Aus dem Muskuloskelettalen Zentrum Würzburg (MCW) · Aus dem Muskuloskelettalen Zentrum Würzburg (MCW) Orthopädische Klinik König Ludwig Haus der Universität Würzburg Vorstand:

Aus dem Muskuloskelettalen Zentrum Würzburg (MCW)

Orthopädische Klinik König Ludwig Haus

der Universität Würzburg

Vorstand: Professor Dr. med. Franz Jakob

Vergleich der genetischen Eigenschaften von Bone Ma rrow derived

Mesenchymal Stem Cells und Trabecular Bone derived Mesenchymal

Stem Cells

Inaugural - Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde der

Medizinischen Fakultät

der

Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von

Maximilian Heitmann

aus Berlin

Würzburg, April 2014

Referent: Prof. Dr. Franz Jakob

Korreferent: Prof. Dr. Torsten Blunk

Dekan: Prof. Dr. Matthias Frosch

Tag der mündlichen Prüfung: 08.01.2015

Der Promovend ist Arzt

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung ...................................................................................................... 1

1.1. Bedeutung der Stammzellen in der modernen Medizin ........................... 1

1.2. Stammzellen ............................................................................................ 2

1.2.1. Embryonale Stammzellen (ESCs)..................................................... 2

1.2.2. Hämatopoietische Stammzellen (HSCs) ........................................... 3

1.2.3. Mesenchymale Stammzellen (MSCs) ............................................... 5

1.3. Vorkommen der MSCs im adulten Organismus....................................... 9

1.4. Epitheliale Mesenchymale Transition (EMT).......................................... 10

1.5. Die Nische der MSCs............................................................................. 11

1.6. Differenzierungspotential der MSCs ...................................................... 12

1.7. Therapeutische Möglichkeiten der MSCs und Tissue Engineering........ 14

1.8. Zielsetzung dieser Dissertation.............................................................. 19

2. Material und Methoden .............................................................................. 21

2.1. Materialen .............................................................................................. 21

Chemikalien und Reagenzien ................................................................... 21

Zellkulturmedien und Bestandteile ............................................................ 22

Enzyme ..................................................................................................... 22

Puffer- und andere Lösungen.................................................................... 22

Bausätze ................................................................................................... 23

2.2. Methoden............................................................................................... 24

2.2.1. Zellen und Zellkultur ........................................................................ 24

2.2.2. RNA- Isolation mit dem Kit „Nucleospin RNA II“............................ 27

2.2.3. cDNA-Synthese............................................................................... 28

2.2.4. Array-Analyse.................................................................................. 28

2.2.5. RT-PCR........................................................................................... 29

2.2.6. Agarose-Gel-Elektrophorese........................................................... 33

2.2.7. Immuncytochemie ........................................................................... 33

3. Ergebnisse .................................................................................................. 36

3.1. Array-Analysen ...................................................................................... 36

3.2. Bestätigung der Ergebnisse durch RT-PCR (Passage 0) ...................... 39

3.3. Übereinstimmung von Array und PCR (Passage 0)............................... 41

3.4. Vergleich der Arrays aus Passage 0 und Passage 1............................. 43

3.5. Immuncytochemie mit CD24.................................................................. 47

4. Diskussion .................................................................................................. 48

4.1. Versuchsauswertungen ......................................................................... 48

4.1.1. Experimentelle Bestätigung des Microarrays .................................. 48

4.1.2. Kontamination der Zellkultur Passage 0.......................................... 49

4.1.3. Auswertung und Bedeutung der analysierten Gene........................ 51

4.1.3.1. Osteogene Markergene ............................................................ 51

4.1.3.2. Myogene Markergene............................................................... 56

4.1.3.3. Sonstige untersuchte Gene ...................................................... 59

4.2. Stellenwert der bhMSCs in der adulten Stammzellforschung im Hinblick

auf Expressionsunterschiede........................................................................ 62

4.3. Stammzellcharakter der MSCs .............................................................. 63

4.4. Zusammenfassende Schlussfolgerungen.............................................. 65

5. Zusammenfassung ..................................................................................... 68

6. Literaturverzeichnis ................................................................................... 70

7. Abbildungsverzeichnis .............................................................................. 77

8. Abkürzungsverzeichnis ............................................................................. 82

Einleitung

1

1. Einleitung

1.1. Bedeutung der Stammzellen in der modernen Medi zin

Der Begriff der Stammzellen ist heutzutage in aller Munde. Längst haben sich

die Diskussion und das Interesse an ihnen von medizinischen und biologischen

Fachkreisen in die breite Öffentlichkeit verlagert.

Die Fortschritte, die die moderne Medizin in den vergangenen Jahrzehnten

verzeichnen konnte, spiegeln sich in den Industrieländern in einer immer älter

werdenden Bevölkerung wider. Bei der Breite der medizinischen Versorgung

und der Möglichkeit potentiell tödliche Erkrankungen heute effektiv behandeln

zu können rückt der Wunsch nach steigender Lebensqualität im Alter immer

mehr in den Fokus der Bevölkerung. Daher rührt auch das stetig zunehmende

Interesse degenerative Erkrankungen effizienter behandeln oder gar heilen zu

können.

Nach heutigem Stand der etablierten Therapieoptionen werden degenerative

Erkrankungen vornehmlich symptomatisch ohne kurativen Ansatz behandelt.

Das Gesundheitssystem einer älter werdenden Gesellschaft wird dadurch

erheblich und dauerhaft belastet. Nicht nur Patienten würden von regenerativen

Therapieansätzen profitieren, sondern auch die Volkswirtschaft durch geringere

Folgekosten.

Als Beispiel für eine solche degenerative Volkskrankheit möchte ich die

Gelenkarthrose ansprechen. Diese kommt in den häufigsten Fällen an der Hüfte

oder am Knie vor und äußert sich klinisch in Gelenkschmerzen. Im Endstadium,

wenn konservative Schmerztherapiemöglichkeiten ausgeschöpft sind, wird

meist ein operativer Gelenkersatz durchgeführt. Künstliche Gelenke weisen nur

eine begrenzte Haltbarkeit (ca. 10 - 20 Jahre (Eskelinen, Remes et al. 2006))

auf und sind Fremdkörper im menschlichen Gewebe. Mögliche

Regenerationsmöglichkeiten des Gelenkknorpels durch Stammzellen können

viel versprechende Therapieansätze bieten. Darüber hinaus gibt es aber auch

interessante Forschungsansätze für Regenerationsmöglichkeiten durch

Stammzellen von vielen anderen Organsystemen des menschlichen Körpers.

Einleitung

2

Trotz aller Fortschritte zum besseren Verständnis der Biologie von

Stammzellen, die in den letzten Jahrzehnten erzielt werden konnten, bleiben

noch viele Fragen ungeklärt und es besteht noch erheblicher

Forschungsbedarf.

1.2. Stammzellen

Als Stammzellen bezeichnet man nach heutigem Verständnis Zellen mit

unbegrenzter Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Differenzierung in

verschiedene Gewebe eines lebenden Organismus. Im Gegensatz dazu haben

reife Gewebszellen diese Fähigkeiten beim Differenzierungsprozess verloren

um bis zu ihrem Untergang eine bestimmte Funktion im Gewebe auszuüben.

Bereits im 19. Jahrhundert wurde die Existenz von Stammzellen vermutet, die

bei Verletzung oder Verlust von Gewebe eine Regeneration gewährleisten.

Julius Cohnheim postulierte 1867 eine Verteilung solcher Zellen aus dem

Knochenmark über den Blutweg um das geschädigte Gewebe zu erreichen.

1.2.1. Embryonale Stammzellen (ESCs)

Prinzipiell lassen sich embryonale von adulten Stammzellen unterscheiden.

Dabei wird nicht nur nominell ein anderer Zeitpunkt in der Entwicklungsstufe im

reifenden Organismus unterschieden, sondern je früher der Zeitpunkt in der

Embryogenese desto größer auch die Differenzierungsfähigkeiten einer

Stammzelle.

Embryonale Stammzellen konnten erstmals von Evans und Kaufman aus

Mäusen gewonnen und erfolgreich kultiviert werden und zeichnen sich durch

Pluripotenz aus, also ihrer Fähigkeit noch in jedes Gewebe des Körpers bzw. in

Zellen aller drei Keimblätter differenzieren zu können (Evans and Kaufman

1981; Reubinoff, Pera et al. 2000; Wobus 2001). Sie befinden sich im Inneren

der Blastozysten und besitzen eine hohe Aktivität des Enzyms Telomerase, das

ihnen ermöglicht, sich unbegrenzt ohne DNA-Verlust teilen zu können und nicht

zu altern (Bodnar, Ouellette et al. 1998; Thomson, Itskovitz-Eldor et al. 1998).

Einleitung

3

Als Nachweis von ESCs dienen unter anderem immunhistochemische

Färbungen von spezifischen Oberflächenmarkern wie SSEA-3, SSEA-4 (Stage-

specific embryonic antigens) oder Alkalischer Phosphatase (Thomson,

Kalishman et al. 1995).

Es wurden bisher einige Faktoren entschlüsselt, die das Zusammenspiel

zwischen Differenzierung und Erhaltung des Stammzellpools sowie der

Pluripotenz ermöglichen. Bei ESCs der Maus (mESCs) wurde der Signalweg

über Leukemia Inhibitory Factor (LIF) und den Transkriptionsfaktor STAT3

(Signal transducer and activator of transcription 3) als System zum Erhalt der

Pluripotenz nachgewiesen, beim Menschen (hESCs) scheinen zusätzlich

andere Mechanismen von Bedeutung zu sein (Daheron, Opitz et al. 2004). Eine

zentrale Rolle spielt dabei der Transkriptionsfaktor POU5F1 (ehemals Oct4,

Octamer binding transcription factor 4), dessen Aktivität bei zunehmender

Differenzierung in eines der drei Keimblätter abnimmt. POU5F1 induziert eine

Expression von Markerproteinen der Pluripotenz wie NANOG und Sox2 (Sex

determining region Y (SRY) box 2) und supprimiert Proteine, die

Differenzierungsprozesse der Zellen anstoßen wie CDX-2 (Caudal type

homebox 2), EOMES (Eomesodermin), BMP-4 (Bone morphogenetic protein 4)

und FGF8 (Fibroblast growth factor 8) (Babaie, Herwig et al. 2007).

1.2.2. Hämatopoietische Stammzellen (HSCs)

Da experimentelle Forschung an hESCs in Gesellschaft und Politik ethisch

schwer vertretbar ist, richtet sich das heutige Augenmerk vermehrt auf adulte

Stammzellen. Diese ermöglichen einen lebenslangen Nachschub für zu Grunde

gegangene Zellen und gewährleisten so eine permanente Regeneration

verschiedener Gewebe, ohne dass sich dabei der körpereigene Stammzellpool

aufbraucht.

HSCs spielen schon seit Jahrzehnten eine Rolle in der Therapie von

Erkrankungen der Blut bildenden Zellen wie beispielsweise Leukämie. Die

Existenz solcher Stammzellen wurde bereits 1909 von Alexander Maximov

postuliert. Nach heutigem Verständnis stammen HSCs aus dem Knochenmark,

Einleitung

4

sind multipotent und mittels Differenzierung über myeloische oder lymphoide

Progenitorzellen für eine permanente Regeneration aller Zellen des Blut

bildenden Systems und des Immunsystems verantwortlich. Dabei verlieren sie

bei zunehmender Differenzierung ihren Stammzellcharakter, also ihre

Multipotenz und Fähigkeit zur Selbsterneuerung (Kondo, Weissman et al. 1997;

Akashi, Traver et al. 2000). Nach der Geburt machen HSCs etwa 0,05 - 0,5 %

aller Knochenmarkszellen aus (Gunsilius, Gastl et al. 2001).

Als Oberflächenmarker der Wahl für HSCs und hämatopoietische

Progenitorzellen gilt nach wie vor CD34, das sich bei zunehmender Zellreifung

und Differenzierung bei der Hämatopoese nicht mehr nachweisen lässt

(Krause, Fackler et al. 1996). Des weiteren wurde im Jahre 1997 AC133

(Hematopoietic stem cell antigen, heute CD133) als weiterer spezifischer

Oberflächenmarker beschrieben (Yin, Miraglia et al. 1997). Somit lassen sich

diese Zellen als CD34+ CD133+ CD38- HLA-DR- charakterisieren.

Als gängigstes Kriterium zur Identifizierung von HSCs gilt schon seit

Jahrzehnten ihre Fähigkeit unter geeigneten Bedingungen in reife Blutzellen zu

differenzieren. In Clonogenic in vitro culture assays können Kolonie bildende

Einheiten (CFUs) – die nachfolgend Zellklone generieren – identifiziert,

quantifiziert und ihrem Differenzierungsgrad zugeordnet werden (Gunsilius,

Gastl et al. 2001).

Seit über 30 Jahren schon werden HSCs mittels autologer und allogener

Stammzelltransplantation erfolgreich zu Therapiezwecken eingesetzt. Dadurch

sind sowohl die myeloablative Hochdosis-Radiochemotherapie bei

Tumorerkrankungen als auch die Therapie bösartiger Erkrankungen des Blut

bildenden Systems erst möglich geworden. Durch Stimulation der Blutbildung

des Donors mit Wachstumsfaktoren (meist G-CSF: Granulozyten Colony-

stimulating factor) treten vermehrt CD34+-positive Blutzellen aus dem

Knochenmark in den Blutkreislauf über und können mittels Apharese-Verfahren

aus dem Blut des Spenders isoliert werden. Dies hat den operativen Eingriff der

Kochenmarkpunktion heute weitgehend überflüssig gemacht. Trotz

jahrzehntelanger Forschung und therapeutischer Erfahrung besteht nach wie

vor Forschungsbedarf zum besseren Verständnis der Vorgänge bei Graft-

Einleitung

5

versus-host-Krankheit und Graft-versus-tumor-Phänomenen um bestmögliche

Therapieschemata für den Patienten zu etablieren (Gunsilius, Gastl et al. 2001;

Lagasse, Shizuru et al. 2001).

1.2.3. Mesenchymale Stammzellen (MSCs)

In den 70er Jahren des 20. Jahrhunderts beschrieb Alexander Friedenstein

erstmals eine Population adulter Stammzellen aus dem Knochenmark, die in

der Lage ist in Knochen und Knochenmarkstroma zu differenzieren. Diese

Zellen erscheinen spindelförmig und wurden aufgrund ihrer histologischen

Morphologie als Fibroblast-like Cells bzw. fibroblastische Vorläuferzellen

bezeichnet. Sie zeichnen sich durch eine ausgeprägte Adhärenz an Plastik aus,

wodurch sie erstmals als eigenständige Subpopulation von Stammzellen des

Knochenmarks isoliert werden konnten (Friedenstein, Piatetzky et al. 1966;

Friedenstein, Gorskaja et al. 1976). In weiteren Versuchen kultivierte

Friedenstein Zellklone stromaler Knochenmarkszellen in vitro, die sich nach

anschließender In-vivo-Transplantation in Diffusionskammern erfolgreich in

Knorpel und Knochen differenzieren ließen. Er nannte diese Zellen Osteogene

Stammzellen (Friedenstein, Chailakhyan et al. 1987; Bianco, Robey et al. 2008;

Bianco 2011).

Caplan prägte dann erstmals den Begriff der Mesenchymalen Stammzelle und

beschrieb ihr Potential aufgrund von extrinsischen (autokrine und parakrine)

und intrinsischen (genomisches Potential) Faktoren zu einem bestimmten

Phänotyp zu differenzieren. Der Begriff Mesenchym kommt aus dem

Griechischen und bedeutet soviel wie das „Mithineingeflossene“. Er beschreibt

das Vorkommen der MSCs zwischen den epithelialen Keimblättern Entoderm

und Ektoderm und ihre Eigenschaft sich zwischen diesen zu bewegen oder gar

ihre Entstehung aus epithelialen Zellen während der Embryogenese (Caplan

1991).

Zunehmendes Interesse und Hoffnungen für therapeutischen Nutzen weckten

die Studien von Pittenger, der auch nach spezifischen Oberflächenmarkern der

MSCs zur besseren Identifizierung suchte. Er beschrieb die Populationen

Einleitung

6

positiv für die Proteindomänen SH2 und SH3 sowie für CD29, CD44, CD71,

CD90, CD106, CD120a und CD124, negativ für CD14, CD34 und CD45, die

demgegenüber bei HSCs nachzuweisen sind (Pittenger, Mackay et al. 1999).

Außerdem wurden STRO-1, HOP26 (CD63), CD49a und SB10 (CD166) als

mögliche Oberflächen-Markerantigene untersucht (Stewart, Monk et al. 2003).

Auch Zelladhäsionsmoleküle der MSCs scheinen eine wichtige Rolle zu spielen,

zum Beispiel bei Zell-Zell-Interaktionen mit T- und B-Lymphozyten sowie für die

Bindung an Proteine der Extrazellularmatrix. Darüber hinaus ermöglichen diese

Moleküle den MSCs auch das Auffinden verletzten Gewebes durch Rollen und

Adhäsion am Endothel. Hohe Expression konnte unter anderem für die

Integrine α1, α5, und β1 gefunden werden (Majumdar, Keane-Moore et al.

2003; Barry and Murphy 2004).

Aus neueren Studien erwächst die Hoffnung CD146 (MCAM, Melanoma Cell

Adhesion Molecule) als möglichen Oberflächenmarker benutzen zu können, ist

er doch hoch exprimiert in stromalen Knochenmarkszellen, die als CFU-F

(Colony-forming unit Fibroblasten) bzw. mesenchymale Progenitorzellen

angesehen werden können. Differenzierte Osteoblasten hingegen zeigen

keinerlei Expression von CD146. Eine Herunterregulation von CD146 kann

dabei schon in frühen Stadien osteogener Differenzierung von CFU-F

beobachtet werden. Auch die Nähe zu Blutgefäßen scheint für die Expression

von CD146 essentiell. Nach Transplantation von MSCs zeigen nur solche

Zellen in unmittelbarer Umgebung von Blutgefäßen Expression von CD146. In

diesem Zusammenhang scheint die bloße Gegenüberstellung von

Vorläuferzellen und differenzierten Osteoblasten aber nicht mehr zeitgemäß. Im

Idealfall sollten sich verschiedene Reifestadien zwischen undifferenzierten

Vorläuferzellen und differenzierten Osteoblasten bzw. Osteozyten anhand

spezifischer Oberflächenmarker und morphologisch unterscheiden lassen

(Bianco 2011; Bianco, Sacchetti et al. 2011).

Es kann also festgestellt werden, dass MSCs eine heterogene

Stammzellpopulation darstellen, für die noch kein eindeutiger

Oberflächenmarker gefunden werden konnte. Folgende Minimalkriterien sollten

deshalb zur Charakterisierung erfüllt werden: die Adhärenz an Plastik, die

Einleitung

7

spindelförmige Morphologie, die Differenzierbarkeit zu Chondroblasten,

Osteoblasten und Adipozyten und die Expression von CD105, CD73 und CD90,

sowie die fehlende Expression von CD45, CD34, CD14 oder CD11b, CD79

oder CD19 (Dominici, Le Blanc et al. 2006). Diese Kriterien erlauben jedoch

generell nur eine retrospektive Identifikation von MSCs. Aktuelle Forschungen

konzentrieren sich darauf MSCs prospektiv in vivo zu identifizieren und

spezifisch mittels Durchflusszytometrie (Fluorescence-activated cell sorting,

FACS) aufzureinigen. Dieses Verfahren wird beispielsweise für die Gewinnung

von CD34+-HSCs seit Jahren erfolgreich angewandt. Neben den von Dominici

vorgeschlagenen Oberflächenmarkern könnten dabei auch LNGFR (Low-affinity

nerve growth factor receptor, CD271) und CD49a geeignete Kandidaten sein.

Es konnte zudem gezeigt werden, dass sich diese MSCs, die mittels FACS

gewonnen wurden, morphologisch vom typischen spindelförmigen Aussehen

der MSCs aus der Zellkultur unterscheiden und eher als großovale Zellen mit

prominenten Nucleoli erscheinen. Daher liegt der Verdacht nahe, dass Biologie

und Morphologie der MSCs in vivo und in vitro differieren (Jones, English et al.

2006; Jones and McGonagle 2008; Augello, Kurth et al. 2010).

Im adulten Organismus haben MSCs bei vielen Regenerations- und

Differenzierungsprozessen eine wichtige Rolle inne. Sie sind essentiell für die

Entwicklung der HSCs, indem sie im Rahmen einer stromalen Differenzierung

durch parakrine Ausschüttung der Zytokine IL-6, IL-11, G-CSF und GM-CSF

deren Proliferation und Differenzierung beeinflussen (Majumdar, Thiede et al.

2000). Dabei wird erst durch Anwesenheit von MSCs eine physiologische

Mikroumgebung geschaffen. Vor allem CD146 scheint dabei eine Schlüsselrolle

in der essentiellen Interaktion von Endothelzellen mit MSCs zu spielen

(Sacchetti, Funari et al. 2007). Endostale Gewebeoberflächen und sinusoidale

Gefäßwände (Adventitia) als Reservoir für CD146+ stromale retikuläre Zellen

(osteogene Progenitor-/ Stammzellen) werden hier als Stammzellnische für

HSCs diskutiert (Bianco 2011; Bianco, Sacchetti et al. 2011).

Ein wichtiger Regenerationsprozess im Organismus ist die Frakturheilung. Über

Hämatomausbildung und inflammatorische Kaskaden im Frakturspalt wird die

Bildung von Kallus vorangetrieben, aus dem sich neuer Knochen bildet. MSCs

Einleitung

8

hemmen die Entzündungsreaktion, indem proinflammatorische Zytokine wie

TNFα oder IL-1 herunterreguliert werden. Gleichzeitig wird die Kallusbildung

positiv beeinflusst durch Ausschüttung von BMP-2 (Granero-Molto, Weis et al.

2008; Granero-Molto, Weis et al. 2009). Ein anderes Beispiel für

Geweberegeneration durch MSCs und Hoffnungen für therapeutischen Nutzen

liefern die Studien von Mansilla. Er konnte im Vergleich zu gesunden Patienten

im peripheren Blut starker Verbrennungsopfer ein erhöhtes Vorkommen von

MSCs messen (Mansilla, Marin et al. 2006).

Neben der Regeneration und Neubildung von Knorpel, Knochen,

Knochenmarkstroma und Bindegewebe gibt es zahlreiche Hinweise, die auch

Differenzierungswege in andere Gewebe vermuten lassen wie Muskulatur,

Sehnen und sogar Zellen des Zentralen Nervensystems (Jiang, Jahagirdar et

al. 2002). Dennoch werden diese Hinweise aus In-Vitro-Untersuchungen auch

heute noch von vielen Wissenschaftlern sehr kontrovers diskutiert. Eine

Reproduzierbarkeit der Differenzierung in Myozyten, Tenozyten und Neuronen

in vivo bereitet nämlich nach wie vor große Schwierigkeiten (Bianco, Robey et

al. 2008; Bianco 2011).

Anders als für HSCs konnte für MSCs bisher keine eindeutig identifizierbare

und klassifizierbare gemeinsame multipotente Stammzelle gefunden werden,

sodass MSCs nach wie vor als heterogene Population verstanden werden

müssen. Der Verdacht liegt nahe, dass bei Zellkulturversuchen nicht

multipotente MSCs die verschiedenen Differenzierungswege bedingen, sondern

Vorläuferzellen aus unterschiedlichen Differenzierungswegen in einem

gemeinsamen Pool kultiviert werden. Somit scheinen eher gewebespezifische

Vorläuferzellen (gewebespezifische Perizyten) als multipotente Stammzellen für

die Regenerationsprozesse unterschiedlicher mesenchymaler Gewebe

verantwortlich zu sein (Bianco, Robey et al. 2008; Bianco 2011). Es ist also an

zukünftigen Forschungen diese Kontroversen zu klären. In meiner Arbeit

benutze ich dennoch den Begriff der MSC, da dieser in der heutigen Literatur

nach wie vor omnipräsent ist. Er soll als Überbegriff für sämtliche

Subpopulationen verstanden sein.

Einleitung

9

1.3. Vorkommen der MSCs im adulten Organismus

Wie bereits beschrieben, bildet das Knochenmark ein Reservoir für MSCs. Sie

konnten darüber hinaus aber auch aus zahlreichen anderen Geweben isoliert

werden. So lassen sich mesenchymale Vorläuferzellen aus peripherem Blut

(Zvaifler, Marinova-Mutafchieva et al. 2000) sowie aus Nabelschnurblut (Erices,

Conget et al. 2000) osteogen und adipogen differenzieren. Dies kann als

Hinweis dafür angesehen werden, dass im Blut nicht nur Vorläuferzellen der

hämatopoietischen Reihe anzutreffen sind. Auch aus dem Fettgewebe lassen

sich Zellen mit ähnlichem Phänotyp wie MSCs aus dem Knochenmark

gewinnen, die chondrogene, osteogene, adipogene, myogene und sogar

neurogene Differenzierbarkeit in vitro zeigen (Zuk, Zhu et al. 2002). Gleiches

konnte auch für MSCs aus Amnionflüssigkeit gezeigt werden (In 't Anker,

Scherjon et al. 2003). Neben dem Knochenmark beherbergen auch die

Kompakta (Guo, Li et al. 2006) und das Periost (De Bari, Dell'Accio et al. 2006),

die Synovialmembran (De Bari, Dell'Accio et al. 2003), die Synovialflüssigkeit

(Jones, English et al. 2004) sowie der Gelenkknorpel (Dowthwaite, Bishop et al.

2004) Nischen für MSCs bzw. mesenchymale Progenitorzellen. Außerdem

gelingt es in letzter Zeit zunehmend solche Zellen aus dem subkutanen

Fettgewebe zu isolieren (Yilgor Huri, Cook et al. 2013).

Ob diese Zellen wirklich als multipotente Stammzellen angesehen werden

können oder vielmehr gewebespezifische Vorläuferzellen darstellen, ist noch

nicht hinreichend geklärt. MSCs aus der Zahnpulpa synthetisieren nämlich im

Vergleich zu solchen aus dem Knochenmark eher Dentin als Knochen, wenn

sie in vivo kultiviert werden (Gronthos, Brahim et al. 2002). Zellen aus anderen

vorher erwähnten Geweben lieferten äquivalente Ergebnisse (Bianco, Robey et

al. 2008).

Eine weitere Subpopulation der MSCs sind die so genannten bhMSCs

(trabecular bone-derived human mesenchymal stem cells), die sich aus

Fragmenten des trabekulären Knochens kultivieren lassen (Noth, Osyczka et al.

2002) und in dieser Arbeit mit den normalen stromalen mhMSCs (marrow-

derived human mesenchymal stem cells) verglichen werden.

Einleitung

10

1.4. Epitheliale Mesenchymale Transition (EMT)

Der entscheidende Schritt zu einer Organogenese und somit zur Entstehung

von Metazoen wurde vor ungefähr 600 Millionen Jahren durch das erstmalige

Auftreten mesenchymaler Zellen bzw. einer Aufteilung in die drei Keimblätter

Ekto-, Ento- und Mesoderm während der Embryogenese ermöglicht. Dieser

Meilenstein legte die Grundlage für die Entwicklungsgeschichte der Wirbeltiere

und ist untrennbar an das funktionelle Potential mesenchymaler Zellen

gebunden, nämlich ihrer Fähigkeit zu Interaktionen zwischen den Keimblättern,

ihres Differenzierungspotentials in verschiedene Organe und Gewebe und ihrer

freien Beweglichkeit und Fähigkeit zum Ortswechsel innerhalb des Organismus.

Der Begriff der EMT beschreibt als weitere essentielle Funktion der

mesenchymalen Zellen für die Organentwicklung höherer Lebewesen, dass das

Mesenchym nicht nur aus dem Mesoderm, sondern auch aus epithelialen

Zellen der anderen Keimblätter entstehen kann. Unter bestimmten

Voraussetzungen können sich also epitheliale Zellen in mesenchymale

umwandeln. Die enorme Plastizität der mesenchymalen Zellen und der rege

funktionelle Austausch zwischen den Keimblättern spiegeln sich auch darin

wieder, dass der umgekehrte Prozess, die Mesenchymale Epitheliale Transition

(MET) bzw. die Umwandlung mesenchymaler in epitheliale Zellen möglich ist.

Diese Mechanismen ereignen sich aber nicht nur während der Embryogenese,

sondern auch im adulten Organismus und konnten in Studien nachgewiesen

werden, seit mesenchymale Zellen (z.B. durch Vimentin) von epithelialen (z.B.

durch E-Cadherin) phänotypisch abgrenzbar sind. Man stellt sich vor, dass

mesenchymale Zellen über den Blutweg oder durch selbständige Bewegung

innerhalb des Gewebes ihren Ort wechseln und sich dann in Epithel umwandeln

können. Die beschriebenen komplexen Prozesse werden weiterhin intensiv

erforscht und scheinen für eine funktionierende Physiologie, aber auch bei

degenerativen Veränderungen und bösartigen Tumoren von großer Bedeutung

zu sein (Thiery and Sleeman 2006; Baum, Settleman et al. 2008).

Einleitung

11

1.5. Die Nische der MSCs

Adulte Stammzellen zeichnen sich durch Multipotenz und Fähigkeit zur

unbegrenzten Selbsterneuerung aus. Zur Aufrechterhaltung dieses

Stammzellcharakters wird eine Organisation der Zellen in einem Zellverbund

angenommen, der sogenannten Stammzellnische, in der über Zell-Zell-

Kontakte und parakrine Signale zwischen Stammzellen und Gewebszellen

innerhalb der Nische Zellteilungen, Differenzierung und Aufrechterhaltung des

Stammzellpools gewährleistet werden.

Schofield postulierte 1978 erstmals das Vorkommen einer solchen Nische für

HSCs (Schofield 1978). Nach derzeitigem Wissensstand wird eine

perivaskuläre (Arteriolen, Kapillaren, Venolen) bzw. sinusoidale Lokalisation der

MSC-Nischen sowohl innerhalb des Knochenmarks als auch in anderen

mesenchymalen Geweben und Organen angenommen. Viele Autoren vermuten

sogar, dass es sich bei retikulären Zellen bzw. Perizyten um die native In-vivo-

Form der MSCs handelt, da diese ein gleichartiges Differenzierungspotential

und entsprechende Oberflächenmarker (CD44, CD73, CD90, CD105, CD146)

wie MSCs aufweisen. Innerhalb der Stammzellnische scheinen Sauerstoff- und

Calcium-Gradienten, Interaktionen über Integrine und Cadherine, der Wnt-

Signalweg sowie lokale Zytokin-Ausschüttungen von Bedeutung zu sein, die

jedoch bisher noch nicht im Detail verstanden werden. Diese Interaktionen

betreffen auch Nicht-Stammzellen wie zum Beispiel Endothelzellen in direkter

Umgebung der MSCs. Der direkte Kontakt zu Blutgefäßen würde auch eine

schnelle Verbreitung der Stammzellen über den Blutweg erklären. Ob Perizyten

aber die einzige Erscheinungsform von MSCs im Organismus sind, bleibt

fraglich, da auch avaskuläre Gewebe (z.B. Gelenkknorpel) MSC-ähnliche Zellen

enthalten (Kolf, Cho et al. 2007; Bianco, Robey et al. 2008; Augello, Kurth et al.

2010; Bianco 2011).

Bianco stellt in diesem Zusammenhang ein neues Erklärungsmodell für die

Stammzellnischen im Knochenmark zur Diskussion, in dem er unter anderem

eine gemeinsame Nische für HSCs und MSCs postuliert. Er versteht das

gesamte Knochenmark als ausgedehnten perivaskulären Raum. Dabei

Einleitung

12

verbindet er das Konzept der sinusoidalen bzw. endothelialen mit dem der

endostalen bzw. osteoblastischen Lokalisation der Nische und spricht von einer

gemeinsamen Nische im Subendothelialraum sowohl für HSCs als auch für

MSCs, die zwangsläufig koexistieren und sich gegenseitig beeinflussen. Von

großer Bedeutung scheinen Interaktionen über CD146 zwischen MSCs und

Endothelzellen zu sein. Er spricht also nicht von einem Nebeneinander der

sinusoidalen und der endostalen Nische im Knochenmark, sondern von einer

„Dualen Nische“, die beide Konzepte vereinigt. Auch die Rolle von Fettzellen im

Knochenmark kann mit dieser Sichtweise in Einklang gebracht werden, da mit

einer Differenzierung von MSCs in Fettzellen auch das Expressionspotential für

alle parakrinen Faktoren verloren geht, die für die Aufrechterhaltung des

hämatopoietischen Stammzellpools von Bedeutung sind. In der Tat ist „gelbes“

fettreiches Knochenmark nicht zur Hämatopoese in der Lage. Eine Umkehrung

dieses Prozesses von fettzellreichem „gelben“ in „rotes“ hämatopoietisches

Knochenmark wird durch Expression der MSCs von Angiopoietin 1 und anderen

angiopoietischen Faktoren ausgelöst (Bianco 2011; Bianco, Sacchetti et al.

2011).

Ein besseres Verständnis um die Biologie der mesenchymalen

Stammzellnischen würde die therapeutischen Möglichkeiten und Ergebnisse im

Rahmen des Tissue Engineering erheblich verbessern, wenn sich ins Gewebe

einzubringende MSCs oder differenzierte Zellen zur Regeneration schon in vitro

in einer optimalen Mikroumgebung befänden und sich somit potentiell effizienter

in vivo in den zu regenerierenden Gewebsdefekt integrieren ließen.

1.6. Differenzierungspotential der MSCs

MSCs werden, wie bereits erläutert, unter anderem durch ihre

Differenzierbarkeit in Knochen, Knorpel und Fettgewebe definiert. Eine

osteogene Differenzierung wird durch Inkubation der Zellkultur mit

Ascorbinsäure, β-Glycerophosphat und Dexamethason angestoßen und kann

über eine erhöhte Expression von Alkalischer Phosphatase (ALP) und Calcium-

Ablagerungen nachgewiesen werden. Alternativ zum Glucocorticoid

Einleitung

13

Dexamethason kann auch BMP-2 verwendet werden (Noth, Osyczka et al.

2002). Da die chondrogene Differenzierung der MSCs eine erhöhte Zelldichte

voraussetzt, müssen die isolierten MSCs vorerst zu Pellets zentrifugiert werden

um dann in einem serumfreien Medium unter Stimulation mit Transforming

Growth Factor β (TGFβ) zu reifen. Dabei lässt sich als Zeichen für die

Chondrogenese die zunehmende Produktion von proteoglykanreicher

Extrazellularmatrix und Typ-2-Kollagen histologisch erkennen. Die Adipogenese

lässt sich induzieren, indem die Zellkultur mit Dexamethason, Insulin, 1-Methyl-

3-Isobutylxanthin und Indomethacin inkubiert wird. Als Charakteristika von

Adipozyten gelten erhöhtes Vorkommen von Fettvakuolen, die sich mit Oil Red

O anfärben lassen, sowie Expression von Peroxisome Proliferation-activated

Receptor g2 (PPARγ2), Lipoproteinlipase (LPL) und das Fettsäuren bindende

Protein 2 (FABP2) (Pittenger, Mackay et al. 1999; De Bari, Dell'Accio et al.

2006; Augello, Kurth et al. 2010).

Darüber hinaus scheinen MSCs über ein weitaus größeres

Regenerationspotential zu verfügen. Sowohl in vitro als auch im Tiermodell ließ

sich durch MSCs eine Tenogenese anstoßen, die vor allem bei Überexpression

von Smad8 in den MSCs beobachtet werden konnte. Bei den Smad-Proteinen

handelt es sich um eine Gruppe von zellulären Mediatoren für BMP-gesteuerte

Signalwege. Nach Injektion von Smad8-vorbehandelten MSCs ins Peritoneum

von Mäusen bildeten sich Tenozyten und Achillessehnenrupturen zeigten

deutlich bessere Regeneration durch Einbringen von Smad8-MSCs in den

Sehnendefekt (Hoffmann, Pelled et al. 2006).

Bereits 1995 konnte Wakitani in vitro eine myogene Differenzierung von MSCs

aus dem Knochenmark von Ratten durch Inkubation mit 5-Azacytidin induzieren

(Wakitani, Saito et al. 1995). Eine solche Differenzierung in vivo gelang De Bari

mit humanen MSCs aus der Synovialmembran (hSM-MSCs), die er im

Tiermodell Mäusen mit Muskeldystrophie Typ Duchenne verabreichte. Er

konnte sowohl eine Differenzierung der menschlichen MSCs zu Muskelfasern

mit physiologischer Dystrophinproduktion innerhalb der erkrankten Muskulatur

der Maus beobachten als auch einen protektiven Effekt auf die pathologisch

veränderten Muskelfasern der Maus nachweisen (De Bari, Dell'Accio et al.

Einleitung

14

2003). Vor allem aufgrund der technisch relativ einfachen Gewinnung aus dem

subkutanen Fettgewebe erfreuen sich Adipogene Mesenchymale Stammzellen

(Adipose-derived stem cells) immer größerer Beliebtheit und zeigen ein

ausgeprägtes myogenes Differenzierungspotenzial. Die Myogenese und somit

die Ausbildung mehrkerniger Muskelzellen aus der Stammzellkultur wird dabei

zusätzlich durch zielgerichtete mechanische Stimulation der Zellkultur positiv

beeinflusst (Yilgor Huri, Cook et al. 2013).

Zudem gibt es Hinweise, die ein neurogenes Differenzierungspotential von

MSCs andeuten. Woodbury entwickelte erstmals ein Protokoll, mit dem er

stromale MSCs zu einem Neuronen-ähnlichen Phänotyp differenzieren konnte.

Die untersuchten Zellen exprimierten Neuronen Spezifische Enolase (NSE),

Neuronales Nucleus Protein (NeuN) Neurofilament M (NF-M), Tau-Protein

(Tau) und Nerve Growth Factor Receptor (trkA), wohingegen die Expression

von Nestin, einem Marker neuronaler Vorläuferzellen, bei zunehmender

Differenzierung abnahm. Gleichzeitig glichen die Zellen unter dem

Lichtmikroskop morphologisch Neuronen und bildeten Dendriten-ähnliche

Zellfortsätze aus (Woodbury, Schwarz et al. 2000). Als weiteres wichtiges

Charakteristikum für Neuronen gilt ihre Fähigkeit Aktionspotentiale auszulösen.

Die dafür erforderlichen spannungsabhängigen Ionenkanäle konnten jedoch bei

den untersuchten Neuronen-ähnlichen Zellen bisher nicht nachgewiesen

werden (Hofstetter, Schwarz et al. 2002).

1.7. Therapeutische Möglichkeiten der MSCs und Tiss ue Engineering

Tissue Engineering beschreibt eine Disziplin der modernen Regenerativen

Medizin. Durch Züchtung von dreidimensionalen Gewebekonstrukten unter

Verwendung von Zellen, Wachstumsfaktoren und eines Trägergerüstes, einem

so genannten Scaffold, und Einbringen dieser in einen Gewebsdefekt im Körper

sollen die Heilungs- und Regenerationsmöglichkeiten von verschiedenen

degenerativ bzw. traumatisch veränderten Geweben verbessert werden. Neben

dem klassischen Tissue Engineering haben auch andere Verfahren mit MSCs

einen hohen Stellenwert in der zukünftigen Therapie degenerativer

Einleitung

15

Erkrankungen. Zum Beispiel die Infusion von MSCs mit anschließender

Rekrutierung im geschädigten Gewebe über den Blutweg oder die

pharmakologische Stimulation von Zytokin- und Chemokin-Rezeptoren, die eine

Rekrutierung von MSCs aus den Stammzellnischen bewirken soll. Von großem

Interesse sind in diesem Zusammenhang unter anderem eine bessere

Regeneration von bradytrophem Knochen alter Menschen oder großer

Knochendefekte, Knorpeldegeneration im Sinne der Gelenkarthrose sowie

verbessertes Remodelling nach Herzinfarkt. Für die jeweilige Indikation sind

verschiedenste Fragen zu klären um Erfolg versprechende Ergebnisse zu

liefern:

Woher und wie sind die MSCs am ehesten zu gewinnen? Sollten die

Stammzellen ex vivo vor der Replantation kultiviert und der gewünschte

Differenzierungsweg bereits initiiert werden? Welche Chemokine bzw. Zytokine

und Differenzierungsmedien wirken sich dabei am ehesten günstig aus?

Können auch mittels FACS gewonnene Stammzellen genügend große

Populationen liefern und welche Oberflächenmarker sind dafür besonders

geeignet? Welche Materialien eignen sich am besten für eine erfolgreiche

Integration der Scaffolds im geschädigten Gewebe? Inwiefern unterscheidet

sich die Biologie der MSCs in vitro und in vivo? Müssen MSCs überhaupt ex

vivo kultiviert werden oder können auch durch pharmakologische Stimulation

MSCs in vivo aus ihren Nischen in ausreichender Anzahl rekrutiert werden?

Jede Indikation verlangt folglich detaillierte und vor allem reproduzierbare

Anwendungsprotokolle um die Verfahren in klinischen Studien zu prüfen

(Augello, Kurth et al. 2010).

Viele Chemokine beeinflussen, wie man heute weiß, die mesenchymalen

Stammzellnischen und haben dabei auch einen Einfluss auf ein erfolgreiches

Auffinden verletzten Gewebes durch die MSCs. Eine Verbesserung der

Knochenheilung konnte für Stromal Cell-derived Factor 1 (SDF-1) und seinen

Rezeptor CXCR4 nachgewiesen werden. Das Chemokin wird aus dem Periost

in Nachbarschaft einer Knochenfraktur ausgeschüttet und sorgt für eine erhöhte

Rekrutierung von MSCs aus der direkten Umgebung des Knochendefektes

sowie aus dem Blut (Kitaori, Ito et al. 2009). Ein solcher positiver Effekt konnte

Einleitung

16

auch für das Remodelling nach einem Myokardinfarkt nachgewiesen werden.

Gerade in der frühen Phase des Remodelling, die mit hoher Expression von

SDF-1 einhergeht, werden besonders viele MSCs aus dem Blut rekrutiert.

Dieses Zeitfenster scheint somit für eine therapeutische Infusion von MSCs

nach einem Herzinfarkt am ehesten geeignet zu sein (Ma, Ge et al. 2005).

Im Folgenden möchte ich über den aktuellen Stand zum Einsatz von MSCs bei

Knochenerkrankungen und Defektheilung berichten. Größere posttraumatische

Knochendefekte führen regelmäßig zu mangelhafter Frakturheilung oder zur

Defektheilung mit Ausbildung von Pseudarthrosen. Nach Auffüllung des

Knochendefektes mit Scaffolds aus Hydroxylapatit, in den vorher kultivierte

stromale MSCs eingebracht wurden, konnte eine deutlich gesteigerte

Kallusbildung und somit Knochenheilung sowohl beim Schaf (Kon, Muraglia et

al. 2000) als auch beim Menschen beobachtet werden (Quarto, Mastrogiacomo

et al. 2001). Diese Ergebnisse und dabei vor allem die Knochenbildung im

Innern der Scaffolds waren in der Vergleichsgruppe im Schafmodell, in der

Scaffolds ohne MSCs benutzt wurden, deutlich geringer oder gar nicht

ausgeprägt (Kon, Muraglia et al. 2000). In einer klinischen Studie an Kindern

mit Osteogenesis imperfecta konnte Horwitz nach allogener

Knochenmarktransplantation einen positiven Effekt auf das Knochenwachstum

und die Knochendichte der Patienten feststellen. Dieser Effekt ließ sich in einer

nachfolgenden Studie an den gleichen Patienten zusätzlich durch Infusion von

MSCs verbessern. Er konnte in nachfolgenden Untersuchungen auch das

Einwachsen der zuvor markierten MSCs und ihre Differenzierung zu

Osteoblasten im genetisch defekten Knochengewebe nachweisen (Horwitz,

Gordon et al. 2002). Da mittlerweile davon ausgegangen wird, dass die

Zellkultur in vitro die Eigenschaften der MSCs verändert und es sich um eine

kostspielige Prozedur handelt, rücken heute zunehmend Methoden in den

Vordergrund, die eine direkte Isolierung der MSCs mittels FACS und

nachfolgende Implantation in Scaffolds oder Verabreichung durch Infusion

verfolgen. Aslan konnte für CD105+-positive Zellen sowohl in vitro als auch in

vivo eine osteogene Differenzierung zeigen (Aslan, Zilberman et al. 2006).

Nach wie vor ist auch die Frage nicht hinreichend geklärt, woher MSCs für eine

Einleitung

17

bestimmte Indikation zu gewinnen sind. MSCs aus dem Periost zeigen zum

Beispiel ein stärkeres osteogenes Potential als solche aus der

Synovialmembran. Aufgrund dieser Ergebnisse erstellte De Bari ein Modell, mit

dem sich anhand knochenspezifischer Biomarker das osteogene Potential für

MSCs vor einer Implantation vorhersagen lässt (De Bari, Dell'Accio et al. 2008).

Da MSCs eine sehr heterogene Population darstellen, werden wohl in Zukunft

derartige Modelle einen immer wichtiger werdenden Beitrag zur Vorhersage des

therapeutischen Nutzens einer gewonnenen Stammzellpopulation haben.

Auch die Rekonstruktion von physiologischem Gelenkknorpel bereitet nach wie

vor Schwierigkeiten, da dieser eine hochkomplexe dreidimensionale Struktur

mit zonaler Gliederung der Chondrozyten und Extrazellularmatrix bei

unterschiedlichem Aufbau der einzelnen Zonen aufweist. Trotz positiver

Resultate der Autologen Chondrozytenimplantation (ACI) in der klinischen

Anwendung bei lokalisierten Knorpelschäden kann dieses Verfahren der

komplexen Struktur des Gelenkknorpels nicht gerecht werden und im Bereich

des Transplantats bildet sich in vivo eine eher homogene Extrazellularmatrix

ohne zonale Gliederung aus. Zudem ist die Frage nach geeigneten Materialien

für Transplantate in einen Knorpeldefekt (Scaffold, Hydrogel-Matrix, Bioprinting)

sowie nach dem Ursprungsort der zu transplantierenden Zellen (Chondrozyten

vs. MSCs) noch nicht ausreichend geklärt. Verschiedene Studien vergleichen

deshalb das chondrogene Potential einzelner MSC-Subpopulationen (Knorpel,

Knochenmark, Synovialmembran, Fettgewebe, Nabelschnur) miteinander. In

modernen Protokollen wird versucht der Mikrostruktur des Gelenkknorpels

schon bei der Kultivierung möglichst gerecht zu werden, indem bereits ex vivo

eine Dreischichtung in Außen-, Mittel- und Innenschicht konstruiert wird und die

MSCs innerhalb jeder Schicht unterschiedlichen Differenzierungsstimuli

ausgesetzt werden. Heute kann in Bioreaktoren jede konstruierte Schicht des

Transplantates variierenden mechanischen und biologischen Reizen ausgesetzt

werden, was für eine physiologische Knorpelarchitektur unvermeidlich

erscheint. Die Ergebnisse aus den Erfahrungen mit der ACI und aus aktuellen

Tiermodellen sollten in den kommenden Jahren in reproduzierbaren klinischen

Studien erprobt werden. In Zukunft wird versucht werden schon frühere Stadien

Einleitung

18

der Arthrose, in denen die tieferen Knorpelschichten noch intakt sind, einer

regenerativen Therapie zuzuführen (Klein, Malda et al. 2009).

Große Hoffnungen schüren die immunmodulatorischen Eigenschaften der

MSCs, die sie zu einem potenten Werkzeug in der Bekämpfung von

Autoimmunerkrankungen und Transplantatabstoßungen machen. MSCs

scheinen innerhalb gesunden und verletzten Gewebes für eine Homöostase der

Signale und Interaktionen zwischen verschiedenen Zellen zu sorgen. Dabei

beeinflussen sie den Erhalt des Stammzellpools sowie die Differenzierung

innerhalb der HSC-Nische durch trophische und anti-apoptotische parakrine

Stimulation der HSCs und der stromalen Gewebszellen in deren Umgebung.

Sie sezernieren Zytokine, die anti-inflammatorisch und anti-proliferativ auf

Immunzellen wirken und somit eine physiologische Heilung verletzten Gewebes

begünstigen. Eine zentrale Rolle für biologische Funktionen der MSCs spielt die

Interaktion mit dem Immunsystem, indem sie unter anderem die Proliferation

von T-Lymphozyten zu unterdrücken vermögen (Di Nicola, Carlo-Stella et al.

2002). Sie greifen wechselseitig in das Zusammenspiel von T-Lymphozyten,

Dendritischen Zellen, Monozyten, Makrophagen, Neutrophilen Granulozyten

und Natürlichen Killerzellen ein und wirken dabei dem Entzündungsgeschehen

entgegen, sodass sich in Anwesenheit von MSCs eine verminderte Expression

der proinflammatorischen Zytokine INFγ, IL-12 und TNFα und eine erhöhte

Expression der anti-inflammatorischen Zytokine IL-4 und IL-10 messen lässt.

Zudem nimmt die zytolytische Aktivität von Natürlichen Killerzellen und CD8+ T-

Lymphozyten ab, während die Proliferation von regulatorischen T-Zellen

zunimmt. Diese Mechanismen können jedoch in Anwesenheit von Bakterien

oder anderen infektiösen Agenzien durch Aktivierung von Toll-like Rezeptoren

(TLR) umgangen werden, sodass MSCs nicht zwangsläufig eine Infektneigung

begünstigen. Die untersuchten Mechanismen sind vielfältig und kompliziert.

Zusammenfassend lässt sich jedoch sagen, dass MSCs für eine Deeskalation

und Stabilisierung von überschießenden Entzündungsreaktionen sorgen

(Uccelli, Moretta et al. 2008).

Diese Erkenntnisse wecken Hoffnungen für neue Strategien bei der Therapie

von Autoimmunerkrankungen. Im Mausmodell mit Multipler Sklerose konnten

Einleitung

19

infundierte MSCs über immunregulierende Effekte an T-Zellen die Stärke der

Erkrankungsschübe abmildern, wobei eine Anergie der krankheits-

verursachenden T-Zellen beobachtet wurde (Zappia, Casazza et al. 2005).

Außerdem zeigten sich im Mausmodell mit Diabetes mellitus nach Infusion von

MSCs Reparaturmechanismen an den geschädigten pankreatischen Inselzellen

und den Nierenglomeruli (Lee, Seo et al. 2006). In einem anderen Mausmodell

zur Rheumatoiden Arthritis konnte eine abgeschwächte Immunaktivität in den

betroffenen Gelenken und somit auch eine verminderte Gelenkzerstörung in

Anwesenheit von hMSCs nachgewiesen werden (Augello, Tasso et al. 2007).

Daneben eröffnen die immunmodulatorischen Eigenschaften der MSCs in

zahlreichen Studien therapeutisches Potential für die Behandlung anderer

Krankheiten wie zum Beispiel Myokardinfarkt (Orlic, Kajstura et al. 2003),

Schlaganfall (Li, Chen et al. 2002), Akutes Nierenversagen (Togel, Hu et al.

2005) oder Leberversagen (Parekkadan, van Poll et al. 2007). Viel

versprechende Therapieansätze ergeben sich auch aus den Versuchen zu

Abstoßungsreaktionen nach Transplantationen, vor allem bei der Graft-versus-

host-Krankheit, bei der sich T-Lymphozyten aus dem Transplantat gegen den

Empfängerorganismus richten (Le Blanc, Rasmusson et al. 2004).

Bei aller Euphorie für zukünftige Therapieoptionen wird weiterhin das

potenzielle Risiko für die Entstehung bösartiger Tumoren durch die Therapie mit

MSCs diskutiert. Ob die verabreichten Stammzellen durch Unterdrückung des

Immunsystems eine Tumorgenese begünstigen oder die eingebrachten Zellen

selbst bösartig entarten, bleibt in diesem Zusammenhang noch zu klären

(Djouad, Plence et al. 2003). Außerdem wurden viele Erwartungen in die

möglichen Regenerationsfähigkeiten der MSCs bisher leider noch enttäuscht

(Bianco 2011).

1.8. Zielsetzung dieser Dissertation

Die Differenzierbarkeit von MSCs in Knorpel, Knochen, Binde- und Fettgewebe

sowohl in vitro als auch in vivo konnte bereits in zahlreichen Versuchen

nachgewiesen werden. Es muss also in zukünftigen Forschungen der

Einleitung

20

Stammzellcharakter der MSCs und die In-vivo-Differenzierung in andere

mesenchymale Gewebe wie zum Beispiel Muskelgewebe genauer beschrieben

werden. Außerdem stellt sich nach wie vor die Frage welches Gewebe bzw.

welche anatomischen Strukturen im menschlichen Körper am besten geeignet

sind sowohl ein hohes Maß an Differenzierungspotential sowie einfache

Gewinnung der Zellen zu gewährleisten.

In diesem Zusammenhang möchte ich in dieser Dissertation zwei Arten von

MSCs miteinander vergleichen, nämlich die bereits oben erwähnten und

vielfach untersuchten stromalen (mhMSCs: bone marrow-derived human

mesenchymal stem cells) mit den auch schon beschriebenen trabekulären

(bhMSCs: trabecular bone-derived human mesenchymal stem cells). Beide

Populationen werden aus dem Knochen gewonnen, jedoch erscheint die

Biologie der bhMSCs innerhalb des mineralisierten Knochens insofern

interessant, als es sich bei ihnen im Vergleich zu den mhMSCs um eine

homogenere Zellpopulation zu handeln scheint. Beide Subpopulationen sollen

auf ihr Differenzierungspotential hin untersucht werden.

Material und Methoden

21

2. Material und Methoden

2.1. Materialen

Chemikalien und Reagenzien

Aceton AppliChem, gekauft bei A. Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland

Agarose (Mehrzweck-) Bioline GmbH, Luckenwalde, Deutschland

Antikörperverdünnungspufferlösung DCS, Hamburg, Deutschland Aquatex® Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland Bovines Serum Albumin BSA 0,5 %

Amersham Bioscienes Europe GmbH, Freiburg, Deutschland

dNTP Mix PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland

Ethanol AppliChem, gekauft bei A. Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland

Ethidiumbromid AppliChem, gekauft bei A. Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland

Ethylendiamintetraacetatsäure (EDTA)-Tetranatriumsalzhydrat

Calbiochem, gekauft bei A. Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland

HPLC-Wasser Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

HPLC-Wasser Rotisolv (RNAse-frei) Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, Deutschland

LE-Agarose Biozym Scientific GmbH, Hessisch- Oldendorf, Deutschland

Levamisol DakoCytomation GmbH, Hamburg, Deutschland

Magnesiumchlorid (MgCl2) Sigma-Aldrich Biochemie GmbH, Hamburg, Deutschland

Mausserum PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich

Natriumchlorid (NaCl) AppliChem, gekauft bei ein GmbH, Würzburg, Deutschland

β-Mercaptoethanol AppliChem, gekauft bei A. Hartenstein GmbH, Würzburg, Deutschland

PBS Dulbecco with Ca2+, Mg2+ PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich

Pferdeserum PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Trisbase)

AppliChem, gekauft bei ein GmbH, Würzburg, Deutschland

Trypanblau (0,4 %) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Deutschland


22

Zellkulturmedien und Bestandteile

DMEM/Ham’s F-12 mit L-Glutamin PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich

Fetales Kälberserum (FBS) PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich

Penicillin/Streptomycin 100x (PenStrep)

PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich

Stammzellmedium (SZM) DMEM/Ham’s F-12 mit L-Glutamin 10% Fetales Kälberserum (FBS) 100 U/mL Penicillin 100 µg/mL Streptomycin 50 µg/mL L-Ascorbinsäure-2-Phosphat

Ca2+ freies SZM Zusammensetzung wie normales SZM, jedoch ohne Ca2+

Enzyme

Kollagenase XI Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Schnelldorf, Deutschland

Reverse Transkriptase Promega GmbH, Mannheim, Deutschland Taq DNA-Polymerase PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen,

Deutschland 2,5% Trypsin (10x konzentriert) PAA Laboratories GmbH, Pasching,

Österreich

Puffer- und andere Lösungen

Blockierungslösung 1 g BSA 2,5 mL Pferdeserum 47,5 mL 1xTBS

Hämalaunlösung 6 g Hämatoxylin 1 g Natriumiodid 250 g Aluminiumkaliumsulfat 250 g Chlorhydrat 5 g Zitronensäure 5 l destilliertes Wasser 4 Wochen offene Lagerung bis Gebrauch

Kollagenasemischung 5 mg Kollagenase XI 5 ml DMEM/ F12 + PenStrep Mischung

Ladepuffer (Loading buffer), 5-fach konzentriert

0,25% Bromphenolblau (w/v) 0,25% (Xylencyanol (w/v) 30% Glycerin (w/v) 1 mM EDTA

1xPBS/ EDTA 9,55 g PBS Dulbecco w/o Ca2+, Mg2+ 0,2 g EDTA-Tetranatriumsalzhydrat 1 l destilliertes Wasser pH auf 7,4 eingestellt und autoklaviert


23

10xTBE (Tris-Borat-EDTA) 108 g Trisbase 55 g Borsäure 9,05 g EDTA-Tetranatriumsalzhydrat 1 l destilliertes Wasser pH auf 8,3 eingestellt und autoklaviert

Tris-Puffer 6,057 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan 8,010 g NaCl 1 l destilliertes Wasser pH auf 7,4 eingestellt

0,25% Trypsin 5 ml 2,5% Trypsin (steril) 50 ml 1xPBS

Waschpufferlösung

Vorratslösung: 10xTBS (0,5 M); pH 7,6 60,6 g Trisbase 87,66 g NaCl 1 l destilliertes Wasser pH-Einstellung auf 7,6; Autoklavieren Arbeitslösung: 1xTBS (0,05 M); pH 7,6 10xTBS 1:10 mit dest. Wasser verdünnt Ergänzen mit 0,5% Tween 20

Bausätze

Nucleospin RNA II Kit Macherey-Nagel GmbH & Co. KG, Düren, Deutschland

Super SensitiveTM ICH Detection System

BioGenex Laboratories, USA Bestandteile: - Link MultiLink® (Mouse, Rabbit): Konzentrierte biotinylierte Anti-Immunglobuline in PBS mit Carrierprotein und 0,09% Natriumazid, 1:100 Verdünnung mit Link Diluent - Label Alkaline Phosphatase Label: Konzentriert, mit alkalischem Natriumazid, 1:100 Verdünnung mit Label Diluent - Substrat-Chrmogen Fast Red Chromogen - Substrat-Puffer Naphtolphosphat


24

Antikörper für die Immuncytochemie

Antikörper Antikörperentität Bestellnummer Hersteller Anti-human CD24

Maus IgG2a, κ Katalog Nr: 311102, Clone: ML5; Workshop Nr: V CD24.5

BIOZOL, Eching, Deutschland

Polyklonaler Kaninchen Anti-Maus-AK

Polyklonaler Kaninchen Anti-Kaninchen, Immunoglobulin, mit Peroxidase konjugiert

Code Nr. P 0449 Dako Deutschland GmbH, Hamburg, Bio

2.2. Methoden

2.2.1. Zellen und Zellkultur

Für die Gewinnung der MSCs wurde nach einem Protokoll von Haynesworth

vorgegangen, das von Nöth et. al. modifiziert wurde. Das Knochenmaterial

wurde dabei aus Hüftköpfen von 7 Patienten gewonnen, die im Zuge einer

Coxarthrose einen kompletten künstlichen Gelenkersatz (Totale Endoprothese,

TEP) der Hüfte erhielten (Haynesworth, Goshima et al. 1992; Noth, Osyczka et

al. 2002). Diese Patienten hatten am Operationstag ein Alter von 41 bis 59

Jahren (45 Jahre im Mittel), es waren 4 weibliche und 3 männliche Patienten.

Internistische Vorerkrankungen mit Einfluss auf den Knochenstoffwechsel oder

systemische Einnahme von Medikamenten, die den Knochenstoffwechsel

beeinflussen, konnten bei allen Patienten ausgeschlossen werden. Einzig die

Einnahme von NSAR (Nicht-steroidale Antirheumatika) zur Schmerztherapie

der Coxarthrose wurde angegeben. Nachfolgend werden die jeweils

unterschiedlichen Isolationsmethoden für die mhMSCs und die bhMSCs

beschrieben. Es sei schon hier darauf hingewiesen, dass für viele

Versuchsreihen nur Proben von 6 Patienten verwendet wurden.


25

mhMSCs:

Als Knochenmaterial für die mhMSC-Gewinnung wurden Knochenmark und

Spongiosa aus dem aufgefrästen Femurschaft sowie Knochenfragmente aus

den resezierten Hüftköpfen mit einer scharfen Bürette entnommen. Davon

wurden jeweils 20 ml in ein 50 ml Zentrifugenröhrchen gebracht, das

anschließend mit normalem Stammzellmedium (SZM: DMEM (Dulbecco’s

Modified Eagle Medium)/ Ham’s F-12 mit L-Glutamin, 10% fetales Kälberserum

(FBS), 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, 50 µg/ml L-Ascorbinsäure-

2-Phosphat) auf 50 ml aufgefüllt und schüttelnd durchmischt wurde. Die

Röhrchen wurden dann 5 Minuten lang bei 1200 x g zentrifugiert und der

Überstand abgesaugt, wieder mit SZM aufgefüllt und durch nochmaliges

Schütteln versucht die mhMSCs vom Knochen zu trennen. Im Anschluss ließ

man die schweren Sedimente am Grund der Röhrchen absetzen, der Inhalt

wurde durch ein Zellsieb von Knochenstückchen befreit, in ein neues

Zentrifugenröhrchen überführt und nochmals zentrifugiert. Nach Absaugen des

überstehenden Mediums wurde der Vorgang (Auffüllen, Schütteln,

Zentrifugieren, Absaugen) noch 4 Mal wiederholt um möglichst viele mhMSCs

zu mobilisieren. Nach dem erneuten vorsichtigen Absaugen des Überstandes

wurde das Zellsediment mit 30 ml normalem SZM aufgefüllt und wiederholt auf-

und abpipettiert. Aus der durchmischten Zellsuspension wurden anschließend

50 µl für die Auszählung in einer Zählkammer entnommen, mit 50 µl Trypanblau

(0,4%) gemischt und mit Phosphatpuffer (PBS) im Verhältnis 1:400 verdünnt.

Weiterhin wurden ca. 8x108 Zellen in Gewebekulturflaschen (175 cm2) ausgesät

und bei 37°C in feuchter Atmosphäre (95% Luft, 5% CO2) kultiviert. Danach

wurden die nicht adhärenten Zellen durch Aspiration der Zellsuspension

entfernt und die am Plastik adhärenten Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Im

weiteren Verlauf wurde das SZM alle drei Tage gewechselt bis nach ungefähr 2

Wochen unter mikroskopischer Kontrolle eine Konfluenz der adhärenten Zellen

von ca. 80% festgestellt wurde, sodass die Zellen abgeerntet werden konnten,

indem sie 5 Minuten lang mit PBS und weitere 2 Minuten mit 0,25% Trypsin/

EDTA bei 37°C inkubiert wurden. Eine anschließende Inaktivierung des

Trypsins wurde durch nochmalige Bedeckung der Zellen mit SZM erreicht.


26

bhMSCs:

Bei den bhMSCs handelt es sich um eine trabekuläre Subkultur der MSCs, die

an den Knochentrabekeln der Spongiosa haften. Mit der scharfen Bürette

wurden kleine Knochenblöcke aus den Hüftköpfen gewonnen, die in gebackene

Glasgefäße gebracht wurden, welche mit Nährmedium (DMEM/ F12 +

PenStrep) aufgefüllt wurden. Nach der Zerkleinerung der Knochenstücke in

sogenannte Bone Chips mit einer gebackenen Schere wurde der Überstand der

Suspension abgesaugt und anschließend wieder mit demselben Nährmedium

aufgefüllt, ein Vorgang der noch 3 Mal wiederholt wurde. Das am Grund der

Flasche abgesetzte Sediment wurde dann in ein Zentrifugenröhrchen gegeben,

das mit Nährmedium (DMEM/ F12 + PenStrep) gefüllt wurde unter Zugabe von

Kollagenasegemisch (5 mg Kollagenase XI, 5 ml DMEM/ F12+ PenStrep-

Medium) und Durchmischung der Suspension auf dem Rührfisch für eine

Stunde. Im weiteren Verlauf wurde der Überstand aus dem Röhrchen aspiriert

und mit PBS aufgefüllt und geschüttelt. Anschließend wurde erneut sämtlicher

Überstand bis auf einen klaren Rest abgesaugt und verworfen, wonach das

Zentrifugenröhrchen mit Ca2+-freiem SZM (normales SZM ohne Ca2+) gefüllt

und geschüttelt wurde. Dabei ergab sich eine Suspension, von der jeweils die

Hälfte zusammen mit je 23 ml Ca2+-freiem SZM in 2 Zellkulturflaschen (175

cm2) gefüllt wurde. Diese Zellen wurden dann bei 37°C unter feuchter

Atmosphäre (95% Luft, 5% CO2) kultiviert, wobei alle 3 Tage das Ca2+-freie

Medium gewechselt wurde. Nach ungefähr 2 Wochen konnte unter dem

Mikroskop ein Herauswachsen der bhMSCs aus den Bone Chips beobachtet

werden, die Zellkulturflaschen wurden dann vorsichtig geschüttelt um die Zellen

von den Knochentrabekeln zu lösen, welche anschließend entfernt wurden.

Nach Zugabe von normalem Ca2+-haltigen SZM konnte nach ungefähr 4

Wochen eine Konfluenz von ca. 80% der adhärenten Zellen auf dem Plastik der

Zellkulturflaschen beobachtet werden, sodass die Zellen nach dem gleichen

Verfahren wie die mhMSCs abgeerntet werden konnten.


27

2.2.2. RNA- Isolation mit dem Kit „Nucleospin RNA II“

Zur Vorbereitung der RNA-Ernte aus den Zellkulturen wurde vorerst das

Medium aus den Zellkulturflaschen aspiriert. In die Flaschen wurde dann 350 µl

RA1 (Lysispuffer aus dem Kit „Nucleospin RNA II“) und 3,5 µl Mercaptoethanol

durch Pipettierung zugegeben und die Zellen vom Plastikgrund abgekratzt.

Diese Zellsuspension wurde in ein Reaktionsgefäß abpipettiert. Eine Zerstörung

der Zellen wurde im Anschluss durch mehrmaliges Aufziehen durch eine 20

Gauge Nadel und Durchmischung erreicht. Die anschließende Verarbeitung der

RNA wurde mit dem Kit „Nucleospin RNA II“ durchgeführt. Vorerst befreite

man die lysierte Zellsuspension von groben Verunreinigungen mittels

Zentrifugation durch ein Filter-Röhrchen. Es fand dann eine Zentrifugation über

eine Silicatmembran statt, nachdem 350 µl 70% Ethanol zugegeben worden

waren, wobei eine optimale Bindung der RNA an die Membran durch den

Lysispuffer erreicht wurde. DNA-Reste wurden noch durch zusätzliche

Inkubation mit DNAse beseitigt und durch wiederholte Waschung und

Zentrifugation mit den Pufferlösungen aus dem Kit (1x RA2, 2x RA3) wurden

Salze, höhermolekulare Zellbestandteile und andere Protein-Rückstände von

der Silicatmembran entfernt, um nur noch RNA-Rückstände an der

Silicatmembran zu erhalten. Diese Membran wurde in ein Nuklease-freies

Reaktionsgefäß gelegt und die aufgereinigte RNA unter Zugabe von 60 µl

RNAse-freiem H2O aus dem Kit zentrifugiert und somit herausgelöst.

Anschließend wurde 1 µl RNA-Gemisch mit 49 µl HPLC-H2O in einer UV-

lichtdurchlässigen Küvette verdünnt und der RNA-Gehalt im Eppendorf

Biophotometer 6131 bei 260 nm bestimmt und mit einer Negativ-Probe aus

reinem HPLC-H2O verglichen, wobei jede Probe auch einer Messung bei den

Wellenlängen 230 nm und 280 nm unterzogen wurde, um Verunreinigungen der

RNA auszuschließen. Kohlenhydrat- und Peptidverunreinigungen absorbieren

nämlich Licht bei einer Wellenlänge von 230 nm, höhermolekulare

Proteinverunreinigungen hingegen bei 280 nm. Die Quotienten E260/E230 bzw.

E260/E280 sind dabei ein Maß für die Reinheit und sollen für E260/E230 Werte


28

größer als 2 bzw. zwischen 1,8 und 2 für E260/E280 ergeben. Die aufgereinigte

und quantifizierte RNA wurde bis zur Weiterverarbeitung bei -80°C tiefgefroren.

2.2.3. cDNA-Synthese

Die tiefgefrorene RNA wurde aus der -80°C-Tiefkühltruhe herausgenommen

und auf Eis langsam aufgetaut. Anhand der zuvor gemessenen RNA-

Konzentration wurde eine RNA-Menge von 2 µg errechnet und mit HLPC-H2O

und 1 µl Oligo-dT (50 pmol) als Primer auf 18 µl Volumen aufgefüllt. Zum

Auflösen von Sekundärstrukturen der RNA und zur Anlagerung des Primers

wurde die Probe für 5 Minuten auf 70°C erhitzt und anschließend auf Eis zum

Arretieren gebracht. Diesem Gemisch wurden 7 µl eines Mastermixes (5 µl

Transkriptionspuffer, 0,625 µl dNTP (20mM), 1 µl Reverse Transkriptase, 0,375

µl HLPC-H2O) zugegeben und bei Raumtemperatur 5 Minuten inkubiert. Durch

60-minütige Inkubation bei 42°C wurde schließlich eine Elongation der cDNA-

Einzelstränge erreicht und die Reaktion wurde gestoppt durch Denaturierung

der Reversen Transkriptase bei 95°C für 10 Minuten. Dieses cDNA-Gemisch

wurde bis zur weiteren Verarbeitung bei -20°C eingelagert.

2.2.4. Array-Analyse

Bei der Array-Analyse wurde mittles Agarose-Gel-Elektrophorese die Reinheit

der RNA in einem Gemisch aus 2µg RNA mit 5µl RNA Ladepuffer (0,25%

Bromphenolblau (w/v); 0,25% Xylencyanol (w/v); 30% Glycerin (w/v); 1mM

EDTA) überprüft. Anschließend schickte man 10 µg der RNA zu Herrn Priv.-

Doz. Dr. Klein-Hitpass (Institut für Zellbiologie, Uniklinikum Essen), der durch

einen Affymetrix GeneChip HG-U 133 Plus 2.0 (High Wycombe,

Großbritannien) die Genexpression der mhMSCs und bhMSCs analysierte,

nach den Angaben im Affymetrix GeneChip Expression Analysis Handbuch

(www.affymetrix.com). Dafür wurden aus dem gesamten RNA-Material

biotinylierte cRNA hergestellt und diese auf einem GeneChip mit mehr als

54.000 Oligonukleotiden, sogenannten Probesets, hybridisiert. Mit dem


29

Genechip konnten dadurch insgesamt 47.400 Transkripte und 38.500 Gene

durch ihr Hybridisierungsverhalten untersucht werden

(http://www.affymetrix.com/support/technical/datasheets/human_datasheet.pdf).

Die Signale bei der Hybridisierung wurden dabei mit einem Affymetrix

GeneChip Scanner 3000 erfasst und durch Affymetrix GeneChip Operating

Software 1.2 und Data Mining Tool 3.1 analysiert. Als Maß für die

Genexpression entstanden dabei unterschiedliche Signalstärken eines Gens

bzw. Transkripts, die jeweils für mhMSCs und bhMSCs gegenübergestellt

wurden. Die Transkriptmenge innerhalb der beiden Zellproben wurde mittels

„significance analysis of microarrays (SAM)“ (http://www-

stat.stanford.edu/~tibs/SAM/) (Tusher, Tibshirani et al. 2001) bestimmt. Im

Verlauf fiel eine Kontamination der mhMSC-Zellkultur der Passage 0 mit

Plasmazellen auf, daher wurde ein weiterer Array mit Zellen aus der Passage 1

gerechnet, der keine Kontamination aufwies, aber unterschiedliche Ergebnisse

erbrachte (siehe Ergebnisse und Diskussion).

Die unterschiedlichen Expressionsmuster der mhMSC-Kultur vor und nach

Passagieren (P0 und P1) stellten wir graphisch in einer Heatmap dar. Dadurch

konnten wir größere Datenmengen anschaulich in einem Farbdiagramm

darstellen, in diesem Fall die Signalstärken einzelner Probesets aus dem

Microarray. Eine helle Rotfärbung zeigte eine starke Expression in der

Patientenprobe an, wohingegen eine helle Grünfärbung für sehr schwache

Expression stand. Die Daten der relevanten Probesets aus dem Array wurden

über die Internetplattform CARMAweb (Comprehensive R based Microarray

Analysis web service) eingelesen (Rainer, Sanchez-Cabo et al. 2006), woraus

sich die Abbildungen 7b und 7c ergaben.

2.2.5. RT-PCR

Oligonukleotide

Für einige Primer (Oligonukleotide) waren die Bedingungen für die Polymerase

Kettenreaktion (PCR) bekannt und wurden daher übernommen, bei anderen

Primern wurden die optimalen Bedingungen erst ausgetestet. Dabei wurden die


30

Primersequenz Produktgröße (bp)

Sequenz ID (NCBI)

Gen EF1-α1 (Eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1)

235 NM_001402

sense: anitsense:

5’-AGGTGATTATCCTGAACCATCC-3’ 5’-AAAGGTGGATAGTCTGAGAAGC-3’

IBSP (integrin-binding sialoprotein) 467 NM_004967 sense: antisense:

5’-GCCTGTGCTTTCTCAA-3’ 5’-ACTTCTGCTTCGCTTT-3’

ALP (Alkaline Phosphatase) 454 NM_000478 sense: anitsense:

5’-TGGAGCTTCAGAAGCTCAACACCA-3’ 5’-ATCTCGTTGTCTGAGTACCAGTCC -3’

OPN (Osteopontin, Secreted phosphoprotein 1) 483 NM_000582 sense: anitsense:

5’-ACGCCGACCAAGGAAAACTC-3’ 5’-GTCCATAAACCACACTATCAG-3’

Col1 (Kollagen1) 461 NM_000088 sense: anitsense:

5’-GGACACAATGGATTGCAAGG-3’ 5’-TAACCACTGCTCCACTCTGG-3’

OC (Osteocalcin, Bone Gla protein) 293 NM_000711 sense: anitsense:

5’-ATGAGAGCCCTCACACTCCTC-3’ 5’-GCCGTAGAAGCGCCGATAGGC-3’

Nid 1 (Nidogen 1) 427 NM_002508 sense: anitsense:

5’-CAACCCTCAGACAGACTTATACACCC-3’ 5’-GCTGCTCATTATCATCCACCAAAT-3’

Nid2 (Nidogen 2) 645 NM_007361 sense: anitsense:

5’-AGACGGTTCGTATCACTCAAA-3’ 5’-GCCGGTCATCTGCAAACTCA-3’

TPM1 (Tropomyosin 1) 257 NM_000366 sense: anitsense:

5’-GCCAATGATAGAGTCAACAGGAA-3’ 5’-GTGCCAATCAGAAAGGAATGGAAGT-3’

MLC1SA (MYL6B, Myosin Light Chain 6B) 147 NM_002475 sense: anitsense:

5’-AAGAACCGAGGCCAAGGCACATA-3’ 5’-GGTCTCCACCTCCTCCTCAGTCATCT-3’

MYOF (Myoferlin) 213 NM_013451 sense: anitsense:

5’-CTGTTCCTGCTTATCCTGCTGCTC-3’ 5’-GACATGGCGTAACCTGCTACTGG-3’

MyoD1 (Myogenic Differentiation 1) 765 NM_002478 sense: anitsense:

5’-CTGCACGTCGAGCAATCCAAACC-3’ 5’-CGAGAAGGGTGCTGCGTGGAAAA-3’

Myog (Myogenin, Myogenic Factor 4) 415 NM_002479 sense: anitsense:

5’-AGGGAGAAGCGCAGGCTCAAGAA-3’ 5’-AATCTCAGTTGGGCATGGTTTCAT-3’

Pax3 (Paired Box 3) 436 NM_013942 sense: anitsense:

5’-AGAGGAAGGAGGCAGAGGAAA-3’ 5’-GGAATAGATGTGGGCTGGTAA-3’

Pax7 (Paired Box 7) 188 NM_002584 sense: anitsense:

5’-CGTCTCCAAGATTCTTTGCCGCTA-3’ 5’-GGTCACAGTGCCCATCCTTCAGC-3’

CD24 230 NM_013230 sense: anitsense:

5’-AGGGCAATGATGAATGAGAAT -3’ 5’-CTGGGCGACAAAGTGAGA-3’

TRIB2 (tribbles homolog 2) 439 NM_021643 sense: anitsense:

5’-ACTTGTCGCATTGCGTTTCTTC-3’ 5’-GGCGTCTTCCAGGCTTTCC-3’

Abb. 1: Verwendete Gene mit Primersequenzen, Produktlänge und Sequenz-ID


31

Bedingungen, wenn möglich, so ausgewählt, dass die Primer verschiedene

Exons überspannten, um falsch positive Nachweise von Verunreinigungen aus

genomischer DNA in den RNA-Proben zu vermeiden. Alle Oligonukleotide

wurden von der Firma Biomers, Ulm bezogen. Gemäß Herstellerangaben

wurden die Oligonukleotide in HPLC-H2O gelöst und verdünnt. Die verwendeten

Gene und die für den Nachweis benutzten Primersequenzen sind in Abbildung

1 (Abb. 1) charakterisiert.

Reverse Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion (RT -PCR)

Um die cDNA-Menge verschiedener Gene in den beiden Proben mengenmäßig

sichtbar zu machen, wurden unter Verwendung spezifischer Primer bestimmte

Gene im Sinne von RNA-Äquivalenten in den kultivierten Stammzellen durch

Polymerase Kettenreaktion (PCR) vervielfältigt, wobei die Amplifikation mittels

hitzestabiler Taq-DNA-Polymerase durchgeführt wurde. Reverse Transkription

beschreibt dabei die Umwandlung der ursprünglichen RNA in komplementäre

DNA (cDNA). In der Abbildung 1 findet man eine Auflistung und Kennzeichnung

der verwendeten Primer, während die Abbildung 2 die jeweils unterschiedlichen

Bedingungen für die PCR darstellt, die in Versuchen ausgetestet wurden. Dabei

wurde für jede Versuchsanordnung ein Mastermix hergestellt: je 1 µl Primer

(sense + antisense, 25 pmol/µl), 5 µl 10xPuffer (blauer bzw. roter Puffer,

zusammen mit Taq-DNA-Polymerase geliefert), 1 µl dNTP (20 mM), 0,3 µl Taq

DNA Polymerase und je nach ausgetesteten Bedingungen für einige Primer

noch zusätzlich MgCl2. Der blaue Puffer sollte dabei eher ein spezifischeres

PCR-Produkt garantieren, der rote Puffer hingegen eine höhere

Produktausbeute. Allerdings wurde der rote Puffer aufgrund der vorherigen

Austestung im Nachhinein für keinen Ansatz verwendet. Dieser Mastermix

wurde dann durch HPLC-H2O so ergänzt, dass sich ein Volumen von 49 µl

ergab. Anschließend wurde noch 1 µl cDNA der jeweiligen Probe in das PCR-

Reaktionsgefäß beigemischt und eine Negativprobe ohne cDNA angefertigt um

ein Gesamtvolumen von je 50 µl in allen Proben zu erhalten. Diese wurden

dann im Thermcycler Primus nach unten aufgeführten Bedingungen

vervielfältigt.


32

Phasen der konventionellen RT- PCR:

94°C 4 min initiale Denaturierung der DNA-Doppelstränge

40x (wenn nicht anders angegeben)

94°C 30 sec Denaturierung

Annealing Temperatur 30 sec Anlagerung Primer

72°C 30 sec Elongation

72°C 10 min terminale Elongation

12°C Abkühlung

Dabei gab es Variationen sowohl der Annealing Temperatur als auch der

Anzahl der Zyklen (siehe Abb. 2).

Primer MgCl2 in µl Annealing Temperatur in °C

Anzahl der Zyklen Puffer

EF1α 0 54°C 40 blau ALP 0 51°C 40 blau IBSP 0 54°C 40 blau OPN 0 58°C 35 blau Col1 0 52°C 35 blau OC 0 60°C 35 blau Nid1 1 55°C 40 blau Nid2 1 55°C 35 blau TPM1 1 53°C 40 blau MLC1SA 1 57°C 32 blau MYOF 0 55°C 33 blau MyoD1 0 64°C 40 blau Myog 0 58°C 40 blau Pax3 0 56°C 40 blau Pax7 0 60°C 40 blau CD24 1 58°C 37 blau AHNAK 0 56°C 40 blau TRIB2 2 57°C 40 blau Abb. 2: PCR-Bedingungen der verwendeten Gene


33

2.2.6. Agarose-Gel-Elektrophorese

Zur optischen Darstellung der vervielfältigten cDNA wurde im Anschluss an jede

PCR eine Elektrophorese in Agarose-Gel durchgeführt. Zur Herstellung des 1%

Agarose-Gels wurde auf je 100 ml TRIS (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan)

Borat EDTA Puffer (TBE) 1 g Agarose in einem 200 ml Erlenmeyer-Kolben

gemischt und bei 400 W ca. 3 min in einem Mikrowellenherd erhitzt.

Anschließend wurde Ethidiumbromid zugegeben, wobei sich eine Konzentration

von 10 µg/ml im Gel ergab. Ethidiumbromid vermag mit doppelsträngiger DNA

zu interkalieren und leuchtet anschließend unter UV-Bestrahlung. Dieses

flüssige Gel wurde dann auf einen Gelträger gegossen, in dem ein eingesetzter

Kamm während der Aushärtung des Gels Taschen zum späteren Einbringen

der amplifizierten DNA-Proben schaffte. Nach ca. 1 Stunde war das Gel bei

Raumtemperatur abgekühlt und ausgehärtet. Im Anschluss wurden je 10 µl der

PCR-Proben inklusive der Negativprobe nacheinander auf das Gel geladen,

wobei in die letzte Tasche ein 100 bp Marker zur anschließenden

Größenzuordnung der PCR-Banden eingebracht wurde. Bei manchen

Versuchen wurden auch zusätzlich PCR-Produkte aus hMSC-TERT analysiert

(Weber, Pohl et al. 2007): Mesenchymale Stammzellen, die mit Telomerase

Reverser Transkriptase immortalisiert wurden. Dann wurde in einem TBE-Bad

eine Spannung von ca. 90 V für ungefähr 40 - 60 min angelegt, wobei die

negativ geladene DNA entlang des elektrischen Feldes im Bad zum Plus-Pol

wanderte. Schließlich wurden die Gele unter UV-Bestrahlung auf einem

Leuchttisch in einer Dunkelkammer mit Foto-Dokumentation abgelichtet und

digital gespeichert.

2.2.7. Immuncytochemie

Eine unterschiedliche Expression des Oberflächenproteins CD24 in den

jeweiligen Zellkulturen sollte auch mittels Immuncytochemie veranschaulicht

werden. Dafür wurden je 5000 mhMSCs und bhMSCs aus Passage 1 auf

Objektträgern in Chamber-Slides (8 Well) ausgesät und 24 Stunden bei 37°C in


34

feuchter Atmosphäre von 95% Luft mit 5% CO2 inkubiert. Diese Zellen mussten

dann fixiert werden, indem das SZM entfernt wurde, die Zellen mit PBS

gewaschen und mit Ethanol und Aceton benetzt wurden, um abschließend noch

einmal mit PBS gewaschen zu werden. Somit konnten die Zellen in den

Zellkammern fixiert und bei -20°C bis zur Verwendung aufbewahrt werden. Für

die Färbungen wurden jeweils Verdünnungen des Antikörpers bzw. des Maus-

Serums von 1:10, 1:50, 1:100 oder 1:200 miteinander verglichen und das

jeweils deutlichste Ergebnis verwendet.

Immuncytochemische Färbungen für CD24

Die in den Chamber-Slides auf Objektträgern fixierten Zellen wurden 20 min bei

Raumtemperatur aufgetaut und anschließend auf den Slides mit einem Fettstift

großzügig eingekreist. Für den im Versuch verwendeten Waschpuffer (1xTBS)

wurde die vorhandene 10xTBS-Stammlösung (10xTBS (0,5 M), pH 7,6: 60,6 g

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan, 87,66 g NaCl, in 1000 ml destilliertem

Wasser lösen, pH einstellen auf 7,6, autoklavieren) im Verhältnis 1:10 mit

destilliertem Wasser verdünnt. Initial wurden die Zellen kurz mit Waschpuffer

(1xTBS) gespült und 15 min lang mit 1xTBS rehydriert. Nach Abpipettieren des

Puffers wurde zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen mit ca. 150 µl

Blockierungslösung (aus BSA und Pferdeserum: 1 g BSA (Bovines

Serumalbumin), 2,5 ml Pferdeserum, 47,5 ml 1xTBS) für 20 min bei

Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit ca. 150 µl des

primären Antikörpers (CD24) in seiner jeweiligen Verdünnung (1:10, 1:50,

1:100, 1:200) über Nacht in einer feuchten Kammer bei 4°C inkubiert. Für die

Negativkontrolle wurde über Nacht unter gleichen Bedingungen mit Maus-

Serum inkubiert, das in einer Konzentration von 330 µg/ml vorrätig war und auf

die gleiche Konzentration wie die des Primärantikörpers eingestellt wurde.

Die Immuncytochemie wurde am folgenden Tag durchgeführt. Dafür wurde das

BioGenex Super SensitiveTM ICH Detection System verwendet, das aus Link,

Label, Substrat-Chromogen und Substrat-Puffer bestand: Link (MultiLink®

(Mouse, Rabbit: Konzentrierte biotinylierte Anti-Immunglobuline in PBS mit

Carrierprotein und 0,09% Natriumazid, 1:100 Verdünnung mit Link Diluent),


35

Label (Alkaline Phosphatase Label: Konzentriertes, mit alkalischer Phosphatase

konjugiertes Streptavidin in PBS mit Carrierprotein und 0,09% Natriumazid,

1:100 Verdünnung mit Label Diluent), Substrat-Chromogen (Fast Red

Chromogen) und Substrat-Puffer (Naphtolphosphat). Die Zellen wurden

anfangs 3 Mal mit Waschpuffer gewaschen und dann mit 1 - 3 Tropfen Link pro

Objektträger überschichtet und 20 min in einer feuchten Kammer bei

Raumtemperatur inkubiert. In der Zwischenzeit wurde das Fast Red

Chromogen mit dem Substrat-Puffer angesetzt und 3 Tropfen Levamisol

zugegeben, um die endogene Alkalische Phosphatase zu blockieren. Die Zellen

wurden 3 Mal mit Waschpuffer gewaschen und im Anschluss daran mit 1 - 3

Tropfen Label für weitere 20 min bei Raumtemperatur in einer feuchten

Kammer inkubiert. Nach 3 erneuten Waschgängen mit Waschpuffer wurden die

Objektträger 3 - 5 min mit dem Fast Red Chromogen gefärbt. Dieser wurde in 3

Waschgängen mit destilliertem Wasser wieder entfernt, die Zellen ca. 1 min in

destilliertem Wasser belassen und anschließend mit Hämalaun (6 g

Hämatoxylin, 1 g Natriumiodid, 250 g Aluminiumkaliumsulfat, 250 g Chlorhydrat,

5 g Zitronensäure, 5 l destilliertes Wasser) 25 sec gegengefärbt. Nach erneuter

dreimaliger Waschung in destilliertem Wasser wurden die Objektträger kurz

unter Leitungswasser gebläut und mit wässrigem Eindeckmittel (Aquatex)

benetzt.

Im Anschluss wurden die eingedeckten Objektträger unter dem Mikroskop

analysiert und digital photographiert.

Ergebnisse

36

3. Ergebnisse

3.1. Array-Analysen

Für die Array-Analysen wurde die RNA aus der Zellkultur der Passage 0 isoliert.

Da nachträglich in der Analyse der RNA der mhMSCs der Passage 0 eine

Kontamination mit Plasmazellen auffiel, wurde nach Zellsplitting ein erneuter

zweiter Array mit RNA von Zellen der Passage 1 ausgewertet (Array Passage 0

mit RNA von 6 Spendern bzw. Passage 1 mit RNA von 4 mhMSC-Spendern).

Dabei ist zu erwähnen, dass für den Array der Passage 0 mhMSCs und

bhMSCs jeweils von den gleichen Spendern stammten, was sich für den

Passage 1-Array nicht mehr verwirklichen ließ.

Der Array wurde von Herrn PD Dr. Klein-Hitpass (Institut für Zellbiologie,

Universitätsklinikum Essen) angefertigt. Dafür wurden je 10 µg RNA aus den

Kulturen der mhMSCs und der bhMSCs jedes Patienten gewonnen und für den

Array nach Essen verschickt, wo die Genexpression beider Zellsorten durch

einen Affymetrix GeneChip HG-U 133 Plus 2.0 (High Wycombe,

Großbritannien) gemäß der Verfahrensanweisungen des Herstellers analysiert

wurde.

Die Ergebnisse des Microarrays wurden im Anschluss in einer SAM

(Significance Analysis of Microarrays) miteinander verrechnet, sodass mittlere

Werte für die Expressionsunterschiede entstanden, so genannte Fold Changes,

anhand derer bestimmte Gene genauer untersucht wurden (ein Fold Change

von 2 entspricht dabei beispielsweise einem 2-fachen Expressionsunterschied

zwischen mhMSCs und bhMSCs).

Array-Analysen (RNA Passage 0)

Im Array der Passage 0 zeigte sich eine differentielle Expression von 587

Probesets. Neben einem Signifikanzlevel unter 0,1 (q-value < 0,1) wurde

mindestens ein 2-facher Expressionsunterschied (Fold Change) gefordert,

wobei 394 Probesets in den mhMSCs stärker exprimiert waren (Fold Change >

2) und 193 eine erhöhte Expression in den bhMSCs aufwiesen (Fold Change <

Ergebnisse

37

Abb. 3: Passage 0 – allgemeine Expressionsunterschiede im Microarray

Ergebnisse

38

0,5). Einige Gene wurden anschließend bestimmten mesenchymalen Geweben

zugeteilt, wobei Markergene bzw. für die Differenzierung oder den Stoffwechsel

des jeweiligen Gewebes bedeutende Gene ausgewählt und graphisch

dargestellt wurden. Manche Probesets erfüllten zwar nur teilweise die

geforderten Kriterien, erschienen jedoch trotzdem interessant für weitere

Analysen zu sein. Anschließend wurde versucht diese Ergebnisse durch PCR

zu bestätigen, wobei cDNA aus derselben RNA Verwendung fand, die für den

Microarray eingeschickt wurde. In den graphischen Darstellungen wird

vereinfacht bei mhMSCs von MSCs und bei bhMSCs von BCs die Rede sein,

wobei die Nummer einem bestimmten Patientenindividuum entspricht.

Auffallend waren extreme Expressionsunterschiede für leichte und schwere

Immunglobulinketten, die ausschließlich von Plasmazellen synthetisiert werden.

Das Diagramm der Abbildung 3 zeigt dafür exemplarisch die 10 am stärksten

exprimierten Probesets des Microarrays der RNA aus Passage 0 sowie einige

myogene sowie osteogene Marker und zuletzt 3 Probesets, die auch im Array

der Passage 1 differentiell exprimiert waren. Der Fold Change, also das Maß für

den Expressionsunterschied zwischen mhMSCs und bhMSCs, ist dabei jeweils

farblich grün und rot gekennzeichnet, ein Fold Change von 2,0 im Array

beschreibt eine doppelt so hohe Expression eines Genes in den mhMSCs, ein

Fold Change von 0,5 eine doppelt so hohe Expression in den bhMSCs. Um

eine bessere Übersichtlichkeit zu gewährleisten und die Ergebnisse auf einen

Blick vergleichen zu können, wurden Fold Changes < 1 (stärkere Expression

durch bhMSCs) in den Kehrwert überführt; 0,5 entsprach also einem Fold

Change von 2. Je heller dabei der dargestellte Farbton, desto höher der

Expressionsunterschied. In der Abbildung wurde der im SAM errechnete

Mittelwert aller 6 Patientenproben (271, 281, 289, 290, 298, 299) verwendet,

um einen ungefähren Trend im Array dann in weiteren Versuchen bestätigen zu

können. Bei der genaueren Auswertung der einzelnen Patientenproben fielen

bei manchen Genen individuelle Unterschiede auf.

Ergebnisse

39

3.2. Bestätigung der Ergebnisse durch RT-PCR (Passa ge 0)

Nach Analyse der Ergebnisse des Arrays wurden einige Gene mittels RT-PCR

noch genauer untersucht, um dadurch die Ergebnisse des Arrays zu bestätigen.

Die Ergebnisse mit RNA aus Stammzellen der Passage 0 sind in der Abb. 4

gegenübergestellt, wobei jeweils für den Array als auch für die RT-PCR – wenn

nicht extra gekennzeichnet – die RNA derselben Spender (271, 281, 289, 290,

298, 299) benutzt wurde. Farblich mit grün oder rot hervorgehoben ist dabei

eine jeweils höhere Expression eines Gens innerhalb einer Stammzellgruppe

bei einem Patienten, und zwar dann, wenn das Ergebnis durch den Fold

Change im Array bestätigt wurde; waren alle mhMSCs (grün) bzw. bhMSCs

(rot) einer PCR beispielsweise in der jeweiligen Farbe umrandet, sprach dies für

eine vollständige Bestätigung der Erwartungen aus der vorherigen Analyse des

Arrays.

Zudem ist das PCR-Ergebnis von EF1α (Eukaryotischer Translations- und

Elongationsfaktor 1α) mit aufgeführt, das als so genanntes Housekeeping-Gen

in allen Körperzellen vorkommt und als Kontrolle für eine erfolgreiche cDNA-

Synthese dient. Es wurden hauptsächlich sogenannte Markergene der

Osteogenese und Myogenese ausgewählt, die für die Differenzierung in das

jeweilige Gewebe von Bedeutung sind bzw. für den Stoffwechsel oder die

Funktion differenzierter Zellen eine wichtige Rolle spielen. Außerdem wurden

solche Probesets ausgewählt, die anhand der Array-Analyse reguliert

erschienen, also entweder in den mhMSCs oder den bhMSCs mehrerer

Patientenproben eine höhere Expression zeigten. Es wiesen jedoch nicht alle

untersuchten Probesets im vorherigen Array einen mindestens zweifachen Fold

Change der Expression auf, wurden aber als wichtige Markergene der

Osteogenese bzw. Myogenese trotzdem untersucht. Vier weitere wichtige

Markergene der Myogenese (Pax3, Pax7, MyoD1, Myog), die im Array keine

Expression aufwiesen, konnten auch in der RT-PCR nicht nachgewiesen

werden, was sich auch für Array und PCR der Passage 1 bestätigte. Im

Allgemeinen wurden mindestens 4-6 PCRs für ein Gen durchgeführt, um

größere Aussagekraft der Ergebnisse zu gewährleisten.

Ergebnisse

40

Abb. 4: Ergebnisse aus der RT-PCR der RNA aus Passage 0 Zellen

Ergebnisse

41

3.3. Übereinstimmung von Array und PCR (Passage 0)

Aufgrund intensiver Analyse des Microarrays wurde versucht bestimmte Gene

mittels RT-PCR in den Zellproben nachzuweisen. Dabei ergaben sich im Mittel

relativ gute Übereinstimmungen der jeweiligen Ergebnisse. Bei größeren

Expressionsunterschieden (Fold Change > 1,5) zeigten sich hierbei relativ

kongruente Ergebnisse. Allerdings konnte auch die beschränkte Aussagekraft

des Arrays festgestellt werden. Wenn schon dort nur geringe Unterschiede

(Fold Change < 1,5) bescheinigt wurden, waren auch die Ergebnisse der PCR

oft sehr variabel von einem zum nächsten Individuum und somit nicht

aussagekräftig. Außerdem konnten individuell sehr hohe Signale in einzelnen

Patientenproben gefunden werden (z.B. IBSP-Signal in BC 271), die bei

geringer Probenzahl – zum Beispiel bei nur 6 Patientenproben – den mittleren

Fold Change als Maß für den Expressionsunterschied auf Kosten der

Repräsentativität deutlich beeinflussten.

Gene Fold Change Microarray RT-PCR

ALP (1557924_s_at) 7,0 ↑ ↑ ↑ ↑ ↔ ↑ ↓ ↑ ↑ ↓ ↑ ↑

Col1 (202311_s_at) 1,0 ↓ (↓) ↑ ↓ ↑ (↑) ↔↔↔↔↔↔

OC (206956_at) 1,47 ↓ (↓) ↓ ↓ ↑ ↑ ↓ ↔ ↓ ↓ ↓ ↓

OPN (209875_s_at) 1,12 ↓ (↑) ↑ ↓ ↓ ↑ ↓ ↑ ↑ ↓ ↑ ↑

IBSP (236028_at) 1,88 ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ↑ ↑ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓

Nid1 (202007_at) 1,29 ↓ ↑ ↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↓ ↔↔ ↑

Nid2 (204114_at) 2,01 (↑) ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑

MLC1SA (204173_at) 1,35 ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↔ ↑ ↑ ↓ ↑

MYOF (211864_s_at) 1,20 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ↔↔↔ ↓ ↓

TPM1 (206117_at) 1,17 ↑ ↑ ↑ (↓) ↓ ↑ ↑ ↔↔↔ ↓ ↔

CD24 (216379_x_at) 2,77 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ↔

TRIB2 (202479_s_at) 1,58 ↓ ↔ ↓ ↓ (↑) ↓ ↓ * ↓ ↓ ↓ ↓

Abb. 5: Vergleich der Ergebnisse aus Microarray und RT-PCR der Patienten-RNA

Reihenfolge: 271, 281, 289, 290, 298, 299. ↑ Höhere Expression in MSC, ↓ höhere Expression in BC, (↑/↓) minimale Unterschiede, ↔ Keine sichtbaren Unterschiede in der PCR, Fold Change grün (MSC Expression erhöht), rot (BC Expression erhöht), * Probe 281 fehlt

Ergebnisse

42

Die Ergebnisse sind in der Abb. 5 gegenübergestellt, wobei stets der mittlere

Fold Change, die Individualergebnisse des Microarrays sowie die PCR-

Resultate miteinander verglichen wurden. Gute Übereinstimmung fand sich

dabei unter anderem für die Gene Nid2, CD24 und TRIB2. Auch die Ergebnisse

für die osteogenen Marker ALP, Col1, OC, OPN, IBSP und für Nid1 und

MLC1SA zeigten relativ gute Kongruenz. Deutliche Unterschiede im Array

bestätigten sich also in der Regel auch in der PCR. Im Umkehrschluss wurden

bei geringfügigen Abweichungen im Expressionsmuster und in der

Signalintensität zwischen mhMSCs und bhMSCs im Array sehr variable und

uneinheitliche Ergebnisse in der PCR hervorgebracht.

Abb. 6: Gegenüberstellung der Ergebnisse aus Array und PCR von P0 und P1

Ergebnisse

43

3.4. Vergleich der Arrays aus Passage 0 und Passage 1

Nach einem erneuten Microarray mit Zellen der Passage 1 relativierten sich die

Expressionsunterschiede für sehr viele Gene. Drei viel versprechende

Ausnahmen (CD24, AHNAK, TRIB2) zeigten jedoch auch in diesem Array

deutliche Unterschiede auf und es wurden daher gesondert erneute RT-PCRs

mit RNA der Passage 1 für diese drei Gene durchgeführt und die Ergebnisse

anschließend mit denen aus Passage 0 verglichen (siehe Abb. 6). AHNAK

konnte dabei mit RT-PCR weder in der RNA der Passage 0 noch in der RNA

der Passage 1 nachgewiesen werden. Zumindest die Ergebnisse für CD24 und

TRIBR2 ließen sich jedoch bestätigen. Es sei anmerkend erwähnt, dass für den

erneuten Array der Passage 1, wie auch in der Abbildung gekennzeichnet,

mhMSCs von anderen Spendern als im vorherigen Array ausgewählt wurden

(276, 247, 295, 296).

Um eine komplette Übersicht zu ermöglichen, möchte ich in einer Tabelle (Abb.

7a) noch die SAM-Ergebnisse aus den beiden Arrays (Passage 0 und 1)

anhand der errechneten Fold Changes gegenüberstellen. Dabei zeigten sich für

manche Probesets relativ gute Übereinstimmungen, durch die Kontaminierung

wurden jedoch auch zahlreiche Ergebnisse entscheidend beeinflusst und somit

verfälscht.

Dies wird auch deutlich, wenn man sich die Heatmaps (Abb. 7b, c)

veranschaulicht, in denen die unterschiedlichen Signalintensitäten bzw.

Expressionsmuster aus den mhMSC-Arrays für Passage 0 und 1 graphisch

gegenübergestellt wurden. Hierbei wurde nur die ursprüngliche mhMSC-Kultur

(P0) mit der mhMSC-Kultur nach Passagieren und Beseitigung der

Kontamination (P1) verglichen. Abb. 7b stellt dabei alle Probesets mit einem

mindestens 2-fachen Expressionsunterschied bei einem q-value kleiner als 0,1

dar. In der folgenden Abb. (7c) wurde das Signifikanzniveau weniger streng

gesetzt (q-value < 0,2) und es konnten somit mehr Probesets verglichen

werden. Eine besonders helle Rotfärbung drückt eine gesteigerte Expression

der Probesets durch die mhMSCs aus, wohingegen eine hellere Grünfärbung

eine niedrigere Expression durch die mhMSCs darstellt. Bei Schwarzfärbung

Ergebnisse

44

bestanden keine Expressionsunterschiede. Zu beiden Abbildungen ist

zusätzlich eine Tabelle erstellt (siehe Abbildungsverzeichnis), in der die

Probesets noch einmal lesbar in der Reihenfolge wie in der Graphik aufgeführt

werden. Die ersten fünf Spalten (MSC P0) zeigen dabei kongruent völlig andere

Ergebnisse als die letzten fünf Spalten (MSC P1), wodurch sich nochmals sehr

übersichtlich darstellen ließ, welchen Einfluss die Kontamination durch

Plasmazellen auf das Expressionsmuster hatte. Außerdem zeigten sich

individuelle Unterschiede zwischen den einzelnen Patientenproben. Beispielhaft

lässt sich dies durch die Probesets in den Zeilen 2-6 (alle Probesets spezifisch

für Plasmazellen) in beiden Abbildungen veranschaulichen, wo an Position 10

(5. Patientenprobe aus dem P1-Array) im Vergleich zu den anderen Individuen

beinahe keine Expressionsunterschiede gefunden werden konnten.

Abb. 7a: Gegenüberstellung der Expressionsunterschiede der Arrays aus Passage 0 und 1

Ergebnisse

45

Abb. 7b: Heatmap 1

Gegenüberstellung des Expressionsmusters der mhMSC-Kulturen aus Passage 0 (Spalten 1-5) und Passage 1 (Spalten 6-10), p-value < 0,1

Ergebnisse

46

Abb. 7c: Heatmap 2

Gegenüberstellung des Expressionsmusters der

mhMSC-Kulturen aus Passage 0 (Spalten 1-5)

und Passage 1 (Spalten 6-10), p-value < 0,2

Ergebnisse

47

3.5. Immuncytochemie mit CD24

Die Immuncytochemie mit CD24 diente als zusätzliche, sehr anschauliche

Bestätigung der Ergebnisse des Microarrays. Auch dabei konnte eine sichtbar

erhöhte Expression in den bhMSCs festgestellt werden (Abb. 8). Die Zellen aus

der Passage 1 wurden – wie vorher beschrieben – in Chamber Slides ausgesät

und nach der anschließenden AK-Färbung digital fotografiert. Die Fotografien

zeigten dabei das für MSCs typische spindelförmige Wachstum. Sowohl

Cytoplasma als auch Zellkern wurden durch die Gegenfärbung mit Hämalaun

blau gefärbt. In den Negativproben, die mit Maus-Serum ohne CD24-AK

inkubiert wurden, ließ sich keine durch den Antikörper vermittelte Rotfärbung

erkennen. Eine sehr leichte Rotfärbung zeigte sich in den mhMSCs. Die

deutliche rote Färbung in den bhMSCs war – wie zu erwarten – gleichmäßig

verteilt, da CD24 ein Oberflächenmolekül der Zellmembran ist.

Abb. 8: Ergebnisse der Immuncytochemie

Diskussion

48

4. Diskussion

4.1. Versuchsauswertungen

Bei der Auswertung der gefunden Ergebnisse komme ich zu folgenden

grundsätzlichen Überlegungen. Aufgrund der Kontamination der mhMSC-Kultur

in Passage 0 kann für einige der vorgestellten Ergebnisse keine weitere

Verwendung gefunden werden. Trotzdem ergeben sich sinnvolle

Schlussfolgerungen, was den Stellenwert des Microarrays und die nachträglich

ausgeführten Versuche mit den Stammzellen aus Passage 1 betrifft.

4.1.1. Experimentelle Bestätigung des Microarrays

Microarrays ermöglichen heutzutage mit kleinem experimentellen Aufwand eine

sehr große Anzahl von Nukleinsäuren oder Proteinen aus einer geringen

Menge biologischen Materials zu analysieren. Der Affymetrix GeneChip HG-U

133 Plus 2.0 der Firma High Wycombe überprüfte 47.400 Transkripte und

38.500 Gene in dem eingeschickten Probenmaterial aus MSC-RNA. Diese

Ergebnisse sollten einen ersten Eindruck über die Transkriptionsrate innerhalb

der Zellkulturen vermitteln und Trends aufzeigen, die durch weitere

molekularbiologische Methoden dann zu bestätigen waren. Der RNA-Gehalt ist

dabei ein indirektes Maß dafür, welche Proteine ein Zelltyp verstärkt

synthetisiert, woraus man auf biologische Eigenschaften der Zelle schließen

kann. Das gängigste Verfahren zur Bestätigung von RNA-Microarrays ist die

RT-PCR, die auch in dieser Arbeit als Standardverfahren angewendet wurde.

Wie bereits erläutert, konnte gezeigt werden, dass der Microarray gut geeignet

ist eine Vorauswahl für zukünftige Nachweisverfahren zu liefern, die mit

gewissen Einschränkungen das Ergebnis des Arrays bestätigen konnten. Die

Aussagekraft war bei deutlichen Unterschieden (Fold Change > 1,5) besonders

groß und lieferte übereinstimmende Ergebnisse zwischen Array und PCR

(siehe 3.3.). Dies zeigte sich unter anderem bei den Ergebnissen für ALP, Nid2,

CD24 und TRIB2 besonders eindrücklich. Bei einer geringeren Probenzahl

Diskussion

49

schlugen sich extreme Abweichungen bei einem Individuum (IBSP-Signal in

BC271: 40.590, mittlere Signalstärke der BCs: 12.756, Median: 7154)

entsprechend im durchschnittlichen Fold Change (Fold Change 1,88 für BCs)

wieder und ließen somit nur begrenzt allgemeingültige Aussagen für die

gesamte Zellpopulation zu, wobei die Einzelproben kongruent zwischen PCR

und Array waren. In diesen Fällen wurde der Array zwar bestätigt, doch der

hohe Wert für ein Individuum ergab einen relativ zu hohen durchschnittlichen

Fold Change und täuschte somit eine übermäßige Expression in allen bhMSCs

vor. In jedem Fall sollten also nicht nur der Fold Change, sondern auch die

Einzelergebnisse überprüft werden. Immer dann, wenn der Array nur minimale

Unterschiede in der Expression zwischen mhMSCs und bhMSCs auftat, zeigte

sich eine schlechte Kongruenz in der PCR. Aus den Ergebnissen des erneuten

Microarrays aus RNA von Passage 1 Zellen ergaben sich schließlich nur noch

signifikante Unterschiede für CD24, AHNAK und TRIB2. Auch hier konnte die

PCR erneut das Ergebnis des Arrays untermauern, wobei AHNAK durch die

PCR nicht nachweisbar war. Werden die Resultate des Microarrays also unter

den richtigen Voraussetzungen und im Wissen um seine Einschränkungen

interpretiert, ist dieser bestens als Screening-Methode für eine große Anzahl

verschiedener Transkripte geeignet.

4.1.2. Kontamination der Zellkultur Passage 0

Die anfänglichen Auswertungen der SAM aus den Ergebnissen des Arrays aus

den Passage 0 Zellkulturen ergaben immense und auch signifikante

Unterschiede bei der Expression zahlreicher Gene, vor allem auch bei vielen

typischen Markergenen der Osteogenese, Chondrogenese und Myogenese.

Diese Erkenntnisse gaben Anlass zu großen Hoffnungen auf Unterschiede im

Expressionsmuster und in den Differenzierungseigenschaften beider

Stammzellpopulationen. Umso mehr weckte die bhMSC-Kultur unser Interesse,

als sich die Ergebnisse der SAM in der RT-PCR größtenteils bestätigen ließen.

Erst nach intensiveren Nachforschungen in der SAM fielen Ungereimtheiten

auf, nämlich eine überdurchschnittliche und nicht erklärbare Expression von

Diskussion

50

Immunglobulinketten (siehe Abb. 3, Abb. 7b/7c). Tatsächlich waren die 10 am

stärksten exprimierten Probesets in der mhMSC-Kultur solche, die nur in

differenzierten B-Lymphozyten bzw. Plasmazellen exprimiert werden. Die einzig

logische Schlussfolgerung war eine Kontamination mit Plasmazellen während

der Zellkultur. Alle bisherigen Ergebnisse waren somit nicht mehr verwertbar.

Dieser Verdacht wurde noch weiter durch nachfolgende FACS-Analysen

erhärtet, in denen eine Kontamination der mhMSC-Kultur (Passage 0) mit

CD56+ NK-Zellen sowie CD138+ Plasmazellen nachgewiesen wurde (siehe

Abb. 9).

mhMSCs Passage 0 Passage 1

NK-Zellen

CD56+

10-50% 0,9%

Plasmazellen

CD138+

1,2% 0,5%

Leukozyten

CD45+

1,4%

Abb. 9: FACS-Analyse der mhMSC-Kulturen

(freundlicherweise von Jörg Arnholdt zur Verfügung gestellt)

Um dennoch die Populationen vergleichen zu können und aussagekräftige

Ergebnisse zu erlangen wurde ein weiterer Microarray einer mhMSC-Kultur aus

der Passage 1 der Zellkultur in einer SAM analysiert, ausgewertet und mit der

nicht kontaminierten bhMSC-Population verrechnet. Hierbei offenbarte sich ein

nahezu identisches Expressionsmuster im Vergleich der beiden Zellkulturen,

sodass festgestellt werden musste, dass die beiden beschriebenen Methoden

zur Gewinnung und Kultur der MSCs aus Bone Chips und Knochenmark eine

biologisch sehr ähnliche Zellpopulation hervorbringen. Das Ausmaß der

Expressionsunterschiede zwischen P0 und P1 Zellen der mhMSC-Kultur stellte

sich in den zusätzlichen Heatmaps sehr eindrücklich dar (siehe Abb. 7b/c).

Zumindest TRIB2 und CD24 wurden einer näheren Betrachtung unterzogen;

Diskussion

51

welche Schlüsse aus den Ergebnissen gezogen werden sollten, bleibt noch zu

klären.

Es gilt also in Zukunft SAM-Analysen genauestens zu überprüfen, bevor weitere

Versuchsreihen gestartet werden und immer dann kritische Überlegungen

anzustellen, wenn extreme Werte auffallen, die vorerst nicht erklärt werden

können.

4.1.3. Auswertung und Bedeutung der analysierten Ge ne

In den folgenden Abschnitten werden die Einzelergebnisse der analysierten

Gene noch einmal vorgestellt und ihre Bedeutung in den Kontext aktueller

Forschungen gestellt.

4.1.3.1. Osteogene Markergene

ALP (Alkalische Phosphatase)

Die ALP ist ein ubiquitäres Enzym, das im Knochenstoffwechsel eine zentrale

Rolle einnimmt. Es kommt dort in Matrixvesikeln vor und nimmt durch Hydrolyse

von Pyrophosphat eine essentielle Rolle in der Mineralisierung der

extrazellulären Knochenmatrix mit Hydroxylapatit, einer Calcium-

Phosphatverbindung, ein. Sie wirkt dabei im ausgeglichenen Wechselspiel mit

dem Natrium-Phosphat-Cotransporter und der Nucleotid Pyrophosphat

Phosphodiesterase 1. Erhöhte Serumwerte finden sich daher unter anderem bei

zahlreichen Krankheiten, die mit einem pathologischen Knochenstoffwechsel

einhergehen wie Osteomalazie, Morbus Paget oder Rachitis. Ein genetischer

Defekt der ALP führt zum Maximalbild der Hypophosphatasie, die durch stark

erniedrigte Serumwerte von ALP auffällt und erhebliche

Mineralisierungsstörungen der Knochenmatrix bedingt (Orimo 2010). Daher

wird die ALP seit Jahren als einer der wichtigsten osteogenen Marker in der

MSC-Forschung verwendet. In diesem Zusammenhang wird eine Expression

des Enzyms in MSCs als ein Zeichen für osteogenes Differenzierungspotenzial

verstanden (Pittenger, Mackay et al. 1999).

Diskussion

52

Die Ergebnisse des Microarrays deuteten eine gesteigerte Expression der ALP

durch die mhMSCs an, der jedoch beim Array der Passage 1 (P1) nicht mehr

signifikant war (Fold Change 1,68). Relativ kongruente Übereinstimmung

zwischen RT-PCR und Microarray mit Zellen der Passage 0 (P0) konnte jedoch

nachgewiesen werden.

Col1 (Kollagen 1)

Col1 ist ein Protein der extrazellulären Matrix vieler Binde- und Stützgewebe,

wo es durch seinen dreidimensionalen Aufbau in Fibrillen eine tragende Rolle

für die Mikroarchitektur und Stabilisierung des Gewebes gewährleistet. Auch

der Knochen ist reich an Kollagenfibrillen des Typs 1, und darüber hinaus sind

zahlreiche Signaltransduktionswege über Integrine beschrieben worden, zum

Beispiel über Integrin α2β1. Col1 steht also neben seiner Gewebe stützenden

Funktion in Interaktion mit anderen Gewebszellen und mit Molekülen der

Extrazellularmatrix. Somit wird der Erhalt einer stabilen Knochenmatrix

ermöglicht, doch auch für die Osteogenese ist eine physiologische Synthese

von Kollagenfibrillen essentiell. Erhöhte Expression von Col1 lässt sich in der

Ossifikationsphase der enchondralen Ossifikation nachweisen. Genetische

Mutationen des Col1 führen zu einer letalen Form der Osteogenesis imperfecta.

Vor diesem Hintergrund wird auch der Kontakt von MSCs mit extrazellulären

Matrixproteinen wie Col1, aber auch Fibronectin, Collagen 4, Vitronectin und

Laminin 1 als Schlüsselereignis einer osteogenen Differenzierung von MSCs

angesehen. Daher gilt es zu Recht als einer der wichtigsten osteogenen Marker

(Salasznyk, Williams et al. 2004).

Differentielle Expression von Col1 konnte weder bei P0-Zellen im Microarray

(Fold Change 1,0) noch in der RT-PCR gefunden werden, was sich auch im

Array der Passage 1 (Fold Change 1,1) bestätigte. Dabei zeigte sich stets eine

gleichmäßige Expression bei den Individuen der Zellpopulationen.

OC (Osteocalcin, BGLAP)

OC ist ein weiteres extrazelluläres Matrixprotein, das im Organismus von

Osteoblasten synthetisiert wird und erstmals bereits vor über 30 Jahren

Diskussion

53

beschrieben wurde. Aus seiner biochemischen Struktur, in der dreimal die

Aminosäure Glutamat mit einer Gamma-Carboxylgruppe vorkommt, rührt der

alternative Name Bone gamma-carboxyglutamate protein (Bone Gla protein,

BGLAP). Ähnlich wie bei Gerinnungsfaktoren, die Gamma-Carboxylgruppen

nachweisen, besitzt OC hohe Affinität zu den Calcium-Verbindungen der

Knochenmatrix und es wurde daher stets eine wichtige Bedeutung für

Mineralisierungsprozesse des Knochens unterstellt. Die genaue Funktion für

den Knochenstoffwechsel ist jedoch ungewiss, da sowohl aus dem Knock-out-

Mausmodell für OC als auch aus einer Überexpression keine pathologische

Knochenmineralisierung resultiert (Murshed, Schinke et al. 2004; Baldock

2011).

Aktuelle Untersuchungen legen nahe, dass OC den Energie- und

Glucosestoffwechsel beeinflusst bzw. dass der Knochen gar als endokrines

Organ durch Ausschüttung von OC aus Osteoblasten auf den Energiehaushalt

Einfluss nimmt. Auch wenn bislang kein Rezeptor für OC gefunden wurde,

erfüllt es zahlreiche Kriterien eines Hormons. So entsteht es aus einem Prä-

Pro-Molekül und wird parakrin ausgeschüttet sowie endokrin ins Blut

abgegeben, wo nur das reife Molekül nachweisbar ist. Zudem unterliegt es

einer zirkadianen Rhythmik bei der Sekretion. Der Phänotyp bei Knock-out-

Mäusen entspricht einem Diabetes mellitus Typ 2 mit verminderter

Insulinausschüttung, erhöhtem Glucosespiegel sowie verminderter

Glucosetoleranz und Insulinsensitivität (Baldock 2011). Die genauen

Zusammenhänge sind spannend und Gegenstand aktueller Forschung.

Schon im Microarray aus den Zellen der Passage 0 konnte für OC nur eine

schwache differentielle Expression (Fold Change 1,47) durch die bhMSCs

aufgezeigt werden, die auch in der RT-PCR ihre Bestätigung fand. Im erneuten

Array mit Zellen der Passage 1 zeigte sich dann nur noch ein Fold Change von

1,18.

OPN (Osteopontin, SPP1)

OPN wurde erstmals als extrazelluläres Protein der Knochenmatrix

beschrieben, wird aber auch als sezerniertes phosphoryliertes Glycoprotein

Diskussion

54

(SPP1) ans Blut abgegeben, wobei die Synthese sowohl durch Osteoblasten

als auch durch Osteoklasten beschrieben wurde. Es gehört zur Gruppe der

SIBLING (small integrin-binding ligand N-linked glycoprotein) und besitzt

Bindungsstellen für Calcium und Heparin sowie für zahlreiche Integrine.

Dadurch findet eine Signalübermittlung an verschiedenste Körperzellen statt.

Der Kontakt zu Endothelzellen und glatter Muskulatur wirkt dabei einer ektopen

Kalzifikation entgegen und hat somit einen protektiven Einfluss auf die

Entwicklung einer Arteriosklerose. Als lösliches Zytokin wirkt OPN hingegen

regulierend auf das Immunsystem, indem es wechselseitig in Kontakt mit

Makrophagen, Dendritischen Zellen und T-Helfer-Zellen steht und zelluläre

Prozesse wie Adhäsion, Migration, Proliferation und somit die Immunantwort

steuert. In diesem Zusammenhang sind unter anderem der inhibitorische

Einfluss auf neoplastische Körperzellen und der proinflammatorische Effekt bei

Autoimmunerkrankungen wie Morbus Crohn Gegenstand aktueller Forschung.

Am Knochen ist OPN das häufigste nicht-kollagene Matrixprotein, wo es an

Calcium-Ionen und Hydroxylapatit bindet und durch Hemmung einer

überschießenden Kalzifikation die Mineralisierung der Knochenmatrix reguliert.

Knock-out-Mäuse präsentieren eine übermäßige Mineralisierung des Knochens,

der jedoch bei gestörter Mikroarchitektur von geringer biomechanischer

Stabilität und Qualität ist. OPN begünstigt dabei die Migration von Osteoklasten

und hat daher fördernde Einflüsse auf die Knochenresorption. Die Vielzahl an

Interaktionen mit verschiedensten Körperzellen erklärt sich aus den zahlreichen

Isoformen, die durch posttranslationale Modifikationen entstehen (Lund,

Giachelli et al. 2009)

OPN konnte sowohl in den Microarrays als auch in der RT-PCR stets

nachgewiesen werden. Für die Passage 0 ergab sich kein signifikanter

Unterschied in der Expression (Fold Change 1,12), wobei auch das RT-PCR-

Ergebnis kongruent dazu war. Im zweiten Array (P1) fand sich zwar ein Fold

Change von 5,81 für die bhMSC-Population, jedoch bei einem p-Wert von 74,9.

Diskussion

55

IBSP (Integrin-binding sialoprotein)

BSP (Bone sialoprotein) ist wie OPN ein Protein der extrazellulären

Knochenmatrix, das auch zur Gruppe der SIBLING gehört, woher der Name

Integrin-binding sialoprotein (IBSP) resultiert. Im Gegensatz zu OPN fördert

IBSP die Mineralisierung des Knochens mit Hydroxylapatit. Die Knochenbildung

wird dabei im Wachstum und bei der Frakturheilung begünstigt, was jeweils mit

einer verstärkten Expression von IBSP einhergeht. Knock-out-Mäuse zeigen

andererseits gravierende Störungen der Knochenbildung. Sie sind phänotypisch

von geringerer Statur, haben kürzere Knochen mit weniger Knochenmasse und

verminderter Mineralisierung durch Hydroxylapatit als Wildtypmäuse. Die

trabekuläre Struktur des Knochens bleibt dabei erhalten, jedoch lässt sich ein

verminderter Knochenumsatz aus Resorption und Neubildung feststellen. Die

Synthese von IBSP findet hauptsächlich in hypertrophen Chondrozyten,

Osteoblasten und Osteoklasten statt, wobei neben parakriner auch

mechanische Stimulation des Knochens die Expression von IBSP steigert. Auch

neoplastische Zellen demonstrieren bei einigen Entitäten IBSP-Expression, was

beim Brustkrebs das Auftreten von Mikrokristallen aus Hydroxylapatit erklärt.

Zusammenfassend scheint für einen physiologischen Knochenmetabolismus,

der in der Lage ist auf wechselnde Anforderungen adäquat zu reagieren, ein

funktionierendes Zusammenspiel der Mitglieder der SIBLING-Familie mit

anderen parakrinen und endokrinen Signalüberträgern unentbehrlich (Ganss,

Kim et al. 1999; Malaval, Wade-Gueye et al. 2008).

IBSP zeigte in beiden Populationen eine starke Signalintensität bei allen

Individuen im Array (Passage 0 und 1). Aus dem ersten Microarray (P0) ergab

sich ein Fold Change von 1,88 für die bhMSCs mit relativ guter Entsprechung in

der RT-PCR, der zwar im zweiten Array noch stärker ausgeprägt war (Fold

Change 3,47), jedoch in Verbindung mit einem p-Wert von 69,9 als nicht

signifikant zu bewerten war.

Diskussion

56

4.1.3.2. Myogene Markergene

Nid1 (Nidogen 1) und Nid2 (Nidogen 2)

Obwohl die beiden Nidogene Nid1 und Nid2 – Synonym Entactine – als

ubiquitäre Proteine der Basalmembran und nicht als myogene Marker im

klassischen Sinne bezeichnet werden können, soll ihre Beschreibung an dieser

Stelle stattfinden, kommt ihnen doch eine gewisse Bedeutung bei der

Myogenese zu.

Die Basalmembran ist eine Leitstruktur für den Aufbau zahlreicher Gewebe und

steht in engem Zusammenhang mit dem Wachstum und der Regeneration nach

Gewebsverletzungen. Sie besteht aus extrazellulären Proteinen wie Kollagen 4,

Perlecan, Laminin und Heparansulfat-Proteoglycanen und steht in regem

Kontakt zu den umliegenden Gewebs- und Stammzellen des jeweiligen

Gewebes (Boonen and Post 2008). Vor allem die Interaktion von Nid1 zu

Laminin scheint für eine physiologische Biologie und Stabilität der

Basalmembran von besonderer Wichtigkeit zu sein (Mokkapati, Fleger-

Weckmann et al. 2011). Im Muskel garantiert Nid1 als Verankerungsprotein

über Integrine den Kontakt des Zytoskeletts zu Satellitenzellen und wirkt somit

als Stabilisator der Stammzellnische der Satellitenzellen; es ist somit ein

wichtiger Faktor bei der Regeneration von verletztem Muskelgewebe (Boonen

and Post 2008; Ten Broek, Grefte et al. 2010).

Untersuchungen zur Expression der Nidogene bei der myogenen

Differenzierung legen Hinweise für unterschiedliche Funktionen der beiden

Isoformen nahe. Die myogene Differenzierung von Myoblasten zu Myofibrillen

induzierte nämlich eine deutlich verstärkte Expression von Nid2, die vor allem

nach ca. 24 Stunden beobachtet werden konnte; Nid2 reguliert daher

wahrscheinlich die frühe Phase der Myogenese. Hohe Expression von Nid1

ging hingegen mit hoher Proliferationsrate von Myoblasten einher, wobei

Marker der myogenen Differenzierung wie Myogenin und Myosin Heavy Chain

vermindert exprimiert wurden (Neu, Adams et al. 2006).

Da sich für Nid2 bei der Untersuchung des ersten Microarrays (P0) eine

differentielle Expression durch die mhMSCs darstellte (Fold Change 2,01),

Diskussion

57

wurden beide Nidogene anschließend auch mittels RT-PCR untersucht und die

Ergebnisse des Arrays konnten hierbei bestätigt werden. Die Analyse von Nid1

ergab aber weder im Array (Fold Change 1,29 für mhMSCs) noch in der PCR

eine signifikant gesteigerte Expression in einer der beiden Zellpopulationen. Im

P1-Microarray konnte dann überhaupt keine unterschiedliche Expression der

Nidogene in den mhMSCs und bhMSCs mehr gefunden werden.

MLC1SA (Myosin light chain 1 slow a)

Myosin, und zwar dessen Isoform Myosin 2, gehört zu den grundlegenden

Muskelproteinen und ist als solches direkt an der elektromechanischen

Kopplung, nämlich der Umwandlung eines elektrischen Gradienten an der

Zellmembran der Muskelzelle in kinetische Energie, beteiligt. Bei der

Muskelkontraktion gleiten Aktin- und Myosinfilamente durch wiederholte

wechselseitige Bindungen ineinander, wodurch sich die Muskelfaser verkürzt.

Motor und Energieträger dieser Bewegung ist ATP (Adenosintriphosphat),

dessen Hydrolyse zu ADP (Adenosintriphosphat) und Phosphat eine

Konformationsänderung bzw. ein Einknicken des Myosins bewirkt und somit die

Filamente ineinander schiebt (Geeves 1991).

Das Myosin 2 Protein ist ein Hexamer aus je zwei schweren und vier leichten

Ketten. Von den leichten Myosinketten (MLC) existieren zahlreiche Isoformen.

MLC1 ist dabei ein Subtyp, der jeweils als Bestandteil von schnell (fast/MLC1F)

und langsam (slow/MLC1S) kontrahierenden Muskelfasern unterteilt werden

kann. MLC1S kommt wiederum in 2 Formen vor, nämlich MLC1SA und

MLC1SB. MLC1SA ist also ein Bestandteil differenzierten Muskelgewebes, aber

es wird auch in Myoblasten exprimiert, wobei deren myogene Differenzierung

eine zusätzliche Induktion von MLC1SA nach sich zieht; während der

Myogenese nimmt die Expression also zu (Hailstones and Gunning 1990;

Reiser and Bicer 2006; Eddinger and Meer 2007).

Was die Ergebnisse des Microarray für MLC1SA angeht, so ergaben sich

weder im ersten (P0: Fold Change 1,35 für mhMSCs) noch im zweiten (P1: Fold

Change 1,32 für mhMSCs) Array signifikante differentielle Unterschiede. Die

RT-PCR der P0-Zellen konnte in diesem Zusammenhang das Ergebnis des

Diskussion

58

Arrays einer verstärkten Expression in den mhMSCs bestätigen, auch wenn

dieses nicht als signifikant gewertet werden kann.

TPM1 (Tropomyosin 1)

Ein weiteres Strukturprotein der Myofibrillen in der Muskulatur ist Tropomyosin,

das als helikaler Strang Aktinfilamente (F-Aktin) umgibt und mit diesen durch

seine dem F-Aktin angepasste Form nicht-kovalent verbunden ist. Außerdem

steht es über Troponin T mit dem Troponin-Komplex in Verbindung. Bei

niedrigem intrazellulären Ca2+-Spiegel versperrt der Troponin-Tropomyosin-

Komplex die Bindungsstelle am F-Aktin, während ein Anstieg des intrazellulären

Ca2+ zu einer Konformationsänderung am Tropomyosin führt und die

Bindungsstelle für Myosin am Aktinfilament freigibt (Li, Tobacman et al. 2011).

TPM1 ist eine von 4 Isoformen des Tropomyosins und scheint neben seiner

Funktion als Strukturprotein der Muskelzelle auch Eigenschaften eines

Tumorsuppressors aufzuweisen, indem es Micro-RNA (miR-21) des MIR21-

Gens bindet, die in Tumorzellen überexprimiert ist (Zhu, Si et al. 2007).

Mutationen im TPM1-Gen können zudem zu familiären oder ideopathischen

Formen der Dilatativen Kardiomyopathie führen (Hershberger, Norton et al.

2010).

Obwohl im P0-Microarray eine minimal ausgeprägte differentielle Expression

durch die mhMSCs gefunden werden konnte, entsprach das insgesamt nur

einem mittlerem Fold Change von 1,17. Daher zeigte auch die RT-PCR dem

Array (P0) entsprechend keine deutlichen Unterschiede auf; TPM1 konnte

jedoch durchwegs nachgewiesen werden. Im P1-Array zeigte sich noch weniger

eine differentielle Expression (Fold Change 1,04).

MYOF (Myoferlin)

MYOF gehört wie Dysferlin zur Familie der Ferlin-Proteine, welche essentielle

Schritte der Myogenese ermöglichen. Beide Proteine sind während der

Myogenese stark exprimiert. Wie Dysferlin bindet MYOF Ca2+ und

Phospholipide und garantiert somit ein Verschmelzen von Membranvesikeln mit

der Zellmembran. Dies ist ein essentieller Prozess bei der Entstehung von

Diskussion

59

Muskelfasern, bei dem zahlreiche Myoblasten miteinander verschmelzen und

vielzellige Muskelfasern entstehen lassen. Knock-out-Mäuse sind daher nicht in

der Lage Muskelfasern von normaler Größe auszubilden, was insgesamt auch

zu geringerer Muskelmasse bei den Individuen führt. Neben der Myogenese

steht aber auch die physiologische Regenerationsfähigkeit der Muskulatur nach

Trauma im ausgewachsenen Organismus in engem Zusammenhang mit MYOF

(Doherty, Cave et al. 2005; Demonbreun, Lapidos et al. 2010).

Aus dem Vergleich der beiden Microarrays ergaben sich annähernd gleiche

Ergebnisse und es zeigte sich nur eine geringe und nicht signifikante

differentielle Expression von MYOF durch die bhMSCs (P0: Fold Change 1,20,

P1: Fold Change 1,26). Die RT-PCR konnte dies bestätigen und erbrachte eine

gleichmäßige Expression von MYOF in beiden Zellpopulationen.

4.1.3.3. Sonstige untersuchte Gene

CD24 (Cluster of Differentiation Antigen 24, Nectad rin)

CD24 gehört zur Gruppe der Oberflächenantigene und ist auf verschiedensten

Zellen wie B-Lymphozyten, Granulozyten, Keratinozyten, Neuronen und

Nierentubuli anzutreffen. CD24 spielt eine Rolle im Signalweg von Ral-

GTPasen, die wichtige Mediatoren bei der Entstehung von Neoplasien sind.

Seine genaue Funktion ist aber noch nicht bis ins Einzelne entschlüsselt

worden. Bekannt ist, dass es als alternativer Ligand für P-Selectin die

Zelladhäsion am Endothel ermöglicht und in diesem Zusammenhang die

Metastasierung von Tumoren zu begünstigen scheint. Zudem erhöht es die

Zelladhäsion an extrazellulären Matrixproteinen wie Kollagen, Laminin und

Fibronectin, wodurch metastatische Zellen im Gewebe stabilisiert werden

können. Seit einiger Zeit wird CD24 als Oberflächenmarker von zahlreichen

bösartigen Tumorentitäten wie Ovarial-, Mamma-, Prostata-, Blasen-,

Nierenzell- und nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom beschrieben und wird

daher neben CD44 und CD133 als allgemeiner Oberflächemarker für

Krebsstammzellen (Cancer Stem Cells/ CSC) diskutiert (Lee, Choe et al. 2010;

Jaggupilli and Elkord 2012; Yu, Pestell et al. 2012).

Diskussion

60

Interessante Versuche konnten CD24 auch als Markerantigen für neuronale

Differenzierung aus embryonalen Stammzellen identifizieren. Mittels FACS

wurden aus embryonalen Stammzellkulturen solche Subpopulationen mit

starker Expression von CD24 isoliert. Diese hatten ein fortgeschrittenes

neuronales Differenzierungsstadium erreicht, wohingegen Populationen mit

niedriger Expression des Oberflächenantigens früheren und gemischten

neuronalen Vorläuferstadien entsprachen (Pruszak, Ludwig et al. 2009). Da

CD24 andererseits in Vorläuferzellen anderer Gewebe hoch exprimiert ist, was

für die Brustdrüse (Shackleton, Vaillant et al. 2006) und das Pankreas

nachgewiesen wurde, betiteln immer mehr Wissenschaftler CD24 heute als

allgemeinen Oberflächenmarker von Stammzellen (Jiang, Sui et al. 2011).

In der Muskulatur des adulten Organismus konnte CD24 vor allem im Bereich

der motorischen Endplatte nachgewiesen werden und ist dort für eine

ungestörte Signalübertragung verantwortlich. Genetische Mutationen führen zu

einer mangelhaften Signalübertragung, die genetischen Defekten des NCAM

(Neural Cell Adhesion Molecule) gleichen, was ähnliche physiologische

Funktionen der beiden Proteine vermuten lässt (Jevsek, Jaworski et al. 2006).

Die Microarrays gaben zu weiteren Untersuchungen Anlass, da eine

differentielle Expression des Proteins durch die bhMSCs sowohl im P0-Array

(Fold Change 2,77) als auch im P1-Array (Fold Change 6,56) auffiel. Deswegen

wurden RT-PCRs sowohl für P0-Zellen als auch für P1-Zellen ausgeführt, die in

Kongruenz zum Microarray standen. Darüber hinaus ließ sich CD24 ebenso

mittels immuncytochemischer AK-Färbung auf den bhMSCs nachweisen. In

diesem Fall konnte also die Kontamination durch Plasmazellen als mögliche

Ursache der Expressionsunterschiede zwischen mhMSCs und bhMSCs

ausgeschlossen werden.

TRIB2 (Tribbles homolog 2)

Die Proteinfamilie der Tribbles, die vor einigen Jahren erstmals in der

Fruchtfliege Drosophilia entdeckt wurden, umfasst drei Isoformen, die jeweils

als Pseudokinasen bei zahlreichen zellulären Prozessen eingreifen und unter

anderem auch den MAPK-Signalweg (Mitogen-activated protein kinase) und

Diskussion

61

somit Proliferation, Zellwachstum und Differenzierung beeinflussen.

Entsprechend ihrer Funktionen kommen sie sowohl im Cytoplasma als auch im

Zellkern vor, wo sie Transkriptionsfaktoren und Genpromotoren regulieren.

TRIB2 fördert den Abbau von Transkriptionsfaktoren der C/EBP-Familie

(CCAAT/Enhancer-binding protein) in Proteasomen. Dadurch wird

beispielsweise eine myeloische Differenzierung zu Monozyten angestoßen, die

bei Immundefizienz in eine Akute Myeloische Leukämie gipfeln kann. Auch bei

nicht-hämatologischen Neoplasien wie dem Malignen Melanom scheint TRIB2

eine Rolle zu spielen, indem es den Transkriptionsfaktor FOXO3 (Forkhead-

Box-Protein O3) herunterreguliert, was das Tumorwachstum beschleunigt.

Allerdings kann aus dieser Wirkung auf FOXO3 die Proliferationsrate von

Hautzellen und somit die Wundheilung auch positiv beeinflusst werden. TRIB2

ist außerdem beim Bronchial-, Mamma-, Ösophagus- und Kolonkarzinom

vermehrt exprimiert und zeigt somit onkogene Eigenschaften. Im Gegensatz

dazu vermögen Tribbles aber auch über eine Hemmung von Januskinasen das

Tumorwachstum einzudämmen. Genauer untersucht ist auch die inhibitorische

Wirkung von TRIB2 auf die Adipogenese. Gefäßplaques unterliegen bei

steigender Expression von TRIB2, die mit einer proinflammatorischen Tendenz

durch verminderte IL-10-Spiegel einhergeht, erhöhter Gefahr für eine Ruptur mit

resultierenden ischämischen Ereignissen.

Die Funktionen der Tribbles-Proteinfamilie legen also große Rätsel auf, wirken

sie doch als Onkogen oder Tumorsuppressor, hemmen den Zellzyklus oder

stoßen ihn an, blockieren oder fördern Zellteilung, Wachstum und Apoptose.

Diese paradoxen Wirkungen können dabei nur teilweise auf gewebespezifische

Funktionen zurückgeführt werden (Yokoyama and Nakamura 2011; Dobens

and Bouyain 2012).

Neben CD24 war TRIB2 ein weiteres Gen, das auch im zweiten Microarray (P1)

noch differentiell exprimiert war, wobei sich eine höhere Expression in den

bhMSCs zeigte (P0: Fold Change 1,58, P1: Fold Change 2,32). Auch dieses

Ergebnis ließ sich anschaulich durch RT-PCR von P0-Zellen und P1-Zellen

bestätigen.

Diskussion

62

4.2. Stellenwert der bhMSCs in der adulten Stammzel lforschung im

Hinblick auf Expressionsunterschiede

Um eines allgemeinen Urteils bei der Auswertung gerecht zu werden,

veranlassen die Ergebnisse in ihrer Zusammenschau nicht zur Annahme, dass

mhMSCs und bhMSCs sich in ihrem Differenzierungspotential deutlich

unterscheiden. Wenn es sich also überhaupt um unterschiedliche

Subpopulationen handelt, so scheinen die Expressionsunterschiede nur sehr

gering zu sein. Zu gering, als dass der höhere Aufwand bei der Gewinnung von

bhMSCs gerechtfertigt wäre. Diese Schlussfolgerung drängt sich vor allem nach

Analyse der Ergebnisse des P1-Microarrays auf, der anhand der gemessenen

Fold Changes und auch nach Beurteilung der Einzelergebnisse viel geringere

bzw. nahezu überhaupt keine Expressionsunterschiede offenbarte. Die

Unterschiede, die auch zuletzt noch nachgewiesen wurden, lassen sich eher als

individuelle Unterschiede zwischen einzelnen Patienten interpretieren und sind

nicht als repräsentativ anzusehen.

Zumindest für TRIB2 und CD24 konnte eine Regulierung bestätigt werden,

welcher Stellenwert sich allerdings aus der höheren Expression in den bhMSCs

ableiten lässt, ist schwierig zu beantworten. Beide Proteine spielen zwar nach

aktuellem Stand der Forschung sicherlich eine Rolle in der Biologie

Mesenchymaler Stammzellen, doch erlaubt die Zusammenschau bisheriger

Untersuchungen zu deren Funktion (siehe 4.1.3.) bisher keine Rückschlüsse

darüber, ob eine gesteigerte Expression für eine homogenere

Stammzellpopulation bzw. bessere Differenzierungseigenschaften spricht.

Eine mögliche Erklärung rückt CD24 erneut in den Fokus der Tumorbiologie

und Metastasierung. CD24 wird nachgewiesenermaßen von Krebszellen

synthetisiert und spielt eine wichtige Rolle bei der Entstehung bzw. bei der

Stabilisierung von osteoblastischen Knochenmetastasen bei bösartigen

Tumoren oder bei primären Knochentumoren (Tang, Cai et al. 2012). Da

bhMSCs in noch engerer biologischer Beziehung zu Osteoblasten stehen als

mhMSCs bzw. selbst als dedifferenzierte Osteoblasten anzusehen sind,

verwundert eine stärkere Expression in bhMSCs im Hinblick auf die Biologie

Diskussion

63

von Knochenmetastasen also nicht. Die Expressionsunterschiede zwischen

mhMSCs und bhMSCs für CD24 könnten in diesem Zusammenhang erklärt

werden.

Die Gewinnung von bhMSCs aus Knochentrabekeln lässt auf eine enge

Beziehung dieser Zellen zum Knochengewebe schließen. Dass es sich bei

bhMSCs wahrscheinlich um eine homogenere Zellpopulation handelt als bei

mhMSCs, kann durch die Tatsache erklärt werden, dass die Zellen in engem

räumlichen und somit auch biologischen Kontakt mit gewebsständigen

Osteoblasten stehen und somit nach vorherigem Kollagenaseverdau der

Zellkultur einzig dem Osteoid entstammen. Tatsächlich werden sie auch

osteoblastische (Progenitor-)Zellen genannt. Es handelt sich demnach am

ehesten um dedifferenzierte Osteozyten, die einen partiellen

Stammzellcharakter wiedererlangt haben. Wie mhMSCs können sie durch

folgende Oberflächenmarker identifiziert werden: CD73+, STRO-1+, CD105+,

CD34–, CD45–, CD144– (Robey 1995; Noth, Osyczka et al. 2002; Osyczka,

Noth et al. 2002; Tuli, Tuli et al. 2003).

Die Bedeutung von bhMSCs in der künftigen Stammzellforschung ist aber in der

Zusammenschau wohl eher als untergeordnet einzustufen.

4.3. Stammzellcharakter der MSCs

Der Begriff der „Mesenchymalen Stammzelle“ ist omnipräsent in der Literatur

der letzten 20 Jahre anzutreffen und suggeriert die Existenz einer

gemeinsamen adulten Stammzelle für alle nicht-hämotopoietischen

Abkömmlinge des Mesoderms, also sowohl für Binde-, Stütz- (Knorpel,

Knochen) und Fettgewebe als auch für die Muskulatur. Der heutige

Wissensstand berechtigt aber nach wie vor oder mehr denn je das Vorkommen

solcher Stammzellen anzuzweifeln.

Nach Bianco (Bianco 2011) baut die Hypothese einer gemeinsamen myogenen

und osteogenen Stammzelle auf falschen Schlussfolgerungen. Beobachtungen

aus In-vitro-Assays werden oftmals einfach unkritisch auf den lebenden

Organismus übertragen bzw. der Nachweis einiger myogener Marker in MSCs

Diskussion

64

verleitet zu der Vermutung sie könne zur Muskelzelle differenzieren. Dass eine

myogene Zelle unter Stimulierung mit BMPs Osteoblasten generieren kann, ist

wahrscheinlich vielmehr in einer fundamentalen Fähigkeit zur

Reprogrammierung zahlreicher Körperzellen begründet und sicherlich nicht nur

für myogene Zellen nachweisbar und hebt die myogene Zelle nicht

zwangsläufig auf eine Ebene mit einer Stammzelle, die auch ohne BMP-

Stimulation Osteoblasten generieren kann. Während der Embryogenese

beschränkt sich das myogene Differenzierungspotenzial örtlich auf Somiten,

wohingegen osteogenes Potential im lateralen und axialen Mesoderm

anzutreffen ist. Im ausgewachsenen Organismus gelten Satellitenzellen als

lokales Reservoir für die Geweberegeneration der Skelettmuskulatur. Welchen

Ursprung eine gemeinsame myogene und osteogene MSC haben soll, bleibt

also nach wie vor unklar (Bianco 2011). In aktuellen Versuchsreihen konnten

ortsständige MSCs aus der Subkutis zu Muskelzellen differenzieren. Eine

ausgeprägte myogene Differenzierung wurde dabei vor allem durch

Nachahmung der äußeren Stimuli im Muskelgewebe erreicht, nämlich durch

mechanische Reize analog zur Muskelkontraktion. Dadurch wird erneut die

Bedeutung der Mikroumgebung und deren Stimuli für die Differenzierung

hervorgehoben. Diese Ergebnisse könnten den Verdacht erhärten, dass das

Fettgewebe als Reservoir für Subkulturen myogener Progenitorzellen bzw.

pluripotenter MSCs dient. Jedoch scheint auch für diese Zellen die direkte

Umgebung entscheidend (Yilgor Huri, Cook et al. 2013).

CD146 (MCAM) sowie ALP konnten zur Identifikation von osteogenen

Vorläuferzellen in der Umgebung von kleinsten Blutgefäßen nachgewiesen

werden (Perizyten). Zudem können mittels FACS CD146+ perivaskuläre

Vorläuferzellen anderer Gewebe, also auch des Muskels, aus dem Organismus

rekrutiert werden. Bei diesen Zelltypen handelt es sich aber eher um

gewebespezifische (Knochen, Knorpel, Muskel) Vorläuferzellen, die in vivo nur

einen ähnlichen Phänotyp besitzen und jeweils nur in das örtliche Gewebe zu

differenzieren vermögen, myogene Perizyten also in Myoblasten und nicht in

Osteoblasten. Dabei scheinen unterschiedliche Populationen von

Diskussion

65

Vorläuferzellen trotzdem einige Oberflächenmerkmale wie CD146 gemeinsam

zu haben (Shih 1999; Sacchetti, Funari et al. 2007; Bianco 2011).

Die Mesenchymale Stammzelle aus dem Knochenmark ist daher am ehesten

als Skelettale Stammzelle bzw. osteogene Vorläuferzelle anzusehen. Kürzlich

verdichtete sich das Augenmerk auf die stabilisierenden Faktoren osteogener

Progenitorzellen auf die Mikroumgebung von Stammzell-Nischen und

Förderung der Angiogenese und der Gefäßregeneration. Es soll nur die

Interaktion zu Endothelzellen und die Produktion von Angiopoietin an dieser

Stelle erwähnt werden. Eine grundsätzliche Voraussetzung für eine

Geweberegeneration ist nämlich stets ein vaskuläres Remodelling und die

Wiederherstellung einer homöostatischen Mikroumgebung im geschädigten

Gewebe. Sind es also die Differenzierungseigenschaften von MSCs, die eine

Regeneration ermöglichen oder eher trophische und immunmodulatorische

Effekte, die ein geeignetes physiologisches Milieu schaffen? Oder trifft beides

zu? In Zukunft wird diese neue Sichtweise die Forschung an MSCs bestimmen

und unser Verständnis weiter verbessern (Bianco 2011; Bianco 2011; Bianco,

Sacchetti et al. 2011).

4.4. Zusammenfassende Schlussfolgerungen

Nur sehr selten führen geniale und meist zufällige Beobachtungen innerhalb

kürzester Zeit zu Bahn brechenden Neuerungen in der naturwissenschaftlichen

Forschungswelt. Fast immer sind es unzählige Puzzlesteine, die in jahrelanger

Kleinstarbeit – oftmals von vielen Rückschlägen und Hindernissen begleitet –

eines Tages ein schlüssiges Gesamtbild ergeben. Dabei ist es nicht untypisch,

dass immer wieder Phasen von überschwänglicher Euphorie von solchen

abgelöst werden, in denen aktuelle Versuchsergebnisse die entstehenden

Erwartungen und Hoffnungen nicht erfüllen können. Oftmals entpuppt sich ein

fertig geglaubtes Puzzle lediglich als neues Puzzlestück in einem viel größeren

Kontext oder es erscheint unmöglich die letzten Puzzleteile zu finden. Trotzdem

herrscht niemals Stillstand oder Resignation und es tun sich immer neue Wege

auf, die den Weg der künftigen Forschung vorgeben. Auch die Forschung an

Diskussion

66

adulten Stammzellen ist ein stetiges Auf und Ab von nützlichen und

zukunftsweisenden Erkenntnissen und herben Rückschlägen. Doch gerade

diese Rückschläge zeigen uns oft ein etwas kompletteres Gesamtbild auf. Im

Besonderen gilt eine solche Sichtweise für Mesenchymale Stammzellen. Nach

wie vor ist der eigentliche Stammzellcharakter, die Beschaffenheit und

Lokalisation ihrer Nische, die Differenzierungseigenschaften und viele

biologische Funktionen dieser Zellen mit vielen Unsicherheiten behaftet.

Gerade diese Unsicherheiten, für die sich nach und nach Erklärungsmodelle

entwickeln bzw. entwickeln werden, machen die Mesenchymale Stammzelle zu

einem der spannendsten und immer noch viel versprechendsten Werkzeuge in

der modernen Molekularbiologie und im Zeitalter des Tissue Engineering. Die

Definition einer Stammzelle ist nach wie vor gültig, nämlich ihre Fähigkeit zur

unerschöpflichen Selbsterneuerung und zur Differenzierung in verschiedene

Zelltypen. Doch es wird gerade bei vielen Versuchsanordnungen in vitro

vorschnell eine Beweisführung konstruiert, die nicht immer dieser Definition

gerecht wird. So gilt die Langzeit-Kultur von MSCs in vitro als Beweis für ihre

Fähigkeit zur unerschöpflichen Selbsterneuerung und die Expression einiger

Markergene und ein ähnlicher Phänotyp als Beweis für das

Differenzierungspotential in ein bestimmtes Gewebe. Doch biologische Gewebe

sind hochkomplexe dreidimensionale Gebilde, und Knochen, Knorpel und

Muskel konnten in dieser Struktur noch nicht in vitro imitiert werden (Bianco

2011). Eine neue Sichtweise ist somit viel umfassender und führt weg von der

multipotenten Stammzelle hin zur Gewebszelle, die unter gewissen Stimuli

dedifferenzieren und Eigenschaften einer Stammzelle übernehmen kann. Dass

MSCs aus unterschiedlichen Geweben in vitro unter identischen Bedingungen

vielfach ähnliche biologische Phänotypen mit gleichen Oberflächenmarkern

hervorbringen, liegt somit womöglich auch an den Bedingungen in vitro, unter

denen diese einem bestimmten Differenzierungsweg zugeführt werden. Oder in

anderen Worten ausgedrückt, nicht die MSC-Population sondern das

Stammzellmedium und andere physikalische und chemische Reize garantieren

den Differenzierungsweg. Nach dieser Sichtweise erklären sich auch sämtliche

Gemeinsamkeiten, die mhMSCs und bhMSCs in unseren Versuchsreihen zu

Diskussion

67

Tage führten. In Zukunft wird also sicherlich die Nische der Stammzellen als

essentielles Milieu noch stärker in den Vordergrund rücken. Nicht nur die

Identifikation bzw. Gewinnung von MSCs aus dem Gewebe alleine ist somit der

Schlüssel, sondern auch ein umfassendes Verständnis um das physiologische

Milieu, in dem sich diese entfalten können. Wenig Zweifel besteht indes

darüber, dass MSCs einen bzw. den entscheidende Beitrag zur Stabilisierung

der Stammzell-Nische leisten. In Zukunft werden MSCs von noch größerer

Bedeutung sein, wenn im Zuge des Tissue Engineering sinnvolle Lösungen und

Therapiekonzepte zur Regeneration von erkranktem und degeneriertem

Gewebe gefunden werden müssen.

Zusammenfassung

68

5. Zusammenfassung

Technische Neuerungen und steigende Ansprüche an die Gesundheit stellen

die moderne Medizin immer wieder vor neue Herausforderungen und führen zur

Entwicklung von neuen Therapiekonzepten wie dem Tissue Engineering.

Vielfach kommen dabei adulte Stammzellen zum Einsatz, die anders als

omnipotente Embryonale Stammzellen (ESCs) als multipotent anzusehen sind.

Bei der Regeneration mesenchymalen Gewebes wie Knochen, Knorpel und

Muskulatur leisten Mesenchymale Stammzellen (MSCs) einen entscheidenden

Beitrag. Diese lassen sich aus allen mesenchymalen Geweben des Körpers

gewinnen und stellen daher zwar keine homogene Zellpopulation dar, doch sie

lassen sich aufgrund phänotypischer und molekularbiologischer

Gemeinsamkeiten charakterisieren.

In großer Zahl lassen sich MSCs aus dem Knochenmark gewinnen und werden

als stromale MSCs bzw. mhMSCs (marrow-derived human MSCs) bezeichnet.

Auf der Suche nach homogenen Subpopulationen von MSCs wurde in dieser

Arbeit eine Zellpopulation aus Knochentrabekeln gewonnen, sogenannte

bhMSCs (trabecular bone-derived MSCs), und anhand ihrer Genexpression mit

mhMSCs verglichen. Dafür wurde RNA aus beiden Populationen in einem

Microarray mit anschließender SAM (significance analysis of microarrays)

analysiert um unterschiedliche Expressionsmuster zwischen mhMSCs und

bhMSCs aufzuzeigen. Diese Ergebnisse wurden durch konventionelle Reverse

Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) bestätigt, wobei das

Augenmerk vor allem auf solche Gene gerichtet wurde, die differentiell

exprimiert waren und zudem als Markergene ein Differenzierungspotential in

bestimmte Gewebe wie Muskel und Knochen vorhersagen. Dabei konnte

sowohl eine gute Übereinstimmung zwischen Microarray und RT-PCR

demonstriert als auch die Hoffnung auf eine homogene (trabekuläre) MSC-

Population mit anderen Differenzierungseigenschaften geweckt werden.

Im Verlauf weitergehender Untersuchungen der SAM fiel eine unerklärlich hohe

Expression von Immunglobulinketten in der mhMSC-Kultur (Passage 0) auf, die

letztlich auf eine Kontamination der Zellkultur mit Plasmazellen schließen ließ.

Zusammenfassung

69

Da die Ergebnisse des Microarrays (Passage 0 Kultur) somit zu hinterfragen

waren, wurde die Kontamination der Plasmazellen durch Passagieren der

mhMSC-Zellkultur (Passage 1) beseitigt und erneut ein Microarray mit SAM

durchgeführt. Dabei relativierten sich fast alle Expressionsunterschiede, die

somit auf die Kontamination der Plasmazellen zurückgeführt werden mussten.

Einzig drei Gene (CD24, TRIB2, AHNAK) wurden in diesem zweiten Array

differentiell exprimiert, was sich bei CD24 und TRIB2 auch durch RT-PCR

untermauern ließ.

Es lässt sich also schlussfolgern, dass bhMSCs wahrscheinlich in der Zukunft

des Tissue Engineering keinen Stellenwert haben werden, zumal ihre

Gewinnung im Vergleich zu mhMSC deutlich aufwendiger ist.

Literaturverzeichnis

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Abbildungsverzeichnis

77

7. Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: Verwendete Gene mit Primersequenzen,

Produktlänge und Sequenz-ID ......................................................................... 30

Abb. 2: PCR-Bedingungen der verwendeten Gene......................................... 32

Abb. 3: Passage 0 – allgemeine Expressionsunterschiede im Microarray ...... 37

Abb. 4: Ergebnisse aus der RT-PCR der RNA aus Passage 0 Zellen............. 40

Abb. 5: Vergleich der Ergebnisse aus Microarray und RT-PCR

der Patienten-RNA ........................................................................................... 41

Abb. 6: Gegenüberstellung der Ergebnisse aus Array und PCR

von P0 und P1.................................................................................................. 42

Abb. 7a: Gegenüberstellung der Expressionsunterschiede der Arrays aus

Passage 0 und 1 .............................................................................................. 44

Abb. 7b: Heatmap 1 ........................................................................................ 45

Abb. 7c: Heatmap 2......................................................................................... 46

Abb. 8: Ergebnisse der Immuncytochemie ...................................................... 47

Abb. 9: FACS-Analyse der mhMSC-Kulturen .................................................. 50

Zu 7b: Auflistung der Probesets zur Heatmap 1

Gene ID Gene Name 215176_x_at LOC651629 217022_s_at IGHA1 /// IGHA2 215379_x_at IGL@ /// IGLV3-25 /// IGLV2-14 /// IGLJ3 214677_x_at F13B /// IGL@ /// IGLV4-3 /// IGLV3-25 /// IGLV2-14 /// IGLJ3 211430_s_at IFI6 /// IGH@ /// IGHG1 /// IGHG2 /// IGHG3 /// IGHM 209138_x_at F13B 215121_x_at IGL@ /// IGLV4-3 /// IGLV3-25 /// IGLV2-14 205959_at MMP13 214669_x_at IGKC 221651_x_at F13B /// IGKC /// IGKV1-5 221671_x_at F13B /// IGKC /// IGKV1-5 224795_x_at F13B /// IGKC /// IGKV1-5 214836_x_at IGKC /// IGKV1-5 1560425_s_at PTPRD 213479_at NPTX2 204845_s_at ENPEP 221796_at NTRK2 32128_at CCL18 229839_at SCARA5


78

1562836_at --- 213502_x_at LOC91316 211124_s_at KITLG 209616_s_at CES1 205375_at MDFI 211401_s_at FGFR2 214043_at PTPRD 235281_x_at AHNAK 221558_s_at LEF1 215101_s_at CXCL5 1568646_x_at ZNF208 1562111_at BRE 226145_s_at FRAS1 229896_at GTF2I 209168_at GPM6B 220532_s_at LR8 202917_s_at S100A8 213994_s_at SPON1 242206_at --- 1558019_at --- 238271_x_at KIAA0182 213839_at KIAA0500 207017_at RAB27B /// SH3BGR 205098_at CCR1 204897_at PTGER4 211205_x_at PIP5K1A 202037_s_at SFRP1 232706_s_at TRABD 203936_s_at MMP9 204044_at QPRT 205681_at BCL2A1 218559_s_at MAFB 228988_at ZNF711 220022_at ZNF334 1557286_at --- 205032_at ITGA2 218934_s_at HSPB7 219778_at ZFPM2 206170_at ADRB2 203910_at ARHGAP29 201596_x_at KRT18 1554960_at C1orf110 229151_at SLC14A1


79

Zu 7c: Auflistung der Probesets zur Heatmap 2

Gene ID Gene Name 215176_x_at LOC651629 217022_s_at IGHA1 /// IGHA2 215379_x_at IGL@ /// IGLV3-25 /// IGLV2-14 /// IGLJ3 214677_x_at F13B /// IGL@ /// IGLV4-3 /// IGLV3-25 /// IGLV2-14 /// IGLJ3 211430_s_at IFI6 /// IGH@ /// IGHG1 /// IGHG2 /// IGHG3 /// IGHM 209138_x_at F13B 215121_x_at IGL@ /// IGLV4-3 /// IGLV3-25 /// IGLV2-14 205959_at MMP13 212592_at IGJ 214669_x_at IGKC 221651_x_at F13B /// IGKC /// IGKV1-5 221671_x_at F13B /// IGKC /// IGKV1-5 224795_x_at F13B /// IGKC /// IGKV1-5 214836_x_at IGKC /// IGKV1-5 1560425_s_at PTPRD 213479_at NPTX2 204845_s_at ENPEP 216207_x_at IGKV1D-13 /// LOC649876 221796_at NTRK2 215214_at IGL@ 217157_x_at --- 32128_at CCL18 209170_s_at GPM6B 215946_x_at CTA-246H3.1 229839_at SCARA5 223343_at MS4A7 204939_s_at PLN 1562836_at --- 213502_x_at LOC91316 211124_s_at KITLG 209616_s_at CES1 217428_s_at COL10A1 205375_at MDFI 204591_at CHL1 211401_s_at FGFR2 214043_at PTPRD 235281_x_at AHNAK 224435_at C10orf58 221558_s_at LEF1 209167_at GPM6B 215101_s_at CXCL5 210643_at TNFSF11 242899_at --- 1568646_x_at ZNF208 1562111_at BRE 226145_s_at FRAS1 211194_s_at TP73L 214608_s_at EYA1 1568644_at ZNF208 244190_at THAP5 229896_at GTF2I 206134_at ADAMDEC1 204638_at ACP5


80

209168_at GPM6B 204220_at GMFG 220532_s_at LR8 209772_s_at CD24 219304_s_at PDGFD 202917_s_at S100A8 204642_at EDG1 205941_s_at COL10A1 205403_at IL1R2 228155_at C10orf58 215648_at NUDCD3 205712_at PTPRD 204456_s_at GAS1 233510_s_at PARVG 213994_s_at SPON1 205822_s_at HMGCS1 242206_at --- 1558019_at --- 215193_x_at HLA-DRB1 203680_at PRKAR2B 238271_x_at KIAA0182 207029_at KITLG 213839_at KIAA0500 207017_at RAB27B /// SH3BGR 241670_x_at --- 235343_at --- 209312_x_at HLA-DRB1 205098_at CCR1 213362_at PTPRD 210997_at HGF 204897_at PTGER4 219064_at ITIH5 214974_x_at CXCL5 211205_x_at PIP5K1A 202037_s_at SFRP1 206496_at FMO3 232706_s_at TRABD 1566624_at SLC1A3 202350_s_at MATN2 209960_at HGF 203936_s_at MMP9 204044_at QPRT 210998_s_at HGF 204670_x_at HLA-DRB1 243689_s_at MGC72104 205681_at BCL2A1 207018_s_at RAB27B /// SH3BGR 208306_x_at HLA-DRB1 40665_at FMO3 218559_s_at MAFB 218404_at SNX10 1570482_at SLC22A3 228988_at ZNF711 221933_at NLGN4X 209652_s_at PGF 210755_at HGF 215552_s_at ESR1 205655_at MDM4


81

220022_at ZNF334 1557286_at --- 214767_s_at HSPB6 226864_at PKIA 217744_s_at PERP 231986_at RIMS1 206382_s_at BDNF 219308_s_at AK5 207733_x_at PSG9 219956_at GALNT6 227145_at LOXL4 204933_s_at TNFRSF11B 218451_at CDCP1 230869_at --- 222392_x_at PERP 222862_s_at AK5 211892_s_at PTGIS 210121_at B3GALT2 226789_at --- 223796_at CNTNAP3 /// CNTNAP3B /// LOC642342 /// LOC642373 /// FLJ37512 244623_at --- 1554685_a_at KIAA1199 201860_s_at PLAT 205032_at ITGA2 239262_at PRSS23 218934_s_at HSPB7 219778_at ZFPM2 206702_at TEK 244065_at CNTNAP3B /// LOC642373 /// FLJ37512 226071_at ADAMTSL4 215856_at CD33L3 205715_at BST1 205302_at IGFBP1 239066_at --- 214265_at ITGA8 227314_at --- 209594_x_at PSG9 209738_x_at PSG6 206170_at ADRB2 204339_s_at RGS4 204602_at DKK1 204337_at RGS4 229121_at --- 203888_at THBD 237435_at --- 205856_at SLC14A1 203910_at ARHGAP29 201596_x_at KRT18 1554960_at C1orf110 215704_at FLG 1555929_s_at --- 204830_x_at PSG5 224022_x_at WNT16 229151_at SLC14A1 1558280_s_at ARHGAP29 210432_s_at SCN3A


82

8. Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

ACI Autologe Chondrozytenimplantation

ADP Adenosintriphosphat

AK Antikörper

ALP Alkalische Phosphatase

ATP Adenosintriphosphat

BC Bone chip – Kurzform für bhMSC

BGLAP Bone gamma-carboxyglutamate protein

bhMSC Trabecular bone-derived human mesenchymal stem cell

BMP-2/ -4 Bone morphogenetic protein 2/ 4

bp Basenpaar

BSA Bovines Serumalbumin

BSP Bone sialoprotein

bzw. beziehungsweise

Ca2+ Calcium ionisiert

CCAAT CCAAT-Box (Cytidin-Cytidin-Adenosin-Adenosin-Thymin)

CD Cluster of differentiation (z.B. CD24)

cDNA komplementäre DNA

CDX-2 Caudal type homebox 2

C/EBP CCAAT/Enhancer-binding protein

CFU Colony-forming unit – Kolonie bildende Einheit

CFU-F Colony-forming unit Fibroblasten

Col1 Kollagen 1

cRNA komplementäre RNA

CSC Cancer Stem Cells

CXCR4 CXC Chemokin Rezeptor 2

DMEM Dulbecco’s modified eagle medium

dNTP Desoxy-Nukleotidtriphosphat

DNA Deoxyribonucleic acid – Desoxyribonukleinsäure

EDTA Ethylendiamintetraacetat


83

EF1α Eukaryotischer Translations- und Elongationsfaktor 1alpha

EMT Epitheliale Mesenchymale Transition

EOMES Eomesodermin

ESC Embryonic Stem Cell – Embryonale Stammzelle

FBS Fetales Kälberserum

FACS Fluorescence-activated cell sorting (Durchflusszytometrie)

FGF8 Fibroblast growth factor 8

FOXO3 Forkhead-Box-Protein O3

G-CSF Colony-stimulating factor Granulozyten

GM-CSF Colony-stimulating factor Granulozyten Makrophagen

GTP Guanosintriphosphat

h human – menschlich (z.B. hESC)

HLA-DR Human Leukocyte Antigen Typ DR

HPLC High Performance Liquid Chromatography

HSC Haematopoietic Stem Cell – Hämatopoietische Stammzelle

hSM-MSC Human synovial membrane Mesenchymal Stem Cell

IBSP Integrin-binding sialoprotein

Ig Immunglobulin

IL Interleukin (z.B. IL-10)

INFγ Interferon gamma

LIF Leukemia inhibitory factor

LNGFR Low-affinity nerve growth factor receptor

LPL Lipoproteinlipase

m murine – mäusespezifisch, Maus-

MAPK Mitogen-activated protein kinase

MCAM Melanoma cell adhesion molecule

MET Mesenchymale Epitheliale Transition

MgCl2 Magnesiumchlorid

mhMSC Marrow-derived human mesenchymal stem cell

miR-21 Micro-RNA des Gens MIR21

MLC1SA Myosin light chain 1 slow a

MSC Mesenchymal Stem Cell – Mesenchymale Stammzelle


84

MyoD1 Myogenic Differentiation 1

MYOF Myoferlin

Myog Myogenin

NCAM Neural cell adhesion molecule

NeuN Neuronales Nucleus Protein

NF-M Neurofilament M

Nid1/ 2 Nidogen 1/ 2

NK-Zellen Natürliche Killerzellen

NSAR Nicht-steroidale Antirheumatika

NSE Neuronen Spezifische Enolase

OC Osteocalcin

Oct4 Octamer binding transcription factor 4

Oligo-dT Kurze Sequenz aus Desoxy-Thymin-Nukleotiden

OPN Osteopontin

P Passage (z.B. P0: Passage 0)

Pax3 /7 Paired Box 3/ 7

PBS Phosphatpuffer

PCR Polymerase Kettenreaktion

POU5F1 POU class 5 homeobox 1

PPARg2 Peroxisome proliferation-activated receptor g2

Ral-GTPase Ras-like GTPase

RNA Ribunucleic acid – Ribonukleinsäure

RT-PCR Reverse Transkriptase-Polymerase Kettenreaktion

SAM Significance analysis of microarrays

SDF-1 Stromal Cell-derived factor

SH2/ 3 Src-homology 2/ 3

SIBLING Small integrin-binding ligand N-linked glycoprotein

Sox2 Sex determining region Y (SRY) box 2

SPP1 Secreted phosphoprotein 1

SSEA-3/ -4 Stage-specific embryonic antigens 3/ 4

STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3

SZM Stammzellmedium


85

Taq Thermus aquaticus (Bakterium)

TBE TRIS Borat EDTA Puffer

TBS Tris Buffered Saline

TERT Telomerase Reverse Transkriptase

TGFβ Transforming growth factor beta

TLR Toll-like Rezeptoren

TNFα Tumor Nekrose Faktor alpha

TPM1 Tropomyosin 1

TRIB2 Tribbles homolog 2

TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

TrkA High affinity nerve growth factor receptor

UV ultraviolett

z.B. zum Beispiel

Danksagung

Mein Dank gilt allen Personen, die mir bei der Erstellung dieser Arbeit auf sehr

unterschiedliche Weise zur Seite standen und ohne deren Unterstützung ich mein

Ziel nicht erreicht hätte.

An erster Stelle möchte ich meinem Doktorvater Franz Jakob danken, der mir

freundlich und konsequent den richtigen Weg aufzeigte und mit interessanten

Anregungen den erfolgreichen Fortgang dieser Arbeit stets im Blick hatte. Für die

kritische Einschätzung der Arbeit möchte ich ihm zudem herzlich danken.

In besonderem Maße danke ich Regina Ebert für die nette und fruchtbare Betreuung.

Zu jedem Zeitpunkt stand sie mir zur Seite, ob mit Erklärungen zur Thematik oder

Verbesserungsvorschlägen. Immer hatte sie ein Auge auf die experimentellen

Ergebnisse und unterstützte mich auch beim Verfassen in regem Email-Kontakt, als

ich in der Assistenzzeit Würzburg schon den Rücken gekehrt hatte.

Als ebenso wichtig und angenehm empfand ich die freundliche Arbeitsatmosphäre im

Osteologie-Labor. Von allen Mitarbeitern wurde ich immer selbstverständlich an die

verschieden molekularbiologischen Methoden herangeführt. Ohne ihre Unterstützung

hätte ich mich in die Thematik nicht einfinden können.

Ich danke Torsten Blunk für die kritische Prüfung und die Erstellung des

Zweitgutachtens.

Außerdem danke ich Jörg Arnholdt, der durch seine Dissertation wichtige Vorarbeit

geleistet hatte.

Bei Ulrich Goschenhofer möchte ich mich für das sorgfältige Korrekturlesen sowohl

auf sprachlicher als auch auf fachlicher Ebene bedanken.

An letzter und entscheidender Stelle gebührt mein Dank meinen Eltern, die mir das

Studium ermöglichten. Sie konnten mein Interesse und meine tiefe Begeisterung für

die Medizin wecken und standen mir ausnahmslos während des gesamten

Bildungsweges nicht nur mit fachlichem Rat zur Seite. Ohne euch hätte ich den Weg

nicht gehen können. Danke!

Lebenslauf Persönliche D aten: Name: Maximilian Heitmann

Adresse:

Mobiltelefon:

Email:

Geburtstag: 10.07.1984, Wiesbaden

Nationalität: Deutschland

Ausbildung und Weiterbildung

01/2015 Promotion: Universität Würzburg, Deutschland

seit 05/2013 2. Ausbildungsabschnitt Unfallchirurgie und Orthopädie Vivantes Humboldt Klinikum Berlin, Deutschland

10/2011 - 11/2012 1. Ausbildungsabschnitt Chirurgie/ Common Trunk: Allgemeinchirurgie, Ospedale Regionale di Mendrisio, Schweiz

05/2011 2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung (Staatsexamen) und Approbation Universität Würzburg, Deutschland

02/2010 - 01/2011 Praktisches Jahr: Rotation in Allgemeinchirurgie: Kantonsspital Luzern, Schweiz Innere Medizin: Ospedale Regionale Mendrisio, Schweiz Orthopädie: König-Ludwig-Haus Würzburg, Deutschland

02/2009 - 06/2009 Erasmus Praktikumssemester: Universität Porto, Portugal Klinische Praktika: Innere Medizin, Pädiatrie, Allgemeinmedizin, Plastische Chirurgie

10/2004 - 01/2010 Medizinstudium: Universität Würzburg, Deutschland Wahlfächer/ Famulaturen: Orthopädie, Plastische Chirurgie, Innere Medizin, Herz- und Gefäßchirurgie, Allgemeinmedizin, Radiologie, EKG-Analyse

09/2003 - 06/2004 Zivildienst: Haßberg-Kliniken, Hofheim/ Ufr., Deutschland Stationsdienst auf der internistischen Pflegestation

06/2003 Abitur Regiomontanus Gymnasium, Haßfurt, Deutschland; Abschlussnote 1,9 Maximilian Heitmann

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Aus dem Muskuloskelettalen Zentrum Würzburg (MCW) · Aus dem Muskuloskelettalen Zentrum Würzburg (MCW) Orthopädische Klinik König Ludwig Haus der Universität Würzburg Vorstand: