Chemische EvolutionDOI: 10.1002/ange.200504053

Aldolreaktionen in einer RNA-Welt**Magnus Rueping*

Stichw�rter:Aldolreaktionen · DNA-Template · Ribozyme ·RNA-Welt

Die Aldolreaktion ist eine der wich-tigsten Transformationen in der Chemieund Biologie. Sie ist in der Lage, Sub-strate unter C-C-Verkn�pfung in Pro-dukte mit zwei benachbarten Stereo-zentren zu �berf�hren, weshalb sieh"ufig zum Aufbau von wichtigen Syn-thesebausteinen oder beim Zusammen-f�gen von Fragmenten in der chemi-schen und biologischen Synthese vonkomplexen Produkten und Naturstoffenherangezogen wird.[1] Man kennt heuteeine Vielzahl von diastereoselektivenund enantioselektiven Aldolreaktionen,die auf der Verwendung von chiralenEnolaten oder Aldehyden, st.chiome-trischen Mengen an chiralen Additivenoder auf metall- und organokatalyti-schen Prozessen beruhen. Des Weiterenkonnten hoch selektive Aldolreaktio-nen durch biochemische Katalysatorenwie katalytische Antik.rper oder Enzy-me realisiert werden.[1f,g,2]

In der Natur kennt man zwei Typenvon Aldolasen, die sich durch ihrenReaktionsmechanismus unterschei-den.[3] Die Typ-I-Aldolasen, die vor-wiegend in S"ugetieren und h.herenPflanzen vorkommen, aktivieren denAldol-Donor durch die Bildung einer

Schiff-Base mit anschließender Additi-on an den Acceptor. Im Unterschieddazu enthalten die Typ-II-Aldolasen,die aus Pilzen und Bakterien isoliertwerden, zweiwertige Metallionen alsCofaktoren, die als Lewis-S"uren imaktiven Zentrum agieren.

Trotz der F�lle der bisher bekanntenAldolreaktionen gelang es k�rzlich denGruppen von Joyce[4] und Famulok,[5]

durch neue Herangehensweisen weitereinteressante Aspekte aufzudecken. Joy-ce und Mitarbeiter entwickelten hierzueine templatvermittelte gekreuzte Al-dolreaktion, und Famulok und Mitar-beiter konnten erstmals zeigen, dassRibozyme (RNA-Enzyme) in der Lagesind, Aldolreaktionen wirksam zu kata-lysieren.

Ribozyme sind RNA-Molek�le, dieaufgrund ihrer katalytischen Aktivit"tbei der chemischen Evolution des Le-bens eine wichtige Rolle gespielt habenk.nnten. Ausgehend von dieser Vor-stellung entwickelte man die RNA-Welt-Hypothese, derzufolge die RNA ineiner pr"biotischen Zeit als prim"resEnzym und genetisches Material dien-te.[6] Es wurde nachgewiesen, dassRibozyme chemische Reaktionen kata-lysieren, die f�r die Entwicklung desLebens entscheidend waren, darunterdie Nucleotidsynthese,[7] Peptidsyntheseund -spaltung,[8] Aminos"ureacyltrans-fer,[9] Michael-Reaktionen,[10] Metallie-rungen von Porphyrin,[11] Alkylierun-gen,[12] Redoxreaktionen[13] und RNA-Polymerisationen.[14]

Von einer der grundlegendsten Re-aktionen in lebenden Zellen, der Al-dolreaktion, die f�r die Glycolyse, denZuckermetabolismus und andere meta-bolische Wege essenziell ist, hatte bis-lang jedoch eine RNA-katalysierte Va-riante gefehlt.[15] K�rzlich nun gelang esFamulok und Mitarbeitern, erstmals ein

Ribozym f�r die Aldolreaktion zuidentifizieren. Hierbei wurde ein Selek-tions-Amplifikations-Verfahren ver-wendet, um aus 2E 1015 unterschiedli-chen RNA-Molek�len Ribozyme zuisolieren, die die Aldolreaktion kataly-sieren. Dazu wurde jedes der RNA-Molek�le am 5’-Terminus �ber einenphotospaltbaren Linker mit einem 4-Oxovalerians"ureamid als Aldol-Donorverkn�pft, sodass nach erfolgreicherAldolreaktion eine einfache Charakte-risierung m.glich war (Schema 1). DerAcceptor-Aldehyd wurde biotinyliert,sodass die RNA-Aldolprodukte durchAffinit"tschromatographie leicht iso-liert werden konnten. Die von 2E 1015

RNA-Molek�len ausgehende Suchelieferte ein Ribozym, das die Aldolre-aktion gegen�ber der unkatalysiertenReaktion um den Faktor 4300 be-schleunigt (Schema 2).

Damit das Ribozym katalytischwirkt, mussten jedoch, in Anlehnung anheutige Typ-II-Aldolasen, Zn2+-Ionenzugegeben werden. Ohne die Zugabedieses Cofaktors lief keine Aldolreakti-on ab, was die allgemeine Frage auf-wirft, ob Aldolaseribozyme Zn2+-Ionenben.tigen, und falls ja, ob diese Ionenzur Aktivierung des Aldol-Donors oderzur Faltung und Stabilisierung derRibozyme dienen. Ebenfalls k.nnteman spekulieren, inwieweit Ribozymeexistieren oder existiert haben, die, wieTyp-I-Aldolasen, Amin-Cofaktoren be-n.tigen, und ob diese Ribozyme dieF"higkeit haben, Aldol- und Retro-Al-dolreaktionen des Kohlenhydratmeta-bolismus zu katalysieren.

An dieser Stelle kn�pft die tem-platvermittelte Aldolreaktion von Joyceund Mitarbeitern an. Diese beschriebenerstmals eine DNA-unterst�tzte ge-kreuzte Aldolreaktion zum Aufbau vonPentosezuckern als ein Modell f�r die

[*] Prof. Dr. M. RuepingDegussa-StiftungsprofessurInstitut f-r Organische Chemie undChemische BiologieJohann Wolfgang Goethe-Universit6tFrankfurt am MainMarie-Curie-Straße 1160439 Frankfurt am Main (Deutschland)Fax: (+49)69-798-29248E-mail:m.rueping@chemie.uni-frankfurt.de

[**] M.R. dankt der Degussa AG f-r die groß-z-gige finanzielle Unterst-tzung, Prof. Dr.Gerhard Quinkert f-r die anregendenDiskussionen und allen Kollegen f-r diefreundliche Aufnahme in Frankfurt.

Highlights

1870 � 2006 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim Angew. Chem. 2006, 118, 1870 – 1872

Synthese von Ribose in einer RNA-Welt. Ribose, der wesentliche Bausteinder RNA, kann durch Kondensationvon Formaldehyd unter basischen Be-dingungen in der Formosereaktion er-halten werden.[16] Jedoch ist die Aus-beute mit ca. 1% sehr gering, und esentsteht ein komplexes Gemisch mitanderen C3-, C4-, C5- und C6-Zuckerde-rivaten.[17] Aus diesem Grund wurdenach alternativen abiotischen Synthese-wegen gesucht, und man fand Bedin-gungen, die erh.hte Ausbeuten von Ri-bosederivaten wie dem Ribose-2,4-di-phosphat liefern.[18]

Joyce und Mitarbeiter besch"ftigtensich nun mit der Frage, wie eine Ver-bindung wie Ribose, die unter gew.hn-lichen und besonders unter aktiviertenBedingungen instabil ist, in einer RNA-Welt h"tte entstehen k.nnen (Sche-ma 3). Ihr Ansatz bestand darin, diebeiden f�r die Bildung von Pentosenotwendigen Aldehyde – Glycerinalde-hyd und Glycoaldehyd – mit Oligonuc-leotiden zu 5’-Glyceryl-DNA- bzw. 3’-Glycoaldehyd-DNA-Konjugaten zuverkn�pfen. Die modifizierten Oligo-nucleotide wurden dann mit einemkomplement"ren DNA-Templat verei-nigt, das durch Watson-Crick-Basen-paarung erkannt wird.[19] Das Templatwurde so entworfen, dass die beidenAldehyde die optimale Orientierung f�reine Aldolreaktion einnehmen k.nnen.Des Weiteren sollte der Templateffektdie gekreuzte Aldolreaktion beschleu-nigen, indem er die effektive Aldehyd-konzentration erh.ht und damit uner-w�nschte Nebenreaktionen unter-dr�ckt. Diesem Ansatz folgend gingendie beiden modifizierten Oligonucleoti-de bei Raumtemperatur und unterschwach basischen Bedingungen eineAldolreaktion ein, w"hrend in Abwe-senheit des Templats keine Reaktionstattfand. Interessanterweise wurde dieReaktion durch Zugabe von Aminenum ein Vielfaches beschleunigt, was aufeinen Typ-I-Aldolasemechanismus hin-weist.

Die DNA-vermittelte gekreuzteAldolreaktion ist ein neuer und elegan-ter Zugang zu Pentosederivaten, kannim Zusammenhang mit der RNA-Welt-Hypothese aber bloß als ein Modellangesehen werden, da in einer RNA-Welt kein DNA-Templat existiert habend�rfte. Unterstellt man jedoch, dass

Schema 1. a) Aldolreaktion eines biotinylierten Aldehyds mit einem 4-Oxovalerians6ureamid alsAldoldonor, der -ber einen photospaltbaren Linker an das Ribozym gebunden ist. b) Die Selekti-on der Aldolaseribozyme aus einem RNA-Pool von 2F1015 RNA-Molek-len (randomisierte Re-gionen von 70 und 72 Nucleotiden) erfolgte im Anschluss an die Aldolreaktion mit dem biotiny-lierten Aldehyd durch Affinit6tschromatographie (Streptavidin, Agarose-Gel). Anschließende UV-Spaltung lieferte die gew-nschten Sequenzen, die daraufhin f-r die Polymerasekettenreaktionmit reverser Transkriptase (RT-PCR) verwendet wurden. Alternativ wurden die immobilisiertenSequenzen auch direkt in der PCR umgesetzt. Nach elf Selektionszyklen wurden die am h6ufigs-ten vorkommenden und aktivsten Sequenzen isoliert und untersucht.

Schema 2. Anhand enzymatischer Untersuchungen vorgeschlagene Sekund6rstruktur des Aldo-laseribozyms. Die aktive Sequenz des Ribozyms, die f-r die Aldolreaktion erforderlich ist, wurdedurch stufenweisen Abbau der RNA-Sequenz identifiziert. F-r die katalytische Aktivit6t sind diegelb markierten Nucleotide essenziell, die blau markierten sind bedeutungslos. Ein vom 3’-Ter-minus erfolgender Abbau der gr-n markierten Nucleotide verringerte allm6hlich die Aktivit6t,was auf eine stabilisierende Funktion schließen l6sst.

AngewandteChemie

1871Angew. Chem. 2006, 118, 1870 – 1872 � 2006 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.angewandte.de

Pentosen, und speziell Ribose, in derRNA-Welt �ber einen templatvermit-telten Weg gebildet wurden, ergebensich spannende Fragen nach der Art ei-nes solchen Templates, wie es sich imLaufe der chemischen Evolution entwi-ckelt hat und ob es heute noch existiert.

Die beiden hier vorgestellten Ar-beiten liefern wichtige Einblicke in dieZucker- und Ribosesynthese im Rah-men der RNA-Welt-Hypothese. Nat�r-lich werden wie nie erfahren, ob eineRNA-Welt jemals existierte, aber Hy-pothesen dieser Art fordern Wissen-schaftler heraus, �ber chemische Trans-formationen in einer m.glichen RNA-Welt nachzudenken und Experimentezu entwickeln, um ihre Ideen zu testen.Wie bei jeder interessanten Forschungergeben sich aus den neuen Ergebnissenmehr Fragen als Antworten. Nahelie-gende Fragen, ob Ribozyme in der Lagesind, auch komplexere Aldolreaktionenund andere Carbonylreaktionen zu ka-talysieren, oder welche Rolle die Co-faktoren spielen, sollte man schon baldbeantworten k.nnen. Dar�ber hinausexistieren aber �bergeordnete Fragen,die weit schwieriger anzugehen sind,etwa nach der Konstruktion einesselbstreplizierenden k�nstlichen Sys-

tems, das die RNA-Welt nachahmt. Vorallem hier gilt es, nach Antworten zusuchen.

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Schema 3. Gekreuzte Aldolreaktion eines 5’-Glyceryl-DNA-Konjugats A mit einem 3’-Glycoalde-hyd-DNA-Konjugat B, vermittelt durch ein komplement6res DNA-Templat C. Aldolreaktionenwurden unter schwach basischen Bedingungen (pH 8.5) oder in Gegenwart von Aminen als Co-faktoren beobachtet.

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1872 www.angewandte.de � 2006 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim Angew. Chem. 2006, 118, 1870 – 1872