UNIVERSITÄTSKLINIKUM HAMBURG-EPPENDORF

Zentralinstitut für Arbeitsmedizin und Maritime Medizin

und Universitätsprofessur für Arbeitsmedizin

Direktor: Prof. Dr. med. X. Baur

Aufbau eines standardisierten Assays zur Quantifizierung von Latexallergenen

Dissertation

zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin

an der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg.

vorgelegt von:

Lena Henrike Mehner aus Hamburg

Hamburg 2011

2

Angenommen von der Medizinischen Fakultät am: 11.09.2011

Veröffentlicht mit Genehmigung der medizinischen Fakultät der Universität Hamburg

Prüfungsausschuss, der/die Vorsitzende: Prof. Dr. U. Latza

Prüfungsausschuss, 2. Gutachter/in: Prof. Dr. M. Augustin

Prüfungsausschuss, 3. Gutachter/in: PD Dr. Lygia Budnik

3

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG 7

1.1 Arbeitshypothese und Fragestellung 7

1.2 Grundprinzipien der Allergie 8

1.3 Nature Rubber Latex (NRL) – ein Allergen? 9

1.4 Die Latexallergie 10

1.4.1 Die Latexallergie – Ursachen, Manifestation und Prävention 10

1.4.2 Die Bedeutung der Latexallergie als Berufskrankheit 13

1.5 Herstellung von Latexhandschuhen 16

1.6 Aktuelle Richtwerte und Regeln im Umgang mit latex-haltigen

Einmalhandschuhen 18

1.7 Quantifizierung von Allergenen in Probenmaterial 20

1.7.1 Überblick gängiger Testmethoden und Standards 20

1.7.2 Wie funktioniert ein ELISA? 21

1.7.3 Wie funktioniert ein Inhibitions-ELISA? 23

1.7.4 IgY – ein Antikörper aus dem Hühnerei 25

2 MATERIAL UND METHODEN 26

2.1 Probenmaterial 26

2.2 Materialien 27

2.2.1 Chemikalien 27

2.2.2 Lösungen und Puffer 28

2.2.3 Verbrauchsmaterialien 30

2.2.4 Geräte 31

2.3 Methoden 32

2.3.1 Vorbereitung des Probenmaterials 32

2.3.1.1 Herstellung von Latexextrakt aus Einmalhandschuhen 32

2.3.2 Proteinchemische Methoden 32

2.3.2.1 Proteinbestimmung mit der modifizierten Lowry-Methode 32

2.3.3 Immunologische Methoden 33

2.3.3.1 Gewinnung der IgG–Antikörper 33

2.3.3.2 Gewinnung der IgY–Antikörper 34

4

2.3.3.3 CAP-Assay 34

2.3.3.4 IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold 37

2.3.3.5 IgY-Inhibitions-ELISA 40

2.3.4 Statistische Methoden 43

2.3.4.1 Verwendete Software und Umgang mit dem Datenmaterial 43

2.3.4.2 Berechnung von Sensitivität und Spezifität 43

2.3.4.3 Berechnung der Korrelation 44

2.3.4.4 Bestimmung der Nachweisgrenzen 45

3 ERGEBNISSE 45

3.1 Messwerte 45

3.1.1 Gesamtproteingehalt der 20 Proben mittels modifizierter Lowry-

Methode 45

3.1.2 Allergengehalt der Proben mittels CAP-Assay 47

3.1.3 Allergengehalt der Proben mittels IgG-Inhibitions-ELISA

nach Beezhold 47

3.1.4 Allergengehalt der Proben mittels IgY-Inhibitions-ELISA 48

3.2 Statistische Analyse 50

3.2.1 Verteilung der erhobenen Messwerte 50

3.2.2 Sensitivität und Spezifität der Methoden 52

3.2.3 Korrelation der Methoden 54

3.2.4 Nachweisgrenzen der Methoden 55

4 DISKUSSION 57

5 ZUSAMMENFASSUNG 65

6 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 66

7 LITERATURVERZEICHNIS 69

8 TIERSCHUTZANTRÄGE 75

9 DANKSAGUNGEN 77

10 LEBENSLAUF Fehler! Textmarke nicht definiert.

11 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG 79

5

VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN

Abbildung 1 Kennzahlen der Berufskrankheit Nummer 5101, 1995-2008 14

Abbildung 2 Vergleich anerkannter Berufskrankheiten, die zur Unterlassung

aller schädigenden Tätigkeiten gezwungen haben 2008 15

Abbildung 3 Prinzip des ELISA 23

Abbildung 4 Inhibitions-ELISA (geringer Antigengehalt) 24

Abbildung 5 Inhibitions-ELISA (hoher Antigengehalt) 25

Abbildung 6 Darstellung der Messwerte im Punktdiagramm 51

6

VERZEICHNIS DER TABELLEN

Tabelle 1 Übersicht der benannten Latexallergene (IUIS) 10

Tabelle 2 Übersicht anerkannter Berufskrankheiten, die zur Unterlassung

aller schädigenden Tätigkeiten gezwungen haben 2008 15

Tabelle 3 Handschuhproben 27

Tabelle 4 Pipettierschema der Allergen-Standardreihe des CAP-Assay 36

Tabelle 5 Pipettierschema des IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold 38

Tabelle 6 Pipettierschema des IgY-ELISA 41

Tabelle 7 Gesamtproteingehalt der Probenextrakte 46

Tabelle 8 Ergebnisse des CAP-Assay 47

Tabelle 9 Ergebnisse des Beezhold Assay 48

Tabelle 10 Ergebnisse des IgY-ELISA 49

Tabelle 11 Mittelwerte der Messreihen 50

Tabelle 12 Ermittlung der Sensitivität und Spezifität des IgY-ELISA 52

Tabelle 13 Ermittlung der Sensitivität und Spezifität des CAP-Assay 53

Tabelle 14 Ergebnis der Berechnung der Korrelation 54

Tabelle 15 Signifikanz der errechneten Korrelationen 55

Tabelle 16 Ergebnis der Bestimmung der Nachweisgrenzen 55

Tabelle 17 Sensitivität und Spezifität der Methoden 62

Tabelle 18 Korrelation und Signifikanz der Methoden 63

Tabelle 19 Nachweisgrenzen der Methoden 63

7

1 EINLEITUNG

1.1 Arbeitshypothese und Fragestellung

Sensibilisierungen gegen Latexallergene stellen nicht zuletzt durch den stetig

steigenden Gebrauch von Latexhandschuhen ein gesundheitliches Problem dar

(Übersicht in Raulf-Heimsoth et al. 2001). Besonders bei Spina-bifida-Patienten, die

in den ersten Lebensjahren multiplen Operationen und somit wiederholtem Kontakt

mit Latexhandschuhen ausgesetzt sind, findet sich ein stark erhöhtes Risiko, im

Laufe ihres Lebens eine Latexallergie zu entwickeln (Sussman et al. 2002). Auch

Mitarbeiter des Gesundheitswesens haben ein erhöhtes Latexallergie-Risiko,

einerseits durch das tägliche Tragen von Latexhandschuhen und andererseits durch

die Aufnahme so genannter Aeroallergene, die beim An- und Ausziehen von

gepuderten Latexhandschuhen freigesetzt werden (Chen und Baur 1999). Der

Umgang mit latexhaltigen medizinischen Produkten stellt ein weiteres relatives Risiko

dar (Kostyal et al. 2009).

Zur Verringerung dieser Belastungen und somit des Risikos einer Sensibilisierung

wurden gesetzliche Grenzwerte des Latexproteingehalts unterschiedlicher Latex-

artikel festgelegt (Deutsches Institut für Normung e.V. 2007, BAuA 2008).

Derzeit genutzte Testverfahren zur Quantifizierung von Latexallergenen sind auf die

Verfügbarkeit spezifischer Latexantikörper angewiesen. Eingesetzt werden unter

anderem humane Antikörper, für deren Gewinnung sensibilisierte Personen

bereitstehen müssen oder Kaninchen-Antikörper, die über das Ausbluten der Tiere

gewonnen werden. Auch monoklonale Antikörper werden genutzt, die jedoch

lediglich Einzelallergene und somit nicht das gesamte Spektrum der Latexallergene

erfassen können.

Ziel der vorliegenden Arbeit war der Aufbau eines standardisierten und zugleich

tierfreundlichen Inhibitionsassays zur Latexallergenbestimmung in Kautschuk-

produkten. Hierfür sollten Immunglobuline der Klasse Y, die zuvor aus dem Hühnerei

gewonnen wurden, eingesetzt werden.

8

Im Folgenden soll zunächst eine Einleitung zum Einstieg in die Thematik gegeben

werden, die einen Überblick über die Latexallergie in Bezug auf ihren

geschichtlichen, pathophysiologischen und wirtschaftlichen Hintergrund gibt.

Anschließend werden die Herstellung von Einmalhandschuhen sowie aktuelle

Richtwerte zum Allergengehalt beleuchtet.

Es schließt sich ein Überblick der gängigen Testmethoden an, der eine

Charakterisierung des IgY-Hühner-Antikörpers beinhaltet.

Dem nachfolgenden Abschnitt „Material und Methoden“, der die experimentelle

Vorgehensweise dokumentiert, folgt eine Zusammenfassung der Ergebnisse. Diese

werden in der darauf folgenden Diskussion interpretiert und zuletzt noch einmal in

der Zusammenfassung im Gesamtkontext bewertet.

1.2 Grundprinzipien der Allergie

Unter einer Allergie versteht man eine überschießende Reaktion des Immunsystems

auf für gewöhnlich harmlose Antigene, der eine Sensibilisierungsreaktion durch einen

vorangegangenen Kontakt mit einem allergenen Stoff vorausgeht. Schon 1963

beschrieben Gell und Coombs vier unterschiedliche Formen der Allergie (Gell und

Coombs 1963). Die von Ihnen entwickelte Einteilung der allergischen Reaktion in Typ

I bis Typ IV gilt weitestgehend bis heute. Bei der durch das Tragen von

Latexhandschuhen hervorgerufenen Immunreaktion spielt neben der durch chemische

Zusatzstoffe hervorgerufenen Typ IV-Allergie (Zucker-Pinchoff und Stadtmauer 2002) die

durch Allergene aus dem Pflanzensaft des Kautschukbaumes Hevea brasiliensis (Nature

Rubber Latex NRL) Typ I-Allergie eine wesentliche Rolle.

Die Typ I-Allergie wird auch als Soforttypallergie bezeichnet, da sie innerhalb von

Sekunden bis wenigen Minuten nach Allergenkontakt ihr volles klinisches Bild zeigt.

Sie wird durch Immunglobuline E (IgE), die auf der Oberfläche von sogenannten

Mastzellen sitzen, vermittelt. Hierbei wird das vermeintlich den Körper bedrohende

Antigen durch IgE-Antikörper erkannt und an die Mastzelle gebunden. Das Binden

des Antigens führt zur Mastzelldegranulation. Hierbei schüttet die Zelle hauptsächlich

ihr in Granula gespeichertes Histamin aus. Histamin ist ein stark und schnell

wirkender Mediator der Entzündungsreaktion. Zusätzlich werden viele weitere

Mediatoren freigesetzt, wie zum Beispiel vasoaktive Amine, Leukotriene und

Prostaglandine. Gemeinsam verursachen sie eine Erhöhung der lokalen

9

Durchblutung und Gefäßpermeabilität, zum anderen wirken sie chemotaktisch auf

Leukozyten und andere Zellen der humoralen Abwehr.

Lokale Ödeme und Hyperämie sind nur zwei Symptome der allergischen Reaktion,

die im schlimmsten Fall bis zum anaphylaktischen Schock reichen kann. Allergische

Rhinitis und Konjunktivitis sowie allergisches Asthma bronchiale und lokale oder

generalisierte Kontakt-Urtikaria können ebenso die Folge sein (Toraason et al. 2000)

1.3 Nature Rubber Latex (NRL) – ein Allergen?

Als Nature Rubber Latex wird der milchige Saft aus dem Baum Hevea brasiliensis

bezeichnet, der zur Familie der Euphorbaceae gehört (Deval et al. 2008). Dieser

stammt ursprünglich aus Brasilien, wird aber heute hauptsächlich in großen Teilen

Südostasiens angebaut (Yeang et al. 2002). Die Latexmilch befindet sich direkt

unterhalb der Rinde des Gummibaums. Hier existiert ein röhrenähnliches,

verzweigtes System, das auf die Latexmilchproduktion spezialisierte Zellen enthält.

Diese Zellen beinhalten in ihrem Zytoplasma cis-1,4 Polyisoprene (allgemein bekannt

als Kautschuk), Wasser und Organellen. Des Weiteren finden sich diverse Proteine,

die beispielsweise bei der Biosynthese der Polyisoprene beteiligt sind. Der

durchschnittliche Proteingehalt der Latexmilch liegt aufgrund dieser Zellbestandteile

bei 1%.

Gewonnen wird dieser Rohstoff durch schräges Anritzen der Rinde, was das

Austreten und Auffangen der Milch ermöglicht. Die gewonnene Rohmilch wird

normalerweise unverzüglich einigen chemischen Behandlungen ausgesetzt, wie der

Substitution von Ammoniak, um ein Gerinnen der Milch zu verhindern. Dieses

Vorgehen kann zu einer Veränderung der Proteinstruktur und zur Aggregation

mehrerer Proteine führen. Es werden wasserlösliche und nichtlösliche Proteine

unterschieden. Zentrifugiert man die frisch gewonnene Latexmilch, so trennt sie sich

in eine feste Phase, die die Kautschukanteile enthält und in eine flüssige Phase, die

als C-Serum bezeichnet wird. Dieses C-Serum enthält ungefähr 200 unterschiedliche

Proteine, von denen etwa ein Viertel eine allergene Potenz aufweist und IgE

Antikörper bindet (Alenius et al. 2002, Posch et al.1997, Sussman et al. 2002,

Zucker-Pinchoff und Stadtmauer 2002).

10

Derzeit sind vierzehn Proteine durch die International Union of Immunological

Societies (IUIS) als Latexallergie verursachend definiert und benannt worden, wobei

einige von ihnen mehrere Isoformen aufweisen (siehe Tab.1).

Tabelle 1 Übersicht der benannten Latexallergene (IUIS)

Allergen Biochemischer Name Molekulargewicht in kDa

Hev b 1 Rubber elongation factor 14

Hev b 2 beta-1,3-glucanase 34

Hev b 3 Small rubber particle protein 24

Hev b 4 Lecithinase homologue 53-55

Hev b 5 Acidic protein 16

Hev b 6.01 Pohevein 20

Hev b 6.02 Hevein 4,7

Hev b 6.03 Prohevein C terminus 14

Hev b 7.01 Patatin-like protein 42

Hev b 7.02 Patatin-like protein 44

Hev b 8 Profilin 15

Hev b 9 Enolase 51

Hev b 10 Superoxide dismutase (Mn) 26

Hev b 11 Class I chitinase 30

Hev b 12 Non-specific lipid transfer

protein 1

9

Hev b 13 Esterase 42

Hev b 14 Hevamine 30

Einige der in Tab.1 genannten Allergene haben unter anderem Aufgaben im

Abwehrmechanismus der Pflanze und werden beispielsweise nach Rindenverletzung

vermehrt exprimiert (Yeang et al. 2002).

1.4 Die Latexallergie

1.4.1 Die Latexallergie – Ursachen, Manifestation und Prävention

Einer der ersten Fälle einer „Überempfindlichkeitsreaktion gegen Kautschuk als

Ursache von Urtikaria und Quinckeschem Ödem“ wurde bereits 1927 dokumentiert

(zitiert in Raulf-Heimsoth et al. 2001). Die Prävalenz und somit auch das Interesse an

11

der Latexallergie stiegen allerdings erst mit dem sprunghaft zunehmenden Gebrauch

von Einmalhandschuhen im Gesundheitswesen im Zusammenhang mit dem

vermehrten Auftreten von Hepatitis B und HIV-Infektionen (Toraason et al. 2000).

Dies erklärt, warum erst um 1980 die Berichte über lebensbedrohliche Zwischenfälle

im Zusammenhang mit der Exposition gegenüber latexhaltigen Materialien

zunahmen (Murat 2000).

Atopiker haben eine deutliche Prädisposition für eine Sensibilisierung gegen Latex.

Sensibilisierend ist hauptsächlich ein ständig wiederholter Kontakt mit Latex

enthaltenden Materialien, die durch einen Tauchprozess (siehe 2.4) hergestellt

werden. Beispiele hierfür sind Einmalhandschuhe, Kondome, Blasenkatheter oder

auch Beatmungstuben (Charous et al. 2002).

Sensibilisierte Kinder haben meist eine Vorgeschichte mit multiplen Operationen

durchlaufen. In den meisten Fällen handelt es sich um Kinder mit einer Spina bifida

oder einer Urogenitalanomalie, die schon in jüngstem Alter durch wiederholte

operative Eingriffe einer massiven Latexexposition ausgesetzt sind. Findet eine

Sensibilisierung im Erwachsenenalter statt, so ist sie meist auf eine Erwerbstätigkeit

im Gesundheitswesen zurückzuführen, die mit einem erhöhten Gebrauch von

latexhaltigen Einmalhandschuhen einhergeht (Turjanmaa und Mäkinen-Kiliunen

2002).

Im Gegensatz zu der Sensibilisierung durch direkten Hautkontakt gibt es auch eine

Gefahr der Sensibilisierung durch eingeatmete Latexallergene aus der Raumluft.

Hierbei stellen insbesondere gepuderte Handschuhe eine Gefahr dar. Ihre

latexallergenhaltige Puderschicht aus phosphatiertem Maismehl gelangt beim An-

und Ausziehen in klinisch relevanten Mengen in die Raumluft. Diese regelmäßige

Exposition kann nachweislich zu einer Sensibilisierung führen (Chen und Baur 1999,

Quirce et al. 2003).

Nach einer Sensibilisierung findet sich eine Vielzahl unterschiedlicher Möglichkeiten

einer ungewollten Allergenexposition. Nicht nur der Kontakt mit Latexallergenen im

Gesundheitswesen spielt hier eine Rolle. Das Verzehren von Obst und Gemüse, das

12

zuvor im Rahmen der industriellen Reinigung und Verpackung von Mitarbeitern mit

Latexhandschuhen angefasst wurde, kann ebenfalls für eine sensibilisierte Person

eine Gefahrenquelle darstellen, da sich wasserlösliche Allergene des Handschuhs

auf der Schale ablagern können. Leichtere Reaktionen auf einen solchen Kontakt

sind allergisches Asthma, allergische Rhinitis und Konjunktivitis aber auch

Kontakturtikaria. Berichtet wurden aber auch Fälle, bei denen beispielsweise im

Rahmen einer Haarverlängerung ein latexhaltiger Klebstoff verwendet wurde, der

nach Kontakt zur Kopfhaut zu einem anaphylaktischen Schock führte (Turjanmaa

und Mäkinen-Kiliunen 2002). In der Kinderanästhesie stellt die Latexallergie sogar

die Hauptursache für anaphylaktische Reaktionen im Rahmen einer Narkose dar und

überholt die Gruppe der Muskelrelaxantien, die im Erwachsenenalter führend ist

(Murat 2000).

Die Allergie gegen Naturlatex ist assoziiert mit einer Reihe von

Nahrungsmittelallergien. Verantwortlich ist eine Kreuzreaktivität mit einzelnen

Früchten, zu denen Banane, Kiwi, Melone, Papaya und Ananas zählen. Aber auch

einige Gemüsesorten und Kräuter wie zum Beispiel Kartoffeln, Tomaten und Dill

stehen im Verdacht (Charous et al. 2002). Das Latex-Frucht-Syndrom beinhaltet

einen positiven Hauttest auf Latex sowie Banane, Avocado, Kastanie oder Kiwi

(Alenius et al. 2002, Zucker-Pinchoff und Stadtmauer 2002).

Um einer fortschreitenden Sensibilisierung und somit dem vermehrten Auftreten von

Latexallergien vorzubeugen, gibt es einige bewährte Methoden zur Minimierung des

Allergenkontakts. So ist nachgewiesen, dass das Verwenden von nur leicht

gepuderten oder puderfreien Handschuhen den Allergengehalt in der Raumluft und

somit das Sensibilisierungsrisiko senkt. Dies gilt auch für das Verwenden

leistungsfähiger Luftfiltersysteme (Chen und Baur 1999). Aber nicht nur die

Reduktion des Allergengehalts der Raumluft wirkt präventiv. Ebenfalls ist der strikte

Gebrauch von puderfreien, allergenarmen Handschuhen und somit die Reduktion der

Allergenexposition gegenüber der Haut des Trägers von Bedeutung (Charous et al.

2002).

Erfolgreich ist auch das konsequente Erzeugen eines latexfreien Umfeldes in der

Behandlung von Spina-bifida-Patienten. Dies gilt auch für bereits sensibilisierte

13

Patienten. Beide Gruppen sollten beispielsweise als erste Patienten des Tages auf

dem Operationsprogramm stehen, da zu dieser Zeit die Raumluftbelastung und eine

mögliche Kontamination der Oberflächen des Operationssaals am geringsten sind

(Murat 2000).

1.4.2 Die Bedeutung der Latexallergie als Berufskrankheit

Die rechtlichen Grundlagen zur Anerkennung einer Erkrankung als Berufskrankheit

(BK) sind in der Berufskrankheiten-Verordnung (BKV) des Sozialgesetzbuches VII

festgelegt. Diese wurde vom Bundesministerium der Justiz zuletzt 2009 aktualisiert,

und ihre Grundlage ist im Bundesgesetzblatt Teil 1 festgehalten. Anerkannte

Berufskrankheiten sind in der „Anlage 1 zur Berufskrankheiten-Verordnung“

aufgezählt. Diese Berufskrankheiten-Liste umfasst sechs Krankheitsgruppen. Hier

finden sich in der Gruppe fünf unter der BK Nummer 5101 „Schwere oder wiederholt

rückfällige Hauterkrankungen, die zur Unterlassung aller Tätigkeiten gezwungen

haben, die für die Entstehung, die Verschlimmerung oder das Wiederaufleben der

Krankheit ursächlich waren oder sein können“.

Die Hauptmanifestation der Latexallergie als Hautkrankheit ist unter der BK-Nummer

5101 einzuordnen.

Latexbedingte Atemwegserkrankungen finden sich unter der BK-Nummer 4301. Auf

diese wird an dieser Stelle nicht weiter eingegangen, da der Fokus der vorliegenden

Arbeit auf der Gefahr von Hautkrankheiten durch das Tragen von

Einmalhandschuhen liegt.

Von den im Jahr 2008 insgesamt 63.757 Anzeigen auf Verdacht einer

Berufskrankheit wurde in 18.995 Fällen der Verdacht auf eine Hauterkrankung (BK-

Nr. 5101) gestellt (BMAS 2010). Die Anzeige einer BK-Nr. 5101 stellt folglich

annähernd ein Drittel der gesamten Verdachtsfälle dar. Nur ein geringer Anteil der

angezeigten Fälle wird offiziell als Berufskrankheit anerkannt.

Abb. 1 zeigt die Anzahl angezeigter beziehungsweise anerkannter Berufskrankheiten

Nr. 5101 im zeitlichen Verlauf. Hierbei fällt auf, dass der im Jahr 1998 beginnende

14

Rückgang der Verdachtsanzeigen im Jahr 2004 endet und seitdem eine stetig

steigende Anzahl von Verdachtsfällen zu verzeichnen ist.

Die Zahl der anerkannten Berufskrankheiten Nr. 5101 ist von 1995 bis 2007

annähernd durchgehend gesunken. Im Jahr 2008 wurden erstmals wieder mehr

Berufskrankheiten anerkannt als im vorausgehenden Jahr.

Abbildung 1 Kennzahlen der Berufskrankheit Nummer 5101, 1995-2008

Die BK-Nr. 5101 steht insgesamt an fünfter Stelle der anerkannten Berufskrankheiten

(BMAS 2010).

Die Aufschlüsselung (siehe Tab. 2 und Abb. 2), der „anerkannten Berufskrankheiten,

die im Jahr 2008 zur Unterlassung aller schädigenden Tätigkeiten gezwungen

haben“, zeigt, dass die BK-Nr. 5101 hier mit 42,8 % der Fälle führt

(Bundesministerium für Arbeit und Soziales (BMAS 2010)).

21

22

4

22

48

6

21

92

2

23

34

9

22

16

4

20

93

1

21

44

0

19

73

1

16

67

7

16

16

5

16

83

3

17

52

6

18

44

8

18

99

5

23

60

20

61

23

07

18

55

17

35

16

80

15

15

15

81

13

20

12

88

89

8

72

4

62

6

64

7

0

5000

10000

15000

20000

25000

Angezeigte Verdachtsfälle Anerkannte Berufskrankheiten

Tabelle 2 Übersicht anerkannter Berufskrankheiten, die zur Unterlassung aller

schädigenden Tätigkeiten gezwungen haben 2008

BK-Nr. Berufskrankheiten-Kurzbezeichnung

5101 Schwere oder wiederholt rückfällige

4301 Durch allergisierende Stoffe verursachte obstruktive

Atemwegserkrankungen

2108 Bandscheibenbedingte Erkrankungen der Lendenwirbelsäule

durch langjähriges Heben oder Tragen

durch langjährige Tätigkeiten in extremer Rumpfbeugehaltung

4302 Durch chemisch-irritativ oder toxisch wirkende Stoffe verursachte

obstruktive Atemwegserkrankungen

1315 Erkrankungen durch Isocyanate

2104 Vibrationsbedingte Durchblutungsstörungen

2110 Bandscheibenbedingte Erkrankungen der Lendenwirbelsäule

durch langjährige, vorwiegend vert

Ganzkörperschwingungen im Sitzen

2101 Erkrankungen der Sehnenscheiden oder des

Sehnengleitgewebes sowie der

2109 Bandscheibenbedingte Erkrankungen der Hal

durch langjähriges Tragen schwerer Lasten auf der Schulter

Gesamt

BK-Nr. = Berufskrankheiten-Nummer nach der Berufskrankheiten(Daten: BMAS 2010)

BK-Nr. = Berufskrankheit

(Daten: BMAS 2010)

Abbildung 2 Vergleich anerkannter Berufskrankheiten, die zur Unterlassung aller schädigenden Tätigkeiten gezwungen

0,0%

10,0%

20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

BK-Nr.

5101

BK-Nr.

4301

bersicht anerkannter Berufskrankheiten, die zur Unterlassung allerschädigenden Tätigkeiten gezwungen haben 2008

Kurzbezeichnung Anzahl

Schwere oder wiederholt rückfällige Hauterkrankungen

Durch allergisierende Stoffe verursachte obstruktive

Atemwegserkrankungen

Bandscheibenbedingte Erkrankungen der Lendenwirbelsäule

durch langjähriges Heben oder Tragen schwerer Lasten oder

Tätigkeiten in extremer Rumpfbeugehaltung

irritativ oder toxisch wirkende Stoffe verursachte

Atemwegserkrankungen

Erkrankungen durch Isocyanate

Vibrationsbedingte Durchblutungsstörungen an den Händen

Bandscheibenbedingte Erkrankungen der Lendenwirbelsäule

durch langjährige, vorwiegend vertikale Einwirkung von

schwingungen im Sitzen

Erkrankungen der Sehnenscheiden oder des

Sehnengleitgewebes sowie der Sehnen- oder Muskelansätze

Bandscheibenbedingte Erkrankungen der Halswirbelsäule

Tragen schwerer Lasten auf der Schulter

1513

Nummer nach der Berufskrankheiten-Verordnung

krankheiten-Nummer nach der Berufskrankheiten-Verordnung

Vergleich anerkannter Berufskrankheiten, die zur Unterlassung schädigenden Tätigkeiten gezwungen haben 2008

Nr.

4301

BK-Nr.

2108

BK-Nr.

4302

BK-Nr.

1315

BK-Nr.

2104

BK-Nr.

2110

BK-Nr.

2101

15

bersicht anerkannter Berufskrankheiten, die zur Unterlassung aller

Anzahl Angabe in

%

647 42,8

408 27

265 17,5

116 7,7

32 2,1

14 0,9

13 0,9

11 0,7

7 0,5

1513 100

Verordnung

Vergleich anerkannter Berufskrankheiten, die zur Unterlassung haben 2008

Nr. BK-Nr.

2109

16

Diese Zahlen zeigen, dass die Latexallergie trotz präventiver Maßnahmen (siehe

2.3.1) nach wie vor eine große Bedeutung als Berufskrankheit hat.

Zusammengefasst belegt die BK-Nr. 5101 den fünften Platz der am häufigsten

anerkannten Berufskrankheiten, den ersten Platz der gemeldeten Verdachtsfälle und

liegt an erster Stelle in Hinblick auf den Zwang zur Unterlassung der schädigenden

Tätigkeit.

1.5 Herstellung von Latexhandschuhen

Der Rohstoff Naturlatexmilch kann auf zwei Arten behandelt und somit haltbar

gemacht werden. 90 % der gewonnenen Latexmilch wird in eine trockene Form

gebracht, die in Platten gehandelt und später zur Herstellung von

Hartgummiprodukten wie beispielsweise Schuhsohlen oder Autoreifen genutzt wird.

Ein geringerer Anteil der Latexmilch wird für dünnschichtige Produkte wie

Einmalhandschuhe, Kondome oder auch Luftballons genutzt und wie folgt behandelt

(Zucker-Pinchoff und Stadtmauer 2002):

Zunächst wird die Latexmilch mit Ammoniak versetzt, was dem beginnenden

Gerinnungsprozess entgegenwirken soll, den pH-Wert stabilisiert und das Wachstum

von Bakterien und somit das Verderben der Milch verhindert. Antioxidantien werden

ebenfalls hinzugefügt.

Eine Zentrifugation der Latexmilch erbringt die gewünschte Reduktion des

Wassergehaltes, entfernt größere Kautschukpartikel und führt zu einer Abnahme

des Proteingehalts um 50 %.

Zur Herstellung des Latexhandschuhs wird eine Porzellanform (in Form einer Hand)

in die flüssige Latexmilch getaucht. Um diesen Zustand zu konservieren und die

natürliche Barrierefunktion des Latexfilms zu verstärken schließt sich eine

Vulkanisation an. Hierbei wird das Latexmonomer cis-1,4 Polyisoprene durch

schwefelhaltige Vulkanisatoren bei über 100 °C zu einem Polymer vernetzt. Zur

Beschleunigung dieser Reaktion werden sogenannte Akzeleratoren eingesetzt, oft

Thiurame oder Diäthyldithiocarbamate. Die vollständige Vulkanisation erfolgt meist

nach dem Tauchvorgang, kann jedoch auch schon zuvor als Prävulkanisation

stattfinden.

17

Beim Tauchprozess sind nicht so hohe Temperaturen wie bei der Herstellung von

Hartgummiprodukten erforderlich, was mit einer geringeren Denaturierung der

Proteine einhergeht. Dies ist eine mögliche Erklärung für den verhältnismäßig hohen

Proteingehalt getauchter Latexprodukte (Charous et al. 2002).

Abschließend wird der Handschuh extensiv gewaschen. Ziel dieses sogenannten

„Leachings“ ist es, auf der Oberfläche sitzende Proteine abzuwaschen und den

Proteingehalt damit zu minimieren. Chloridionen sorgen für das Ablösen einzelner

Proteine von der Oberfläche und für eine Versiegelung dieser (Beezhold 2002, Paul

Hartman GmbH, Parella und Gaspari 2002, Toraason et al.2000, Zucker-Pichoff,

Stadtmauer 2002).

Um das problemlose Ablösen des durch das Tauchen entstandenen Rohhandschuhs

von der Porzellanform zu ermöglichen, wird meist ein Puder aus Maismehl

verwendet. Solche Trennmittel verhindern das Zerreißen des noch instabilen

Handschuhs. Aber nicht nur während des Herstellungsprozess bieten solche

Pudersubstanzen einen Vorteil. Auch in der anschließenden Verpackung und

Lagerung der fertigen Handschuhe ist eine dünne, oberflächliche Puderschicht

nützlich. Sie verhindert ein Zusammenkleben sowohl der Innenseiten eines

Handschuhs als auch der Außenseiten mehrerer Handschuhe in einer

Verpackungseinheit. Ebenfalls erhöht sich der Tragekomfort des Handschuhs. Eine

dünne Innenpuderschicht ermöglicht ein besseres An- und Ausziehen und fängt bei

langem Tragen entstehenden Schweiß auf (Truscott 2002).

Trotz des auf der Hand liegenden Vorteils von Pudern jeglicher Art gibt es in den

letzten Jahren aufgrund der damit verbundenen erhöhten Allergenfreisetzung die

Bestrebung, gepuderte Handschuhe nicht mehr zu produzieren und darüber hinaus

den Proteingehalt so gering wie möglich zu halten. Der Allergengehalt im Puder

durch Maisproteine ist vernachlässigbar. Vielmehr bindet das Maismehl die

Latexallergene, so dass sich diese in der Puderschicht anreichern (Beezhold et al.

2002).

Gepuderte Handschuhe haben daher einen deutlich höheren Protein- und

Allergengehalt als ungepuderte und stellen somit ein höheres Risiko für ihren Träger

und andere Kontaktpersonen dar. Auch die allergene Raumluftbelastung ist höher,

18

da die Puderpartikel als Trägersubstanz für die Latexallergene fungieren und eine

Ausbreitung in der Luft begünstigen (Chen und Baur 1999).

Als puderfrei gilt nach dem Deutschen Institut für Normung (DIN) und der DIN 455-

3:2006 ein Handschuh, von dessen Oberfläche sich 2 mg oder weniger Puder oder

anderes Material lösen lassen.

1.6 Aktuelle Richtwerte und Regeln im Umgang mit latex-

haltigen Einmalhandschuhen

In der Bundesrepublik Deutschland sind Richtwerte und Regeln im Umgang mit

latexhaltigen Einmalhandschuhen in zwei Schriften festgehalten. Hierbei handelt es

sich zum einen um die Normen des „Deutschen Instituts für Normung e. V.“ (DIN)

und zum anderen um die „Technischen Regeln für Gefahrstoffe“ (TRGS). Letztere

werden von der Bundesanstalt für Arbeitsschutz und Arbeitsmedizin (BAuA), die in

den Geschäftsbereich des Bundesministeriums für Arbeit und Soziales (BMAS)

gehört, veröffentlicht und regelmäßig aktualisiert.

In der DIN 455-3, die unter anderem die Anforderungen an medizinische

Handschuhe zum einmaligen Gebrauch aufstellt, findet sich ein Hinweis für

Handschuhhersteller, der besagt, dass exakte Angaben von Proteinwerten unter

50µg Protein/g Handschuh nicht erlaubt sind (Deutsches Institut für Normung e.V.

2007). Als Grund hierfür werden Schwankungen des Proteingehalts durch

Prozessvariationen in der Herstellung und in der Testung der Handschuhe genannt.

Wichtige Hinweise und Richtlinien zum Umgang mit Einmalhandschuhen finden sich

in der TRGS 401, die sich besonders an Arbeitgeber wendet und der Verbesserung

des Arbeitsschutzes gefährdeter Arbeitnehmer dient (BAuA 2008). Die TRGS 401

betrifft hauptsächlich die „Gefährdung durch Hautkontakte“.

Inhaltlich werden zunächst Stoffe beziehungsweise Stoffgruppen definiert, die für die

Entstehung eines allergischen Kontaktekzems eine Bedeutung haben. In der Gruppe

der „Tierischen und Pflanzlichen Proteine“ ist der Stoff „Naturkautschuklatex“ zu

finden. Die TRGS 401 befasst sich weiter mit der Pathogenese der

19

Latexsensibilisierung durch das Tragen von Einmalhandschuhen und stellt hier vor

allem den Okklusionseffekt flüssigkeitsdichter Handschuhe in den Vordergrund.

Durch die Schweißbildung und -ansammlung zwischen Haut und Handschuh komme

es zu einem Aufweichen der Haut, dass die natürliche Abwehrfunktion des Gewebes

schwäche und ein anschließendes Eindringen von Allergenen aber auch anderen

schädigenden Substanzen begünstige.

Die Empfehlungen der TRGS 401 im Umgang mit Latexhandschuhen besagen, dass

die Tragedauer möglichst gering sein und den Zeitraum von vier Stunden nicht

überschreiten soll, dass ein stündlicher Handschuhwechsel stattfinden soll und ein

Wechsel zwischen Tätigkeiten mit und ohne Handschuhen erstrebenswert ist.

Zusätzlich wird auf die Beachtung von Haltbarkeitsdatum und korrekter Lagerung

hingewiesen.

Die TRGS 401 enthält außerdem Richtlinien zu Beratung, Vorsorge- und

Pflichtuntersuchungen, die dem Arbeitnehmer durch den Arbeitgeber angeboten

werden müssen.

Es wird zusätzlich eine Empfehlung zum Proteingehalt der Handschuhe gemacht. So

darf ein Handschuh den Gesamtproteingehalt von 30 µg Protein/g Handschuh nicht

überschreiten.

Ebenfalls wird darauf hingewiesen, dass Latexhandschuhe nicht gepudert sein

dürfen beziehungsweise gepuderte Handschuhe durch nicht gepuderte ersetzt

werden sollen.

Die TRGS 401 ersetzt gemeinsam mit den „Technischen Regeln für biologische

Arbeitsstoffe und Gefahrstoffe“ (TRBA/TRGS) 406 seit Juni 2008 die bis dahin

gültige TRGS 540 (BAuA 2008).

Die TRBA/TRGS 406 enthält Richtlinien zum Umgang mit „Sensibilisierenden Stoffen

für die Atemwege“, zu denen der Stoff Naturkautschuklatex gezählt wird (BauA

2008). Die Hinweise der TRGS 401 zum Umgang mit latexhaltigen Handschuhen

finden sich in der TRBA/TRGS 406 weitestgehend wieder. Auch hier wird als

empfohlener maximaler Gesamtproteingehalt die Angabe von 30 µg Protein/g

Handschuh gemacht (TRBA/TRGS 406).

20

1.7 Quantifizierung von Allergenen in Probenmaterial

1.7.1 Überblick gängiger Testmethoden und Standards

Sämtlichen Testverfahren geht eine Extraktion des zu untersuchenden Handschuhs

voraus (siehe 3.3.1). Das in Deutschland gültige Testverfahren zur Bestimmung des

Proteingehalts latexhaltiger Handschuhe wird vom Deutschen Institut für Normung

e.V. festgelegt und ist in Form der DIN 455-3 zuletzt im Jahr 2006 aktualisiert

worden. Hiernach wurde die modifizierte Lowry-Methode als Standardmethode

bestimmt (siehe 3.3.2). Sie misst den Gesamtproteingehalt (nicht den

Latexallergengehalt!) einer Probe mittels spektralphotometrischer Messung der

Intensität einer Farbentwicklung, die auf der Reduktion von Kupferionen basiert. Sie

findet ihren Ursprung in der 1951 publizierten Proteinbestimmung nach Lowry (Lowry

et al. 1951).

Eine weitere Methode, die den Gesamtproteingehalt ermittelt, ist die

Aminosäureanalyse „High-performance-liquid-chromatography“ (HPLC). Sie gilt

allerdings als sehr aufwändig, zeitintensiv und teuer (MAT 1 – CT 940060, 1998).

Hierbei werden die in der Probe enthaltenen Proteine hydrolysiert und anschließend

die Summe der Aminosäuren bestimmt, was Rückschluss auf die Gesamt-

proteinmenge zulässt.

Den proteinchemischen Methoden (mod. Lowry und HPLC) stehen mehrere

immunologische Methoden gegenüber, deren Ziel es ist, den genauen Allergengehalt

eines Handschuhs zu bestimmen.

Während mit den proteinchemischen Methoden der Proteingehalt gemessen wird, ist

es das Ziel der immunologischen Methoden, den Anteil der Proteine zu messen, der

eine allergene Potenz aufweist, also den Allergengehalt. Dies ist insofern sinnvoll, als

dass nicht sämtliche in Latexprodukten enthaltenen Proteine als Allergen fungieren.

Ebenfalls wird eine Korrelation zwischen Protein- und Allergengehalt in Frage gestellt

(Fuchs 2002, DIN 455-3). Das Interesse an validen immunlogischen Methoden, mit

denen der spezifische Allergengehalt gemessen werden kann, ist daher groß.

Die meisten immunologischen Tests beruhen auf dem Prinzip des „Enzyme-linked-

immunosorbent-assay“ (ELISA), (siehe 2.6.2). Sie unterscheiden sich zum einen in

der Art der verwendeten Antikörper, beispielsweise humanes IgE oder IgG aus

Kaninchenserum, radioaktiv markiert oder enzymgekoppelt, zum anderen im

21

methodischen Vorgehen. So gibt es Assays, die dem Prinzip des ELISAs direkt

folgen („Latex-ELISA-for-Antigenic-Protein“ (LEAP)), aber auch Methoden, denen

eine Inhibitionsreaktion zugrunde liegt („Radioallergosorbent-test“ (RAST), IgE-

ELISA-Inhibtionsassay) oder ein Sandwich-Prinzip („Monoclonal-antibody-based-

sandwich-ELISA“) (Palosuo et al. 1998, Raulf-Heimsoth et al. 2000, Tomazic-Jezic

and Lucas 2002).

Zwei im Rahmen dieser Arbeit eingesetzte Methoden folgen dem Prinzip des

Inhibitions-ELISA, bei dem über die Menge eines verbrauchten Antikörpers

Rückschluss auf die Allergenmenge erhalten wird (siehe 2.5.3).

Die eine Methode ist ein RAST-Inhibitionsassay im CAP-System (Capacity-System)

(siehe 3.3.3.3). Hierbei werden Antikörper der Klasse E aus dem Serum

latexsensibler Patienten verwendet, um die Allergene zu untersuchender Proben zu

quantifizieren.

Die in den USA von der ASTM (American Society for Testing and Materials) als

Standard geltende Methode zur Bestimmung des Allergengehalts in latexhaltigen

Materialien ist ein Inhibitions-ELISA (siehe 2.5.3), dessen Antikörper aus dem Serum

zuvor sensibilisierter Kaninchen stammt (ASTM D 6499-07). Hierbei handelt es sich

um Antikörper der Klasse IgG. Es wird über die Menge des in einer Inhibition

verbrauchten IgG-Antikörpers Rückschluss auf den Allergengehalt gezogen (siehe

3.3.3.3).

1.7.2 Wie funktioniert ein ELISA?

Der ELISA gehört zur Gruppe der Immunoassays der Bioanalytik, mit denen man in

Flüssigkeiten gelöste Antigene oder Antikörper nachweisen kann. Möglich ist dies

durch die spezifische Antigen-Antikörper-Bindung, die nach dem Schlüssel-Schloss-

Prinzip funktioniert.

Die Abkürzung ELISA steht für Enzyme-linked-immunosorbent-Assay, da die

Bindung von Antigen und Antikörper durch eine enzymatische Farbreaktion

nachgewiesen wird. Dies ist durch einen zweiten, enzymmarkierten Antikörper

möglich, der spezifisch an den ersten Antikörper bindet und mit einem anschließend

hinzugefügten Substrat reagiert. Die Intensität der Reaktion gibt Rückschluss auf die

22

Menge der entstandenen Antigen-Antikörper-Bindungen. Je nach Test wird somit

eine Aussage über den Antigen- oder Antikörpergehalt einer Probe möglich.

Für einen ELISA zur Ermittlung des Antigengehalts einer unbekannten Probe

benötigt man zunächst einen Antikörper, der eine Proteinsequenz aufweist, die eine

für das Antigen charakteristische Struktur erkennt und diese bindet (Epitop). Diese

Antikörper können in verschiedenen gentechnischen oder zellbiologischen Verfahren

hergestellt werden. Sie können aber auch aus dem Blut von Mensch oder Tier

gewonnen werden, sofern dieser Organismus den benötigten Antikörper bildet. Das

folgende Modell soll vereinfacht das Grundprinzip eines ELISA erklären (siehe Abb.

3): Zunächst wird eine Oberfläche mit einem spezifischen Antigen (rot dargestellt)

überzogen. Hierfür wird eine Antigen-Lösung verwendet, die eine bestimmte Zeit mit

der Oberfläche reagiert. Überschüssiges Antigen, das nicht an die Oberfläche bindet,

wird anschließend abgewaschen.

Im nächsten Schritt wird zu dem zu untersuchenden Material ein erster Antikörper

(gelb dargestellt) gegeben. Jedes Antigen bindet einen Antikörper. Überschüssige,

das heißt nicht an ein Antigen gebundene Antikörper werden dann in einem

Waschprozess entfernt. Im Anschluss wird die Menge an gebundenem Antikörper

bestimmt. Dies ist durch einen zweiten, enzymmarkierten Antikörper (blau

dargestellt) möglich. Dieser bindet an den ersten Antikörper. Anschließend wird der

nicht gebundene Anteil des zweiten Antikörpers abgewaschen. Zuletzt wird eine

definierte Menge Substrat zu dem Antikörper-Antikörper-Antigen-Komplex gegeben.

Die Umsetzung des Substrats durch das Enzym des zweiten Antikörpers führt zu

einem Farbumschlag (grün dargestellt) in der Lösung. Die Intensität der

Farbentwicklung wird anschließend, durch die photometrisch gemessene Optische

Dichte (OD) ermittelt. Eine intensive Farbentwicklung steht für eine große Anzahl an

Antigen-Antikörper-Bindungen, wohingegen eine kleine OD für wenige Antigen-

Antikörper-Bindungen steht.

Abbildung 3 Prinzip des ELISA

Durch den Vergleich der Intensität des Farbumschlages von

Allergen- bzw. Antikörpergehalts mit

die Menge des Antigens bzw. Antikörpers

1.7.3 Wie funktioniert ein Inhibitions

Der Inhibitions-ELISA ist eine Varia

eine Inhibitionsreaktion voraus, die in einem ersten Gefäß

stattfindet. Hierbei wird eine Probe unbekannten Allergengehalts

einem ersten Antikörper (gelb dargestellt)

entsprechend wird ein großer oder

Anschließend wird der gesamte Reaktionsansatz in das zweite Gefäß

dargestellt) überführt, dessen Oberfläche wie in 2.6.2 beschrieben mit

besetzt ist.

Im Folgenden gibt es zwei Möglichkeiten:

mit dem an der Oberfläche

dass im ersten Schritt, dem Inhibitionsschritt, nicht die gesamte Antikörpermenge

verbraucht wird. Eine anschließende Bindung der Rest

Prinzip des ELISA

Durch den Vergleich der Intensität des Farbumschlages von Proben bekannten

gehalts mit unbekannten Proben, ist es zusätzlich möglich

des Antigens bzw. Antikörpers zu bestimmen.

ie funktioniert ein Inhibitions-ELISA?

ELISA ist eine Variante des in 2.6.2 beschriebenen ELISA.

voraus, die in einem ersten Gefäß (orange dargestellt)

. Hierbei wird eine Probe unbekannten Allergengehalts (rot dargestellt)

(gelb dargestellt) inkubiert. Dem Allergengehalt der Probe

ein großer oder kleiner Anteil des Antikörpers gebunden.

der gesamte Reaktionsansatz in das zweite Gefäß

essen Oberfläche wie in 2.6.2 beschrieben mit

Im Folgenden gibt es zwei Möglichkeiten: Es reagiert der überschüssige Antikörper

äche gebundenen Antigen (siehe Abb. 4). Hier ist dargestellt,

dass im ersten Schritt, dem Inhibitionsschritt, nicht die gesamte Antikörpermenge

. Eine anschließende Bindung der Rest-Antikörper mit dem

23

Proben bekannten

ist es zusätzlich möglich

des in 2.6.2 beschriebenen ELISA. DIhm geht

(orange dargestellt)

(rot dargestellt) mit

. Dem Allergengehalt der Probe

kleiner Anteil des Antikörpers gebunden.

der gesamte Reaktionsansatz in das zweite Gefäß (schwarz

essen Oberfläche wie in 2.6.2 beschrieben mit dem Antigen

Es reagiert der überschüssige Antikörper

). Hier ist dargestellt,

dass im ersten Schritt, dem Inhibitionsschritt, nicht die gesamte Antikörpermenge

Antikörper mit dem

24

Oberflächenantigen ist möglich. Wie in 2.6.2 beschrieben wird dieser an die

Oberfläche gebundene Anteil durch einen zweiten, enzymmarkierten Antikörper

gebunden. Durch anschließende Substratzugabe und enzymatische Umsetzung

werden die entstandenen Bindungen sichtbar gemacht und es kann anhand der

Intensität des Farbumschlags der Allergengehalt der Probe ermittelt werden.

Abbildung 4 Inhibitions-ELISA (geringer Antigengehalt)

Ist der Allergengehalt der Probe höher, so wird ein größerer beziehungsweise der

gesamte Antikörper im Inhibitionsschritt gebunden (siehe Abb. 5). Nach dem

Überführen des Reaktionsansatzes in das zweite Gefäß kann es nicht zur Bindung

des ersten Antikörpers mit dem Oberflächenantigen kommen, da dieser bereits

komplett in gebundener Form vorliegt. Dem nach dem Waschen hinzugegebenen

zweiten, enzymmarkierten Antikörper steht somit kein erster Antikörper zur Bindung

zur Verfügung. Er wird daher komplett im nächsten Schritt abgewaschen und es

kommt nach Substratzugabe nicht zum Farbumschlag der Lösung.

25

Abbildung 5 Inhibitions-ELISA (hoher Antigengehalt)

Der Zusammenhang zwischen OD und Allergengehalt im Inhibitions-ELISA ist daher

invers: Ein intensiver Farbumschlag steht für einen geringen Antigengehalt – ein

großer Antigengehalt stellt sich durch geringe Farbentwicklung dar.

1.7.4 IgY – ein Antikörper aus dem Hühnerei

Die erste dokumentierte Beobachtung über Antikörper aus den Eiern immunisierter

Hennen findet sich im Jahr 1893, blieb jedoch lange Zeit unbeachtet (Schade et al.

2001). Erst mit der Weiterentwicklung der Bioanalytik, die oft auf das Vorliegen

spezifischer Antikörper angewiesen ist, fand die Möglichkeit, Antikörper aus dem

Hühnerei zu gewinnen, neuen Anklang (Schade et al. 2001).

Zunächst wurde jedoch die Methode der Antikörpergewinnung aus Kaninchenblut

bevorzugt, da die Isolation der Immunglobuline aus dem Eigelb lange eine

zeitaufwändige Herausforderung war und somit die Schwachstelle der Methode

darstellte. Nicht zuletzt durch die Bestrebungen die Tierschutzrichtlinien schärfer zu

gestalten, um dem ethischen Konflikt der Versuchstierhaltung Rechnung zu tragen,

wurde um 1990 das Interesse an IgY-Antikörpern als tierfreundlichere Methode

erneut geweckt.

26

IgY-Antikörper werden aus dem Eigelb der Eier immunisierter Hennen gewonnen. Es

bietet sich also die Möglichkeit einer kontinuierlichen täglichen Quelle der

Antikörpergewinnung. Das Ausbluten und somit der Tod des Versuchstiers, wie im

Fall des Kaninchens (siehe 3.3.3.1) ist daher nicht nötig. Ein quantitativer Vorteil liegt

ebenfalls vor – die aus einem Eigelb gewonnene Antikörpermenge entspricht der

Menge, die aus dem gesamten Blut eines Kaninchens gewonnen werden kann.

Im Gegensatz zu IgG-Antikörpern weisen die IgY-Antikörper ein geringeres Maß an

unspezifischen Bindungen auf. Diese entstehen beispielsweise beim

Zusammentreffen menschlicher Blutproben mit IgG-Antikörpern, da diese mit dem in

der Probe enthaltenen Protein A oder Rheumafaktoren reagieren. Ein weiteres

Problem von IgG-Antikörpern, nicht jedoch IgY-Antikörpern, ist die ungewollte

Aktivierung des Komplementsystems, einer Kaskade von Plasmaproteinen, die Teil

der menschlichen Immunreaktion sind (Haak-Frendscho 1996).

Auch ist das Ausbleiben einer Immunreaktion und somit der Antikörperbildung auf

bestimmte Antigene von Säugetieren bei Hühnern sehr viel seltener als es bei

Kaninchen der Fall ist. Hier wird vermutet, dass der zwischen Huhn und Mensch

größere phylogenetische Abstand einen Vorteil bietet (Schade et al. 2001).

2 MATERIAL UND METHODEN

2.1 Probenmaterial

Die Allergen- beziehungsweise Proteinbestimmungen wurden an gepuderten und

ungepuderten Latex-Einmalhandschuhen verschiedener Hersteller durchgeführt. Als

gepudert gilt entsprechend der DIN 455-3 ein Handschuh, der mehr als 2 mg Puder

enthält, als ungepudert werden Handschuhe mit einem Pudergehalt von 2 mg oder

weniger angesehen (DIN 455-3). Es wurde eine Auswahl gängiger Handschuh-

Modelle gewählt.

27

Tabelle 3 Handschuhproben

Probenname Hersteller LOT-Nr /Charge Gewicht des

extrahierten

Handschuhs in

Gramm

rotiprotect CarlRoth 03200580020297 6,30

Heiland Heiland JD273V00 8,60

Biogel Sigma 99L1280 12,3

Safeskin Kimberly Clark 0095T-5 6,90

peha-soft Hartmann 72492081 7,01

Profissimo dm 7,85

Unigloves Unigloves JC474189 14,71

Hygostar Franz Mensch 5,40

DermaClean Ansell 0808381228 6,47

Comfort-Unigloves Unigloves RH316L76 5,82

Eco-Plus AMPri GmbH E/28/00672 6,48

NeoLab NeoLab 08081901 6,39

Med-Comfort AMPri GmbH 08021602 5,74

H-Schein gep. Henry Schein 217076 6,68

semperguard gep. sempermed 02200707750482 5,27

Braun gep. Braun 02200708208490 5,89

EMITEX gep. EMILA KS131-3T 6,10

Heiland gep. Heiland MC421106-200703 5,63

rotiprotect-gep. CarlRoth 32940153 5,70

Vasco gep. Braun 6066542 5,85

2.2 Materialien

2.2.1 Chemikalien

Anti-Chicken-IgY Alkalische- Promega, Mannheim

Posphatase-konjugiert

Anti-Rabbit-IgG, horseradish- Sigma-Aldrich, München

peroxidase (HRP) conjugated [A-0545]

28

Lowry Micro DC Protein Assay Kit BioRad, München

Diethanolamin Merck, Darmstadt

Magnesiumchlorid MgCl2 Merck, Darmstadt

Natriumchlorid NaCl Merck, Darmstadt

Natriumdesoxycholat (DOC) Serva, Heidelberg

Natriumhydroxid Merck, Darmstadt

4-Nitrophenylphosphate- Sigma-Aldrich, München

disodiumsalt hexahydrate (NNP)

Ortho-Phenylendiamin (OPD)-Tabletten Merck, Darmstadt

Ovalbumin Chickenegg [A-5503] Sigma-Aldrich, München

Phosphorwolframsäure (PTA) Sigma-Aldrich, München

Salzsäure (3 N) HCl CarlRoth, Karlsruhe

Trichloressigsäure (TCA) Merck, Darmstadt

Trockenmilchpulver CarlRoth, Karlsruhe

Tween 20 Merck, Darmstadt

Wasserstoffperoxid H2O2 Merck, Darmstadt

2.2.2 Lösungen und Puffer

Blocking-Puffer 3g Trockenmilchpulver aufgefüllt auf

100 ml mit T-PBS

Carbonat-Puffer pH 9,6 Na2CO3 0,795 g

NaHCO3 1,465 g

NaN3 0,1 g

aufgefüllt auf 500 ml mit Aqua dest.

Coating-Lösung Standard-Antigen-Lösung verdünnt

mit Carbonat Puffer pH 9,6 auf

20 µg/ml

29

DOC-Lösung 0,15 % 15 mg Natriumdesoxycholat

aufgefüllt auf 10 ml mit Aqua dest.

Ovalbumin-Standard-Lösung 1 mg/ml

NRL-Standard-Antigen-Lösung lyophilisiertes Natural-Rubber-Latex

rekonstituiert in Aqua dest., Kon-

zentration 1mg/ml

PBS – 10 x Stamm (Phosphate- NaH2PO4H2O 5,125 g

Buffer Saline) pH 7,4 Na2 HPO47H2O 45 g

Aqua dest. 2000 ml

NaCl 175,3 g

PBS – 1 x Verdünnung (Phosphate- 100 ml 10 x PBS aufgefüllt auf 1 l mit

BufferSaline) pH 7,4 Aqua dest.

Primary-Antibody (IgY-ELISA) IgY enthaltendes Hühner-Serum mit

Verdünnungspuffer auf 1:10 ver-

dünnt

Primary-Antibody (Beezhold) IgG enthaltendes Kaninchen-Serum

mit Verdünnungspuffer auf 1:6000

verdünnt (Gewinnung siehe 3.3.3.2)

PTA-Lösung 72 % 7,2 g Phosphorwolframsäure

aufgefüllt auf 10 ml mit Aqua dest.

Secondary-Antibody (IgY-ELISA) Anti-Chicken-IgY AP-konjugiert

mit Verdünnungspuder auf 1:1000

verdünnt

30

Secondary-Antibody (Beezhold) Anti-Kaninchen-IgG HRP-konjugiert

mit Verdünnungspuffer auf 1:1000

verdünnt

Substrat-Puffer (IgY-ELISA) pH 9,8 Diethanolamin 52,6 g

1M MgCl2 250 µl

aufgefüllt auf 500 ml mit Aqua dest.

Substrat-Lösung (IgY-ELISA) 4-Nitrophenylphosphate disodiumsalt

hexahydrate (NNP)

1,5 mg NNP / ml Substratpuffer

Substrat-Lösung (Beezhold) 1 OPD Tablette aufgelöst in 10 ml

Aqua dest., versetzt mit 30 µl 30 %

H2O2

TCA-Lösung 72 % 72 g Trichloressigsäure aufgefüllt auf

100 ml mit Aqua dest.

Verdünnungspuffer 0,2 g Trockenmilchpulver aufgefüllt

auf 100 ml mit T-PBS

Waschpuffer (T-PBS) 0,5 ml Tween 20

aufgefüllt auf 1 l mit 1 x PBS

2.2.3 Verbrauchsmaterialien

Assay-Platte, Maxi-Sorb 96-well Nunc, Langenselbold

Einmalküvetten Eppendorf, Hamburg

Eppendorf-Tubes Eppendorf, Hamburg

Inhibitionsplatte, Low-protein-binding 96-well Nunc, Langenselbold

31

Parafilm Pechiney plastic packaging,

Menasha, WI, USA

Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg

Plattenversiegelungsfilm Nunc, Langenselbold

Große Zentrifugenröhrchen, Cellstar greiner bio-one,

Frickenhausen

2.2.4 Geräte

Brutschrank Memmert, München

CAP-System, UniCap Phadia, Uppsala, Schweden

ELISA-Reader MR 5000 Dynatech, Offenburg

ELISA- Waschkamm, ImmunoWash 12 Nunc, Langenselbold

Ein-Kanal-Pipette, div. Eppendorf, Hamburg

Feinwaage, SI 234 A Denver Instrument,

Göttingen

Kühlschrank Bosch, Stuttgart

Magnetrührer Ikamag RCT, Basel

Multi-Kanal-Pipette (Multipette) BIOHIT, Rosbach vor der

Höhe

Photometer, SmartSpec Plus Spectro- BioRad, München

photometer

Schüttler Wasserbad 3047 Köttermann, Uetze/Hänigsen

Tiefkühlschrank Liebherr, Biberach an der

Riss

Tischwaage, PC 4400, delta range Mettler Toledo, Giessen

Tischzentrifuge 5415C Eppendorf, Hamburg

Vortex-Schüttler REAX 2000 Heidolph, Schwabach

Zentrifuge groß, rotina 48R Hettich Zentrifugen,

Tuttlingen

Zentrifuge klein, centrifuge 5418 Eppendorf, Hamburg

32

2.3 Methoden

2.3.1 Vorbereitung des Probenmaterials

2.3.1.1 Herstellung von Latexextrakt aus Einmalhandschuhen

Während des gesamten Prozesses der Herstellung der Handschuhextrakte wurden

latexfreie Handschuhe getragen. Eine Verfälschung des Latexgehaltes durch das

Anfassen der Proben mit latexhaltigen Handschuhen wurde dadurch aus-

geschlossen.

In der Literatur findet man unterschiedliche Extraktionsmethoden. In den USA ist von

der ASTM der Standard D 5712-95 als gültige Extraktionsmethode beschrieben. Da

in der vorliegenden Arbeit der Aufbau des IgY-ELISA in Anlehnung an den IgG-

Inhibitions-ELISA nach Beezhold geschah und dieser der Extraktionsmethode D

5712-95 folgt, haben wir letztere Extraktionsmethode gewählt.

Vor der Herstellung der Extrakte wurde das Gewicht der einzelnen Handschuhe

bestimmt (siehe Tab. 2). Anschließend wurde je ein Handschuh einer Marke in 1 x 1

cm große Stücke zerschnitten. Hinzu wurde 1 ml 1 x PBS pro Gramm Handschuh

gegeben. Das mit Parafilm verschlossene Gefäß wurde 2 Stunden im Wasserbad bei

37 °C (entsprechend der Körpertemperatur) geschüttelt. Für die anschließende

Zentrifugation wurde das entstandene Eluat ohne die Handschuhstücke in

Zentrifugenröhrchen dekantiert. Die Zentrifugationszeit betrug 20 Min bei 4000 rpm.

Der hierdurch erhaltene Überstand wurde in weitere Röhrchen dekantiert und in

diesen bis zur Protein- beziehungsweise Allergenbestimmung bei -20 °C gelagert.

2.3.2 Proteinchemische Methoden

2.3.2.1 Proteinbestimmung mit der modifizierten Lowry-Methode

Zur Bestimmung des Gesamtproteingehalts der Probenextrakte nach der

modifizierten Lowry-Methode wurde das Test-Set Lowry Micro DC Protein Assay Kit

der Firma BioRad Laboratories verwendet, welches ein Reagenz A und ein Reagenz

B enthält. Photometrisch gemessen wurden die zuvor hergestellten Probenextrakte

33

(siehe 3.3.1) bei 750 nm. Als Standardreihe wurden sieben Verdünnungen der

Ovalbumin-Standard-Lösung von 0,005 mg/ml bis 0,320 mg/ml angesetzt.

Sowohl die Proben- als auch die Standardverdünnungen wurden in 1,5ml Eppendorf

Tubes angesetzt und anschließend nacheinander mit Trichloressigsäure (72 % TCA-

Lösung), Phosphorwolframsäure (72 % PTA-Lösung) und Natriumdesoxycholat

(0,15 % DOC-Lösung) versetzt. Dies bewirkte eine Befreiung der Proteine von

wasserlöslichen Störsubstanzen und eine Proteinfällung. Zunächst wurden 100 µl

DOC-Lösung zugegeben. Nach 10 Min Inkubationszeit wurden je 100 µl TCA-Lösung

und PTA-Lösung hinzu pipettiert und anschließend mit dem Vortex-Schüttler

gemischt. Nach 20 Min Inkubationszeit bei RT wurden die Proben und die

Standardverdünnungen für 15 Minuten bei 6000 g zentrifugiert. Der hierdurch

entstandene Überstand wurde vollständig dekantiert, und das sich am Boden der

Reaktionsgefäße befindende Pellet in 250 µl 0,1 N Natriumhydroxid gelöst.

100 µl des Reagenz A wurden zugegeben. Nach 15 Min Inkubation bei RT wurden

die Reaktionsansätze abschließend mit 800 µl Reagenz B versetzt. Im ersten Schritt

kommt es hierbei zur Biuretreaktion zwischen den Peptidbindungen der Proteine und

Kupferionen des Reagenz A, hierdurch kommt es zu einer Reduktion der

Kupferionen. Dies ermöglicht im zweiten Schritt eine Reduktion des Reagenz B, was

zu der Entstehung von Molybdänblau führt.

Nach dem Überführen der Proben in Einmalküvetten konnte anschließend der

Proteingehalt der Proben im Vergleich zur Standardreihe photometrisch bei 750nm

ermittelt werden.

2.3.3 Immunologische Methoden

2.3.3.1 Gewinnung der IgG–Antikörper

Zur Gewinnung des IgG wurden Kaninchen immunisiert und anschließend die

Antikörper aus dem Blut der Tiere gewonnen. Das gesamte Vorgehen wurde von

Mitarbeitern der Versuchstierhaltung des Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf

(UKE) durchgeführt. Es wurde gemäß dem Immunisierungsprotokoll zur „Gewinnung

34

diagnostischer Antikörper beim Kaninchen nach §10a TschG“ des UKE

vorgegangen.

Die Erstimmunisierung zweier Kaninchen wurde mit dem Standard-Antigen (StAg)

und komplettem Freund-Adjuvans im Verhältnis 1:1 durchgeführt. Bei der zweiten

Immunisierung wurde vier Wochen später mit Standard Antigen und inkomplettem

Freund- Adjuvans verabreicht.

Nach insgesamt sechs Wochen wurde die Entblutung der Kaninchen in Narkose

durchgeführt, hierbei wurde die maximal mögliche Menge Blut durch transthorakale

Herzpunktion aspiriert und anschließend das Antikörper enthaltende Serum isoliert.

2.3.3.2 Gewinnung der IgY–Antikörper

Die für den IgY-ELISA benötigten Hühnerantikörper lagen zu Beginn dieser Arbeit

bereits vor und wurden in Anlehnung an das Immunisierungsprotokoll zur „Ge-

winnung diagnostischer Antikörper beim Kaninchen nach §10a TschG“ des UKE

hergestellt.

Die Immunisierung von 10 Tieren wurde zweimal mit je 500 µl komplettem Freund-

Adjuvans und 500 µl NRL-Standard-Antigenlösung durchgeführt. Für die

anschließende Extraktion der IgY-Antikörper aus dem Eigelb der Hühnereier wurde

das EGGSTract IgY Purification System der Firma Promega verwendet.

2.3.3.3 CAP-Assay

Bei dem ImmunoCAP (Phadia) handelt es sich um eine Methode, die das Ziel hat,

den IgE-Gehalt der Seren latexsensibler Personen zu quantifizieren. Grundlage der

Methode sind sogenannte CAPs, die eine schwammähnliche Konsistenz haben und

auf ihrer Oberfläche Antigene tragen. Es gibt eine Vielzahl unterschiedlicher CAP-

Schwämme, die kommerziell erhältlich sind. In diesem Fall wurden Latexallergen-

CAPs k82 verwendet.

Prinzip ist hierbei, dass unbekannte Proben mit einer bekannten IgE-Standardreihe

verglichen werden. Diese IgE-Standardreihe besteht aus Referenzantikörpern, die in

35

einem Poolserum vorliegen und aus dem Blut mehrerer Latexallergiker stammen.

Dieses Standardserum wird in unterschiedlichen bekannten Konzentrationen mit den

CAPs inkubiert. Nach einer anschließenden Waschung wird die an die CAPs

gebundene IgE-Menge mittels eines weiteren enzymmarkierten Antikörpers detektiert

und durch Hinzugeben eines Substrats und durch somit entstehende Fluoreszenz

sichtbar gemacht. Unbekannte Proben, mit denen ebenso verfahren wird, können

dann in der Intensität ihrer Fluoreszenz mit der Intensität der bekannten IgE-

Standardreihe verglichen werden, was eine Berechnung der IgE-Konzentration

ermöglicht.

Wenn man der CAP-Methode eine Inhibitionsreaktion zwischen IgE und

Latexallergen voranstellt, kann man sich die Möglichkeit der Quantifizierung freier

IgE-Mengen zu Nutze machen, um den Allergengehalt unbekannter Proben zu

ermitteln (CAP-Assay).

Die Messungen mit der im Folgenden beschriebenen Methode wurde von einer

Mitarbeiterin der Arbeitsgruppe Allergologie des Zentralinstituts und Ordinariats für

Arbeitsmedizin des UKE durchgeführt, hierbei wurde das Uni CAP 100 Gerät von

Phadia verwendet, das eine halbautomatische Durchführung der oben

beschriebenen Abläufe ermöglicht.

Zunächst wurde eine Verdünnungsreihe eines zuvor lyophilisierten und anschließend

in PBS gelösten Latex-C-Serums hergestellt, dessen Ausgangskonzentration bei

einem Allergengehalt von 1120 µg/ml lag und somit bekannt war. Als

Verdünnungspuffer wurde während der gesamten Versuchsdurchführung 1 x PBS

verwendet. Die erhaltene Verdünnungsreihe funktionierte im Weiteren als Allergen-

Standardreihe (siehe Tab. 4).

36

Tabelle 4 Pipettierschema der Allergen-Standardreihe des CAP-Assay

Verdünnung Allergengehalt in µg/ml

(1 : 1)* (1120)*

1 : 10 112

1 : 50 22,4

1 : 100 11,2

1 : 200 5,6

1 : 500 2,24

1 : 1000 1,12

1 : 2000 0,56

1 : 5000 0,224

1 : 10000 0,112

1 : 15000 0,075

*im Assay nicht eingesetzt

Die einzusetzende Verdünnung der Probenextrakte wurde anhand des bekannten

Gesamtproteingehalts aus dem Lowry-Assay (siehe 3.3.2.1) ermittelt. Proben, die

einen Gesamtproteingehalt > 50 µg/g hatten, wurden in einer 1:10 Verdünnung

eingesetzt. Bei einem Gesamtproteingehalt < 50 µg/g wurden die Extrakte nicht

verdünnt.

Das Ansetzen der Inhibition wurde wie folgt durchgeführt: Jeweils 40 µl der

Standardverdünnungen wurden in 1,5 ml Reaktionsgefäße pipettiert. Hierbei wurde

die 1:1 Ausgangsverdünnung nicht verwendet, demnach wurden 10 Verdünnungen

eingesetzt. Von den Probenextrakten beziehungsweise deren individuellen

Verdünnungen wurden ebenfalls je 40 µl in die gleichen Reaktionsgefäße gegeben.

Ein zusätzliches Reaktionsgefäß wurde zur späteren Ermittlung eines Leerwertes mit

40 µl 1 x PBS bestückt. Anschließend wurden je 100 µl des IgE-Poolserums zu den

10 Standardverdünnungen, dem Leerwert und den Probenextrakten gegeben. Die

Inkubation der versiegelten Reaktionsansätze erfolgte bei 4 °C über Nacht.

Über Nacht kam es zu einer Bindung der IgE-Antikörper des Poolserums mit den

Latexallergenen der Standardverdünnungen und denen der Latexextrakte.

Am nächsten Tag wurden die inkubierten Reaktionsansätze im Uni CAP Gerät auf

ihren freien IgE-Gehalt analysiert. Hierbei wurde nach dem ImmunoCAP-Protokoll

37

des Herstellers vorgegangen. Es wurde die Menge IgE quantifiziert, die nach der

Inkubation noch nicht an Latexallergen gebunden war und somit frei war für die

Reaktion mit dem Latexallergen der CAP-Schwämme. Die durch das CAP-System

ermittelte IgE-Menge korrelierte folglich negativ mit dem Latexallergengehalt der

Probenextrakte.

Eine Probe in der viel Allergen enthalten war, fing eine große Menge des

hinzugefügten IgE weg, sodass im anschließenden ImmunoCAP nur noch eine

geringe Menge IgE vorlag und es im letzten Schritt zu keiner starken

Fluoreszenzentwicklung kam.

Durch die im ImmunoCAP ermittelten Signalstärken der Fluoreszenz war es also

möglich die Allergenkonzentration der Probenextrakte zu berechnen.

2.3.3.4 IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold

Der IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold stellt den derzeit in den USA gültigen

Standard zur Quantifizierung von Latexallergenen dar (ASTM D 6499-07). Er wird

nacheinander auf zwei unterschiedlichen 96-well-Platten durchgeführt.

Für diesen Assay wurde zunächst eine Nunc Maxi-Sorb 96-Well-Platte (im folgenden

Assayplatte genannt) mit dem Standard-Antigen gecoatet. Hierfür wurden 100 µl der

zuvor angesetzten Coating-Lösung in jedes der 96 Wells der Assayplatte gegeben.

Jede Vertiefung enthielt 2 µg des Standard-Antigens. Die Platte wurde anschließend

versiegelt und für 2 h bei 37 °C inkubiert. Abschließend wurde die Assayplatte

einmal mit 200 µl pro Well T-PBS gewaschen und konnte bei –20 °C gelagert

werden.

Eine low-protein-binding 96-Well-Platte (im Folgenden Inhibitionsplatte) wurde mit

300 µl Blocking-Puffer über Nacht bei 4 °C geblockt und am nächsten Tag dekantiert

und zweimal mit 200 µl T-PBS pro Well gewaschen. Das Blocken der Platten

verhindert das Auftreten unspezifischer Bindungen der später verwendeten

Antikörper.

Bestückt wurde die Platte mit 100 µl Verdünnungspuffer pro Well, wobei Reihe A bis

auf die Positionen A3, A4 ausgespart wurde. 200 µl einer Verdünnung der NRL-

38

Standard-Antigen-Lösung mit der Konzentration 4 µg/ml wurden in Position A1, A2

gegeben. In die Wells A5–A12 wurden 200 µl der zu quantifizierenden

Probenextrakte pipettiert. Jede Probe wurde je zweimal pipettiert (siehe Tab. 5).

Tabelle 5 Pipettierschema des IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A StAg 4

µg/ml

StAg 4

µg/ml

StAg 0,031 µg/ml

StAg 0,031 µg/ml

Probe 1 1:1

Probe 1 1:1

Probe 2 1:1

Probe 2 1:1

Probe 3

1:1

Probe 3

1:1

Probe 4

1:1

Probe 4

1:1

B StAg 2

µg/ml

StAg 2

µg/ml

StAg 0,016 µg/ml

StAg 0,016 µg/ml

Probe 1 1:2

Probe 1 1:2

Probe 2 1:2

Probe 2 1:2

Probe 3

1:2

Probe 3

1:2

Probe 4

1:2

Probe 4

1:2

C StAg 1

µg/ml

StAg 1

µg/ml

StAg 0,008 µg/ml

StAg 0,008 µg/ml

Probe 1 1:4

Probe 1 1:4

Probe 2 1:4

Probe 2 1:4

Probe 3

1:4

Probe 3

1:4

Probe 4

1:4

Probe 4

1:4

D StAg 0,5

µg/ml

StAg 0,5

µg/ml

StAg 0,004 µg/ml

StAg 0,004 µg/ml

Probe 1 1:8

Probe 1 1:8

Probe 2 1:8

Probe 2 1:8

Probe 3

1:8

Probe 3

1:8

Probe 4

1:8

Probe 4

1:8

E StAg 0,25 µg/ml

StAg 0,25 µg/ml

StAg 0,002 µg/ml

StAg 0,002 µg/ml

Probe 1 1:16

Probe 1 1:16

Probe 2 1:16

Probe 2 1:16

Probe 3

1:16

Probe 3

1:16

Probe 4

1:16

Probe 4

1:16

F StAg 0,125 µg/ml

StAg 0,125 µg/ml

StAg 0,001 µg/ml

StAg 0,001 µg/ml

Probe 1 1:32

Probe 1 1:32

Probe 2 1:32

Probe 2 1:32

Probe 3

1:32

Probe 3

1:32

Probe 4

1:32

Probe 4

1:32

G StAg 0,0625 µg/ml

StAg 0,062

5 µg/ml

StAg 0,0005 µg/ml

StAg 0,0005 µg/ml

Probe 1 1:64

Probe 1 1:64

Probe 2 1:64

Probe 2 1:64

Probe 3

1:64

Probe 3

1:64

Probe 4

1:64

Probe 4

1:64

H No Inhib.

No Inhib.

No Inhib.

No Inhib.

No Second

.

No Second

.

No Second

.

No Second

.

No Prim.

No Prim.

No Prim.

No Prim.

Mit der Multipette wurden 100 µl der Wells A5–A12 in die sich darunter befindenden

Vertiefungen der Reihe B überführt und fünfmal durch Repipettieren gemischt.

Anschließend wurden erneut 100 µl der Positionen B5–B12 in die darunter liegenden

Wells der Reihe C überführt und wieder gemischt. So wurde bis zur Reihe G

verfahren. 100 µl aus den Wells G5–G12 wurden verworfen. Es entstanden somit

sieben Verdünnungen, mit einer Endkonzentration in G5–G12 von 1:64 der

Ausgangslösungen in A5–A12.

Mit den Positionen A1, A2 wurde ebenso verfahren, allerdings wurden die aus G1,

G2 entnommenen 100 µl nicht verworfen, sondern in die Wells A3, A4 überführt,

sodass die Verdünnungsreihe bis zur Position G3, G4 weitergeführt werden konnte.

100 µl aus G3, G4 wurden dann verworfen. Es ergab sich also eine

39

Verdünnungsreihe von A1, A2 bis G3, G4 mit einer Endkonzentration des NRL-

Standard-Antigens von 0,0005 µg/ml (siehe Tab. 5).

Zu den mit NRL-Standard-Antigen beziehungsweise mit Proben bestückten Wells

wurde nun der Primary-Antibody (Kaninchen IgG) gegeben. 100 µl des Primary-

Antibody wurden in jedes Well gegeben. Die Positionen H9–H12 wurden ausgespart,

sie wurden mit weiteren 100 µl Verdünnungspuffer gefüllt. Alle Wells der Platte

enthielten somit ein Gesamtvolumen von 200 µl. Für 2 h wurde die versiegelte Platte

bei 37 °C inkubiert.

Vor dem anstehenden Transfer der Proben von der Inhibitions- auf die Assayplatte,

wurde letztere mit dem Blockingpuffer geblockt. Zunächst wurde die Assayplatte

zweimal mit 200 µl T-PBS je Well gewaschen, dann mit 200 µl Blocking-Puffer je

Well 1 h bei 37 °C inkubiert und zuletzt erneut zweimal wie beschrieben gewaschen.

Anschließend wurden je 100 µl aller Wells der Inhibitionsplatte an die entsprechende

Position auf der Assayplatte überführt. Hierbei wurde für jedes Well eine neue

Pipettenspitze verwendet. Die Assayplatte wurde dann 2 h bei 37 °C oder über

Nacht bei 4 °C inkubiert.

Vor der Zugabe des Secondary-Antibody wurde die Platte dreimal mit 200 µl T-PBS

pro Well gewaschen. 100 µl des Secondary-Antibody wurden an jede Position der

Platte bis auf H5–H8 gegeben. In die ausgesparten Wells wurden mit 100 µl

Verdünnungspuffer pipettiert. Die nun folgende Inkubationszeit betrug eine Stunde

bei 37 °C. Anschließend wurde der gesamte Inhalt der Platte dekandiert und dreimal

mit 200 µl T-PBS je Well gewaschen.

100 µl einer zuvor angesetzten Substrat-Lösung wurden in jedes der 96 Wells

pipettiert. Nach 10 Min wurde zum Abbrechen der Reaktion 50 µl einer 3N Salzsäure

zu den 100 µl Substrat-Lösung in jedem Well gegeben. Nach weiteren 5 Min hatte

sich die zu beobachtende Farbentwicklung stabilisiert, sodass die Platte im

Photometer gemessen werden konnte. Die Messung der optischen Dichte der

einzelnen Wells wurde bei 490 nm durchgeführt.

40

2.3.3.5 IgY-Inhibitions-ELISA

Der Aufbau des IgY-Inhibitions-ELISA zur Quantifizierung von Latexallergenen

orientierte sich am IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold (siehe 3.3.3.4). Auch hier

wurde nacheinander auf zwei unterschiedlichen 96-Well-Platten gearbeitet.

Die Platte für den Inhibitionsschritt wurde über Nacht mit 300 µl Blocking-Puffer pro

wellbestückt, anschließend versiegelt und bei 4 °C geblockt. Die Platte für den

zweiten Schritt, die Assayplatte, wurde mit Latexantigenen gecoatet. Je 100 µl einer

zuvor hergestellten Coating-Lösung wurden in jedes der 96 Wells gegeben. Es ergab

sich eine Menge von 2 µg NRL pro Well. Versiegelt wurde die Platte über Nacht bei 4

°C inkubiert.

Sowohl die Inhibitions- als auch die Assayplatte wurden nach dem Blocken

beziehungsweise Coaten einmal mit 300 µl T-PBS pro Well gewaschen und konnten

dann bei -20 °C versiegelt gelagert werden. Vor dem Ansetzen der Inhibition auf der

Inhibitionsplatte wurde diese zweimal mit je 300 µl T-PBS pro Well gewaschen.

Die Standardverdünnungsreihe wurde in 13 1,5 ml-Eppendorf Tubes angesetzt. Als

Verdünnungspuffer wurde 1 x PBS verwendet.

Die erste Verdünnung lag bei 50 µg/ml und wurde mit 50 µl NRL-Standard-Antigen-

Lösung und 950 µl Verdünnungspuffer angesetzt und gemischt. In das nächste

Reaktionsgefäß wurden 500 µl Puffer vorgelegt und mit 500 µl der 50 µg/ml

Verdünnung versetzt. Dach dem Mischen wurden wiederum 500 µl der nun

entstandenen 25 µg/ml Verdünnung in ein weiteres bereits mit 500 µl Puffer

bestücktes Reaktionsgefäß überführt. So wurde fortgefahren, bis die NRL-

Standardreihe bei einer Verdünnung von 0,012 µg/ml komplett war.

Jeweils 100 µl dieser NRL-Standardverdünnungen wurden auf die Positionen B1, B2

bis G3, G4 der Inhibitionsplatte gegeben (siehe Tab. 6).

41

Tabelle 6 Pipettierschema des IgY-ELISA

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A StAg 0,78 µg/ml

StAg 0,78 µg/ml

Probe 1 1:1

Probe 1 1:1

Probe 2 1:1

Probe 2 1:1

Probe 3 1:1

Probe 3 1:1

Probe 4 1:1

Probe 4 1:1

B StAg 50

µg/ml

StAg 50

µg/ml

StAg 0,39 µg/ml

StAg 0,39 µg/ml

Probe 1 1:2

Probe 1 1:2

Probe 2 1:2

Probe 2 1:2

Probe 3 1:2

Probe 3 1:2

Probe 4 1:2

Probe 4 1:2

C StAg 25

µg/ml

StAg 25

µg/ml

StAg 0,195 µg/ml

StAg 0,195 µg/ml

Probe 1 1:4

Probe 1 1:4

Probe 2 1:4

Probe 2 1:4

Probe 3 1:4

Probe 3 1:4

Probe 4 1:4

Probe 4 1:4

D StAg 12,5 µg/ml

StAg 12,5 µg/ml

StAg 0,098 µg/ml

StAg 0,098 µg/ml

Probe 1 1:8

Probe 1 1:8

Probe 2 1:8

Probe 2 1:8

Probe 3 1:8

Probe 3 1:8

Probe 4 1:8

Probe 4 1:8

E StAg 6,25 µg/ml

StAg 6,25 µg/ml

StAg 0,049 µg/ml

StAg 0,049 µg/ml

Probe 1 1:16

Probe 1 1:16

Probe 2 1:16

Probe 2 1:16

Probe 3 1:16

Probe 3 1:16

Probe 4 1:16

Probe 4 1:16

F StAg 3,13 µg/ml

StAg 3,13 µg/ml

StAg 0,024 µg/ml

StAg 0,024 µg/ml

Probe 1 1:32

Probe 1 1:32

Probe 2 1:32

Probe 2 1:32

Probe 3 1:32

Probe 3 1:32

Probe 4 1:32

Probe 4 1:32

G StAg 1,56 µg/ml

StAg 1,56 µg/ml

StAg 0,012 µg/ml

StAg 0,012 µg/ml

Probe 1 1:64

Probe 1 1:64

Probe 2 1:64

Probe 2 1:64

Probe 3 1:64

Probe 3 1:64

Probe 4 1:64

Probe 4 1:64

H No Inhib.

No Inhib.

No Inhib.

No Inhib.

No Second.

No Second.

No Second.

No Second.

No Prim.

No Prim.

No Prim.

No Prim.

Bis auf Reihe A und H wurden in die noch leeren Wells je 100 µl 1 x PBS vorgelegt.

In Reihe A wurden 200 µl der zu untersuchenden Proben in den jeweiligen

Ausgangskonzentrationen pipettiert. Auf der Platte konnten vier Proben gleichzeitig

quantifiziert werden. Jede Probe wurde hierbei zweimal bestimmt (siehe Tab. 6).

Zur Herstellung der Probenverdünnungen wurden nun mit der Multipette 100 µl aus

den Positionen A5–A12 in die nächsttiefergelegenen Wells der Reihe B überführt.

Anschließend wurde mit der Multipette durch mehrmaliges Repipettieren gemischt.

100 µl der nun entstandenen 1:2 Verdünnung der Proben aus B5–B12 wurden

wieder mit der Multipette in die nächsttiefergelegenen Wells der sich anschließenden

Reihe C überführt. Bis zur Reihe G wurde diese Verdünnungsreihe durchgeführt. 100

µl aus den Wells der Reihe G wurden verworfen. In Reihe G wurde also eine 64fache

Verdünnung der Ausgangskonzentration der Proben erreicht.

In den Wells der Reihe H befindet sich weder Standard-Antigen noch eine

Probenverdünnung. Somit ist der Latexallergen-Gehalt in dieser Reihe gleich Null.

In die Wells H1–H8 wurden 100 µl 1x PBS, in die Wells H9–H12 wurden 200 µl 1 x

PBS gegeben. Position A1, A2 blieben leer.

42

Anschließend folgte die Zugabe von 100 µl Primary Antibody in sämtliche Positionen

der Inhibitionsplatte, bis auf A1–A2 und H9–H12. (siehe Tab. 4).

Mit der Multipette wurde gemischt, hierbei wurde für jedes Well eine neue

Pipettenspitze benutzt. Die Platte wurde danach über Nacht versiegelt und bei 4 °C

im Kühlschrank gelagert, sodass die Inhibitionsreaktion zwischen dem Primary-

Antibody und dem NRL-Standard-Antigen, beziehungsweise dem Antigen der

Probenextrakte am nächsten Morgen vollständig abgeschlossen war.

Vor dem Transfer der Proben von der Inhibitions- auf die bereits mit NRL-Antigen

gecoatete Assayplatte wurde diese mit Blocking-Puffer geblockt. Hierfür wurde die

Platte zunächst zweimal mit je 300 µl T-PBS pro Well gewaschen. Von dem

Blocking-Puffer wurden pro Well 200 µl pipettiert. Nach einer Stunde bei 37 °C im

Brutschrank wurde die Platte dekantiert und wieder nach zuvor beschriebener Art

gewaschen.

100 µl aus jedem Well der Inhibitionsplatte wurden nun auf die gleiche Position der

Assayplatte überführt. Hierbei wurde für jedes Well eine neue Pipettenspitze

verwendet, um einem Verunreinigen der Proben entgegen zu wirken. Die nun

folgende Inkubation geschah bei RT über 2 h.

Im Anschluss wurde die Platte dekantiert. Das folgende Waschen der Platte wurde

dreimal wiederholt um zu gewährleisten, dass sich nur noch die an die Latex-

Allergene der Platte gebundenen IgY-Antikörper in den Wells befinden.

Vom Secondary-Antibody wurden nun 100 µl pro Well pipettiert. Die Positionen H5–

H8 wurden hierbei ausgespart und mit 100µl Verdünnungspuffer bestückt. Die Wells

A1, 2 blieben wie zuvor leer. Abgedeckt inkubierte die Platte 1 h bei RT.

Vor der folgenden Zugabe des Substrates wurde der Platteninhalt dekantiert und die

Wells erneut dreimal mit je 300 µl T-PBS gewaschen.

In sämtliche Wells wurden abschließend 200µl Substrat-Lösung pipettiert, was eine

Menge von 0,3 mg Substrat pro Well ergab. Die Intensität des dann stattfindenden

Farbumschlags wurde photometrisch bei 405 nm nach 60 Min ermittelt.

43

2.3.4 Statistische Methoden

2.3.4.1 Verwendete Software und Umgang mit dem Datenmaterial

Die Messwerte wurden mit Hilfe des Tabellenkalkulationsprogramms Microsoft Office

Excel 2007 erfasst. Die vergleichende statistische Analyse der gewonnenen Daten

erfolgte mit dem Analysepaket PASW Statistics 18.0.1 der Firma IBM Deutschland

GmbH und dem Programm STATISTICA 9.1 der Firma StatSoft (Europe) GmbH.

Die Mehrfachbestimmungen aller Messwerte wurden jeweils gemittelt, um

anschließend die Aussagekraft der verschiedenen Tests zu ermitteln.

Für Ergebnisse, die unterhalb der Nachweisgrenze lagen, wurde für den jeweiligen

Test der halbe Wert der Nachweisgrenze eingesetzt.

Als Goldstandard wurde in der vorliegenden Arbeit der IgG-Inhibitions-ELISA nach

Beezhold angesehen. Diese Wahl wurde getroffen, da der Aufbau des IgY-

Inhibitions-ELISA in direkter Anlehnung an den IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold

erfolgte, der in den USA einen anerkannten Standard darstellt.

2.3.4.2 Berechnung von Sensitivität und Spezifität

Zur Berechnung von Sensitivität und Spezifität wurden zunächst Vierfeldertafeln

aufgestellt und anschließend nach folgenden Formeln ausgewertet:

Sensitivität = x 100 %

Spezifität = x 100 %

Als Grenzwert, der über positiven oder negativen Allergengehalt entschied, wurde

hierbei der vom Gesetzgeber empfohlene Allergengehalt von ≤ 30 µg/g Material

gewählt (siehe 2.5).

Anzahl richtig positiver Ergebnisse

Anzahl richtig positiver + Anzahl falsch negativer

Ergebnisse

Anzahl richtig negativer Ergebnisse

Anzahl richtig negativer + Anzahl falsch positiver

Ergebnisse

44

Als positiv und somit hochallergen gilt also ein Handschuh > 30 µg/g, als negativ wird

ein Allergengehalt von ≤ 30 µg/g angesehen.

2.3.4.3 Berechnung der Korrelation

Es wurde die Korrelation der Ergebnisse des IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold

mit denen des CAP-Assays und denen des IgY-Inhibitions-ELISA ermittelt. Zur

Berechnung der Korrelation wurde der Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman

verwendet. Dieser nimmt Werte zwischen -1 und +1 an. Je dichter er bei 0 liegt,

desto schwächer ist die Korrelation; je dichter er bei -1 bzw. +1 liegt, desto stärker ist

die Korrelation. Für r = 0 gilt, dass keine Korrelation vorliegt. Zur Überprüfung der

Signifikanz der berechneten Rangkorrelation nach Spearman, wurden die

dazugehörigen p-Werte ermittelt.

Hierfür wurde zunächst ein gewünschtes Signifikanzniveau (p-Wert), bzw. das α-

Risiko festgelegt. Für α wurde der gängige Wert von 0,05 gewählt.

Signifikanzniveau = 1 – α

Bei α = 0.05 ergab sich: 1 – 0.05 = 0.95 => 95 %

Das Signifikanzniveau lag somit bei 95 %, dies bedeutete, dass das vorliegende

Zahlenmaterial, sofern es zufällig zustande gekommen war, in nur

100 % – 95 % = 5 % aller Fälle eine vergleichbare oder extremere Ausprägung

angenommen hätte.

Anschließend wurde eine Hypothesenformulierung durchgeführt:

Forschungshypothese: „Der IgY-ELISA/CAP-Assay misst (wie der Goldstandard)

den Allergengehalt unbekannter Proben.“

Nullhypothese: „Der IgY-ELISA/CAP-Assay misst zufällige Werte, die von dem

Goldstandard unabhängig sind.“

45

Bei einem p-Wert < 0,05 wurde die Nullhypothese abgelehnt und somit die

Forschungshypothese angenommen.

Bei einem p-Wert > 0,05 wurde die Nullhypothese angenommen und somit die

Forschungshypothese abgelehnt.

2.3.4.4 Bestimmung der Nachweisgrenzen

Die Nachweisgrenze einer Methode ist der extremste Wert, den das Ergebnis

annehmen darf, damit er gerade noch verlässlich ist. Für die Bestimmung der

Nachweisgrenzen der drei Methoden (IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold, CAP-

Assays und IgY-Inhibitions-ELISA) wurde die ROC-Kurve (Receiver Operating

Characteristic) der jeweiligen Methode erstellt. Sie visualisiert die für verschiedene

mögliche Grenzwerte geltende Sensitivität und Spezifität.

Sowohl Spezifität als auch Sensitivität werden bei extremen Messwerten schlechter.

Ziel war es, den Grenzwert zu ermitteln, bei dem ein extremer Wert gerade noch eine

hohe Spezifität und eine hohe Sensitivität aufweist und diesen dann als

Nachweisgrenze festzuhalten. Jenseits dieses extremen Werts nehmen Spezifität

und Sensitivität deutlich ab, was die Verlässlichkeit der Ergebnisse nicht mehr

gewehrleistet und diese somit nicht angegeben werden dürfen.

Anhand der zugehörigen Daten wurde folglich der extremste Grenzwert ausgewählt,

bei dem Spezifität und Sensitivität maximal hoch waren und diese wurden als

Nachweisgrenze gewählt.

3 ERGEBNISSE

3.1 Messwerte

3.1.1 Gesamtproteingehalt der 20 Proben mittels modifizierter

Lowry-Methode

Sämtliche Probenextrakte wurden mittels der modifizierten Lowry-Methode auf ihren

Gesamtallergengehalt untersucht. Die Nachweisgrenze ist in der Literatur bei 2 µg/ml

Extrakt entsprechend 10 µg/g Handschuh angegeben (DIN 455-3). Da die

Ergebnisse der weiteren Testmethoden zur Bestimmung des Allergengehalts

46

durchgehend in µg Allergengehalt/g Handschuh angegeben sind, wurden im

Folgenden beide Maßangaben gewählt (siehe Tab. 7). Die photometrische Messung

ergab eine Proteinmenge, die sich auf einen Milliliter des untersuchten

Probenextraktes bezieht (µg Protein/ml Probenextrakt). Diese Werte wurden

anschließend auf ein Gramm Handschuh bezogen (µg Protein/g Handschuh).

Tabelle 7 Gesamtproteingehalt der Probenextrakte

Probenname Gesamtproteingehalt

µg/g

Gesamtproteingehalt

µg/ml

Rotiprotect <NG <NG

Heiland 1304,65 187

Biogel <NG <NG

Safeskin <NG <NG

peha-soft <NG <NG

profissimo <NG <NG

Unigloves 1207,34 177,6

Hygostar 1080 116,9

DermaClean <NG < NG

Comfort-Unigloves <NG < NG

Eco-Plus <NG < NG

NeoLab <NG < NG

Med-Comfort 974 111,8

H-Schein gep. <NG <NG

Semperguard gep. <NG <NG

Braun gep. <NG <NG

EMITEX gep. 1057,38 129

Heiland gep. 195,38 22

rotiprotect-gep. 215 24,5

Vasco gep. 260 30,6

NG = Nachweisgrenze

Es zeigte sich, dass die überwiegende Zahl der untersuchten Handschuhe in ihrem

Proteingehalt unterhalb der Nachweisgrenze liegt. Hierbei zeigte sich kein

gravierender Unterschied beim Vergleich von gepuderten mit ungepuderten

Handschuhen.

47

3.1.2 Allergengehalt der Proben mittels CAP-Assay

Tabelle 8 zeigt die Ergebnisse der 20 Handschuhproben, die im CAP-Assay ermittelt

wurden.

Tabelle 8 Ergebnisse des CAP-Assay

Probenname 1. Messung

Allergengehalt µg/g

2. Messung

Allergengehalt µg/g

Mittelwerte Allergengehalt µg/g

Rotiprotect 9,9 21,9 15,9

Heiland 448,7 507,6 478,15

Biogel 1,98 3,06 2,52

Safeskin 3,3 4,9 4,1

peha-soft 1,05 1,73 1,39

profissimo 10,4 13,8 12,1

Unigloves 654,4 1083,4 868,9

Hygostar 129,94 129,6 129,77

DermaClean 3,9 3,03 3,47

Comfort-Unigloves 9,12 9,65 9,39

Eco-Plus 38,26 25,66 31,96

NeoLab 4,44 2,29 3,37

Med-Comfort 83,06 51,67 67,34

H-Schein gep. 23,3 37,03 30,17

Semperguard gep. 8,7 24 16,35

Braun gep. 15,9 17,3 16,6

EMITEX gep. 79,8 96,2 88

Heiland gep. 46,2 64,3 55,25

rotiprotect-gep. 32,64 28,38 30,51

Vasco gep. 62,04 34,82 48,43

3.1.3 Allergengehalt der Proben mittels IgG-Inhibitions-ELISA

nach Beezhold

Für einen späteren Vergleich des IgY-Inhibitions-ELISA mit dem IgG-Inhibitions-

ELISA nach Beezhold wurden sämtliche Proben mittels letzterem auf ihren

Allergengehalt untersucht. Hierbei wurden die Extrakte an unterschiedlichen Tagen

48

insgesamt zweimal analysiert. Die Nachweisgrenze des IgG-Inhibitions-ELISA nach

Beezhold ist bei 5 µg Allergen/g Handschuh angegeben (Tomazic-Jezic et al. 2002).

Tabelle 9 Ergebnisse des Beezhold Assay

Probenname 1. Messung

Allergengehalt µg/g

2. Messung

Allergengehalt µg/g

Mittelwerte*

Allergengehalt µg/g

Rotiprotect <NG <NG 2,5

Heiland 396,3 151,2 273,75

Biogel <NG <NG 2,5

Safeskin <NG <NG 2,5

peha-soft <NG <NG 2,5

profissimo <NG <NG 2,5

Unigloves 81,7 93,8 87,75

Hygostar 24,8 41,48 33,14

DermaClean <NG < NG 2,5

Comfort-Unigloves <NG < NG 2,5

Eco-Plus <NG <NG 2,5

NeoLab <NG < NG 2,5

Med-Comfort 26,66 38,85 32,76

H-Schein gep. 12,5 9,8 11,15

Semperguard gep. 5,6 <NG 4,05

Braun gep. 6,7 6 6,35

EMITEX gep. 42 39,2 40,6

Heiland gep. 51,1 38 44,55

rotiprotect-gep. 15,26 20,53 17,895

Vasco gep. 8,17 11,54 9,855

NG = Nachweisgrenze

*Bei Werten unterhalb der Nachweisgrenze (5 µg/g) wurde der halbe Wert der Nachweisgrenze eingesetzt.

3.1.4 Allergengehalt der Proben mittels IgY-Inhibitions-ELISA

Um eine größtmögliche Objektivität zu erreichen, wurden die Probenextrakte

verblindet und an unterschiedlichen Tagen mit dem IgY-Inhibitions-ELISA auf ihren

Allergengehalt untersucht. Die Nachweisgrenze wurde bei 10 µg Allergen/g

Handschuh definiert (siehe 4.2.4).

49

Tabelle 10 Ergebnisse des IgY-ELISA

Probenname

1

Messung

Allergengehalt

µg/g

2

3

Mittelwert*

Allergengehalt

µg/g

Rotiprotect 40,84 161,57 48,71 85,37

Heiland 299,22 135,54 372,13 268,96

Biogel <NG <NG <NG 5

Safeskin <NG <NG <NG 5

peha-soft <NG <NG <NG 5

profissimo <NG <NG <NG 5

Unigloves 667,74 547 531,2 581,98

Hygostar 36,67 48,7 17,8 34,39

DermaClean <NG < NG <NG 5

Comfort-Unigloves <NG <NG <NG 5

Eco-Plus <NG < NG <NG 5

NeoLab <NG < NG <NG 5

Med-Comfort <NG 25,12 <NG 11,71

H-Schein gep. <NG <NG <NG 5

Semperguard gep. <NG <NG <NG 5

Braun gep. <NG <NG <NG 5

EMITEX gep. <NG <NG <NG 5

Heiland gep. 201,65 158,97 128,157 179,59

rotiprotect-gep. 89,6 114,67 9,27 71,18

Vasco gep. 46,32 30,77 24,7 35,6

NG = Nachweisgrenze

*Bei Werten unterhalb der Nachweisgrenze (10 µg/g) wurde der halbe Wert der Nachweisgrenze eingesetzt.

50

3.2 Statistische Analyse

3.2.1 Verteilung der erhobenen Messwerte

Eine Übersicht der mit der beschriebenen Methodik (siehe 3.3.4.1) erhaltenen Mittel-

werte, die zur weiteren statistischen Analyse verwendet wurden, zeigt Tab. 11.

Tabelle 11 Mittelwerte der Messreihen

Mittelwert* des Allergengehalts (µg/g) der Messreihen

Probenname IgY-Assay

IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold

CAP-Assay

Rotiprotect 85,37 2,5 15,9

Heiland 268,96 273,75 478,15

Biogel 5 2,5 2,52

Safeskin 5 2,5 4,1

peha-soft 5 2,5 1,39

profissimo 5 2,5 12,1

Unigloves 581,98 87,75 868,9

Hygostar 34,39 33,14 129,77

DermaClean 5 2,5 3,47

Comfort-Unigloves 5 2,5 9,39

Eco-Plus 5 2,5 31,96

NeoLab 5 2,5 3,37

Med-Comfort 11,71 32,76 67,34

H-Schein gep. 5 11,15 30,17

Semperguard gep. 5 4,05 16,35

Braun gep. 5 6,35 16,6

EMITEX gep. 5 40,6 88

Heiland gep. 179,59 44,55 55,25

rotiprotect-gep. 71,18 17,895 30,51

Vasco gep. 35,6 9,855 48,43

*Bei Werten unterhalb der Nachweisgrenze wurde der halbe Wert der Nachweisgrenze eingesetzt.

Eine Darstellung o.g. Mittelwerte zeigt Abb. 6. Aufgetragen sind die Wertepaare der

Mittelwerte des IgG-ELISA (mean IgG) mit zum einen den Werten des CAP-Assays

(mean CAP) und zum anderen den Werten des IgY-ELISA (mean IgY).

51

Abbildung 6 Darstellung der Messwerte im Punktdiagramm

52

3.2.2 Sensitivität und Spezifität der Methoden

Für Sensitivität und Spezifität ergaben sich nach der in 3.3.4.2 beschriebenen

Methode folgende Werte:

Tabelle 12 Ermittlung der Sensitivität und Spezifität des IgY-ELISA

Mittelwert IgG-Inhibitions-ELISA

nach Beezhold

≤ 30 µg/g > 30 µg/g Gesamt

Mittelwert IgY-

Inhibitions-ELISA

≤ 30 µg/g

11 2 13

Mittelwert IgY-

Inhibitions-ELISA

> 30 µg/g

3 4 7

Gesamt 14 6 20

Sensitivität IgY-Inhibitions-ELISA

66,7 %

Spezifität IgY- Inhibitions-ELISA

78,6 %

Die Sensitivität des IgY-Inhibitions-ELISA lag somit bei 66,7%. Die Spezifität des

Tests lag bei 78,6%.

53

Tabelle 13 Ermittlung der Sensitivität und Spezifität des CAP-Assay

Mittelwert IgG-Inhibitions-ELISA

nach Beezhold

≤ 30 µg/g > 30 µg/g Gesamt

Mittelwert CAP-

Assay

≤ 30 µg/g

10 0 10

Mittelwert CAP-

Assay

> 30 µg/g

4 6 10

Gesamt 14 6 20

Sensitivität CAP-Assay

100 %

Spezifität CAP-Assay

71,4 %

Die Sensitivität des CAP-Assay beträgt somit 100%. Die Spezifität des Tests liegt bei

71,4%.

54

3.2.3 Korrelation der Methoden

Für die Korrelation der Ergebnisse des IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold mit

denen des CAP-Assays und denen des IgY-Inhibitions-ELISA ergaben sich folgende

Werte:

Tabelle 14 Ergebnis der Berechnung der Korrelation

Korrelierte Mittelwerte Rangkorrelation nach

Spearman CAP-Assay

- IgG-Inhibitions-ELISA nach

Beezhold

0,89

IgY-Inhibitions-ELISA -

IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold

0,67

Da beide Werte der Rangkorrelation nach Spearman einen anderen Wert als 0

annahmen und somit von einer Korrelation auszugehen war, wurden zusätzlich die p-

Werte berechnet.

Das Signifikanzniveau war mit 95 % beziehungsweise α = 0,05 festgelegt worden.

Forschungshypothese: „Der IgY-ELISA/CAP-Assay misst (wie der Goldstandard)

den Allergengehalt unbekannter Proben.“

Nullhypothese: „Der IgY-ELISA/CAP-Assay misst zufällige Werte, die von dem

Goldstandard unabhängig sind.“

55

Tabelle 15 Signifikanz der errechneten Korrelationen

Korrelierte Mittelwerte p-Wert

Bezug auf α = 0,05 Bezug auf Nullhypothese

CAP-Assay -

IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold

< 0,01 (< 0,01) < 0,05 Die Nullhypothese wird abgelehnt.

IgY-Inhibitions-ELISA

- IgG-Inhibitions-

ELISA nach Beezhold

0,01 0,01 < 0,05 Die Nullhypothese wird

abgelehnt.

Da beide p-Werte unter dem zuvor festgelegten Wert von 0,05 lagen, wurde in

beiden Fällen die Nullhypothese abgelehnt und die Forschungshypothese

angenommen.

Somit misst sowohl der IgY-Inhibitions-ELISA als auch der CAP-Assay den

Latexallergengehalt unbekannter Proben.

3.2.4 Nachweisgrenzen der Methoden

Folgende Nachweisgrenzen ergaben sich für die einzelnen Methoden:

Tabelle 16 Ergebnis der Bestimmung der Nachweisgrenzen

Nachweisgrenze

(µg/g) Sensitivität Spezifität

CAP-Assay 30 ≈ 1 ≈ 0,917

IgY-Inhibitiohns-

ELISA 10 ≈ 0,8 ≈ 0,917

IgG-Inhibitions-

ELISA nach

Beezhold

10 ≈ 1 ≈ 0,917

56

Die ermittelte Nachweisgrenze wich im Fall des IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold

mit 10 µg Allergen/g Handschuh von der in der Literatur angegebenen

Nachweisgrenze von 5 µg Allergen/g Handschuh ab. Für den CAP-Assay ergab sich

eine Nachweisgrenze von 30 µg Allergen/g Handschuh. Für den neu entwickelten

IgY-Inhibitions-ELISA wurde eine Nachweisgrenze von 10 µg Allergen/g Handschuh

ermittelt.

57

4 DISKUSSION

Seit den zwanziger Jahren sind Überempfindlichkeitsreaktionen gegen Bestandteile

des Naturkautschuklatex bekannt. Mit Beginn der Hepatitis B- und später der HIV-

Pandemie wurde zunehmend der Gebrauch von Latexhandschuhen im

medizinischen Bereich empfohlen. Infolge dessen kam es in den 80er Jahren zu

einer mehrfachen Vervielfältigung des Verbrauchs von Latexhandschuhen (Raulf-

Heimsoth et al. 2001). In den späten 1980er Jahren wurden die Folgen dieses

vermehrten Verbrauchs in der signifikant steigenden Anzahl von Personen, die eine

Latexallergie entwickelten, sichtbar (Zucker-Pinchoff und Stadtmauer 2002).

Besonders die zunächst oft eingesetzten gepuderten Latexhandschuhe, die

zusätzlich einen hohen Proteingehalt hatten, wiesen ein hohes Sensibilisierungs-

potential auf (Raulf-Heimsoth et al. 2001).

Die Erkenntnis über die Gefahr der Entwicklung einer Latexallergie durch das

vermehrte Tragen von Latexhandschuhen führte zu einem Umdenken im Umgang

mit diesen. So wurde empfohlen, gepuderte Handschuhe durch nicht gepuderte zu

ersetzen. Diese Maßnahme hatte vor allem einen Rückgang der latexbedingten

Atemwegserkrankungen (BK-Nr. 4301) zur Folge (Chen und Baur 1999).

Neben grundsätzlichen Empfehlungen zum Umgang mit latexhaltigen Handschuhen

(siehe 2.5) wurde empfohlen, proteinarme Handschuhe mit einem maximalen

Proteingehalt von 30 µg Protein/g Handschuh zu verwenden (BAuA 2008). Hieraus

resultierte ein Rückgang der latexbedingten Hauterkrankungen (BK-Nr. 5101) (Latza

et al. 2005).

In den 1990er Jahren war durch diese Empfehlungen erstmalig ein Rückgang der

Fälle neu aufgetretener Latexallergien zu verzeichnen. Wurden 1995 noch 2360

Berufskrankheiten Nr. 5101, unter die die Latexallergie fällt, anerkannt, so waren es

2008 nur noch 647 Fälle (siehe Abb. 1, BMAS 2010).

Trotz dieses signifikanten Rückgangs um mehr als 70 % in 13 Jahren, liegt die

Inzidenz der BK-Nr. 5101 seit drei Jahren bei durchschnittlich 666 Fällen pro Jahr. Es

scheint ein Ende des rasanten Rückgangs erreicht zu sein, der hauptsächlich durch

die Umstellung auf gepuderte, proteinarme Handschuhe bedingt war (Kostyal et al.

2009). Das Ziel muss daher sein, die verbleibende jährliche Anzahl an

58

Neuerkrankungen zu verringern, beziehungsweise die Ursachen für deren

Entstehung zu verstehen.

Ein wichtiger Faktor zur Prävention der Latexallergie ist der möglichst geringe

Proteingehalt der verwendeten Handschuhe. Daher sind standardisierte Tests zur

Angabe des Proteingehalts von Latexhandschuhen unverzichtbar.

Nicht nur die Gesundheit des Verbrauchers profitiert von verlässlichen

Proteinangaben, auch die Hersteller haben ein Interesse, den Proteingehalt ihrer

Produkte möglichst genau zu kennen, um den aktuellen Richtlinien zu genügen und

ihre Ware entsprechend kennzeichnen zu können (Palosuo et al. 2007).

Die aktuellen in der Bundesrepublik Deutschland gültigen Richtlinien zum

Proteingehalt von Latexhandschuhen sind in der DIN 455-3 und der TRGS 401

beschrieben (siehe 2.5). Beide machen eine Angabe zum maximalen Proteingehalt

verwendeter Handschuhe.

Die DIN 455-3 erklärt Herstellerangaben zum Proteingehalt unter 50 µg Protein/g

Handschuh für ungültig, da sowohl die Herstellung als auch anschließende Tests

stets Schwankungen unterliegen (Deutsches Institut für Normung e.V. 2007).

Die TRGS 401 fordert den ausschließlichen Gebrauch ungepuderter, niedrig

allergener Handschuhe, die einen Proteingehalt von 30 µg Protein/g Handschuh

nicht überschreiten (BAuA 2008).

Als Testverfahren zur Ermittlung des Proteingehalts latexhaltiger Handschuhe wird in

der DIN 455-3 die modifizierte Lowry-Methode als Standardverfahren erklärt

(Deutsches Institut für Normung e.V. 2007).

Es findet sich jedoch in der DIN 455-3 selbst ein erster Hinweis darauf, dass die

Qualität der modifizierten Lowry-Methode anfechtbar ist. So könne die

Farbentwicklung des Tests durch unterschiedliche in den Handschuhen enthaltene

Chemikalien beeinflusst werden – hierbei wären ein verstärkter aber auch ein

verringerter Farbumschlag möglich (Deutsches Institut für Normung e.V. 2007).

Andere Autoren zweifeln die Messgenauigkeit der modifizierten Lowry-Methode für

Proben niedrigen Allergengehalts an (Audo et al. 2004).

59

Zusätzlich zu diesen methodischen Unsicherheiten zeichnet sich ein grundlegendes

Problem der modifizierten Lowry-Methode ab. Sie gilt als Standardtest für

latexhaltige Handschuhe, und ihre Ergebnisse zum Proteingehalt spielen eine

entscheidende Rolle in der Bewertung der Qualität von Einmalhandschuhen. An

dieser Stelle wird eine Korrelation von Proteingehalt und Allergengehalt

vorausgesetzt. Dieser Zusammenhang ist jedoch äußerst umstritten. Der direkte

Rückschluss von einem hohen Proteingehalt eines Handschuhs auf einen hohen

Allergengehalt (und somit auf eine hohe Sensibilisierungsgefahr durch diesen) wird

von vielen Autoren abgelehnt (Fuchs 2002, Alenius et al. 2002, Peixinho et al. 2006).

Zur sicheren Bestimmung der Allergenität und somit Sicherheit eines Produktes

sollte daher ausschließlich der Allergengehalt von Interesse sein. Folglich ist eine

Verbesserung der Testmethodik dringend gefordert.

Einen standardisierten Test zur Bestimmung des Latexallergengehalts von

Einmalhandschuhen stellt der IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold dar (siehe

3.3.3.4). Er ermittelt unter der Verwendung von IgG-Kaninchen-Antikörpern den

Allergengehalt und ist in den USA als gültige Standardmethode anerkannt (ASTM D

6499-07).

Neben dem Vorteil der ausschließlichen Allergenbestimmung hat der IgG-Inhibitions-

ELISA nach Beezhold jedoch viele Nachteile. Diese sind hauptsächlich durch den

verwendeten Antikörper begründet.

Bei der Herstellung der IgG-Antikörper werden Kaninchen gegen Latexallergen

sensibilisiert und die gebildeten Antikörper anschließend durch das Ausbluten der

Tiere gewonnen (siehe 3.3.3.1). Die hierfür notwendige Immunreaktion bleibt jedoch

oft aus oder findet nur schwach ausgeprägt statt (Schade et al. 2001). Dies

erschwert zum einen stark die Gewinnung ausreichender Mengen an IgG-

Antikörpern und ist zum anderen zwangsläufig mit dem Ausbluten und somit dem

Tod einer hohen Anzahl an Kaninchen verbunden. Dieses Verfahren ist somit nicht

nur zeit- und kostenintensiv, sondern auch unter dem Punkt des ethischen Konflikts

der Versuchstierhaltung als negativ zu bewerten.

Nachteile finden sich aber nicht nur in der Gewinnung der Kaninchen-Antikörper

sondern auch in ihrem Reaktionsverhalten (siehe 2.6.4). Sie bergen das Risiko

60

ungewollter unspezifischer Bindungen und somit falsch positiver Ergebnisse (Haak-

Frendscho 2006). Der IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold ist daher keine ideale

Methode zur sicheren Bestimmung des Allergengehalts von Handschuhproben.

Eine weitere Methode zur Bestimmung des Allergengehalts latexhaltiger

Handschuhe ist der CAP-Assay im CAP-System. Hierbei handelt sich um eine

Inhibitionsreaktion, bei der humane IgE-Antikörper verwendet werden (siehe 3.3.3.3).

Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode stellt die halbautomatisierte Arbeitsweise

dar, die mit einem geringeren Zeitaufwand einhergeht und zusätzlich weniger

Schwankungen aufweist.

Großer Nachteil dieser Methode ist jedoch auch hier der verwendete Antikörper. Zum

einen ist die Gewinnung humaner Antikörper an die limitierte Anzahl latexsensibler

Personen gebunden, die zudem spendenbereit sein müssen (Deutsches Institut für

Normung e.V. 2007). Zum anderen sind die Antikörper-Profile der Spender

unterschiedlich ausgeprägt und nicht genau definiert, was bei Verwendung

unterschiedlicher Seren zu unterschiedlichen und vor allem nicht vergleichbaren

Ergebnissen führt (Koch 2002).

Die drei beschriebenen Methoden – modifizierte Lowry-Methode, IgG-Inhibitions-

ELISA nach Beezhold und CAP-Assay – sind anerkannte Methoden. Jedoch

beinhalten sie eine Vielzahl an Nachteilen und genügen nicht dem Ziel einer

genauen Analyse des Allergengehalts zur Allergenitätsbestimmung, die zur

optimalen Prävention von Neuerkrankung beziehungsweise

Krankheitsverschlechterung unverzichtbar ist.

Der im Rahmen dieser Arbeit entwickelte IgY-Inhibitions-ELISA stellt eine gute

Alternative zu den genannten Methoden dar.

Der Aufbau des IgY-Inhibitions-ELISA geschah auf der Basis des prinzipiell guten

IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold, dessen Nachteile hauptsächlich durch den

verwendeten Antikörper begründet sind. Der Hauptunterschied liegt daher in der

Verwendung eines anderen Antikörpers. Während im IgG-Inhibitions-ELISA nach

Beezhold Kanninchen-Antikörper eingesetzt werden, basiert die neu entwickelte

Methode auf der Verwendung von IgY-Hühner-Antikörpern.

61

IgY-Antikörper sind aus vielen Gründen eine gute Alternative zum oft verwendeten

IgG-Antikörper (siehe 2.6.4). Schon zu Beginn der Antikörpergewinnung, die mit der

Sensibilisierung des Versuchstiers einhergeht, zeigen sich Vorteile. So ist ein

Ausbleiben der Immunreaktion, wie es bei Kaninchen gehäuft vorkommt, bei

Hühnern wesentlich seltener (Haak-Frendscho 1996).

Die anschließende Gewinnung der Antikörper erfolgt aus dem gelegten Ei. Hier

liegen die wesentlichen Vorteile des IgY-Antikörpers. Die Gewinnung aus dem Ei

ermöglicht den Verzicht auf das Ausbluten des Tieres und stellt somit eine wesentlich

tierfreundlichere Methode dar.

Zusätzlich stellt ein einmal immunisiertes Huhn einen unerschöpflichen Vorrat an

Antikörpern dar, da es bis zu seinem natürlichen Tod regelmäßig Eier legt. Diese

Tatsache gewinnt an Bedeutung, wenn man berücksichtigt, dass die aus einem Ei

gewonnene Antikörper-Menge der Menge entspricht, die beim einmaligen Ausbluten

eines Kaninchens gewonnen wird. Aus der Immunisierung eines Huhns resultiert

folglich ein Vielfaches der Antikörpermenge, die durch die Immunisierung eines

Kaninchens gewonnen werden kann.

Somit kann durch geringeren Arbeitsaufwand eine größere Menge von auf

tierfreundlichere Weise gewonnenen Antikörpern, hergestellt werden. Dies und die

im Vergleich zum Kaninchen niedrigeren Preise der Anschaffung, Unterbringung und

Versorgung des Versuchshuhns, begründen den zusätzlichen Vorteil der niedrigen

Kosten der IgY-Gewinnung (Schade et al. 2001).

Das Problem der nicht gewünschten unspezifischen Proteinbindungen, das für die

IgG-Antikörper beschrieben ist, findet sich bei den IgY-Antikörpern in wesentlich

geringerer Ausprägung.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die verlässlichere Immunisierung, die

tierfreundlichere Gewinnung aus dem Ei, die größere pro Versuchstier gewonnene

Antikörpermenge, die niedrigeren Kosten und die weniger häufigen Proteinbindungen

den IgY-Antikörper als einen geeigneteren als den IgG-Antikörper auszeichnen.

62

Um dies auch im praktischen Versuch zu bestätigen, wurde im Rahmen dieser Arbeit

der IgY-Inhibitions-ELISA mit dem IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold verglichen.

Zusätzlich wurde der in unserer Arbeitsgruppe häufig eingesetzte CAP-Assay mit

dem IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold verglichen, um eine eventuelle

Überlegenheit des CAP-Assays gegenüber dem IgY-Inhibitions-ELISA nicht zu

übersehen.

Insgesamt wurde der Allergengehalt von 20 Handschuhproben ermittelt ( siehe 3.1).

Anschließend wurden zunächst Sensitivität und Spezifität des IgY-Inhibitions-ELISA

und des CAP-Assays berechnet (siehe 3.3.4.2). Hierbei wurde in Anlehnung an den

in der TRGS 401 beschriebene Grenzwert von 30µg Protein/g Handschuh der Wert

von 30µg Allergen/g Handschuh als Kriterium für die Einordnung eines Handschuhs

als Allergen-positiv beziehungsweise -negativ gewählt.

Tab. 17 zeigt die Ergebnisse der Berechnung der Sensitivität und Spezifität des IgY-

Inhibitions-ELISA und des CAP-Assays.

Tabelle 17 Sensitivität und Spezifität der Methoden

IgY-Inhibitions-ELISA CAP-Assay

Sensitivität 66,7 % 100 %

Spezifität 78,6 % 71,4 %

Der CAP-Assay hat mit 100 % eine höhere Sensitivität als der IgY-Inhibitions-ELISA,

dessen Sensitivität bei 66,7 % liegt. Dieser ist jedoch in der Spezifität mit 78,6 %

dem CAP-Assay überlegen. Insgesamt sind die Werte für Sensitivität und Spezifität

für beide Methoden zufrieden stellend.

Zur weiteren Validierung der Methoden wurde die Korrelation nach Spearman

berechnet (siehe 3.3.4.3). Tab. 18 zeigt die ermittelten Ergebnisse für die Korrelation

der Methoden, sowie die dazu gehörigen p-Werte.

63

Tabelle 18 Korrelation und Signifikanz der Methoden

Korrelation mit dem IgG-Inhibitions-ELISA nach

Beezhold p-Wert

IgY-Inhibitions-ELISA 0,67 0,01

CAP-Assay 0,89 <0,01

Hierbei ergab sich für den CAP-Assay eine Korrelation von 0,89 mit dem IgG-

Inhibitions-ELISA nach Beezhold. Die Korrelation des IgY-Inhibitions-ELISA mit dem

IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold betrug 0,67.

Die anschließende Berechnung der zugehörigen p-Werte ergab für beide

Korrelationen eine hohe Signifikanz, da die p-Werte unter dem α-Wert von 0,05 lagen

(siehe 4.2.4).

Sowohl die Ergebnisse des CAP-Assays als auch die des IgY-Inhibitions-ELISA

korrelieren somit hoch signifikant mit denen des IgG-Inhibitions-ELISA nach

Beezhold.

Zuletzt wurde für jede der drei Methoden die jeweilige Nachweisgrenze ermittelt

(siehe 3.3.4.4). Tab. 18 zeigt die Nachweisgrenze der jeweiligen Methode.

Tabelle 19 Nachweisgrenzen der Methoden

IgY-Inhibitions-

ELISA

IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold

CAP-Assay

Nachweisgrenze der Methode in µg

Allergen/g Handschuh 10 10 30

Hierbei fällt auf, dass die Nachweisgrenze des CAP-Assays bei einem Wert von

30 µg Allergen/g Handschuh liegt und somit dreimal so hoch wie die Nachweisgrenze

der anderen beiden Methoden ist. Für den IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold und

den IgY-Inhibitions-ELISA wurde eine Nachweigrenze von 10 µg Allergen/g

Handschuh ermittelt.

Zusammengefasst ergab die statistische Analyse folgende Erkenntnisse: Die

Nachweisgrenze des IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold lag mit 10 µg Allergen/g

64

Handschuh über der in der Literatur angegebenen Grenze von 5 µg Allergen/g

Handschuh und war somit schlechter als erwartet.

Der CAP-Assay liefert in Bezug auf Sensitivität, Spezifität und Korrelation mit dem

IgG-Inhibitions-ELISA nach Beezhold gute Ergebnisse. Jedoch ist die ermittelte

Nachweisgrenze von 30 µg Allergen/g Handschuh deutlich schlechter, als die der

anderen beiden Methoden und liegt gerade in dem Bereich niedriger Werte, der für

die Bestimmung der Allergenität von großem Interesse ist.

Der neu entwickelte IgY-Inhibitions-ELISA hat sowohl für die Sensitivität und die

Spezifität, als auch für die Korrelation mit dem IgG-Inhibitions-ELISA gute

Ergebnisse erreicht. In der Spezifität ist er zusätzlich besser als der CAP-Assay.

Auch in der Berechnung der Nachweisgrenze schlägt er den CAP-Assay.

Das Ziel dieser Arbeit, nämlich der „Aufbau eines standardisierten Assays zur

Quantifizierung von Latexallergenen“, kann als erreicht erklärt werden.

Der neu entwickelte IgY-Inhibitions-ELISA ist als eine den gängigen Methoden

gleichwertige Alternative zu bewerten. Sowohl die Vorteile des IgY-Antikörpers

selbst, als auch die statistische Analyse der Ergebnisse der neuen Methode

unterstreichen dies.

Die IgY-Antikörper-Gewinnung ist verlässlicher, tierfreundlicher und nicht zuletzt

preiswerter als die Gewinnung anderer Antikörper. Die statistische Analyse zeigte,

dass der neu entwickelte IgY-Inhibitions-ELISA mit dem IgG-Inhibitions-ELISA nach

Beezhold signifikant korreliert und dem CAP-Assay in den Punkten Spezifität und

Nachweisgrenze überlegen ist.

Der im Rahmen dieser Arbeit entwickelte IgY-Inhibitions-ELISA stellt eine valide,

tierfreundliche und kostengünstige Methode zur Ermittlung des Latexallergengehalts

in medizinischen latexhaltigen Einmalhandschuhen dar.

65

5 ZUSAMMENFASSUNG

Seit nunmehr achtzig Jahren ist die Latexallergie Gegenstand der wissenschaftlichen

Forschung. Dem in den 1980er Jahren erreichten Maximum der Inzidenz der

Latexallergie, wurde mit einem Umdenken im Umgang mit latexhaltigen

Handschuhen begegnet. Doch trotz neu eingeführter Präventionsmaßnahmen und

Richtlinien für Hersteller und Verbraucher, die einen starken Rückgang der Inzidenz

bewirkten, bleibt ein Restrisiko der Sensibilisierung durch Latexallergene bestehen.

Die Zahl der jährlich hinzukommenden Neuerkrankungen hält seit einigen Jahren

unverändert das gleiche Niveau.

Um diese Zahl zu minimieren, die nicht nur persönliches Leid der Betroffenen,

sondern auch wirtschaftliche Folgen durch Arbeitsausfall oder gar Berufsunfähigkeit

nach sich zieht, ist das Vorhandensein verlässlicher Testmethoden zur Ermittlung

des Allergengehalts eines Handschuhs unverzichtbar. Nur durch die Kenntnis des

Allergengehalts lässt sich eine Empfehlung zur sicheren Verwendung eines

Handschuhs aussprechen.

Die gängigen Testmethoden haben jedoch unterschiedliche Schwachpunkte. So

misst die modifizierte Lowry-Methode den Gesamtproteingehalt einer Probe. Es sind

aber nicht sämtliche Proteine zwingend allergen. Daher wurden Tests zur

Bestimmung des Gesamtallergengehalts entwickelt. Diese sind jedoch

beispielsweise auf das Vorliegen humaner Antikörper angewiesen, was das ständige

Vorhandensein eines spendenbereiten Patientenpools voraussetzt. Eine weitere

Möglichkeit ist die nicht tierfreundliche Gewinnung durch das Ausbluten zuvor

sensibilisierter Kaninchen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war der „Aufbau eines

standardisierten Assays zur Quantifizierung von Latexallergenen“, der sowohl eine

tierfreundliche Gewinnung der Antikörper beinhaltet, als auch verlässliche

Ergebnisse erbringt, die mit den gängigen Methoden korrelieren. Der im Rahmen

dieser Arbeit entwickelte IgY-Inhibitions-ELISA, bedient sich auf tierfreundliche Art

aus dem Hühnerei gewonnener, preiswerter Antikörper. Er misst mit einer Sensitivität

von 66,7 % und einer Spezifität von 78,6 % ob eine Probe ober- oder unterhalb des

empfohlenen Grenzwertes von 30 µg Allergen /g Material liegt.

Der IgY-Inhibitions-ELISA stellt eine tierfreundliche, kostengünstige und valide

Alternative zur Quantifizierung von Latexallergenen in latexhaltigen Handschuhen

dar.

66

6 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

In der vorliegenden Arbeit wurden durchgehend die international üblichen

chemischen Symbole und Abkürzungen der SI-Einheiten (Systeme International

d`Unites) benutzt. Sämtliche verwendete physikalischen Größen entsprechen der

Konvention der „International Union for Biochemistry“.

Abb. Abbildung

Ag Antigen

Ak Antikörper

ASTM engl.: American Society for Testing and

Materials

BAuA Bundesanstalt für Arbeitsschutz und

Arbeitsmedizin

BK Berufskrankheit

BKV Berufskrankheiten-Verordnung

BMAS Bundesministerium für Arbeit und Soziales

BSA Rinderserumalbumin (engl.: bovine serum

albumin)

°C Grad Celsius

ca. circa

CAP Capacity

cDNA komplementäre DNA

cm Zentimeter

CO2 Kohlendioxid

dest. destilliert

DIN Deutsches Institut für Normung e.V.

ELISA Enzymgekoppelter Immuntest (engl.:

enzyme- linked immunosorbent assay)

et al. und andere (lat. et alii)

h Stunde(n)

HPLC Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie

(engl.: high performance liquid chromato-

graphy)

67

HRP Horseradisch peroxidase

H2O Wasser

H2O2 Wasserstoffperoxid

Ig Immunglobuline

IgY Immunglobuline der Klasse Y

IgE Immunglobuline der Klasse E

IgG Immunglobuline der Klasse G

IUIS International Union of Immunological

Societies

l Liter

LEAP Latex ELISA for Antigenic Protein

µ mikro

m milli

m Meter

M Molar

Min Minute(n)

mod. modifiziert

mol 6,23*10²³ Teilchen

N Stickstoff

Nm Nanometer

OD Optische Dichte

OPD Ortho-Phenylendiamin

PBS Phosphat- gepufferte Salzlösung (engl.:

phosphate buffered saline)

pH negativer dakadischer Logarithmus der

Oxoniumionen- Konzentration

RT Raumtemperatur

rpm Umdrehungen pro Minute (engl.: rounds per

minute)

s Sekunde(n)

SDS Natriumdodecylsulfat (engl.:

sodiumdodecylsulfate)

Tab. Tabelle

68

TCA Trichloressigsäure

TES N-tris-[Hydroxymethyl]-methyl-2-

aminoethansulfonsäure, (Heminatriumsalz)

TRBA Technische Regel für biologische

Arbeitsstoffe

TRGS Technische Regeln für Gefahrstoffe

Tris Trishydroxymethylaminomethan

TschG Tierschutzgesetz

Tween 20 Polyoxyethylensorbitanmonolaurat

u.a. unter anderem

UKE Universitätsklinikum Hamburg Eppendorf

Upm Umdrehungen pro Minute

USA Vereinigte Staaten von Amerika (engl.:

United States of Amercia)

z.B. zum Beispiel

w/v Gewicht pro Volumen (engl.: weight)

ZfAM Zentralinstitut für Arbeitsmedizin und

Maritime Medizin

69

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75

8 TIERSCHUTZANTRÄGE

76

77

9 DANKSAGUNGEN

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit vom Juli 2007 bis September 2011 am

Zentralinstitut für Arbeitsmedizin und Maritime Medizin der Freien und Hansestadt

Hamburg unter der Leitung meiner Doktormutter Frau Prof. Dr. rer. nat. U. Latza,

MPH angefertigt.

Ganz herzlich bedanke ich mich bei meiner Doktormutter Frau Prof. Dr. rer. nat. U.

Latza, MPH für die Betreuung meiner Arbeit. Besonders möchte ich mich für die

stets schnelle, unkomplizierte und wertvolle Hilfe bei der Anfertigung dieser Arbeit

bedanken.

Mein ganz besonderer Dank gilt der Betreuerin meiner Arbeit Frau Dr. med. Cordula

Bittner, für die Bereitstellung des interessanten Themas. Sie hat durch Ihre

Unterstützung einen maßgeblichen Teil zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen. Seit

nun fast vier Jahren ist sie für mich eine verlässliche Hilfe, die es immer wieder

verstanden hat, mich neu zu motivieren, und mir mit ihrem Fachwissen stets zur

Seite stand.

Bedanken möchte ich mich bei Frau Frauke Koops für ihre hilfreiche Einweisung

und Betreuung der praktischen Anteile meiner Arbeit im Labor. Auch für das stets

freundliche und kollegiale Arbeitsklima während unserer gemeinsamen Laborstunden

möchte ich ihr danken.

Den Mitarbeitern der Versuchstierhaltung des Universitätsklinikum Eppendorf möchte

ich herzlich für die Übernahme der Gewinnung, der im Rahmen dieser Arbeit

verwendeten Kaninchenantikörper danken.

Ein herzliches Dankeschön geht an Frau Svea Marie Fahrenholz und Herrn Stefan

Kloth, die dazu beigetragen haben, die gemeinsame Zeit im Labor zu einem

unvergesslichen Abschnitt der vorliegenden Arbeit werden zu lassen.

Mein Dank gilt meiner Familie, meinem Freundeskreis und vor allem meinem Freund

für die beständige, liebevolle Unterstützung und Geduld während der letzten Jahre.

78

Besonders bedanken möchte ich mich bei meinen Eltern, die mich während meiner

gesamten Ausbildung unterstützten und bestärkten und mir somit die notwendige

Ruhe und Sicherheit für die Fertigstellung dieser Arbeit gaben.

79

10 LEBENSLAUF

Entfällt aus datenschutzrechtlichen Gründen.

80

11 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG

Ich versichere ausdrücklich, dass ich die Arbeit selbständig und ohne fremde Hilfe

verfasst, andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt

und die aus den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen

einzeln nach Ausgabe (Auflage und Jahr des Erscheinens), Band und Seite des

benutzten Werkes kenntlich gemacht habe.

Ferner versichere ich, dass ich die Dissertation bisher nicht einem Fachvertreter an

einer anderen Hochschule zur Überprüfung vorgelegt oder mich anderweitig um

Zulassung zur Promotion beworben habe.

Unterschrift: ......................................................................