•• Neue Entwicklungen in der Biologie Neue Entwicklungen in der Biologie

•• Somatisches Klonen und Somatisches Klonen und transgenetransgene Tiere Tiere

•• Embryonale und Embryonale und adulteadulte StammzellenStammzellen

Forum „Chancen der Landwirtschaft im Bereich regenerativer Medizin – Status Quo, Perspektiven, Geschäftsmodelle“

Nifa Hannover, 12. November 2008

Prof. Dr. Heiner Niemann Institut für Nutztiergenetik (FLI)Mariensee, Neustadt, Germany

(Agrar(Agrar--) wissenschaftliche Perspektiven ) wissenschaftliche Perspektiven der regenerativen Medizinder regenerativen Medizin

Was ist regenerative Medizin?Was ist regenerative Medizin?

• Definition: Entwicklung und Anwendung innovativer medizinischer Therapien unter Nutzung von Biomaterialien, Zellen und Organen.

• Ziel: Wiederherstellung der Gewebefunktion, Unterstützung der Regeneration kranker oder verletzter Organe.

• Charakteristikum: Interdisziplinär: Forschung aus Allgemeinmedizin, Chirurgie, Intensiv-, Transplantations-medizin, Entwicklungsbiologie, Molekularbiologie; Grund-lagen- und anwendungsorientiert,

Arbeitsmethoden aus: Zellbiologie, Biotechnologie, Medizintechnik, Molekularbiologie, Ingenieurswesen, u.a.

Der Adler und Prometheus: Erste Hinweise fDer Adler und Prometheus: Erste Hinweise füür r Regenerative MedizinRegenerative Medizin

Nature 426, 2003

Ein neues Zeitalter der Biologie:Ein neues Zeitalter der Biologie:GenomsequenzierungGenomsequenzierung, somatisches Klonen und , somatisches Klonen und

embryonale Stammzellenembryonale Stammzellen

2004: Erste Versionen des Rinder- und Geflügelgenoms

2006: Hund, Biene

2007: Pferd

2009: Schwein (erwartet)

1998Dolly

1996 - 2003

RIP

Qiu, Nature 441, 143-145, 2006

Weitere epigenetische Mechanismen:

• Telomerenlänge

• X-Chromosom-Inaktivierung

Gesamtheit der epigenetischen Mechanismen:

Epigenom

Hauptfaktoren der Hauptfaktoren der epigenetischenepigenetischen Modulation Modulation der Genexpression: der Genexpression:

DNADNA--MethylierungMethylierung und und HistonHiston--ModifikationenModifikationen

Hauptkomponenten des epigenetischen

Codes

DNA MethylierungMethylgruppen an DNA-Basen unterdrücken Genaktivität

HistonmodifikationVerschiedene Moleküle können an die Proteinendenbinden. Dies verändert die DNA-Aktivität.

Chromosom

Histon

Histonende

Me

Me

Me

Me

Dolly

1996 - 2003

RIP

Dolly, das erste geklonte Säugetier markiert den Beginn einer neue Aera in der biologischen

Forschung

Ableitung humaner embryonaler Ableitung humaner embryonaler Stammzellen aus Embryonen im Stammzellen aus Embryonen im

BlastozystenstadiumBlastozystenstadium

1998

Nature 426, 2003

2004: Rind, Gefügel

2006: Hund, Biene

2007: Pferd

2009: Schwein (erwartet)

Aktueller Stand der Aktueller Stand der GenomsequenzierungGenomsequenzierung

Geklonte Rinder in Mariensee aus adulten (links) und fetalen(rechts) Fibroblasten

ET

RekonstruierterEmbryo

7d. IVC

SchlüpfendeKT-Blastozyste

EnukleierteOozyte

KT

Die zweite Generation geklonter Rinder

Somatisches Klonen beim RindSomatisches Klonen beim Rind

Porcine Cumulus OocytenKomplexe aus Schlachthofovarien

Porcine COC nach 42 Std IVM

Mikrochirurgische Entfernung derMetaphase II Platte (Licht und Fuoreszenzmikroskopie)

Somatisches Klonen beim Schwein I: In Somatisches Klonen beim Schwein I: In vitrovitroReifung und Reifung und EnukleationEnukleation von von OozytenOozyten

Gewinnung fetaler und adulter Fibroblastenfür somatischen Kerntransfer

Growing

fibroblasts

Tissue explant

- +

Schweinefetus am Tag 25 pcund auswachsende Fibroblasten

Aufsaugen der Spender-zelle (Fibroblast)

Transfer der Spenderzelle

Fusion von Spenderzelle und Cytoplast

Status 15 min. nach Fusion

Schlüpfende Blastozyste

nach 7 Tagen Kultur

Somatisches Klonen beim Schwein II: Transfer der Somatisches Klonen beim Schwein II: Transfer der Spenderzelle in Spenderzelle in enukleierteenukleierte in in vitrovitro gereifte gereifte OozytenOozyten

Aktueller Entwicklungsstand des Aktueller Entwicklungsstand des somatischen Kerntransferssomatischen Kerntransfers

Spezies % lebensfähige Geschätzte Anzahl

Nachkommen geklonter Tiere

Rind 15-20 <4000

Schaf 8 <400

Ziege 3 <600

Schwein 2-5 <800

Katze ~1 ~10

Maus < 2 >250

Kaninchen < 2 <10

Maultier <1 3

Pferd <1 ~10

Ratte 1 3

Hund 1 4

Wolf 1 2

Weltweite Schätzung, Mai 2008

56 (3.2%)11

(100%)11/11 (78.6%)

1736(∅∅∅∅= 124)

1951 (87.0%)

224314

Geb. Ferkel(Effiz. %)

Abferke-lung(%)

TrächtigTag 25 (%)

Transf. Embryo-nen

Fusion(%)

Anzahl derKT-

Komplexe

AnzahlTransfers

EffizienzEffizienz des des somatischensomatischen KerntransfersKerntransfers beibei VerwendungVerwendungprprääovulatorischerovulatorischer peripubertalerperipubertaler SauenSauen alsals EmpfEmpfäängernger

und und transgenentransgenen SpenderzellenSpenderzellen

♀

♂In vivo embryo

x

Housekeeping Genes

Tissue specific genes

Pluri-/Totipotency related genes

Developmentally immportant genes

xx

Somatic cell

xxxx

x

Clonedembryo

x x

x

IVP embryo

x

xx

x

EpigenetischeEpigenetische ReprogrammierungReprogrammierung der Gender Gen--expressionexpression bei geklonten Embryonenbei geklonten Embryonen

Anwendungsperspektiven des somatischen Anwendungsperspektiven des somatischen Kerntransfers (=Klonen) Kerntransfers (=Klonen)

Reproduktives KlonenReproduktives Klonen

☺ Genetisch identische

Mehrlinge

☺ Transgene Tiere

(Transfektion, homolog.

Rekombination)

☺ Krankheitsmodelle

☺ Erhaltung genetischer

Resourcen

☺ Tierzucht

(Milch, Fleisch, etc.)

Therapeutisches KlonenTherapeutisches Klonen

☺ ES –Zellen

☺ Gerichtete

Differenzierung

☺ Regenerative Zellen

und Gewebe (homolog,

heterolog)

☺ Tissue Engineering

☺ Biomedizin

GrundlagenforschungGrundlagenforschung

☺ Toti- und Pluripotenz

☺ Reprogrammierung

☺ De-Differenzierung

☺ Re-Differenzierung

☺ Alterung

☺ Tumorbildung

☺ Telomerenbiologie

☺ Viele andere Gebiete

Erstellung transgener Tiere mit Hilfe des Erstellung transgener Tiere mit Hilfe des somatischen Kerntransferssomatischen Kerntransfers

Transgene ZelleTransgene Zelle

Transgenes TierTransgenes Tier

Zeitdauer der Produktion transgener Schweine durch Zeitdauer der Produktion transgener Schweine durch Mikroinjektion oder somatischen KerntransferMikroinjektion oder somatischen Kerntransfer

MikroinjektionMikroinjektion der DNA

in Zygoten

Foundertiere

Paarung der Foundertiere

Geburt von F1-Tieren

Testen der F1-Tiere auf transgene Expression

Somatischer KTTransfektion der Spenderzellen

Somatisches Klonen

Transgene Klonschweine

Testen auf transgene Testen auf transgene ExpressionExpression

Zeitgewinn: ~ 350 Tage

Tag0

115

122

180-200

~360

475

530-550

Source: Deutsche Stiftung Organtransplantation 2005

Warteliste und Anzahl der Warteliste und Anzahl der Nierentransplantationen in DeutschlandNierentransplantationen in Deutschland

Das Schwein als potentielle Spenderspezies fDas Schwein als potentielle Spenderspezies füür r humane Organehumane Organe

I like pigs; dogs look up to us, cats look down to us, pigstreat us as equal.

(Winston Churchill)

• Domestizierte Species• Hohe Fertilität, viele Tiere• Anatomie, Physiologie nicht zu verschieden vom Menschen

• Haltung unter strikten hygienischen Konditionen möglich

• Genetische Veränderungen möglich

Klinische Prüfung von Inselzellen vom Schwein zur Diabetes Behandlung läuft zur Zeit.

Endothel der norma-len Schweinegefässe

Genetisch verändertesEndothel der Schweine-gefäße (α1,3Gal-KO)

HAR

AVR

CXRhCD46

hCD46

hCD55

hCD55

hCD59

hCD59

hirudinhirudin

hTMhTM

TFPITFPI

HOHO--II

HLA-G

HLA-GHLA-E

HLA-E

A20A20

A1A1

Fas-L

Fas-L

= αGal-epitopes

= Membrane attack complex (MAC)

= Thrombus

= Natural Killer Cells

preformed anti-Gal-antibodies

Erste dreifach Erste dreifach transgenetransgene (hCD59/hDAF/hTM) (hCD59/hDAF/hTM) Schweine, geb. 11. August 2005Schweine, geb. 11. August 2005

Gene Gene PharmingPharming

ATrynATryn®®: das : das ersteerste zugelassenezugelassene rekombinanterekombinanteMedikamentMedikament ((humaneshumanes AntithrombinAntithrombin III) III) ausaus derder

MilchdrMilchdrüüsese transgenertransgener ZiegenZiegen

Indikation:Prophylaktische

Behandlung genetischbedingter AntithrombinDefizienz im Rahmen

einer eines chirurgischenEingriffs

FRAMINGHAM, MA – June 2, 2006 - GTC Biotherapeutics, Inc. ("GTC", Nasdaq: GTCB) announced today that the Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) of the European Medicines Agency (EMEA) has adopted a positive opinion on the market authorization application (MAA) for ATryn®®, GTC’s recombinant form of human antithrombin.

Generierung differenzierter Zellen durch Generierung differenzierter Zellen durch ReprogrammierungReprogrammierung somatischer Zellensomatischer Zellen

Ableitung embryonaler Stammzellen aus Ableitung embryonaler Stammzellen aus Embryonen im Embryonen im BlastozystenstadiumBlastozystenstadium

1998

Humane Humane ESES--ZellZell KolonieKolonie

Gezielte Differenzierung von ESGezielte Differenzierung von ES--, EG, EG--und ECund EC--Zellen Zellen

Einsatz von Stammzellen zur Generierung von Einsatz von Stammzellen zur Generierung von regenerativen Zellen und Gewebenregenerativen Zellen und Geweben

Therapeutisches KlonenTherapeutisches Klonen

Bioptierte Zelle(z.B. Fibroblast)

Enukleiertehumane Eizelle

Kerntransfer-embryo

Blastozyste

Embryonale StammzellenBenötigte Zellen (z.B.Herzmuskelzellen)

In vitro-

Differenzierung

Published Nature online

ahead of press, June7th, 2007

Erzeugung Erzeugung pluripotenterpluripotenter Stammzellen durch Stammzellen durch ÜÜberexpression von 4 berexpression von 4 SchlSchlüüsselgenensselgenen

Somatische Körperzellen

Induzierte pluripotenteStammzellen

• Oct4 (PouSf1)

• Sox 2

• c-Myc

• KIf4

Gewinnung von Gewinnung von iPSiPS aus humanen aus humanen HaarzellenHaarzellen

Gadue and Cotsarelis; Nature Biotechnology 26, 1243-1244, 2008

Applikation Applikation adulteradulter Stammzellen am HerzenStammzellen am Herzen

Die Notwendigkeit neuer Tiermodelle

Jüngste Entwicklungen:

Pluripotente Zellen,

Reprogrammierung, iPS

In Vorbereitung: Modelle im Minischwein, Rhesusaffe,

Weissbüschelaffe

• Sequenzierung und Annotierung von Genomen

• Somatisches Klonen beim Säuger

• Epigenetische Plastizität von Zellen (Pluripotenz und De-Differenzierung)

Neue Horizonte fNeue Horizonte füür die Nutztiergenetik r die Nutztiergenetik

und Biomedizinund Biomedizin

UmwUmwäälzungen in der Biologielzungen in der Biologie

Area A:

Stammzell Biologie

Klonen/Reprogrammierung

Organogenese

Proliferation und Alterung

• Blut

•Herz

• Lunge

• Leber

• Künstliche Organe

• Autologe Zellen und

Gewebe

• Allogene Zellen und Gewebe

• Xenogene Zellen und

Gewebe

• Tissue Engineering

• (Xenotransplantate)

REBIRTHREBIRTH**: Aufbau eines Centers f: Aufbau eines Centers füür r Regenerative Medizin mit internationaler Regenerative Medizin mit internationaler

SpitzenstellungSpitzenstellung

*DFG-Exzellenzcluster: MHH, Leibniz Univ., TiHo, HZI, MPI, ING-Mariensee

Zusammenfassung und Schlussfolgerungen

• Das somatische Klonen erlaubt die Erstellung transgener Tiermodelle für die regenerative Medizin.

• Pharming ist bereits in der praktischen Anwendung.

• Die Erzeugung multi-transgener Schweine wird die Xenotransplantationbis zur präklinischen Prüfung voranbringen.

• Effektive Verfahren zur Reprogrammierung somatischer Zellen stehen zur Verfügung.

• Die Erstellung individual-spezifischer therapeutischer Zellen, entweder durch therapeutisches Klonen oder iPS Verfahren ist möglich.

• Die Etablierung aussagekräftiger Tiermodelle ist von entscheidender Bedeutung für die Erweiterung der Grundlagenkenntnise und die Weiterentwicklung dieser Technologien bis zur klinischen Anwendungsreife.

• Die Entwicklung aussagekräftiger Grosstiermodelle für die regenerative Medizin ist eine viel versprechende Nische für wirtschaftliche Aktivitäten

VielenVielen Dank fDank füür r

IhreIhre

AufmerksamkeitAufmerksamkeit

Lowry and Plath; Nature Biotechnology 26, 1246-1248, 2008

Lowry and Plath; Nature Biotechnology 26, 1246-1248, 2008