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Allgemeine Methoden:
ZELLE:
Laborgrundlagen ( 11.4.2012)
Lösungen:
Allgemeines:
• Lösung = homogenes Gemisch aus mindestens 2 chemischen Stoffen
• Lösungsmittel (Solvens) meistens Wasser oder ein Puffer ( Puffer ist ein Gemisch aus mehreren Substanzen) / zu lösende Substanz (Solut)
• Limitierender Faktor = Löslichkeit: gibt an, in welchem Umfang eine Substanz (Solut) im Lösungsmittel ( Solvens) gelöst werden kann
o Löslichkeit hängt ab vom eigentlichen Lösungsmittel und von weiten gelösten Substanzen/ Co-Substanzen
o Maximale Löslichkeit ist charakteristisch für jede Substanz (Solut)/ Lösungsmittel (Solvens) –Kombination (-> Löslichkeitsprodukt)
• Gesättigte Lösung -> Suspension: höchstmögliche Menge eines Stoffen ist im Lösungsmittel bis zu Sättigungsgrenze gelöst, weiter Zugabe der Substanz kann nicht mehr aufgelöst werden
• Suspension: heterogenes Stoffgemisch aus mindestens zwei chemischen Stoffen – einer Flüssigkeit und einem festen Stoff- der bis zur Sättigungsgrenze gelöst ist
Eigenschaften von Lösungen:
• PH- Wert:
o Negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration pH= -log₁₀ c (H₃O⁺)
o pH <7 = saure Lösung pH: 7 = neutrale Lösung pH > 7 = basische Lösung
o Messung des pH-Wertes über Indikatoren oder pH-Eletrode
o Ionenstärke: Maß für elektische Feldstärke gelöster Ionen
• Stoffmenge n in mol:
o Quantitative SI-Basisgröße
o Gibt die Anzahl an Teilchen ( Moleküle, Ionen etc.) an
o 1 mol = 6,022·10²³ Teilchen (Avogadro- Konstante)
o n= m= Masse in g M= Molare Masse in
o n= c·V
• Molare Masse M in
o Summe der Masse aller Atome im Molekül bezogen auf 1 mol Stoffmenge
o M = m= Masse in g n= Stoffmenge in mol
!!!
• Konzentration c in :
o Stoffmengenkonzentration: c= =
o Massenkonzentration eines Stoffes i : p(i) = in
o Volumenkonzentration eines Stoffes i : σ(i) = keine Einheit, häufig in %
• Verdünnen einer Lösung:
o c₂= = c₁= Ausgangskonzentration von der zu verdünnenden Lösung
c₂= Endkonzentration nach Verdünnung
V₁ = Ausgangsvolumen vor Verdünnung V₂= Endvolumen
Puffer:
• Verwendung
o Puffer werden verwendet um günstige und konstante pH-Werte und Salzkonzentrationen für die enzymatische Aktivität zu erhalten, Proteine vor der Denaturierung zu schützen und passende Bedingungen für die Kultur von Mikroorganismen und Geweben herzustellen
o Lösungssystem, welches Änderungen des pH-Wertes gegenüber beständig ist und bei Zugabe oder Verlust von Säure oder Base die Änderung minimal hält
o Bsp.: Carbonat-Puffer stabilisiert den pH-Wertes von Blut auf 7,35 – 7,45
o Zusammensetzung : Schwache Säure + korrespondierende Base und Salzen
o Wird über seine Komponenten und den pH-Wert charakterisiert
o pH-Wert ist im geringen Maße temperaturabhängig
• Henderson-Hasselbach-Gleichung
o pH = pKₐ + log ₁₀ ()
o Puffer ist unabhängig von seiner Gesamtkonzentration, solange das Konzentrationsverhältnis Salz/Säure konstant bleibt
▪ Keine wesentliche Veränderung des pH-Wertes bei Verdünnung oder Zugabe geringer Mengen an Säure/Base
o Ermöglicht die Berechnung des Pufferkapazität und die Ermittlung des pH-Wertes (über die analytisch bestimmbaren Konzentrationen von Salz und
Säure und den messbaren pKₐ-Wert), Bei gleicher Konzentration an Salz und
Säure, gilt pH=pKₐ
o Kenngröße / Pufferkapazität : β =
▪ Ausdruck für die Wirkung eines Puffers bezüglich des Zusatzes einer Säure oder Base
▪ Beschreibt die Änderung des pH-Wertes der Pufferlösung in Abhängigkeit vom Säure- bzw. Basezusatz
▪ Puffersystem hat die Kapazität β= 1, wenn sich bei Zugabe von 1 mol H₃O⁺ bzw. OH⁻ Ionen zu 1 Liter Pufferlösung der pH-Wert um eine Einheit ändert
▪ Pufferkapazität hängt von der Gesamtkonzentration des Puffersystems ab -> Je konzentrierter eine Pufferlösung ist, desto größer ist ihre Pufferkapazität
▪ Pufferkapazität wird von der Zusammensetzung des Systems bestimmt: sie erreicht ein Maximum, wenn äquimolare Mengen an schwacher Säure und konjugierter Base enthalten sind (Verhältnis von zwei verschiedenen Molekülen im Verhältnis 1:1) pH-Wert
enspricht dem pKₐ-Wert der schwachen Säure
▪ Biologische Puffer:
▪
!Zentrifugieren:
• Trennung einer Substanz aus einer Suspension (heterogenes Stoffgemisch bis zur Sättigungsgrenze gelöst ) in einem Zentifugalkraftfeld
o Substanz wird häufig vorher durch Fällungsreagenzien ausgefällt
• Trennung von Lösungen ( Bsp.: Trennung von Blut in seine Bestandteile -> Auftrennung nach unterschiedlicher Sedimentationsgeschwindigkeit)
Ansetzen von Lösungen/ Puffern : Beispiele aus dem Praktikum:
• 100 ml einer 60 mM Na₂HPO₄ x 2 H₂O – Lösung ansetzen ( M= 178g/mol)
o 1 Liter -> 178 g (1mol) / : 10 (1000 ml -> 100 ml)
o 100 ml -> 17,8 g (1mol) / x0,06 (1 mol -> 60 mM)
o 100 ml -> 1,068 g (0,06 mol -> 60 mM)
• 100 ml einer 30mM NaH₂PO₄ x 2 H₂O – Lösung ansetzen (M= 156 g/mol)
o 1 Liter -> 156 g (1mol)
o 100 ml -> 15,6 g (1mol) / x 0,03
o 100 ml -> 0,468 g (30 mM -> 0,03mol)
• 50 ml der 60 mM Na₂HPO₄ x 2 H₂O – Lösung und 25 ml der 30mM NaH₂PO₄ x 2 H₂O – Lösung mischen und die Konzentration des entstehenden Puffers berechnen:
o c₃= n= c·V
o c₃= c₃= c₃= = 0,05 M
!Proteinaufreinigung und Bestimmung (18.4.2012)
Hintergrund:
• Proteine können aufgrund ihrer biophysischen Eigenschaften aus Komplexen Gemischen ( Zellextrakte) aufgereinigt werden
o Ionenaustausch – Chromatographie : Auftrennung nach Ladung
!!!!!
oGelfiltration : Auftrennung nach Größe
!!!!!
oAffinitätschromatographie: Bindung von Proteinen an bestimmte Komponenten in der Trennungssäule -> Methode aus dem Praktikum
•Ziel: His – p97 aus dem Zellextrakt zu gewinnen indem man dessen hohe Affinität zu Ni²⁺ ausnutzt, welches in der Waschsäule gebunden vorliegt
•Wegwaschen der ungebundenen Proteine
•Elution durch Imidazol, da dieses mit dem His-p97 um die Bindung mit dem Ni²⁺ konkurriert
•Die Ausbeute und die Anreicherung werden anschließend durch Proteinbestimmung und SDS-Gelelektrophorese geprüft
!!!!Proteinbestimmung nach Bradford:
• Bio-Rad Protein Assay basiert auf dem Farbumschlag ( 465 nm nach 595 nm ) nach Bindung des Farbstoffes Coomassie-Brilliant-Blau G-250 an die basischen und aromatischen Seitenketten ( vor allem Arginin)
• Der Extinktionskoeffizient (wie viel elektromagnetische Strahlung eine spezielle Substanz bei einer bestimmten Wellenlänge absorbiert) des Farbstoff-Protein-Komplexes ist sehr viel höher als der des freien Farbstoffes
• Deshalb kann die Zunahme der Absorption bei 595 nm durch die Bildung des Komplexes gegen das freie Farbreagenz photometrisch gemessen werden
• Ist ein Maß für die Proteinkonzentration der Lösung
• Stärke der Farbreaktion hängt jedoch von Protein ab und ist sehr störanfällig
• Zweck:
o Charakterisierung der Aktivität ( Bindung, Katalyse, biologische Aktivität)
o Charakterisierung der Beschaffenheit ( Sequenz, Modifikation, Struktur)
o Immunisierung
Woraus und Wie?
• Zell- oder Gewebe Lysate
• Kulturüberstände
• Endogen oder heterolog exprimierte Proteine:
o Heterologe Expression:
o Expressionssysteme:
▪ Bakterien
▪ Hefe
▪ Insektenzellen
▪ Säugetierzellen
• Auswahl der Expressionssysteme:
o Löslichkeit der Proteine
o Codon Verständigung ( Baktieren müssen Codon lesen können)
o Giftigkeit (Zelltod)
o Sauberkeit (kann es komplett gereinigt werden?)
o Post-translationale Modifikation
o Menge, Ausbeute
• Pro und Kontra der Expressionssysteme:
!
Elektrophorese (25.4.2012)
Definition:
• Analytische Methode zur Trennung von speziellen Molekülen
Bakterien Hefe Insekten Säugetiere
Vermehrung Schnell Schnell Langsam Langsam
Zellkultur Einfach Einfach Mäßig Komplex
Kosten Gering Gering Mäßig Hoch
Expressionsgeschwindigkeit
Schnell Langsam – Schnell
Langsam – Schnell Mäßig
Faltung Schlecht Mäßig Gut Exzellent
• Grundvoraussetzung: Die zu trennenden Moleküle müssen geladen sein, da sie unter Einfluss eines elektrischen Feldes durch das Gel wandern
• Auftrennung erfolgt nach Größe und Ladung / Das Gel dient als „Sieb“
o Auftrennungsverhalten = umgekehrt proportional zur (log.) Größe des Moleküls
o Positiv geladene Moleküle (Kationen) = wandern zur negativ geladenen Kathode
o Negativ geladene Moleküle ( Anionen) = wandern zur positiv geladenen Anode
Was wird analysiert?
• DNA / RNA
• Proteine
Verfahren:
• Agarose(gelelektrophorese )
o Agarose: Besteht aus glykosidisch verbundener D-Galaktose und 3,6-Anhydrogalaktose
o Dient als interne Matrix, in der DNA- Moleküle in einem elektrischen Feld wandern
o Agarosekonzentration wird der zu analysierenden Nukleinsäure angepasst
• Je kürzer die Ketten desto höher die Agarosekonzentration
o DNA / RNA Analyse mittels Agarosegelelektrophorese
• DNA – Aufbau:
• in regelmäßigen Abständen ist eine negative Ladung vorhaben -> Die DNA wandert zur Anode (+)
• Masse: Ladungsverhältnis ist proportional
• In freier Lösung wandern alle Nukleinsäuren größenunabhängig -> Agarose wirkt als Sieb das große Moleküle mehr bremst als kleine
• Abhängigkeiten der Nukleinsäureauftrennung:
• Agarosekonzentration
• Größe der Nukleinsäure
Agarosekonzentration [%] Kettenlänge [kb]
0,6 1- 20
1,5 0,3 - 6
• Form : Die DNA kann mindestens 3 Formen aufweisen
o Ccc-Form ( circular covalently closed ) -> Superhelikale Forme
o Oc –Form ( open circle) -> relaxierte Form
o Linearisierte DNA
o Jede Form hat die gleiche Masse aber ein anderen gelelektrophoretisches Auftrennungsverhalten
!!
• Nachweis der Nukleinsäure
• Färbung durch Ethidiumbromid
o Interkaliert mit seinen planaren Molekülen zwischen den Basen der DNA-Doppelhelix -> Kanzerogene (Krebserzeugende) Wirkung
o Visualisierung durch Anregung mit UV/blau-Licht bei 300-500nm
▪ Führt zur Emission von Fluoreszenzlicht bei 585nm
• Färbung mit Midori Green
o Interagiert it dem Phosphatrückgrat der DNA -> keine mutagene Wirkung
o Visualisierung mit UV Licht
▪ Emission bei 540nm
• Proteinanalyse mittels Gelelektrophorese
o Analyse durch Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE)
• Matrix = Acrylamid -> polymerisiert unter Freisetzung von Radikalen und wird mit N,N‘-Methylenbisacrylamid quervernetzt
• Initialisierung = Ammoniumpersulfat (APS)
• Katalysator = N,N,N‘,N‘-Tetramethyl-Ethylendiamin (TEMED)
• Native Gelelektrophorese
o Proteine werden in geeigneten Puffer gegeben -> Denaturierung
• Ladung bei Proteinen:
• R = Rest der Aminosäure
• Isoelektrischer Punkt von Aminosäuren und damit auch von ganzen Proteinen ist wichtig
• Puffer für d ie Gele lektrophorese müssen e inen entsprechenden pH-Wert aufweisen, so dass das Protein negativ geladen vorliegen kann
!!
o Vor- und Nachteile der nativen Gelelektrophorese
▪ Vorteil:
• Proteine bleiben nativ und können für weitere Assays genutzt werden
• Native Proteinkonformation kann untersucht werden ( Sekundär-, Tertiärstrukturen und Oligomerisierung)
• Analysen von Modifikationen : Kleiner Änderungen wie Phosphorylierung oder Ausbildung von Disulfidbrücken können beobachtet werden
!!
!▪ Nachteil
• Für jedes Protein muss ein optimaler Puffer (pH-Wert) bestimmt werden
• Analyse von Proteinkomplexen wird aufgrund der Größe und Zusammensetzung sehr schwierig
• Proteingemische können nicht analysiert werden
• Sehr langsame elektr. Auftrennung nötig für die Proteinstabilität
• Diskontinuierliche SDS – PAGE
o Prinzip:
• Um die konstante Ladung der Proteine zu erhalten werden die Proben und das Polyacrylamidgel mit Sodiumdodecylsulfat (SDS) versetzt
• SDS bindet mit den hydrophoben Schwanz an die hydrophoben Regionen der Proteine und richtet die geladenen Kopfgruppen nach außen
o Sekundär,- und Tertiärstruktur des Proteins werden zerstört konstantes Ladung : Masse Verhältnis wird erzeugt
• Proben werden zur weiteren Denaturierung gekocht
• Detergenzien, wie Dithiothreitol (DTT) oder β-Mercaptoethanol werden hinzugegeben, um Disulfidbrücken auf zu lösen
• Zur Optimierung des Auftrennungsverhaltens der SDS-PAGE werden 2 Gele übereinander gegossen und die Probe durchläuft beide Bereiche (diskontinuierliche Auftrennung)
• Grundlagen:
• 2 verschiedene Gele : Sammel-, Trenngel
• 3 verschiedene Puffer: Sammel-, Trenn- und Laufpuffer
• Sammelpuffer: niedrig konzentriertes TRIS/HCL pH: 6,8
• Trennpuffer: höher konzentriertes TRIS/HCL pH:8,8
• Laufpuffer: TRIS/Glycin
•Proteinproben (blau) werden in die Taschen pipettiert
• Sammelgel = niedrige Konzentration an TRIS/HCL (grüne Kugeln)
• Trenngel = hohe Konzentration an TRIS/HCL
!• Im Sammelgel: Glycin (orange) als Zwitterion (neutrale Ladung ) -> viel geringere
Mobilität als das negativ geladene Chlorid (grün)
• Zwischen den Lauffronten des Leitions (Chlorid) und des Folgeions (Glycin) bilden sich wegen der Potentialdifferenz Proteinstapel (blau) -> wandern gleich schnell
!• Trenngel: Änderung des pH-Wertes und der Porengröße
• Glycin liegt negativ geladen vor (Glycinat) -> wandert schneller = Potentialdifferenz hebt sich auf
• Kleinere Poren: Proteinstapel verdichten sich -> werden nach Größe aufgetrennt
o Nachweis von Proteinen:
▪ Coomassie Blue R-250 -Färbung:
• Bindet im sauren Milieu an Proteinen
• Hintergrundfärbung wird durch Essigsäure herausgewaschen
• Nachweisgrenze: 100 ng
▪ Silberfärbung
• Beruht auf der Komplexbildung von Ag⁺-Ionen mit Glutamin-, Asparagin- und Cysteinresten von Proteinen
• Detektion durch Agenzien -> reduzieren die Ag⁺-Ionen zu metallischem Silber
• Nachweisgrenze: < 10 ng
▪ Indirekter Nachweis:
• Western-Blot
o Protein wird auf eine Membran übertragen und mittels spezieller Antikörper detektiert
• Spezielle Gelelektrophoresen wie zB.: 2D- Gelelektrophorese
• Nachweis von Proteinen aus einem großen Gemisch
• Grundlage für Proteom-Analysen
• Unterscheid zur einfachen SDS-PAGE -> es werden zwei Trennverfahren angewandt
o 1. Dimension
• Isoelektrische Fokussierung (IEF)
• Immobilisierter pH-Gradient wird auf einen Gelstreifen aus Polyacrykamid angelegt
• Eine Seite: Arcylamidderivate mit sauren funktionellen Gruppen
• Andere Seite: Acrylamidderivate mit alkalischen funktionellen Gruppen
• Spannung wird angelegt:
o Auf geladene Proteine wirkt eine Kraft die sie zu einer Seite zieht bzw.von ihr wegschiebt
o Entspricht der pH-Wert dem isoelektrischen Punkt so sind keine wirenden Ladungen mehr vorhaben ( Fokussierung)
o 2. Dimension:
• Proben werden nach Molekulargewicht aufgetrennt
•Trennung mittels SDS-PAGE
•Gelstreifen der 1.Dimension wird mit in das Gel gegossen (keine Kämme)
•Nachweis mittels Silberfärbung
!
!Praktikumsskript : Rechenübungen:
• Wie viel NaCl müssen sie einwiegen, um 250 µL einer Lösung der Konzentration 1 herzustellen?
o Benötigte Formel : Massenkonzentration eines Stoffes i : p(i) = in
o V= 250 µL 0,25ml p= 1 wir wollen m wissen
o m= p·V = 0,25ml · 1 = 0,25 mg
o Man benötigt 0,25 mg NaCl
• Wie viel µL eier 100fach konzentrierten Kanamycin-Stammlösung müssen für eine 25 ml Agarplatte verwendet werden, wenn für die Selektion eine 1fache Konzentration erforderlich ist?
o Merksatz: (·Volumen)
o ·25 ml = 0,025 ml 25 µL
• Wie viel Gramm NaCl brauchen Sie, um 250 ml einer 1,16%igen Kochsalzlösung herzustellen?
o Dreisatz: 250 ml = 100% x ml = 1,16 %
o = 2,9 g
o Man benötigt 2,9 g
• Sie haben eine 20%ige und eine 36%ige SDS-Lösung. Wie viel ml jder Lösung braucht man, um einen Liter einer 30%igen SDS-Lösung herzustellen?
o Mischungsdreieck: 20% 36% (30%-20% ; 36% - 30% ) 30% 6 : 10 = 16 Teile benötigt man insgesamt
o 6 Teile 20%ige Lösung von einem Liter Liter = 0,375 L 375 ml
o 10 Teile der 36%ign Lösung von einem Liter Liter = 0,625 L 625 ml
!!!!!!!
!!!!!PCR (2.5.2012)
DNA-Aufbau:
• Doppelhelix
• Zucker-Phosphat-Rückgrat : 5’-P / 3’-OH
• Vier Nukleinbasen: komplementäre Paarung mittels Wasserstoffbrücken ( A-T / G-C)
Ablauf der PCR:
• 3 Phasen Zyklen
o 1. Denaturierung der Doppelstrang DNA ( ca. 94°C)
▪ Wichtig: vollständige Denaturierung zu Beginn
• Zugänglichkeit der Matrizen - DNA
o 2. Anlagerung von Starteroligonukleotiden ( Primer) ( 50°C-60°C)
▪ Wichtig: optimale Anlagerungstemperatur
• Zu hoch : keine Primer-Anlagerung kein PCR-Produkt
• Zu niedrig: unspezifische Anlagerung versch. PCR-Produkte
o 3. DNA-Strangsynthese ( Elongation, ca. 72°C)
▪ Ausreichende Elongationszeit
• Unvollständige Synthese Abbruchfragmente
Replikation
Topoisomerase entspiralisieren den DNA- Doppelstrang Helicasen trennen die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basenpaaren aufgespaltener Bereich = Replikationsgabel Strang in 5‘-3‘ Richtung: nicht codogener Strang: DNA Polymerase verknüpft die komplementären Nukleotide an den vorhandenen RNA-Primer und verknüpft sie zu einem Einzelstrang ( Kontinuierlicher Strang in (3‘-5‘ Richtung) Strang in 3‘-5‘ Richtung: codogener Strang: RNA Primer müssen von der Primerase immer neu gebildet werden, da der Strang Diskontunierlich gebildet werden muss ( in 5‘-3‘ Richtung). Die DNA Polymerase bildet nun wieder die komplementären Nukleotide. Die Primer werden später durch die DNA Polymerase durch Nukleotide ersetzt. Die Lücken die entstanden sind werden von DNA Ligasen geschlossen
• Faustregel 1min für 1.000 bp
▪ Für effiziente DNA – Amplikation zu beachten:
• Keine zu hohe Zyklenzahl ( meist 25 – 30)
o Anhäufung von Fehlpaarunge
• Abschließende Elongation
o Vervollständigung von Teilfragmenten
• Sorgfältiges Arbeiten
o Vermeidung von Kontaminationen
PCR-Programm für das Praktikum :
%
Bestandteile einer PCR:
• Matrizen ( Template ) meiste doppelsträngige DNA-Probe
o Plasmid-DNA
o Genomische DNA
o PCR-Fragmente
o Zellmaterial
• Zwei Starteroligonukleotide ( Primer)
o Meist 18-28 bp
o G/C-Gehalt etwa 50%
o Keine langen Sequenzwiederholungen
o Nicht selbstkomplementär
o Möglichst unique ( nicht verschiedene Bindestellen)
o Möglichst 3‘ G/C Basen
o Ähnliche Schmelztemperaturen (Tm)
o Näherungsformel T(m) = 4 · (G+C) + 2 · (A+T)
• Desoxyribonukleosid- Triphosphate (dNTPs)
o Anhänge an 3‘-OH des Synthesestranges
• Thermostabile DNA-Polymerase
o Taq (Thermus aquaticus)
o Pfu ( Pyrococcus furiosus)
o Verschiedene Aktivitäten z.B.: Proofreading (3‘ 5‘ Exonuklease)
• Puffer
o Optimale Reaktionsbedingungen für die Enymaktivität
• MgCl₂ / MgSO₄
o Dient als Cofaktor
o Erhöht die dsDNA-Schmelztemperatur
o Komplexiert mit Nukleotiden Substrat für Polymerase
o Konzentration auf Reaktionsansatz abgestimmt
▪ Zu wenig : geringere Amplifikationseffizienz
▪ Zu viel : ggf. unspezifische PCR-Produkte
• H₂O:
o Anpassung des Reaktionsvolumens und der Konzentrationen
• Ggf. Enhancer (DMSO, TWEEN-20, Glycerin…)
o Erhöhung der Spezifität
o Inhibierung von DNA-Sekundärstrukturen
PCR-Ansatz im Kurs:
• Plasmid-DNA als Template
• Ca. 600 bp Fragmente
• Test der MgCl₂- Abhängigkeit
Pipettierschema -> Sophie fragen !
!!Anwendungsaufgaben:
• Vervielfältigung spezifischer Sequenzen
o Klonierung, Sequenzierung
• Nachweis bestimmter Sequenzen
o Identifikation von Mutationen
• Genexpressionsuntersuchung
o Analyse von Transkriptleveln in verschieden Geweben
• Medizinischer Diagnostik
o Nachweis viraler/ bakterieller DNA, rechtsmedizinische Spurenanalyse, Genotypisierung
Methoden:
• PCR zu Klonierungszwecken
o Einfügen von Restriktionsschnittstellen mittels PCR
!• Megaprime-PRC
o Verbindung von PRC-Fragmenten mit übereinstimmender Endsequenz
!
• PCR zu Mutantenherstellung
o Einbringen von Deletionen, Insertionen, Mutationen in eine DNA-Sequenz
!!
!• Kolonie PCR
o DNA Amplifikation ausgehend von Gazzellmaterial
▪ Verwendung von wenig Zellmaterial ( Bakterien, Hefen)
▪ Zellaufschluss ( Mikrowelle)
▪ Zufügen des PCR-Mixes ( Bestandteile wie normale PCR, ohne Matrizen-DNA)
▪ Z.B. zu indirekten Identifikation von positiven Klonen, Transformationen
▪ ebenso mit Vollblut oder verschiedenen eukaryotischen Zelltypen möglich (benötigt spezielle Isolierungsmethoden für Nukleinsäuren)
!• Nested PCR
o Zwei aufeinander folgende PCR-Reaktionen
o Minimierung unspezifischer Fragmente
!• Inverse PCR
o Amplikation von unbekannten, genomischen DNA-Sequenzen
o Voraussetzungen:
▪ Bekannte, benachbarte Sequenzen
▪ Restriktionsschnittstellen für 300 – 1.00 bp Fragmente
▪ Erkennungssequenzen für entgegengesetzte Primer
▪ Keine Schnittstellen zwischen den Primern
▪ Herstellung ringförmiger DNA
• Reverse Transkriptase
o Herstellung von copy DNA (cDNA) mittels reverser Transkriptase
!!!!!!!!
!• Real time PCR
o Quantitative PCR
▪ Analyse von gewebe- oder zell (zyklus)abhängiger Genexpression
▪ Bestimmung der mRNA-Level sensitiver, genauer und schneller als mittels Northern Blotting
▪ Detektion mit Hilfe von Fluorophoren
• SYBR-Green als Fluorophoren
o Fluoreszenzstoff, der in dsDNA interkaliert
o Anregung durch kurzwelliges UV-Licht
▪ Emission von längerwelligem Licht ( 530nm)
o Wichtig: kann auch zwischen Primern und nicht spezifischen PCR-Produkten interkalieren
▪ Verwendung von Referenzproben ohne Template DNA ( Hintergrundsignal)
▪ Wichtig:
• Verwendung eines internen Standards (z.B. Actin) mit bekannter mRNA Menge
• Test mehrerer Verdünnungsstufen der Probe ( variierende Menge der Ausgangsmoleküle)
• Analyse nur im exponentiellen Bereich
• Multiplex-PCR
o Schnelle Methode zum Nachweis chromosomaler Aberrationen
o Erfordert Kenntnis der zu untersuchenden Sequenz
o Mehrere Primerpaare in einem Ansatz
!!!!!!!
!!Blotting (9.5.2012)
Übersicht:
- Überblick:
• Elektrophoretisch aufgetrennte Proben von DNA, RNA oder Proteinen werden von einem Gel auf eine Membran transferiert und dort irreversibel fixiert ( immobilisiert)
• Einzige weiterführende Bewegungen sind auf Diffusionsvorgänge während des Blottings zurückzuführen
• Für eine scharf abgegrenzte Detektion sollte man die schnelleren Verfahren vorziehen
- Membranen:
• Unterschiedliche Eigenschaften verschiedener Membran-Typen:
o Nitrocellulosefilter (NC)
▪ Hohe Bindekapazität für DNA und RNA ( 2h, 80°C)
▪ Proteine binden auch jedoch nicht kovalent und nur ein kleiner Anteil des Proteins bleibt haften. Kleinere Proteine wandern durch die Membran
▪ Kleinere Porengröße höhere Bindungskapazität
▪ Nachteil: brüchig – mechanische Instabilität
• Gelatinebeschichtung oder unterstützendes Polyester-Netzwerk als Trägermaterial
▪ Hydrophob: Vor Verwendung mit Wasser anfeuchten
o Nylonmembranen/ aktivierten Nylon
▪ Reißfest
▪ Bindet gut Nukleinsäuren, die man durch UV-Licht kovalent vernetzt
▪ Nach dem Blotten mehrere Nachweise (Hybridisierung)
▪ Hydrophil leichter handhabbar als NC
▪ Puffersysteme mit hoher/niedriger Ionenstärke ( Elektroblotting)
▪ Neutrale/geladene Membranen
▪ Seiten mit unterscheidlichen Bindungskapazitäten
▪ Nachteil: hohe Bindungskapazität (Hintergrund!)
o Polyvinylidendifluoridmembranen (PVDF – auf Teflonbasis)
▪ Hohe Bindungskapazität
▪ Hohe mechanische Stabilität
▪ Hohe chemische Stabilität
▪ Mehrfache Verwendung
▪ Einsatz für direkte Proteinsequenzierung möglich
▪ Zugänglich für Coomassie Brilliant Blue Färbung
• Nachteil: Färbungen nicht reversibel
o Aktiviertes Papier (Diazo-Gruppen)
▪ Vorteil: Kovalente Bindung von Proteinen über primäre Amine
▪ Nachteil: Bindungsmethode mit den meisten Gelelektrophoresesystemen nicht kompatibel
!o Ionenaustauschermembranen
▪ Diethylaminoethly (DEAE) und Carboxymethly (CM)
▪ Ionenbindung kann umgekehrt werden Einsatz zu präparativen Zwecken
▪ Nachteil : Sehr brüchige Membranen
!- Transfer:
• Transferpuffer
o Für die Zusammensetzung des Puffers ist das Ausgangsmaterial entscheidend
o Proteine = alkalischer Puffer
o Nukleinsäuren = saurer Puffer
o Art des Gels muss beachtet werden
• Diffusionsblotting:
o Blotmembran wird auf die Geloberfläche gelegt
o Übertragung der Moleküle erfolgt durch Diffusion aus dem Gel
o Allseitiger Vorgang: 2. Membran unter das Gel legen man erhält einen gespiegelten Transfer
o Temperaturerhöhung = Beschleunigung der Diffusion
• Kapillarblotting
o Standard für RNA/DNA aus Agarose
o Puffer wird über Saugpapier durch das Gel und die Blotmembran gesaugt Moleküle werden aus dem Gel mitgenommen und adsorbieren an der
Membran
o Verschiedene Anordnung:
▪ Einseitig gerichtetes Kapillarblotting auf eine einzelne oder mehrere Membranen
▪ Anordnung gegen die oder mit der Schwerkraft
• Vakuumblotting / Überdruckblotting:
o Modifizierung Kapillarblotting
o Druck=treibende Kraft
o Apparatur mit porösem Träger, auf einer Seite geschlossen:
▪ Unter- oder Überdruck wird erzeugt der den Transferpuffer und die Moleküle durch das Gel auf die Membran treiben
o Vorteil:
▪ Zeitgewinn gegenüber dem Kapillarblotting ( 30- 40 min Blotzeit)
▪ Vermeidung von Rücktransfer
o Nachteil:
▪ Gel kann zusammenbrechen
▪ Teure Apparatur ( Erfahrung erforderlich)
• Elektrophoretischer Transfer (Elektroblotting)
o Für RNA/DNA + Protein aus PAA-Gelen
o Wanderung von Nukleinsäuren und Proteinen in einem elektrischen Feld von dem Gel (Agarose) auf die Membran
o Verfahren:
▪ Tankblotting:
• Hohe Stromstärke
• hohe Salzkonzentration des Puffers für die Übertragung von DNA auf Nitrocellulose
• Starke Erwärmung
• rascher Pufferabbau
▪ Semidry-Verfahren:
• Elektrodenplatten aus Platin oder Graphit
• Geringere Erwärmung
!- Blockierung:
• Um zu verhindern das der Hintergrund der Membran stört, da er noch Bindungskapazität aufweist, werden unbesetzte Bindungsstellen mit
makromolekularen Substanzen besetzt die nicht an der Nachweis Reaktion teilnehmen
• Von Nukleinsäuren:
o Denhardts Puffer
o Enthält heterologe DNA
o Fixierung : UV- Licht, 2h bei 80°C
• Von Proteinen :
o Mehrere Möglichkeiten :
▪ 2 % - 10 % BSA
▪ Magermilch oder 5% Magermilchpulver
▪ § % Gelatine
o Mind. 1h bei 37°C
- Nachweis – Immunoblot & Hybridisierung :
• Herkömmliche / unspezifische Färbemethoden
o Proteine : Allgemeine / direkte Anfärbung von Proteinen ( direkte Protein-Reportergruppen)
▪ Schneller Überblick über die getrennten Proteine
▪ Qualitative Beurteilung des Transferergebnisses
▪ Methodenvalidierung von teuren/aufwendigen spezifischem Nachweis
▪ Färbung der Blotmemben und der darauf befindlichen Strukturen
▪ Protein-Farbkomplex unterschiedlicher Bindungsqualitäten ( irreversibel (bessere Sensivität können jedoch Proteinanalyse beeinträchtigen), reversibel ( Proteine lassen sich weiterverarbeiten))
▪ Nachfolgende Entfärbung: Blotmembran transparent, gefärbte Proteine treten hervor ( Proteinfärbung auch vor Blotting möglich)
▪ Färbemethoden:
• Amidoschwarz,
• Coomassie-Brilliantblau
o irreversibel
o Ergebnis rel. Schnell sichtbar
o Färbelösung stabil
o Keine Hintergrundfärbung
o Alle Oligopeptide werden erfasst ( < 10 – 15 aa)
• Indian-Ink- Methode
o irreversibel
o Nachweisempfindlichkeit beinahe vergleichbar mit Silber-Färbung
• Ponceau S
o Reversibel, geeignet wenn Blots weiterverarbeitet werden sollen
• Fast Green
o Reversibel, vollständig entfärbbar
• Silber Färbung
o Hohe Empfindlichkeit
o Direkt visualisierbar
o Nicht radioaktiv
o Direkt- oder Nachfärbung von getrockneten nicht ausreichend gefärbten Coomassie-Färbungen
o Nukleinsäuren: Allgemeine / direkte Abfärbung von Nukleinsäuren ( direkte Nukleinsäure-Reportergruppen)
▪ Ähnlich wie bei Proteinen
• Silber-Färbung
o Hohe Empfindlichkeit
• fluoreszensassoziierte Systeme
o indirekt visualisierbar
o nicht radioaktiv
o Ethidiumbromid-Färbung (interkaliert in DNA/RNA)
o Acridin.Orange-Färbung: emittiert gebunden an DNA im grünen Farbbreich, an RNA im Orange/roten Bereich ( Differenzierung DNA/RNA)
• Lumineszenz
o Indirekt visualisierbar
o Nicht radioaktiv
o Zeitverzögerte Abgabe von Lichtenergie nach (Licht-) Energieabsorption
o Aequorin
o Phenanthrolin-Komplexe
!
• Spezifische Methoden ( Immuno – Blotting ) und Amplifikationssysteme :
o Einfacher jedoch teurer als unspezifische Methoden
o Gesuchte Strucktur wird mit spezifischen Antikörpern/Hybrid-DNA/RNA direkt detektiert
o Spezifischer Nachweis auf molekularer Ebene
o Direkte/indirekte Systeme
▪ Direkt:
▪ Direkte Immundetektion:
• Grundlage: hochselektive Bindungsfähigkeit der Antikörper
• Direkt an den unspezifischen, kristallienen Fc-Teil des Antikörpers gekoppelte Reportereinheit
▪ Hybridisierung:
• Identifikation einer spezifischen DNA/RNA-Zielsequenz über ein künstlich synthetisiertes, der Zielsequenz komplementäres Oligonukleotid = Gen-Sonde (spezifische Sonde= künstliche DNA-Sequenz)
• Grundlage: Denaturierung von DNA/RNA-Helices ber Erwärmung, Rückbildung bei langsamer Abküklung
• Bei der Abkühlung bleiben die Sonden an der Zielsequenz haften
• Kopplung mit Fluoreszenzfarbstoffen, Lumineszenzfarbstoffen oder radioaktivem Material als Reportergruppe
!!
▪ Indirekt:
• Erstantikörper bzw. Hybridom sind nicht direkt markiert, sondern tragen eine Gruppe, die von Detektionsmechanismen wiedererkannt wird
• Indirekt Methoden werden um Enzym-Amplifikationstechniken erweitert
• Indirekte Reportersysteme:
o Primär-/ Sekundär- Antikörper-Systeme
▪ Antikörper gegen Primär-Antikörper - Zweit-Antikörper aus anderer Spezies oder Probenmaterial (Kreuzreaktionen)
o DIG / Anti-DIG-Systeme
▪ DIG (Digoxygenin)-Primärmarkierung an Erst-Antikörper/Gen-Sonde; Anti-DIG-Antikörper
o Bio/Avidin-Systeme:
▪ Proteine Biotin und Avidin ( Hühnereiweis)/ Streptavidin (synthetisch)von Natur aus hohe Affinität zueinander ( pH >7 Bio-Avidin; pH <7 Bio-Streptavidin)
Southern Blot
• DNA
o 1. Restriktionsverdau von DNA
o 2. Gelelektrophorese der DNA-Fragmente
o 3. Depurinierung mit Säure ( weitere Fragmentierung)
o 4. Fixierung der DNA-Fragmente auf einer Membran mittels alkalischer Lösung
o 5. Kovalente Bindung der DNA an die Membran durch Hitze oder UV-Licht
o 6. Nachweis spezifischer DNA-Fragmente durch Hybridisierung mit markierten Sonden ( Radioaktivität, Fluoreszenz, Chemilumineszenz)
!!Northern Blot
• RNA
• Methode zur Untersuchung der Genexpression anhand des Nachweises von RNA
• Ablauf wie bei Southern – Blot:
o Elektrophorese ( Agarosegele mit Formaldehyd zur Reduktion von sekundären RNA-Strukturen)
o Fixierung der Fragmente auf Membran
o Kovalente Bindung
o Nachweis spezifischer Fragmente mit Sonden
Western Blot
• Proteine
• Immunblot, weil zur Detektion spezifischer Proteine Antikörper verwendet werden
• Spezifität der Antikörper-Antigen-Interaktion ermöglicht die Detektion von Zielproteinen in komplexen Proteingemischen
• Faktoren, die die Blotting-Effizienz beeinflussen
o Elutionseffizienz von Proteinen aus der Gel-Matrix ( Transfereffizienz)
▪ Transfereffizienz: abhängig von der Konzentration an Acrylamid und Quervernetzer sowie der Dicke der Gele es gilt: geringere Konzentration und Dicke = einfacherer Transfer
o Bindungsfähigkeit der Membran:
▪ PVDF-Membran:
• Hohe Proteinbindungskapazität
• Physikalische Beanspruchung
• Chemische Stabilität
▪ Nitrocellulose-Membran
• Im trockenen Zustand brüchig
• Lassen kleine Proteine durch
• Blot-Puffer:
o Enthält Methanol :
▪ Erhöht die Bindung der Proteine an die Membran
▪ Reduziert Anschwellen der Gele
▪ Sorgt für Kühlung
• Ablauf:
o Elektrophoretische Auftrennung von Proteingemischen in Acrylamid-Gelen mit SDS-PAGE
o Elektrophoretischer Transfer der Proteine aus dem Gel auf eine Membran
▪ Wet-Blot/ Tank Blot:
• Puffergefüllte Kammer
• Draht-Elektrode
• Nachteil:
o Schwankungen im elektrischen Feld = unterschiedliche Blotting-Effizienzen
o Großes Puffervolumen benötigt
o Extere Kühlung notwendig
• Vorteil:
o Besserer Transfer großer Proteine
!▪ Semidry:
• Stapel in Puffer getränkter Filterpapiere
• Platten Elektrode
• Nachteil
o Schlechter Transfer großer Proteine
• Vorteil:
o Geringere Schwankungen des elektrischen Feldes
o Geringere Puffermenge
o Keine externe Kühlung
o Geringer Pufferverbrauch
o Blockieren der Membran mit Milch oder BSA
▪ Notwendig um unspezifische Bindungen der Antikörper an der Membran zu verhindern
▪ Absättigung freier Bindungsstellen durch Inkubation mit einem Überschuss an Protein
• 5% BSA oder Milchpulver
o Antikörper-Inkubation
o Detektion: Reversible Visualisierung aller auf der Membran vorhandenen Proteinbanden
▪ Direkt:
• Vorteil:
o Schnell
o Keine Kreuzreaktion durch SAK (sekundärer Antikörper)
• Nachteil:
o Markierung des PAK (Primärer Antikörper) kann seine Immunreaktivität reduzieren
o Teuer (markierter Antikörper für jedes Protein)
o Geringe Amplifikation des Signals
▪ Indirekt:
• Membran wird mit einem PAK inkubiert, der spezifisch gegen ein Epitop des Zielproteins gerichtet ist. Nach mehrmaligem Waschen mit dem Puffer wird die Membran mit einem markierten SAK inkubiert, der den PAK erkennt
• Vorteil:
o Amplifikation des Signals durch SAK
o Vielfalt markierter SAK erhältlich
o Markierung des SAK beeinflusst die Immunreaktivität des PAK nicht
• Nachteil:
o Unspezifische Bindungen des SAK möglich
o Aufwendiger + zeitintensiver
▪ Antikörper-Detektion:
• Primärer Antikörper (PAK)
o Polyklonal (rabbit or goat)
▪ Günstiger
▪ Leicht zu produzieren
o Monoklonal ( mouse or rabbit)
▪ Reinheit und Spezifität sorgen für wenig Hintergrund
!• Sekundäre Antikörper (SAK)
o Wahl abhängig von Tierspezies, in der der PAK generiert wurde
o Gekoppelt mit
▪ Alkalischen Phosphaten (AP)
▪ Peroxidase (HRP)
▪ Radioaktiver Markierung
▪ Fluorophor
▪ !▪ Detektionsmethoden: Markierungsarten für den SAK
• Kolorimetrisch
• Chemilumineszent
• Radioaktiv
• Fluoreszent
▪ Kolorimetrisch:
• Inkubation mit einem Substrat
o Reagiert mit dem Reporterenzym am Antikörper
o Reaktion wandelt die lösliche Form des Substrates in einen unlöslichen Farbstoff der auf der Membran präzipitiert
o Bsp.: BCIP (5-Brom-4-Chlor-3-indoxylphosphat) in Verbindung mit NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid) = blau/violetter Farbstoff
o Proteinlevel werden durch die Intensität der Färbung bestimmt
▪ Chemilumineszent:
• ECL (enhanced chemiluminescence)
• Inkubation mit einem Substrat
o Leuchtet wenn es mit dem Reporter in Kontakt kommt
o Bsp.: Peroxidase
o Luminol als Substrat wird durch H₂O₂ oxidiert
▪ Es entsteht 3-Aminophtalat im Anregezustand, das beim Zurückfallen auf den Grundzustand Licht emittiert
• Nachweis der Lichtreaktion
o Mittels Röntgenfilm
o Durch eine CCD Kamera als digitales Foto
• Analyse durch Intensität der Färbung/Lichtreaktion ( Densitometrie)
▪ Radioaktiv:
• Durch radioaktive Markierung der Antikörper werden keine Substrate benötigt
• Direkte Verwendung eines Röntgenfilmes
• Dunkle Stellen auf dem Film entsprechen den spezifischen nachgewiesenen Proteinbanden
• Immer seltener in der Verwendung da teuer und hohes Gesundheitsrisiko
▪ Fluoreszent:
• Mit Fluoreszenz-Farbstoffen gekoppelte Antikörper
• Anregung des Fluorphors mit Licht
• Nachweis der Emission mittels Imaging System
o Emission kann durch einen Photosensor (CCD-Kamera mit passendem Emissionsfilter) detektiert werden
• Fluoreszenz zählt zu den sensitivsten Detektionsmethoden für Blotting
NMR (16.5.2012)
Grundlagen:
• Proteine Aminosäuren Atome
• Aminosäuren:
o Aufbau
▪ Besitzen ein α-C Atom
▪ Funktionelle Gruppe: Carboxylgruppe ( Coo⁻)
▪ Aminogruppe : H₃N⁺
▪ Variable Seitenkette ( „Rest“)
o Einteilung der Aminosäuren:
▪ Apolare Seitenketten
• Glycin (Gly , G)
• Alanin (Ala, A)
• Valin (Val , V)
• Leucin (Leu, L)
• Isoleucin (Ile, I )
• Methionin ( Met, M)
• Prolin (Pro, P)
• Phenylalanin (Phe, F)
• Tryptophan (Trp, W)
▪ Polar, ungeladen
• Tyrosin (Tyr , Y)
• Serin ( Ser, S)
• Threonin ( Thr, T)
• Cystein (Cys, C)
• Asparagin (Asn, N)
• Glutamin (Gln, Q)
▪ Polar, geladen: Sauer
• Aspartat (Asp, D)
• Glutamat (Glu, E)
▪ Polar, geladen : basisch
• Lysin ( Lys, K)
• Arginin (Arg, R)
• Histidin (His, H)
• Peptid-Bindung:
o Wasserabspaltung zwischen der Carboxylgruppe (Coo⁻) einer Aminosäure und der Aminogruppe (NH₃⁺) der darauf folgenden Aminosäure
o > 100 AS= Protein
o < 100 AS = Peptid
!• Hexapeptid:
o Peptid aus 6 Aminosäuren
!• Struktur von Proteinen:
o Sekundärstruktur:
▪ Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Peptidbindungen
▪ α-Helix oder β-Faltblatt
o Tertiärstruktur:
▪ Wechselwirkungen zwischen Aminosäure-Seitenketten
▪ Wasserstoffbrückenbindungen ( H-Brücken)
▪ Hydrophobe Wechselwirkungen
▪ Ionenbindung
▪ Disulfidbrücken (nur bei Schwefel nur zwischen Cystein)
NMR-Spektroskopie :
• Nuclear Magnetic Resonance
• Aus der Midizin bekannt als MRT (Magnetresonanztomographie)
• Zweck:
o Dient der Strukturaufklärung von Proteinen (Aussehen, Funktion etc.)
o Nähere Charakterisierung von Ligandenbindung an das Zielprotein (Welche AS sind an der Bindung des Liganden beteiligt, Wie bindet der Ligand, Was ist der Mechanismus)
o Medikament Entwicklung, Pflanzenschutz etc.
!!
• Wie funktionier die NMR
o Beruht auf der magnetischen Eigenschaft der Atomkerne
o Für die NMR benutzt man nur halbzahlige Spins für auswertbare Ergebnisse
o Man benötigt die Abstände zwischen den Protonen der Aminosäuren der Peptidkette
o Aufnahme von Spektren die die Abstandinformationen liefern eindeutige Zuordnung der sichtbaren Signale
o Jedem Signal im Spektrum wird eine Kopplung zwischen zwei Protonen zugeordnet
▪ Voraussetzung Primärsequenz des Peptids/Proteins ist bekannt
• NMR- Spektren:
o 1D-, 2D-, 3D- und 4D Spektren
o Von Bedeutung sind die 2D-Sprektren
▪ COSY ( Correlated Spectroscopy)
• Kopplung von 2 Protonen über maximal drei Bindungen
▪ TOCSY ( Total Correlated Spectroscopy)
• Kopplung von 2 Protonen über meist das ganze Spinsystem
▪ NOESY ( Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy)
• Kopplung von 2 Protonen über den Raum wenn beide maximal 5 Å (= 10⁻¹²) voneinander entfernt sind
o Tabelle:
!o Durch COSY+TOCSY kann man die einzelnen AS im Spektrum erkennen
o Für die sequentielle Einordnung in die Peptidkette benötigt man das NOESY
o Regeln:
• 1. Ausgehend von HA/NH Signal sucht man nach links/rechts im Spektrum nach reinem NOESY –Signal danach nach oben /unten nach dem nächsten HA/NH Signal, dann bewegt man sich in Richtung C-Terminus ( )
• 2. Ausgehend von HA/NH Signal sucht man oben /unten im Spektrum nach einem reinen NOESY-Signal danach nach links/rechts zu dem nächsten HA/NH Signal, dann bewegt man sich in Richtung N-Terminus ( ↑)
Praktikum:
"
!Photometrie ( 23.5.2012)
Licht: Elektromagnetische Wellen
• Besteht aus elektromagnetischen Wellen ( em-Wellen= kommen durch Überlagerung von einem magnetischen Feld ( B-Feld) und einem elektrischen Feld ( E-Feld) zustande.
• Em-Wellen haben eine charakteristische Frequenz bzw. eine dazugehörende Wellenlänge
• Breiten sich mit Lichtgeschwindigkeit c aus ( 300.000 m/s)
• Wellen können im für den Menschen sichtbaren (400-700nm) oder unsichtbaren (unterhalb von 400 und oberhalb von 700 nm ) Bereich liegen
• 400 nm : Übergang aus dem ultravioletten (UV) ins violette Licht
• 700 nm : Übergang von rotem Licht ins Infrarote Licht ( IR)
• Verwendung in der Chemie:
o Substanzen/ einzelne Atomgruppen oder Bindungen sind in der Lage eine bestimmte Wellenlänge zu absorbieren ( verschlucken)
o Wie viel Licht absorbiert wird hängt von der Substanz und der Anzahl der bestrahlten Moleküle ab
o Bei den betrachteten Elektronenübergängen sind stehts die Laporte-Regeln zu beachten:
!o Laporte-Regeln:
▪ 1. Spinregel: Gesamtspin muss erhalten bleiben
• Bsp.: Übergänge zwischen verschiedenen Spinmultiplizitäten sind verboten
▪ 2. Verbot von Übergängen gleicher Parität
• Bsp.: Verboten : Übergang 3s 4s erlaubt : Übergang 3s 3p/4p Verboten: Übergang gerade gerade (Orbital)
▪ 3. Überlappungsregel: nur bei ähnlicher Symmetrie und Größe
Bauweise Spektralphotometer:
%
Lambert-Beersche Gesetz:
• E (λ) = -lg () = ε( λ) · c · d
o I₁ = Intensität des transmittierten Lichtes
o I ₀= Intensität des einfallenden ( eingestrahlten ) Lichtes
o c = Konzentration der absorbierenden Substanz in der Flüssigkeit (typische Einheit: mol · dm⁻³ oder )
o ε( λ) = dekadischer Extinktionskoeffizient ( spektraler Absorptionskoeffizient) ber der Wellenlänge λ ( Für die absorbierende Substanz spezifische Größe, die vom pH-Wert oder vom Lösungsmittel abhängen kann
o d =Schichtdicke des durchstrahlten Körpers
• Abnahme der Lichtintensität beim Durchqueren eine Probelösung mit der Konzentration c :
o I₁ = I₀e⁻ᵋ*ᶜᵈ
o Umformung: -ln( )= ε*cd
o Aus ε* wird : ε= lg(e) ε* ≈ 0,434 ε*
!!!!!L-LDH aus Kaninchenmuskel:
• Katalysierte Reaktion Pyruvat + NADH + H⁺ ↔ Lactat + NAD⁺
• Photometrische Aktivitätsbestimmung:
• Temperatur: RT
• Wellenlänge : 340nm
• Aktivität wird als dE/min gemessen
• Assay-Zusammensetzung:
o 50 µl NADH-Lösung (10 mg/ml)
o 50 µl Pyruvat Lösung ( 0,1 M)
o 7,5 µl Probe
o 892,5 µl Imidazol-Puffer 0,1M pH: 6,5
TIM aus Kaninchenmuskel:
• Katalysierte Reaktion : GAP ↔ DHAP
• Indikatorreaktion: DHAP + NADH + H⁺ ↔ Glycerin-3-Phosphat + NAD ⁺ + GDH aus Kaninchenmuskel
• Photometrische Aktivitätsbestimmung
• Temperatur: RT
• Wellenlänge : 366 nm
• Assay Zusammensetzung:
o 75 µl GAP-Lösung (0,1M)
o 5 µl NADH Lösung (0,2M)
o 3 µl GDH Lösung ( 260 Units/ mg Protein; 10 mg/ml)
o 5 µl Probe
o 912 µl 50mM Hepes-Puffer , pH = 7,0
Brandford-Test:
• Farbstoff Coomassie-Brilliant-Blue G-250 ( CBBG) bildet in saurer Lösung mit kationischen und unpolaren Seitenketten von Proteinen Komplexe
• Die ungebundene (kationische) rote Form des Farbstoffes hat im Absorptionsspektrum ein Maximum bei 470 nm
• Durch die Komplexbildung mit einem Protein wird der Farbstoff in seiner blauen, unprotonierten, anionischen Form stabilisiert und das Absorptionsspektrum verschiebt sich auf 595 nm
• Extinktionskoeffiezient des Komplexes ist höher als der des freien Farbstoffes Absorption kann mit hoher Empfindsamkeit gegen die es freien Farbreagenz photometrisch gemessen werden und ist ein Maß für die Proteinkonzentration der Lösung
• Pipettierschema: + 200 µl Brandford Reagenz Gut durchrühren
15 min. bei RT stehen lassen Bei 595 nm vermessen
!Kalibrierungskurve: Absorption bei 595nm gegen die Konzentration c(BSA) in [µg/ml]
"
Zählkammer nach Thoma:
"
ORGANISMUS:
Schnitt- und Färbemethoden von Geweben ( 30.5.2012)
Was ist Histologie:
• Lehre von Geweben
• Mikroskopische Anatomie
• Feinbau der Organe
• Wirkungsgefüge des Organismus
Zweck:
• Medizinische Diagnostik
• Pathologie
• Gerichtsmedizin
• Grundlagenforschung
!Ablauf:
• Haltbarmachung und Aufarbeitung des Gewebes
o Fixiermethoden:
▪ Erhaltung des naturgetrauen Zustandes des Objektes durch die Verhinderung des Zerfalls
▪ Haltbarmachung von Geweben mitteln Vernetzung der im Präparat enthaltenen Eiweiße
▪ Autolytische Vorgänge nach dem Tod werden verhindert
▪ Zell- und Gewebsstrukturen bleiben möglichst natürlich erhalten
▪ Härtung des Materials
▪ 2 Methoden:
• Immersionsfixierung:
o Probe wird in Fixierlösung eingelegt
o Bei kleinen, gut permablen Gewebsproben
• Perfusionsfixierung:
o Organ wird über das eigene Gefäßsystem mit Fixierlösung durchspült und fixiert
o Für große oder flüssigkeitsgefüllte Organe wie Herz, Hirn etc.
o Nur beim lebenden, betäubten Organismus möglich
▪ Fixierungsmittel:
• Formalin ( 4% neutrale Formaldehydlösung)
o Quervernetzung und Denaturierung der Proteine
o Formaldehydmolekül (HCHO) wird an Proteine gebunden und bildet Methylbrücken (-CH₃₋) zwischen Aminosäureketten, dabei wird das Formalin verbraucht
o Nachteil:
▪ Lipide und nicht mit Proteinen assoziierte Kohlenhydrate werden nicht vernetzt
• Glutaraldehyd
o Gleiche Funktion wie Formalin, stärkere Quervernetzung
• Alkohol
o Wasserentzug bewirkt Fällung der Proteine ohne Denaturierung
o Permeablisiert Membranen
o Nachteil:
▪ Härtung und Schrumpfung des Gewebes
• Salzbildner: Sublimat (HgCl) Pikrinsäure
o Salzkristallbildung im Gewebe bewirkt Denaturierung der Proteine, rasche Fixierung von Oberflächen
o Optimale Erhaltung antigener Strukturen
o Nachteil:
▪ Schlechte Durchdringung des Gewebes
!!
o Einbettung
▪ Fixierte Gewebeproben werden in ein Lösungsmittel gebracht
▪ Völliger Wasserentzug und Lipidlösung
▪ Nachteil: Artefaktentstehung, das Objekt kann schrumpfen oder zerreißen
▪ Anforderung:
• Um dünne und gleichmäßige Schnitte anfertigen zu können muss das Material Stabilität und gleichmäßige Konsistenz aufweisen
▪ Einbettungsmedien:
• Parafin
o Gute Durchdringung des Gewebes
o Schnitte bis zu 5-8 µm dünn möglich
o Gute histologische Beurteilung
o Nachteil:
▪ Entwässerung des Gewebes
▪ Parafin ist nur in organischen Lösungsmitteln löslich
• Kunstharz ( Methacrylat)
o Sehr dünne Schnittdicken (1-2 µm)
o Gut geeignet für harte Gewebe
o Nachteil:
▪ Entwässerung des Gewebes
▪ Spezialmesser nötig
▪ Nur für wenige Färbemethoden und nicht für Immunhistochemie geeigent
• Gelatine
o Wasserlöslich
o Gute und schnelle Durchdringung des Gewebes
o Kultivierung des Gewebeschnittes möglich
o Nachteil:
▪ Nur sehr dicke Schnitte möglich
• Alternativ: Kryomikroskopie
o Frische Organstücke werden in flüssigen Stickstoff eingebracht
o Komponenten bleiben in natürlicher Konformation erhalten
o Schnelle Methode ( z.B. bei einer Operation)
o Kein Wasserentzug
o Gut für Immunhistologie geeigent
o Nachteil:
▪ Nicht für harte Gewebe geeignet
▪ Schlechte Morphologie der Gewebe
o Schneiden
▪ Für mikroskopische Untersuchung und eine gute Auflösung des Gewebes
▪ Schneiden mit dem Mikrotom („klein schneiden“)
▪ Verwendete Mikrotome hängen von der Einbettungsart ab:
• Schlitten- und Rotationsmikrotom:
o Schnittdicke : 1-60 µm
o Einbettungsmedium: Parafin
• Ultramikrotom:
o Schnittdicke: 0,5 – 0,01 µm
o Einbettungsmedium: Kunstharz
• Kryomikrotom:
o Schnittdicke: 5 – 100 µm
o Für Gefrierschnitte
o Eindecken
▪ Dient der Konservierung des gefärbten Schnittes
▪ Verhindert Austrocknung
▪ Erleichtert die mikroskopische Analyse durch spezielle Licht brechende Eigenschaft von Deckglas und Eindeckmedium
▪ Entwässerte Präparate:
• Eindeckung mit Kunstharz
▪ Wasserhaltige Präparate:
• Eindecken mit Glycerin und Glycerinderivaten
• Färbemethoden
o Schnitt wird zunächst durch z.B. Xylol entparaffiniert und in Wasser eingebracht, da die meisten Farben wässrige Lösungen sind
o Die Farbstoffe werden mit unterschiedlicher Affinität aufgenommen
o Elektrostatische Kräfte zwischen dem Farbstoff und den Zell- und Gewebekomponenten spielen eine entscheidende Rolle
o Färbemethoden:
▪ Chemische Färbungen
• Farbstoff und Substrat gehen eine chemische Bindung ein (z.B. Eisennachweis Fe² bildet mit Kaliumhexacyanidoferrat ein unlöslichen Farbstoff)
▪ Physiko-chemische Färbung:
• Bindung des Farbstoffes an Gewebe aufgrund unterschiedlicher Ladungen
• Bindung ist von pH-Wert der Farblösung abhängig (Bsp.: ein alkalischer Farbstoff färbt in saurer Lösung nur die stark sauren Strukturen : Kerne)
▪ Progressive Färbung:
• Schnitte inkubieren in der Färbelösung bis sie ausreichend gefärbt sind
▪ Regressive Färbung:
• Schnitten werden überfärbt und dann der Überschuss an Farbe ausgewaschen ( Differenzierung)
▪ Succedanfärbung:
• Mehrere Farbstoffe färben nacheinander verschiedene Strukturen des Gewebes
▪ Simultanfärbung:
• Eine Farblösung enthält mehrere Farbstoffe die gleichzeitig färben
▪ Endpunktfärbung:
• Zeitunabhängige Färbung von Teilstrukturen aufgrund ihrer Ladung und dem pH-Wert der Farblösung
!
!!
o Hämatoxylin-Eosin-Färbung
• Hämatoxylin
o Natürlicher, farbloser Pflanzenfarbstoff aus Blauholz
o Wird durch Oxidation in Hämatein überführt
o Hämatein ist ein saurer Farbstoff mit gelb-rötlicher Färbung
o Durch Zugabe von Metallionen Entstehung von positiv geladenem Hämalaun, das bei einem pH-Wert über 3 blau gefärbt ist
o Hämalaun ist basophil und bindet an negativ geladene Strukturen (z.B. Zellkerne (DNA)
• Hämalaun wird progressiv gefärbt, beim Erreichen des gewünschten Färbegrades wird die Färbung abgebrochen
• Hämalaun ist positiv geladen und bindet an die sauren Bestandteile der DNA Kernfärbung
• Eosin:
o Eosin Y- Eosin G
▪ Wasserlösliches Eosin
▪ Schwachsauer und gelb
o Eosin S
▪ Wasserunlöslich/ alkohollöslich ( s= Spritlöslich)
▪ Hohe Lichtbeständigkeit
▪ Wird in 70%igen ETOH gelöst
o Eosin ist rot-oranger azidophil und wird von positiven Ladungen angezogen ( z.B. Kollagen, Cytoplasma)
• Eosin wird regressiv gefärbt, d.h. erst überfärbt und dann in Wasser differenziert
• Eosin ist negativ geladen und bindet sich an die positiven Gewebsbestandteile ( Proteine) Plasmafärbung
▪ Ergebnis: Kerne blau --- Hintergrund rosa / rot
!!!!!!
!!
o Toluidinblau Färbung
▪ Basischer Thioninfarbstoff
▪ Endpunktfärbung durch elektropolare Anlagerung des Farbstoffs im alkalischen Milieu an saure Strukturen
▪ Metachromasie:
• Schwach saure Bestandteile des Zytoplasmas färben sich in einer vom Farbstoff abweichenden Farbe
▪ Zellkerne blau --- Cytoplasma violett
• Immunhistochemische (Antikörperfärbung) Nachweismethoden
o Zweck:
▪ Identifikation der Lokalisation und Verteilung eines Antigens ( Proteins) im Gewebe
▪ Identifikation von infektiösen Erregern
▪ Selektive Darstellung bestimmter Zelltypen zu Beurteilung derer Häufigkeit und Verteilung im Gewebe
▪ Klassifizierung und Diagnose von Tumoren
▪ Bestimmung von prognostischen und prädiktiven Faktoren
o Aufbau eines Antikörpers:
▪ Fab :
• variabler Teil
• bindet an das Antigen
• 2 Antigenbindungsstellen
▪ Fc:
• Konstanter Teil
• Bindet an die Membran der Makrophagen und aktiviert die Immunantwort
• Spezifität des Fc Fragments unterscheidet sich zwischen den Spezies dient zu Bestimmung der Spezies
o Direkter / Indirekter Antikörpernachweis:
!• Indirekter Nachweis mittels Peroxidase-Anti-
Peroxidase Nachweis:
o benötigt 2 Antikörper
o Sekundärer Antikörper ( Brückenantikörper) wird in einer anderen Spezies hergestellt
o Er erkennt das Fc Fragment des primären Antikörpers als Antigen
o HRP: Meerrettich Peroxidase Reaktion :
▪ Setzt durch Oxidation ein farbloses Substrat in einen Farbstoff um, der das Präparat in der Region des gebundenen Antikörpers durch Niederschlagsfärbung färbt
!• Indirekter Nachweis eines Antigens über Biotin-Avidin Komplexe
• Avidin:
oTetrameres Glykoprotein aus Hühnereiern
oBindet Biotin
▪ Biotin:
• Vitamin aus dem B-Komplex
• Vorteil:
o Verstärkung der Antikörperfärbung
!!!!
• Molekularbiologische Nachweismethoden
o In situ Hybridisierung:
▪ Zweck:
• Direkte Lokalisation von Gegen und anderen DNA-Sequenzen in Chromosomen
• Direkter Nachweis von RNA ( und damit Genexpression) in Geweben und Zellen
• Nachweis von Krankheitserregern ( .Viren) in Geweben und Zellen
• Identifizierung von Chromosomen durch spezifisches Anfärben
• Molekularbiologische Methode, um Nukleinsäuren ( DNA, RNA) in Geweben, einzelnen Zellen oder auf Metaphase-Chromosomen nachzuweisen
•Prinzip:
o radioaktiv
o Künstlich hergestellte Sonde aus einer Nukleinsäure wird über Basenpaarung an die nachzuweisende Nukleinsäure gebunden (Hybridisiert)
!o Whole Mount in situ Hybridisierung:
▪ Nachweis für Genexpression im gesamten Organismus
▪ Nur für Embryonalstadien verwendbar
▪ Keine gute Durchdringung des Gewebes
o Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH):
▪ Nachweis von numerischen Chromosomenaberrationen und strukturellen Chromosomenveränderungen wie Translokation, Deletionen oder Amplifikationen in zytologischen Ausstrichpräparaten und histologischen Schnittpräparaten
▪ FISH-Technik findet primär in Krebsforschung und –Diagnostik Anwendung
!• Markierung der DNA:
o Radioaktive Markierung:
▪ ³²P
▪ ³⁵S
▪ ³H
o Nichtradioaktive Markierung:
▪ Biotin
▪ Digoxigenin
▪ Fluoreszenz
!• Praktischer Teil:
!!!!!!!
!!!!!Verhaltensbeobachtungen (6.6.2012)
• Was ist Ethologie?
o Kontrolle und Ausübung von Bewegungen oder Signalen, mit denen ein Organismus mit Artgenossen oder anderen Komponenten seine belebten und unbelbten Welt interagiert
o 3 Fragen der Ethologie:
▪ 1. Wie verhält sich das Tier?
• Deskriptive Ethologie (Beschreibend)
▪ 2. Wie wird sein Verhalten gesteuert?
• Proximate Mechanismen Explikative Ethologie (Erklärung
▪ 3. Warum verhält es sich so?
• Ultimate Funktion
o 4 Fragen in der Ethologie:
▪ 1. Wie verhält sich das Tier und wie wird sein Verhalten gesteuert?
▪ 2. Wie entwickelt sich das Verhaltensmuster
▪ 3. Warum verhält es sich so?
▪ Was ist der phylogenetische Ursprung?
o Wie wird beobachtet oder gemessen?
▪ Wie denkt der Beobachter? Was erwartet er?
▪ Was weiß der Beobachter?
▪ Was kann/will er registrieren?
▪ Objektivität durch:
• Systematische Datenaufnahme
• Objektive Auswertung
• Falsifizierbarkeit der Hypothese (sonst Dogma)
▪ Hypothese
• Vorläufige Antwort auf eine Frage
• Versuchsweise Erklärungen
• Vorhersagen auf dem Deduktions-Prinzip einer „Wenn … dann“-Logik
• Eine gute Hypothese muss falsifizierbar und sparsam sein
o Prinzip der Einfachheit:
▪ Annahme möglichst weniger, einfacher Prinzipien, Gesetze, Regeln des Naturgeschehens
• Testen von Hypothesen
o Beobachtung Fragestellung Hypothese Vorhersage Test der Hypothese Bewertung Vorhersage Bestätigt? (Nein Zurück zu Fragestellung oder Hypothese) / Ja Neugier befriedigt? (Nein zurück zu Test der Hypothese) / Ja Neues Thema
• Voraussetzung:
o Kenntnis der Systematik
o Recherchen
o Geduld, Zeit
o Reflexion von Problemen
▪ Theorie:
• System wissenschaftlich begründeter Aussagen zur Erklärung bestimmter Tatsachen oder Erscheinungen und der ihnen zugrunde liegenden Gesetzmäßigkeiten
!Probleme/ Überlegungen:
• Ethische, juristische Überlegungen
• Vermeidung von Artefakten
o Anwesenheit des Beobachters?
• Opel- Field-Test
• Kluger Hans Effekt
o Labor vs. Freiland
• Stichprobengröße und Statistik
• Kontrollversuche und Blindversuche
• Unterscheidbarkeit der Tiere
o Markierung
o Telemetrie
o Natürliche Identifizierungsmerkmale
Disziplinen der Verhaltensbiologie
• Deskriptive Ethologie ( Wie verhält sich das Tier?)
o Ethogramm = Verhaltensrepertoire
▪ Verhaltensweisen erkennen und benennen
▪ Katalogisierung/ Gruppierung
• Routine:
o Schlafen, Putzen (Selber/Durch andere), Nahrungsaufnahme, Trinken, Exkretion, Koprophagie, Einfache Bewegung, Wachsamkeit, …
• Paarung, Fortpflanzung, Brutpflege:
o Partnersuche, Werben, Kopulation, Säugen oder Fütterung, Brutfürsorge, …
• Sozialverhalten:
o Agonistisches Verhalten ,Revierverteidigung, Rangordnung, Kooperation, Spielen, …
• Abberantes ( pathologisches) Verhalten:
o Hospitalismus, Desinteresse, Anzeichen von Stress
▪ Beschreibung von Verhaltensweisen:
• Möglichst objektive Formulierung
• Keine interpretierende Beschreibung
Hilfsmittel:
• Einfache Hilfsmittel
• Technik
o Videoüberwachung ( Zeitraffermodus, Infrarotkamera) , Endoskop, Licht-oder Ultraschallschranke, Transponder und Lesegeräte, Telemetrie, Tonbandgerät/digitales Aufnahmegerät, Räumliche Orientierung: Labyrinthe, Emlen-Trichter etc.
!Messgrößen:
• Latenzzeiten
• Dauern
• Häufigkeiten
Methoden der Registrierung:
• Kontinuierliche Datenregistrierung
• Intervall-strukturierte Registrierung
o Momentregistrierung
o One-zero sampling
o Ad libitum Registrierung
• Gruppenbeobachtung L= Laufen, R= Ruhen, F=Fressen
o Fokustierbeobachtung
o Scan sampling ( Momentregistrieung)
o Behavior sampling ( One-zero sampling)
Beobachtungsanalyse
• Black-Box System
o Zeitlicher Zusammenhang
o Starre oder variable Beziehung
o Problem: Korrelation
Vergleichende Ethologie:
• Analogie x Homologie
• Konvergenz x Divergenz
• Phylogenische Analyse
Experimentelle Ethologie:
• Manipulation
• Attrappen
• Labyrinthe
• Spontanes Verhalten
o Wahlpräferenzen
• Induziertes Verhalten
o Lernen
Verhaltensphysiologie:
• Stoffwechselphysiologie
o O₂ - Verbrauch, EKG
o Manipulation (Kältestress, Wärmestress, Hunger)
Ethoendokrinologie:
• Hormonanalyse ( Blut, Urin, Fäzes)
• Kerrelation mit Verhalten
o Jahreszeitliche Uterscheide
o Paarungsverhalten
o Dominante gegen submissive Tiere
o Stress
Mulle:
• Systematik:
o Ordnung: Rodentia
▪ Unterordnung: Hystricognatha
• Familie: Bathyeridae ( Sandgräber)
o Gattung:
▪ Strandgräber ( Bathyergus)
▪ Graumulle ( Fukomys/ Cryptomys)
▪ Blessmulle ( Georhychus)
▪ Erdbohrer ( Heliophobius)
▪ Nacktmulle ( Heterocephalus)
• Nacktmulle und Graumulle leben eusozial ( Staatenbildung):
o Reproduktive Arbeitsteilung
o Nachkommen: lebenslange Philopatrie ( Brutortstreue, Brüten am selben Ort)
o Nachkommen helfen bei der Aufzucht jüngerer Geschwister
• Unterirdische Lebensweise sinnesbiologische Anpassung?
o Nahrungssuche: Mulle fressen z.B. Möhren immer nur an der Spitze an
o Visuelle Fähigkeiten
▪ Subterrane Säugetiere : funktionell blind?
• Präferenz für Nestbau in dunklen Kammern
• Graumulle unterscheiden Licht und Dunkel
o Raumorientierung bei unterirdisch lebenden Graumullen
▪ Nutzen sie das Erdmagnetfeld zur Orientierung?
• Sozialsystem Unterscheid zwischen reproduktiven und nichtreproduktiven Tieren?
o Reproduktive Graumulle leben länger als nichtreproduktive
o Potenzielle Faktoren
▪ Nahrung ? Labortiere bekommen alle das selbe Futter
▪ Aktivität? Abhängig vom Alter und nicht von der Reproduktivität
▪ Dominanzverhalten?
▪ Ruhemetabolismus ( Sauerstoffverbrauch) ?
▪ Telomerverkürzung?
!!!!!!!!ÖKOSYSTEM:
Fisch (13.6.2012)
Parasiten
• Was ist ein Parasit?
o Griech. Para = Bei , Sitos = Essen
o Einfache Definition : Parasiten sind Lebewesen, die in oder auf einem artfremden Organismus leben, von ihm Nahrung beziehen und ihn schädigen“
o Direkte trophische Interaktion:
▪ Wirte werden vom Parasiten geschädigt
▪ Parasiten profitieren vom Wirt ( meist abhängig von diesem) und bringen ihn in der Regel nicht um
o Bsp.: Bandwurm im Darm
▪ Vorteile:
• Dauerhafte Zufuhr vorverdauter Nahrung
• Rel. Konstanter Lebensraum
▪ Nachteile:
• Sauerstoffarmes Milieu
• Verdauungsenzyme
• Extremer pH-Wert
• Hohe Osmolarität
• „Strömung“
• Immunabwehr des Wirtes
• Partnerfindung schwierig
o Arten von Parasiten:
▪ Protozoische Parasiten = einzellige Parasiten
▪ Metazoische Parasiten = mehrzellige Parasiten
▪ Ektoparasiten = leben auf dem Wirt
▪ Endoparasiten = leben im Wirt
o Lebenszyklen:
▪ Monoxenisch: nur ein Wirt beteiligt
▪ Heteroxen : 2 oder mehr Wirte
▪ Begiffe:
• Wirt:
o Organismus der Nahrung und Lebensraum für einen anderen Organismus darstellt
• Endwirt:
o Wirt in dem sie sexuelle Fortpflanzung stattfindet
o Geringere Pathologie als im Zwischenwirt
• Zwischenwirt:
o Entwicklung des Parasiten
o Keine sexuelle Fortpflanzung
o Oft tödlich für den Wirt
• Paratenischer Wirt:
o Keine Entwicklung
o Akkumulation von infektiösen Stadien
• Vektor:
o Häufig ein steckendes Insekt
o Übertragung von Parasiten ( aber auch Viren, Bakterien)
!▪ Fakten:
• 50 % der Pflanzen und Tiere leben parasitisch in einem Entwicklungsstadium
• 100 % der Pflanzen und Tierarten sind parasitiert
• Mehr als 100.000 der ca. 1,5 Mio. Metazoenarten sind Parasiten
• 342 helminthische (Würmer) Parasiten können Menschen infizieren
• 50 % der Weltbevölkerung ist mit einer Vielzahl an Parasiten infiziert
Parasiten im Fisch:
• Plathelminthes ( Plattenwürmer)
o Wenige freilebende Arten
o Viele Endoparasiten
o Ca. 14.000 Arten viele humanpathogene
o Klassen:
▪ Turbellaria:
• Freilebend mit Wimpernkleid
• Räuberisch
▪ Trematoda:
• Endoparasit
• Rel. Klein ( ca. 1cm)
• Meist 2 Saugnäpfe
• Dorsoventral abgeflacht
• Generations- und Wirtswechsel
• Komplizierte Zyklen
▪ Monogenea:
• Ektoparasit bei Fischen und Amphibien
• Leben auf Haut und Kiemen
• Haftapparat : Haken
• Sehr klein 0,03 – 2mm
▪ Cestoda:
• Endoparasit
• Rel. Groß
• Haftorgane am Kopf
• Polyzoisch = Körper ist unterteilt in viele Glieder
• Adulte Tiere leben im Darm, Plerocercoid-Larve in Leibeshöhle
• Wirts- aber kein Generationswechsel
▪ Acanthocephale ( Kratzwürmer)
• Hakenbewährte Proboscis ( Rüssel)
• Eine cm lang
• Gelblich
▪ Nematoden ( Fadenwürmer)
• Meist drehrund
• Unsegmentiert
• Adulte im Darm, Larven in Organen oder Muskulatur
▪ Parasitische Crustacea:
• Karpfenlaus
!!Praktikum:
• Blut untersuchen
o Trypanosomen
• Fischart bestimmen
o Altersbestimmung:
▪ Wachstumszonen auf den Schuppen
▪ Unterscheidung zwischen Sommer- und Winterwachstumszonen
• Dunkle Bereiche = Winterwachstum
• Heller Bereiche = Sommerwachstum
▪ Sommerwachstumszonen werden gezählt ( Zonen nicht Ringe)
• Untersuchung von Haut und Flossen
o 1. Makroskopische Untersuchung auf Ektoparasiten
▪ Fischegel (Piscicola spec.)
• Bis 5 cm groß
• Zwei Saugnäpfe
• Zwei Augenpaare
• Segmentiert
• Annelida ( Ringelwürmer)
▪ Karpfenlaus (Argulus spec.)
• Einige Millimeter
• Zu Haftscheiben umgewandelte Mandibeln
• Crustacea (Krebstiere)
▪ Erreger der Weißpünktchenkrankheit (Ichthyophirius multifiliis)
• Weiße Pünktchen auf der Fischhaut
• Kugelförmiger Ciliat ( Wimperntierchen)
• Hufeisenförmiger Makronucleus
o 2. Hautabstrich
▪ Mikroskopische Untersuchung
• Trichodina spec.
o 100 x fache Vergrößerung
o Ufoförmiges Aussehen
o Ciliat ( Wimperntierchen)
• Ichthyobodo ncator
o 100 x – 400 fach
o Nur bei frisch getöteten Fischen und starkem Befall
o Flagellat (Geißeltierchen)
▪ Makroskopische Untersuchung
• Gyrodactylus spec.
o Zweizipfliger Kopf , Keine Augen
o Typischer Halteapparat (Haken, Zähnchen, Klammern)
o Monogenea ( Hakensaufwürmer)
• Posthodiplostomum cuticola
o Schwarzer Punkt auf der Haut
o Trematoda (Saufwürmer)
!!!
• Untersuchung der Kiemen
o Kiemendeckel abtrennen, Kiemenbögen aufschneiden Abstriche, Quetschen
o 1. Makroskopische Untersuchung auf Ektoparasiten
▪ Kiemenkrebs (Ergasilus spec.)
• verankern sich mit zweitem Antennenpaar
• Crustacea
▪ Dactylogyrus spec.
• Vierzipfliger Kopf
• Vier Augen
• Typischer Halteapparat ( Klammern, Zähnchen, Haken)
• Monogenea ( Hakensaugwürmer)
▪ Doppeltierchen (Diplozoon spec)
• Zwei überkreuz wachsende Tiere
• Monogenea ( Hakensaugwürmer)
▪ Larven von Großmuscheln ( Glochidium gen. Spec.)
• Manche Arten auch an Flossen
• Mollusca (Weichtiere)
▪ Myxozoa
• Meist in Cysten
• Als weiße Punkte zu erkennen
• Auf den Kiemenfilamenten und am Kiemenbogen
• Sporen mit zwei Polkapseln
▪ Bucephaloidae
• Am Kiemenbogen
• Trematoden-Larven (Saugwürmer)
• Auge heraus präparieren unter untersuchen
▪ Thylodelphis clavata
• Im Glaskörper
• Metacercarie (Larve) ist nicht encystiert (Bildung keiner Zysten)
• Sehr zappelig
• Länglicher Körperbau
• Kalkeinschlüsse länglich
• Trematoden (Saugwürmer)
▪ Diplostomum spec.
• In der Linse
• Metacercarie ist nicht encystiert
• Eher träge keine schnellen Bewegungen
• Kalkeinschlüsse rund
• Trematoden ( Saugwürmer)
!!
• Fisch aufschneiden und Leibeshöhle auf Parasiten absuchen
o Bauchhöhle mit Schere von Kloake bis zum Kopf aufschneiden
o Zweiter Schnitt = Entfernen des Lappens der über den Organen liegt
!!
• Organe ( Milz, Leber, Galle, Gonaden, Nieren) untersuchen
▪ Philometra spec.
• Leibeshöhle
• Enden sind sehr rund
• Rötlicher Nematode(Fadenwürmer)
▪ Paradilepis scolencia
• Leber
• Wenige mm groß
• Cestodenlarve besitz Haken (Bandwurmlarve)
▪ Ligula intestinalis
• Bandartige Cestodenlarve
• Quillt beim Öffenen aus der Leibeshöhle
• Wird mehrere cm lang
• Darm ausbreiten, öffnen und untersuchen
▪ Bucephalus polymorphus
• Saugnapf mit Tentakeln
• Trematoden
▪ Caryophyllaeus laticeps
• Nelkenartiger Kopf
• Cestoden (Bandwürmer)
▪ Camallanus lacustris
• Typische Kopkapsel
• Nematoden ( Fadenwürmer)
▪ Pomphorhynchus laevis
• Verankert sich mit Bulbus in der Darmwand
• Gelb gefärbt
• Bei Fehlwirten auch frei in der Leibeshöhle oder in der Leber zu finden
• Acanthocephalen (Kratzwürmer)
▪ Myxidum spec.
• Niere
• Polkapsel an gegenüberliegenden Enden der Sporen
• Sporen oval mit ± spitzen Enden
• Myxozoa
▪ Sphaerospora spec.
• Niere
• Runde Sporen
• Deutliche Naht zwischen Sporenschalen
!• Schwimmblase untersuchen
▪ Anguillicola crassus
• 4,5 cm Länge und 5 mm im Durchmesser
• Mundöffnung besteht aus einem Zahnkranz
• Nematoden (Fadenwürmer)
• !! In allen Organgen können Cysten von Mircospora, Myxozoa oder anderer Protozoen gefunden werden
o Microspora –und Myxozoa-Cysten sind als weiße Punkte erkennbar
o Einzelen Sporen erst bei 40 – 100facher Vergrößerung zu sehen
Zustandsparameter:
• Zustand des Fisches :
o Konditionsfaktor : Maß für den Ernährungszustand eines Fisches
▪ K =
o Hepatosomatischer Index : Maß für des Stresszustand eines Organismus
▪ HSI=
o Gonadosomatischer Index: Aussage über die Reproduktion, Reifegrad
▪ GSI=
• Variablen:
o m(ges)= Fischmasse in [g]
o mɩ = Masse der Leber in [g]
o m(G) = Masser der Gonaden in [g]
o l = Fischlänge in [cm]
Intensität und Prävalenz:
• Beschreibung der Parasitengemeinschaft :
o Intensität (I) = Zahl der Parasitenindividuen einer Art pro Wirt
o Prävalenz (P) = prozentueller Anteil an Wirtsfischen, die mit einer oder mehreren Individuen einer Parasitenart infiziert sind
▪ P = · 100%
• Variablen:
o W(inf) = Anzahl aller Wirte, die mit Parasit I infiziert sind
o W (alle) = Anzahl aller untersuchten Wirte
o W(i) = Anzahl der Individuen einer Parasitenart auf Wirt i
o N = Gesamtindividuenzahl in einem Habitat
o N(max) = Anzahl der Individuen der dominanten Parasitenart
o n(i) = Individuenzahl der Parasitenart i
o S = Gesamtartenzahl ( der Parasiten) eines Standortes
o p(i) = relative Häufigkeit der Parasitenart i
!!Messmethoden im Freiland (20.6.2012)
Chlorophyllfluoreszenz
• Erscheinung, dass nach der Anregung die absorbierte Energie in Form von langwelligem Licht wieder abgegeben wird
• Absorption von blauen oder rotem Licht bewirkt im Chlorophyllmolekül die Anhebung eines Elektrons aus dem Grundzustand in einen angeregten Zustand
• Beim Übergang eines Elektrons vom angeregten in den Grundzustand wird elektromagnetische Strahlung emittiert ( = Fluoreszenz)
Quenching:
• Anregungsenergie kann durch 3 unterschiedliche Möglichkeiten abgebaut (dissipiert, gequenscht) werden:
o 1. Nutzung der Energie in der Photochemie
▪ Photochemische Fluoreszenzlöschung P („photochemical quenching“)
o 2. Strahlungslose Umwandlung in Wärme
▪ Nicht photochemische Fluoreszenzlöschung D
o 3. Durch Fluoreszenz F
• Energieerhaltungssatz: Fluoreszenz (F)+ Photochemie(P) + Wärme (D) = 1
o Wenn unter Stress ( Trockenstress, Schadstoffe) die Photochemie gestört wird, steigt der Fluoreszenzanteil an
o Er bleibt gering, wenn die Umwandlung in chemische Energie optimal abläuft oder andererseits die thermische Energieabgabe gefördert wird
Ausbreitung von DCMU (Diuron) im Blatt
• DCMU = Phenylharnstoff-Derivat, das als Herbizid verwendet wird und die Photosynthese von Pflanzen hemmt ( elektronentransport zwischen Photosystem II und Plastochinon wir inhibiert)
• Wirkung ist messbar, da die Chlorophylle der Pflanze eine erhöhte Fluoreszenz zeigen
Stressindikatoren:
• Photosynthese allgemein:
• Elektronentransportkette lichtabhängige Reaktion
o Elektronentransport wird durch mehrere große Enzymkomplexe in der Thylakoidmembran vermittelt
o Ablaufende Prozesse:
▪ Wasserspaltung: (Photolyse des Wassers)
▪ Reduktion von NADP⁺ zu NADH + H⁺
▪ ATP-Bildung ( Photophosphorylierung)
• Normalbedingungen :
o Absorbierte Lichtenergie wird hauptsächlich in biochemische Energie( ATP,NADH/H⁺) umgewandelt
o Nur wenig ( 0,5 – 3% ) werden als Fluoreszenz angestrahlt
• Stress: Behinderung der Photosynthese
o Schutzmechanismen (Wärme) werden aktiviert und deutlich mehr Fluoreszenzlicht abgegeben
o Störungen der Photosynthese, vor allem beim Elektronentransport, können sich als Verstärkung der Fluoreszenz äußern und dadurch quantifiziert werden
o Messung der Chlorophyllfluoreszenz bietet eine Möglichkeit die Leistungsfähigkeit der Photosynthese und ihrer Reaktion auf Stress zu untersuchen
Fluorometer:
• Junior PAM
• Standard Imaging PAM
• Maxi Imaging PAM
• Fluoreszenzparameter:
o Sättigungsimpulsmethode
▪ Nach einschalten des Messlichtes ( ML) wird die minimale Fluoreszenz gemessen (F₀)
▪ Licht-Sättigungsimpuls (SP ) bewirkt kurzzeitig eine vollständige Reduktion aller Reaktionszentren ( simuliert „knock-out „ der Photosynthese)
▪ Messung des maximalen Fluoreszenz-Levels im Dunkel-adaptierten (Fm) oder Licht-adaptierten Zustand (Fm‘)
o Maximale Quantenausbeute von PS II: =
• Maß für die maximale Effizienz mit der Anregungsenergie aus den Antennenkomplexen von offenen Reaktionszentren im PS II übernommen wird
o Effektive Quantenausbeute von PS II im belichteten Zustand (yield) : =
• Spiegelt den momentanen Aktivitätszustand des Photosyntheseapparates wieder
o Non-photochemical quenching (NPQ) =
▪ Bei Kenntnis der effektiven Quantenausbeute von PS II und der eingestrahlten Quantenflussdichte ( PFD) kann die relative Elektronentrasportrate (ETR) von PS II berechnet werden :
• ETR = · PFD · abs · 0,5
Fluoreszenzbildanalyse : Anwendungsbeispiele
• Demonstration 1: Rosenblatt wird 2 Minuten in 45 °C warmes Wasser getaucht
o Beobachtungen:
▪ Das F.image zeigt nur geringe Unterscheider / Heterogenitäten
▪ Eingetauchter Blattbereich (Hitzeschädigung ) ist deutlich mittel und yield-image zu diagnostizieren
• Demonstration 2 : Abszisinsäure (ABA) appliziert über die Petiolen von Arabidopsis Stomataschluss
!!Kartiermethoden im Freiland (27.6.2012)
Faunistische Untersuchungen am Beispiel des Ökosystems Fließgewässer:
• Ziel: Repräsentative Stichprobe der an einen Ort vorkommenden Fauna
• Methoden: Fallen, Zählen, Handaufsammlungen
• Kurs : Untersuchung des Makrozoobenthos von Fließgewässern, wegen der hohen Dichte
o Makrozoobenthos = Kleintiere ( Krebse, Muscheln, Insektenlarven) der Gewässersohle
o Werden bei Bestimmung der Wasserqualität eingesetzt
o Häufigkeit und Artenvielfalt sind vom Habitat abhängig 1. Schritt ist die Abschätzung der Lebensräume auf der Sohle 2.Schritt : Mischprobe mit Fangnetzt entnehmen (Verteilung der Einzelproben richtet sich nach der Zusammensetzung der Habitate ) Probe enthält neben Tieren auch Steine, Sand und Pflanzenteile aus denen die vorkommenden Tierarten semiquantitativ erfasst werden können
1. Schritt: Habitatkartierung:
o Kartierung aller im Bereich der Probestelle vorkommenden Habitate
o Ergebnisse im Feldprotokoll festhalten ( in 5% Schritten, bei unter 5% ein x eintragen)
o Die Summer des Deckungsgrades aller Substrattypen muss 100 % ergeben
o Feldprotokollbeispiel:
Erklärung der Spalten:
Deckungsgrad (5% Stufen)
• Abschätzung der Deckungsgrade vorkommender Substrattypen
• Ist mineralisches Substrat von organischem bedeckt ist das bedeckende Substrat ausschlaggebend
Anzahl der Teilproben:
• Basierend auf der Deckungsgrad-Abschätzung wird die Anzahl der Teilproben bestimmt
• Auf jeweils 5% Deckungsgrad entfällt eine Teilprobe
• Gesamtzahl der Teilproben = 20
• Bsp.: 5% Akal = 1 Teilprobe
25% Psammal = 5 Proben
Bemerkungen:
• Welches mineralische Substrat von organischem verdeckt ist
Mineralische Substrate:
• Megalithal
o > 40 cm
o Große Steine, Blöcke, anstehender Fels
• Makrolithal:
o > 20 cm – 40 cm
o Steine von Kopfgröße
• Mesolithal:
o > 6 cm – 20 cm
o Faustgroße Steine
!• Mikrolithal:
o > 2cm – 6 cm
o Grobkies
o Größe eines Taubeneis bis Größe einer Kinderfaust
• Akal:
o > 0,2 cm – 2 cm
o Fein - bis Mittelkies
• Psammal / Psammopelal
o > 6 µm – 2mm
o Sand und / oder Schlamm
!• Argyllal
o < 6 µm
o Lehm und Ton
!• Künstliche Substrate:
• Technolithal 1
o Steinschüttungen
• Technolithal 2
o Geschlossener Verbau ( betonierte Sohle)
!Organische Substrate:
• Algen
o Filamentöse Algen , Algenbüschel
• Submerse Makrophyten
o Makrophyten inkl. Moose und Characeae
!• Emerse Makrophyten
o Typha, Carex, Phragmites
• Lebende Teile terrestrischer Pflanzen
o Feinwurzeln, schwimmende Ufervegetation
• Xylal ( Holz)
o Baumstämme, Totholz, Äste, größere Wurzeln
!• CPOM
o Ablagerungen von grobpartikulärem organischen Material (Falllaub)
!• FPOM
o Ablagerungen von feinpartikulärem organischen Material (Holzstaub)
!• Abwasserbakterien und – Pilze, Sapropel
o Abwasserbedingter Aufwuchs und /oder organischer Schlamm
!• Debris
o In Uferzone abgelagertes organisches und anorganisches Material ( durch Wellenbewegungen abgelagerte Mollukenschalen)
!2. Schritt : Beprobung
• Basierend auf der Abschätzung des Deckungsgrades wird die Zahl der Teilproben für jeden Substrattyp bestimmt
• 5% Deckungsgrad = 1 Teilprobe ; 100% = 20 Teilproben maximal
• Beprobung erfolgt entgegen der Fließrichtung beginnend am unteresten Ende der Probestelle
• Entnahme einer Teilprobe auf einer Fläche von 25 x 25 cm (Rahmenmaße des Keschers)
• Kescher wird senkrecht zum Gewässerboden aufgesetzt und das Substrat in Fließrichtung vor dem Kescher aufgewirbelt ( Kicksampling)
• Beispeil:
!!!!!!!!3. Schritt:
Sortierung und Abschätzung der Häufigkeiten
• Individuenzahl der klar unterscheidbaren Taxa werde gezählt und auf die Gesamtprobe hochgerechnet
• Individuen seltener Taxa ( bis 10 Individuen) werden gezählt, Häufigkeit anderer Taxa wird geschätzt
Vegetationsaufnahme:
• Repräsentative Stichprobe der an einem Standort vorkommenden Flora
• Pflanzen werden nicht gezählt sondern Deckungsgrade bestimmt, weil
o Auszählung schwierig, da Pflanzen Ausläufer bilden und Individuen über unterirdische Organe mit einander verbunden sind
o Anzahl der Individuen hat wenig Aussagekraft , da die Individuen einer Pflanzenart sich beträchtlich in ihrer Größe unterscheiden können
• Relevant: Anteil einer Pflanzenart an der pflanzlichen Biomasse
!!!1. Schritt: Fläche
• Probefläche ausmessen und markieren (feuchte Wiese = 5 – 25 m²)
• Die Größe der Untersuchten Fläche richtet sich nach den untersuchten Pflanzen
2. Schritt: Pflanzenliste
• Vorkommende Arten werden erfasst ( Feldnamen für jede unterscheidbare Art)
3. Schritt: Abschätzung des Deckungsgrades
• Einteilung der Deckungsgrade in Klassen entsprechend der Skala von Braun-Blanquet
!!!!
• Deckungsgrade:
!!!!!!!!!!!!!!!Statische Auswertung Vegetationskundlicher und
faunischer Daten
• Liste der vorkommenden Arten sowie ggf. Angaben zur Häufigkeit:
• Man unterscheidet:
!o Qualitative Artenliste (Angaben zu Vorkommen / Nicht-Vorkommen)
%
o Semiquantitative Artenliste ( zusätzlich Angaben zur Häufigkeitsklasse)
!!!!!!oQuantitative Artenliste ( Angaben zur
Individuenzahl, Abundanz = Individuen/Fläche)
!!!!!
Diversitätsberechnung:
Kennwerte einer einzelnen Artenliste:
• Abundanz ( Individuen / m²) bzw. Deckungsgrad in %
• Artenzahl
• Diversität:
• Shannon-Wiener-Index:
o Ds-w = · ln ()
!o ni= Individuenzahl einer Art bzw. Deckungsgrad
o A= Abundanz (Gesamtzahl) aller Individuen
o Bsp:
!o Ds-w= ((4/19) · ln (4/19))+((5/19) ·ln (5/19)) + ((10/19) · ln (10/19)) =
0,3+0,3+0,5 = 1,1
o Berücksichtigt Artenzahl und die Gleichverteilung der Arten
▪ Niedrig wenn wenige Arten vorkommen bzw. einzelne Arten stark
dominieren
▪ Hoch wenn viele Arten vorkommen und alle Arten ähnlich Häufig sind
• Margalef-Index:
o Dm= (i-1) / ln (A)
▪ i= Arten
▪ A= Gesamtzahl der Individuen
▪ Bsp.:
▪ Dm= (3-1) / ln (19) = 0,68
!!Vergleich von mehreren Artenlisten:
• Anhand Ähnlichkeits- und Unähnlichkeitsmaßen („Distanzmaßen“)
• Man unterscheidet:
Taxon A (Gesamtzahl)
Art 1 4
Art 2 5
Art 3 10
Summe 19
Taxon A
Art 1 4
Art 2 5
Art 3 10
Summe 19
o Arten Identität: Welche Arten kommen nur in einer Probe vor, welche Arten kommen in beiden Proben vor?
o Quantitative Identität : Wie ähnlich sind sich Häufigkeiten der vokommenden Arten
• Varibalen:
o a = Variable ( z.B. Art) kommt in beiden Proben vor
o b = Variable kommt in Probe 1, aber nicht in Probe 2 vor
o c = Variable kommt in Probe 2, aber nicht in Probe 1 vor
o d = Variable kommt weder in Probe 1 noch in 2 vor, aber in anderen Proben der Reihe
Jaccard-Index: ( Arten Identität):
• JAC =
• Bsp:
• JAC = = 0,33
SФrenson-Index: ( Arten Identität)
• SOR=
Renkonen-Index (Dominanten Identität )
Taxon A B
Art 1 +
Art 2 + +
Art 3 +
Taxon A B Gesamt
Art 1 200 (0,88) 65 (0,49) 265
Art 2 25 (0,11) 65 (0,49) 90
Art 3 1 (0,004)
2 (0,016) 3
Art 4 1 (0,004)
-- 1
!!!
• J,k = zu vergleichende Proben
• X = relative Häufigkeit der Art
• i = Arten
• Bsp:
• Relative Häufigkeit ausrechen: · Artenzahl = · 200 = 87,7 %
• Beim Vergleich nimmt man nur die niedrige Häufigkeit (min) und addiert diese !
• RENjk= 0,49 + 0,11 + 0,004 = 0,604
Art 5 1 (0,004)
-- 1
Summe 228 132 360
