Aus der Klinik mit Poliklinik für Kinder und Jugendliche

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. med. Dr. h. c. Wolfgang Rascher

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Aktives Visfatin zeigt

erhöhte Serumkonzentrationen bei Hämodialyse-

patienten und korreliert invers mit zirkulierendem

HDL-Cholesterin

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät der

Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von Maurice Petrasch

aus Erlangen

Gedruckt mit Erlaubnis der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler

Referent: Prof. Dr. med. J. Dötsch

Korreferent: Prof. Dr. med. Dr. h.c. W. Rascher

Tag der mündlichen Prüfung: 22. September 2010

Widmung Diese Arbeit widme ich den Menschen, die mich stets auf meinem Weg unterstützt

haben; die mir helfend zur Seite standen, wenn ich sie gebraucht habe.

Ganz besonderer Dank gilt meinen Eltern, Wolfgang und Brigitte Petrasch,

meiner Freundin Renate P., meinen besten Freunden Johannes B., Johannes H. und

Markus P. Vielen Dank!

Inhaltsverzeichnis:

1 Zusammenfassung 1

1.1 Deutsch 1

1.1.1 Hintergrund und Ziele 1

1.1.2 Patienten und Methoden 2

1.1.3 Ergebnisse 2

1.1.4 Schlussfolgerung 2

1.2 Englisch 3

1.2.1 Background 3

1.2.2 Methods 3

1.2.3 Results 3

1.2.4 Conclusions 4

2 Einleitung 5

2.1 Grundlagen 5

2.1.1 Visfatinaufbau und Lokalisation 5

2.1.2 Korrelation der Fettgewebsmasse und der Visfatinkonzentration 5

2.1.3 Die Rolle von Visfatin im Insulin-/ Glukosestoffwechsel 6

2.1.4 Visfatinspiegel bei Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz 8

2.1.5 Bedeutung der Präanalytik innerhalb der Visfatinbestimmung 9

2.1.5.1 Korrelation zwischen Probenröhrchen und Visfatinkonzentration 9

2.1.5.2 Korrelation zwischen Lagerungsbedingungen und Visfatin-

konzentration 10

2.1.6 Visfatinbestimmung: ELISA versus EIA 12

2.2 Zielsetzung der Studie 14

3 Material und Methoden 15

3.1 Probanden 15

3.2 Zuordungskriterien 17

3.2.1 Terminale Niereninsuffizienz 17

3.2.2 Diabetes mellitus 18

3.3 Ablauf der Hämodialyse 20

3.4 Sammeln der Proben 20

3.5 Prinzipien der verwendeten Kits 20

3.5.1 Prinzipien des EIA/ ELISA-Verfahrens zur Visfatinmessung 20

3.5.2 Prinzipien des RIA-Verfahrens zur Insulinmessung 22

3.5.3 Prinzipien der Photometrie 23

3.6 Umsetzung im Labor 24

3.6.1 Bestimmung der Insulinkonzentration mittels DSL-1600 RIA-Kit 24

3.6.2 Bestimmung der Visfatinkonzentration mittels ELISA-Kit 27

3.6.3 Bestimmung der Visfatinkonzentration mittels EIA-Kit 31

3.7 Auxologische Parameter 36

3.8 Statistische Analyse 36

4 Ergebnisse 38

4.1 Bivariate Analysen der Körperzusammensetzung und der Labor-

parameter 38

4.2 Multiple Regressionsanalyse der Serumvisfatinkonzentration

aller Probanden 40

4.3 Korrelationsanalysen und multiple Regressionsanalyse des

aktiven Serumvisfatins bei HD-Patienten 41

4.4 Korrelationsanalyse der Ergebnisse beider Verfahren, ELISA

und EIA 44

5 Diskussion 45

6 Literaturverzeichnis 49

7 Abkürzungsverzeichnis 55

8 Abbildungsverzeichnis 59

9 Tabellenverzeichnis 60

10 Veröffentlichungen 61

11 Danksagung 62

12 Lebenslauf 63

1

1 Zusammenfassung

1.1 Deutsch

1.1.1 Hintergrund und Ziele

Visfatin ist ein 52 kDa schweres Protein, das aus 473 Aminosäuren besteht. Ferner

fungiert es als Wachstumsfaktor für B-Vorläuferzellen, weswegen es auch als Pre-B-

Cell Colony Enhancing Factor (PBEF) bezeichnet wird. Es steht in starkem Zusam-

menhang mit der Masse an visceralem und zum Teil auch subkutanem Fettgewebe.

Wie kürzlich vorausgegangene Studien zeigten, ist es der extrazellulären Form der

Nicotinamid-5-Phosphoribosyl-1-Pyrophosphat-Transferase (eNAMPT) gleichzuset-

zen, die den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der NAD-Synthese aus Nicotin-

amid katalysiert.

Hauptziel der Studie war es zunächst, verlässliche Daten über die Konzentration des

zirkulierenden, aktiven Visfatins im Serum von Hämodialysepatienten mit chronisch-

terminaler Niereninsuffizienz im Vergleich zu gesunden Probanden zu erheben.

Vorausgegangene Studien beschäftigten sich hauptsächlich mit den Interaktionen

von Visfatin und Glukose bzw. Insulin und bedienten sich zur Konzentrationsbe-

stimmung oftmals einem Enzyme Immuno Assay (EIA). Sie lieferten kontroverse

Ergebnisse. Neue Untersuchungen zeigten allerdings, dass der EIA zur Bestimmung

der Visfatinkonzentration wahrscheinlich ungeeignet ist, da er nicht das Visfatinmo-

lekül an sich, sondern ein unspezifisches, 500 kDa schweres Protein detektiert.

Basierend auf dieser Erkenntnis nutzten wir zur Visfatinbestimmung einen alternati-

ven, nachweislich besser geeigneten Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA),

der vor allem dimeres, aktives Visfatin erfasst. Auch hier sollten mögliche Zusam-

menhänge von Visfatin mit Körperbau bzw. Parametern des Glukosestoffwechsels

aufgedeckt werden. Die erhobenen Daten wurden anschließend mit denen des EIAs

verglichen.

Einflüsse von Visfatin auf den Lipidstoffwechsel wurden bislang in der Literatur

nicht beschrieben, was uns veranlasste auch hier eine mögliche Korrelation zu unter-

suchen.

2

1.1.2 Patienten und Methoden

Die Studie erfasste 74 Hämodialysepatienten (HD) und 35 Personen in einer Kon-

trollgruppe (K), wobei das mittlere Alter bei 62.9 Jahren lag. Den Probanden wurde

morgens im nüchternen Zustand Blut abgenommen; den HD-Patienten genauge-

nommen 66 bis 69 Stunden nach der letzten Dialyse und somit kurz vor Beginn der

nächsten Dialysesitzung. Aktives Visfatin (ELISA), Insulin (RIA) und Glukose

(klinische Routinemessung) wurden bestimmt. Die Daten zur Körperzusammenset-

zung erhoben wir mittels Bauchumfang, Hautfaltendickemessung und Body Impe-

dance Analyse (BIA). Schließlich wurden die Ergebnisse der Visfatinmessung mit-

tels ELISA mit den Daten der EIA-Messung verglichen.

1.1.3 Ergebnisse

Wir stellten eine erhöhte Konzentration von aktivem Visfatin in der HD-Gruppe

(5.58 ± 6.50 ng/ml) im Vergleich zur Kontrollgruppe K [0.97 ± 1.79 mg/ml, im Mit-

tel ± SD; p < 0.0001 per multipler Regressionsanalyse (MRA)] fest. Die Erhöhung

war unabhängig von der Plasmaglukose, dem Seruminsulin, dem Vorliegen eines

Diabetes mellitus Typ 2, dem HDL-Cholesterin und der Körperzusammensetzung.

Interessanterweise verhielt sich das aktive Visfatin innerhalb der HD-Gruppe invers

zum Plasma-HDL (p < 0.001; 4 % Erniedrigung pro zusätzlichem mg/dl an HDL)

und positiv zum Vorliegen eines insulinbehandelten Diabetes [Subgruppe n=18; 119

% höher als bei Patienten ohne Diabetes (n=40); p=0.011].

Der Vergleich der Visfatinwerte zwischen EIA- und ELISA-Verfahren ergab, wie

vermutet, keinerlei signifikante Korrelation.

1.1.4 Schlussfolgerung

Unsere Studie lieferte als eine der Ersten verlässliche Daten über die Visfatinkon-

zentration bei HD-Patienten und gesunden Probanden, die per ELISA-Verfahren

erhoben wurden. Ein Verlust der Nierenfunktion bei Patienten mit terminaler Nieren-

insuffizienz geht mit einer erhöhten Plasmavisfatinkonzentration einher. Weiterhin

könnte die verminderte HDL-Serumkonzentration, die als unabhängiger Prädiktor für

ein gehäuftes Auftreten von kardiovaskulären Ereignissen zu sehen ist, eine hilfrei-

che Erklärung für eine gesteigerte Morbidität und Mortalität von HD-Patienten mit

erhöhtem Serumvisfatin sein.

3

1.2 Englisch

1.2.1 Background

Increased circulating visfatin may be associated with both endothelial damage and

increased mortality in end stage renal disease patients. HDL cholesterol is an inde-

pendent, strong inverse predictor of cardiovascular events. However, an association

between visfatin and parameters of lipid metabolism is unclear.

Previous studies used a C-terminal enzyme immuno assay (EIA) for measurement of

visfatin. However, conflicting results have been reported, because the EIA may not

detect full-length human visfatin sufficiently. Therefore, we used a well-

characterized enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which primarily detects

enzymatically active, dimeric visfatin. We focused on a putative association of active

serum visfatin with body composition as well as parameters of glucose and lipid me-

tabolism in HD patients. Finally, data were compared with those measured by EIA.

1.2.2 Methods

We included 74 hemodialysis patients (HD) and 35 controls (K). All subjects (mean

age 62.9 years) provided fasted blood samples (HD patients after 66–69 hours with-

out dialysis). Circulating active visfatin was measured by the ELISA. Body composi-

tion was evaluated using waist circumference, skinfold thickness and body impe-

dance analysis (BIA). Results obtained by the ELISA were compared with EIA data.

1.2.3 Results

Active serum visfatin was increased in HD (5.58 ± 6.50 ng/mL) versus K [0.97 ±

1.79 ng/mL, mean ± SD; p < 0.0001 by multiple regression analysis (MRA)] inde-

pendently of plasma glucose, serum insulin, diabetes, HDL cholesterol and body

composition. Within the HD group, only plasma HDL cholesterol (4 % lower per

additional mg/dl HDL; p=0.001) and insulin-treated diabetes mellitus [subgroup of

n=18; 119 % higher compared with patients without diabetes (n=40); p=0.011] were

independently (by MRA) associated with active serum visfatin. Visfatin measured by

an EIA showed no correlation with ELISA data.

4

1.2.4 Conclusions

Our study provides reliable data on active visfatin in HD patients by employment of

a well-characterized ELISA. Loss of renal function is accompanied by increased cir-

culating active visfatin concentrations in our patients. Furthermore, decreased HDL

cholesterol may hint at an increased probability of cardiovascular events in HD

patients with elevated serum visfatin.

5

2 Einleitung

2.1 Grundlagen

2.1.1 Visfatinaufbau und Lokalisation

Samal et al. gelang es 1993 aus peripheren Lymphozyten des Menschen ein Gen zu

isolieren, das für die Kodierung eines bestimmten Polypeptides verantwortlich ist.

Dieses Peptid verstärkt die Wirkung von SCF (Stem Cell Factor) und Interleukin

(IL)-7 auf B-Vorläuferzellen. Sie nannten es demnach PBEF (Pre-B-Cell Colony

Enhancing Factor) [36]. Es handelt sich hierbei um ein 52 kDa schweres Protein aus

473 Aminosäuren. Seine Expression findet vor allem im Knochenmark als Ort der B-

Zell-Lymphogenese statt, aber auch in der Leber, in Muskelzellen und im visceralen

Fettgewebe. Dies gilt sowohl für die Maus als auch den menschlichen Organismus.

Seitdem ist PBEF auch als Visfatin bekannt [13].

2.1.2 Korrelation der Fettgewebsmasse und der Visfatinkonzentration

Fukuhara et al. [13] konnten 2005 in einer Studie zeigen, dass die Plasmavisfatin-

konzentration im menschlichen Organismus in starkem Zusammenhang mit der Mas-

se an visceralem und zum Teil auch mit der Masse an subkutanem Fettgewebe steht.

Sie bestimmten dabei den Anteil am Körpergewicht sehr präzise mit Hilfe der Com-

putertomographie.

Shunsuke et al. knüpften 2008 an diese Ergebnisse an und nutzten die Plasmavisfa-

tinkonzentration als Marker für die Fettanhäufung bei übergewichtigen Kindern

(s. Abb. 2.1) [37].

6

Abb. 2.1: Korrelation zwischen Visfatin und visceralem als auch subkutanem Fettgewebe

(EIA) [37]; SAT=subcutaneous adipose tissue, VAT=visceral adipose tissue, r=Korrelations-

koeffizient, p=Überschreitungswahrscheinlichkeit.

2.1.3 Die Rolle von Visfatin im Insulin-/ Glukosestoffwechsel

In den letzten Jahren erschienen eine Vielzahl von Veröffentlichungen mit der An-

nahme, Visfatin besitze insulinähnliche Stoffwechseleffekte und vermittle diese mit-

tels Insulinrezeptor an der Effektorzelle [13]. Somit bestünde ein direkter Einfluss

auf den Blutglukosespiegel.

Revollo et al. [34] wiederlegten 2007 die Vermutung, dass Visfatin direkt an den

Insulinrezeptor bindet und diesen aktiviert [13]. Durch Untersuchungen in vitro und

in vivo wurde gezeigt, dass das zirkulierende Visfatin mit der extrazellulären Form

der Nicotinamid-5-Phosphoribosyl-1-Pyrophosphat-Transferase (eNAMPT) gleich-

zusetzen ist. Dieses Enzym katalysiert den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in

der NAD- (Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid) Biosynthese (s. Abb. 2.2) [34, 35].

Somit übt Visfatin möglicherweise einen kritischen Einfluss auf die Energiebilanz,

Funktion und das Überleben von Zellen aus [39].

7

Abb. 2.2: Regulation der Insulinsekretion aus den ß-Zellen des Pankreas durch die Nampt-

vermittelte NAD-Biosynthese: Ausdifferentierte Adipozyten setzen die extrazelluläre Form

des Nampt (eNampt) frei und beeinflussen somit die intrazelluläre NAD-Biosynthese [32];

iNampt/eNampt=intrazelluläre/extrazelluläre Nicotinamid-5-Phosphoribosyl-1-Pyrophosphat

-Transferase; NMN=Nicotinamid-Mononucleotid; NMAT=Nicotinamid-Mononucleotid-A-

denylyl-Transferase; Sirt1=Sirtuin 1.

Adipozyten

Nikotinamid

eNampt

NMN

NMNAT NAD

Sirt1 Redox- Pathway

Insulinsekretion

?

Insulin

weitere Zellen Adipozyten

ß- Zelle

Nikotinamid NMN iNampt

8

Die Autoren kamen zu dem Schluss, dass Visfatin auf diesem Weg den Energiestatus

der pankreatischen ß-Zellen beeinflussen kann. Eine reduzierte Visfatinaktivität führt

demnach zu einer verminderten NAD-Verfügbarkeit, was wiederrum eine herabge-

setzte glucosevermittelte Insulinausschüttung aus den ß-Zellen zur Folge hat [34].

2.1.4 Visfatinspiegel bei Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz

Einige Studien beschäftigten sich bereits mit der Rolle des Visfatins bei Patienten

mit terminaler Niereninsuffizienz (TNI) [1, 40]. So stellten Axelsson et al. [1] erhöh-

te Visfatinkonzentrationen bei gleichzeitig hohem sVCAM-1 fest, einem Marker für

die endotheliale Dysfunktion. Daraus wurde der Schluss gezogen, dass eine erhöhte

Sterblichkeit bei niereninsuffizienten Patienten möglicherweise Folge einer endothe-

lialen Dysfunktion bei Hypervisfatinämie ist (s. Abb. 2.3) [1, 40].

Abb. 2.3: Kumulativüberleben von Patienten mit TNI in Relation zur Visfatinkonzentration

(EIA): Starker Einbruch der Überlebenszeitkurve bei hohen Visfatinkonzentrationen [1].

9

2.1.5 Bedeutung der Präanalytik innerhalb der Visfatinbestimmung

Viele bislang durchgeführte Studien richteten ihr Hauptaugenmerk auf diverse Inter-

aktionen der Plasmavisfatinkonzentration mit Insulin-/ Glukosespiegel bzw. Faktoren

der Körperzusammensetzung wie z.B. das Gewicht oder dem BMI (Body Mass In-

dex). All diese Studien basierten auf dem bis vor kurzem gängigen EIA-Verfahren

(Enzyme Immuno Assay). Die Ergebnisse waren jedoch nicht zufriedenstellend, da

häufig kontroverse Resultate oder starke Unterschiede in der Spannbreite der Visfa-

tin-Nüchtern-konzentrationen zwischen 0.5-1.0 ng/ml [16, 17] bis hin zu 20-25 ng/ml

vorlagen [5, 6, 29].

Wir nahmen zunächst an, dass Störfaktoren zu der enormen Streuung der Visfatin-

werte beitrugen. Bei näherer Betrachtung stellte sich heraus, dass keiner der Autoren

auf präanalytische Bedingungen wie die Wahl der Blutröhrchen oder die optimale

Lagerungstemperatur einging.

Unsere Studie lieferte hierzu neue Daten und zeigte, dass die Visfatinkonzentrations-

bestimmung mittels EIA vor allem unter Verwendung von K2-EDTA bzw. Serum-

Probenröhrchen geschehen sollte. Nach Entnahme sollten die Proben schnellstmög-

lich auf 4°C heruntergekühlt und während der Studie nicht öfters als fünf Mal aufge-

taut und erneut eingefroren werden (s. Punkt 2.1.5.1/ 2.1.5.2).

Allerdings zeigte sich, dass selbst bei der Verwendung der EDTA-Plasmaröhrchen,

die vom Hersteller des EIA-Kits ausdrücklich empfohlen wurden, eine erhebliche

Intra- und Interassay-Varianz vorlag. Dies ließ uns bereits an eine nicht optimale

Qualität des EIAs für diesen Verwendungszweck, die Bestimmung der Visfatinkon-

zentration, denken (s. Punkt 2.1.6) [28].

2.1.5.1 Korrelation zwischen Probenröhrchen und Visfatinkonzentration

Die Visfatinkonzentrationsmessung (EIA) in unterschiedlichen Probenröhrchen er-

gab, dass die Bestimmung mittels EDTA-Plasmaröhrchen am zuverlässigsten ist.

Ebenso lieferte die Verwendung von Serumröhrchen annehmbare und ziemlich ver-

gleichbare Ergebnisse. Dennoch zeigte sich hier ein Variationskoeffizient von

>15 %. Die mittlere Konzentration lag 13.5 % niegriger als im K2-EDTA-Plasma.

Die Werte des Li-Heparin-Plasmas waren ebenfalls zuverlässig, aber 50 % niedriger

als im EDTA-Plasma.

10

Citrat- und Fluorid-Plasma sind nicht zu empfehlen. Sie zeigten hohe Abweichungen

und niedrige Reliabilität der gemessenen Konzentrationen (s. Abb. 2.4).

Folglich kann die Verwendung unterschiedlicher Probenröhrchen zu stark variieren-

den Ergebnissen führen.

Abb. 2.4: Abhängigkeit der gemessenen Visfatinkonzentration von den verwendeten Proben-

röhrchen: EDTA liefert neben Serum als Trägersubstanz die zuverlässigsten Werte [28].

2.1.5.2 Korrelation zwischen Lagerungsbedingungen und Visfatinkonzentration

Die Studiendaten ließen erkennen, dass die Lagerung der Blutproben bei unterschied-

lichen Temperaturen ebenfalls eine entscheidende Rolle für das Outcome der Mes-

sung spielt. So erwies sich die Aufbewahrung bei 4°C für fünf Tage als durchaus

akzeptabel, da hier lediglich eine Reduktion von

11

Tag Visfatin (ng/ml)

4°C

Visfatinanteil

(% von Tag 0)

4°C

Visfatin

(ng/ml)

23°C

Visfatinanteil

(% von Tag 0)

4°C

0 35.8 ± 13.9 100 35.8 ± 13.9 100

1 34.8 ± 13.8 96.7 ± 5.3 25.9 ± 9.0 73.2 ± 4.2

2 38.5 ± 16.1 107.1 ± 9.9 25.6 ± 8.0 73.3 ± 7.6

3 37.1 ± 14.1 106.9 ± 27.7 22.5 ± 6.0 66.0 ± 14.4

4 34.9 ± 14.6 100.4 ± 29.7 19.5 ± 5.3 57.3 ± 13.1

5 32.8 ± 14.2 91.1 ± 8.2 20.6 ± 4.6 61.8 ± 16.8

Tab. 2.1: Stabilität von Visfatin im K2-EDTA-Plasmaröhrchen bei 4°C bzw. 23°C: Bereits

nach einem Tag zeigte sich eine deutliche Reduktion der Visfatinspiegel bei Raumtempera-

tur (23°C). Alle Daten wurden mittels EIA erhoben, unter Berücksichtigung der Standard-

abweichung [28].

Anzahl der

Auftauvorgänge Visfatin (ng/ml)

Visfatinanteil vom Aus-

gangswert in %

0 35.8 ± 13.9 100

1 35.3 ± 13.2 99.6 ± 6.6

2 39.2 ± 14.0 111.0 ± 12.6

3 36.5 ± 9.9 107.3 ± 26.2

4 33.1 ± 9.2 97.1 ± 22.4

5 30.2 ± 8.9 88.4 ± 22.6

Tab. 2.2: Stabilität von Visfatin in Abhängigkeit von der Anzahl der Auftauvorgänge mit

anschließend erneutem Einfrieren: Wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist bis zu fünf Mal

bedenkenlos möglich [28].

12

Abb. 2.5: Visfatinkonzentration bei unterschiedlichen Temperaturen: Erhebliche Reduktion

unter Raumtemperatur bereits nach einem Tag [28].

2.1.6 Visfatinbestimmung: ELISA versus EIA

Studien, die den EIA zur Visfatinbestimmung nutzten, wiesen hohe Spannbreiten

innerhalb der gemessenen Konzentrationen auf [1, 29, 30, 40, 41]. Diese Tatsache

sowie die Ergebnisse unserer Präanalytikstudie ließen uns an der Eignung des EIAs

für unsere Zwecke zweifeln.

In der Tat zeigten neue Untersuchungen, dass dies wahrscheinlich an der unpräzisen

Messung des EIAs liegt, der nicht Visfatin an sich, sondern ein undefiniertes Protein

mit einem molekularen Gewicht von ungefähr 500 kDa detektiert. So zeigten Körner

et al. erstmals die erheblichen Unterschiede in der Detektionseigenschaft der einzel-

nen Assays bezüglich Visfatin auf (s. Abb. 2.6 und 2.7) [22]. Die Detektion von mo-

nomerem Visfatin mit einem Molekulargewicht von 52 kDa gelang bislang nicht.

13

Abb. 2.6: Detektionsspektrum des EIAs: Er misst nicht monomeres Visfatin (52 kDa), son-

dern ein nicht weiter definiertes Protein mit ca. 500 kDa [22].

Eine gute Alternative zum fehlerhaften EIA bietet das ELISA-Verfahren (Enzyme

Linked Immunosorbent Assay), welches hauptsächlich das dimere und somit aktive

Visfatin misst.

Abb. 2.7: Detektionsspektrum des ELISAs: Das ELISA-Verfahren detektiert ziemlich genau

dimeres, aktives Visfatin. Es ist somit besser zur Bestimmung der Plasmavisfatinkonzentra-

tion geeignet [22].

14

2.2 Zielsetzung der Studie

Visfatin ist ein Protein, das vom menschlichen Fettgewebe sezerniert wird. Es steht

in starkem Zusammenhang mit der Masse an sowohl visceralem, als auch subkuta-

nem Fettgewebe. Zudem entspricht es der extrazellulären Form der Nicotinamid-5-

Phosphoribosyl-1-Pyrophophat-Transferase (eNAMPT) und nimmt somit höchst-

wahrscheinlich Einfluss auf die Energiebilanz der Zellen. Seine aktive Form lässt

sich am genauesten mit Hilfe des ELISA-Verfahrens bestimmen. Dabei spielt die

Präanalytik, d.h. die Umstände unter denen die Proben gesammelt und archiviert

werden, eine entscheidende Rolle für die Zuverlässigkeit der Visfatinkonzentrations-

bestimmung.

Hauptziel unserer Studie war die Erhebung verlässlicher Daten über die Konzentra-

tion des Visfatins sowohl bei HD-Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz als

auch gesunden Probanden. Insbesondere sollten mögliche Korrelationen zwischen

Visfatin und Körperbau bzw. Parametern des Glukose- sowie des Lipidstoffwechsels,

welcher bislang in der Literatur noch nicht weiter erwähnt wurde, dargestellt werden.

Da Zweifel an der Spezifität und Reliabilität des bislang standardmäßig verwendeten

EIAs bestanden, erhoben wir unsere Daten anhand beider Verfahren, ELISA und

EIA, und verglichen diese anschließend miteinander.

15

3. Material und Methoden

3.1 Probanden

Die Studie wurde vom Ethik-Komitee der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-

Nürnberg genehmigt. Alle in die Studie aufgenommenen Personen wurden aufgeklärt

und gaben ihr schriftliches Einverständnis.

Es nahmen 109 Probanden an der Studie teil. Darunter befanden sich 74 Hämodialy-

sepatienten mit einer terminalen Niereninsuffizienz (TNI) aus drei unterschiedlichen

Dialysezentren sowie 35 Probanden als Kontrollen. Innerhalb der Gruppen wurde auf

eine Verteilung mit ähnlichem Alter, Geschlecht und BMI geachtet (Tab. 3.1).

Hämodialyse-

Patienten (HD) Kontrollen (K)

N 74 35

Alter (Jahre) 63.9 ± 11.2 60.7 ± 15.1

Geschlecht (männlich; weiblich) 38; 36 22; 13

BMI (kg/m²) 26.9 ± 5.7 25.9 ± 4.2

Tab. 3.1: Verteilung innerhalb der Kontroll- und Patientengruppe hinsichtlich Alter, Ge-

schlecht und BMI.

Die Probanden in der Kontrollgruppe waren völlig gesund. Als Einschlusskriterien

galten ein Alter ≥ 18 Jahre, die Zustimmung nach erfolgtem Aufklärungsgespräch

sowie Nüchternheit am Untersuchungstag. Ausschlusskriterien waren sowohl klini-

sche bzw. laborchemische Anzeichen für eine Nierenerkrankung, Entzündungszei-

chen, maligne Erkrankungen, Diabetes mellitus oder andere Stoffwechselerkrankun-

gen, sowie die Einnahme jeglicher Medikamente, die die erhobenen Daten

verfälschen könnten.

Das Alter der HD-Patienten lag ebenfalls über bzw. gleich 18 Jahre. Sie gaben ihr

Einverständnis und erschienen nüchtern zum Untersuchungstermin. Typ 2 Diabetiker

wurden ebenfalls in die Studie eingeschlossen. Wir achteten darauf, dass keine ma-

16

lignen Erkrankungen im Endstadium vorlagen bzw. sich die Patienten nicht unter

Wachstumshormontherapie befanden. Eine mögliche Insulinrezeptormutation wurde

anamnestisch ausgeschlossen. Auch Dialysepatienten mit Anzeichen einer exzessi-

ven Hyperhydration (>7 L), die die BIA-Messungen verfälschen könnte, wurden aus-

geschlossen. Primär wurden 81 HD-Patienten untersucht, sieben anschließend ausge-

schlossen (kein Einverständnis, n=3; Typ 1 Diabetes, n=1; nicht nüchtern, n=2; in-

compliance, n=1).

Der TNI in der HD-Gruppe lagen unterschiedliche Ätiologien zu Grunde: Diabeti-

sche Nephropathie (25), Hypertensive Nephropathie (13), Glomerulonephritis (21),

Polyzystische Nierenerkrankung (6), Refluxnephropathie (1), unbekannter Ursprung

(8). Drei Patienten mussten sich laut Anamnese einer allogenen Nierentransplanta-

tion unterziehen.

Begleiterkrankungen waren arterielle Hypertonie (56), Diabetes mellitus Typ 2 (34),

Koronare Herzkrankheit (27), Herzinsuffizienz (20), Hyperurikämie (20), Hyperli-

poproteinämie (28), pulmonale Obstruktion (10) und elf weitere Erkrankungen (1-8/

Patient). 24 Patienten hatten eine Anurie (0-50 ml/d), 12 eine Oligurie (100-500

ml/d) und 31 hatten ein Urinvolumen von 500-2500 ml/d. Die Restdiurese konnte

bei sieben Patienten nicht bestimmt werden. 59 Patienten befanden sich in antihyper-

tensiver Therapie; 42 Probanden nahmen Beta-Blocker, 19 ACE-Hemmer, 20 Calci-

umkanal-Blocker, sieben Alpha-Rezeptorblocker, 27 Diuretika, sechs Imidazolin-

Rezeptorantagonisten, zehn Angiotensin-2-Rezeptorblocker. Weitere Medikamente

waren Alpha-Calcidiol (27), Calcitriol (5), Cinacalcet (13), Phosphatbinder (63),

Sodium Bicarbonat (9), Eisen-III-Sodium-Gluconat i.v. (43), Allopurinol (22), Stati-

ne (32), Acetylsalycilsäure (41), Clopidogrel (9), Digitoxin (14), Nitrate (15), Proto-

nenpumpeninhibitoren (36), Levothyroxin (12), Metamizol (14), Antihistaminika (8)

und weitere Medikamtente (1–6/ Patient). 50 Patienten erhielten rekombinantes hu-

manes Erythropoetin bzw. Darbepoetin. 18 Patienten spritzten Insulin, wobei zehn

dies s.c. 15–45 Min. vor der Blutabnahme durchführten. Es handelte sich um Insulin

lispro (1), Insulin aspart (2), Kurzzeitinsulin (3), Kombiniertes Kurz- und Langzeit-

insulin (3) und Langzeitinsulin (1). Bei den verbleibenden acht Patienten war die

letzte Injektion mehr als zehn Stunden vorausgegangen: Kurzzeitinsulin (4), Kombi-

niertes Kurz- und Langzeitinsulin (3) und Langzeitinsulin (1).

17

Die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) wurde mittels MDRD-Formel (vier Parameter,

s.u.) bestimmt. In der HD-Gruppe lag so die mittlere GFR 66-69 Stunden nach Dia-

lyse bei 5.90 ± 2.57 ml/min/1.73 m2.

3.2 Zuordnungskriterien

3.2.1 Terminale Niereninsuffizienz

Die terminale Niereninsuffizienz (TNI) ist die Folge einer irreversiblen Verminde-

rung der glomerulären, tubulären und endokrinen Funktion beider Nieren mit einer

Reduktion der glomerulären Filtrationsrate (GFR) von < 10 ml/min/1.73 m2.

Zwei Parameter sprechen für eine Manifestation der Niereninsuffizienz. Dies ist zum

einen ein für drei oder mehr Monate bestehender Nierenschaden bzw. eine GFR von

< 60 ml/min/1.73 m2 für ebenfalls drei oder mehr Monate [19].

Die in diese Studie eingeschlossenen Patienten der HD-Gruppe wiesen alle eine GFR

zwischen 0–10 ml/min/1.73m2 auf (=TNI) und erfüllten somit die Einschluss-

kriterien. Die GFR wurde mittels vereinfachter MDRD-Formel (Modification of Diet

Renal Disease) berechnet:

GFR (ml/min/1.73m2) = 186 * S-Krea -1.154 * Alter -0.203

[* 0.742 nur bei Frauen] [*1.21 bei Patienten mit schwarzer Hautfarbe].

Abb. 3.1.: MDRD-Formel zur Bestimmung der GFR

18

Stadium:

Kreatinin-Clearance

(ml/min) = GFR

(ml/min/1.73 m2):

1. Nierenschädigung mit normaler Nierenfunktion > 90

2. Nierenschädigung mit Niereninsuffizienz

a) leicht

b) mäßig

c) hochgradig

d) terminal

60-89

30-59

15-29

< 15

Tab. 3.2: Stadien der Nierenfunktionsstörung anhand der GFR bzw. Kreatinin-Clearance

[19].

3.2.2 Diabetes mellitus

Diabetes mellitus ist eine erbliche, chronische Stoffwechselstörung, die auf einem

absoluten oder relativen Mangel an Insulin beruht. In deren Folge treten meist erst

nach längerer Krankheitsdauer Schäden an Blutgefäßen und Nervensystem auf [19].

Man unterteilt den Diabetes mellitus anhand der Ätiologie in Typ 1 bis 4:

• Typ 1-Diabetes:

Im Rahmen des Typ 1-Diabetes kommt es zur Zerstörung der ß-Zellen der Langer-

hansschen Inseln des Pankreas, woraus ein absoluter Insulinmangel resultiert. Dies

ist meist durch eine Autoimmuninsulitis (90%), zum Teil auch idiopathisch bedingt

(in Europa eher selten). Dabei spielen genetische Faktoren eine prädisponierende

Rolle [19].

• Typ 2-Diabetes:

Beim Typ 2-Diabetes sind pathogenetisch zwei Mechanismen entscheidend: Die ge-

störte postprandiale Insulinsekretion mit resultierender postprandialer Hyperglykä-

mie und die herabgesetzte Insulinwirkung (= Insulinresistenz) in Folge eines Prä-

19

Rezeptordefekts, Rezeptordefekts mit Downregulation oder Störung der Signaltrans-

duktion. Überernährung mit Adipositas stellt jedoch den entscheidensten Manifesta-

tionsfaktor des Typ 2-Diabetes mellitus dar. Ca. 80% der Typ 2-Diabetiker sind

übergewichtig. Hohe Insulinspiegel vermindern die Sensibilität und Dichte der Insu-

linrezeptoren (= Downregulation) und damit die Insulinwirkung [19].

• Typ 3-Diabetes:

Dem Typ 3-Diabetes liegen verschiedene Ursachen zu Grunde. So spielen hier gene-

tische Defekte in der ß-Zellfunktion (Insulinsekretionsstörung, Insulinrezeptorde-

fekt), chronische Pankreatitis, Endokrinopathien (Akromegalie, Cushing- Syndrom),

Medikamente (Glukokortikoide, Schilddrüsenhormone, etc.), Infektionen (kongenita-

le Rötelninfektion, CMV-Infektion), selten vorkommende immunologisch bedingte

Formen wie Anti-Insulin-Rezeptor-Antikörper oder genetische Syndrome (Down-,

Klinefelter-, Turner-Syndrom) eine Rolle [19].

• Typ 4-Diabetes:

Der Typ 4-Diabetes oder auch Gestationsdiabetes ist für unsere Studie nicht

ausschlaggebend, soll aber an dieser Stelle zur Vollständigkeit erwähnt werden: Un-

ter Gestationsdiabetes versteht man jede erkannte Störung des Kohlenhydratstoff-

wechsels während der Gravida. Er ist meist reversibel und verschwindet in der

Mehrzahl der Fälle nach Beendigung der Schwangerschaft. Das Risiko einer perma-

nenten Manifestation beträgt bis zu 45 % in zehn Jahren [19].

Zu den häufigsten Komplikationen im Rahmen des Diabetes mellitus zählen die

Makro-/ Mikroangiopathie und somit auch die Diabetische Nephropathie [19]. Die

Kriterien zur Diagnosesicherung eines Diabetes mellitus können Tab. 3.3 entnom-

men werden.

In unserer Studie wurde das Vorhandensein eines Diabetes mellitus bei den entspre-

chenden Probanden in der HD-Gruppe per Nüchtern-Plasmaglukose sowohl mit ei-

nem handelsüblichen Glukometer als auch im Plasma bestimmt. Alle Probanden der

HD-Gruppe mit Diabetes wiesen Werte > 6.1 mmol/l auf.

20

Stadium: Nüchtern-Plasmaglukose:

Manifester Diabetes ≥126 mg/dl (≥7.0 mmol/l)

Gestörte Glukosehomöostase ≥110

21

mit einem Enzym markiert. Die durch das Enzym katalysierte Reaktion dient als

Nachweis für das Vorhandensein des Antigens. Das sogenannte Substrat wird vom

Enzym umgesetzt, das Reaktionsprodukt kann üblicherweise durch Farbumschlag,

Fluoreszenz oder Chemolumineszenz nachgewiesen werden. Die Signalstärke ist im

Allgemeinen eine Funktion der Antigenkonzentration, so dass der ELISA für quanti-

tative Nachweise verwendet werden kann. Die Auswertung erfolgt dann beispiels-

weise mittels Photometrie.

Eine der ELISA Techniken (Sandwich-ELISA) verwendet zwei Antikörper (Ak), die

beide spezifisch an das nachzuweisende Antigen binden. Hierbei ist es wichtig, dass

beide Antikörper an unterschiedlichen Stellen an das Antigen binden, da sie sich

sonst gegenseitig behindern würden. Der erste Antikörper (coating-Antikörper) wird

an eine feste Phase (meist spezielle 96-Well-Mikrotiterplatte) gebunden. Die Probe

mit dem nachzuweisenden Antigen wird dann in die Wells gegeben und eine Zeit

lang inkubiert. Während dieser Zeit bindet der an die Platte gebundene Antikörper

das in der Probe vorhandene Antigen. Nach Ablauf der Inkubationsphase wird die

Platte gewaschen. Die ungebundenen Bestandteile der Probe werden dadurch ent-

fernt und zurück bleibt nur das am (coating-) Antikörper gebundene Antigen. Im

nächsten Schritt wird ein Detektions-(detection)-Antikörper zugegeben, an dessen

Ende ein Enzym [meistens Meerrettichperoxidase (HRP, von engl. horseradish),

Alkalische Phosphatase (AP) oder seltener Glucoseoxidase (GOX)] gebunden ist.

Dieser zweite Antikörper bindet ebenfalls an das Antigen und es entsteht der Anti-

körper-Antigen-Antikörper Komplex (deshalb der Name Sandwich-ELISA; das An-

tigen ist zwischen die beiden Antikörper wie in einem Sandwich gepackt). In Abbil-

dung 3.2 werden die einzelnen Reaktionschritte veranschaulicht.

Durch erneutes Waschen der Platte wird der überschüssige zweite Antikörper aus-

gewaschen und dann ein zum Enzym passendes Substrat (Chromogen) zugegeben.

Dieses wird vom Enzym zu einem Reaktionsprodukt umgesetzt, dessen Nachweis

durch Farbumschlag, Fluoreszenz oder Chemoluminiszenz erfolgen kann. Wie ein

solcher Farbumschlag aussehen kann, macht Abbildung 3.3 deutlich.

Für quantitative Nachweise wird üblicherweise eine Serie mit bekannten Antigen-

konzentrationen durchgeführt, um eine Kalibrierungskurve für das gemessene Signal

(optische Extinktion, emittierte Intensität) zu erhalten [12, 14].

22

Abb 3.2: Reaktionsschritte des ELISAs: (1) Mit coating-Antikörper beschichtete Mikroti-

terplatte; (2) Zugabe der Probe und Inkubation; (3) Zugabe des Detektions-Antikörpers;

(4) Zugabe und Komplexbildung des enzyme-linked Antikörper-Antigen-Antikörpers;

(5) Zugabe eines zum Enzym passenden Substrats, das zu einem nachweisbaren Re-

aktionsprodukt umgesetzt wird [12].

Abb 3.3: Farbreaktion des ELISAs: Mittels Photometrie kann so auf die jeweilige Visfatin-

konzentration geschlossen werden [14].

3.5.2 Prinzipien des RIA-Verfahrens zur Insulinmessung

Der RIA (Radioimmunoassay) gehört ebenso wie der EIA / ELISA zu den Immuno-

assay-Verfahren. Er ist eine Labormethode zur quantitativen Bestimmung kleinster

Substanzmengen. Kleine Konzentrationen von Hormonen, Enzymen, Tumorantige-

nen, Infektionsantigenen, Arzneimitteln und DNA können mit dieser radioimmuno-

logischen Methode recht zuverlässig und spezifisch bestimmt werden.

23

Der RIA basiert auf radioaktiven und nicht radioaktiven Antigenen, die um eine kon-

stante Anzahl von Antikörperbindungsstellen konkurrieren. Die an den Antikörper

gebundene Menge des radioaktiv markierten Antigens, in unserem Fall des Insulins,

ist umgekehrt proportional zu der Konzentration des vorhandenen unmarkierten An-

tigens. Eine rasche Trennung des freien und gebundenen Antigens erfolgt mittels

eines Doppel-Antikörper-Systems [32].

3.5.3 Prinzipien der Photometrie

Absorption und Farbe einer Flüssigkeit oder eines transparenten Festkörpers hängen

von der stofflichen Zusammensetzung und der Konzentration ab. Mit der Photome-

trie werden mit Hilfe des sichtbaren Lichtes die Konzentrationen von farbigen Lö-

sungen bestimmt.

Bestrahlt man die Lösung eines absorbierenden Stoffes mit monochromatischem

Licht, hängt die Absorption von der Konzentration des absorbierenden Stoffes und

der Strecke ab, die das Licht durch die Lösung zurücklegen muss. Das transmittierte

Licht wird gemessen. Um den Transmissionsgrad in Abhängigkeit von der Konzen-

tration darzustellen, wird die Transmission in die Extinktion umgerechnet:

E = − lg (T)

Die Extinktion E ist der negative dekadische Logarithmus des Transmissionsgrades.

Trägt man die Extinktion gegen die Konzentration auf, so entsteht eine Gerade. Man

kann auf diese Weise Lösungen mit unbekannten Konzentrationen messen und die

Konzentration der Lösung bestimmen [21].

24

3.6 Umsetzung im Labor

Um die Konzentration des dimeren, enzymatisch aktiven Visfatins zu bestimmen,

verwendeten wir den ELISA-Kit der Firma Adipogen, Germany. Alle Blutproben

wurden doppelt bestimmt. Das Erfassungsintervall des Kits lag bei 0.03–16 ng/mL,

die Interassay-Varianz bei 6.31–9.53 % und die Intraassay-Varianz bei 3.46 –

5.52 %, übereinstimmend mit den Herstellerangaben. Nur um die per ELISA erhobe-

nen Daten mit dem zuvor standardmäßig verwendeten EIA-Kit zu vergleichen,

benutzten wir zusätzlich den Visfatin-EIA-Kit der Firma Phoenix, USA. Auch hier

wurden alle Proben doppelt bestimmt. Das Erfassungsintervall betrug 0.1–1000 ng/

mL, die Interassay-Varianz war < 14 % und die Intraassay-Varianz < 5 % für das

Visfatin-Standardpeptid. Zur Bestimmung der Insulinkonzentration im Serum nutz-

ten wir den DSL – 1600 RIA-Kit der Firma DSL, USA.

Alle weiteren Laborparameter wurden mittels Standardverfahren erhoben.

3.6.1 Bestimmung der Insulinkonzentration mittels DSL - 1600 RIA-Kit

Vorbereitung: Zunächst mussten die Insulin-Standards wie folgt rekonstituiert wer-

den: Standard A (0 µlU/ml) wurde mit 5 ml und Standard B bis F (5, 15, 50, 150, 130

µlU/ml) mit 1 ml deionisiertem Wasser versetzt. Danach erfolgte die Rekonstituie-

rung des Insulinreagens mit 11 ml deionisiertem Wasser. Das Insulin-Antiserum

wurde mit 10 ml und die Insulin-Kontrollen mit je 1 ml deionisiertem Wasser ver-

setzt. Alle rekonstituierten Reagenzien mussten anschließend bis zu 24 Stunden bei

2 bis 8 °C gelagert werden.

Durchführung: Zur ordnungsgemäßen Durchführung beschrifteten wir jeweils in

doppelter Ausfertigung Röhrchen zur Bestimmung der Totalaktivität, NSB (nicht

spezifische Bindung), Standards, Kontrollen und Proben. Nun mussten jeweils

100 µl Insulin-Standard, Kontrolle und Probe in die entsprechenden Röhrchen sowie

200 µl Insulin-Standard in die NSB-Röhrchen pipettiert werden. In alle Röhrchen,

mit Ausnahme der NSB-Röhrchen und der Röhrchen zur Bestimmung der Totalakti-

vität, wurde nun jeweils 100 µl Insulin-Antiserum pipettiert. Alle Röhrchen erhielten

im Anschluss jeweils 100 µl des Insulin-Reagens. Die Proben wurden mit dem Vor-

tex gemischt und bei 2 bis 8 °C für 16 Stunden inkubiert. Alle, mit Ausnahme der

Röhrchen zur Bestimmung der Totalaktivität, erhielten nun 1 ml Präzipitationsrea-

gens (dieses vorher gut mischen!). Nach einer Inkubationszeit von 10 bis 15 Min. bei

25

Raumtemperatur (ca. 25 °C) mussten alle Ansätze, mit Ausnahme der zur Bestim-

mung der Totalaktivität, 20 Min. bei 1500 r.p.m. zentrifugiert werden (gekühlt!).

Alle Röhrchen wurden nun dekantiert und mussten 15 bis 30 Sekunden auf einer

saugfähigen Unterlage ausgeklopft werden. Nun konnten wir die Proben im Gamma-

zähler auszählen (Dauer circa eine Minute).

Auswertung: Sie erfolgte mittels linearer Regressionsanalyse mit halblogarithmi-

scher Kurvenanpassung. Anhand der Standardkurve konnten die Insulinkonzentra-

tionen der Mittelwerte der Doppelbestimmung jeder Kontrolle und Probe ermittelt

werden.

Tab. 3.4: Kit-Komponenten - DSL- 1600 RIA, Diagnostic System Laboratorie, Webster, TX,

USA

Insulin-Standards: Fläschchen A- F (0, 5, 15, 50, 150, 300 µlU/ml),

Teil d. Kits, Cat. # 1601- 1606

Insulin-Reagens: Mit I- 125 (185 kBq) markiertes Insulin, Teil d.

Kits, Cat. # 1620

Insulin-Antiserum: Meerschweinchenantiserum, Teil d. Kits,

Cat. # 1610

Präzipitationsreagens: Ziegen-anti-Meerschweinchen-Gammaglobulin-

serum mit Polyethylenglykol als Fällungsmittel,

à 105 ml, Teil d. Kits, Cat. # 2430

Insulin-Kontrollen: High-/ Low- Concentration, Teil d. Kits,

Cat. # 2430

26

Tab. 3.5: Verwendete Geräte - DSL- 1600 RIA

Gammazähler: Multi Crystall LB 2111, Berthold Technologies

GmbH & Co. KG, Bad Wildbad, Germany

Zentrifuge (gekühlt): Cryofuge® 5500i, Thermo Fisher Scientific Inc.,

81 Wyman Street, Waltham, MA 02454

Vortex: Vortex- Genie®, Bender & Hobein AG, Zürich,

Switzerland

Pipetten: Pipetman P 1000, Ident U71928G

Pipetman P 200, Ident U72043G, Gilson, Middle-

ton, USA

Pipettenspitzen: Dualfilter T.I.P.S.®, 100 µl Eppendorf GmbH,

Hamburg, Deutschland

Aufsätze zu 1000 µl Sarstedt AG & Co., Nüm-

brecht, Deutschland

Reaktionsgefäße: Spitzröhre 12 x 75 mm, Sarstedt AG & Co., Nüm-

brecht, Deutschland

27

3.6.2 Bestimmung der Visfatinkonzentration mittels ELISA-Kit

Vorbereitung: Zunächst war es notwendig, die gesammelten Blutproben und die

Kit-Komponenten bei Raumtemperatur (20-25°C) für ca. 30 Min. zu akklimatisieren.

Dann wurde die dem Kit beiliegende „10x Wash Solution“ und der „10x Diluent“

1:10 mit destilliertem Wasser verdünnt (= „1x Wash Solution“ bzw. „1x Diluent“).

Wir versetzten 10 µl „1x Detector“ mit 990 µl „1x Diluent“ (= „1x Detector“). 1 ml

destilliertes Wasser wurde in ein Röhrchen als QC (Quality control) pipettiert.

Durchführung - Reihenverdünnung: Das Standardröhrchen wurde abzentrifugiert

und 1 ml destilliertes Wasser zugegeben. In zehn Eppendorfcups wurden jeweils

250 µl des „1x Diluent“ pipettiert. Desweiteren gaben wir 250 µl der Stock Standard

Solution in das Eppendorf Cup #9, vermischten die Lösung und erhielten so eine

Konzentration von 16 ng/ml. Die Cups #8 bis #1 (ausser #0) wurden ebenfalls 1:2

verdünnt, so dass wir folgende Verdünnung erhielten:

Tab. 3.6: Reihenverdünnung – ELISA

Stock: 32 ng/ml ST 4: 0.5 ng/ml

ST 9: 16 ng/ml ST 3: 0.25 ng/ml

ST 8: 8 ng/ml ST 2: 0.125 ng/ml

ST 7: 4 ng/ml ST 1: 0.0625 ng/ml

ST 6: 2 ng/ml ST 0: 0

ST 5: 1 ng/ml

*ST=Standard

Durchführung – Serumproben: Zunächst mussten die aufgetauten Serumproben

abzentrifugiert werden. Nun pipettierten wir 100 µl der Standards #0 bis #9, der Qua-

lity Control (QC) und des Serumplasmas in die dem Kit beiliegende Antikörperplatte

und ließen den Ansatz für drei Stunden bei 37 °C inkubieren.

28

Tab. 3.7: Auszug - Belegungsplan – ELISA-Wells

NTC NTC ST 3 ST 3 P 7 P 7 P 16 P 16 P 24

QC QC ST 2 ST 2 P 8 P 8 P 17 P 17 P 24

ST 9 ST 9 P 1 P 1 P 9 P 9 P 18 P 18 P 25

ST 8 ST 8 P 2 P 2 P 10 P 10 P 19 P 19 P 25

ST 7 ST 7 P 3 P 3 P 11 P 11 P 20 P 20 P 27

ST 6 ST 6 P 4 P 4 P 13 P 13 P 21 P 21 P 27

ST 5 ST 5 P 5 P 5 P 14 P 14 P 22 P 22 P 28

ST 4 ST 4 P 6 P 6 P 15 P 15 P 23 P 23 P 28

*In der Tabelle vorkommende Abkürzungen: NTC=negative control, QC=quality control,

P=Probe, ST=Standard

Nach vorgegebener Inkubationszeit erfolgte dreimaliges Waschen der Wells mit je-

weils 350 µl der „1x Wash Solution“. Nun wurden 100 µl des sekundären Antikör-

pers zugegeben; es folgte eine weitere Inkubationszeit von einer Stunde bei 37°C mit

anschließendem Waschen wie bereits beschrieben. 100 µl des „1x Detectors“ kamen

anschließend in jedes Well. Der Ansatz musste erneut für eine Stunde bei 37 °C ru-

hen; es folgte ein weiterer Waschschritt. Nun pipettierten wir 100 µl des Substrats in

jedes Well. Nach zehn Minuten Inkubationszeit unter Lichtausschluss konnte den

Wells 100 µl „Stop-Solution“ zugegeben und die Proben anschließend bei 450 nm

ausgewertet werden. Dabei lagen zwischen Reaktionsende und photometrischer Mes-

sung nicht mehr als insgesamt 30 Minuten.

29

Tab. 3.8: Kit-Komponenten – ELISA, AdipoGen, Cat. No. V0523EK, Germany

Wells: Antibody coated 96-well plate, 12 x 8 -

well strips, mit monoklonalem Visfatin-

Ak

Plate sealer: 3 Stck.

Spüllösung: „10x Wash concetrate“, 100 ml

Verdünnung: „5x Diluent“, 50 ml

Sekundärer Antikörper: Polyklonaler Visfatin-Ak, 12 ml

Enzym: Horse-raddish-peroxides (HRP), 150 µl

Standard: rekombinantes Visfatin (32.0 ng) aus

HEK 293 Zellen, 1 vial

Quality Control (QC): rekombinantes Visfatin protein, 1 vial

Substrat: Chromogenes Substrat, 12 ml

Stop-Solution: 1M H3PO4, 12 ml

30

Tab. 3.9 : Verwendete Geräte – ELISA

Zentrifuge: EBA 12, Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen, Germany

Vortex: Vortex-Genie®, Bender & Hobein AG Zürich, Switzer-

land

Photometer:

Multiskan Ex, Thermo Fisher Scientific Inc., 81 Wyman

Street, Waltham, MA 02454

Software: Ascent 2.6

Standardpipetten: Pipetman P 1000, Ident U71928G

Pipetman P 200, Ident U72043G

Pipetman P 20, Ident U50311H, Gilson, Middleton, USA

Multipipette: Pipetman 8x 200, Ident S55130J, Gilson, Middleton,

USA

Pipettenspitzen: Dualfilter T.I.P.S.®, 100 µl Eppendorf GmbH, Hamburg,

Deutschland

Aufsätze zu 1000 µl Sarstedt AG & Co., Nümbrecht,

Deutschland

Reagenzröhrchen:

BD FalconTM Polystyrene Enical Tube, 17 x 120 mm

style, 15 ml, BD Biosciences, Mississauga, Canada

Reagiergefäß: 57 x 16.5 mm, Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Deutsch-

land, 8ml

Reagenzglas: 500 ml, Schott Duran Group GmbH, Mainz, Germany

Sonstiges: Eppendorfcup, 0.5 ml, Eppendorf AG, Hamburg,

Deutschland

Einmal- Reagenzreservoir à 25 ml, Carl Roth GmbH &

Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

31

3.6.3 Bestimmung der Visfatinkonzentration mittels EIA-Kit

Auch hier war es nötig, den Kit sowie die zu messenden Serumproben an die Raum-

temperatur anzupassen (laut Herstellerangaben 30 Min.). Das „20x Assay-Puf-

ferkonzentrat“ musste mit 950 ml destilliertem Wasser vermischt werden, um den

„1x Assay-Puffer“ für die weiteren Schritte zu erhalten. Das beiliegende Standard-

peptid wurde abzentrifugiert und mit 1 ml des „1x Assay-Puffers“ vermischt. Somit

erhielt man eine Konzentration von 1000 ng/ml. Das Standardpeptid musste zehn

Minuten bei 20-23°C ruhen und vor dem nächsten Arbeitsschritt zentrifugiert und

anschließend gemischt werden. Nun wurden die Wells der Immunoplatte mittels

Multipipette mit jeweils 300 µl „1x Assay-Puffer“ gespült. Wir belegten die trocke-

nen Wells wie folgt:

Tab. 3.10: Reihenverdünnung – EIA:

Stock: 1000 ng/ml ST 6: 10 ng/ml

ST 12: 1000 ng/ml ST 5: 5 ng/ml

ST 11: 100 ng/ml ST 4: 2 ng/ml

ST 10: 50 ng/ml ST 3: 1 ng/ml

ST 9: 30 ng/ml ST 2: 0.5 ng/ml

ST 8: 25 ng/ml ST 1: 0.1 ng/ml

ST 7: 20 ng/ml

*ST=Standard

32

Tab. 3.11: Auszug – Belegungsplan EIA - Wells:

B B ST 7 ST 7 P 1 P 1 P 9 P 9 P 17 P 17 P 25 P 25

TB TB ST 8 ST 8 P 2 P 2 P 10 P 10 P 18 P 18 P 26 P 26

ST 1 ST 1 ST 9 ST 9 P 3 P 3 P 11 P 11 P 19 P 19 P 27 P 27

ST 2 ST 2 ST 10 ST 10 P 4 P 4 P 12 P 12 P 20 P 20 P 28 P 28

ST 3 ST 3 ST 11 ST 11 P 5 P 5 P 13 P 13 P 21 P 21 P 29 P 29

ST 4 ST 3 ST 12 ST 12 P 6 P 6 P 14 P 14 P 22 P 22 P 30 P 30

ST 5 ST 5 PC1 PC1 P 7 P 7 P 15 P 15 P 23 P 23 P 31 P 31

ST 6 ST 6 PC2 PC2 P 8 P 8 P 16 P 16 P 24 P 24 P 32 P 32

*In der Tabelle vorkommende Abkürzungen: B=Blank, TB=Total Binding, PC=Positive

Control, ST=Standard

Well A-1 und A-2 wurden als B (=Blank) ausgelassen. In die Wells B-1 und B-2, die

als TB (=Total Binding) dienten, pipettierten wir 50 µl des „1x Assay-Puffers“. In

Well C-1 und C-2 bis G-1 und G-2 kamen 50 µl des 0.1 ng/ml Standardpeptids. 50 µl

der Serumproben wurden dann den vorgesehenen Wells zugeführt (s. Tab. 3.11). Als

nächstes verdünnten wir 50 µl des primären Antiserumkonzentrats mit 2.5 ml des

„1x Assay-Puffers“ (Verhältnis 1:50). Anschließend wurden in jedes Well, B ausge-

schlossen, 25 µl dieser Lösung pipettiert. Ebenso verfuhren wir mit dem biotinylier-

ten Peptidkonzentrat und führten jedem Well 25 µl zu, B ausgeschlossen. Die Wells

wurden verschlossen und für zwei Stunden bei Raumtemperatur (20-23°C) auf einem

Rüttler bei 300-400 r.p.m. stehengelassen. Der nächste Arbeitsschritt bestand im

Vorbereiten der SA-HRP Lösung. Dazu wurde das SA-HRP Konzentrat fünf Sekun-

den auf 3.000–5.000 r.p.m. zentrifugiert, 12 µl mit 12 ml des „1x Assay-Puffers“

versehen und anschließend auf dem Vortex gemischt.

Nach zwei Stunden Inkubationszeit spülten wir die Well-Platte mit 350 µl des „1x

AssayPuffers“ (trocken tupfen!). Dieser Schritt wurde vier Mal wiederholt. Nun pi-

pettierten wir 100 µl SA-HRP in jedes Well. Die Platte musste erneut verschlossen

werden und eine Stunde bei Raumtemperatur auf dem Orbitalshaker bei 300-400

r.p.m. ruhen. Anschließend erfolgte erneut fünfmaliges Spülen mittels „1x Assay-

33

Puffer“ wie oben beschrieben. Danach wurde jedem Well 100 µl der TMB Lösung

zugeführt und die Wellplatte lichtdicht verschlossen. Dieser Ansatz musste erneut

eine Stunde bei Raumtemperatur und 300-400 r.p.m. auf dem Orbitalshaker lagern.

Nun wurde 100 µl 2N HCL als Stopplösung zugeführt. Kontrolle war der Farbum-

schlag von Blau auf Gelb. Innerhalb von 20 Minuten wurden per Photometrie die

Visfatinkonzentrationen bei einer Wellenlänge von 450 nm bestimmt.

34

Tab. 3.12: Kit – Komponenten – EIA - Phoenix Pharmaceuticals, Inc., Belmont, California

Puffer: 20x Assay-Pufferkonzentrat Katalog No EK-

BUF, 50 ml

Wells: 96 well Immunoplatte Katalog No EK-PLATE

Well-Verschluss: Acetate Plattenverschluss (APS), Katalog No

EK-APS, 3 Stck.

Antiserum: Primäres Antiserumkonzentrat, rabbit anti-

peptide IgG, 1 vial

Standardpeptid: 1 vial

Biotinyliertes Peptidkonzentrat: 1 vial

Enzym: Streptavadin-horseradish-Peroxidase (SA-

HRP), Katalog No EK- SA-HRP, 30 µl

Substrat: 3.3´.5.5-Tetramethylbenzidine (TMB), Katalog

No EK- SS, 12 ml

Stop-Solution: Hydrogen Chlorid (2N HCL), Katalog No EK-

HCL, 15 ml

Tab. 3.13: verwendeten Geräte – EIA

Microplate Reader: SpectraMax® 190, Molecular Devices, Union

City, CA 94587, U.S.A.

Orbital Shaker: OR100-20, The Lap Depot, Inc., Dawsonville,

GA 30534

Zentrifuge: EBA 12, Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen,

Germany

Vortex: Vortex-Genie®, Bender & Hobein AG Zürich,

Switzerland

35

Standardpipetten: Pipetman P 1000, Ident U71928G

Pipetman P 200, Ident U72043G

Pipetman P 20, Ident U50311H, Gilson,

Middleton, USA

Multipipetten: Pipetman 8 x 200, Ident S55130J, Gilson,

Middleton, USA

Pipettenspitzen: Dualfilter T.I.P.S.®, 100 µl Eppendorf GmbH,

Hamburg, Deutschland

Aufsätze zu 1000 µl Sarstedt AG & Co., Nüm-

brecht, Deutschland

Reagenzröhrchen:

BD FalconTM Polystyrene Enical Tube, 17 x

120 mm style, 15 ml, BD Biosciences,

Mississauga, Canada

Reagiergefäß: 57 x 16.5 mm, Sarstedt AG & Co., Nümbrecht,

Deutschland, 8ml

Reagenzglas: 500 ml, Schott Duran Group GmbH, Mainz,

Germany

Sonstiges: Eppendorfcup, 0.5 ml, Eppendorf AG, Ham-

burg, Deutschland

Einmal-Reagenzreservoir à 25 ml, Carl Roth

GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

36

3.7 Auxologische Parameter

Größe und Bauchumfang über dem Hüftknochen wurden bis auf 0.1 cm genau erho-

ben. Das Körpergewicht (KG) nach Dialyse konnte mit einer max. Abweichung von

0.1 kg bestimmt werden. Auf die Messung des KG vor Dialyse wurde auf Grund der

Hyperhydration und der damit verbundenen Abweichung der Daten verzichtet. An-

schließend wurde der BMI (Body Mass Index) berechnet. Mittels Caliper erhob ein

und derselbe Untersucher die Hautfaltendicke über Scapula (Sc), Biceps (Bi) und

Triceps (Tr) bis 0.1 cm Abweichung während der Dauer der Dialyse. Folgende Glei-

chung ergab die mittlere Hautfaltendicke: (Sc+ Bi+ Tr)/ 3. Als weiteren Parameter

für den Körperbau nutzten wir die BIA (Bioelektrische Impedanzanalyse; Gerät BIA

101, Medi Cal HealthCare, Germany). Die Daten wurden bewusst am Ende der Dia-

lyse erhoben, um Fehler durch Hyperhydration zu vermeiden. Zudem wurden fol-

gende Werte bestimmt: Totales Flüssigkeitsvolumen relativ zum KG (TV%), Extra-

zellulärflüssigkeit relativ zum Totalvolumen (EZV%) und Körperzellmasse (KZM%)

sowie Fettmasse (FM%) relativ zum KG. Vorausgegangene Studien belegen, dass

die BIA Messung zur Bestimmung des Körperfettanteils streng mit anderen Verfah-

ren wie insbesondere der CT-gesteuerten Messung bei gesunden Probanden [20] so-

wie mit Verfahren wie der dual-energy x-ray Absorptiometrie, deuterium oxide- oder

sodium-bromid isotop-Verdünnung bei HD-Patienten [8,10] korreliert.

Der HOMA-Index wurde wie folgt bestimmt (Nüchtern-Insulin u. Glukose):

HOMAIR = Insulin (µU/ml) x Glukose (mmol/l) / 22.5.

3.8 Statistische Analyse

Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Zur Aus-

wertung wurde der Mann-Whitney U-Test (Homogenitätstest; überprüft die Signifi-

kanz der Übereinstimmung zweier Verteilungen), der X2-Test (Chi-Quadrat-Test;

untersucht statistische Verteilungsmuster) und zur Darstellung möglicher Zusam-

menhänge die Spearman Korrelation verwendet. Ein P-Wert (zweitalliert) von < 0.05

wurde berücksichtigt, ohne Adjustierung für multiple Vergleiche.

Bei allen 109 Probanden wurde eine schrittweise, multiple lineare Regressionsana-

lyse (MRA1) durchgeführt um herauszufinden, ob eine unabhängige Beziehung zwi-

schen aktivem Visfatin im Serum und den folgenden Parametern besteht: Alter, mitt-

lere Hautfaltendicke, Plasmaglukose, Seruminsulin, Plasma HDL-Cholesterol, Dia-

37

betes (gesplittet in: kein D.m.; D.m. ohne sowie mit Insulintherapie) sowie Gruppen-

zugehörigkeit (K, HD). Visfatinmessungen mit dem Wert Null wurden durch die

kleinstmögliche Detektionskonzentration ersetzt (0.1 ng/ml). Die bestimmten Kon-

zentrationen wurden anschließend logarithmiert. Alle Konstrukte enthielten jegliche

Variablen, um einer möglichen Interaktion mancher Parameter vorzubeugen. An-

schließend wurde eine „standard backwards variable selection“ mit einer Aus-

schlusswahrscheinlichkeit von 0.1 durchlaufen.

Eine zweite multiple Regressionsanalyse (MRA2) wurde in der HD-Gruppe (n=74)

mit denselben Parametern wie oben bereits beschrieben durchgeführt. Eine Ausnah-

me stellte die Gruppenzugehörigkeit dar. Da ein HD-Patient (D.m. ohne Insulinthe-

rapie) einen Insulinausreißer zeigte (158.96 µU/ml), wurden die Analysen vorsichts-

halber mit bzw. ohne diesen Patienten durchlaufen.

Um die Ergebnisse beider Kits (ELISA und EIA) zu vergleichen, bedienten wir uns

der Spearman Korrelation.

38

4 Ergebnisse

4.1 Bivariate Analysen der Körperzusammensetzung und der Labor-

parameter

In Bezug auf die Körperzusammensetzung zeigten die Patienten der HD-Gruppe

gleiche BMI-Werte wie die Kontrollprobanden. Gleiches galt für das Gesamtkörper-

wasser. Innerhalb der HD-Gruppe fiel ein erhöhtes extrazelluläres Flüssigkeitsvolu-

men bei gleichzeitig verminderter relativer Körperzellmasse auf (Funktionsgewebe

wie Organe, Muskel, etc.). Die relative Fettmasse war leicht erhöht. Dabei zeigten

die HD-Patienten eine abnorme Fettverteilung mit einer deutlich reduzierten mittle-

ren Hautfaltendicke (spiegelt die subkutane Fettmasse wieder) bei umso größerem

Bauchumfang (entspricht der viszeralen Fettmasse; p=0.001). Alle anthropometri-

schen Daten der jeweiligen Gruppen können Tab. 4.1 entnommen werden.

Labortechnisch wiesen die HD-Patienten erhöhte Konzentrationen von enzymatisch

aktivem Visfatin im Serum auf (Abb. 4.1). Verglichen mit den Kontrollen zeigten

sich ähnliche Plasma HbA1c- und Nüchtern-Plasmaglukosespiegel. Allerdings waren

erhöhte Insulinkonzentrationen, ein erhöhter HOMA-Index sowie vermehrt C-

reaktives Protein (CRP), ein Entzündungsmarker, erkennbar. Weiterhin zeigten die

HD-Patienten gesteigerte Triglyzeride bei vermindertem LDL- sowie HDL- und Ge-

samtcholesterol. Alle Laborparameter sind in Tab. 4.1 aufgelistet.

39

Tab. 4.1: Bivariate Analyse des Körperbaus und der Laborparameter; (*) ≙„signifikant“

Hämodialyse

patienten (HD) Kontrollen (K) P-Wert

N 74 35 –––

Alter (Jahren) 63.9 ± 11.2 60.7 ± 15.1 0.072 (NS)

Geschlecht (männlich; weibl.) 38; 36 22; 13 > 0.10 (NS)

BMI (kg/m²) 26.9 ± 5.7 25.9 ± 4.2 > 0.10 (NS)

Wassergehalt (% KG) 52.8 ± 8.1 54.4 ± 5.6 > 0.10 (NS)

Zellmasse (% KG) 34.4 ± 7.5 42.3 ± 6.4 < 0.0001 (*)

Extrazellulärflüssigkeit (% WG) 49.5 ± 7.7 42.5 ± 4.1 < 0.0001 (*)

Fettmasse (% KG) 29.1 ± 9.8 24.5 ± 8.6 0.017 (*)

Mittlere Hautfaltendicke (cm) 15.3 ± 6.3 18.2 ± 6.0 0.013 (*)

Taille (cm) 102.8 ± 14.5 91.4 ± 10.4 < 0.0001 (*)

Kreatinin (Plasma, µmol/L) 783 ± 267 75.5 ± 11.0 < 0.0001 (*)

Urea (Plasma, mmol/L) 23.5 ± 6.4 5.13 ± 1.30 < 0.0001 (*)

GFR (mL/min/1,73m²) 5.90 ± 2.57 79.1 ± 10.5 < 0.0001 (*)

CRP (plasma, mg/L) 10.3 ± 10.6 1.64 ± 1.55 < 0.0001 (*)

Triglyzeride (Plasma, mg/dL) 206 ± 248 107.0 ± 47.6 0.001 (*)

Gesamtcholesterin (Plasma, mg/dL) 169.7 ± 54.1 209.1 ± 35.7 < 0.0001 (*)

LDL-Cholesterin (Plasma, mg/dL) 79.2 ± 43.8 118.5 ± 27.4 < 0.0001 (*)

HDL-Cholesterin (Plasma, mg/dL) 34.4 ± 16.9 49.3 ± 13.8 < 0.0001 (*)

HbA1c (Plasma, %) 5.89 ± 0.93 5.77 ± 0.34 > 0.10 (NS)

Glukose (Plasma, mmol/L) 5.68 ± 1.94 5.05 ± 0.43 > 0.10 (NS)

Insulin (Serum, µU/mL) 22.9 ± 25.9 10.1 ± 7.4 0.007 (*)

HOMAIR 6.60 ± 12.90 2.31 ± 1.70 0.040 (*)

Visfatin (ELISA, Serum, ng/mL) 5.50 ± 6.48 0.97 ± 1.79 < 0.0001 (*)

40

Abb. 4.1: Visfatinkonzentrationen in der Kontroll- und HD-Gruppe: Die Visfatinwerte sind

bei Hämodialysepatienten deutlich erhöht.

4.2 Multiple Regressionsanalyse der Serumvisfatinkonzentration aller Pro-

banden

Die erste, schrittweise durchgeführte Regressionsanalyse (MRA1) bei allen Proban-

den (n=109) zeigte einen unabhängigen Zusammenhang zwischen der Gruppenzuge-

hörigkeit (K, HD) und der Serumvisfatinkonzentration mit erhöhten Konzentrationen

in der HD-Gruppe (p < 0.0001). Hoch interessant war auch die unabhängige, inverse

Beziehung zwischen Visfatin und HDL-Cholesterin bei allen Teilnehmern (p=0.019).

Alle anderen Parameter stellten sich als nicht signifikant heraus. Dazu zählten das

Alter, die mittlere Hautfaltendicke, die Konzentration der Plasmaglukose, Serumin-

sulin sowie Diabetes mellitus. Der Ausschluss des Insulinausreißerpatienten führte

zu keiner Veränderung der Ergebnisse. Eine zusätzliche MRA aller Patienten ohne

Diabetes (n=75; 35 Kontrollen und 40 HD-Patienten) lieferte ähnliche Ergebnisse

(Gruppe, p < 0.0001; HDL-Cholesterin, p=0.031).

41

4.3 Korrelationsanalysen und multiple Regressionsanalyse des aktiven Se-

rumvisfatins bei HD-Patienten

Um den Zusammenhang zwischen aktivem Serumvisfatin und Parametern der HD-

Patienten (n=74) zu untersuchen, führten wir zunächst eine Spearman Korrelations-

analyse (s. Tab. 4.2) durch. Diese lieferte eine signifikante, inverse Beziehung zwi-

schen HDL-Cholesterin und der aktiven Form des Serumvisfatins (Abb. 4.2). Wei-

terhin konnten wir eine positive Abhängigkeit des Seruminsulins sowie der mittleren

Hautfaltendicke vom Serumvisfatin feststellen. Alle weiteren Parameter wie Körper-

bau, einschließlich Körperwasseranteil, GFR, Restdiurese oder CRP waren auch hier

nicht signifikant. Das gleiche galt für die Geschlechterabhängigkeit (Mann-Whitney

U-test; p > 0.10).

Diese Ergebnisse müssen jedoch behutsam behandelt werden, da die HD-Gruppe

Patienten von drei unterschiedlichen Dialysezentren mit einem breitgefächerten

Spektrum an renalen und anderen Begleiterkrankungen beinhaltet. Zudem erhöhen

möglicherweise Hyperglykämie und Hyperinsulinämie, welche vorallem bei Patien-

ten mit Typ 2-Diabetes mellitus vorhanden waren, die Serumvisfatinkonzentrationen

[33].

Aus diesem Grund führten wir eine zweite, schrittweise multiple lineare Regres-

sionsanalyse (MRA2) durch, korrigiert für Diabetes und Insulintherapie, inklusive

der signifikanten Faktoren aus der bivariaten Korrelationsanalyse oder anderer inte-

ressanter Auffälligkeiten (s. Abschnitt 3.8). Sie lieferte eine negative Korrelation

zwischen Plasma HDL-Cholesterin und aktivem Serumvisfatin in der HD-Gruppe (4

% weniger pro mg/dl mehr an HDL; p=0.009). Ähnlich signifikante Werte zeigten

sich in der Untergruppe „HD-Patienten ohne Diabetes“ (p=0.006). Im Vergleich zu

den Patienten ohne Diabetes fielen bei der Diabetesgruppe, die mit Insulin behandelt

wurden, eine erhöhte Konzentration des aktiven Serumvisfatins auf (119%;

p=0.011). Dagegen hatten Diabetespatienten, die keine Insulintherapie erhielten, ver-

gleichbare Visfatinkonzentrationen wie Patienten ohne Diabetes (p=0.9; insgesamt

p=0.027).

42

Abb. 4.2: Korrelation des HDL-Cholesterins und der Serumvisfatinkonzentration: Bei allen

Gruppen zeigt sich eine inverse Korrelation.

Eine anfangs schwach positive Abhängigkeit zwischen Seruminsulin und Visfatin

musste nach Ausschluss des Patienten mit dem Insulinausreißer verworfen werden

(p=0.5). Weiterhin konnte weder eine Beziehung zwischen Visfatin und Alter, mittle-

rer Hautfaltendicke noch der Plasmaglukose ermittelt werden.

43

Tab. 4.2: Spearman Korrelationsanalyse der Nüchtern-Visfatinkonzentration in der HD-

Gruppe (n=74); (*) ≙„signifikant“

Korrelations-

koeffizient P-Wert

Alter (Jahren) – 0.02 > 0.10 (NS)

BMI (kg/m²) 0.21 0.075 (NS)

Wassergehalt (% KG) – 0.22 0.061 (NS)

Zellmasse (% KG) – 0.05 > 0.10 (NS)

Extrazellulärflüssigkeit (% WG) 0.00 > 0.10 (NS)

Fettmasse (% KG) 0.21 0.088 (NS)

Mittlere Hautfaltendicke (cm) 0.30 0.010 (*)

Taille (cm) 0.19 > 0.10 (NS)

Kreatinin (Plasma, µmol/L) – 0.02 > 0.10 (NS)

Urea (Plasma, mmol/L) 0.09 > 0.10 (NS)

GFR (mL/min/1,73m²) 0.02 > 0.10 (NS)

Restdiurese (ml/d) 0.01 > 0.10 (NS)

CRP (mg/L) 0.15 > 0.10 (NS)

Triglyzeride (mg/dL) 0.14 > 0.10 (NS)

Gesamtcholesterin (mg/dL) 0.06 > 0.10 (NS)

LDL-Cholesterin (mg/dL) – 0.11 > 0.10 (NS)

HDL-Cholesterin (mg/dL) – 0.34 0.004 (*)

HbA1c (%) 0.22 0.066 (NS)

Glukose (mmol/L) 0.23 0.060 (NS)

Insulin (µU/mL) 0.26 0.028 (*)

HOMAIR 0.26 0.031 (*)

44

Tab. 4.3: Faktoren, die die Visfatinserumkonzentration beeinflussen [MRA, nach rückwärti-

ger Selektion (p < 0,1)]:

Faktor Effekt* (95% CI) p

Kein Diabetes 0

D.m. ohne Insulintherapie +4 (-45 bis +95) 0,90

D.m. unter Insulintherapie +119 (+20 bis +298) 0,011

Gesamtabweichung 0,027

HDL (mg/dL) -4 (-6 bis -2) 0,001

*Effekt auf die Visfatin-Serumkonzentration in %- Abweichung und ng/mL.

4.4 Korrelationsanalyse der Ergebnisse beider Verfahren, ELISA und EIA

Wie sich herausstellte, zeigte das enzymatisch aktive, dimere Visfatin, welches per

ELISA bestimmt wurde, keinerlei Korrelation mit dem 500 kDa Protein des EIAs.

Dies galt sowohl für die Kontrollen (n=35; r=0.13, nicht signifikant) als auch für die

Dialysepatienten (n=74; r= -0.06, nicht signifikant; Abb. 4.3)

Abb. 4.3: Vergleich zwischen EIA und ELISA: Keinerlei Korrelation der Visfatinkonzentra-

tionen.

45

5 Diskussion

Interessant war die aus unserer Studie hervorgegangene inverse Beziehung zwischen

Visfatin und dem im Blut zirkulierenden HDL-Cholesterin; ein Zusammenhang, der

bislang nicht berichtet wurde. Diese Abhängigkeit war unbeeinflusst von möglichen

Störfaktoren wie Glukose, Insulin, Diabetes mellitus Typ 2 oder der Körperzusam-

mensetzung. Weiterhin lieferte unsere Studie verlässliche Daten über die Serumvis-

fatinkonzentration bei gesunden Probanden und im Besonderen bei HD-Patienten

unter Verwendung des ELISA-Verfahrens [22]. Alle anderen in der Vergangenheit

erhobenen, teilweise widersprüchlichen Ergebnisse über die Visfatinkonzentration

wurden mit dem für die Messung nicht optimalen EIA bestimmt [1, 29, 30, 40, 41].

Zudem bestätigte sich der Verdacht, dass die Daten beider Verfahren im Vergleich

keinerlei Korrelation aufweisen, sowohl innerhalb der Kontrollen als auch der HD-

Gruppe. Dieser Umstand wurde zuvor nur an Probanden mit normaler Nierenfunkti-

on beschrieben [22, 33]. Die Ergebnisse zeigten, dass ein Verlust der renalen Funkti-

on mit erhöhten Serumvisfatinspiegeln bei Patienten mit TNI unter Dialysetherapie

einhergeht. Einige Studien kamen bereits zu ähnlichen Resultaten bei anderen Prote-

inen [1, 43]. So werden Leptin, Adiponectin, IL-6 und TNFα normalerweise bei Ge-

sunden mittels Niere eleminiert und weisen ebenfalls erhöhte Konzentrationen bei

Patienten mit Niereninsuffizienz auf [18, 30, 43, 44].

Erhöhte Visfatinspiegel führen bei Patienten mit chronischem Nierenversagen zu

einer vermehrten Sterblichkeit [1], die häufig durch kardiovaskuläre Ereignisse be-

dingt ist [9]. Es ist auch bekannt, dass Patienten mit Artheriosklerose erhöhte Visfa-

tinkonzentrationen zeigen [42]. Eine Beziehung zwischen Hypervisfatinämie und

endothelialer Dysfunktion unter Nierenfunktionsstörung wurde bereits beschrieben

[1, 40]. Auch die positive Korrelation zwischen Visfatin und dem proinflammatori-

schen Zytokin Resistin bei Patienten mit TNI ist bekannt [43]. Ebenfalls trifft der

Umkehrschluss zu, dass Resistin bei Dialysepatienten mit kardiovaskulärer Be-

einträchtigung erhöht ist [11].

Unsere Studie zeigte eine auffällige Reduktion der HDL-Cholesterinkonzentration

im Blut bei gleichzeitig erhöhten Serumvisfatinwerten. HDL ist für sich gesehen ein

unabhängiger, bedeutsamer Risikofaktor für eine kardiovaskuläre Schädigung [3,

15]. Aus diesem Grund könnte ein vermindertes HDL-Cholesterin eine zusätzliche

46

Erklärung für die gehäuft auftretenden kardiovaskulären Ereignisse bei HD-Patienten

mit erhöhter Visfatinkonzentration im Blut liefern.

Auf der anderen Seite existieren einige Studien, die die zellschützende Eigenschaft

von Visfatin hervorheben. Man weiß, dass zirkulierendes Visfatin identisch mit der

extrazellulären Form der Nicotinamid-5-Phosphoribosyl-1-Pyrophosphat Transferase

(eNAMPT) ist. Es handelt sich hierbei um ein Enzym, welches den geschwindig-

keitsbestimmenden Schritt der Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid (NAD)-Biosynthese

katalysiert [35]. Demnach hat eine verminderte Visfatinaktivität negativen Einfluss

auf die Energiebilanz und die Funktion von Zellen [39]. Erhöhte Visfatin-

Genexpression und eine erhöhte Proteinsekretion unterstützen sowohl die Zellfunk-

tionen als auch das Zellüberleben, vor allem unter Einflüssen wie Hypoxie, Energie-

bzw. allgemeinem Nährstoffmangel, z.B. im Rahmen von Entzündungsprozessen

[2, 35]. Direkt wirkende kardiopretektive Effekte in der Maus wurden ebenfalls auf-

gezeigt [24]. Es ist aber durchaus denkbar, dass trotz hoher Visfatinspiegel beim

Vorhandensein von Sekundärfaktoren wie vermindertem HDL-Cholesterin oder er-

höhtem Resistin die schützenden Eigenschaften des Visfatinproteins nicht ausrei-

chend sind.

Bekannt ist, dass Entzündung und Energiemangel die Sterblichkeit unter HD-

Patienten erhöhen [9]. Möglicherweise wird dieser Umstand durch Visfatin verstärkt,

da es dem PBEF entspricht und eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung von B-

Zellen im Rahmen eines Entzündungsprozesses spielt. Visfatin besitzt demnach

proinflammatorisches Potenzial [27]. Innerhalb unserer Studie benutzten wir den

CRP-Spiegel als Marker für eine Inflammation. Es zeigten sich erhöhte CRP-Werte,

die somit für einen Entzündungsprozess sprechen, der wiederum mit einem erhöhten

Energiebedarf einhergeht. Viszerale Fettleibigkeit (s. HD-Gruppe) könnte eine Erhö-

hung der Visfatinkonzentration und somit eine Inflammation begünstigen, da

menschliche Adipozyten Visfatin über einen bislang nicht klassifizierten Pathway

sezernieren [34]. Abgesehen von ähnlichen BMI-Werten war in der HD-Gruppe eine

abnorme Fettverteilung festzustellen, mit deutlich erhöhtem Anteil an viszeralem

Fettgewebe (s. Tab. 4.1). Zudem zeigten unsere HD-Patienten interessanter Weise

eine verminderte Körperzellmasse (Muskulatur und Organe mit einbezogen) bei

gleichzeitig erhöhtem Extrazellulärvolumen; trotz Flüssigkeitsentzug durch die Dia-

lysetherapie (s.Tab. 4.1). Beddhu et al. bewiesen in ihrer Studie, dass allein diese

Konstellation Einfluss auf das Überleben bei Patienten mit TNI nimmt [4]. Unsere

47

HD-Patienten stellen somit eine Hochrisikogruppe dar. Andererseits zeigten die mul-

tiplen Regressionsanalysen weder eine Korrelation zwischen aktivem Visfatin mit

Parametern der Fettmasse noch des Körperbaus. Dies stimmt mit Daten überein, die

bei Patienten ohne Nierenfunktionsstörung erhoben wurden [22]. Es konnte kein Zu-

sammenhang zwischen CRP und Visfatin festgestellt werden. Dies könnte daran lie-

gen, dass die CRP-Werte unserer Patienten meist nur leicht erhöht waren und nahe

beieinander lagen, da Patienten mit deutlich erhöhten Entzündungszeichen aus der

Studie ausgeschlossen werden mussten (s.Tab. 4.2). Alles in Allem lieferte unsere

Studie weder einen klaren Zusammenhang von Visfatin mit Parametern der Körper-

zusammensetzung als auch mit Entzündungsprozessen bei HD-Patienten.

Ein weiterer Fokus der Studie galt dem Glukosemetabolismus. Zunächst wurde

vermutet, dass Visfatin an den Insulinrezeptor bindet und somit eine ähnliche

Funktion wie Insulin übernimmt [13]. Neue Studien konnten dies allerdings

wiederlegen [34, 35]. Stattdessen ist bewiesen, dass das zirkulierende Visfatin

identisch mit der extrazellulären Nicotinamiden-5-Phosphoribosyl-1-Pyrophosphat

Transferase (eNAMPT) ist [18]. Eine reduzierte Visfatinaktivität führt zu

verminderter NAD-Verfügbarkeit und verminderter Glukose-vermittelter

Insulinsekretion in Vitro und in Vivo. Applikation des Nicotinamid Mononucleotid

(NMN), das Produkt der per Visfatin katalysierten Reaktion, kehrt diesen Effekt um

[34]. Wir zeigten erhöhte Visfatinkonzentrationen bei Patienten mit insulinpflichtigem

Diabetes. Dies könnte auf einen Kompensationsmechanismus hinweisen, der mögli-

cherweise eine Erhöhung der endogenen Insulinsekretion hervorruft und in unserer

Patientengruppe vermutlich beeinträchtigt ist. Allerdings müssen diese Ergebnisse

vorsichtig interpretiert werden. Unsere Patienten waren ziemlich heterogen, da nur

zehn der 18 Patienten ihr Insulin kurz vor der Blutabnahme spritzten. Zudem konnten

wir weder eine Korrelation zwischen erhöhtem aktiven Visfatin und Plasmainsulin,

noch mit der Glukosekonzentration oder des Vorhandenseins eines Diabetes mellitus

Typ 2 ohne Insulintherapie bei den HD-Patienten nachweisen. (s. Tab. 4.2). Ein

Grund dafür ist möglicherweise die eingeschränkte Regulation von Insulin durch

Visfatin bei HD-Patienten. Eine Anreicherung von Visfatin im Körper der Patienten

aufgrund einer Nierenfunktionsstörung könnte zu diesem Umstand beitragen. Den-

noch zeigten insulinresistente Typ 2-Diabetiker ohne Nierenfunktionsstörung und

gesteigerten Visfatinwerten erhöhte Glukose- und Insulinkonzentrationen im Sinne

48

eines Kompensationsmechanismus [33]. Daher ist anzunehmen, dass Visfatin bei

nierengesunden Patienten einen Einfluss auf die Insulinregulation besitzt.

Unsere Studie ist auf Korrelationsanalysen beschränkt. Weiterhin ist die HD-Gruppe

heterogen, mit verschiedensten Begleiterkrankungen und Dauermedikationen. Insbe-

sondere Medikamente, die den Fett- oder Glukosemetabolismus beeinflussen, wie

z.B. Statine, könnten die Visfatinwerte verändern. Wie jedoch bereits gezeigt wurde,

reguliert Atorvastatin die Visfatingenexpression in Adipozyten herunter und kann

eine Apoptose dieser Zellen provozieren [26]. Daten über Visfatinkonzentrationen

mit Statinmedikation liegen bislang nicht vor, allerdings scheint eine Erhöhung

implausibel. Auch könnten ACE-Hemmer bzw. Angiotensin-2-Rezeptorblocker die

Visfatinfreisetzung beeinflussen [38]. Allerdings konnten dies die Autoren nicht ein-

deutig belegen. Dementgegen muss die Heterogenität unserer Patientengruppe nicht

unbedingt von Nachteil gewesen sein, da sie einen repräsentativen Querschnitt von

Dialysepatienten in unserer Region darstellt und die Ein- und Ausschlusskriterien

klar festgelegt waren.

Abschließend ist zu sagen, dass die Studie verlässliche Daten über die aktive Form

des Visfatinmoleküls bei HD-Patienten lieferte; und zwar unter Verwendung des zur

Visfatinmessung gut geeigneten ELISAs. Es wurde gezeigt, dass der Verlust der Nie-

renfunktion zu einer Erhöhung des zirkulierenden Visfatins führt. Am interessantes-

ten ist das Ergebnis, dass erhöhte Visfatinwerte mit verminderten HDL-Choles-

terinkonzentrationen einhergehen. Aufgrund der wichtigen Rolle des HDLs bei kar-

diovaskulären Geschehnissen könnte dies einen zusatzlichen Hinweis liefern, warum

es bei HD-Patienten mit erhöhten Visfatinwerten gehäuft zu kardiovaskulären Kom-

plikationen kommt.

49

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