von allergischen Symptomen, sind aber schwer verifizierbar, da hierfür keine spezifischen Tests zur Verfügung stehen. Geprüft wurden in Studien allgemein entzündliche Reaktionen mittles Laboruntersuchungen wie Blutsenkung, C-reaktives Protein, Blutbild, diverse Zytokine, Eosinophiles kationisches Protein (ECP). Die genaue Ursache für die entzündlich-toxischen Wirkungen ist noch nicht eindeutig geklärt, vermutet werden Stoffwechselprodukte oder Bestandteile von Pilzen. Insbesondere die β-(1-3)-Glucane als Zellwandbestandteil der Pilze stehen in Verdacht, proinflammatorische Effekte auszuüben. So konnte gezeigt werden, dass Symptome, Lungenfunktionsparameter und verschiedene Entzündungsmarker bei Exposition gegenüber β-(1-3)-Glucan pathologisch verändert waren (Rylander, Norrhall et al. 1998; Thorn und Rylander 1998; Rylander 1999; Douwes 2005). Insgesamt sind die Ergebnisse der Studien unterschiedlich, weiterer Forschungsbedarf wird angemahnt (Douwes 2005). Umfangreiche klinische und labortechnische Untersuchungen wurden in vorliegender Arbeit zur Überprüfung beschriebener oder möglicher Wirkungen der Glucane durchgeführt. In unserem Projekt konnten wir signifikante Korrelationen zwischen Symptomen der oberen Atemwege sowie der Blutsenkung als allgemeiner Entzündungsparameter und dem Schimmelnachweis aufgrund kultureller Methoden nachweisen. Die Höhe der Glucanwerte im Hausstaub zeigte keine signifikante Abhängigkeit zu klinischen Befunden. Möglicherweise sind größere Untersuchungszahlen erforderlich. Infektionen kommen selten und insbesondere nur bei abwehrgeschwächten Patienten vor. Deswegen wurde hinsichtlich von Mykosen keine weitergehende Diagnostik durchgeführt. Die Probennahme der Staubproben in den Wohnungen der Probanden erfolgte nach etablierten Verfahren (in Anlehnung an die Vorgaben von Dr. Gabrio, LGA Baden-Württemberg (Landesgesundheitsamt Baden-Württemberg 2001)) durch die Umweltambulanz des Klinikums. Die Proben wurden von der Umweltambulanz mikrobiologisch mit konventionellen Kulturmethoden und parallel dazu von Sension mit Hilfe des β-(1→3)-Glucan-ELISAs analysiert. Die Resultate und die statistische Auswertung sind im Ergebnisteil der Umweltmedizin dargestellt. Wie berichtet konnte die Auswertung der 100 untersuchten Patienten einen Zusammenhang zwischen gesundheitlichen Beschwerden und Schimmelnachweis in der Wohnung zeigen und bestätigt damit Beobachtungen weiterer Studien (Douwes, Zuidhof et al. 2000). Der Schimmelnachweis wurde mittels mikrobiologischer Kulturen nach derzeit anerkannten Methoden erbracht. Ein statistischer Test konnte einen Zusammenhang zwischen Schimmelwachstum in Zellkultur und Glucannachweis im Staub belegen. Die Signifikanzen sind allerdings nicht so deutlich, wie das für die Festlegung eines klaren Grenzwertes, der klinisch kritische Konzentrationen von unkritischen Konzentrationen differenziert, wünschenswert gewesen wäre. Es sollen für die Auswertung der ELISAs drei Bereiche mit der Untergliederung „unterer“, „mittlerer“ und „oberer“ Bereich festgelegt werden. Diese Einteilung wird Bestandteil der Testinstruktionen des ELISA-Kits sein.

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Auch bei kritischer Betrachtung der Abgrenzung bedenklicher Werte von Unbedenklichen ist festzuhalten, dass auch in den Leitlinien des LGA Baden-Württemberg (Landesgesundheitsamt Baden-Württemberg 2001) diese Abgrenzung auf der Grundlage anerkannter Methoden durchaus vergleichbare Probleme in der Abgrenzung aufzeigt. Alleine die sehr unterschiedliche Bewertung von Sommer- und Winterwerten zeigt die schwierige Abgrenzung. Staub stellt eine sehr komplexe und vor allem heterogene Matrix dar (Koistinen, Edwards et al. 2004). Der Einfluss der jeweiligen Oberflächen (Teppiche etc.) übt einen wichtigen Einfluss auf die schließlich gemessene β-Glucanmenge aus. Die Technik der Probennahme und das Substrat von dem die Staubprobe letztendlich geerntet wird, sind von großer Bedeutung und haben bei den Entwicklungsarbeiten eine zentrale Rolle eingenommen. Die Probennahme sollte verlässlich, praktikabel und integrierbar in einen Test-Kit sein. Einige der erprobten Ansätze, wie das Sammeln von Staubproben mit Textilunterlagen oder Nitrocellulosefiltern, erwiesen sich trotz anfänglicher Erfolge letztendlich als ungeeignet. Schließlich konnte mit dem Einsatz der beschriebenen Staubkollektoren, die in handelsübliche Staubsauger zu integrieren sind, eine Methodik etabliert werden, die der in der Studie verwendeten Staubsammlung weitgehend vergleichbar sein sollte (Gehring, Douwes et al. 2001; Arbes, Sever et al. 2005). Die Staubkollektoren wurden speziell für die Sammlung von Staubproben zur Analytik von Hausstaubmilbenallergen und vergleichbaren Allergenen konzipiert. Somit wird diese Methodik der Staubsammlung in unsere ELISA-Analytik integriert werden. Die Fortentwicklung der Probennahme wird bei der geplanten kontinuierlichen Fortentwicklung des Kits sicher auch weiterhin eine wichtige Rolle spielen. Hervorzuheben bleibt auch, dass sich durch die hohe Praktikabilität des Tests problemlos mehrere Proben nehmen lassen. Dadurch wird der Test nicht nur die geplante Einteilung in weniger oder mehr belastete Bereiche zulassen, sondern auch Aufschluss darüber geben, welche Bereiche höheren und welche geringeren Belastungen ausgesetzt sind. Die Möglichkeit, mehrere Proben parallel zu nehmen, sollte der Problematik, die im Rahmen einer qualifizierten Probensammlung häufig beschrieben wird, entgegenwirken. Die klinische Relevanz von β-(1→3)-Glucan ist in mehreren wissenschaftlichen Veröffentlichungen dokumentiert. Speziell auf die Eignung des β-Glucan-Tests im Zusammenhang mit der Problematik β-Glucan-haltigen Staubs wird in Chew et al. (Chew, Douwes et al. 2001) eingegangen. Williams DL und Douwes et al. (Williams 1997; Douwes, Zuidhof et al. 2000) dokumentieren den Zusammenhang gemessener Glucankonzentrationen mit gesundheitsrelevanten Symptomen in unterschiedlichen Studien. Es kann mit Sicherheit davon ausgegangen werden, dass ein Testsystem zur Detektion von β-(1→3)-Glucanen einen klinisch hochrelevanten Marker erfasst. Bei der Analytik im häuslichen Bereich ist der Probennahme, wie erörtert, große Aufmerksamkeit zu widmen (Landesgesundheitsamt Baden-Württemberg 2001).

7.1.3 Analytik von Baumaterialien Neben der Analytik von Staubproben soll auch die Untersuchung von Materialien wie Innenputz, Tapeten oder anderen Baumaterialien dazu beitragen, die Schimmelpilzbelastung bewerten zu können. Damit kann der Test ein Routineverfahren zur Bewertung von Bausubstanz darstellen. Erste Versuche zeigten, dass diese Vorgehensweise Informationen zur

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Belastung mit β-Glucanen liefern kann. Mögliche Anwendungen wurden geprüft. Offensichtlich durch Schimmel befallenes Material zeigte auch positive Signale im ELISA, im Gegensatz zu offensichtlich unbefallenem Material. Da auch abgetötes, nicht keimfähiges Material detektiert wird, ist es schwierig, gesicherte Kontrollmaterialien zu erhalten. Es sind diesbezüglich weitere Validierungsarbeiten erforderlich, die über den Förderzeitraum hinaus weiterverfolgt werden. Verschiedene Fachkongresse und Gespräche haben ergeben, dass in der Begutachtung von Bausubstanz ein Bedarf an geeigneten Analysemethoden besteht.

7.1.4 Geplante weitere Anwendungen des β-Glucan-ELISAs Die Staubproben, die Gegenstand der in dieser Studie durchgeführten Untersuchung waren, entstammten aus mehr oder weniger belasteten Wohnräumen. Darüber hinaus gibt es aber auch Gebäude, wo weit höhere Belastungen möglich sind, und zum Schutz der dort beschäftigten Personen ein analytisches Kontrollinstrument angeraten ist. Berichtet wird beispielsweise über durch Glucane ausgelöste Entzündungen von Arbeitern in Geflügelfarmen (Rylander und Carvalheiro 2006). Vergleichbare Belastungen könnten in weiteren landwirtschaftlich genutzten Räumlichkeiten, in verarbeitenden Betrieben oder allgemein in gewerblich genutzten Gebäuden auftreten, wo mit erhöhter Feuchtigkeit zu rechnen ist. Selbstverständlich trifft die Problematik von durch Feuchtigkeit bedingten Schäden kommerzielle und private Räumlichkeiten gleichermaßen. Die Problematik von Schimmelpilzen in Gebäuden und der damit verbundenen Belastungen ist von Hankammer und Lorenz (Hankammer und Lorenz 2003) ausführlich beschrieben. Die Anwendung quantitativer β-Glucanbestimmungen ist bei weitem nicht auf die beschriebenen Anwendungen begrenzt. Nur einige weitere Anwendungen sind im Folgenden exemplarisch beschrieben. Für die Diagnostik endogener Mykosen hat sich der β-Glucan-Nachweis bereits zur Beurteilung invasiver Candidosen bewährt (Willinger 2004). Dabei zeigten alle klinisch diagnostizierten Fälle tiefer oder systemischer Candida-Infektionen eindeutig positive Ergebnisse. Häufig wird der LAL-Test (Limulus amebocyte lysate test) (Foto, Plett et al. 2004) verwendet, der neben Endotoxinen auch β-Glucane erkennt. Diese Anwendung ist besonders deshalb interessant, weil die Diagnostik dieser tiefen Mykosen problembehaftet ist. Es existieren verschiedene LAL-basierte Testkits auf dem Markt (z.B. Fungitell Assay (Pickering, Sant et al. 2005)). Es ist zu prüfen, inwieweit ein ELISA gegenüber diesen Testsystemen, gerade auch bezüglich der Spezifität, Vorteile aufweisen kann, beispielsweise dadurch, dass Endotoxine im ELISA nicht erkannt werden und dadurch nicht mit der Glucanmessung interferieren. Falsch positive Resultate, bedingt durch unspezifische Reaktionen LAL-basierter kinetischer Test-Kits, werden in Yoshida et al. (Yoshida, Niki et al. 2005) berichtet. Damit weist ein spezifischerer ELISA-basierter β-Glucan-Test für die Diagnostik invasiver Mykosen signifikante Vorteile auf. Unsere Validierung ergab keinerlei Erkennung der eingesetzten Endotoxine. Die Eignung von β-(1→3)-D-Glucan als Marker für die Diagnostik von Pneumocystis carinii pneumonia wird vorgeschlagen und bestätigt (Yasuoka, Tachikawa et al. 1996; Shimizu, Oka et al. 2005). Somit ist ein Markt in der klinischen Diagnostik zur Erkennung invasiver fungaler Infektion mit Sicherheit gegeben. Die Notwendigkeit neuer Technologien für das

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mykologisch-medizinische Labor, unter Nennung des β-Glucan-Nachweises, wird ebenfalls beschrieben (Alexander 2002). Die erforderliche Sensitivität für klinische Untersuchungen liegt im Bereich von ca. 40 pg/L β-Glucan. Die für die Staubmessungen erforderliche Sensitivität liegt dagegen um Größenordnungen höher. Deshalb wären künftig Anstrengungen erforderlich, den Test im Hinblick auf eine signifikant gesteigerte Sensitivität zu optimieren. Vermutlich wäre dies am ehesten dadurch zu erzielen, dass die Mikrotiterplatten mit den Anti-β-Glucan-Antikörpern beschichtet werden. β-Glucan wäre an Peroxidase zu koppeln. Das dabei synthetisierte Konjugat würde mit freiem Glucan aus Standard oder Probe kompetitieren. Mit diesem Assayformat ließe sich die Sensitivität mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit wesentlich verbessern. Als weitere Anwendungen werden die Qualitätskontrolle in den Bereichen Biotechnologie, Lebensmittelzusatzstoffe, Kosmetika und im Zellkulturbereich genannt. In einer 2004 erstellten Checkliste Mikrobiologie und Hygiene-Bakteriologie des Sektorkomitees Medizinische Laboratorien ZLG (Zentralstelle der Länder für Gesundheitsschutz bei Arzneimitteln und Medizinprodukten 2004) wird auf eine differenzierte mikrobiologische Qualitätssicherung eingegangen. Die Anwendung eines empfindlichen β-Glucan-ELISA für diese Aufgabenstellung ist denkbar. In den Laboratory Standards des New York State Department of Health Wadsworth Center, Clinical Laboratory Evaluation Program sind ausführliche Anordnungen für die Notwendigkeit mykologischer Untersuchungen von Präparaten, Kulturflüssigkeiten etc. beschrieben. Ein vergleichsweise einfaches Verfahren zur Detektion von β-Glucan als Marker für Pilzinfektionen wäre auch in diesem Bereich sicher ein Instrument, das zusätzliche Sicherheit bietet. Vertreter gesundheitsbewusster Konsumenten äußern Interesse an einer verlässlichen Bestimmung von β-Glucanen in Hafer und Gerste. Dabei sollen Keimlinge mit hohem β-Glucan-Level frühzeitig eliminiert werden. In Kanada wird der Wunsch geäußert, ELISA-Systeme zum β-Glucan-Test einzusetzen, da diese rasch und wirtschaftlich für Screeningzwecke eingesetzt werden können. Auch interferieren β-Glucane im Brauprozess negativ. Hier sind es also nicht nur gesundheitliche sondern auch technische Probleme, denen mit einer praktikablen Routineanalytik begegnet werden kann. Wir konnten im Internet Informationen recherchieren, nach denen zufolge größere Hersteller von Haferprodukten wie General Mills and Quaker Oats (kanadische Hersteller) ihre Marketingaktivitäten auf der Grundlage solcher Test signifikant verbessern könnten. Es ist deshalb für uns von großem Interesse, den Test auch auf diese Anwendung auszudehnen, zu prüfen und zu validieren. Es wurden bereits ELISA-Tests mit Fruchtsäften durchgeführt. Dabei traten allerdings noch Störeffekte, ausgelöst durch die Saftmatrix auf, deren Ursache noch nicht endgültig erkannt und beseitigt werden konnte. Da β-Glucane bekanntermaßen auch Bestandteile von pflanzlichen Produkten sein können, sind diesbezügliche Interferenzen auszuschließen. Gerade in diesem Bereich ist erhebliches Marktpotenzial zu erwarten. Aus anderen Bereichen ist bekannt, dass eine Vor-Ort Analytik, beispielsweise bei der Ernte und ersten Verarbeitungsprozessen, hervorragender Marktakzeptanz begegnen kann. Dies wären ideale Bedingungen für den Einsatz von Teststreifen. Dieser Vor-Ort-Einsatz würde auch Möglichkeiten eröffnen, Fungizide nur noch gezielt und damit sparsamer einzusetzen. Eine β-Glucan-Bestimmung wird beispielsweise von der NovaBiotec Dr. Fechter GmbH angeboten. Es handelt sich um einen photometrischen Test mit einem Messbereich von 10 bis

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500 mg / L β-Glucan. Der Test ist auf die Problematik von Brauereien ausgerichtet. Auch die Problematik in der Baubiologie wird dort angesprochen. Es ist zu prüfen, inwieweit die mindestens 250-mal höhere Sensitivität des SensioMold ELISA dessen Vermarktungschancen verbessern kann. Außerdem ist für den photometrischen Test des Wettbewerbers eine vorherige Reinigung der Proben über eine Säule erforderlich. Der ELISA zur β-(1→3)-Glucanbestimmung soll auch als sogenannter R&D-Kit angeboten werden. Damit haben Anwender die Möglichkeit, deren Glucan-Analytik mit dem ELISA-Kit durchzuführen, ohne die von uns empfohlene Probenvorbereitung durchzuführen. Dadurch sollen weitere Anwendungsmöglichkeiten geboten werden.

7.2 Etablierung und künftige Anwendung des β-Glucan-Teststreifens

Der β-Glucan Teststreifen ist konzipiert für unkomplizierte Anwendungen vor-Ort. Einsatzmöglichkeiten wären zunächst die Überprüfung von Baumaterialien, Screening von Proben bei der Ernte entsprechender pflanzlicher Produkte. Die Vorteile der Anwendung von Teststreifen liegen auf der Hand. Überall dort, wo rasch und ohne Einsatz eines Labors getestet werden soll, sind Teststreifen das analytische Instrument der Wahl. Die Verfügbarkeit von Messergebnissen innerhalb von wenigen Minuten lässt auch rasche Entscheidungen zu. Bei der Überwachung industrieller Prozesse ist dies besonders vorteilhaft. In der einfachsten Anwendung führt der Einsatz von Lateral-Flow-Tetstreifen zu einer qualitativen Ja / Nein Antwort. Falls Anwender die Teststreifen für den Routinebetrieb einsetzen wollen, lohnt sich die Anschaffung von einfachen Messgeräten (Anschaffungspreis im Bereich einiger hundert Euro) zur Erzielung semiquantitativer Resultate durch Bestimmung der Farbintensität auf der Fängerlinie. Mit der intensiven Zusammenarbeit mit Bioassay Works, MA, USA ist der Firma Sension die Etablierung einer ausgesprochen wichtigen strategischen Partnerschaft im Bereich der Teststreifenentwicklung gelungen. Mehrere Entwicklungen werden gemeinsam verfolgt. Die Etablierung des β-Glucan-Tetstreifens ist die erste Produktentwicklung innerhalb dieser Allianz. Die Technologieplattform von Bioassay Works bietet die Möglichkeit für Qualitätsstandards, die sonst nur schwer zu erzielen wären. Ein weiterer, mindestens ebenso großer Vorteil liegt darin, dass die Technologieplattform frei von Patentrechten Dritter ist. Dies ist gerade dann von Bedeutung, wenn nachhaltiger wirtschaftlicher Erfolg angestrebt wird.

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7.3 Qualitätskontrolle, ergänzende HPLC-Analytik und Erstellung von SOPs

Die geplante Anwendung der analytischen Technologie als Dienstleistungsanalyse und der Verkauf der Test-Kits an Dritte erfordern eine fundierte Qualitätssicherung und klar definierte Produktionsvorschriften, die die Erstellung von SOPs mit einschließt. Sollten, wie geplant Testsysteme für die oben erläuteten Anwendungen für die klinische Diagnostik und die Überprüfung von Lebensmitteln folgen, werden diese Ansprüche noch einmal unterstrichen. Deshalb sollte auch eine weitere unabhängige Methode zur Kontrolle der ELISA-Analytik prinzipiell zur Verfügung stehen. Deshalb wurden die Trennbedingungen mit der HPLC-Analytik für höhere β-Glucankonzentrationen unter UV-Detektion etabliert. Diese Methodik stellt die Grundlage dar für die spätere Analytik von Proben, die naturgemäß komplexer und schwieriger sein wird und noch weitere intensive Probenaufbereitungs- und Optimierungsarbeiten erfordern wird.

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8 Fazit Mit dem etablierten ELISA wurde ein Routineverfahren zur Bestimmung von β-Glucanen und damit einem Marker für keimfähige und nicht keimfähige Schimmelpilze bzw. Schimmelpilzsporen etabliert und zur Verfügung gestellt. Die Testvalidierung bestätigte ein sensitives, und hoch spezifisches Routineverfahren zum Nachweis von β-Glucanen, das zunächst speziell für die Analytik von Staubproben validiert wurde. Der ELISA-Test besitzt eine hohe Sensitivität im Bereich weniger Nanogramm. Relevante Kreuzreaktivitäten, auch gegen strukturell verwandte Verbindungen, wurden nicht festgestellt. Der ELISA ist somit hochspezifisch für ß-(1,3)-Glucan. Damit kann der ELISA problemlos und ohne umfangreiche Probenvorbereitung für die Schimmelanalytik eingesetzt werden. Ein fertig konfektionierter Prototyp eines ELISA-Test-Kits mit Arbeitsvorschrift (Anlage 5) steht zur Verfügung. Dieser Test ist zunächst für die Bestimmung von Staubproben validiert worden. Weitere Anwendungen, über die Staubanalytik hinaus, die zum Teil in Vorversuchen schon erprobt wurden, sind geplant. Die Reagenzien des ELISAs konnten langzeitstabilisiert werden. Auf dieser Grundlage ist der ELISA-Test auch kommerziell verfügbar. Die Methodik zur Probennahme von Staubproben wurde an die Anforderung einer einfachen Anwendung angepasst, wodurch eine Probenahme von Staubproben ohne spezielle Gerätschaften mit einem handelsüblichen Staubsauger ermöglicht wird. Hierfür wurde ein spezieller Kit zur Sammlung von Staubproben erstellt. Im Hinblick darauf, dass die Bedeutung von β-Glucanen in steigendem Masse erkannt wird, zeigen sich neue Anwendungsfelder für die Routineanalytik, insbesondere auch in den Bereichen Lebensmitteltechnologie und medizinische Diagnostik. Den häufig gewünschten Anforderungen einer raschen Messung vor Ort kommt ein Teststreifen in idealer Weise entgegen. Die Etablierung eines Teststreifens wurde begonnen und die Machbarkeit einer erfolgreichen Entwicklung aufgezeigt. Die Auswertung der 100 untersuchten Patienten konnte einen Zusammenhang zwischen gesundheitlichen Beschwerden und Schimmelnachweis in der Wohnung zeigen. Signifikant war die Abhängigkeit von Symptomen im Nasenbereich (Schnupfen, verlegte Nasenatmung, Niesen, chronische Nasennebenhöhlenentzündungen), des Entzündungsparameters Blutsenkungsgeschwindigkeit und allergologischer Parameter insbesondere der IgE-Antikörper gegen Schimmelpilze von dem Nachweis von Schimmel im Wohnraum. Die Problematik schimmelbefallener Wohnungen ist in den letzten Jahren zunehmend erkannt worden und fordert im Sinne gesundheitlicher Prävention schnelle Maßnahmen. Dazu liefern die Erkenntnisse dieses Projektes weitere Unterstützung. In 77 Wohnungen war das Vorhandensein von Schimmel eindeutig oder wahrscheinlich aufgrund anerkannter Auswerteverfahren. Ein statistischer Test konnte den Zusammenhang zwischen Schimmelwachstum im Staub aufgrund kultureller Verfahren und Glucannachweis mittels ELISA erbringen.

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9 Kooperationen, Öffentlichkeitsarbeit und Vermarktungsaktivitäten

Durch Kooperation mit Landesgesundheitsamt Baden-Württemberg (Dr. Gabrio) konnte ein Technologietransfer bezüglich bestimmter Methoden zur mikrobiologischen Kultivierungen von Schimmelpilzspezies stattfinden. Dieser bei der Umweltambulanz des Klinikums etablierte Methodik konnte die ELISA-Analytik gegenübergestellt werden. Single-Spezies-Kulturen des LGA wurden im ELISA analysiert. An dieser Stelle sei dem LGA-Baden-Württemberg, im besonderen Herrn Dr. Gabrio, für seine kooperative Unterstützung gedankt.

Die Kooperation mit dem Baugutachterbüro Dr. Lorenz in Düsseldorf wird weiter gepflegt werden. Die weitere Validierung des Tests für die Analyse speziell von Baumaterialien wird hierfür erforderlich sein.

Insgesamt sollen weitere Kooperationspartner mit der Verfügbarkeit der Test-Kits einbezogen werden. Genetic ID, USA und Europe planen, die Test-Kits mit Hilfe deren Netzwerk anzubieten. Des Weiteren wurden eine Reihe von Kontakten zu spezialisierten Bauingenieuren und Architekten auf Fachveranstaltungen geknüpft. Die Umweltambulanz Augsburg hat interdisziplinäre Veranstaltungen für Fachleute und Informationsveranstaltungen zur Thematik ausgerichtet. Sowohl die Umweltambulanz als auch Sension waren als Referenten vertreten. Die große Tageszeitung „Augsburger Allgemeine“ hat ausführlich über eine dieser Veranstaltungen berichtet. Beim Kongress der International Society of Environmental Medicine und der Gesellschaft für Hygiene und Umweltmedizin in Halle sowie der Gesellschaft für Umweltmedizin in Erlangen waren ebenfalls beide Kooperationspartner mit einem Vortrag bzw. einer Posterpräsentation (siehe Anhang). vertreten. Ebenso wurden Ergebnisse bei einer Veranstaltung des LGA Baden-Württemberg präsentiert. Auf einer Veranstaltung für Einzelgespräche im Bereich der Baubiologie wurden Kontakte geknüpft und mögliche Anwendungsfelder diskutiert. Vertreter aus dem Baubereich, insbesondere der Baubiologie, zeigten Interesse an praktikablen Testsytemen, favorisierten aber besonders Teststreifen für Vor-Ort-Messungen. Das Projekt wird mit Sicherheit über die Projektlaufzeit hinaus fortgeführt, da es mit Aufgabenstellungen in Produktion und Vermarktung in direkter Beziehung steht. Erfahrungsgemäß ist die Verwertung von Produkten auch mit weitergehenden Produktverbesserungen und Weiterentwicklungen verbunden. Weitere attraktive Anwendungen der β-Glucananlytik sind in der Diskussion dargestellt. Der ELISA-Kit soll zunächst Fachleuten aus der Umweltmedizin angeboten werden. Dabei sollen insbesondere die Kontakte der Umweltambulanz Augsburg genutzt werden. In Folge ist geplant, auch niedergelassene Ärzte mit spezifischer Fachausrichtung mit einzubeziehen. Durch die eingerichtete und noch im Aufbau befindliche Internetseite www.schimmelschnelltest.de, die von Sension reserviert wurde, sollen unterschiedliche Interessenten, gerade auch aus den Bereichen Forschung und Entwicklung, auf den ELISA

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http://www.schimmelschnelltest.de/

aufmerksam gemacht werden. Eine Reihe von Gesprächen auf den besuchten Fachtagungen hat ergeben, dass der ELISA für Anwendungen in Frage kommt, die bisher noch nicht in Erwägung gezogen wurden, wie beispielsweise die Untersuchung von Nasensekret für die Diagnostik im HNO-Bereich. Mit den Partnerunternehmen Genetic ID USA, Europe und Japan stehen uns international aktive Vermarktungspartner für unsere Testsysteme zur Verfügung. Gerade im Bereich der Nahrungsmittelproduktion, aber auch für die Umweltanalytik verfügt das Unternehmen über ein hervorragendes internationales Netzwerk. Für medizinisch-diagnostische Anwendungen bzw. umweltmedizinische Anwendungen können wir die Produkte sowohl national, als auch international, über die Arrows GmbH in Münster (www.arrows-biomedical.com) präsentieren.

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http://www.arrows-biomedical.com/

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84

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Zentralstelle der Länder für Gesundheitsschutz bei Arzneimitteln und Medizinprodukten, Z. (2004). Medizinisches Labor : Qualitätsmanagement und Akkreditierung. Stuttgart, Wiss. Verl.-Ges.

85

Danksagung Wir danken Herrn Dr. Gabrio und seiner Abteilung vom Landesgesundheitsamt Baden Württemberg für die freundliche Kooperation während des gesamten Vorhabens.

86

11 Anhang Anlagen: Anlage 1: Protokoll Wohnraumbegehung Kurzfragebogen bei Wohnraumbegehung Allgemeine Angaben Name: Ort der Begehung: Anschrift: Zu beurteilende Räume: Wohnung Art der Probe Entnahmeort Innenluft ____________________________ Aussenluft ____________________________ Fussbodenstaub (Teppich) Hochflor Niedrigflor sonstiges _____________ Abklatsch ____________________________ Raum Temperatur rel. Luftfeuchte UG EG ... E. DG ___________ _____°C _______% Tag der Begehung : __.__.__ Uhrzeit der Begehung: __. __ h Teilnehmer der Begehung: _________________________________________ Bemerkung: _____________________________________________________ Sind folgende Auffälligkeiten gegeben: mit Schimmel befallenes Material Wo?:______________________ Grösse < 20 cm² <0,5 m² >0,5m² ρ geschätzte m²____ Art des Befalls

punktförmiges Wachstum rasenartiges Wachstum hinter einer geschlossenen Fläche z. B. Fußbodenbelag sonstiger, wenn ja welcher________________________________

sichtbarer Feuchtflecken (aktiv) wo _________________ Größe (cm²)____________ sichtbare Feuchteflecken (abgetrocknet)

87

wo _________________ Größe (cm²)____________ Geruchsbelästigung wonach_____________ seit wann ______________ andere biologische Innenraumbelastungen , u.a. Milben welche______________ andere chemische Innenraumbelastungen , u.a. Formaldehyd welche______________ Bauschaden u. a. Wasserschaden innen/aussen wo__________________ welcher____________ wann___________ Höhe der Wohnung (Etage)_______ Wie lüften Sie häufiges Stosslüften Fenster langzeitig gekippt Besonderheiten z. B. Haustiere (auch Aquarium) welche____________________ Matratze auf dem Boden grosse Schränke bzw. Schrankwände an der Aussenwand Wintergarten Haus nicht unterkellert befahrene Strasse / Gleis wo____________ wie weit_____________ Nähe einer Quelle für chemische Schadstoffe z. B. Lackiererei Nähe einer Quelle für biologische Schadstoffe z. B. Kompostierwerk Wurden schon einmal Expositionsmessungen durchgeführt worauf______________________ weitere Besonderheiten________________________________________

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Anlage 2: Probenahme in der Wohnung des Patienten Folgende Utensilien werden bereitgestellt.

- Name u. Adresse des Patienten mit Stadtplan bzw. Anfahrtsplan - Infobrief (Einverständnis zur Studienteilnahme) - Legitimation - Untersuchermappe - Kurzfragebogen Wohnraumbegehung - Meterstab - Klebeband - Staubsauger mit Saugrohr und 2 gereinigten Filterhaltern - Gelatinefilter (muß vorher im Labor gewogen werden) - Plastikdose zum Aufbewahren der Staubprobe mit Namensetikett (muß vorher im Labor gewogen

werden) - Einmalhandschuhe und Überschuhe - Plastikbeutel zum Aufbewahren der Proben und Geräte - Kühlbox mit Kühlakku - 2 Luftkeimsammler im Koffer (kontrollieren ob alles vollständig ist) - Teststreifen für Luftkeimsammler mit Namensetikett - Abklatschproben - Einmalskalpell zum Öffnen der Abklatschproben - Thermometer / Hygrometer - Alkohol / Flächendesinfektion - Einmal-Allzwecktücher - Aufbewahrungskasette für Abklatschproben - Stoppuhr

Bei Ankunft in der Wohnung wird wie folgt vorgegangen:

- Wohnung besichtigen und Kurzfragebogen ausfüllen. - Wohnraum, der beprobt werden soll, bestimmen. - Temperatur und Feuchtigkeitsmesser im befallenen Raum aufstellen. - Staubsammlung im beprobten Raum durchführen - Luftsammlung im beprobten Raum durchführen - Abklatschproben im beprobten Raum entnehmen - Luftsammlung der Außenluftprobe an der Außenseite vor dem beprobten Raum durchführen. - Temperatur u. Feuchtigkeitsmessung notieren. - Alle Untersuchungsteile dokumentieren, alle Geräte wieder einpacken, kontrollieren.

Die Staubsammlung des Bodens wird wie folgt durchgeführt:

- Einmalüberschuhe anziehen. - Die zu saugende Fläche des Teppichs (1 m²) wird mit einem Meterstab abgemessen und mit

Klebestreifen markiert. - In den Filterhalter wird unter Verwendung von Einmalhandschuhen und Pinzette ein Gelatinefilter

eingelegt. - Der Filterhalter wird auf den Staubsaugerschlauch gesteckt - Staubsauger einschalten und markierte Fläche insgesamt 5 min (Stoppuhr, Zeit genau einhalten) längs

und quer absaugen, dabei Saugspitze leicht schräg halten. - Filterhalter vom Schlauch abnehmen - Gelatinefilter samt angesammeltem Staub in die vorbereitete Plastikdose überführen.

Es erfolgt die Messung der Innenraum- und Außenluft mittels Luftkeimsammler RCS der Firma Biotest nach folgendem Schema:

89

Der Volumenstrom des Luftkeimsammlers wird wegen des saisonalen Sporenfluges vom 1. Mai bis 30. September auf einen Volumenstrom von 100 l eingestellt, vom 1. Oktober bis 30. April auf einen Volumenstrom von 200 l.

- Schutzkappe entfernen - Schutzhülle des Luftkeimindikators aufreißen und Luftkeimindikator herausnehmen

(Einmalhandschuhe!) - Luftkeimindikator mit der Nährbodenfläche in den Rotor einschieben. - Rotor auf den Magnetflansch aufsetzen und Schutzkappe wieder aufschrauben. - Luftkeimsammler in 1 – 1,20 m Höhe waagrecht mit der Schalterfläche nach oben auf eine feste

Unterlage stellen. - Gerät einschalten; es stellt sich nach Beendigung des Messvorganges automatisch ab. - Schutzkappe wieder entfernen, Rotor abnehmen, Luftkeimindikator aus dem Rotor nehmen und in die

Schutzhülle zurückschieben und verschließen. - Luftkeimindikator mit Name und Ort der Messung und Gerätenummer beschriften - Gerät und Rotor in den Koffer zurücklegen - Messung in Dokumentationsbogen eintragen

Bei sichtbarem Schimmel wird eine Abklatschprobe durchgeführt:

Die Sabouraud-Glucose Abklatschplatte wird auf eine vorher mit Flächendesinfektionsmittel gereinigte Fläche gelegt, so daß die Beschriftung oben ist. Anschließend wird die Oberseite der eingeschweißten Agarplatte mit 70%igem Alkohol gereinigt. Offene Agarfläche auf die entsprechende Fläche sanft aufdrücken. Nach Abklatsch in die Alu-Kassette legen und verschließen. Alu-Kassette in einen Plastikbeutel geben und beim Transport darauf achten, daß die Kassette waagrecht liegt. Ab 1.10.2004 erfolgt eine Umstellung der Abklatschproben von Sabouraud-Glucose-Agar Selektivnährböden Agarflex der Fa. Medco auf Rosa-Bengal-Agar Keimindikator für Oberflächen YM der Fa. Oxoid. Von Juni 2004 bis September 2004 fanden parallele Austestungen mit beiden Abklatschböden statt.

Auf dem Kurzfragebogen Wohnraumbegehung wird notiert von welcher Stelle und welchem Material die Probe genommen wurde (Mauer, Tapete, Holzverkleidung, Putz, etc.).

Nach Abschluß der Wohnungsbegehung werden die Materialien durch die Mitarbeiter der Umweltambulanz zur Verarbeitung umgehend ins Labor gebracht.

90

Anlage 3: Bewertungshilfe von Staubproben (ungesiebt) Nach dem Leitfaden „Schimmelpilze in Innenräumen – Nachweis, Bewertung, Qualitätsmanagement des Arbeitskreises „Qualitätssicherung – Schimmelpilze in Innenräumen“ am Landesgesundheitsamt Baden-Württemberg Staubuntersuchung Proben ungesiebt

Hintergrundbelastung Innenraumquelle unwahrscheinlich

Innenraumquelle nicht auszuschliessen1)

Innenraumquelle wahrscheinlich2)

Konzentration häufiger Pilzgattungen bzw. Arten im Staub KBE/m² Cladosporium spp. *< 200 000 > 200 000 -< 400 000 > 400 000 Hefen < 150 000 > 150 000 -< 300 000 > 300 000 Sterile Kolonien < 80 000 > 80 000 -< 200 000 > 200 000 Penicillium spp. < 40 000 > 40 000 -< 80 000 > 80 000 Aureobasidium spp. < 10 000 > 10 000 -< 20 000 > 20 000 Aspergillus spp. < 20 000 > 20 000 -< 40 000 > 40 000 Aspergillus fumigatus < 3 000 > 3 000 -< 15 000 > 15 000 Aspergillus niger < 3 000 > 3 000 -< 15 000 > 15 000 Aspergillus versicolor < 5 000 > 5 000 -< 20 000 > 20 000 Alternaria spp. < 10 000 > 10 000 -< 30 000 > 30 000 Eurotium spp. < 3 000 > 3 000 -<15 000 > 15 000 Feuchteindikatoren mit hohem Sporenflug

< 3 000 > 3 000 -< 20 000 > 20 000

Feuchteindikatoren mit geringem Sporenflug

< 1 000 > 1 000 -< 3 000 > 3 000

Zusammensetzung Allgemeine Misch-

Population Konzentration an Feuchteindikatoren erhöht

Überwiegend Indikatorkeime

Gesamt-KBE ohne Aureobasidium spp. Cladosporium spp. Penicillium spp. Hefen Sterile Kolonien

< 20 000 > 20 000 -< 60 000 > 60 000

Gesamt-KBE (Winter) Gesamt-KBE (Sommer)

< 50 000 < 250 000

> 50 000 -<120 000 > 250 000 -< 600 000

> 120 000 > 600 000

1) Indiz für Quellensuche ²) Indiz für kurzfristige Quellensuche * in den Wintermonaten ist davon auszugehen, dass die nachweisbaren Konzentrationen deutlich unter den Sommermonaten liegen.

91

92

Anlage 4: Berechnung von 0.95-Konfidenz- und Prognoseintervallen

Berechnung von 0.95-Konfidenz- und Prognoseintervallen für y (Glucankonzentration) an einer vorgegebenen Stelle x (Staub-CFU). Dabei unterstellen wir für y eine Lognormalverteilung und einen funktionalen Zusammenhang der folgenden Form: y = a * x^b = a * exp( b * ln(x) ) < --- > ( mittlerer Wert für y unter dem Wert x = E [ y | x ] )

( Für die logarithmierten Daten hatten wir Normalverteilungsannahme und Regressionsgerade )

Im Einzelnen berechnen wir (Rundung auf 4 Stellen hinter dem Komma genau):

(0) E[ y | x ] (Punktschätzung - siehe oben)

(1) 0.95-Konfidenzintervall für E[ y | x ] an einer ganz bestimmten vorgegebenen Stelle x

(2) 0.95-Konfidenzintervall für E[ y | x ] simultan, d.h. für alle Stellen x gleichzeitig

(3) Prognoseintervall für eine künftige Beobachtung y an der Stelle x (fest vorgegeben) mit Trefferwahrscheinlichkeit 0.95 Staub- Punktschätzung Intervallschätzung für Intervallschätzung für Prognoseintervall für y CFU (x) für E [ y | x ] E [ y | x ] E [ y | x ] simultan

3000 1,6615 [ 1,2328 , 2,2392 ] [ 1,1433 , 2,4146 ] [ 0,5849 , 4,7192 ] 10000 1,8743 [ 1,5062 , 2,3324 ] [ 1,4252 , 2,4648 ] [ 0,6732 , 5,2186 ] 20000 2,0090 [ 1,6852 , 2,3950 ] [ 1,6120 , 2,5037 ] [ 0,7276 , 5,5474 ] 30000 2,0922 [ 1,7960 , 2,4372 ] [ 1,7281 , 2,5330 ] [ 0,7605 , 5,7556 ] 50000 2,2020 [ 1,9391 , 2,5006 ] [ 1,8778 , 2,5822 ] [ 0,8033 , 6,0363 ] 70000 2,2774 [ 2,0325 , 2,5519 ] [ 1,9749 , 2,6263 ] [ 0,8321 , 6,2331 ] 90000 2,3355 [ 2,0998 , 2,5976 ] [ 2,0441 , 2,6683 ] [ 0,8540 , 6,3867 ] 100000 2,3602 [ 2,1270 , 2,6190 ] [ 2,0719 , 2,6887 ] [ 0,8633 , 6,4529 ] 200000 2,5298 [ 2,2838 , 2,8023 ] [ 2,2256 , 2,8757 ] [ 0,9255 , 6,9153 ] 300000 2,6346 [ 2,3552 , 2,9472 ] [ 2,2895 , 3,0318 ] [ 0,9628 , 7,2093 ] 400000 2,7116 [ 2,3981 , 3,0661 ] [ 2,3249 , 3,1627 ] [ 0,9897 , 7,4293 ] 500000 2,7729 [ 2,4280 , 3,1668 ] [ 2,3479 , 3,2748 ] [ 1,0108 , 7,6068 ]

93

Staub- Punktschätzung Intervallschätzung für Intervallschätzung für Prognoseintervall für y CFU (x) für E [ y | x ] E [ y | x ] E [ y | x ] simultan

600000 2,8239 [ 2,4506 , 3,2542 ] [ 2,3643 , 3,3729 ] [ 1,0281 , 7,7563 ] 700000 2,8679 [ 2,4687 , 3,3316 ] [ 2,3769 , 3,4602 ] [ 1,0429 , 7,8862 ] 800000 2,9065 [ 2,4837 , 3,4012 ] [ 2,3870 , 3,5389 ] [ 1,0558 , 8,0011 ] 900000 2,9409 [ 2,4965 , 3,4644 ] [ 2,3953 , 3,6108 ] [ 1,0672 , 8,1046 ] 1000000 2,9721 [ 2,5077 , 3,5225 ] [ 2,4024 , 3,6769 ] [ 1,0774 , 8,1987 ] 2000000 3,1857 [ 2,5763 , 3,9391 ] [ 2,4418 , 4,1561 ] [ 1,1457 , 8,8580 ] 3000000 3,3177 [ 2,6138 , 4,2111 ] [ 2,4610 , 4,4725 ] [ 1,1863 , 9,2782 ] 4000000 3,4146 [ 2,6396 , 4,4171 ] [ 2,4735 , 4,7138 ] [ 1,2154 , 9,5929 ] 5000000 3,4917 [ 2,6594 , 4,5846 ] [ 2,4826 , 4,9110 ] [ 1,2382 , 9,8471 ] 6000000 3,5561 [ 2,6754 , 4,7266 ] [ 2,4898 , 5,0788 ] [ 1,2568 , 10,0615 ] 7000000 3,6114 [ 2,6888 , 4,8504 ] [ 2,4958 , 5,2256 ] [ 1,2727 , 10,2476 ] 7500000 3,6364 [ 2,6948 , 4,9069 ] [ 2,4984 , 5,2928 ] [ 1,2798 , 10,3324 ]

Man erkennt deutlich: Die Prognoseintervalle sind wesentlich breiter als die Konfidenzintevalle zum selben Niveau (0.95). Dagegen sind die simultanen Konfidenzintervalle nur unwesentlich breiter als die - nichtsimultanen, auf ein festes x bezogenen - Konfidenzintervalle. Dies wird optisch auch auf den nachfolgenden Grafiken deutlich (jeweils zum Niveau 0.95): Der Prognosestreifen ist wesentlich breiter als der Konfidenzstreifen, während letzterer nur unwesentlich schmäler ist als der simultane Konfidenzstreifen.

Konfidenzstreifen, Simultaner Konfidenzstreifen und Prognosestreifen (jeweils zum Niveau 0.95) bezogen auf die Original-

Ausganngsdaten

0

2

4

6

8

10

0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000 8000000

x

y

x = Staub-CFU (Einflussgröße) , y = Glucankonzentration (Zielgröße) - jeweils pro m^2 : Folgende SCHÄTZ-Funktion wurde ermittelt: y = a * x^b = a * exp( b * ln(x) ) , wobei a = 0,745396651991778 und b = 0,100113007700041

= obige Regressionsfunktion

= 0.95-Konfidenzstreifen für E[ y | x ] für jedes - feste - x separat betrachtet

= 0.95-Konfidenzstreifen für E[ y | x ] simultan, d.h. für alle x gleichzeitig

= Für jedes fest vorgegebene x: Prognoseintervall für eine künftige Beobachtung y mit Trefferwahrscheinlichkeit 0.95

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Konfidenzstreifen, Simultaner Konfidenzstreifen und Prognosestreifen (jeweils zum Niveau 0.95) bezogen auf die

logarithmierten Daten

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

8 9 10 11 12 13 14 15 16

x

y

x = Nat. Logarithmus Staub-CFU (Einflussgröße) y = Nat. Logarithmus Glucankonzentration (Zielgröße)

= Regressionsgerade: y = -0,2938387835 + 0,1001130077*x

= 0.95-Konfidenzstreifen für E[ y | x ] für jedes - feste - x separat betrachtet

= 0.95-Konfidenzstreifen für E[ y | x ] simultan, d.h. für alle x gleichzeitig

= Für jedes fest vorgegebene x: Prognoseintervall für eine künftige Beobachtung y mit Trefferwahrscheinlichkeit 0.95

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SensioMold β-Glucan ELISA

- 1 -

SensioMold ELISA

β-Glucan

Enzyme Immunoassay Kit

Catalog No. 500-002

96 Well Kit

This test kit has been developed in close collaboration with the department „Umweltambulanz des Klinikums Augsburg”. Studies regarding this test

kit were funded by “Deutsche Bundesstiftung Umwelt”, Osnabrück.

Table of Contents

TABLE OF CONTENTS ...................................................................................................................................... - 1 - PRECAUTIONS AND LIMITED WARRANTY......................................................................................................... - 2 - MATERIALS SUPPLIED ..................................................................................................................................... - 3 -

Other essential materials needed but not supplied:...................................................................................- 3 - SCIENTIFIC BACKGROUND............................................................................................................................... - 4 -

Information to the determination of β-(1→3)-D-Glucan in dust samples .................................................- 4 - KIT FEATURE .................................................................................................................................................. - 4 - PRINCIPLE OF THE ASSAY................................................................................................................................ - 5 - PREPARATION OF REAGENTS ........................................................................................................................... - 6 - DUST PREPARATION AND Β-GLUCAN-DETERMINATION PROCEDURE.............................................................. - 6 - ELISA PROTOCOL .......................................................................................................................................... - 7 - PERFORMANCE CHARACTERISTICS.................................................................................................................. - 8 -

Specificity ..................................................................................................................................................- 8 - Standard curve...........................................................................................................................................- 8 -

APPENDIX ....................................................................................................................................................... - 9 - Short Instruction........................................................................................................................................- 9 - Plate Layout: ...........................................................................................................................................- 10 -

REFERENCES ................................................................................................................................................. - 11 - NOTES........................................................................................................................................................... - 12 -

Plate Template.........................................................................................................................................- 12 - V20051201


- 2 -

Precautions and limited warranty Sension warrants its products to be manufactured in accordance with its specifications and free from defects in material. This warranty is expressly limited to the refund of the price of any defective product or the replacement of any defective product with new product. This warranty applies only when the buyer gives written notice to the company within thirty days after the receipt of the product by the buyer. In addition, this warranty applies under conditions of normal use, but does not apply to defects that result from intentional damage, negligence or unreasonable use. The company makes no warranties, either express or implied, except as provided herein, including without limitation thereof, warranties as to marketability, merchantability, fitness for a particular purpose or use, or non-infringement of any intellectual property rights. In no event shall the company be liable for any indirect, incidental, or consequential damages of any nature, or losses or expenses resulting from any defective product or the use of any product. The design of the product is under constant review and every effort is made to keep this guide up to date. The company reserves the right to change specifications and equipment at any time without prior notice.

FOR RESEARCH USE ONLY. NOT FOR USE IN DIAGNOSTIC PROCEDURES

1. Some Buffers contain Thimerosal. Thimerosal is highly toxic by inhalation, contact

with skin or if swallowed. Thimerosal is a possible mutagen and should be handled accordingly.

2. Stop solution is a solution of sulphuric acid. The solution is caustic; care should be

taken in use.

3. Standard solutions contain β-Glucan. Care should be taken handling these solutions.


- 3 -

Materials supplied # Contents Volume Quantity Storage 1 Microplate coated with β-Glucan. The microtiter

plate consists of 12 strips with 8 wells each

96 wells 1 Plate (12 strips)

2-8 °C

2 β-Glucan standard solutions

200.000 ng/ml 20.000 ng/ml 5.000 ng/ml

156 ng/ml 39 ng/ml 10 ng/ml 0 ng/ml

1 mL each 1 Vial each 2-8 °C

3 Primary anti β-Glucan Antibody from rabbit. The antibody is lyophilized and is to be reconstituted with reconstitution buffer to the final volume of 5.0 mL

Lyophilisate

reconstituted: 5 mL

2 Vials 2-8 °C

4 Secondary anti-rabbit-Peroxidase antibody from goat. The antibody is lyophilized and is to be reconstituted with reconstitution buffer to the final volume of 5.0 mL

Lyophilisate

reconstituted: 5 mL

2 Vials 2-8 °C

5 Reconstitution Buffer

12 mL 1 Vial 2-8 °C

6 TMB Color Substrate Solution

10 mL 1 Vial 2-8 °C

7 Stop Reagent (Containing sulphuric acid)

10 mL 1 Vial 2-8 °C

8 Washing-Buffer (15x concentrate)

20 mL 1 Vial 2-8 °C

9 Dust-Extraction Buffer (10x concentrate)

20 mL 1 Vial 2-8 °C

10 Instruction Booklet

- 1 -

Other essential materials needed but not supplied:

1. Deionized or distilled water 2. Repeater or multichannel pipettes for dispensing 3. Beakers for diluting the buffers 4. Graduated cylinders 5. A microtiter plate washer (alternatively washing with multi-channel pipette) 6. A microplate reader capable of reading 450 nm wavelength 7. SensioMold Dust Collection Kit


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Scientific background

Information to the determination of β-(1→3)-D-Glucan in dust samples β-(1→3)-D-Glucan is regarded as a biomarker for mold contaminations and is used in this test as the immunochemical target. In contrast to microbiological cultures, also material, which is not capable of germinating, will be detected. This is advantageous as also this material can cause health effects. Mold loadings in rooms and housings do present serious health risks for the persons affected. These risks are going to be even more critical by increased levels of humidity, caused by floods, but also by strict thermo isolation. The quantitative recognition of such mold loadings can be arranged by the SensiMold ELISA.

Kit Feature Specificity: The antibody used in this test is specific for β-(1→3)-D-Glucan. Cross reactivities for other structurally related compounds were not detected. Range of determination: The quantitative analysis ranges from 40 ng to 1000 ng/ml. This corresponds to 40µg 1.000 µg β-Glucan / g of dust. This range can be adapted to higher or lower ranges by changing the dilutions of the samples appropriately. Reproducibility: The ELISA determination is highly reproducible. The coefficient of variation (CV) has been determined within one kit mostly under 5 % and within 6 kits mostly under 8 %. Total time required: The total time for the assay performance with forty samples is only 3 hours with ease of handling. Extra time is required for the collection of dust samples. Several samples can be prepared in parallel. Simultaneous measurements: The kit enables simultaneous measurements of multiple samples at reasonable costs.


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Principle of the Assay

1. Competitive Reaction The test is based on the specific recognition of β-(1→3)-Glucan by specific antibodies. The β-(1→3)-Glucan present in the standard solution or in the sample competes with a constant amount of a Glucan immobilized on the surface of the microtiter plate for the binding sites of the specific anti-ß-Glucan antibody. If the free analyte reveals a relative higher concentration compared to the immobilized β-Glucan, it will predominantly bind to the antibody and vice versa. As a result higher signals will correspond to lower concentrations of analyte.

2. Chromogenic reaction An anti-rabbit-antibody-enzyme-conjugate binds to the anti-β-glucan-antibody in a further incubation step. Unbound conjugate is washed out, when the plates are rinsed using the plate washer (or pipettes). The antibody bound enzyme conjugate catalyzes the conversion of the TMB substrate to a colored product. After an incubation period, the reaction is stopped by the addition of diluted acid. The result of a lower concentration of β-(1→3)-Glucan is the generation of a higher color (lower absorbance) and vice versa.

3. Quantitative analysis The standard curve, a dose-response curve obtained from known concentrations of β-Glucane-standards, is determined from the absorbance at 450 nm. The concentration of analyte in each sample is calculated by interpolation using the absorbance intensity obtained from the standard curve. Flowchart for the Quantitative Determination of β-(1→3)-Glucan in Dust Samples (see also page - 9 -)

1. Sample collection and preparation including autoclaving process 2. Adjustment of all reagents to RT prior use 3. Antibody-enzyme-Conjugate Reconstitution 4. Incubation of Standards / Samples with anti-β-Glucan-antibody 5. Competitive Reaction 6. Washing Step 7. Incubation with peroxidase-conjugated secondary anti-rabbit-antibody 8. Washing Step 9. Color Development 10. Quantification


- 6 -

Preparation of reagents • Bring all reagents to room temperature prior use • Place all reagents at 2-8 °C immediately after use.

Washing buffer: The washing buffer is 15 times concentrated. Dilute it with distilled water. Antibody powder:

The antibodies supplied have to be reconstituted wit 5 ml of reconstitution buffer. Use within one week and store it at 2-8°C.

Dust dilution buffer: The Dust Dilution buffer is 10 times concentrated. Dilute it with distilled water.

Dust Preparation and β-Glucan-Determination Procedure • A dust sample is collected using the SensioMold dust collection kit. The weight of the

dust sample will be determined. • 10 ml of distilled water will be given to each 10 ml of dust sample collected. • The solution is autoclaved over a period of 2 hours. After autoclaving the volume is

adjusted to the original volume before the autoclaving process. • Before ELISA-determination the sample is diluted 1/10 using dilution buffer. The

sample is ready for analysis. • Measure the sample directly in the assay • Determine the concentration of β-Glucane per g dust by multiplying the calculated

level with the dilution ratio.


- 7 -

ELISA Protocol

• Take out all the kit contents from the refrigerator and let them adjust to room temperature (18-25°C) for approximately 30 minutes prior to the assay.

• Reconstitute antibodies with 5 ml of Reconstitution buffer. Reconstituted antibodies should be used within one week

• Do not mix reagents from different kits. • Store reagents under refrigeration (2-8°C) • Do not use expired kits. • Dispose of kit components in accordance with applicable regulations after use. • Duplicate measurement is recommended for more accurate determination.

1. Remove the required number of test strips. 2. Pipet 50 µl of Standards 1-8 and the sample solutions in double into the test strips 3. Pipet 100 µl of the anti-β-Glucan-antibody solution in double into the test strips 4. Incubate for 90 min 5. Wash wells 3 times with 300 µl Washing buffer 6. Remove the remaining buffer by patting the plate on a stock of paper 7. Add 150 µl of Peroxidase-conjugated secondary antibody to each well 8. Incubate for 60 min 9. Wash wells 3 times with 300 µl Washing buffer 10. Remove the remaining buffer by patting the plate on a stock of paper 11. Add 100 µl of Substrate solution to each well 12. Incubate for 30 minutes in the dark 13. Stop the color reaction by adding 50 µl Stop solution 14. Measure immediately at 450 nm.


- 8 -

Performance Characteristics

Specificity The following substances were tested for cross reactivity of the assay. Cross reactivities were determined using the method of G.E. Abraham (Abraham 1969).

Laminarin 100 % Glucose 0 % Fructose 0 % Dextran 0 % Mannan 0 % Lipopolysaccharides from Serratia marcescens

0 %

Standard curve

100(%)/ ×=ODBoNet

ODNetBoB

Laminarin-Standardkurve

0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,82,0

0 1 10 100 1000 10000 100000

Laminarin [ng/ml]

OD

Standardkurve

Figure 1: Typical standard curve to be produced with this kit. This curve must not be used to determine the values of your samples. You must run a new standard curve every time you run the Assay.


- 9 -

Appendix

Short Instruction

Short Instruction β-Glucan ELISA Step Reagent µl / well

1 Standards 1 - 8, or Sample 50

2 Anti- β-(1→3)-Glucan -Antibody 100

3 Incubate for 90 minutes

4 Washing Buffer 3 x 300

5 Remove the remaining buffer by patting the plate on a stock of paper.

6 Peroxidase-Conjugated Secondary Antibody 150

7 Incubate for 60 minutes

8 Washing Buffer 3 x 300

9 Remove the remaining buffer by patting the plate on a stock of paper.

10 Substrate Solution 100

11 Incubate for 30 minutes in the dark

12 Stop Solution 50

13 Measure at 450 nm λ


- 10 -

Plate Layout:

a) Full Plate Format (Example) Fill standards, negative and positive control in duplicates in rows 1 and 2. Fill samples in duplicates in the other wells.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A S1 S1 1 1 9 9 17 17 25 25 33 33

B S2 S2 2 2 10 10 18 18 26 26 34 34

C S3 S3 3 3 11 11 19 19 27 27 35 35

D S4 S4 4 4 12 12 20 20 28 28 36 36

E S5 S5 5 5 13 13 21 21 29 29 37 37

F S6 S6 6 6 14 14 22 22 30 30 38 38

G S7 S7 7 7 15 15 23 23 31 31 39 39

H S8 S8 8 8 16 16 24 24 32 32 40 40

b) Partial Plate Format (Example) Fill standards, negative and positive control in duplicates in rows 1 and 2 or 7 and 8. Fill samples in duplicates in the other wells.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A S1 S1 1 1 9 9 S1 S1 17 17 25 25

B S2 S2 2 2 10 10 S2 S2 18 18 26 26

C S3 S3 3 3 11 11 S3 S3 19 19 27 27

D S4 S4 4 4 12 12 S4 S4 20 20 28 28

E S5 S5 5 5 13 13 S5 S5 21 21 29 29

F S6 S6 6 6 14 14 S6 S6 22 22 30 30

G S7 S7 7 7 15 15 S7 S7 23 23 31 31

H S8 S8 8 8 16 16 S8 S8 24 24 32 32


- 11 -

References Abraham, G. E. (1969). "Solid-phase radioimmunoassay of Trenbolone-17 beta." J Clin

Endocrinol Metab 29(6): 866-70.


- 12 -

Notes

Plate Template

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A

B

C

D

E

F

G

H

SensioMold Dust Collector Kit

- 1 -

SensioMold

Dust Collector Kit

Catalog No. 600-002

This test kit has been developed in close collaboration with the department „Umweltambulanz des Klinikums Augsburg”. Studies regarding this test

kit were funded by “Deutsche Bundesstiftung Umwelt”, Osnabrück.

Table of Contents

TABLE OF CONTENTS ...................................................................................................................................... - 1 - KIT CONTENTS................................................................................................................................................ - 2 -

Other Materials needed but not supplied: .................................................................................................- 2 - INSTRUCTIONS FOR USE OF THE DUST COLLECTOR......................................................................................... - 3 - REFERENCES ................................................................................................................................................... - 3 -

V20051201


- 2 -

Kit Contents

Figure 1: Contents of the SensioMold Dust Collector Kit

# Content Quantity

Dust Collector 1

Plastic filters 4

Plastic bags 4

Envelope 1

Manual 1

Other Materials needed but not supplied:

• Standard vacuum cleaner (preferably with extension tube)

13

4

2


- 3 -

Instructions for Use of the Dust Collector

1. Insert the plastic filter into the dust collector and attach the collector to the vacuum cleaner tube.

2. Turn on the vacuum cleaner and vacuum 4 separate 20 x 30 cm areas (letter-size paper

(DIN-A4)) for 30 seconds each (total sampling time, 2 minutes; total area sampled ~0.25 m2).

3. Remove the filter containing the dust samples and place it in a plastic bag . Sample

may be returned to Sension for analysis in the provided envelope or can be analysed with the SensioMold ß-Glucan ELISA.

4. Rinse the dust collector with water, place a clean filter inside the collector for repeat

sampling.

References Arbes, S. J., Jr., M. Sever, et al. (2005). "Feasibility of using subject-collected dust samples in

epidemiologic and clinical studies of indoor allergens." Environ Health Perspect 113(6): 665-9.

Nachweisverfahren von (1,3)Beta-D- Glucanenfür den Schimmelpilznachweis im Wohnbereich

Schimmelpilzbelastungen in Wohnräumen stellen ein ernsthaftesgesundheitliches Risiko für die betroffenen Personen dar.Diese Belastungen nehmen bedingt durch erhöhte Feuchtigkeit,beispielsweise ausgelöst durch Hochwasser, aber auch durchzu strikte Isoliermaßnahmen, an Bedeutung zu.Die Erkennung von Schimmelpilzbelastungen durch mikrobiolo-gische Kulturverfahren ist außerordentlich zeit-, kosten- und arbeits-intensiv. Deshalb besteht Bedarf an einer Methodik, die für Routine-untersuchungen zur raschen und wirtschaftlichen Analytik möglicherBelastungen geeignet ist.

ß-Glucane stellen einen festen Bestandteil von Schimmelpilzsporendar. Deshalb wurde mit einem ELISA ein immunchemisches Verfahrenetabliert, der diese als Marker für Schimmelpilzbelastungen mit hoherEmpfindlichkeit nachweist.Das Testsystem wird in Kürze wahlweise als ELISA-Kit oder als Proben-nahme-Kit, insbesondere zur Sammlung von Staubproben angebotenwerden und als weiteres Instrument zur Beurteilung des Wohnumfeldszur Verfügung stehen.Eine Spezifizierung von Schimmelpilzspezies ist mit diesem Test nichtmöglich.

Einordnung des ß-(1,3) Glucan-Assays in die re levanten Fragestellungender Schimmelpilzanalytik in Innenräumen.

La minarin -Standardkurve

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

2

0 1 1 0 100 1000 10000 100000

L amin arin [ng/ml ]

Sta n dard kurv e

Standardkurve von Laminarin, die durchEinsetzen bekannter Konzentrationen anLaminarin im beschriebenen ELISA-Formaterstellt wurde.Die Nachweisgrenze liegt bei ca 20 -40 ng/mlProbelösung.Es ist darauf zu achten, dass beispielsweiseauch bestimmte pflanzliche Organismen

-(1,3)-D-Glucane enthalten können.ß

Spezifität und Kreuzreaktionen zu anderen Glucanen

Standardkurve

<115,0<116,91002500

<162,1<19,010020000

CR Mannan[%]

Gemessene Konz.MannanBez. aufLaminarinStandard[ng/ml]

CR Dextran[%]

Gemessene Konz.DextranBez. aufLaminarin-Standard[ng/ml]

CR Laminarin100 % perDefinition

eingesetzteKonzentrationenLaminarin [ng/ml]Dextran [ng/mL]Mannan [ng/mL]

<115,0<116,91002500

<162,1<19,010020000

CR Mannan[%]

Gemessene Konz.MannanBez. aufLaminarinStandard[ng/ml]

CR Dextran[%]

Gemessene Konz.DextranBez. aufLaminarin-Standard[ng/ml]

CR Laminarin100 % perDefinition

eingesetzteKonzentrationenLaminarin [ng/ml]Dextran [ng/mL]Mannan [ng/mL]

Kreuzreaktionen zu anderen relevanten Glucanen (Dextran(Alpha(1,6)(1,3)(1,4)(1,2)-Glucan)und (Mannan(Alpha(1,2)(1,3)(1,6)-Glucan)

Schematische Darstellung der ß-Glucan-Bestimmung aus Staubproben

Probennahme in der PraxisDer Probennahme-Kit beinhaltet einen speziellen Aufsatzfür die Staubsammlung mit handelsüblichen Staubsaugern.Es wird damit eine definierte Fläche (4 DINA4 Seiten) füreine definierte Zeit gesaugt, der Sammelbehälter wird immitgelieferten Verschlußbeutel zur Analyse an unser Laboreingesandt.

Damit ist es möglich, Staubproben auf unkomplizierteWeise zu sammeln, da kein weiterer Umgang mit der Probenötig ist und auch mehrere Proben parallel gesammelt undpre isgünstig untersucht werden können.

Das Staubsammel-Set kann in Kürze angefordert werden.

Sension GmbH , Am Mittleren Moos 48, D-86167 AugsburgTel.: ++49 (0) 821 7493 173, Fax: ++49 (0) 821 7493 171, email: [email protected], www.sension-gmbh.de

Kooperationspartner:

Abteilung Umweltambulanz Klinikum AugsburgProf. Dr. Dr. W. EhretDr. M. Schulze

Das Projekt wird gefördert durch dieDeutsche Bundesstiftung Umwelt

Entwicklung eines Nachweissystemsfür Schimmelpilze

Probensammlung in Wohnungenpotentiell betroffener Patienten

Etablierung einer Schimmelpilz-Routineanalytikvon Staub- und anderen Proben

KontrollierteGebäudesanierun g

Bekämpfung derPatientenbesc hwerden

Geziel te Begutachtungvon Bausubstanz

Verhinde rung vonUmweltschäden(z.B. durch unnötigen Ein satz vo nFungiziden )

Charakterisierung des ELISA-Tests

Testaufbau

Kompetition auf einer beschichteten PlatteWaschschrittBindung des sekundären Antikörper-Enzym-KonjugatsWaschschrittSignalerzeugung durch enzymatische UmsetzungAbstoppen der Reaktion und photometrische Auswertung

30 min.5 min.

30 min.5 min.

15 min.10 min.

Mi te st Dust Colle ctor der FirmaIndoor biotechnologi es (www. inbio.co m)

Teppichflächemit Staub

Staubsauger mitDust-Collector

Staubprobe(ca. 0,5 bis 10 mg)

Wägung

Verdünnung 1 : 100 mit Puffer30 min. schütteln

(0,1 g Staub ergibt 10 ml Probelösung)

Mikrobiologische Analytik(Umweltambulanz, Klinikum Augsburg)

ELISA-AnalytikSension GmbH

http://www.softwarefuture.com/

http://www.softwarefuture.com/

mailto:[email protected]

www.sension-gmbh.de

www.inbio.com

Documents

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