Biochem. Physiol. Pflanze" 118, 249-261 (1983)

Akti vitatsbestimmung der Superoxid-Dismutase-Isoenzyme von Pinus sylvestris Nadeln im Polyacrylamidgel

HORST SCHULZ Akadcmie der Landwirtschaftswissenschaften der DDR, Institut fiir Landscha,ftsforschung und

NatuTschutz Ha.lle (Saale), DDR

Estimation of SOD Isoenzyme Activities of Pinus sylvestris Needles in Polyacrylamide Gel

Key Term Index: superoxide dislllutase, isoenzy mes, polyacrylamide gel electrophoresis, a.ctivity estima.tion; Pinus sytvestris

Smnmary

The assay for superoxide dislllutase of Piuus syh.:estris needles is disturbed by substances in crude extracts. This paper describes a method which allows the estima.tion of SOD isoenzyme activities after electrophoresis in polyacrylamide gel, a.fter elimina.tion of such substances. The error of quanti­t ative assa.y with NAD H, PMS a.nd I NT is small.

Dry a.ceto ne powder of Pinus sylvestris needles contain nine SOD isoenzymes: Four isoenzymes wi th higher mobility towa.rds the anode, KCN- a.nd H20 2-sensit ive (Cu, Zn-SOD) and five isoenzymes with lower mobi lity town.rrls the a.node, KCN- and H20 2-resistent (Mn-SOD)_ Isoenzymes of Fe-SOD h ave not been fou nd in dry acetone powder of Pinus sylvestris needles.

Einleitung

SlIperoxid-Dismlltasen (EC 1.15.1.1.) geMrell zlIr Klasse der Oxydoredllktasen lind kommell allssehlie.i.llich als ClI , Zn-; Fe- 1I1ld Mn-Metallenzyme in allen O,-metabolisie­renden Organismen vor. MlIltiple Formen wlIrden bisher allS v ielen Organismen MCCORD lind FRIDOVICH (i969); MISHRA lind FRIDOVICH (1972); SAWADA et al. (1972); GOSCIN lind FRlDOVICH (1972); BEAUCHAMP lind FRIDOVICH (1973) sowie andere isoliert und teilweise bioehemiseh gllt ulltersucht . Die umlangreichen Ergebnisse si nd in Reviews vo n FRIDOVICH (1974, 1975) und MCCORD (1979) zusammengestellt.

Aile 3 Superoxid-Dismlltasen (SOD) katalysieren die Disproportionierung von 2 SlI­peroxidradikalen ZlI Sallerstoff lind Wasserstolfperoxyd naeh folgender Gleiehllng:

- - SOD 0,' + 0,' + 2H+ -~ 0, + H,O,

Aulgrund der Instabilitat des Substrates (0,) wird hiill lig wr Aktivitatsbestimmllng dieser Enzyme die indirekte Methode gewahlt. Hierliir verwendet man ein Indikator­system, wobei in einer Primarreaktion ein SlIperoxidradikal erzeugt wird, das in der Folgereaktion ein Indikatormolekiil redllziert. In Gegenwart von SlIperoxid-Dismlltase

AblnlrzlIngen: SOD, Superoxid Dismutasc; POD, Peroxydase; NB1\ Niroblautetrazolilllllch iorid; INT, Jodnitrotetrazol iumchlorid ; P .MS, Phennzinmethosuliat; FMN, Riboflavin-5'-pbosphat ; PVP, Polyviny lpyrolidon; XOD. Xanthinoxydase ; ~ADH, Nikotina mid-Adenin-Dinukleotid

250 H. SCHULZ

wird dUTCh enzymatisehe Dismutation des Radikals (Konkurrenzreaktion) die Reduk­tion des Indikators gehemmt.

In der Literatur werden zahlreiehe Systeme fiir die Radikalerzeugung und den Radi­kalnaehweis von McCoHn und FRIDOVlCH (1969); BEAUCHAMP und FRIDOVICH (1971); NIsHIKmI et al. (1972); ASADA et al. (1977); MARSHALL und WORSFOLD (1978) sowie MISRA und FRIDOVlCH (1977) besehrieben. Die Aktivitatsbestimmung mit Rohhomoge­natextrakten wird jedoch bei allen Methoden mehr oder weniger durch Begleitsubstan­zen im Rohextrakt gestOrt.

Erfolgversprechender erscheint die Aktivitatsbestimmung der SOD bzw. ihrer Iso­enzyme nach elektrophoretiseher Auftrennung im Polyacrylamidgel. In der folgenden Arbeit soli deshalb unter Verwendung des Probenmaterials von Pinus sylvestris Nadeln eine Methode besehrieben werden , die einen quantitativen Aktivitatsnaehweis von mul­tiplen SOD-Formen erlaubt.

Material uod Methoden Material

Die Untersuchungen wllrden an Ijahrigen ausdiffcrenzierten Nadeln von P i,iUS sylvesttis durch­gefflhrt. F.-If die Probenmaterialgewinnung sta,nd cine etwa. 25jiilrrige J\iefer jill Botanischen Ga,rtcn der Ma,rtin-LutheT-Univcrsitat Ha.lIe-Wittenberg znT Verfugung.1) Die SOD-Bestimmung und ge l­elektrophoretisrhe Auftrennung erfolgte ausschlieBlich linter Verwendung von Rohhomogenatell, die durch Pufferextraktion a,us Acetontrockenpulver der Nadeln von Pillus sylvestf"is hergestellt w\lrden.

AceiontrockenpuivergewhHlWl[J Die Nadeln werden tHif etwa - 20 bis - 30 °C vorgekiihlt, mit einer Schere grob zerkleinert und

bei _ 25°C mit dem Ultra 1'urrax fur 1,5 min in 25 ml Aceton homogenisiert. AnschlieBend wurde vakuumfiltriert, mit etwa. 25 ml ka.ltem Aceton gewaschen lind der acetonha ltigc Hiickstand gefrier­getrocknct. Nahere Einzelheiten sind SCIIULZ (1981) zu entnehmen .

Extraktion Wenn nicht anders vermerkt, wurden 25 mg Acetontrockenplliver mit 1 ml 0,02 M ]{~ HPO, (nuf

pH 8 mit 0,02 M EDT A eingestellt) extrahiert lind das Zentrifuga.t (Rohextrakt) zur Analyse einge­scht.

SOD-Aktiviliitsbestimnl1mg it)/. Rohextrakt Xanthi,, /X(ltIlh illoxyd(lse/Cytoch rom C-Methode, (MCCORD lind FRIOOVJCIl 1969). In 1,5 1111

0,1 M Phosphatpuffcr pH 7,8 (der O,IIIlM t;DTA enthielt) waren cnthaltcn 0,05 IIlM Cytochrolll C; 0,1 mM Xanthin' Na-Sa lz; 30,'g Xanthinoxydase und 5- 20,,1 SOD- Rohextrakt bzw. Extraktions­puffer.

Xanthin /Xallthilloxydase/N lIT-Methode (B.EAUCIIA!'IlP und FRIOOVlrn 1971). In 1,5 ml 0,051\1 Na~C03 pH 10,2 (der 0,1 mM EDTA enthielt) waren entha lten 50,u?l1 NBT; 0,1 mM Xanthin' Na· Salz; 16,67 p,g Xanth inoxydnse und 5- 201'1 SOD~nohextrakt hzw. Extraktionspuffer.

NADH /PMS/NRT-Metltode (NISIIIKIi\II et a.1. 1972). ]n 1,5 ml 0,02 M Pyrophosphat-Puffcr (Na'4P207 /N~H,P207) pH 8,5 waren entha-Iten 0,5 mM NBT, 0,0031 mM Phenazinmethosulfat (PMS), 0,078 mM NADH und 5- 10,,1 SOD-Rohextrakt hzw. Extraktionspuffer.

Aile Aktivitiitsmessungen erfo lgten photometrisch bei 550 nm lind 23°C.

1) vgl. Mitt. Nr.70 aus dern Botanischen Garten der Martin-Luther-Universittit Haile-Witten ­berg

Bestimmung der Superoxid~Dismutase in Gelen 251

Die SOD·Aktivitat wurde nach McCono und FUIDOVICII (1969) in Einheiten berechnet, wonach cine Einheit a.ls die enzymatische Aktivitiit definiert wird, die cine 5O%ige Hemmung der Umsetzung des Indikatormolekftls bewirkt. Einheit = (Vjv) - 1, wobei V und v die Umsatzraten (ilEjmin) in Abwesenheit bzw. Anwesenheit von SOD·Rohextmkt da.rstellen.

Pol yewr yla 11Ii d gel-Elektropltorcse

Eingesetzt wurde ein 7%iges Trenngel mit cincm T·Wert von 7,21 % und einem C·Wert von 2,98%. Der Trennge lpllffer lind der Elektrodenpllffer (10 % TrisjGlycin, pH 8,3) entspmtil den An· gaben von l\L\unER (1968).

Es wllrden, wenn nicht unders vermerkt, 501'1 SOD·Rohextrakt .wf die Oberflache des Trenngel­zylinders ( 0 = 5 mm) u IIfgetragen und mit 50 It! 40%ige Saccha.rose·U>sung iibetschichtet. Die Auf· trennung erfolgte bei konsta.nter Strolllstarke von 2,5 mA jRohrchen lind 6°C.

Staudardmelhode zur Aktivitiitsbestimmung du 80D~lsoew~yme im PolyacryJam£dgel

Nach elektroJlhoretischer Auftrennung wurde das Gel mit dest. H2 0 gespiilt lind zunaehst in 10 ml 0,02 .M Pyrophosphat·PuUer (pH 8,5), der 0,05 mM Jodnitrotetrazoliumthlorid (TNT) und 0,01 mM Pl\IS enthielt, 20 min vorinkubiert. Die Stil-ftinkubation erfolgte ansehlie6end in 8 ml 0,02.M Pyrophosphat.Puffer (pH 8,5) mit 0,15 ml\f NADH. Durch Uberfflhrung des Gels in dest. H20 wurde der SOD·Na.ehweis nach 30 min Inkllbation gestoppt. Vorinkubation und Startinkuba· tion erfolgten bei 30°C linter Liehtaussehl1l6. ZlIr Aktivitatsbestimmung wurden naeh einer Stun de mit dem Densitometer (Schnell photometer G 1I von VEB Carl Zeiss JENA) die Extinktionen der SOD~Isoenzymbanden gegen ein Referen1.~Gel ohne Probenallftrag registriert (vgl. Abb.3). Zur Be· rechnung der enzyma.tisthen Aktivita.t winl der Quotient <lUS der Gelgrundextinktion (EI) lind der Bandenextinktion (Ez) gebildet lind der Wert 1 subtrahiert (EI /~)~l.

Ergebnisse und Diskussion

Bereits NISIIIKIMI et al. (1972) weisen auf die Problematik der SOD-Bestimmung in Rohextrakten hin und empfehlen die Testung verschiedener Reaktionssysteme zum Aktivitatsnachweis. In Abb. 1 erkennt man deutlich die Differenzierung der gemessenen SOD-Aktivitiit im Rohextrakt VOIl Pinus sylvestris, wenn unterschiedliche Methoden angewendet werden. Ein Ergebnis , das nicht iiberraseht und in Einklang mit den Arbei­ten von MCCORD nnd FRIDOVICH (1970) siwic BEAUCHA"P und FRIDOVICH (1971) die Annahme crbartet, daB Rohextrakte Substanzen enthalten, die den Elektroncntrans!er vom erzeugendcn System (Abb. 2) auf das Sauerstoffmolekiil verhindern. Die Reduktion des Indikatormolekiils (NBT, INT oder Cytocbrom c) erfolgt dann nicht oder nUT teil­weise durch das Ireie 02~-Radikal (k2 > k,). Durch Zusatz von Polyvinylpyrolidon (PVP) zum Extraktionspufler kann abcr auch ein positiver Ellekt erzielt werden, wie spater noch zu zeigen ist. Von GIANNOPOLITIS und RlEs (1977) wird der storende EinfluB von Peroxydase auf die NBT-Reduktion diskutiert. Das Enzym kann die Oxydation von reduziertem NBT katalysiere n. SALIN und BRIDGES (1980) weisen bei Verwendung von Cytochrom c auf die Stiirung durch Cytochromoxydase hin . Bei Anwendung dieser Me­thode wird in Rohcxtraktcn von Pinus sylvestris die geringste SOD-Aktivitat gemessen. Die Xanthin(Xanthinoxydase(NBT-Methode, NADH(PMS(NBT; INT-Methode und die FMN(NBT-Methode') ergoben dagegen etwa anniihernd gleiehe Enzymaktivitiiten.

I) Die SOD-llestim mung der FMN·Methode wurde in dankenswerter Weise von Frau Dip!.~Bio~ chern. KOCK, Scktion Biowissensthaften dcr Martin·Luther· Un iversitiit Halle~ Wittenberg, dnr("h· gcfflhrt.

252 H. SCHULZ

3 I I

2.5

2 A -., -?. ,. '. I :;'1.5

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1

0.5

D

5 10 15 20 ,..1 SOD - Rohextrakt

Abb.1. Mef3methodenve.,gleich zur SOD-AktiviUilsbestitnmung unleT Venvendung von Pinus sylvestris Rohenzymextraktel~.

MeBbedingungen \Vie unter Material und ~lethoden angegeben. MeBansatz der FMN /NBT-Methode: 1 rnl 50 ruM TricinlKOH (pH 8,5), 0,2 rnl 251'M FMN, 0,2 ml 25,IM NBT, 0,55 rnl H,O nnd 0,05 ml Enzymextrakt (oach KftCK, unveroffentlicht) A - Xanthinl XODINBT-Methode B - NADHIPMSINBT; !NT-Methode C - FMNINBT-Methode D - XanthinlXODICytochrom c-Methode

Werden dem Extraktionspuller 5% PVP zugesetzt (Tabelle 1), erhiiht sich die SOD­Aktivitat urn das Doppelte, eine teilweise Hemmung der enzymatischen Aktivitat durch 1 mM KON (BRIDGES und SALIN 1981) wie in Extrakten ohne PVP nachgewiesen, bleibt aber aus. Eine Schutzwirkung von PVP kann ausgeschlossen werden, da im gleichen Rohex 'crakt Peroxydase durch 1 mM KON vollstandig inhibiert wird.

Bemerkenswert ist auch die Hitzestabilitat von SOD-Rohextrakten (GIANNOPOLITIS

und RIES 1977). Erhitzt man Rohextrakte von Pinus sylvestris etwa 3 min bci 100 ' 0,

e

Bestimmung der Superoxid-Dismutase in Gelen

<tINT; H +

-----------;,----------~._ I NT,ed. k2

System zur Erzeugung I v, "" ~2", k, ?Ms}{NADI1·iN1j·pl) Aeduktion des Indikator-

yon Aeduktionsaquiya- 'I I molekiils zB. !NT

lenten I V2'K t1i!.~k2 [PMSj·lNADI1 . ~ NTj i bzw. deren Hemmung

zB. NADH\ PMS I I durch SOD

I v3'" ~ = kJ [soq]· p;l I

I " ,

v._ :~Nt...jk4 ' N~ [Oi!' I

Abb. 2. Reaklionsmodell zur allgemeinen SOD-Aktivitatsbestimmung

253

ist kein Verlust der SOD-Akt ivitilt nach der XanthinfXODfNBT-Methode als auch nach der NADHfPMSfNBT-Methode festzustellen. GIANNOPOLITIS und RIES (1977) weisen in diesem Zusammenhang auf die stabilisierende Wirkung von Begleitsubstanzen im Rohextrakt hin , die offensichtlich auch fiir die oben beschriebencn Pseudo-SOD-Aktivi­tilten in Pinus-Rohextrakten verantwortlich zeichnen. Die Richtigkeit dieser Annahme crhartet sich, wcnn SOD-Rohhomogenate verschiedener Extraktionspnfier (Tabelle 1) elektrophoretisch im Polyacrylamidgel aulgetrennt werden . 1m Gegensatz zur Aktivitilts­bestimmung im Roheniymextrakt wird jetzt bei allen SOD-Isoenzymen cine geringere

Tabelle 1. Einflu/J ve-rschiedcneT Extraktiotlspuffer auf die SOD-Aktivitiit im Rohenzymexlrakt ( N ADH­Methode) tUld nach eiektrophoretisclier Auftrennung am Beispiel des Isoenzyms 4 (Standardmethode im Polya.crylamidgel )

Extraktionspuffer SO D-Aktivitiit SOD-Aktivitiit des Iso-in 5,ttl Rohextrakt enzyms 4 in 50,al Roh-

extrakt

ohne KeN % Hem- ohne KeN % Hem-mung durch mung dutch 1 mM KeN 1 ruM KeN

0,02 M Pytophosphat 1,33 0 1,33 + 5% PVP,pH 8

0,02 M Pytophosphat, 0,56 59 1,70 pH 8

0,02 M K,HPO" 0,36 71 2,19 89 pH 8

0,02 M K,HPO, 0,67 0 1,41 91 + 5%PVP,pH8

0,1 M K,HPO" pH 8 0,43 77 1,73

254 H. SCH ULZ

0

I T A I B

@ 4 f 4 0 is 32 .2 0.1

® '\ :l< 5

~ w

-./l 0.2 98 7

6

~ 0 .3 e Gl

c D

0.3 3

0 .2

w"

10 20 30 40 50 60 10 20 30 40 so Startinkubation ( min )

Abb. 3. Optimierung der Aktivitiilsbestimmung von Pinus sylvestris SOD·!soemymen nach Auftrentlung im 7%igeu Polyacrylamidgel

A - ]soenzym mllster nach Standardmethode mit System NADH/PMS/ INT B - Jsoenzymmllstcr nach Standardmethode mit System NADHjPMSjNBT C - V,riation der Vo,inkub,tion (INT + PMS) und de, Stotlinkubation (NADH) nach de, Stan­

dardmethode am Beispiel von Isoenzym 4; (1) 10 min Vorinkubation; (2) 20, 30 und 40 min Vorinkubation

D - Varia.tion der Startinkubation (NADH) hei 20 min Vorinkubation nach der Sta.ndardmethode (1) Isoenzym 4; (2) Isocnzym 5

e

e

Bcstimmung dec Supccoxid-Dismutase in Gelcn

9876

5

4 !

B

3 2

c

255

Abb . 4. Nachweis deT SOD-Isoenzyme VOlt Pinus sylvestris nach AtI{tremltmy im 7%igen Polyacryl­amidgel unter verschiedellen I llkubutio1lsbedillY1Ulgen

A - Standardmethodc ohnc Vorinkubation Sofortstart mit 0,5 ml\I INT, 0,014 mM Pl\IS lind 0,15 m~I NADH im Ansat,

B - Standardmethode ohne Vorinkubatioll i Sofortstart mi t 0,5 ml\l INT, 0,15 ruM NADH ohne PMS

C - StandlLrd methode D - Standard methode ohne PMS

256 H. SCIIULZ

SOD .fQQ.

Af e 0.102

I 0.138 0.183 0.244

0.326

0.453 0.51 0.553 0.593 .... -

Abb. 5. SODw und POD-Isoenzymmusler von Pinus sylvestris im 7%igen pQlyacrylamidgel SOD-Nachweis: Standardmethode POD-Nachweis: Der Inkubationsansatz enthielt 7,5 ml 0,2 AI Na-Acetat, 1 ,75 ml Benzidin/Guajakol­Gemisch (in 1,54 ml Eisessig werden 50 rug Benzidin und 501'1 Guajakol gelost und ad 25 ml mit dest. H20), nach 30 min Vorinkubation bei 23 °0 Start mit 0,75 ml H2;0Z (200 #1 30%iges H20 z ad 50 ml dest. H20); nach 5 min Reaktionsstopp mit 10 ml 1 mM KON

Aktivitat gemessen. Auch die KCN-Sensitivitat des PVP-Extraktes weist auf die elek­trophoretische Abtrennung sttirender Substanzen hin.

Voruntersuchungen zurn qualitativen Nachweis der SOD-Isoenzyme lieJ.len erken­nen, daJ.l die photochemischen Methoden von BEAUCHAMP und FRIDOVICH (1971) sowie BAUM und SCANDALIOS (1979) zum quantitativen Isoenzymnachweis im Polyacrylamid­gel weniger geeiget sind. Die Grundfarbung von reduziertem NBT im Gel ist nicht homogen, so daB eine exakte densitometrische Auswertung sehr fehlerbehaftet sein kann. Bessere Voraussetzungen fiir die quantitative Auswertung im Gel ergab der SOD-Nach­weis mit dem NADH/PMS-System nach NISHIKIMI et al. (1972). A1s besonders vorteil­haft erwies sich dabei (Abb. 3A) der Aktivitatsnachweis mit INT. Jodnitrotetrazolium­chlorid diffundiert schnell in das Gel, die Untergrundfarbung ist homogener als bei Ver­wen dung von NBT (Abb. 3 B) und die SOD aktiven Banden werden kontrastreicher ge­zeichnct. Wie in Abb. 3 C und Abb. 4 dargestellt, erhOht sich die Intensitat der Iso­enzymbanden, wenn vor Reaktionsstart, das Gel mit INT und PMS 20 min vorinkubiert wird. Die Extinktionsdifferenz (E,- E.) ist dann iiber etwa 40 min (Abb. 3D) linear. Unterbleibt diese Vorinkubation bzw. der Zusatz von PMS als Elektroneniibertrager, wird entweder nur geringe Aktivitat gemessen (Abb. 4A) oder der Nachweis von SOD­Isoenzymen bleibt aus (Abb. 4B, D). Anstelle der in der Farbintensitat aufgehellten SOD-

Bestillllllung der Superoxid-Dismutase in Gelen 257

Tabelle 2. EinflufJ VOIl l(aliumcyanid und lVasserstoffperoxyd auf die SOD-lsoemytne von P,:nus sylvcstris Standard methode illl Polyacrylamidgel , Effektorcinflu6 20 min bei Vorinkubation

Effektor SOD-Aktivitat del' Isoenzyme

Cu, Zn-SOD Mil-SOD

1 2 3 4 5 6 7 8 9

ohne EUektor 0,59 1,39 1,43 1.94 1,14 0,41 0,29 0,33 0,46 1 mM KeN 0,31 1,20 0,20 0,20 0,20 0,18 2 mM H20 2 0,24 0,41 0,G5 1,27 0,36 0,36 0,44 0,49 4 mM H20 2 0,10 0,23 0,36 1,24 0,26 0,26 0,41 0,44 6 mM H,O, 0,22 0,32 1,39 0,30 0,33 0,74 0,93 8 mill H20 2 1 ,56 0,34 0,41 0,83 0,83

Banden erscheint auf farblosem Geluntergrund eine rotgelarb te, vermutlich Dehydro­genasebande (Abb. 4B , D). Die Beeinflussung der SOD-Isoenzyme 3, 4, 5 und 6 (Abb. 5) in ihrer enzymatischen Aktivitat durch multiple Peroxyda.se-Formen von gleieher Mo­bilitat bleibt jedoch zunachst nieht ausgeschlossen.

Ein signifikanter EinfluE von HzOz wird nur bei den Isoenzymen 8 und 9 erzielt. Allerdings bei so hohen Wasserstoffperoxydkonzentrationen, die in vivo unrealistiseh sind. Eine StOrung dureh Peroxydase, wie aueh von GIANNOPOUTIS und RIES (1977) diskutiert, ist deshalb zu vernaehlassigen.

Aus den Effektoruntersuehungen mit HzOz und KCN, deren Ergebnisse in Tabelle 2 zusammengestell t sind, kann man naeh BRIDGES und SALIN (1981) annehmen, daE Roh­extrakte von Pinus sylvestris-Acetontrockenpulver Isoenzyme der Cu, Zn-SOD (1,2,3,4) und Isoenzyme der Mn-SOD (5, 6, 7, 8, 9) enthalten (vgl. auch Abb . 4C). Isoenzyme der Fe-SOD, die H,Oz-sensitiv aber KCN-resistent sind, kommen offensiehtlich nicht vor. Selbst 8 mM HzO, Hihrt nicht zur Inhibierung eines der 9 na ehgewiesenen SOD-Iso­enzyme.

Die SOD-Bestimmung im Polyacrylamidgel ist nach Abtrennung von stOrenden Sub­stanzen somit spezifisch und schlieBt den Nachweis von Fremdaktivitaten unter Ein­haltung bestimmter Reaktionsbedingungen aus. Entscheidend ist dabei die optima le Wahl der Reagenzkonzentrationen von I NT, PMS und NADH. Dureh die Konzentration deT Reaktionspartner konnen die Gesehwindigkeiten der Teilreaktionen v, und I', (Abb. 2) entseheidend bceilllluBt werden . Wird die Konzelltration eines Reaktionsteil­nehmers z. B. XOD, NADH oder PMS bei der SOD-Bestimmung im Rohextrakt erhoht (Tabelle 3), verringer t sich die nachweisbare SOD-Aktivitat, der Umsatz der Kontroll­reaktion (ohlle Zusatz von SOD-Extrakt) nimmt dagegen zu . Die gleichen Resultate werden bei der SOD-Isocllzym-Bestimmung ill Abhangigkeit von der NADH-, PMS­und INT-Konzentration iro Polyacrylamidgel erzielt (Abb. 6). So stehen die Ergebnissc , die in Tabelle 3 und Abb. 6 zusammengestellt sind, in guter Ubereinstiromung mit Un­tersuchungen von WORSFOLD et a l. (1977). Die Verlasser weisen beim Dehydrogenase­nachweis mit NBT und PMS auf den storenden EinfluB von Sauersto!! bei geringer PMS­Konzentration hin. 17 Biochem. Phyaiol. Ptlanzen, Bd.178

258 H. SCHULZ

Tab.lIe 3. Einflu/i VOli Xanthilloxydase (XOD-MetitodeJ bzw. N ADH und PllIS (N ADH-MethodeJ auf die SOD-Beslitnmuug ·im Rohextrakt von Pinus sylvestris

-,~ :~

')

5

4

:;: 2 ..: I o o C/)

System Substanz des Reaktions- SOD-Aktivitiit systems (V/v - l) KOIlZ /l,5 mt Tcstansatz

XOD/Xltnthin /N BT') XOD 12,of.lg 2,64 14,3jtg 1,83 16,51'g 1,67

20,01tg 1,52 25,01'g 1,49

NADH/PMS/NllT') NADH 0,021 m~l 2,62 0,053 mM 0,94 0,106 mM 0,845

PMS 0,003 mM 2,19 0,012 mM 1,0 0,031 mM 0,29

Xanthin- und NBT-Konzentration wie im Standardansatz

Kontrolle (.1 E/min)

0,0309 0,0368 0,047 0,054 0,077

0,0615 0,155 0,44 0,0303 0,0421 0,128

A

B C

5 10 15 .20 2'5 Jo-----3,s NADH · l0·

5M ; PMS · l0 ·

8M ; INT ' 1O-

4M

A

5 10 15 20 25 NADH · ,o'M ; PMS ' lIj' M ; INT'U)' M

30 35

Abb. 6. SOD-Aktivitiit von Isoenzym 4 in Abhiingigkeit von der (AJ NADH-, (B) PMS- und (C) 1 NT -KonzentratiQn. Standardmethode unter Variation eines Reaktoinsteilnehmers

Bestimmung der Superoxid-Dismutase in Gelen 259

Tabelle 4. Eillflup 'VOIJ 1 milt K CN (im Testallsatz) aUf die SOD- Aktivitiit im Rohellzymextrakt utld nac" clektrop"oretiscller Auftremwng am Beispiel des l soenzyms 4 in Ahhiingigkeit von der PMS­KOrlzelltration

Methode

NADH-Methode Rohextrakt-Test (10 ld)

NADH-Mcthodc Il<Lch .Elekttophotese lsocnzym 4 (501.1)

% Hemmllllg der SOD-Aktivitiit in Ahha.ngigkeit von PMSI)

60% 90,2 %

91,6 % 87,8%

1) Aile f1hrigen Reagenzkonzentrationen wie im Sta,ndarda.nsu.tz

5

I

4 l I

I A 0

7N 3

"' ~ e ',!! : ~ .. 2

" , 0 0 (/)

~ ____ L-___ L-__ ~ __ -L __ ~ __ ~~ __ L- . __ ~ __ -L~

20 40 60 80 100 fJI SOD - Rohextrakt

Abb. 7. SOD-Aktivitiit des l soenzyms 4 (Cu, Zn-SOD) tmd des I soenzyrns 5 rAIn-SOD) von Pinus sylvestris in Ahlliitlgigkeit vom {ur die elektroplioretische Atlfirennutlg au{getragenen RohextraktvQZumetlS Standardmethode, A - Isoenzym 4; B - Isoenzym 5

""

2GO H. SCHULZ

Unter der Bedingung, daB das Reaktionssystem mit Sauerstoff angereichert ist, erfolgt bei Konzentrationen von PMS> 0,033 mM und NADH> 0,25 mM die INT­Reduktion bevorzugt auf direktem Weg (k. > k,). Bei geringeren PMS- und NADH­Konzentrationen wird k, > k" die Reduktionsaquivalente werden auf das Sauerstoff­molekul ubertragen, Superoxiddismutase und INT konkurrieren urn das gleiche Substrat (Abb.2). Die direktc Reduktion des IndikatormolekUls ohne Sauerstoffradikalbildung kommt auch hier in dem erbOhten Kontrollumsatz zum Ausdruck (Insert), wobei bei gleichen Reagenzkonzentrationen die SOD-Aktivitat geringer ist (Abb. G).

Aus Untersucbungen ZUT KCN-Sensitivitat (Tabelle 4) der SOD-Aktivitat im Roh­extrakt konnte man zunachst annehmen, daB die Hemmung der enzymatischen Aktivitat dUTCh KCN von der PMS-Konzentration abhangig ist. Bei 3,l.uM PMS wurde gegeniiber 1,55 .uM PMS eine urn etwa 30 % eTbOhte Inhibierung der Gesamt-SOD-Aktivitat im Rohenzymextrakt-Test gemessen. Das Ergebnis lieB vermuten , daB bei k, > k, die Af­finilat der InhibitoTmolekiile zum Enzym [EI] groBer als zu seinem Substrat [ES] ist und a priori eine verstiirkte Hemmung resultiert. Die Effektoruutersuchungen wurden deshalb fortgesetzt, indem der Rohextrakt in seine Isoenzyme aufgetrennt wurde und anschlieBend die cyanidempfindlichen Isoenzyme der Cn, Zn-SOD gepriift wurden. Wie das Ergebnis in Tabelle 4 zeigt, konnte das vorherige Ergebnis zur KCN-Sensitivitat der SOD-Aktivitat im Rohextrakt nicht bestatigt werden . Bei Gfacher Konzentrations­erbOhung von PMS wird beim KCN-sensitiven Isoenzym 4 der Cu, Zn-SOD keine PMS­Abhangigkeit der KCN-Inhibierung gemessen. Die Diflerenzierung beim Rohextrakt­Test ist offenbar auf s!Orende Begleitsubstanzen zuriickzufubren. Der uberwiegende Teil der Gesamt-SOD-Aktivitat ist mit 71,3 % (vgl. Tabelle 2) der Cu, Zn-SOD zuzu­scbreiben.

Interessant bleibt noeh zu erwahnen, daB das Mn-SOD-Isoenzym 5 durch 1 mM KCN eine leichte Aktivierung eTfahTt, wabrend die Isoenzyme 6, 7, 8 und 9 gering inhi­biert werden. Der Effekt von Wasserstoffperoxyd ist konzentrationsabhangig bei allen Isoenzymen, auBer 6 nnd 7. Die Mll-SOD-Isoenzyme 5, 8 und 9 erlahTen eine geringe bis doppelte Aktivierung .

Bei Einhaltung der oben bescbriebenen Stalldardbedillgungen zum Nachweis der durch Polyacrylamidgelclektrophorese aufgetrennten SOD-Isoenzyme liegt die Prazi­sion der quantitativen Aktivitatsbestimmung iiber die registrierten Extinktionen im vertretbaren Fehlerbereich. Der mittlere Fehler des arithmetischen Mittels wurde bei 10 Wiederholungen am Beispiel von Isoenzym 4 (Cu, Zn-SOD) zu 1,31 % und am Beispiel von Isoenzym 5 (Mn-SOD) zu 2,35 % ermittelt.

Wie Abb. 7 zeigt, konnen Konzentrationsidfferenzierungen von einzelnen Isoen­zymen exakt bestimmt werden. Aus bisherigen Voruntersuchungen kann abschlieBend znsammengefaBt werden, daB die vorgestellte Methode zurSOD-Aktivitiitsbestimmung von Nadeln der Pinus sylvestris-Rohextrakte nach Elektrophorese gegeniiber dem Roh­extrakt-Test aufgrund der zu erwartenden S!Orungen durch Begleitsubstanzen vorteil­hafter ist.

Bestimmung der Superoxid-Dismutase in Gclcn 261

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E'iJlgega1ige,~ am 30. August 1982; akzeptiert am 28. Oktober 1982

Anschrift des Verfassc rs: Dr. HORST SCHULZ, Institut fUr Landscha.ftsrorschu ng und Naturschutz Halle (Sa.le), Nenwerk 4, DDR· 4020 Ihlle (Sa ale) .