BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA 2 9

BBA 12336

A N R E I C H E R U N G U N D C H A R A K T E R I S I E R U N G E I N E R

1 7 f l - H Y D R O X Y S T E R O I D : N A D ( P ) - O X Y D O R E D U C T A S E

D E R R A T T E N N I E R E

H. BREUER UND K. DAHM

Chemische Abteilung der Chirurgischen Universitiitsklinik, Bonn (Deutschland)

(Eingegangen am 27. August, i963)

SUMMARY

Partial purification and characterisation of a z7fl-hydroxysteroid: N A D ( P )-oxidor eductase of rat kidney

The cytoplasm of rat kidney contains a i7fl-hydroxysteroid dehydrogenase which has been purified I2-fold by precipitation of the 20 ooo × g supernatant with am- monium sulfate. The enzyme reacts with both phenolic and neutral steroids; either NAD or NADP can be utilised as cofactors.

The oxidation of testosterone to androst-4-en-3,I7-dione shows a maximum at p H 8.7, whereas the reduction of androst-4-en-3,i7-dione to testosterone is optimum at pH 6.6. The Michaelis-Menten constants were found to be 18.5"1o -5 M for testosterone and 4O.lO -5 M for NAD. A value of 9.1 . io -gM was obtained for the equilibrium constant. The enzyme shows an activation energy of 13.2 kcal/mole and an inactivation energy of --24.0 kcal/mole within the range of lO-37°; the Q10 values varied between 1.6 and 1. 5 .

The enzymic activity is inhibited by SH blocking agents, but activated by zink ions in low concentrations (lO -5 M). The physiological significance of the 17fl- hydroxysteroid dehydrogenase of rat kidney is discussed briefly.

EINLEITUNG

xTfl-Hydroxysteroid-Dehydrogenasen (17fi-Hydroxysteroid: NAD(P)-Oxydoreducta- sen) spielen bei der Biogenese und im Zwischenstoffwechsel der C-I8 und C-I 9- Steroide eine wichtige Rolle; sie katalysieren die Bildung von Oestradiol-i7fl und Testosteron aus den biologisch weniger aktiven iT-Oxo-Verbindungen. Obgleich I7fl-Hydroxysteroid-Dehydrogenasen in zahlreichen Organen nachgewiesen worden sind (vgl. Ref. i), liegen Angaben fiber ihre Anreicherung und Charakterisierung bis heute nur ffir die Placenta 2-4, die Lebere, ~, die NebenniereS, 9 und die Erythro- zyten 1° vor.

Untersuchungen aus neuerer Zeit lassen erkennen, dass neben der Leber auch die Niere in gr6ssere m Umfange am Stoffwechsel der Steroide teilnimmt (vgl. Ref. 1). Es erschien deshalb wfinschenswert, n/ihere Angaben tiber die Steroidenzyme der Niere zu erhalten. In Fortsetzung unserer Arbeiten tiber die XT/~-Hydroxysteroid-

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3 ° H. BREUER, K. DAHM

Dehydrogenasen bei S~ugetierenS, "~ und niederen Vertebraten ~ berichten wit im folgenden tiber die Anreicherung und Charakterisierung einer cytoplasmatischen I7/5-Hydroxysteroid:NAD(P)-Oxydoreductase aus der Rattenniere. Durch Behand- lung mit Ammoniumsulfat liess sich eine I2-fache Anreicherung der Enzymaktivit~it erzielen; auf Grund seiner Eigenschaffen kann das Enzym in die Klasse der bisher bekannten I7~-Hydroxysteroid-Dehydrogenasen mit funktionellen SH-Gruppen ein- gereiht werden.

METHODIK

Reagentien und L6sungen

Alle verwendeten Reagentien waren von p.a. Reinheitsgrad (E. Merck, Darm- stadt); Glycerin (E. Merck, Darmstadt) war zweimal destilliert. Die Medien A und B wurden in Anlehnung an JARABAK, AI)AM,% WILLIAMs-ASHMAN UND TALALAY 4 her- gestellt; sie enthielten o.oi M Phosphat-Puffer (pH 7.o), o.0o 5 M EDTA und 2o'/~, Glycerin (Medium A) bzw. 50% Glycerin (Medium B). Alle organischen L6sungs- mittel wurden vor dem Gebraueh zweimal destilliert.

Versuchstiere

MS.nnliche und weibliche Wistar-Ratten im Alter yon 6-8 Wochen wurden nach 24-sttindigem Nahrungsentzug durch Dekapitation get6tet und die Nieren nach dem Ausbluten der Tiere entnommen.

Zellfraktionierung

Alle Schritte wurden bei o ° ausgeftihrt. Das Nierengewebe wurde in einem M6rser zerkleinert und in Medium A mit einem Glashomogenisator homogenisiert. Das I5% ige Homogenat wurde 60 rain bei 5000 x g zentrifugiert; anschliessend wurde der t]berstand 6o rain bei 20 ooo x g zentrifugiert.

Fraktionierge Fdllung mit Ammoniumsulfat

Der 2o ooo x g (}berstand wurde bei o ° der fraktionierten F~tllung mit Am- moniumsulfat unterworfen. Durch Zugabe wm 4%igem Ammoniak wurde der pH- Wert w/ihrend der F~llung zwischen 6.8 und 7.2 gehalten. Der Zusatz yon Ammonium- sulfat bis zur 4o%igen S~ttigung erfolgte innerhalb von 2 h. Die L6sung wurde dann etwa 20 h stehen gelassen, der Niederschlag abzentrifugiert und das Sedi- ment in Medium B aufgenommen. Der ~]berstand der 4o% igen Ammoniumsulfat- Fiillung wurde his zur 8o%igen Siittigung mit Ammoniumsulfat versetzt und die L6sung wie oben beschrieben aufgearbeitet. Die 4 °- und 8o% igen Ammoniumsulfat- F~illungen sowie der i3berstand wurden bei - -6 ° autbewahrt.

Inkubationen Wenn nicht anders vermerkt, hat ten die Versuchsans~ttze folgende Zusammen-

setzung: o. 7/~Mol Testosteron (gel6st in o.05 ml Methanol), 0.5 ml Enzyml6sung, 5/~Mol NAD oder NADP und 0.4 M Tris-HC1 Puffer (pH 8.8) in einem Gesamt- volumen yon 3.5 ml.

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I7/~-HYDROXYSTEROID-DEHYDROGENASE DER RATTENiNIERE 31

Aufarbeitung der Versuchsansdtze

Nach Beendigung der Inkubationen wurden die L6sungen dreimal mit je 5 ml Aether-Chloroform (3:1) extrahiert, die Extrakte vereinigt und unter vermindertem Druck im Rotationsverdampfer zur Trockne gebracht. Die Rtickst/inde der Inkuba- tionen mit Testosteron wurden der Papierchromatographie im System Petrol- aether (kp. 4o-6o°)-Methanol-Wasser (lOO:85:15) unterworfen; Laufzeit 2 h. Die Lokalisierung yon Testosteron und Androst-4-en-3,I7-dion erfolgte durch Kontakt- photographie im Ultraviolett. Die Rtickst/inde der Inkubationen mit Oestradiol-i7fl wurden auf Propylenglycol impr~gnierten Papier im System Cyclohexan-Benzol (I : I) ftir 7 h chromatographiert. Oestradiol-I7fl und Oestron wurden durch Anf/irben der Randstreifen mit FOLIN-CIOCALTEUS 12 Reagens lokalisiert.

Quantitative Bestimmungen

Neutrale Steroide (Aa-3-Oxosteroide): Die durch ultraviolette Kontaktphoto- graphie ermittelten steroidhaltigen Positionen wurden ausgeschnitten und die Papierstticke nach dem Zerkleinern mit 3 ml Methanol in einem 25 ml-Erlenmeyer- kolben mit Schliff fiir IO min eluiert. Die methanolischen L6sungen wurden vor- sichtig abpipettiert und die Extinktionen in io-mm Quarzktivetten bei 238 m/~ ge- messen. Nach Papierchromatographie und Elution betrug die Wiederfindung von Testosteron und Androst-4-en-3,i7-dion 85 bis 90% (IO Versuche). Die Gesamt- wiederfindung ftir beide Steroide (Bereich 5-4 °/~g) nach Zusatz zu Standardinkuba- tionen, die an Stelle des Enzyms o.5ml einer o.2~oigen Rinderserumalbumin- L6sung enthielten, betrug 7O~o (8 Versuche).

Phenolische Steroide: Die Oestrogen-haltigen Positionen wurden, wie oben be- schrieben, mit Methanol eluiert, die Eluate durch eine Glasfritte (Schott, Mainz) G 4 filtriert und eingedampft. Die quantitative Bestimmung yon Oestradiol-I7fl und Oestron wurde mit der Kober-Reaktion durchgeff~hrt; Einzelheiten siehe BREUER UND NOCKE 13.

Eiweissbestimmung: Diese erfolgte nach LOWRY et al. 14.

ERGEBNISSE

Nach Inkubation yon Testosteron mit verschiedenen Fraktionen des Nierencyto- plasmas entstand Androst-4-en-3.i7-dion in unterschiedlicher Ausbeute. Wie aus Tabelle I hervorgeht, land sich die h6chste spezifische Aktivit~t in der 8o°/0igen Ammoniumsulfat-Fraktion. Diese Fraktion zeigte gegeniiber dem Homogenat eine etwa I2-fach h6here spezifische Aktivit/it und wurde in allen weiteren Versuchen ver- wendet; unter den vorliegenden Bedingungen wurde ausser Androst-4-en-3.i7-dion kein weiterer Metabolit yon Testosteron gefunden.

Die Enzympr/iparation oxydierte Oestradiol-I7fl in etwas geringerem Umfange (etwa 7O~o) als Testosteron, Mit NAD und NADP wurden gleich grosse Ums/itze beobachtet.

Kinetische Untersuchungen

Wie aus Fig. I hervorgeht, zeigt die Oxydation von Testosteron zu Androst- 4-

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3 2 I-I. B R E U E R , K. DAHM

T A B E L L E 1

G E S A M T A K T I V I T . : ~ T E N U N D S P E Z I F I S C H E A K T I V I T f i , T E N D E R N 2 ~ D - A B H ~ k N G I G E N J 7[J- H Y D R O X Y S T E R O I D - D E H Y D R O G E N A S E N I N V E R S C H I E D E N E N P R A P A R A T I O N E N

D E R R A T T E N N I E R E

0. 7 /dv lo l T e s t o s t e r o n w u r d e n m i t 0. 5 m l de r j c w e i l i g e n E n z y m p r ~ p a r a t i o n , 5 l tMol N A D u n d o. 4 M T r i s - H C 1 Puf fe r ( p t I 8.8) i n e i n e m G e s a m t v o l u m e n v o n 3.5 m l f ~ r 60 ra in be i 37 :~ u n t e r

I m f t i n e i n e m S c h i i t t e l t h e r m o s t a t e n i n k u b i e r t . \Ve i te re E i n z e l h e i t e n s iehe METHODIK.

Gob ihlctc M enge I:'ia;eis sgcha It

F, nzymprgpr~ration .! ndrost 4-on dcr Enzym Gesamt- Spczifischc ¢.z7-dio~ prc~paration Aktivit~t* Aktivitdt** ( M d/ (mg/o.5 rid)

o,5 ml ~, h)

H o l n o g e n a t 5 <) 26.5 355 ° i .0 l oo ooo × g ( ~ b e r s t a n d ,t o 5.5 ~88o 7.-' 40°//o A m m o n i u m s u l f a t - F ~ l l u n g 28 z.3 1ooo i2 .1 8 0 % A m m o n i u m s u l f a t - F ~ l l u n g 1"4 5.5 I8OO 22.() 15be r s t and d e r 8O~o A m m o -

n i u m s u l f a t - F ~ l l u n g o o.3 • o

• G e s a m t a k t i v i t a t - m/~-I°l- j )ndr°st-4-er~-3"~I7-di°n- gel2ilde-t" h

** Spez i f i sche A k t i v i t A t = mfd~'I°l ia~nclr°st-4-eI1--3'I7 -di°l} gebiM_ e t

m g E i w e i s s X h

en-3.I7-dion ein scharfes Maximum bei einem pH-Wert von 8. 7 ftir die Reduktion von Androst-4-en-3.IT-dion wurde ein etwas breiteres Maximum im pH-Bereich von 6.4-6. 7 gefunden. Der zeitliche Verlauf der enzymatischen Oxydation von Testosteron

7 0

6 0

5O -o

3 0 E

2 0

q i 6.0 7.0 8.O 9.'0 10.O

pH

Fig . i . A b h / ~ n g i g k e i t dc r A k t i v i t / i t d e r i 7 / ~ - H y d r o x y s t e r o i d - l ) e h y d r o g e n a s ~ yon de r ~Vasserstoff- i o n e n - l , 2 o n z e n t r a t i o n . • - 0 , o . 7 / , M o l T e s t o s t e r o n w u r d e n m i t o.25 m l l : .nzym, 5 / t M o l N A I ) u n d 0. 4 M T r i s - H C 1 - P u f f e r ( p H - B e r e i c h 6.8 9.3) i n k u b i e r t . Es w u r d e d ie B i k h m g yon ; \ n d r o s t - 4 - c n - 3 . I 7 -d ion g e m e s s e n . ()- , : , o .35 /2Mol A n d r o s t - 4 - e n - 3 . I 7 -d ion w u r d e n m i t o.5 m l E n z y m , 6.8 ffMol NADH,z u n d o.~ M P h o s p h a t - P u f f e r ( p H - B e r e i c h 5.4 7.8) i n k u b i e r t . E s w u r d e (lie B i M u n g v o n

T e s t o s t e r o n gemessen . Alle V e r s u c h e w u r d e n in 3.5 m l flhr 6o m i n be i 37 ° d u r c h g e f g h r t .

Bioahim. 1Mophys. ,It/a, 83 ( t9~4) 29-37

I?f l -HYDROXYSTEROID-DEHYDROGENASE DER RATTENNIERE 33

-I() -5

._o c 100 -o I

I e-

l ~t

I

5O o

" o c <

-6 "3

E

C o ! I ,5 2'o 6o 9'o

Zeit (rain)

Fig. 2. Zeit l icher Ver lauf der O x y d a t i o n von Tes tos te ron zu Andros t -4-en- 3 . I7-dion du rch die I7 f l -Hydroxys te ro id -Dehydrogenase . o. 7/~Mol Tes tos te ron w u r d e n mi t 0. 5 ml E n z y m , 6.8 /~Mol N A D und o. 4 M Tr i s -HCl -Puf fe r (pH 8.8) in e inem G e s a m t v o l u m e n yon 3.5 ml bei 37 ° inkubier t .

I n k u b a t i o n e n i m In te rva l l yon o~)o min .

ist in Fig. 2 dargestellt; zwischen o und 9 ° min wurde ein stetiger Anstieg des Um- satzes beobachtet. Die AbMngigkeit des Umsatzes yon der Konzentration des Substrates (Testosteron) und des Cofaktors (NAD) zeigt Fig. 3 in Form der LINE- WEAVER-BORK-Transformation. Bei einem pH-Wert yon 8. 7 betr/igt Km 18.5" lO -5 M f~r Testosteron (Konzentration von NAD 5 #Mol) und 4 ° . lO -5 M ftir NAD (Konzen- tration von Testosteron 0.6 9 #Mol).

I ! I I 5 10 15 20

, - -

E - b 4

;K¢.

2 ¸

/

Fig. 3. O x y d a t i o n von Tes tos te ron zu Andros t -4 -en-3 . i7 -d ion du rch die i7 f l -Hydroxys te ro id - D e h y d r o g e n a s e in Abhi~ngigkeit yon tier K o n z e n t r a t i o n des Subs t r a t e s bzw. Cofaktors . S - - Q , verschiedene Mengen Tes tos te ron (o.o87-1.o 5/~Mol) wurden mi t 0. 5 ml E n z y m u n d 5/*Mol N A D in 0. 4 M Tr i s -HCl -Puf f e r (pFI 8.8) inkubier t . O - - O , o.7/~Mol Tes tos te ron w u r d e n m i t o. 5 ml E n z y m u n d versch iedenen Mengen N A D (o.17-6.8/~Mol) in 0. 4 M Tris-HC1-Puffer (pH 8.8)

inkubier t . Alle Versuche wurden in 3.5 ml fQr 60 min bei 37 ° durchgeff ihr t .

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34 H. BREUER, K. DAHM

Die Gleichgewichtskonstante fiir die Reakt ion

Testosteron F NAD~-o Androst-4-en-3.i7-dion + N:kI)H T t l ,

wurde nach folgender Gleichung ermit te l t

[Androst-4-en- 3. t 7-dion] IN ADH] [H Ix" u . . . . . . . . . ['l'estosteroIi] [N-.S~I) +~ - -

U m das Gleichgewicht schnell zu erreichen und m6glichen Inakt ivierungsprozessen zuvorzukommen, wurde die Reakt ion mit einer Konzent ra t ion von o.35/~Mol Testo- s teron und o.o 7 #Mol Androst-4-en-3. i7-dion gestartet. Unte r den gew~ihlten Ver- suchsbedingungen wurde das Gleichgewicht nach 2 4 o m i n erreicht (Fig. 4); die Gleichgewichtskonstante betr~igt 9.1 ~_ 2- IO -9 M bei 37 °.

.0 ? L #

2

EL E

200

15C

IOC

50

f I I I

6o 12o 40 300 3;0 Zeit (rain)

Fig. 4. Geschwindigkeit der Gleichgewichtseinstellung der Reaktion: Testosteron -i NAD + ~ An- drost-4-en-3.i7-dion + NADH -}- H + dutch die i7fl-Hydroxysteroid-Dehydrogenase, o.35 /,Mol Testosteron und o.o 7/*M Androst-4-en-3.i7-dion wurden mit o.5 ml Enzym, 6.8/,Mol NAD und

o. 4 M Tris-HC1-Puffer (pH 8.8) in einem Gesamtvolumen von 3.5 ml bei 37 ° inkubiert.

Aktivierung und Inaktivierung

Das Tempera tu rop t imum des Enzyms liegt bei 37 °. Die Abh~ingigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit v o n d e r Tempera tur im Bereich yon lO-57 ° ist in Fig. 5 wiedergegeben. Bei 57°tri t t eine irreversible Inak t iv ie rung des Enzyms auf. Die Aktivierungsenergie der i7/5-Hydroxysteroid-Dehydrogenase betr/igt ~ 13.2 kcal/ Mol, die Inakt ivierungsenergie - - 24.0 kcal/Mol. Im Temperaturbereich wm Io-2o ° wurde ein Q10-Wert yon 1.6, im Temperaturbereich yon 27-37 ° ein Q10-Wert wm 1.5 ermittel t .

I n Tabelle I I sind die Versuche zur Akt ivierung und Inak t iv ie rung zusammen- gefasst. Von den untersuchten Verbindungen hat te lediglich Zink in einer End- konzent ra t ion von IO 5 M einen akt ivierenden Einfluss. Alle iibrigen Zus/itze hemmten in Endkonzen t r a t i onen yon Io -S- Io -5 M die Aktivit~it der i7fl-Hydroxysteroid- Dehydrogenase in unterschiedlichem Ausmass.

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I7fl-HYDROXYSTEROID-DEHYDROGENASE DER RATTENNIERE 35

- 3 . 7

--~'o -4.C

: I_

E

-4 .3 o

I I I J I I ~I 3.2 3.3 3.4 :~5 3.6

l x 1 0 3

Fig. 5. Abhi~ngigkeit der O x y d a t i o n yon Tes tos te ron zu Andros t -4 -en-3 . i7 -d ion du rch die I7fl- H y d r o x y s t e r o i d - D e h y d r o g e n a s e yon der T e m p e r a t u r . 0. 7 #Mol Tes tos te ron w u r d e n m i t 0.25 ml E n z y m , 6 .8/ ,Mol N A D u n d o. 4 M Tris-HC1-Puffer (pH 8.8) in e inem G e s a m t v o l u m e n yon 3-5 ml

ft~r I2o rain inkubier t . Die T e m p e r a t u r wurde im Bereich y o n ro -57 ° vari iert .

DISKUSSION

D i e v o r l i e g e n d e n U n t e r s u c h u n g e n z e i g e n , d a s s s i c h i n d e r 1 6 s l i c h e n F r a k t i o n d e r

R a t t e n n i e r e e i n e i 7 f l - H y d r o x y s t e r o i d - D e h y d r o g e n a s e b e f i n d e t , d i e s o w o h l m i t N A D

a l s a u c h m i t N A D P a l s C o f a k t o r r e a g i e r t . D i e s e s E r g e b n i s b e s t / ~ t i g t d i e k f i r z l i c h

v e r 6 f f e n t l i c h t e n A n g a b e n y o n AOSHIMA UND KOCHAKIAN 15, w o n a c h n u r d i e c y t o -

p l a s m a t i s c h e , n i c h t a b e r d i e m i k r o s o m a l e F r a k t i o n d e r R a t t e n n i e r e f i b e r e i n e N A D /

N A D P - a b h / i n g i g e I 7 f l - H y d r o x y s t e r o i d - D e h y d r o g e n a s e v e r f f i g t . D a s h i e r n a c h -

T A B E L L E I I

Z U S A M M E N S T E L L U N G D E R V E R S U C H E Z U R A K T I V I E R U N G U N D I N A K T I V I E R U N G

D E R I 7 f l - H Y D R O X Y S T E R O I D - D E H Y D R O G E N A S E D E R R A T T E N N I E R E

o. 7 #Mol Tes tos t e ron w u r d e n re.it o. 5 ml E n z y m , 5/~Mol NAD, 0. 4' M Tr is -HC1-Puffer (pH 8.8) u n d den jeweil igen Zus~ tzen (alle in w~ssriger L6sung) in e inem G e s a m t v o l u m e n y o n 3.5 ml ffir 60 rain bei 37 ° inkubier t . Vor Beg inn der I n k u b a t i o n wurde das E n z y m m i t d e m jeweiligen

Zusa t z ffir 5 rain pr '~inkubiert .

Zuscaz

Gebildete Xnderung Menge gegen~bev

Endkonzen#ation Androst-4-en. dem (M) 3.xT-dion Konlrollwert

(ra~Mol) (%)

Keiner - - 132 - - ZnC12 1°-8 3 ° - - 77

xo -5 I52 + 1 5 MgCl~ 10 -3 i 12 -- 15

I O - 5 9 8 - - 26 CRCI2 1o-3 93 - - 3 °

I O - s 96 - -27 Glu t a th ion i o -a 64 - - 5 i

xo -s 89 -- 32 J o d a c e t a m i d Io -8 61 -- 54

I O - 5 1 2 1 - - 8 o-JodosobenzoesAure TO--S 54 - - 59

lO -5 I16 - -12 p -Chlormercur ibenzoesgure lO-4 o -- ioo

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3 6 H. BREUER, K. DAHM

gewiesene Enzym konntc durch fraktionierte F~illung des 2o ooo x g Uberstandes mit Ammoniumsulfat bei 5o%iger Ausbeute um etwa das I2-fache angereichert werden. Zum Vergleich sei angegeben, dass die bisher bekannt gewordenen An- reicherungen fiir die cytoplasmatische t7fi-Hydroxysteroid-Dehydrogenasen aus der Leber des Meerschweinchens das 5-lathe v, aus der Placenta des Menschen das 5o-fache ~ bzw. 25oo-faehe a, aus der Nebenniere der Rat te das 7(>lathe' und aus der Leber der Ratte das I7o-fache ~6 betragen.

Die I7fl-Hydroxysteroid-Dehydrogenase der Rattenniere oxydiert Oestradiol- I7fl in etwas geringerem Umfange als Testosteron. Demnach ist die Substratspezifitttt dieses Enzyms welt weniger ausgeprggt als diejenige des placentaren Enzyms, das nur phenolische Steroide angreift2, tv. Das pH-Opt imum der enzymatischen Dehy- drierung (Testosteron-~ Audrost-4-en-3.i7-dion ) liegt bei 8,7, wS, hrend die Hydrie- rung (Androst-4-en-3.i7-dion-> Testosteron) ein Optimum bei 6.6 zeigt. Aus dem Verlauf beider pH-Kurven geht hervor, dass der Umsatz im alkalischen Bereich etwa 4 mal gr6sser ist als im sauren. Ftir Testosteron betr/igt K m I8. 5 " IO .5 M,

wtihrend fiir NAD ein Km Wert yon 4 ° . IO '~ M gefunden wurde. Beide \Verte liegen in der fiir Hydroxysteroid-Dehydrogenasen bekannten Gr6ssenordnung (vgl. Ref. I). Ein Vergleich der Michaelis-Menten Konstanten lttsst erkennen, dass das Enzvm zu NAD eine etwas geringere Afflnitttt besitzt als zu Testosteron. Demnach scheint die Bildung des Enzym-NAD Komplexes bei der Dehydrierung yon Testosteron der geschwindigkeitsbestimmende Schritt zu sein.

Wegen ihrer relativ geringen spezifischen AktivitS, ten stellen tierische z7fi- Hydroxysteroid-Dehydrogenasen das Gleichgewicht zwischen oxydierter und re- duzierter Verbindung hmgsamer ein als entsprechende Enzyme bakteriellen Ur- sprungs. Unter den bier gewtthlten Vcrsuchsbedingungen wurde das Gleichgewicht nach 3-4 h erreicht; die Gleichgewichtskoi~stante KH betr~igt bei 3 7 9, I :_ 2 • io-" M und entspricht anntihernd den Werten fiir die,, z7fl-Hydroxyster(fid-Dehydrogenasen der menschlichen Placenta" (18 :q~ 5" IO :) M bei 35 °) und aus Pseudomom~s testo- steroni is (26. io '~ M bei 35°). Dutch eine Steigerung der Temperatur yon io auf 2o :~ nimmt die Reaktionsgesehwindigkeit um das 1.6-fache, durch eine Steigerung yon 27 ° auf 37 ° um das 1.5-fache zu. Die geringe Temperaturabh~ingigkeit der ()t0-\Verte spricht fiir eine geringc Thermohtbilit~tt des Enzvnls im Bereieh \'~m z,~ .}7 und damit fiir eine optimale Anpassung des Enzyms an das Substrat. Die Aktivierungs- energie des Enzyms betrtigt -k I3.2 kcal/Mol, dic lnaktivierungsenergie z4.o kcal/ M ol. Diese fiir eine I7fi-Hydroxysteroid-Dehydrogenase erstmalig mitgeteilten \\:crte liegen in dem fflr Dehydrogenasen zu erwartenden lntervall.

Die I7fi-Hydroxysteroid-Dehydrogenase dvr Rattenniere besitzt, fihnlich wie die NAD/NADP-abhSngigen Dehydrogenasen, fllnktionelle Stt-(;ruppen. l)iese k6nnen durch Schwermetallionen sowie durch typische SH-(;ruppen blockierende Verbindungen, wie 0-,lodosobenz(~e<iure und/5-Ctfloromercuribenzoes~ture, gehemmt werden. Besonders charakteristisch wird die Wirksamkeit der SH-Gruppen durch den aktivierenden Einfluss yon Zinkionen in geringer Konzentration (Io .5 M) her- vorgehoben. Dieser Befund spricht fiir die Beteiligung e, ines Zink-Sulthydryl- Protein Komplexes an der enzymatischen Dehydrierung von Testosteron 2".

I)ie hier nfitgeteilten Ergebnisse unterstiitzen die Annahme, dass die Nitre nicht nur durch die Ausscheidung yon wasserl6slichen Konjugaten, sondern ;ruth durch Oxydoreduktionen regulierend in den Stoffwechsel der Steroide eingreift.

Hiochim. 13iophys. Ac/a, 85 U964) '29-37

I7fl-HYDROXYSTEROID-DEHYDROGENASE DER RATTENNIERE 37

DANK

Die vorliegende Untersuchung wurde mit Untersttitzung der Deutschen Forschungs- gemeinschaft durchgeftihrt.

ZUSAMMENFASSUNG

Die cytoplasmatische Fraktion der Rattenniere enth~ilt eine i7fl-Hydroxysteroid- Dehydrogenase, die durch F~tllung mit Ammoniumsulfat etwa I2-fach angereichert werden konnte. Das Enzym zeigt gegentiber Testosteron und Oestradiol-I7fl an- n~thernd die gleiche spezifische Aktivit~tt und reagiert sowohl mit NAD als auch mit NADP als Cofaktor.

Das Optimum der Oxydation yon Testosteron zu Androst-4-en-3.I7-dion liegt bei einem pH-Wert yon 8.7; ftir die Reduktion von Androst-4-en-3.I7-dion zu Testo- steron wurde ein pH-Optimum yon 6.6 gefunden. Die Michaelis-Menten Konstanten betragen 18.5" lO -5 M ftir Testosteron und 40" lO -5 M ftir NAD. Die Gleichgewichts- konstante der Oxydation yon Testosteron zu Androst-4-en-3.I7-dion hat einen Weft von 9.1 .1o -9 M. Das Temperaturoptimum liegt bei 37°; die Aktivierungs- energie des Enzyms betr~igt + 13.2 kcal/Mol, die Inaktivierungsenergie -- 24.0 kcal/ Mol. Im Bereich von lO°-2o ° sowie im Bereich yon 270-37 ° wurden Q10-Werte von 1.6 bzw. 1.5 ermittelt.

Durch Zusatz yon SH-Gruppen blockierenden Verbindungen wird das Enzym gehemmt; Zinkionen (lO -5 M) i~ben einen aktivierenden Einfluss aus. Die physiolo- gische Bedeutung der i7fl-Hydroxysteroid-Dehydrogenase in der Rattenniere wird kurz besprochen.

L I T E R A T U R

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