Aus der Abteilung für Immunologie (Leiterin Univ.- Prof ... fileAus der Abteilung für Immunologie (Leiterin Univ.- Prof. Dr. Barbara M. Bröker) des Instituts für Immunologie und

Aus der Abteilung für Immunologie

(Leiterin Univ.- Prof. Dr. Barbara M. Bröker)

des Instituts für Immunologie und Transfusionsmedizin

(Direktor: Univ.- Prof. Dr. Andreas Greinacher)

der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

Staphylococcus aureus und der Zelltod von humanen neutrophilen Granulozyten

Inaugural - Dissertation

zur

Erlangung des akademischen

Grades

Doktor der Medizin (Dr. med.)

der

Universitätsmedizin

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität

Greifswald

2013

vorgelegt von: Paula Döring geboren am: 26.04.1987 in: Berlin

Dekan: Univ.- Prof. Dr. Reiner Biffar

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Barbara M. Bröker

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Barbara C. Kahl

Tag der Disputation: 30.01.2014

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................................ III

1 Einleitung ........................................................................................................................... 1

1.1 Neutrophile Granulozyten und ihre Rolle bei der Immunabwehr ............................... 1

1.2 Staphylococcus (S.) aureus .......................................................................................... 3

1.3 Ziele der Arbeit .......................................................................................................... 10

2 Material ............................................................................................................................ 11

2.1 Geräte ......................................................................................................................... 11

2.2 Verbrauchsmaterial .................................................................................................... 12

2.3 Zellbiologische Arbeiten ........................................................................................... 12

2.4 Immunologische Arbeiten ......................................................................................... 14

2.5 Mikrobiologische Arbeiten ........................................................................................ 13

2.6 Molekularbiologische Arbeiten ................................................................................. 13

2.7 Proteinbiochemische Arbeiten ................................................................................... 15

2.8 Kits ............................................................................................................................. 16

2.9 Bakterienstämme, -toxine und Blutprodukte ............................................................. 16

2.10 Datenbanken, Software .......................................................................................... 17

2.11 Medien, Puffer, Lösungen ...................................................................................... 18

3 Methoden .......................................................................................................................... 22

3.1 Zellbiologische Methoden ......................................................................................... 22

3.2 Mikrobiologische Methoden ...................................................................................... 23

3.3 Molekularbiologische Methoden ............................................................................... 24

3.4 Immunologische Methoden ....................................................................................... 27

3.5 Proteinbiochemische Methoden ................................................................................ 30

3.6 Statistische Auswertung ............................................................................................ 31

4 Ergebnisse ........................................................................................................................ 33

Inhaltsverzeichnis

II

4.1 Wirkung von S. aureus-Kulturüberständen auf den Zelltod von neutrophilen

Granulozyten ........................................................................................................................ 33

4.1.1 Unmittelbare Effekte der bakteriellen Kulturüberstände ................................... 34

4.1.2 Effekte von bakteriellen Überständen in der Langzeit-Untersuchung ............... 37

4.2 Vergleichende Untersuchung von S. aureus-Isolaten von gesunden Carriern und

Patienten mit Furunkulose .................................................................................................... 44

4.2.1 Effekte von rekombinantem PVL auf Neutrophile ............................................ 44

4.2.2 Vergleich der bakteriellen Überstände klinischer Isolate aus Besiedlung und Furunkulose ...................................................................................................................... 49

4.2.3 Abhängigkeit der PVL-Expression von den Wachstumsbedingungen für S. aureus ........................................................................................................................... 51

4.3 Zelltodinduktion bei Neutrophilen durch lebende S. aureus-Zellen ......................... 58

4.3.1 Vergleichende Untersuchung von S. aureus-Zellen von Carrier- und Furunkulose-Isolaten ........................................................................................................ 59

5 Diskussion ........................................................................................................................ 61

5.1 Methodik der Zelltodbestimmung: Wie aussagekräftig sind die hier genutzten

Assays? ................................................................................................................................. 61

5.2 Modulierung des Zelltods von neutrophilen Granulozyten durch S. aureus ............. 63

5.3 Die Rolle von PVL .................................................................................................... 68

6 Zusammenfassung ............................................................................................................ 73

7 Anhang ............................................................................................................................. 75

8 Literaturverzeichnis .......................................................................................................... 82

Publikationen ............................................................................................................................ 94

Eidesstattliche Erklärung .......................................................................................................... 95

Tabellarischer Lebenslauf ........................................................................................................ 96

Danksagung .............................................................................................................................. 98

Abkürzungsverzeichnis

III


Abb. Abbildung

A. bidest. Aqua bidestillata

A. dest. Aqua destillata

agr accessory gene regulator

AK Antikörper

APS Ammoniumperoxodisulfat

BHI Brain Heart Infusion

BSA bovines Serumalbumin

CA-MRSA community-associated MRSA

CBA cytometric bead array

CC clonal cluster

CCY casein hydrolysate and yeast extract-containing

CD cluster of differentiation

CFU colony forming units

DAPI 4'-6-Diamidino-2-Phenylindol

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate

ECM extrazelluläre Matrix

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

eta, etd exfoliatives Toxin a, d

FACS fluorescence activated cell sorting

FCS fetales Kälberserum

FITC Fluoresceinisothiocyanat

fMLP N-Formylmethionyl-Lencyl-Phenylalanin

Fnbp Fibronektin-bindendes Protein

g vielfaches der Erdbeschleunigung

(1g = 9,81 m/s2)

HA-MRSA health care-associated MRSA

HCl Chlorsäure

HLA α-Hämolysin, Synonym: α-Toxin


IV

IL Interleukin

Kap. Kapitel

kDa Kilodalton

LDH Laktatdehydrogenase

LPS Lipopolysaccharid

LTA lipoteichoic acid

mAK monoklonaler Antikörper

MGE mobile genetische Elemente

MLST multilocus-sequence-typing

MRSA Methicillin-resistenter S. aureus

MSCRAMMs microbial surface components recognizing

adhesive matrix molecules

n.d. nicht detektierbar

NE neutrophile Elastase

NETs neutrophil extracellular traps

OD optische Dichte

pAK polyklonaler Antikörper

PBMCs mononukleäre Zellen des peripheren Bluts

PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung

PBS/T Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween®

PCR Polymerasekettenreaktion

pI isoelektrischer Punkt

PI Propidiumiodid

PICD Phagozytose-induzierter Zelltod

PMA Phorbolmyristatacetat

PS Phosphatidylserin

PSMs phenol-soluble modulins

PVDF Polyvinylidendiflourid

PVL Panton-Valentine-Leukocidin

RKI Robert-Koch-Institut

ROS reaktive Sauerstoffspezies

rpm Umdrehungen pro Minute, 1/60 s-1

RPMI Roswell Park Memorial Institute

RT Raumtemperatur


V

S. Seite

s. siehe

S. Staphylococcus

SAg Superantigen

SDS Natriumdodecylsulfat

SE staphylokokkales Enterotoxin

SEM Standardfehler des Mittelwerts

SpA, spa staphylokokkales Protein A

spp. Spezies

Tab. Tabelle

TBS Tris-gepufferte Kochsalzlösung

TBS/T Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween® 20

TEMED Tetramethylethylendiamin

TLR Toll-like-Rezeptor

TNFα Tumor-Nekrose-Faktor α

TRITC Tetramethylrhodaminisothiocyanat

TSB Tryptone Soy Broth

TSST-1 toxisches Schock Syndrom-Toxin

TUNEL TdT-mediated dUTP-biotin nick end-labeling

üN über Nacht

UV ultraviolett

VRSA Vancomycin-resistenter S. aureus

WT Wildtyp

7-AAD 7-Aminoactinomycin

1 Einleitung

1

1 Einleitung

1.1 Neutrophile Granulozyten und ihre Rolle bei der Immunabwehr

Das Immunsystem dient in erster Linie zur Abwehr von Infektionen. An fast allen Stellen des

Körpers finden sich Bestandteile des Immunsystems, denn dazu zählen verschiedene

Zelltypen, Effektormoleküle und physikalische Schutzmechanismen. Es wird unterteilt in das

angeborene und das erworbene Immunsystem.

Hauptakteure des erworbenen Immunsystems sind die T- und B-Lymphozyten, die durch ein

hochkomplexes Kombinationssystem aus vielen Rezeptorgenen und anschließende

Selektionsprozesse Antigen-spezifische Rezeptoren besitzen. Daher kann sich das erworbene

Immunsystem in seinem Rezeptorspektrum an die Erfordernisse durch verschiedene

Infektionserreger anpassen, es ist lernfähig und generiert im Laufe des Lebens ein

individuelles Immungedächtnis [1]. Weil im Infektionsprozess die entsprechend spezifischen

Zellen erst rekrutiert werden müssen, ist die Antwort des erworbenen Immunsystems

allerdings zeitlich verzögert.

Diese Lücke füllt das angeborene Immunsystem. Hierzu zählt man Phagozyten und NK-

Zellen, aber auch mechanische Barrieren und die Interleukine. Es erkennt konservierte

Strukturen der Infektionserreger und reagiert sofort, dafür aber eher unspezifisch [2].

Ein wichtiges verbindendes Glied beider Systeme stellt das Komplementsystem dar, ein

System mehrerer Plasmaproteine, die bei Entzündungsreizen kaskadenartig aktiviert werden.

Das Komplementsystem vermittelt über den Bestandteil C3b die Opsonierung von

Mikroorgansimen, über C5a die Chemotaxis der Immunzellen und kann an Zielzellen durch

Porenbildung den Zelltod auslösen [3].

Neutrophile Granulozyten sind Zellen des angeborenen Immunsystems. Sie machen den

größten Anteil der Leukozyten aus und sind als erste am Ort des Entzündungsgeschehens.

Dort kommt ihr reichhaltiges Waffenarsenal zur Anwendung, um Mikroorgansimen zu töten.

Sie phagozytieren, sezernieren verschiedene antimikrobielle Faktoren und können durch

Bildung von neutrophil extracellular traps (s.u.) selbst beim Sterben noch Eindringlinge

abfangen. Außerdem sind sie wichtige Initiatoren einer systematischen Immunantwort, denn

sie locken durch Chemoattraktanten weitere Immunzellen an [4].

1 Einleitung

2

1.1.1 Rekrutierung und Effektormechanismen von Neutrophilen

Nach Aktivierung durch frühe Entzündungsmarker wie TNFα, IL-8 oder C5a flachen sich

neutrophile Granulozyten ab, adhärieren an das Gefäßendothel und wandern hindurch, der

Fährte eines Chemokingradienten folgend, zum Entzündungsgeschehen [5].

Durch pattern recognition receptors, wie die Toll like-Rezeptoren, erkennen sie typische

Strukturen von Bakterien und Viren [6]. Eine weitere Möglichkeit, Mikroorganismen zu

erkennen, ist die Opsonierung: Die Erreger werden durch Antikörper oder C3b, einen

Bestandteil des Komplementsystems, markiert und diese binden wiederum an Fc-Rezeptoren

bzw. dem Komplement-Rezeptor CR-1 der Neutrophilen [7].

Die erkannten Eindringlinge werden phagozytiert und in Phagolysosomen abgebaut oder

durch Degranulation mit aggressiven Agenzien abgetötet. Die Granula der Neutrophilen

enthalten verschiedene antimikrobielle Peptide (α-Defensine, Lysozym, Lactoferrin) sowie

Enzyme, die die extrazelluläre Matrix abbauen (neutrophile Elastase,

Matrixmetalloproteinasen), um den Weg zum Entzündungsgeschehen frei zu machen [8].

Außerdem produzieren Neutrophile eine Vielzahl von bakterizid wirkenden reaktiven

Sauerstoffspezies (ROS) [9]. Viele dieser Substanzen verursachen allerdings auch

Gewebsschäden [10].

Neutrophile sind sehr kurzlebige Zellen und wandern nach getaner Arbeit nicht zurück in den

Blutkreislauf, sondern gehen in Apoptose und werden dann von Makrophagen abgeräumt.

Durch entsprechende Signale leiten Neutrophile außerdem die Auflösung der

Entzündungsreaktion und die Initiation der Gewebsrekonstruktion ein [11].

1.1.2 Neutrophil Extracellular Traps (NETs)

Neben diesem Prinzip der Erregerabwehr bestehend aus Degranulation und Phagozytose

verfügen Neutrophile noch über eine weitere, einzigartige Strategie: die Bildung von NETs.

Dabei bilden die Zellen Fangnetze aus ihrer DNA, Histonen und Bestandteilen der Granula,

die ausgeworfen werden und so Mikroorganismen einfangen und abtöten sowie Exotoxine

neutralisieren [12]. Nach Aktivierung z.B. durch IL-8 oder LPS wird die Synthese ROS

angeregt, die wohl eine wichtige Rolle als second messenger spielen [13]. Die

Aktivierungswege sind noch nicht vollständig geklärt. Dann kann eine Veränderung der

Zellmorphologie beobachtet werden (Abb.1): Der Zellkern verliert seine Segmentierung und

rundet sich ab, das Chromatin dekondensiert, die Kernmembran löst sich auf und Zell- und

Plasmabestandteile vermischen sich. Schließlich werden NETs freigesetzt und die Zellen

1 Einleitung

3

sterben [14]. Von der Stimulation der Zellen bis zum Auftreten von NETs vergehen abhängig

von den experimentellen Bedingungen 45 bis 240 min [14].

Abb. 1: Schema zum Ablauf der NETs-Bildung: Nach bestimmten Aktivierungssignalen (1) und

abhängig von ROS löst sich die Kernmembran auf (2), der Kern verliert seine lobulierte Form und

Kern- und Zytoplasmabestandeile vermischen sich (3), dann werden NETs freigesetzt (4). Aus:

Brinkmann et al., 2007, Nature Reviews Microbiology [13]

Die Neutrophilen sind während der NETs-Freisetzung noch vital, es handelt sich also um

einen aktiven Vorgang und nicht eine unkontrollierte Membranruptur der toten Zellen. Weder

die Induktion von Apoptose noch von Nekrose führen zur NETs-Bildung. Man spricht daher

von einer neuartigen Form des Zelltods, genannt NETose [14].

Es ist für verschiedene Erreger [12, 15-18], darunter auch Staphylococcus aureus [12] gezeigt,

dass sie NETs induzieren können und dadurch abgetötet werden. NETs konnten in humanen

Proben in vitro [12, 18, 19], in verschiedenen Infektionsmodellen im Tier [12, 15, 20-22] und

auch in situ [23] nachgewiesen werden.

Wie entscheidend Neutrophile für die Immunabwehr sind, wird bei einem absoluten Mangel

der Neutrophilen (Neutropenie) [24] oder auch einer genetischen Störung der NADPH-

Oxidase (chronische Granulomatose) [25], dem zentralen Enzym der ROS-Synthese, deutlich:

Die Betroffenen sind sehr infektionsanfällig und schon durch unkomplizierte Erreger

lebensgefährdet.

1.2 Staphylococcus (S.) aureus

1.2.1 Kommensale und Pathogen – die Rolle von S. aureus für den Menschen

Staphylokokken kommen fast überall in unserer Umwelt vor, so auch auf unserem Körper:

Sie sind ein häufig anzutreffender Bestandteil unserer Hautflora und Besiedler des

Nasenvorhofs. Ist diese feine Balance zwischen Kommensale und Wirt allerdings gestört,

kann S. aureus auch zu einem ernst zu nehmenden Infektionserreger werden; für den

Menschen nimmt S. aureus daher eine ambivalente Rolle ein. Etwa 20 % der Bevölkerung

1 Einleitung

4

sind ständig symptomfrei mit Staphylokokken im Nasenvorhof besiedelt, man nennt sie

Carrier. Auch andere Körperregionen (Haut, Schleimhäute) können besiedelt sein. Dauerhaft

besiedelte Menschen tragen dabei meist den gleichen Stamm im Nasenvorhof [26]. Bisher

konnte der Carrierstatus noch nicht eindeutig mit bestimmten genetischen oder

umweltbedingten Determinanten des Wirts oder des Bakteriums korreliert werden.

S. aureus ist aber auch ein häufiger Auslöser vor allem nosokomialer Infektionen. Bei

geschwächtem Immunsystem oder wenn die natürliche Hautbarriere gestört ist, z.B. durch

Hautverletzungen, Verbrennungen, Operationswunden oder Katheter, kann S. aureus sich

leicht als Infektionserreger etablieren.

Verbreitet sind dabei lokale Infektionen im Haut- und Weichgewebe, aber auch systemische

Infektionen bis hin zur Sepsis sowie toxinvermittelte Erkrankungen.

Der kolonisierende Stamm kann bei den genannten disponierenden Faktoren für den Carrier

zur Gefahr werden, denn eine S. aureus-Sepsis entwickeln besonders oft Carrier durch eine

endogene Infektion. Die Prognose ist allerdings besser als bei Nicht-Carriern, die sich exogen

infizieren und eine Sepsis ausbilden. Dieses Phänomen wird das Carrier-Paradoxon genannt

[26]. Man begründet diese Beobachtung damit, dass während der Besiedlung eine

Immunreaktion auf den kolonisierenden Stamm stattfindet, ohne dass eine lokale Entzündung

entsteht, und der Carrier so besser bei einer Infektion mit seinem kolonisierenden Stamm

geschützt ist.

1.2.2 Genetik von S. aureus und Typisierungsmethoden

Das S. aureus-Genom setzt sich aus einem core genome (ca. 75 %), einem core variable

genome (ca. 10 %) und mobilen genetischen Elementen (MGE, ca. 15 %) zusammen [27].

Das core genome ist hochkonserviert, hier werden sog. housekeeping-Gene, die für Wachstum

und Überleben essentiell sind, kodiert. Sequenzbasierte Genotypisierungsmethoden, wie

multilocus-sequence-typing (MLST) und spa-Typisierung, nutzen allele Varianten im core

genome. Beim MLST werden S. aureus-Stämmen anhand ihrer verschiedenen

Allelkombinationen von sieben housekeeping-Genen Sequenz-Typ (ST)-Nummern

zugeordnet. Eng verwandete STs werden in klonalen Linien (clonal clusters, CC)

zusammengeführt. Eine einfachere Möglichkeit der Stammeinteilung ist die spa-Typisierung,

dabei werden Sequenzvariationen innerhalb des Protein A (spa)-Gens erfasst.

Resistenz- und Virulenzgene (z.B. Superantigene, Panton-Valentine-Leukocidin) werden auf

MGE, wie z.B. Bakteriophagen, Pathogenitätsinseln und Plasmiden kodiert. MGE können

zwischen verschiedenen Isolaten ausgetauscht werden, deshalb können sich einzelne

1 Einleitung

5

Staphylokokken-Stämme genetisch stark unterscheiden. Dennoch werden Superantigen-

kodierende MGE nicht zufällig verteilt, sondern sind stark an den genetischen Hintergrund

der Isolate geknüpft, d.h. jede klonale Linie ist durch ein typisches Superantigen-Gen-

Repertoire charakterisiert [28].

1.2.3 Antibiotikaresistenzen

Beinahe so schnell, wie im letzten Jahrhundert die Antibiotika-Entwicklung ihren Lauf nahm,

hielt S. aureus mit ihr durch die Ausbildung von Resistenzen Schritt. So waren mit dem

Aufkommen der ersten Antibiotika in den 1940er Jahren S. aureus-Stämme noch Penicillin-

sensitiv, inzwischen exprimieren über 80 % der Stämme eine Penicillinase und sind somit

resistent. Seit den 1960er Jahren traten zudem kurz nach Einführung des Methicillins erste

Methicillin-resistente S. aureus (MRSA)-Stämme auf, die gegen die ganze Breite der β-

Lactamantibiotika resistent sind (kodiert durch das mecA-Gen). Zunehmend muss daher auf

Reserveantibiotika wie Vancomycin, Linezolid oder Daptomycin [29] zurückgegriffen

werden. Seit einigen Jahrzehnten sind MRSA-Stämme, sei es als Besiedler oder

Infektionserreger, in Krankenhäusern und Pflegeeinrichtungen weit verbreitet (sogenannter

health care-associated, HA-MRSA). In Deutschland liegt die MRSA-Prävalenz bei 25 %.

Damit liegt Deutschland in Europa im Mittelfeld, in Skandinavien betragen die Raten 1 bis

5 %, in südeuropäischen Staaten 30 bis 50 %. In Ostasien (Sri Lanka, Südkorea, Vietnam)

wurden sogar MRSA-Raten von bis zu 86 % dokumentiert [30]. Die starken Unterschiede

sind am ehesten mit den unterschiedlichen Verordnungsstrategien bzw. der freiverkäuflichen

Verfügbarkeit von Antibiotika und den verschiedenen Screening- und Isolierungsmaßnahmen

von MRSA-positiven Patienten in Krankenhäusern und Pflegeeinrichtungen zu begründen.

Vor allem in den USA wurden seit 2002 auch schon Fälle von Vancomycin-resistenten

S. aureus (VRSA)-Stämmen bekannt [31], so dass die therapeutischen Möglichkeiten

zunehmend schrumpfen.

1.2.4 Community-associated-MRSA – eine neue Bedrohung

Für Gesunde spielt S. aureus als Krankheitserreger eher eine untergeordnete Rolle. In den

letzten Jahren kamen allerdings neue klonale Linien besonders virulenter Staphylokokken auf,

die eine Methicillin-Resistenz und meist auch das porenbildende Toxin Panton-Valentine-

Leukocidin (PVL) besitzen und bei völlig Gesunden schwere, oft nekrotisierende Haut- und

Weichteilinfektionen oder Pneumonien auslösen. Diese klonalen Linien werden in

Abgrenzung zu den bisher bekannten, auf nosokomiale Infektionen beschränkten HA-MRSA-

Stämmen CA (community-associated)-MRSA-Stämme genannt [32]. Infektionen treten vor

1 Einleitung

6

allem bei engem Körperkontakt, schlechten hygienischen Bedingungen und gemeinsamer

Benutzung von Hygieneutensilien auf [33]. Wichtige CA-MRSA-Stämme sind die Linien

USA300 und USA400, so benannt, weil Ausbrüche erstmals in den USA dokumentiert

wurden und sie dort stärker verbreitet sind als in Europa [32]. In den USA entwickelte sich

CA-MRSA zu dem häufigsten Erreger von schweren Hautinfektionen, die in der

Notaufnahme vorgestellt werden mussten [34]. In Deutschland ist CA-MRSA bisher nicht

endemisch [35].

1.2.5 Virulenzfaktoren

Um zum Pathogen zu werden, muss S. aureus invasiv werden. Die wichtigsten Gegner von

S. aureus sind die neutrophilen Granulozyten, daher verwundert es auch nicht, dass viele

Virulenzfaktoren der Staphylokokken speziell auf Abwehrmechanismen der Neutrophilen

abzielen. Durch Blockierung von Adhäsionsmolekülen am Endothel wird die Diapedese der

Neutrophilen erschwert [36]. Eine Polysaccharidkapsel schützt vor Phagozytose [37],

Immunglobulin-bindende Moleküle wie Protein A (SpA) vor Opsonierung [38]. Außerdem

hat S. aureus Strategien entwickelt, um das Komplementsystem [39] und die Chemotaxis der

Neutrophilen [40] zu unterwandern oder antimikrobielle Peptide der Neutrophilen, wie die α-

Defensine [41] zu inaktivieren. Antioxidative Moleküle schützen vor der Schädigung durch

ROS der Neutrophilen [42, 43].

Verschiedene Moleküle erleichtern dann die Etablierung im menschlichen Körper, indem sie

an Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) adhärieren (sog. microbial surface

components recognizing adhesive matrix molecules, MSCRAMMs): S. aureus hat spezifische

Rezeptoren für Fibrinogen (Clumping factor u.a.), Fibronektin (Fibronektin-bindendes Protein

(FnbpA und -B)) und viele andere ECM-Bestandteile [44].

Eine Reihe an Toxinen lysieren Blutzellen (α-Hämolysin [45], phenol-soluble modulins [46],

PVL [47]) oder schädigen enzymatisch Zell-Zell-Kontakte der Epidermis [48].

Außerdem produziert S. aureus Superantigene, das sind Antigene, die nicht über den

gewöhnlichen Weg prozessiert und präsentiert werden, sondern direkt den T-Zell-Rezeptor

einer T-Zell-Subpopulation und das MHCII-Molekül professioneller antigenpräsentierender

Zellen kreuzvernetzen und zur sofortigen polyklonalen Aktivierung der T-Zellen führen.

Dabei bindet das Superantigen außerhalb der Antigen-Bindungsstelle an die Vβ-Domäne des

Rezeptors. Diese Peptidvariante tragen 5 bis 20 % der T-Zellen, so dass es zu einer starken

proinflammatorischen Antwort mit massiver Zytokinausschüttung und daraus resultierend

zum Kreislaufschock kommt. Als Superantigene wirken das Toxische Schock-Syndrom-

1 Einleitung

7

Toxin, TSST-1, und die staphylokokkalen Enterotoxine (SE), u.a. verantwortlich für schwere

Lebensmittelvergiftungen [49].

Staphylokokken können intrazellulär, z.B. in Leukozyten und Endothelzellen, persistieren,

indem sie aus Phagosomen entkommen und sich in Vakuolen abkapseln [50]. So sind sie vor

dem Immunsystem versteckt. Intrazelluläre Persistenz ist ein Faktor für die Chronifizierung

von S. aureus-Infektionen [51].

Die Expression der verschiedenen Virulenzfaktoren wird abhängig von der Wachstumsphase

reguliert, am wichtigsten ist hier das accessory gene regulator (agr)-System: Über quorum

sensing, einer Kommunikationform zwischen Bakterienzellen, um die Populationsdichte zu

erfassen, werden bei steigender Bakteriendichte (Erreichen der stationären Wachstumsphase)

zahlreiche membrangebundene Moleküle, so z.B. die MSCRAMMs, vermindert exprimiert

und sezernierte Virulenzfaktoren, wie Toxine, verstärkt exprimiert [52].

Daher wurden in dieser Arbeit S. aureus-Sekretionsprodukte aus der frühen (logarithmischen)

und der späten (stationären) Wachstumsphase eingesetzt, um verschiedene Expressionsmuster

zu erfassen.

1.2.6 Panton-Valentine-Leukocidin: Das rätselhafte Toxin

Im Jahr 1932 publizierten Sir Philip Noel Panton und Francis Valentine einen Bericht über ein

Molekül von S. aureus, das humane Leukozyten lysiert und mit schweren Hautinfektionen

assoziiert ist [53]. Es wurde später nach den Entdeckern Panton-Valentine-Leukocidin (PVL)

genannt.

PVL besteht aus zwei Komponenten, den Polypeptiden LukF-PV und LukS-PV, die jeweils

allein keine zytolytische Wirkung haben. Dimerisieren die beiden Komponenten allerdings,

bilden sie eine oktamere β-Faltblatt-Struktur, die in Zellmembranen eine Pore bildet [45].

PVL ist dabei hochspezifisch und wirkt in geringen Konzentrationen nur an neutrophilen

Granulozyten vom Mensch und vom Kaninchen porenformend [47]. Ein Rezeptor an den

Zielzellen ist bisher jedoch nicht bekannt [54].

Je höher die PVL-Konzentration und damit die porenbildende Wirkung, desto verheerender

der Effekt: In niedrigen Konzentrationen bewirkt PVL zunächst eine proinflammatorische

Aktivierung der Zielzellen [47, 55], bei entsprechender Membranschädigung gehen die Zellen

dann in Apoptose bzw. werden bei völligem Verlust der Membranintegrität nekrotisch [55].

Die Gene lukF-PV, lukS-PV sind im lukPV-operon auf einem Prophagen [56]codiert. Ca. 2 %

aller S. aureus-Isolate tragen die Gene für das Toxin [57]. Neben PVL sind noch weitere

1 Einleitung

8

Zwei-Komponenten-Leukotoxine bei S. aureus bekannt, für die bisher keine klinische

Relevanz nachgewiesen wurde [58].

Im klinischen Kontext fiel wiederholt auf, dass PVL epidemiologisch mit schweren Haut- und

Weichteilinfektionen (Furunkulose) und nekrotisierenden Pneumonien assoziiert ist [59-63].

Bei den betroffenen Patienten mit Hautinfektionen sind besonders die Haarbälge betroffen:

Bei einer oberflächlichen Entzündung derselben spricht man von einer Follikulitis; diese kann

sich jedoch bis zur Entstehung von Furunkeln, einer eitrigen Entzündung der tiefen

Haarbalganteile, ausweiten. Konfluieren mehrere Furunkel, bildet sich ein Karbunkel. Oft

entstehen in Folge dessen entzündliche Gewebseinschmelzungen mit einer Eiterabkapselung,

man spricht dann von einem Abszess [64]. Abszesse sind für die antibiotische Therapie

schwer zugänglich, sie rezidivieren bzw. chronifizieren häufig [65].

Besonders die seit einigen Jahren aufkommenden Infektionen mit CA-MRSA-Stämmen, die

überproportional häufig die Gene für PVL (lukPV) exprimieren, verursachen schlimme

Krankheitsverläufe [32].

In in vitro-Arbeiten mit humanen neutrophilen Granulozyten konnte bestätigt werden, dass

lukPV-positive Isolate eine stärkere Zelllyse auslösten [47]. Auch im Pneumonie-Modell im

Kaninchen zeigte sich bei Infektion mit lukPV-positiven Isolaten eine stärkere

Gewebsschädigung, Neutrophilen-Infiltration und letztendlich Mortalität der Tiere [66].

Ein starker Effekt von PVL auf murine Neutrophile ist in vitro nicht nachgewiesen [47],

trotzdem belegen einige Studien ein schwereres Krankheitsbild bei Infektion mit lukPV-

positiven Stämmen im Mausmodell [67-69]; die Datenlage hierzu ist allerdings

widersprüchlich [70, 71].

Ob PVL entscheidend zur Pathogenese von nekrotisierenden Infektionen und den zunehmend

aufkommenden CA-MRSA-Infektionen beiträgt, ist noch nicht eindeutig geklärt [72-77].

1.2.7 Zelltod von neutrophilen Granulozyten durch S. aureus

Wie bereits erläutert, verfügt S. aureus über zahlreiche Strategien, um Abwehrmechanismen

der neutrophilen Granulozyten zu inaktivieren oder auch die Zellen zu schädigen bis hin zur

Zelltodinduktion. Gleichzeitig ist der rasche, programmierte Zelltod der Neutrophilen nach

Erfüllung der Abwehrfunktionen auch ein physiologisches Prinzip des Immunsystems.

Da in dieser Arbeit besonders die Zelltodinduktion von neutrophilen Granulozyten durch

S. aureus beleuchtet werden soll, wird im Folgenden ein Überblick über die bisher

untersuchten Zelltodphänomene von Neutrophilen in Interaktion mit S. aureus dargestellt.

1 Einleitung

Die Phagozytose von S. aureus

Aktivierungsprozessen induziert die Apoptose bei Neutrophilen

charakterisiert durch Caspase-

Auch Autophagie der Neutrophilen, also der Abbau der eigenen Zellorganellen mit Bildung

kleiner Vakuolen, wurde nach Phagozytose beobachtet

programmierte Nekrose der Neutrophilen beschrieben, eine Caspase

Autophagie-ähnliche Vakuolisierung der Zellen

Neutrophilen wie ROS oder destruierende Enzyme

vitale Infektionserreger sind so sicher verpackt und werden von Makrophagen abgeräumt.

Neben diesen Zelltodformen der Neutrophilen ist in der Interaktion mit

NETose [14] bekannt, also die Freisetzung des Zellinhalts, um Mikroorganismen einzufangen

und abzutöten.

Bei starker Schädigung der Neutrophilen, wenn z.B. durch Membranschäden die osmotische

Balance nicht mehr reguliert werden kann oder schwere DNA

Nekrose induziert.

Die Morphologie der drei wichtigsten Zelltodformen, Apoptose, Nekrose und NETose, die

auch in dieser Arbeit untersucht werden, ist in Abb. 2 dargestellt.

Abb. 2: Zelltodmorphologie von neutrophilen GrTransmissionselektronenmikroskopie:und löst sich in apoptotische Körperchen auf (a). Bei der Nekrose dagegen schwillt die Zelle an, die

DNA bleibt dekondensiert, die Membranen lös

Während der NETose löst sich die Kernmembran auf, DNA und Zytoplasmabestandteile vermischen

sich und werden anschließend in Form von NETs freigesetzt (c). Aus: Fuchs

Cell Biology [14]

9

aureus bzw. die ROS-Freisetzung in Folge von

Aktivierungsprozessen induziert die Apoptose bei Neutrophilen [78, 79]. Die Apoptose ist

-Aktivierung und Abschnürung apoptotischer Körperchen


kleiner Vakuolen, wurde nach Phagozytose beobachtet [81]. Zudem wurde eine

programmierte Nekrose der Neutrophilen beschrieben, eine Caspase-unabhängige,

ähnliche Vakuolisierung der Zellen [82]. Aggressive Substanzen der

Neutrophilen wie ROS oder destruierende Enzyme sowie phagozytierte, möglicherweise noch


Neben diesen Zelltodformen der Neutrophilen ist in der Interaktion mit S. aureus

bekannt, also die Freisetzung des Zellinhalts, um Mikroorganismen einzufangen


Balance nicht mehr reguliert werden kann oder schwere DNA-Schäden vorliegen


auch in dieser Arbeit untersucht werden, ist in Abb. 2 dargestellt.

Zelltodmorphologie von neutrophilen Granulozyten in der Transmissionselektronenmikroskopie: Bei der Apoptose kondensiert die DNA, die Zelle schrumpft

und löst sich in apoptotische Körperchen auf (a). Bei der Nekrose dagegen schwillt die Zelle an, die

DNA bleibt dekondensiert, die Membranen lösen sich auf, so dass der Zellinhalt freigesetzt wird (b).


sich und werden anschließend in Form von NETs freigesetzt (c). Aus: Fuchs et al.

. Die Apoptose ist

Aktivierung und Abschnürung apoptotischer Körperchen [80].


. Zudem wurde eine

unabhängige,

. Aggressive Substanzen der

sowie phagozytierte, möglicherweise noch


aureus auch die

bekannt, also die Freisetzung des Zellinhalts, um Mikroorganismen einzufangen


Schäden vorliegen, wird die


Bei der Apoptose kondensiert die DNA, die Zelle schrumpft

und löst sich in apoptotische Körperchen auf (a). Bei der Nekrose dagegen schwillt die Zelle an, die

en sich auf, so dass der Zellinhalt freigesetzt wird (b).


et al., 2007, Journal of

1 Einleitung

10

1.3 Ziele der Arbeit

Gegenstand dieser Arbeit ist die Charakterisierung des Zelltodverhaltens von neutrophilen

Granulozyten in Interaktion mit Staphylococcus (S.) aureus. Dabei sollen besonders klinische

S. aureus-Isolate von Patienten mit einer Furunkulose-Infektion hinsichtlich ihrer Fähigkeit,

bei Neutrophilen Apoptose, Nekrose bzw. NETose zu induzieren, untersucht werden; als

Vergleich sollen klinische Isolate aus nasaler Besiedlung in die Studie miteinbezogen werden.

Ziele dieser Arbeit sind es daher,

(1) Effekte von S. aureus-Sekretionsprodukten (Kulturüberstände, rekombinantes PVL),

klinischen S. aureus-Isolaten und ganzer Bakterienzellen auf das Zelltodverhalten von

humanen neutrophilen Granulozyten zu analysieren

(2) klinische Isolate aus nasaler Besiedlung und aus Furunkuloseinfektion hinsichtlich

ihrer Zelltodinduktion bei Neutrophilen zu vergleichen.

Damit soll diese Arbeit einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Rolle des Zelltods von

Neutrophilen in der S. aureus-Infektion im Allgemeinen und speziell in der

Furunkuloseinfektion leisten.

2 Material

11

2 Material

2.1 Geräte

Agarose-Gelelektrophoresekammer OWL Separation Systems, Portsmouth,

USA

Bakterienschüttler New Brunswick Scientific, Edison, NJ,

USA und Sartorius, Göttingen

Bürker-Zählkammer Laboroptik, Friedrichsdorf

Digitalkamera Visitron Systems, Puchheim

Durchflusszytometer FACS Canto II Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ,

USA

Fluorometer Varioskan Flash Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,

USA

Laufkammer Mini-PROTEAN Dodeca Cell BioRad, München

LumiImager Roche applied science, Mannheim

Mikroskope

Lichtmikroskop Carl Zeiss, Jena

inverses Lichtmikroskop Hund, Wetzlar

Fluoreszenzmikroskop Imager.A1 Carl Zeiss, Jena

Multi Gel Gießkammer BioRad, München

Nanodrop 2000 Spektrophotometer Thermo Scientific, Waltham, MA, USA

Neubauer improved Petroff-Zählkammer Marienfeld, Lauda-Königshofen

PCR-Gradientencycler Biometra, Göttingen

Short Plates, Mini Protean 3 BioRad, München

Spacer Plates, Mini Protean 3, 1,0 mm BioRad, München

Stromversorgungsgerät Power Pac 200 und 300 BioRad, München

UV-Lampe mit Digitalkamera MWG-Biotech, Ebersberg

UV-Photometer Biometra, Göttingen

UV-Tisch Fluolink, Cambridge, EnglandZentrifugen

Megafuge 1.0 / 1.0R Haereus Instruments, Hanau

Biofuge fresco Haereus Instruments, Hanau

2 Material

12

2.2 Verbrauchsmaterial

Columbia-Blutagarplatten BD, Heidelberg

Deckgläschen R. Langenbrinck, Teningen

Einmalküvetten Roth, Karlsruhe

FACS-Röhrchen BD, Heidelberg

Glasflaschen 500 ml Schott AG, Mainz

Glaskolben 200 ml und 500 ml Schott AG, Mainz

Kimtech-Papier Kimberly-Clark, Koblenz-Rheinhafen

Kryo-Röhrchen Sarstedt, Nümbrecht

Lab-Tek® chamber slides Nunc, Roskilde, Dänemark

Mikrotiterplatten 96 Well Flachboden Greiner, Frickenhausen

Mikrotiterplatten 96 Well Maxisorp Nunc, Roskilde, Dänemark

Mikrotiterplatten 96 Well Optical Bottom, Nunc, Roskilde, Dänemark

schwarz

PCR-Reaktionsgefäße 0,2 ml Sarstedt, Nümbrecht

Pipetten Eppendorf, Hamburg

Pipettenspitzen Eppendorf, Hamburg und

Sarstedt, Nümbrecht

Pipettenspitzen, aerosol-resistent Biozym, Hessisch Oldendorf

Reaktionsgefäße 0,5, 1,5 und 2 ml Eppendorf, Hamburg und

Sarstedt, Nümbrecht

Sterilfilter, Porengröße 0,2 und 0,45 µm Sarstedt, Nümbrecht

Sterilpipetten 10 und 25 ml Sarstedt, Nümbrecht

Vacutainer® K2EDTA BD, Plymouth, England

Whatman-Papier Roth, Karlsruhe

Zentrifugenröhrchen 15 und 50 ml BD, Heidelberg, Greiner, Frickenhausen

und Sarstedt, Nümbrecht

2.3 Zellbiologische Arbeiten

Dextran Amersham / GE Healthcare, München

Dulbecco´s PBS PAA Laboratories, Pasching, Österreich

Humanes Serumalbumin 20% (HSA) Grifols, Langen

L-Glutamin PAA Laboratories, Pasching, Österreich

2 Material

13

LSM 1077 Lymphocyte Separation PAA Laboratories, Pasching, Österreich

Medium

Penicillin-Streptomycin PAA Laboratories, Pasching, Österreich

Phorbolmyristatacetat Calbiochem, La Jolla, CA, USA

RPMI-1640 Gibco, Eggenstein

steriles A. bidest., endotoxinfrei Charles River Laboratories, Charleston,

SC, USA

Sytox® Green Invitrogen, Karlsruhe

Triton X-100 Ferak, Berlin

Trypanblau-Lösung Biochrom, Berlin

2.4 Mikrobiologische Arbeiten

BHI-Medium Oxoid, Hampshire, England

Caseinhydrolysat Roth, Karlsruhe

Glyzerol AppliChem, Darmstadt

Hefeextrakt Roth, Karlsruhe

Kaliumhydrogenphosphat (KH2PO4) Merck, Darmstadt

Lysostaphin Genmedics, Reutlingen

Lysozym Sigma, Deisenhofen

Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Roth, Karlsruhe

Natriumpyruvat Roth, Karlsruhe

TSB-Medium Oxoid, Hampshire, England

2.5 Molekularbiologische Arbeiten

A. dest., DNAse- und RNAse-frei Gibco, Eggenstein

Agarose Biozym, Hessisch Oldendorf

DMSO Sigma, Deisenhofen

DNA-Größenmarker (100 bp ladder) Roth, Karlsruhe

dNTPs Roche Diagnostics, Mannheim

Ethanol Roth, Karlsruhe

GoTaq Polymerase Promega, Mannheim

Magnesiumchlorid (MgCl2) Promega, Mannheim

2 Material

14

Natrium-EDTA Sigma, Deisenhofen

Random-Primer Invitrogen, Karlsruhe und

Eurofins mwg operon, Ebersberg

RedSafe® DNA-Farbstoff iNtRON Biotechnology, Gyeonggi-do,

Korea

Tris-HCl Sigma, Deisenhofen

5x Green GoTaq Flexi Buffer Promega, Mannheim

2.6 Immunologische Arbeiten

Annexin V-Bindungspuffer Southern Biotech

Annexin V-FITC BD, Heidelberg

Anti-FITC-Kaninchen-IgG-Fraktion-Alexa 488 Invitrogen, Karlsruhe

Anti-neutrophile-Elastase-Kaninchen-pAK Calbiochem, La Jolla, CA, USA

Bovines Serumalbumin (BSA) ICN Biomedicals, Costa Mesa, CA, USA

CD3-FITC/CD19-PE Simultest® BD, Heidelberg

CD45-PerCP BD, Heidelberg

FACS Clean BD, Heidelberg

FACS Flow BD, Heidelberg

Fetales Kälberserum (FCS) Gibco, Eggenstein

Fischgelatine Sigma, Deisenhofen

Fluoroprep® bio Mérieux, Marcy l’Etoile, Frankreich

Formaldehyd 16% Polysciences, Warrington, PA, USA

Humane γ-Globuline (Cohn II-Fraktion) Sigma, Deisenhofen

Kaninchen IgG Isotyp Calbiochem, La Jolla, CA, USA

Katalase Sigma, Deisenhofen

Natriumazid Sigma, Deisenhofen

PBS Biochrom, Berlin

Propidiumiodid Sigma, Deisenhofen

Schwefelsäure (2 N H2SO4) Roth, Karlsruhe

Tween® 20 Sigma, Deisenhofen

Via-Probe® (7‘AAD) BD, Heidelberg

Ziege-anti-Kaninchen-AK-FITC BD Biosciences, Heidelberg

Ziegenserum Invitrogen, Karlsruhe

2 Material

15

4'-6-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI) Thermo Scientific, Dreieich

2.7 Proteinbiochemische Arbeiten

Acrylamide 4K solution (40 %) Mix 37,5:1 AppliChem, Darmstadt

Ammoniumperoxodisulfat (APS) Amersham Biosciences, Uppsala,

Schweden

Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4) Merck, Darmstadt

Β-Mercaptoethanol Sigma, Deisenhofen

Bromphenol-Blau Sigma, Deisenhofen

Coomassie brilliant blue G-250 Merck, Darmstadt

Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Sigma, Deisenhofen

Essigsäure Roth, Karlsruhe

Ethanol Merck, Darmstadt

Glyzerol Merck, Darmstadt

Glyzin Roth, Karlsruhe

Kaliumchlorid (KCl) Merck, Darmstadt

Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Roth, Karlsruhe

Immobilon Polyvinylidene fluoride (PVDF) Millipore, Bedford, USA

Transfermembran

Isopropanol Merck, Darmstadt

Methanol Merck, Darmstadt

Milchpulver (blotting grade) Roth, Karlsruhe

Natriumchlorid (NaCl) Roth, Karlsruhe

Natriumdodecylsulfat (SDS) Merck, Darmstadt

Natriumhydoxid (NaOH) Roth, Karlsruhe

Pelikan Tinte 4001 Pelikan, Hannover

Phosphorsäure (H3PO4) Roth, Karlsruhe

Protein MW Marker Fermentas, St. Leon-Rot

Salzsäure (HCl) Roth, Karlsruhe

SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Thermo Scientific, Rockford, USA

Substrate Kit

Tetramethylethylendiamin (TEMED) Amersham Biosciences, Uppsala,

Schweden

2 Material

16

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS-Base) Merck, Darmstadt

Tween® 20 Sigma, Deisenhofen

3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]- Sigma, Deisenhofen

1-propansulfonat (CHAPS)

2.8 Kits

DNeasy® Blood & Tissue Kit Qiagen, Hilden

Human Th1/ Th2 Cytokine Kit BD, Heidelberg

Phagoburst®-Test Orpegen Pharma, Heidelberg

2.9 Bakterienstämme, -toxine und Blutprodukte

SH1-2, SH10-1, SH15-1, SH27-1, SH39-1, S. aureus-Stämme, isoliert aus dem

SH42-1 Nasenvorhof gesunder Probanden, Institut

für Immunologie und Transfusions-

medizin, Universität Greifswald [28]

H5313, H678, H3163, H6110, H7176, H4764, S. aureus-Stämme, isoliert aus Wunden

H6754 von Furunkulose-Patienten, Institut für

Mikrobiologie und Immunologie,

pommersche medizinische Universität

(PMU) Stettin, Polen [83]

SZ275, SZ255 S. aureus-Stämme, isoliert aus dem

Nasenvorhof gesunder Probanden, Institut

für Mikrobiologie und Immunologie,

PMU Stettin, Polen [83]

LAC (USA300), TM300 WT, TM300+lukPV Bettina Löffler, Institut für medizinische

Mikrobiologie, Universität Münster [47]

USA300∆lukPV Michael Otto, Abteilung für humane

bakterielle Pathogenese, National

Institutes of Health, Hamilton, MT, USA

[47]

2 Material

17

8325-4 WT Institut für medizinische Mikrobiologie

und Infektiologie, Erasmus-Universität

Rotterdam, Niederlande

CMRSA80, CMRSA8, CMSSA1, CMRSA1 Nationales Referenzzentrum für

Staphylokokken, Robert-Koch-Institut

Wernigerode

E. coli DM5α Institut für Immunologie und

Transfusionsmedizin, Universität

Greifswald

LukF, LukS, Anti-PVL-IgG, Anti-PVL-Serum Bettina Löffler, Institut für medizinische

Mikrobiologie, Universität Münster

Humanes venöses Vollblut, Serum gesunde freiwillige SpenderInnen, Institut

für Immunologie und Transfusions-

medizin, Universität Greifswald

2.10 Datenbanken, Software

FCAP Array v1.01 (Soft Flow) Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ,

USA

FlowJo Tree Star Inc., Ashland, OR, USA

Graph Pad Prism 5.0 Graph Pad Software, La Jolla, CA, USA

ImageJ open source, entwickelt von Wayne

Rasband, National Institutes of Health

NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov

Skan It RE for Varioskan Flash Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,

USA

Spot Advanced SPOT Imaging Solutions, Sterling

Heights, MI, USA

2 Material

18

2.11 Medien, Puffer, Lösungen

Kulturmedien

optimiertes RPMI-Medium 10 ml L-Glutamin (200 mM)

50 ml HSA 20 %

ad 500 ml RPMI-Medium

bei Experimenten ohne lebende Bakterien:

10 ml Penicillin-Streptomycin

BHI-Medium 37 g

ad 1 l A. dest., 15 min autoklaviert

CCY-Medium, pH 6,7 [84] 15 g Hefeextrakt

10 g Caseinhydrolysat

11,5 g Natriumpyruvat

3,15 g Na2HPO4

0,205 g KH2PO4

ad 500 ml A. dest., 15 min autoklaviert

TSB-Medium 30 g

ad 1 l A. dest., 15 min autoklaviert

Immunologische, zellbiologische Arbeiten

Blockpuffer für Immunfluoreszenz 10 ml Ziegenserum

5 g Fischgelatine

1 g BSA

50 µl Tween® 20

200 µl Natriumazid 10 %

ad 100 ml 1x PBS

Dextranlösung 2,5 g Dextran

ad 50 ml Dulbecco´s PBS, sterilfiltriert

FACS-Puffer 20 ml FCS

200 µl Natriumazid 10 %

ad 1 l FACS Flow

2 Material

19

Trypanblau-Lösung 50 ml Trypanblau-Stammlösung

50 ml PBS

Proteinbiochemische Arbeiten

SDS-Probenpuffer, reduzierend, 5x 0,6 ml Tris-HCl 0,5 mM (pH6,8)

2 ml SDS 10 %

5 ml Glyzerol

1 ml Bromphenolblau

0,9 ml A. bidest.

500 µl β-Mercaptoethanol

SDS-Elektrophorese-Laufpuffer (10x) 30 g Tris-HCl

240 g Glyzin

83 ml SDS 20 %

ad 1 l A. dest.

Sammelgel 5% (für 1 Gel) 258 µl Acrylamid 40 %

525 µl Tris 0,5 M, pH 6,8 (0,4 % SDS)

1,3 ml A. dest.

30 µl APS 10 %

2,5 µl TEMED

Trenngel 12,5% (für 13 Gele) 37,5 ml Acrylamid 40 %

30 ml Tris 1,5 M, pH 8,8 (0,4 % SDS)

52 ml A. dest.

600 µl APS 10 %

30 µl TEMED

Coomassie brilliant blue solution 50 g Coomassie brilliant blue G-250

(CBB stock) ad 1 l A.dest.

Colloidal coomassie staining solution 83 g (NH4)2SO4

(CCD stock) 9,6 ml H3PO4 (80 %)

17 ml CBB stock

ad 1 l A.dest.

2 Material

20

Colloidal coomassie solution 250 ml Methanol (100 %)

750 ml CCD stock

Coomassie-Fixierungslösung 400 ml Ethanol

100 ml Essigsäure

ad 1 l A. dest.

PBS pH 7,4 (1x) 8 g NaCl

0,2 g KCl

1,44 g Na2HPO4

0,24 g KH2PO4

ad 1 l A.dest.

PBS/T (1x) 1 ml Tween® 20

ad 1 l 1x PBS

TBS pH 7,6 (10 x) 24,2 g Tris

80 g NaCl

ad 1 l A.dest.

TBS/T (1x) 1 ml Tween® 20

ad 1 l 1x TBS

Blockpuffer für Western Blot 50 g Milchpulver

ad 1 l TBS/T

Transfer-Puffer pH 8,5 (1x) 3,025 g Tris

15 g Glyzin

200 ml Methanol

ad 1 l A.dest.

pH 8,5 mit HCl einstellen

Tintenfärbelösung 10 µl Pelikan Tinte

10 ml Essigsäure

90 ml PBS/T

2 Material

21

Substratlösung 15 ml Super Signal West Femto Luminol /

Enhancer Solution

15 ml Super Signal West Femto Stable

Peroxide Buffer

Tab. 1: Bestandteile und deren molekulare Masse und isoelektrischer Punkt des Protein-MW-Markers. Der Größenmarker wurde in den Proteingelen (SDS-PAGE) benutzt.

kDa Bestandteil pI-Wert

116 β – Galactosidase (E. coli) 5,28

66,2 BSA 5,60

45 Ovalbumin 5,19

35 LDH (Schweinemuskel) 8,22

25 REase Bsp98I (E. coli) 6,08

18,4 β - Lactoglobulin 4,83

14,4 Lysozym (Hühnereiweiß) 9,2

Tab. 2: Übersicht über die verwendeten DNA-Primer in der multiplex-PCR. Angegeben sind

zudem die Nukleotidsequenz, Größe und Literaturvermerk.

Name Gen Sequenz Größe (bp) Referenz

SmecA-1 mecA GTG AAG ATA TAC CAA GTG ATT 21 [85]

SmecA-2 ATG CGC TAT AGA TTG AAA GGA T 22

smw1409-1 MW1409 CAA ATT TTG AAA ACT TTA CGC 21 [86]

smw1409-2 TCC AGG ATT AAA AGA AGC G 19

Snuc-1 nuc GCG ATT GAT GGT GAT ACG GTT 21 [87]

Snuc-2 AGC CAA GCC TTG ACG AAC TAA AGC 24

Smw756-1 MW765 TGG TTA GCT ATG AAT GTA GTT GC 23 [86]

Smw756-2 GTC CAT CCT CTG TAA ATT TTG C 22

SarcA-1 arcA GCA GCA GAA TCT ATT ACT GAG CC 23 [86]

SarcA-2 TGC TAA CTT TTC TAT TGC TTG AGC 24

16SrRNA-1 16SrRNA AAC TCT GTT ATT AGG GAA GAA CA 23 [87]

16SrRNA-1 CCA CCT TCC TCC GGT TTG TCA CC 23

Sseh-1 seh CAA CTG CTG ATT TAG CTC AG 20 [88]

Sseh-2 GTC GAA TGA GTA ATC TCT AGG 21

Setd-1 etd CCC GTT GAT TAG TCA TGC AG 20 [88]

Setd-2 TCC AGA ATT TCC CGA CTC AG 20

Spvl-1 lukPV ATC ATT AGG TAA AAT GTC TGG ACA TGA TCC A 31 [88]

Spvl-2 GCA TCA A(G/C=S)T GTA TTG GAT AGC AAA AGC 27

Sgyr-1 gyr AGT ACA TCG TCG TAT ACT ATA TGG 24 [28]

Sgyr-2 ATC ACG TAA CAG TTC AAG TGT G 22

3 Methoden

22

3 Methoden

3.1 Zellbiologische Methoden

3.1.1 Isolation von Neutrophilen

Frisches mit EDTA antikoaguliertes Blut wurde mit 0,25 ml Dextranlösung je ml Blut

versetzt, mehrmals invertiert und 30 min bei 37°C inkubiert.

Anschließend wurde das Dextranplasma mit den enthaltenden Leukozyten von den

sedimentierten Erythrozyten abgenommen und vorsichtig auf das gleiche Volumen Ficoll

überschichtet. Die Zellen wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation 20 min bei 300 g

ohne Bremse separiert.

Der Überstand und der PBMC-Ring wurden abgenommen, das Pellet enthält die Neutrophilen

und restliche Erythrozyten. Diese wurden mit A. bidest. lysiert und das Pellet wurde dreimal

mit PBS gewaschen (Zentrifugation für 5 min bei 410 g).

Die Zellen wurden in Medium aufgenommen und ein kleines Volumen wurde zur Vitalitäts-

und Zellzahlbestimmung mit Trypanblau verwendet. Anschließend wurden die Zellen in

Medium auf die gewünschte Konzentration eingestellt.

3.1.2 Vitalitäts- und Zellzahlbestimmung der Neutrophilen

Trypanblau färbt Proteine an, ist jedoch nicht membrangängig. Vitale Zellen bleiben daher

ungefärbt, während durch den Verlust der Membranintegrität tote Zellen blau angefärbt

werden. Die Zellvitalität wird über das Verhältnis lebender zu toter Zellen ermittelt.

Die Zellen wurden 1:10 in Trypanblau-Lösung verdünnt und in der Bürker-Kammer gezählt.

Für die Zellkonzentration gilt folgende Rechnung:

gezählte Zellzahl in 25 Kleinquadraten x 104 x Verdünnungsfaktor = Zellzahl/ml

3.1.3 Sytox-Assay

Der Sytox®-Farbstoff interkaliert in DNA, ist aber nicht membrangängig. Daher wird nur

extrazelluläre DNA detektiert. So kann der Zelltod über den Zeitverlauf erfasst werden. Die

Messung erfolgte an einem fluorometrischen Mikrotiterplatten-Lesegerät. Es wurden

schwarze 96-Well-Mikrotiterplatten verwendet, da diese eine niedrige Eigenfluoreszenz

aufweisen. Die Einführung in diese Methode wurde freundlicherweise durch Volker

Brinkmann vom Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie in Berlin ermöglicht [89].

3 Methoden

23

Je Well wurden 105 Neutrophile in 100 µl Kulturvolumen (optimiertes RPMI) eingesät und

mit den entsprechenden bakteriellen Stimulanzien bei 37°C inkubiert. PMA als NETose-

Kontrolle wurde mit einer Endkonzentration von 50 nM je Well eingesetzt, Triton als

Nekrose-Kontrolle mit 0,1 % (v/v). Als Negativkontrolle dienten unstimulierte Neutrophile,

um den natürlichen Apoptoseverlauf zu erfassen. Alle Stimulanzien wurden in optimiertem

RPMI verdünnt und mit einem Volumen von 80 µl eingesetzt. Es wurden

Triplettbestimmungen durchgeführt.

Vor der ersten Messung wurden 20 µl Sytox® Green in einer Endkonzentration von 1,25 µM

zugegeben. Das Endvolumen betrug 200 µl pro Well.

Am Fluorometer wurde mit Hilfe der Skan It RE-Software die Fluoreszenz bei einer

Extinktion von 485 nm und einer Emission von 538 nm gemessen.

Die detektierte relative DNA-Menge wurde in relative fluorescence units (RFU) angegeben.

3.2 Mikrobiologische Methoden

3.2.1 Kultivierung von S. aureus

Staphylokokken wurden auf Blutagar-Platten ausgestrichen und 12-24 h bei 37°C kultiviert.

Mit einer Einzelkolonie wurde eine 3 ml-TSB-Kultur in einem 15 ml-Falcon angeimpft und

ca. 2 h bei 37°C, 200 rpm und ausreichender Sauerstoffversorgung bis zum Erreichen der

logarithmischen Wachstumsphase (OD595 nm = 0,5) zirkulär geschüttelt. Diese Bakterienkultur

wurde für die folgenden Methoden weiterverwendet.

3.2.2 Gewinnung von S. aureus-Kulturüberstand

Aus einer 3 ml-Vorkultur wurde die Hauptkultur mit OD595 nm = 0,1-0,5 angeimpft. Die

Kolben wurden mit einem Zehntel bis einem Fünftel des Kolbenvolumens befüllt, um eine

optimale Sauerstoffversorgung zu gewährleisten. Innerhalb eines Versuchs wurden immer die

gleichen Kolbengrößen und Volumina eingesetzt. Die Bakterienkulturen wurden bis zu den

gewünschten ODs geschüttelt, welche UV-photometrisch bei 595 nm überprüft wurden. Das

Bakterienwachstum und dementsprechend die OD-Werte, die in der logarithmischen bzw.

stationären Phase erreicht wurden, hängen vom Nährstoffgehalt des eingesetzten

Kultivierungsmediums ab.

Zur Gewinnung der Überstände wurden 3-4 ml der Kultur 3 min bei 16.060 g zentrifugiert,

der Überstand abgenommen, sterilfiltriert und bei -20°C gelagert.

3 Methoden

24

3.2.3 Vorbereitung von S. aureus für Neutrophilen-Versuche

Eine 3 ml-TSB-Kultur wurde bis zum Erreichen der logarithmischen Phase geschüttelt und

die OD UV-photometrisch bei 595 nm bestimmt. 1 ml der Kultur wurde abgenommen und 3

min bei 16.060 g zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Pellet zweimal mit

sterilem PBS gewaschen. Die Bakterien wurden durch Korrelation mit der OD auf die

gewünschte Zellzahl in Zellkulturmedium (optimiertes RPMI) eingestellt, dabei gilt für TSB-

Kulturen: OD = 1 entspricht 6,5 x 108 Bakterien/ml Kultur. Dieser Zusammenhang wurde in

Vorversuchen, in denen Bakterien verschiedener Kultur-ODs mikroskopisch in einer

Neubauer improved Petroff-Zählkammer gezählt wurden, festgestellt.

3.2.4 Anlegen von Glyzerolstocks

Die Bakterien wurden in einer 3 ml-TSB-Kultur bis zum Erreichen der stationären Phase

geschüttelt. 800 µl Kultur und 200 µl steril filtriertes 70 % Glyzerol wurden in ein

Kryoröhrchen überführt, gut gemischt und bei -80°C gelagert.

3.2.5 Gewinnung von Bakterienpellets

Die Bakterien wurden in einer 3 ml-TSB-Kultur bis zum Erreichen der stationären Phase

geschüttelt. 2 ml Kultur wurden abgenommen und 3 min bei 16.060 g zentrifugiert. Der

Überstand wurde dekantiert und das Pellet bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert.

3.3 Molekularbiologische Methoden

Alle Arbeiten mit DNA wurden mit Aerosol-resistenten Filterspitzen durchgeführt.

3.3.1 DNA-Isolation aus S. aureus

Zu Isolation der genomischen DNA aus S. aureus wurde das DNeasy® Blood & Tissue-Kit

von Qiagen verwendet. Um die Staphylokokken zu lysieren, wurde das Zellpellet mit 180 µl

enzymatischen Lysepuffer (20 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM Natrium-EDTA, 1,2 % Triton, 20

mg/ml Lysozym, 220 µg/ml Lysostaphin) resuspendiert und 30 min bei 37°C inkubiert. Alle

weiteren Schritte wurden entsprechend den Herstellerangaben durchgeführt.

Mit Hilfe des Nanodrop-Geräts (Peqlab) wurde bei 260 und 280 nm die OD der DNA-Lösung

und die DNA-Konzentration gemessen. Der Quotient OD260 nm/OD280 nm gibt eine Aussage

über die Reinheit der DNA-Probe. Liegt das Verhältnis zwischen 1,8 und 2,0 handelt es sich

3 Methoden

25

um reine DNA. Bei Werten unter 1,8 bzw. über 2,0 handelt es sich Kontaminationen mit

Proteinen bzw. mit organischen Lösungsmitteln.

3.3.2 Multiplex-Polymerasekettenreaktion

Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) können in vitro bestimmte Gene oder

Genabschnitte selektiv amplifiziert werden. Einzelsträngige DNA dient dabei als Matrize für

die Synthese neuer komplementärer DNA-Stränge durch die bakterielle hitzestabile Taq-

Polymerase. Die benötigten freien 3´-Hydroxylgruppen werden von Primern geliefert, die als

komplementäre Oligonukleotide an flankierende Sequenzen des gewünschten DNA-

Abschnitts binden. Bei der Multiplex-PCR werden durch Kombination geeigneter Primer

mehrere DNA-Abschnitte in einem Ansatz nachgewiesen (Primersequenzen s. Tab. 2).

Hier wurden verschiedene Virulenzgene und stammspezifische Marker von S. aureus in zwei

Multiplex-PCRs detektiert.

Genomische DNA der zu untersuchenden S. aureus-Stämme wurde auf eine Konzentration

zwischen 10-20 ng/µl eingestellt. Von diesen Verdünnungen wurde pro Ansatz 1 µl zu 24 µl

Mastermix gegeben.

Als Positivkontrolle wurde eine DNA-Mischung verschiedener S. aureus-Referenzstämme

des nationalen Referenzzentrums für Staphylokokken (Wernigerode) verwendet (s. Tab. 4),

als Negativkontrolle DNA des S. aureus-Stammes 8325-4 und von E. coli. Um DNA-

Kontaminationen auszuschließen, wurde außerdem ein Mastermix-Ansatz ohne DNA

mitgeführt.

Tab. 3: Zusammensetzung der PCR-Ansätze Angegeben sind µl. Außer seh mit 10µM wurden alle

Primer 5 µM eingesetzt.

I II

A. bidest 3,30 0,30

5x Green GoTaq Flexi Buffer

5,00

5,00

dNTPs (1mM) 2,50 2,50

MgCl2 5,00

5,00

Primer mecA 1/2 1,00 MW1409 1/2 0,75

gyr 1/2 1,00 seh 1/2 2,00

MW756 1/2 0,75 aecA 1/2 0,75

PVL 1/2 0,75 etd 1/2 1,00

16srRNA 1/2 0,50 nuc 1/2 1,00

Taq-Polymerase (5 U/ml) 0,20 0,20

3 Methoden

26

Folgende PCR-Bedingungen wurden für die Amplifikation verwendet:

1. Initiale Denaturierung: 95°C 5 min

2. Denaturierung: 95°C 30 s

3. Hybridisierung: 60°C 30 s

4. Elongation: 72°C 1 min

5. Finale Elongation: 72°C 7 min

6. Lagerung 4°C ∞

26 Zyklen (2. – 4.)

Tab. 4: Übersicht über die Referenzstämme der Positivkontrolle der Multiplex-PCR. Angegeben

sind zudem die Stamm-Nr. des Robert-Koch-Instituts (RKI) und das Vorkommen der PCR-relevanten

Gene.

interne Stamm-Nr. RKI-Stamm-Nr. PCR-relevante Gene

CMRSA80 06-00300 lukPV, etd, mecA

CMRSA8 06-01127 lukPV, arcA, mecA, MW1409

CMSSA1 05-01290 lukPV, seh

CMRSA1 07-00814 MW756, mecA

3.3.3 Agarosegelelektrophorese

Die Auswertung der PCR-Ergebnisse erfolgte durch die Agarosegelelektrophorese. Durch

Anlegen einer äußeren Spannung können DNA-Moleküle im Agarosegel aufgetrennt werden,

da sie in Abhängigkeit von ihrer molekularen Masse unterschiedlich schnell durch das

Netzwerk der polymerisierten Agarose wandern.

In dieser Arbeit wurden 1,5 %ige Gele verwendet. Die Agarose wurde in TBE-Puffer durch

Aufkochen gelöst, nach kurzem Abkühlen mit RedSafe® (1:10.000), einem fluoreszierenden

DNA-Farbstoff versetzt und in eine Gelkammer zum Aushärten gegossen. Pro Tasche wurden

anschließend 10 µl des PCR-Produkts geladen.

Die Detektion der DNA-Banden erfolgte nach der Auftrennung unter UV-Licht, das

RedSafe® zur Fluoreszenz anregt.

3 Methoden

27

3.4 Immunologische Methoden

3.4.1 Immunfluoreszenzfärbung zur Darstellung von NETs

NETs bestehen größtenteils aus DNA und Bestandteilen der Granula der Neutrophilen. Diese

Komponenten werden zur Anfärbung der NETs genutzt. Hier wird DNA und neutrophile

Elastase (NE), ein Granulabestandteil, in der Immunfluoreszenzfärbung dargestellt. Die

Einführung in diese Methode wurde freundlicherweise durch Volker Brinkmann vom Max-

Planck-Institut für Infektionsbiologie in Berlin ermöglicht [89].

105 Neutrophilen pro Well wurden in chamber slides® eingesät, die Zellstimulation und die

eingesetzten Volumina entsprachen dem Vorgehen für den Sytox-Assay. Statt Sytox® Green

wurden 20 µl Zellkulturmedium (optimiertes RPMI) zugegeben.

Zum Abstoppen der Inkubation wurden die Zellen mit 2 % Formaldehyd fixiert.

Anschließend wurde vorsichtig die Flüssigkeit abgenommen und die Kammer abgehoben.

Der Objektträger wurde dreimal mit 1x PBS in Glasküvetten gewaschen.

Zur Permeabilisierung wurden die Zellen für 1 min mit 0,5 % Triton behandelt und danach

wieder gewaschen.

Nun wurde zur Blockierung unspezifischer Bindungsstellen 40 µl Blockpuffer je Well

aufgetragen und 30 min in einer feuchten Kammer bei 37°C inkubiert.

Der Blockpuffer wurde entfernt und anschließend wurden als Primärantikörper (-AK) der

Anti-neutrophile-Elastase-Kaninchen-AK bzw. Kaninchen IgG Isotyp (je 10 µg/ml)

zugegeben und üN bei 4°C inkubiert. Alle Färbereagenzien wurden in Blockpuffer verdünnt

und es wurden immer 40 µl/Well aufgetragen.

Danach wurde gewaschen, als Sekundär-AK der Ziege-anti-Kaninchen-AK-FITC (5 µg/ml)

aufgetragen und 30 min bei 37°C im Dunkeln inkubiert.

Nach erneutem Waschen wurden anschließend die Tertiärreagenzien zugegeben. Zur DNA-

Färbung wurde Propidiumiodid (50 ng/ml) verwendet, zur Farbverstärkung des FITC-

markierten Sekundär-AK der α-FITC-Alexa 488-AK (10 µg/ml). Bei diesem Färbeschritt

wurde 1 h bei 37°C im Dunkeln inkubiert.

Anschließend wurde mit A. bidest. gewaschen, die Gummiabgrenzungen vom Objektträger

entfernt, das Präparat mit Fluoroprep® konserviert und mit einem Deckgläschen abgedeckt.

Das Präparat wurde am Fluoreszenzmikroskop ausgewertet und fotografiert.

Die Belichtungszeiten innerhalb einer Färbungsreihe wurden beibehalten, um die

Vergleichbarkeit zu gewährleisten. Die Bilder wurden eingefärbt, überlagert und ggf.

3 Methoden

28

bearbeitet mit dem Programm ImageJ. DNA wurde immer rot eingefärbt, neutrophile Elastase

grün.

3.4.2 Durchflusszytometrische Analyse der Burst-Fähigkeit von Neutrophilen

Mit Hilfe des Phagoburst®-Kits von Orpegen Pharma werden reaktive Sauerstoffspezies

(ROS), die von aktivierten Neutrophilen produziert werden, gemessen. ROS oxidieren das

fluorogene Substrat Dihydrorhodamin 123 und diese Reaktion kann durchflusszytometrisch

quantifiziert werden, so dass die Burst-Fähigkeit der aktivierten Neutrophilen bestimmt

werden kann.

In eine 96-Well-Flachbodenplatte wurden 105 Neutrophile je Well eingesät und mit den

jeweiligen Stimulanzien bei 37°C inkubiert. Außerdem wurden als Kontrollen Neutrophile

mit PMA stimuliert oder blieben unstimuliert. Die eingesetzten Konzentrationen und

Volumina entsprachen dem Vorgehen für den Sytox-Assay. Statt Sytox® Green wurden 20 µl

Zellkulturmedium (optimiertes RPMI) zugegeben.

Nach festgelegten Inkubationszeiten wurden mehrere Wells gepoolt und in ein FACS-

Röhrchen überführt. Ein Färbeansatz sollte ca. 3x105 Neutrophile enthalten. Bei längeren

Inkubationszeiten und bei zelltodfördernden Stimulanzien muss eine höhere Zelltodrate

berücksichtigt werden und es sollten dementsprechend mehr Wells gepoolt werden.

Die Zellen wurden 5 min bei 350 g zentrifugiert, der Überstand abgenommen und die Zellen

mit 100 µl Medium resuspendiert. Um die Burst-Reaktion auszulösen, wurden die Zellen mit

50 nM PMA als starken Stimulus oder 5 µM fMLP als schwachen Stimulus stimuliert oder

blieben unstimuliert. Bei der Substratzugabe wurden zusätzlich 50 µg/ml Katalase zugegeben,

um Artefakte durch eine Kettenaktivierung durch extrazelluläre ROS zu reduzieren.

Zur DNA-Färbung wurden 25 ng/ml DAPI verwendet.

Ansonsten wurde nach Herstellerprotokoll verfahren. Die Proben wurden

durchflusszytometrisch analysiert, dabei wurde die Burst-Messung auf die lebenden, also

DAPI-negativen Zellen bezogen.

3.4.3 Durchflusszytometrische Untersuchung der Reinheit der Neutrophilen-

Suspension

Um kontaminierende PBMCs zu identifizieren, wurde die Zellsuspension mit CD3 und CD19

angefärbt, außerdem wurde zur Färbung aller Leukozyten CD45 als Pan-Leukozyten-Marker

eingesetzt.

Pro Färbeansatz wurden 106 Neutrophile eingesetzt. Die Zellen wurden mit FACS-Puffer

gewaschen (Zentrifugation für 6 min bei 300 g und 4°C, der Überstand wurde verworfen und

3 Methoden

29

die Zellen resuspendiert) und anschließend 10 min bei RT mit 1 mg/ml Cohn II inkubiert, um

Fc-Rezeptoren auf den Neutrophilen zu blockieren, die sonst unspezifisch AK binden würden.

Dann wurden 10 µl der CD3-/CD19-AK-Mischung und 25 µl des CD45-AK zugegeben und

15 min bei RT im Dunkeln inkubiert. Nach erneutem Waschen wurden die Zellen in 100 µl

FACS-Puffer resuspendiert und durchflusszytometrisch analysiert.

3.4.4 Cytometric Bead Array (CBA)

Mit Hilfe des „Human Th1/ Th2 Cytokine Kits“ von BD werden typische pro- und

antiinflammatorische T-Zell-Zytokine detektiert. Das Kit beinhaltet sechs Bead-Populationen,

die sich in ihrer Fluoreszenzintensität (FL-3) unterscheiden und mit für IL-2-, IL-4-, IL-5-,

IL-10-, TNF-α- bzw. IFN-γ-spezifischen AK beschichtet sind. Diese Beads werden mit PE-

konjugierten Detektions-AK und den Standards bzw. Proben inkubiert und bilden dabei

sogenannte „Sandwich-Komplexe“. Die Auswertung erfolgte mit der FCAP Array-Software.

Es wurden nur 40 µl Bead/PE-Reagenz und 20 µl Kulturüberstand verwendet, für alle

weiteren Schritte wurde das Herstellerprotokoll befolgt. Die Nachweisgrenzen lagen für IL-5

bei 2,4 pg/ml, für IL-2 und IL-4 bei 2,6 pg/ml, für IL-10 und TNF-α bei 2,8 pg/ml und für

IFN-γ bei 7,1 pg/ml.

3.4.5 Durchflusszytometrische Quantifizierung apoptotischer Zellen

Annexin V detektiert Phosphatidylserin, einen Zellmembranbestandteil, der während der

frühen Phase des Zelltods an die Membranaußenseite gelangt und so von Annexin V

gebunden werden kann. 7’AAD färbt DNA an, ist jedoch nicht membrangängig, so dass nur

die von toten Zellen freigesetzte DNA erfasst wird.

In eine 96-Well-Flachbodenplatte wurden 105 Neutrophile je Well eingesät und mit den

jeweiligen Stimulanzien bei 37°C inkubiert. Außerdem wurden als Kontrollen Neutrophile

mit PMA stimuliert oder blieben unstimuliert. Die eingesetzten Konzentrationen und

Volumina entsprachen dem Vorgehen für den Sytox-Assay. Statt Sytox® Green wurden 20 µl

Zellkulturmedium (optimiertes RPMI) zugegeben.

Nach festgelegten Inkubationszeiten wurden mehrere Wells gepoolt und in ein FACS-

Röhrchen überführt. Ein Färbeansatz sollte ca. 3x105 Neutrophile enthalten. Bei längeren

Inkubationszeiten und bei zelltodfördernden Stimulanzien muss eine höhere Zelltodrate

berücksichtigt werden und es sollten dementsprechend mehr Wells gepoolt werden.

Wurde eine Stimulation mit lebenden Bakterien durchgeführt, wurden die Proben nach dem

Poolen mit 70 µg/ml Lysostaphin bei 37°C für 30 min inkubiert, um eine Kontamination des

Durchflusszytometers zu vermeiden. Lysostaphin beeinträchtigt nicht die Vitalität der

3 Methoden

30

Neutrophilen, was lichtmikroskopisch und in Kontrollansätzen in dieser Apoptosefärbung

überprüft wurde.

Die Zellen wurden mit FACS-Puffer gewaschen (Zentrifugation für 6 min bei 300 g und 4°C,

der Überstand wurde verworfen und die Zellen resuspendiert).

Nun wurden 95 µl Annexin V-Bindungspuffer und 5 µl Annexin V-FITC zugegeben und 20

min bei RT im Dunkeln inkubiert.

Anschließend wurden die Zellen mit 1 ml Annexin V-Bindungspuffer wie oben beschrieben

gewaschen.

Zum Schluss wurden 10 µl 7’AAD und 150 µl Annexin V-Bindungspuffer zugegeben und die

Proben durchflusszytometrisch analysiert. Anhand der Population unstimulierter Zellen wurde

3.5 Proteinbiochemische Methoden

3.5.1 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die Proteine werden hitzedenaturiert und mit Hilfe von Natriumdodecylsulfat (SDS)

einheitlich negativ geladen. Im elektrischen Feld wandern sie somit zur Anode. Dabei werden

sie in einem Polyacrylamid-Netzwerk nach ihrer molekularen Masse aufgetrennt. Zur

Erhöhung der Trennschärfe werden sie erst in einem grobmaschigen Sammelgel konzentriert

und wandern dann in einem engmaschigen Trenngel.

Zunächst wurde das Trenngel vorbereitet, in die Gelapparaturen gegossen und zum Schutz vor

Austrocknung mit Isopropanol überschichtet. Auf das polymerisierte Trenngel wurde nach

Entfernung des Isopropanols das Sammelgel gegossen und sofort luftblasenfrei ein Kamm

eingesetzt, der nach dem Aushärten des Gels vorsichtig wieder entfernt wurde. Die fertigen

Gele wurden in die Laufkammer gestellt und diese mit Laufpuffer gefüllt. Die Proteinproben

wurden mit dem 5x Ladepuffer versetzt und 5 min bei 95°C denaturiert. 10 µl der Proben

wurden dann in die Geltaschen geladen. Ein Proteinmarker (s. Tab. 1) zur Einschätzung des

Molekulargewichts der Proteinbanden wurde auf jedem Gel mitgeführt. Die ersten 30 min

wurde eine Spannung von 10 mA pro Gel angelegt, dann wurde auf 15 mA pro Gel erhöht.

3.5.2 Coomassie-Färbung

Um die Proteine im SDS-Gel sichtbar zu machen, wurden sie nach der Elektrophorese mit

Coomassie gefärbt. Dazu wurden die Gele zuerst in der Coomassie Fixierungslösung für 1 h

fixiert und zweimal 10 min in A. dest. gewaschen. Die Färbung der Gele in der Coomassie-

Färbe-Lösung erfolgte üN. Die gefärbten Gele können dann gescannt werden.

3 Methoden

31

20 % Methanol-Lösung diente zum Entfärben der Gele. Bei allen Schritten wurden die Gele

bei RT geschüttelt.

3.5.3 Western Blot

Die Proteine im Gel werden durch Anlegen eines elektrischen Felds auf eine Membran

transferiert. Die Membran kann dann für weitere Färbeschritte benutzt werden, so dass

bestimmte Proteine durch spezifische AK und daran gekoppelte Detektionsreagenzien

nachgewiesen werden können.

Die Gele wurden auf PVDF-Membranen geblottet, welche vorher in Methanol aktiviert

wurden. Gele, Membranen und Whatman-Papier wurden in Transferpuffer hydratisiert. Gel

und Membran wurden zwischen jeweils drei Lagen Whatman-Papier eingebettet. Pro

Membran wurde eine Stromstärke von 104 mA (1,75 mA/cm2) für 80 min angelegt. Um den

Erfolg des Proteintransfers zu prüfen, wurden die Proteine auf den Membranen 20 min mit

Tintenlösung angefärbt und können gescannt werden.

Nach dem Entfärben mit TBS/T wurden unspezifische Bindungsstellen für 1 h mit 30 ml

Milchpulver-Lösung je Membran geblockt. Anschließend wurden die Membranen üN bei 4°C

mit dem Primär-AK (Kaninchen-α-PVL-Serum, 1:100.000, 20 ml/Membran) inkubiert.

Nach fünfmaligem Waschen in TBS/T folgte die Inkubation mit dem Sekundär-AK (4 ng/ml)

für 1 h.

Es folgte wieder ein Waschschritt, dann wurde die Substratlösung nach Herstellerangaben

angesetzt (Thermo Scientific, SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Kit)

und die Membranen wurden mit je 3 ml Substratlösung 5 min im Dunkeln inkubiert. Die

Analyse erfolgte mit einem Chemilumineszenz-Scanner (LumiImager).

Wenn nicht anders angegeben, wurden die Membranen bei allen Block-, Wasch- und

Inkubationsschritten bei RT geschüttelt.

3.6 Statistische Auswertung

Bei Dreifachbestimmungen ist der Mittelwert angegeben, sofern der Standardfehler des

Mittelwerts (SEM) weniger als 20 % betrug. War der Standardfehler größer, wurde der am

stärksten abweichende Wert des Triplikats ausgeschlossen.

Bei den Balkendiagrammen mit Fehlerbalken ist der SEM des technischen Triplikats

angegeben.

3 Methoden

32

Die relative DNA-Menge, die im Sytox-Assay detektiert wurde, ist in relative fluorescence

units (RFU) angegeben.

Zur statistischen Auswertung wurden der ungepaarte zweiseitige t-Test mit Welch-Korrektur

bzw. die one-way analysis of variance (ANOVA) eingesetzt.

4 Ergebnisse

33

4 Ergebnisse

4.1 Wirkung von S. aureus-Kulturüberständen auf den Zelltod von

neutrophilen Granulozyten

Die Virulenz von S. aureus wird vor allem durch dessen Sekretionsprodukte vermittelt.

S. aureus sezerniert eine Vielzahl von Faktoren, die auf das Immunsystem stimulierend,

inhibierend oder toxisch wirken können. Dabei bilden neutrophile Granulozyten im

Immunsystem die erste Linie der Abwehr gegen Staphylokokken und werden mit deren

Sekretionsprodukten konfrontiert.

Als erstes sollten daher die Effekte der bakteriellen Sekretionsprodukte auf die

Zelltodinduktion bei Neutrophilen untersucht werden.

Dazu wurden sechs klinische S. aureus-Stämme analysiert, die aus dem Nasenvorhof

gesunder Probanden gewonnen wurden (sogenannte Carrier-Isolate) und aus

unterschiedlichen genetischen Linien stammen, so dass ein breites Bild erfasst wurde. Eine

Übersicht der genutzten Stämme findet sich in Tab. 5. Die Isolate sind publiziert [28].

Tab. 5: Übersicht über die sechs verwendeten Carrier-Isolate und ihre Superantigen-Gene. Aus

einer klinischen Studie (SH-Studie) wurden sechs Isolate aus nasaler Besiedlung ausgewählt, die aus

verschiedenen klonalen Linien stammen und sich in ihrem Superantigen-Genmuster unterscheiden.

S. aureus-Isolat

Superantigene

SE, tst egc eta, etd pvl

SH1-2 c l g i m n o - -

SH10-1 d j r - - -

SH15-1 - - - -

SH27-1 - - - -

SH39-1 tst g i m n o u - -

SH42-1 p g i m n o - -

Von diesen Isolaten wurden Kulturüberstände, also die Sekretionsprodukte, im Standard-

Medium TSB gewonnen. Da die Sekretion einzelner Faktoren wachstumsphasenabhängig

reguliert wird, wurden sowohl Überstände aus der logarithmischen (OD595 nm = 0,5) als auch

aus der stationären Wachstumsphase (ca. 3,5 h nach Abknicken des exponentiellen

Wachstums, dies entsprach OD595 nm ≈ 6) für die folgenden Versuche verwendet.

4 Ergebnisse

34

4.1.1 Unmittelbare Effekte der bakteriellen Kulturüberstände

Neutrophile Granulozyten sind kurzlebige Zellen und ihre Hauptaufgabe ist es, schnell – das

bedeutet im menschlichen Körper innerhalb von Stunden – auf schädigende Noxen zu

reagieren. Danach gehen sie in aktivitätsinduzierte Apoptose. Eine weitere schnelle Form des

Zelltods ist die durch PMA-Stimulation induzierte NETose. In vitro wurde NETose 3 bis 5 h

nach PMA-Stimulation beobachtet [14].

Wegen dieser Überlegungen wurde zunächst ein kurzer Zeitraum von ca. 8 h

Stimulationsdauer im Sytox-Assay untersucht.

Der Sytox-Assay dient zur Quantifizierung der DNA-Freisetzung, also Zellschädigung, von

Neutrophilen. Dies funktioniert mit Hilfe eines fluoreszierenden DNA-Farbstoffs, Sytox®

Green, der nicht membrangängig ist, also nur extrazelluläre DNA detektieren kann. Die

Fluoreszenzintensität wird quantifiziert und die DNA-Freisetzung somit als relative

fluorescence units (RFU) angegeben. In diesem Assay können verschiedene

Stimulationsbedingungen und -zeiträume getestet werden.

Abb. 3 zeigt die DNA-Freisetzung nach Stimulation mit S. aureus-Kulturüberständen, PMA,

Triton sowie ohne Behandlung. Stimulation mit PMA diente als Positivkontrolle für NETose.

NETose ist eine Zelltodform mit Freisetzung von Fangnetzen aus DNA und anderen

Zellbestandteilen der Neutrophilen zur Abwehr von Infektionserregern. Bereits 2 h nach

PMA-Zugabe wurde eine DNA-Freisetzung beobachtet, die über einen 4 bis 5-stündigen

Zeitverlauf weiter anstieg. Bei Tritonbehandlung wird durch eine Membranschädigung die

Zelllyse, also Nekrose induziert. Hier wurden innerhalb 1 h stark erhöhte Werte

extrazellulärer DNA detektiert, danach gab es nur noch einen schwachen Anstieg der Werte.

Bei unstimulierten Neutrophilen änderte sich das niedrige Niveau extrazellulärer DNA über

den beobachteten Zeitraum nicht.

Neben diesen Zelltodkontrollen wurden Neutrophile mit bakteriellen Überständen von sechs

Carrier-Isolaten aus der logarithmischen und stationären Wachstumsphase stimuliert.

Überstände der stationären Phase enthalten eine höhere Dichte und andere Zusammensetzung

der Sekretionsprodukte von S. aureus.

Abb. 3 zeigt die Ergebnisse mit den Überständen der stationären Phase des klinischen Isolats

SH10-1. Höhere Konzentrationen der Überstände (hier auf OD595 nm = 1 normalisiert) lösten

eine rasche DNA-Freisetzung der Neutrophilen aus: Innerhalb 1 h konnte ein Anstieg der

Werte extrazellulärer DNA beobachtet werden und dieser Anstieg setzte sich über die

nächsten Stunden fort, so dass nach 7 h sogar höhere Werte als nach PMA-Stimulation

4 Ergebnisse

35

erreicht wurden. Mit dem Sytox-Assay kann zwar keine definitive Aussage über die

Zelltodform der Neutrophilen erfolgen, doch im Vergleich zu den Kontrollen lässt die hier

beobachtete Kinetik der DNA-Freisetzung vermuten, dass es sich eher nicht um NETose

handeln kann. Dies soll anschließend in der Immunfluoreszenzfärbung aufgeklärt werden.

Niedrigere Konzentrationen der stationären Überstände erzielten keine detektierbare DNA-

Freisetzung der Neutrophilen.

Abb. 3: Zelltodinduktion bei Neutrophilen durch bakterielle Überstände der stationären Phase in hoher Konzentration (OD595 nm = 1). Neutrophile wurden im Sytox-Assay mit verschiedenen

Verdünnungsstufen des Kulturüberstands des klinischen Isolats SH10-1 aus der stationären Phase

stimuliert. Zur Kontrolle wurden außerdem Neutrophile mit Triton oder PMA behandelt oder blieben

unstimuliert. Extrazelluläre DNA wurde als relative fluorescence units (RFU) detektiert.

Während Triton eine rasche DNA-Freisetzung innerhalb 1 h auslöste, war die DNA-Freisetzung unter

PMA-Behandlung um 2 h verzögert und nahm über 4-5 h zu. Unstimulierte Neutrophile verblieben

über den beobachteten Zeitraum auf einem niedrigen Niveau extrazellulärer DNA. Mit dem auf OD595

nm = 1 normalisierten Kulturüberstand der stationären Phase erfolgte eine rasche DNA-Freisetzung

innerhalb 1 h, ansteigend über die nächsten Stunden. Niedrigere Konzentrationen des Überstands

erzielten keine Effekte über den beobachteten Zeitraum.

Überstände der logarithmischen Wachstumsphase enthalten eine geringere Dichte an

bakteriellen Sekretionsprodukten, die maximal einsetzbare Konzentration entsprach daher

OD595 nm = 0,2. Diese Überstände lösten keine DNA-Freisetzung der Neutrophilen im

beobachteten Zeitfenster aus (s. Anhang Abb. A1).

Mit den Überständen der anderen fünf Carrier-Isolate wurden ähnliche Ergebnisse erzielt wie

mit dem Isolat SH10-1 (s. Anhang Abb. A2). Allerdings induzierten die Isolate eine

unterschiedlich starke DNA-Freisetzung.

Die Morphologie der Neutrophilen unter verschiedenen Stimulationsbedingungen kann in der

Immunfluoreszenzfärbung dargestellt werden. Angefärbt wurden DNA und neutrophile

4 Ergebnisse

Elastase (NE), ein Bestandteil der Granula. Beide Färbekomponenten lokalisieren sich auch in

NETs, so dass mit dieser Färbung NETose von anderen Zelltodformen abgegrenzt werden

kann.

Um die Zelltodform durch stationäre Überstän

wurden Neutrophile unter den oben erläuterten Stimulationsbedingungen 5 h inkubiert und

dann in der Immunfluoreszenzfärbung dargestellt (Abb. 4

Abb. 4: Aktivierung und leichte Zelllyse der Neutrophilen durch baktstationären Wachstumsphase. Neutrophile wurden mit stationären Überständen des klinischen

Isolats SH10-1 in zwei Verdünnungsstufen stimuliert sowie zur Kontrolle mit PMA und Triton

behandelt bzw. blieben unstimuliert. Nach 5 h Inkuba

dem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet.

Unstimulierte Neutrophile behielten ihre ursprüngliche runde Zellform und lobulierte Kernstruktur

(Bild 1), PMA-stimulierte bildeten

Verdünnungen auf OD595 nm = 1 und 0,4 des Kulturüberstands der stationären Phase bewirkten eine

Zellabflachung und schwache Lyse der Neutrophilen, es wurden keine NETs beobachtet.

Unstimulierte Neutrophile zeigten eine erhaltene Zellmorphologie mit runder Zellform und

lobulierten Kernen (Abb. 4, Bild 1). PMA

lange DNA-Fäden dargestellt werden, in die neutrophile Elastase eingelagert war (Bild

Mit Triton behandelte Neutrophile waren nach 5 h vollständig lysiert, so dass nur noch

Zelltrümmer anfärbbar waren (Bild 3).

36



Um die Zelltodform durch stationäre Überstände in höherer Konzentration abzuklären,


szenzfärbung dargestellt (Abb. 4).

Aktivierung und leichte Zelllyse der Neutrophilen durch bakterielle Überstände der Neutrophile wurden mit stationären Überständen des klinischen

1 in zwei Verdünnungsstufen stimuliert sowie zur Kontrolle mit PMA und Triton

behandelt bzw. blieben unstimuliert. Nach 5 h Inkubation wurden die Zellen fixiert, gefärbt und mit

dem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. DNA wurde rot, NE grün eingefärbt.


stimulierte bildeten NETs (Bild 2), Triton behandelte wurden lysiert (Bild 3). Die

= 1 und 0,4 des Kulturüberstands der stationären Phase bewirkten eine


Neutrophile zeigten eine erhaltene Zellmorphologie mit runder Zellform und

, Bild 1). PMA-stimulierte Neutrophile bildeten NETs: Es konnten

Fäden dargestellt werden, in die neutrophile Elastase eingelagert war (Bild


Zelltrümmer anfärbbar waren (Bild 3).



de in höherer Konzentration abzuklären,


erielle Überstände der Neutrophile wurden mit stationären Überständen des klinischen

1 in zwei Verdünnungsstufen stimuliert sowie zur Kontrolle mit PMA und Triton

tion wurden die Zellen fixiert, gefärbt und mit


NETs (Bild 2), Triton behandelte wurden lysiert (Bild 3). Die

= 1 und 0,4 des Kulturüberstands der stationären Phase bewirkten eine


Neutrophile zeigten eine erhaltene Zellmorphologie mit runder Zellform und

stimulierte Neutrophile bildeten NETs: Es konnten

Fäden dargestellt werden, in die neutrophile Elastase eingelagert war (Bild 2).


4 Ergebnisse

37

Nach 5 h Stimulation mit stationären Überständen des klinischen Isolats SH10-1 in den

Verdünnungen OD595 nm = 1 und 0,4 (Bild 4 und 5) zeigten die Neutrophilen

Aktivierungszeichen: Die Zellen waren abgeflacht und bildeten einige Ausläufer, die

Kernlobulierung war meist noch erhalten. Es wurden einige Zelltrümmer angefärbt, NETose

war allerdings nicht zu beobachten.

Die Überstände lösten also eine leichte Zelllyse aus, aber keine NETose.

4.1.2 Effekte von bakteriellen Überständen in der Langzeit-Untersuchung

Es ist möglich, dass schwächere, bakterielle Stimuli im Vergleich zu dem potenten PKC-

Aktivator PMA verzögert NETose induzieren. Daher soll neben der Betrachtung

unmittelbarer Effekte der S. aureus-Überstände nun ein längerer Stimulationszeitraum bis

zum natürlichen Zelltod der Neutrophilen in Kultur analysiert werden.

Bei Kultivierung im hier genutzten optimierten RPMI-Medium haben unbehandelte

Neutrophile eine Lebensspanne von 20-30 h. Ab 10 h Kulturdauer kann ein leichter Anstieg

der extrazellulären DNA-Werte unstimulierter Neutrophiler im Sytox-Assay beobachtet

werden, bis nach 20-30 h das Niveau der Zelltodkontrollen (PMA, Triton) erreicht ist, also

davon auszugehen ist, dass der Großteil der Zellen tot ist.

Bei Vorarbeiten mit bakteriellen Überständen in TSB wie auch mit TSB-Medium allein

konnte eine Verzögerung der DNA-Freisetzung der Neutrophilen beobachtet werden. TSB

selbst verlängerte also das Langzeitüberleben der Neutrophilen in Kultur (s. Anhang Abb.

A3). Ob bakterielle Sekretionsprodukte die DNA-Freisetzung durch Neutrophile ebenfalls

beeinflussen, ließ sich vor diesem Hintergrund nicht feststellen. Als Ursache für die TSB-

Wirkung wurde die reichhaltige Nährstoffzusammensetzung des TSB-Mediums

angenommen, die ein verlängertes Überleben der Neutrophilen in vitro ermöglichen könnte.

Um den TSB-Effekt zu vermeiden, wurden die bakteriellen Überstände für

Langzeituntersuchungen im Kulturmedium der Neutrophilen, optimiertem RPMI, gewonnen.

S. aureus zeigte in diesem Medium aufgrund der für Bakterien ungünstigeren

Nährstoffzusammensetzung ein geringeres Wachstum, die Sekretionsprodukte von S. aureus

liegen daher in diesen Überständen wahrscheinlich in deutlich geringeren Konzentrationen als

in typischen Prokaryoten-Medien vor.

Zelltodverzögerung durch bakterielle Zellkulturüberstände

Die in optimiertem RPMI gewonnenen bakteriellen Überstände wurden für die

Langzeituntersuchungen in sublytischen Konzentrationen (OD595nm = 0,1 und kleiner)

4 Ergebnisse

38

eingesetzt. Vor allem Überstände aus der stationären Wachstumsphase bewirkten in diesen

Konzentrationen eine Verzögerung des spontanen Zelltods der Neutrophilen in Kultur

(Abb. 5a), ähnlich wie es zuvor mit TSB-Medium beobachtet wurde. Ein Effekt durch das

Bakterienmedium kann hier allerdings ausgeschlossen werden.

Beginnend ab 12 h Kulturdauer konnte eine gegenüber unstimulierten Neutrophilen reduzierte

DNA-Freisetzung der mit stationären Überständen stimulierten Neutrophilen beobachtet

werden (Abb. 5a). Dieser Effekt war nach 24 h Inkubation am deutlichsten; hier war die

Menge extrazellulärer DNA von Neutrophilen stimuliert mit Überständen der stationären

Phase signifikant gegenüber den Werten unstimulierter Neutrophiler reduziert (Abb. 5b).

Bei stärkerer Verdünnung der Überstände war dieser Unterschied abgeschwächt, der

beobachtete Effekt war also konzentrationsabhängig (Abb. 5a).

Mit Überständen der logarithmischen Wachstumsphase konnte diese Zelltodverzögerung

nicht festgestellt werden (Abb. 5a).

Abb. 5a: Reduzierte DNA-Freisetzung der Neutrophilen durch S. aureus-Kulturüberstände der stationären Phase. Neutrophile wurden im Sytox-Assay mit verschiedenen Verdünnungsstufen des

Kulturüberstands des klinischen Isolats SH10-1 aus der logarithmischen bzw. stationären Phase,

gewonnen in optimiertem RPMI-Medium, stimuliert.

Überstände der stationären Phase bewirkten in hohen Konzentrationen (normalisiert auf OD595 nm = 0,1

bis 0,025) nach ca. 24 h Kulturdauer eine reduzierte DNA-Freisetzung der Neutrophilen verglichen

mit unstimulierten Neutrophilen.

4 Ergebnisse

39

Abb. 5b verdeutlicht die Unterschiede in der DNA-Freisetzung der Neutrophilen nach 24 h

Kulturdauer und Stimulation mit Überständen der stationären Phase verglichen mit

unstimulierten Neutrophilen.

Abb. 5b: Reduzierte DNA-Freisetzung der Neutrophilen durch S. aureus-Kulturüberstände der stationären Phase. DNA-Freisetzung der Neutrophilen nach 24 h Kulturdauer und Inkubation mit Überständen der stationären Phase (normalisiert auf OD595 nm = 0,1) der bakteriellen Isolate SH10-1, SH27-1 und SH39-1 verglichen mit unstimulierten Neutrophilen. Überstände der stationären Phase bewirkten eine signifikant (p < 0,01) geringere DNA-Freisetzung der

Neutrophilen verglichen mit unstimulierten Neutrophilen.

Die Ergebnisse der Immunfluoreszenzfärbung (Abb. 6) verdeutlichen den Effekt der

Zelltodverzögerung: Nach 24 h Inkubation war die Zellzahl von Neutrophilen, die mit

stationären Überständen (Isolat SH10-1, Verdünnung auf OD595nm = 0,1) stimuliert wurden,

gegenüber der von unstimulierten Neutrophilen deutlich erhöht. Außerdem gab es in der

ersten Gruppe morphologische Anzeichen einer verbesserten Vitalität; die Zellform und die

lobulierte Kernstruktur waren besser erhalten. Unstimulierte Neutrophile zeigten dagegen

vermehrt runde, verdämmernde Zellkerne. Es konnten keine Anzeichen einer Zellaktivierung

durch die Überstände und keine NETose beobachtet werden.

4 Ergebnisse

Abb. 6: Verbesserte Vitalität der Neutrophilen nach langer Kulturdauer bei Stimulation mit Überständen der stationären Phase. des klinischen Isolats SH10-1, normalisiert auf OD

fluoreszenzmikroskopisch analysiert.

Bei den Neutrophilen, die mit dem Kulturüberstand stimuliert wurden, war die lobulierte

Kernmorphologie besser erhalten und die Zellzahl erhöht verglichen mit unstimulierten Neutrophilen.

Aktivierbarkeit der überlebenden Neutrophilen

Um dieses Phänomen der Zelltodverzögerung durch bakterielle Überstände der stationären

Wachstumsphase weiter aufzuklären, wurden

durchgeführt. Es sollte geprüft werden, ob die Neutrophilen durch Behandlung mit den

Überständen in einen anergischen Zustand versetzt werden oder aber länger funktionsfähig

bleiben als unbehandelte Neutrophile.

Dazu wurde nach 24 h Kulturdauer die proinflammatorische Aktivierbarkeit der Zellen,

nämlich die Fähigkeit, bei Aktivierung NETs oder reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu

bilden, untersucht. ROS werden bei Aktivierung der Neutrophilen

Reize freigesetzt und dienen der Abtötung und dem Abbau von Infektionserregern.

Neutrophile wurden mit verschiedenen Konzentrationen des stationären Überstands vom

Isolat SH10-1 stimuliert oder blieben unstimuliert. Nach 24 h wurden alle Ansätze zusätzlich

für 4 h mit PMA behandelt und in der Immunfluoreszenzfärbung analysiert (Abb.

Dabei zeigte sich, dass die Neutrophilen

dieser langen Kulturdauer bei PMA

verdämmerten die Zellen und die Zellzahl reduzierte sich zusätzlich. Dies geschah allerdings

in einem geringeren Ausmaß bei den Neutrophilen, die mit Überständen stimuliert wurden.

40

Verbesserte Vitalität der Neutrophilen nach langer Kulturdauer bei Stimulation mit Überständen der stationären Phase. Neutrophile wurden mit dem Überstand der stationären Phase

normalisiert auf OD595 nm = 0,1, stimuliert und nach 20 h Inkubation

fluoreszenzmikroskopisch analysiert. DNA wurde rot, NE grün eingefärbt.


lten und die Zellzahl erhöht verglichen mit unstimulierten Neutrophilen.

Aktivierbarkeit der überlebenden Neutrophilen


Wachstumsphase weiter aufzuklären, wurden Funktionsversuche mit den Neutrophilen



bleiben als unbehandelte Neutrophile.

wurde nach 24 h Kulturdauer die proinflammatorische Aktivierbarkeit der Zellen,


bilden, untersucht. ROS werden bei Aktivierung der Neutrophilen durch inflammatorische

freigesetzt und dienen der Abtötung und dem Abbau von Infektionserregern.


1 stimuliert oder blieben unstimuliert. Nach 24 h wurden alle Ansätze zusätzlich

4 h mit PMA behandelt und in der Immunfluoreszenzfärbung analysiert (Abb.

Dabei zeigte sich, dass die Neutrophilen – mit oder ohne Behandlung mit Überständen

dieser langen Kulturdauer bei PMA-Stimulation keine NETs mehr bilden können. E



Verbesserte Vitalität der Neutrophilen nach langer Kulturdauer bei Stimulation mit Neutrophile wurden mit dem Überstand der stationären Phase

= 0,1, stimuliert und nach 20 h Inkubation


lten und die Zellzahl erhöht verglichen mit unstimulierten Neutrophilen.


Funktionsversuche mit den Neutrophilen



wurde nach 24 h Kulturdauer die proinflammatorische Aktivierbarkeit der Zellen,


durch inflammatorische

freigesetzt und dienen der Abtötung und dem Abbau von Infektionserregern.


1 stimuliert oder blieben unstimuliert. Nach 24 h wurden alle Ansätze zusätzlich

4 h mit PMA behandelt und in der Immunfluoreszenzfärbung analysiert (Abb. 7, Teil A).

mit oder ohne Behandlung mit Überständen – nach

Stimulation keine NETs mehr bilden können. Eher



4 Ergebnisse

Gegenüber unstimulierten, PMA

behandelt mit dem Überstand in OD

erhöht und die Zellmorphologie besser erhalten. Der Unterschied war, wenn auch schwächer,

auch noch bei Behandlung mit der niedrigeren Konzentration

sichtbar.

Abb. 7: Verbesserte Vitalität nach PMANeutrophilen stimuliert mit dem Kulturdauer. Neutrophile wurden mit d

stationären Phase normalisiert auf OD

24 Kulturdauer wurden die Zellen zusätzlich für 4 h mit PMA behandelt (

zu bilden, zu untersuchen. Oder es wurde eine oxidative Burst

Synthese der verschieden vorstimulierten Neutrophilen quantifiziert.

Neutrophile bildeten nach 24 h Kulturdauer und zusätzlicher PMA

sondern reagierten eher mit erhöhter Sterblichkeit; doch Zellen stimuliert mit dem Überstand der

stationären Phase normalisiert auf OD

eine verbesserte Vitalität (A). Auch die Burst

h Kultur noch stärker ausgeprägt verglichen mit den unstimulierten Neutrophilen (

waren abgeschwächt auch mit der höheren Verdünnung des Überstands (normalisiert auf

OD595 nm = 0,02) sichtbar.

Nach langer Kulturdauer können bei Neutrophilen also nicht mehr NETs induziert werden,

doch die Behandlung mit bakteriellen Überständen vermindert den PMA

41

Gegenüber unstimulierten, PMA-restimulierten Neutrophilen (Bild 2) war bei Neutrophilen

behandelt mit dem Überstand in OD595 nm = 0,1 nach PMA-Restimulation (Bild 3) die Zellzahl


auch noch bei Behandlung mit der niedrigeren Konzentration des Überstands (Bild 4)

Verbesserte Vitalität nach PMA-Behandlung (A) und stärkere Burst-Neutrophilen stimuliert mit dem S. aureus-Kulturüberstand der stationären Phase nach 24 h

Neutrophile wurden mit dem Kulturüberstand des klinischen Isolats SH10

stationären Phase normalisiert auf OD595 nm = 0,1und 0,02 stimuliert oder blieben unstimuliert. Nach

24 Kulturdauer wurden die Zellen zusätzlich für 4 h mit PMA behandelt (A), um die Fähigkeit, NETs

zu bilden, zu untersuchen. Oder es wurde eine oxidative Burst-Reaktion ausgelöst (

Synthese der verschieden vorstimulierten Neutrophilen quantifiziert.

Neutrophile bildeten nach 24 h Kulturdauer und zusätzlicher PMA-Stimulation keine NETs meh


stationären Phase normalisiert auf OD595 nm = 0,1 zeigten gegenüber unstimulierten Neutrophilen hier

). Auch die Burst-Reaktion war bei den stimulierten Neutrophilen nach 24

h Kultur noch stärker ausgeprägt verglichen mit den unstimulierten Neutrophilen (



doch die Behandlung mit bakteriellen Überständen vermindert den PMA-induzierten Zelltod.

bei Neutrophilen

Restimulation (Bild 3) die Zellzahl


des Überstands (Bild 4)

-Reaktion (B) von Kulturüberstand der stationären Phase nach 24 h

em Kulturüberstand des klinischen Isolats SH10-1 aus der

= 0,1und 0,02 stimuliert oder blieben unstimuliert. Nach

), um die Fähigkeit, NETs

Reaktion ausgelöst (B) und die ROS-

Stimulation keine NETs mehr aus,


0,1 zeigten gegenüber unstimulierten Neutrophilen hier

tion war bei den stimulierten Neutrophilen nach 24

h Kultur noch stärker ausgeprägt verglichen mit den unstimulierten Neutrophilen (B). Beide Effekte



induzierten Zelltod.

4 Ergebnisse

42

Um dieses Ergebnis zu präzisieren, wurde außerdem die Fähigkeit zur ROS-Synthese bei

Aktivierung der Neutrophilen nach 24 h Kulturdauer ermittelt. Dieser Versuch wurde mit dem

Phagoburst®-Test von Orpegen Pharma durchgeführt. Neutrophile wurden direkt nach der

Isolation oder nach 24-stündiger Kultur mit den oben beschriebenen Überständen bzw. ohne

Stimulation mit PMA restimuliert. Die Zahl der Zellen, die ROS bilden, also mit einer

oxidative burst-Reaktion auf die Aktivierung antworten, wurde durchflusszytometrisch

quantifiziert. Dabei wurde der Anteil der burst-positiven Zellen auf die Gesamtzahl der

vitalen Zellen bezogen, damit Zellzahlverluste nach langer Kulturdauer nicht falsch-niedrige

Werte bedingen.

In Teil B von Abb. 7 sind die Ergebnisse dazu dargestellt. Frisch isolierte Neutrophile zeigten

nach PMA-Stimulation eine starke burst-Reaktion: 86,9 % der Zellen bildeten als Reaktion

auf den proinflammatorischen Stimulus ROS (Histogramm 1). Nach 24-stündiger Kulturdauer

sank dieser Anteil bei unstimulierten Neutrophilen auf 12,9 % (Histogramm 2). Die Fähigkeit

zur burst-Reaktion war aber deutlich besser erhalten, wenn die Neutrophilen über die lange

Kulturdauer mit bakteriellen Überständen stimuliert wurden; bei Behandlung mit dem

stationären Überstand des Isolats SH10-1 in der OD595 nm = 0,1 bildeten nach PMA-

Restimulation noch 72,8 % der Neutrophilen ROS (Histogramm 3). Bei Behandlung mit dem

niedriger konzentrierten Überstand (OD595 nm = 0,002) waren es immerhin noch 18,2 %

(Histogramm 4). Neben der Verzögerung der spontanen Apoptose war bei Stimulation mit

bakteriellen Überständen der stationären Phase also auch die proinflammatorische

Aktivierbarkeit der Neutrophilen konserviert.

Die Langzeit-Effekte der bakteriellen Überstände sind nicht durch PBMCs

vermittelt

Auch Moulding et al. konnten zeigen, dass bei Zusatz von S. aureus-Überständen die

Neutrophilen in Kultur länger überlebten als die unstimulierten Kontrollen [90]. Die Autoren

führten dies zurück auf den Einfluss kontaminierender PBMCs. Insbesondere die

Superantigene in den bakteriellen Überständen bewirkten eine polyklonale T-Zell-

Aktivierung, so dass auch eine geringe T-Zellzahl ausreichen würde, um Zytokin-vermittelt

die Effektorfunktionen und das Überleben der Neutrophilen zu beeinflussen. Hier ist

besonders das Zytokin Interferon-γ (IFN-γ) zu nennen, das bewiesenermaßen [90-92] die

Lebensspanne der Neutrophilen verlängert.

Um zu überprüfen, ob der Effekt der Zelltodverzögerung der Neutrophilen direkt durch die

bakteriellen Überstände oder durch PBMCs vermittelt wird, wurde die T- und B-

Zellkontamination nach Isolation der Neutrophilen durchflusszytometrisch analysiert. Dazu

4 Ergebnisse

wurde zur Darstellung aller enthaltenden Leukozyten CD 45 als Panleukozytenmarker

nachgewiesen; außerdem wurden der T

eingesetzt, um diese Populationen abzugrenzen. Abb.

abhängig von Zellgröße (FSC) und Granularität (SSC). Die größte Population bilden die

Neutrophilen (A). Lymphozyten (B) können schon anhand ihrer geringeren Größe und

Granularität von den Neutrophilen abgegrenzt werden. Sie mach

analysierten Zellen aus. Davon waren 34,7

(CD 19-positiv). Die restlichen Zellen müssen anderen Zelltypen zugeordnet werden, z.B.

Monozyten oder NK-Zellen, die hier nicht weiter analysiert w

Der Anteil kontaminierender T

Neutrophilen auszugehen ist.

Abb. 8: Nach Isolation befand sich in der NeutrophilenKontamination mit Lymphozyten. analysiert, um Kontaminationen durch andere Zelltypen festzustellen. Lymphozyten (

ihre geringere Größe (FSC) und Granularität (SSC) von der Neutrophilen

Der Anteil kontaminierender Lymphozyten (

Zur weiteren Klärung wurden mit dem

Konzentrationen der T-Zell-Zytokine IL

Neutrophilen-Kultur nach 24-stündiger Kult

mit dem bakteriellen Überstand der stationären Phase des Isolats SH10

oder 0,002, mit PMA oder mit rekombinanten TSST

unstimuliert. PMA diente als NETose

eine T- und B-Zell-Aktivierung

43


nachgewiesen; außerdem wurden der T-Zell-Marker CD 3 und der B-Zell-Marker CD 19

opulationen abzugrenzen. Abb. 8 zeigt die Verteilung der Zelltypen



Granularität von den Neutrophilen abgegrenzt werden. Sie machten nur 0,2

analysierten Zellen aus. Davon waren 34,7 % T-Zellen (CD 3-positiv) und 9,18

positiv). Die restlichen Zellen müssen anderen Zelltypen zugeordnet werden, z.B.

Zellen, die hier nicht weiter analysiert wurden.

Der Anteil kontaminierender T-Zellen ist so gering, dass nicht von einer Beeinflussung der

Nach Isolation befand sich in der Neutrophilen-Suspension nur eine minimale Kontamination mit Lymphozyten. Neutrophile wurden nach der Isolation durchflusszytometrisch

analysiert, um Kontaminationen durch andere Zelltypen festzustellen. Lymphozyten (

ihre geringere Größe (FSC) und Granularität (SSC) von der Neutrophilen-Population (

ontaminierender Lymphozyten (B) machte ca. 0,2 % aus.

Zur weiteren Klärung wurden mit dem Human Th1/ Th2 Cytokine Kit von BD

Zytokine IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α und IFN

stündiger Kulturdauer ermittelt. Dabei wurden die Neutrophilen

mit dem bakteriellen Überstand der stationären Phase des Isolats SH10-1 in OD

oder 0,002, mit PMA oder mit rekombinanten TSST-1 stimuliert oder sie blieben

unstimuliert. PMA diente als NETose-Kontrolle und verursacht außerdem als PKC

Aktivierung [93]. TSST-1 ist ein S. aureus-Superantigen; falls die


Marker CD 19

ie Verteilung der Zelltypen



ten nur 0,2 % aller

positiv) und 9,18 % B-Zellen

positiv). Die restlichen Zellen müssen anderen Zelltypen zugeordnet werden, z.B.

Zellen ist so gering, dass nicht von einer Beeinflussung der

Suspension nur eine minimale wurden nach der Isolation durchflusszytometrisch

analysiert, um Kontaminationen durch andere Zelltypen festzustellen. Lymphozyten (B) wurden durch

Population (A) separiert.

BD die

α und IFN-γ in der

urdauer ermittelt. Dabei wurden die Neutrophilen

1 in OD595 nm = 0,1

1 stimuliert oder sie blieben

trolle und verursacht außerdem als PKC-Aktivator

Superantigen; falls die

4 Ergebnisse

44

Hypothese von Moulding et al. [90] hier zutrifft, müsste TSST-1 eine IFN-γ-Sekretion bei

möglicherweise enthaltenden T-Zellen auslösen. Im Sytox-Assay konnte allerdings bei TSST-

1-behandelten Neutrophilen keine Zelltodverzögerung festgestellt werden (s. Anhang Abb.

A4).

Unter allen Stimulationsbedingungen lagen die Konzentrationen aller getesteten Zytokine bei

max. 5 pg/ml oder lagen unter den Nachweisgrenzen (vgl. Kap. 3.4.4). Da keine Unterschiede

zwischen den Zytokin-Konzentrationen bei stimulierten und bei unstimulierten Neutrophilen

bestanden und alle detektierbaren Werte extrem niedrig waren, ist davon auszugehen, dass

diese Zytokin-Konzentrationen keinen biologischen Effekt auf die Neutrophilen hatten.

Bakterielle Überstände von klinischen Carrier-Isolaten verursachten also in hohen

Konzentrationen den Zelltod der Neutrophilen, sublytische Konzentrationen der stationären

Phase bewirkten dagegen bei langer Inkubationsdauer ein verlängertes Überleben und einen

Erhalt der proinflammatorischen Aktivierbarkeit der Neutrophilen.

4.2 Vergleichende Untersuchung von S. aureus-Isolaten von gesunden

Carriern und Patienten mit Furunkulose

Furunkulose ist eine schwere, oft chronifizierende Hautinfektion mit Beteiligung tiefer

Hautschichten und Gewebsnekrosen, die meist durch S. aureus ausgelöst wird. Die

infizierenden Isolate tragen besonders häufig das Toxin Panton-Valentin-Leukozidin (PVL)

[59]. PVL induziert bei humanen neutrophilen Granulozyten eine Zellaktivierung und den

Zelltod.

Das Toxin ist jedoch nicht krankheitsdeterminierend, denn es sind auch Fälle bekannt, bei

denen PVL-negative S. aureus-Isolate eine Furunkulose-Infektion auslösten [83].

Vor den Studien mit den klinischen Isolaten sollen zunächst die Effekte von rekombinantem

PVL selbst in den hier genutzten Assays erläutert werden.

4.2.1 Effekte von rekombinantem PVL auf Neutrophile

Das porenbildende Toxin PVL setzt sich aus zwei Einzelkomponenten, LukF-PV und LukS-

PV, zusammen, die jeweils allein keine Zelltod-induzierende Wirkung haben [55]. Im

Folgenden wurde rekombinantes PVL verwendet, das freundlicherweise von Bettina Löffler

(Universität Münster) bereitgestellt wurde. Löffler et al. zeigten, dass es ab Konzentrationen

von 200 ng/ml innerhalb 1 h den Zelltod der Neutrophilen auslöste [47].

4 Ergebnisse

45

Im Sytox-Assay wurde zunächst der Einfluss der beiden Einzelkomponenten und des PVL auf

die DNA-Freisetzung von Neutrophilen analysiert.

Abb. 9 zeigt, dass beide Einzelkomponenten keine Veränderung der DNA-Freisetzung

gegenüber unstimulierten Neutrophilen verursachten. Eine Kombination beider Komponenten

(PVL) aber löste einen Anstieg der extrazellulären DNA-Werte innerhalb 1 h aus. Die Werte

stiegen während der nächsten 3 Stunden weiter und blieben dann konstant. Sie lagen

unterhalb der Werte bei PMA-induziertem Zelltod. Die Kurvenverläufe der verschiedenen

PVL-Konzentrationen wichen nur geringfügig voneinander ab. Lichtmikroskopisch konnte

ein weitreichender Zelltod bei PVL-Behandlung festgestellt werden (Daten nicht gezeigt).

Abb. 9: Das Toxin PVL, nicht aber die Einzelkomponenten LukF- und LukS-PV, bewirkte eine DNA-Freisetzung der Neutrophilen. Neutrophile wurden im Sytox-Assay mit verschiedenen

Konzentrationen LukF-PV, LukS-PV oder PVL stimuliert.

Eine DNA-Freisetzung der Neutrophilen konnte nur mit PVL beobachtet werden; der Effekt war

dosisabhängig und konnte ab ca. 1 h Inkubation beobachtet werden.

Es ist bekannt, das PVL eine proinflammatorische Aktivierung der Neutrophilen bewirkt. Ob

PVL auch NETs induziert, soll im Folgenden in der Immunfluoreszenzfärbung geklärt

werden.

Neutrophile wurden unter gleichen Stimulationsbedingungen wie oben beschrieben zu

verschiedenen Zeitpunkten (30 min, 1h, 4 h, 12 h) fluoreszenzmikroskopisch analysiert (Abb.

10). Bereits nach 30 min Inkubation konnte beginnend bei der höchsten PVL-Konzentration

4 Ergebnisse

(200 ng/ml) eine Zelllyse beobachtet werden: Die Kerne wurden rund und waren stark

vergrößert, die Zellmembranintegrität war geschädigt, so dass Zellinhalt (angefär

den Granula) austrat (Abb. 10, Bild 7). Bei den niedrigeren PVL

Bild 8 und10 ng/ml, Bild 9) trat der Zelltod etwas verzögert nach 1 bzw. 4 h auf, neben

Zelllyse konnten auch verdämmernde Zellkerne (12 h) beobachtet w

A5). Es wurden keine NETs detektiert. Mit den Einzelkomponenten (Abb.

konnte in allen eingesetzten Konzentrationen zu allen Zeitpunkten keine Zellschädigung

festgestellt werden, allenfalls eine geringfügige Aktivierung

Abb. 10: Nach 30 min Inkubation konnte mit PVL, nichtLukF- und LukS-PV, eine Zelllyse der Neutrophilen beobachtet werden. verschiedenen Konzentrationen LukF

Zeitpunkten fluoreszenzmikroskopisch analysiert. Dargestellt ist der 30 min

rot, NE grün eingefärbt.

Unter PVL-Stimulation konnte besonders bei hohen PVL

Schädigung bis hin zur Lyse der Neutrophilen festgestellt werden. NETs wurden nicht beobachtet. Mit

den Einzelkomponenten LukF- und LukS

46


vergrößert, die Zellmembranintegrität war geschädigt, so dass Zellinhalt (angefär

, Bild 7). Bei den niedrigeren PVL-Konzentrationen (40 ng/ml,


Zelllyse konnten auch verdämmernde Zellkerne (12 h) beobachtet werden (s. Anhang Abb.

). Es wurden keine NETs detektiert. Mit den Einzelkomponenten (Abb.


, allenfalls eine geringfügige Aktivierung der Zellen.

Nach 30 min Inkubation konnte mit PVL, nicht aber mit den Einzelkomponenten PV, eine Zelllyse der Neutrophilen beobachtet werden. Neutrophile wurden mit

verschiedenen Konzentrationen LukF-PV, LukS-PV oder PVL stimuliert und zu verschiedenen

Zeitpunkten fluoreszenzmikroskopisch analysiert. Dargestellt ist der 30 min-Zeitpunkt.

onnte besonders bei hohen PVL-Konzentrationen (200 und 40


und LukS-PV traten keine Veränderungen der Zellmorphologie


vergrößert, die Zellmembranintegrität war geschädigt, so dass Zellinhalt (angefärbt war NE in

Konzentrationen (40 ng/ml,


erden (s. Anhang Abb.

). Es wurden keine NETs detektiert. Mit den Einzelkomponenten (Abb. 10, Bild 1-6)


aber mit den Einzelkomponenten Neutrophile wurden mit

PV oder PVL stimuliert und zu verschiedenen

Zeitpunkt. DNA wurde

Konzentrationen (200 und 40 ng/ml) die


PV traten keine Veränderungen der Zellmorphologie auf.

4 Ergebnisse

47

Die Immunfluoreszenzfärbung bestätigte also, dass PVL in hohen Konzentrationen

(200 ng/ml) innerhalb 1 h Nekrose bei Neutrophilen auslöste; in mittleren Konzentrationen

(10-40 ng/ml) kam es aber zu einem verzögerten Zelltod, der morphologisch Anzeichen einer

Apoptose trägt.

Diese Vermutung wurde in einem Apoptose-Assay adressiert. Hierbei wird

durchflusszytometrisch die Lokalisation von Phosphatidylserin untersucht. Im Laufe des

frühen Apoptoseprozesses wird dieser Membranbestandteil an die Extrazellulärseite der

Zellmembran gebracht und kann so durch spezifische Bindung des Farbstoff-markierten

Annexin V detektiert werden. Außerdem wird DNA mit 7-Aminoactinomycin (7’AAD)

angefärbt. Sobald die Membranintegrität zerstört ist, kann DNA detektiert werden. Es können

folgende Stadien unterschieden werden: (1) Doppelt-negative Zellen sind vital. (2) Annexin

V-positive, 7’AAD-negative Zellen sind frühapoptotisch. (3) Doppelt-positive Zellen

befinden sich in der späten Apoptose oder Nekrose.

Neutrophile wurden unter den gleichen Stimulationsbedingungen wie oben beschrieben zu

drei Zeitpunkten (1 h, 4 h, 12 h) mit diesem Assay analysiert. In Abb. 11 ist der Anteil der

Zellen, der sich zu dem jeweiligen Zeitpunkt in der frühen Apoptose (Annexin V-positiv,

7’AAD-negativ) oder in der späten Apoptose bzw. Nekrose (Annexin V-positiv, 7’AAD-

positiv) befindet, dargestellt. Die Werte der unstimulierten Zellen wurden bei allen Gruppen

abgezogen, um den natürlichen Zelltodverlauf zu berücksichtigen. Bei Stimulation mit den

Einzelkomponenten wurden in allen Konzentrationen und zu allen Zeitpunkten keine

nennenswert erhöhten Anteile früh- oder spätapoptotischer Zellen festgestellt. Bei PVL-

Behandlung war bereits nach 1 h der Anteil frühapoptotischer Zellen erhöht. In der höchsten

PVL-Konzentration (200 ng/ml) stieg der Anteil doppelt-positiver, also schon

spätapoptotischer Zellen nach 4 h auf ca. 13 %, nach 12 h auf ca. 33 %. In den niedrigeren

PVL-Konzentrationen (40 und 10 ng/ml) fand die Apoptose verzögerter statt; nach 4 h war

der Anteil Annexin V-positiver, also frühapoptotischer Zellen um ca. 11-13 % erhöht, nach

12 h wurden die Neutrophilen zunehmend spätapoptotisch, die Anteile doppelt-positiver

Zellen stiegen auf ca. 20 % (40 ng/ml PVL) bzw. 4 % (10 ng/ml PVL).

PMA löste wie bereits bekannt nach einigen Stunden den Zelltod der Neutrophilen aus.

Neben der in der Immunfluoreszenzfärbung beobachteten Nekrose induziert rekombinantes

PVL also auch Apoptose; die Geschwindigkeit des Zelltods ist konzentrationsabhängig.

4 Ergebnisse

48

Abb. 11: PVL induzierte den Zelltod der Neutrophilen. Neutrophile wurden mit verschiedenen

Konzentrationen LukF-PV, LukS-PV oder PVL stimuliert und nach 1, 4 und 12 h

durchflusszytometrisch auf Zelltodmerkmale (Phosphatidylserin, detektiert durch Annexin V, und

DNA-Freisetzung, quantifiziert mit 7’AAD) analysiert. Weitere Erläuterungen s. Text. Die Werte der

unstimulierten Zellen wurden bei allen Gruppen abgezogen.

Bereits nach 1 h Stimulation konnte ein Anstieg der frühapoptotischen und zu späteren Zeitpunkten

auch spätapoptotischen bzw. nekrotischen Zellen unter PVL-Stimulation beobachtet werden. Dieser

Effekt war dosisabhängig. Mit den Einzelkomponenten LukF- und LukS-PV konnte keine erhöhte

Zelltodrate beobachtet werden.

4 Ergebnisse

49

4.2.2 Vergleich der bakteriellen Überstände klinischer Isolate aus Besiedlung

und Furunkulose

Unter Berücksichtigung der Ergebnisse mit rekombinantem PVL wurden nun Untersuchungen

mit bakteriellen Überständen von Carrier- und Furunkulose-Isolaten angeschlossen. Es sollte

untersucht werden, ob sich Furunkulose-induzierende S. aureus-Isolate in ihrer Fähigkeit, den

Zelltod von Neutrophilen zu induzieren, von symptomfrei besiedelnden S. aureus-Isolaten

unterscheiden.

Dafür wurden aus der Studie von Masiuk et al. [83] Furunkulose-Isolate ausgewählt, die einen

möglichst ähnlichen genetischen Hintergrund zu den bereits analyierten sechs Carrier-Isolaten

aufweisen, also aus der gleichen klonalen Linie (clonal cluster, CC) stammen und möglichst

übereinstimmende Superantigen-Genmuster besitzen (Tab. 6). Zu dem Carrier-Isolat SH15-1

(CC 25) lag kein Furunkulose-Isolat mit entsprechendem CC vor. Zwei der insgesamt sieben

ausgewählten Furunkulose-Isolate trugen nicht die PVL kodierenden Gene (lukPV ); alle vier

gesammelten Furunkulose-Isolate des CC 45 (entsprechend zu SH1-2) waren lukPV-negativ

und für den CC 15 (entsprechend zu SH27-1) lag in der Furunkulose-Studie nur ein Vertreter

vor (H6110), der lukPV-negativ war.

Zusätzlich wurden Furunkulose- und Carrier-Isolate aus den CCs 121 und 22 eingeschlossen,

da Stämme dieser klonalen Linien in der Studie von Masiuk et al. ca. 70 % der Furunkulose-

Isolate ausmachten. Das Carrier-Isolat des CC 22 zeigte allerdings ein äußerst schlechtes

Wachstumsverhalten in den genutzten Standardmedien, so dass es ausgeschlossen wurde. Alle

im Folgenden genutzten Isolate sind in Tab. 6 zusammengestellt.

4 Ergebnisse

50

Tab. 6: Übersicht über die genutzten Carrier- und Furunkulose-Isolate, sortiert nach clonal clusters (CC). Zu den bereits eingesetzten sechs Carrier-Isolaten (SH-Stämme) wurden S. aureus-

Stämme isoliert aus Wundabstrichen von Furunkulose-Infektionen (H-Stämme) ausgewählt, die dem

gleichen CC angehören und ein möglichst gleiches Superantigen-Genmuster aufweisen. Außerdem

wurden Pärchen aus den CCs 121 und 22 ausgewählt (Erläuterungen s. Text). Zu den Isolaten SH15-1

(CC 25) und H4764 (CC 22) konnte kein entsprechendes Isolat der jeweils anderen Gruppe

miteinbezogen werden (Erläuterungen s. Text).

S. aureus-Isolat

spa-Typ MLST CC SE, tst egc eta, etd pvl agr

SH1-2 t015 CC45 c l g i m n o - - I

H4764 t015 CC45 c l g i m n o - - I

SH10-1 t008 CC8 d j r - - - I

H3163 t068 CC8 k q - - + III

SH15-1 t056 CC25 - - - - I

SH27-1 t084 CC15 - - - - II

H6110 t084 CC15 - - - - II

SH39-1 t012 CC30 tst g i m n o u - - III

H678 t037 CC30 a tst g i m n o u - + III

SH42-1 t002 CC5 p g i m n o - - II

H7176 t002 CC5 j r p g i m n o - + II

SZ275 t4495 CC121 - g i m n o u - - IV

H5313 t159 CC121 b g i m n o u - + IV

H6754 t005 CC22 - g i m n o - + I

Zunächst wurden die Überstände wie in Kap. 4.1.2 eingeführt in optimiertem RPMI

gewonnen und zur Stimulation der Neutrophilen im Sytox-Assay eingesetzt.

Hier zeigten sich keine Unterschiede zwischen beiden Gruppen. Beispielhaft sind die

Ergebnisse mit einem Isolat jeder Gruppe in Abb. 12 dargestellt. Bakterielle Überstände von

Furunkulose-Isolaten lösten keine vermehrte DNA-Freisetzung bei Neutrophilen aus. Auch

der Langzeit-Effekt der Zelltodverzögerung der Neutrophilen, der in Kap. 4.1.2 anhand der

Carrier-Isolate erläutert wurde, trat bei Stimulation mit Überständen der stationären Phase von

Furunkulose-Isolaten auf (Abb. 12).

4 Ergebnisse

51

Abb. 12: Keine Unterschiede zwischen Carrier- und Furunkulose-Isolaten in der DNA-

Freisetzung der Neutrophilen nach Stimulation mit Kulturüberständen der stationären Phase. Neutrophile wurden im Sytox-Assay mit S. aureus-Überständen der stationären Phase des Carrier-

Isolats SH10-1 (links) und des Furunkulose-Isolates H678 (rechts) in verschiedenen

Verdünnungsstufen stimuliert.

Es konnte keine veränderte DNA-Freisetzung durch den Kulturüberstand des Furunkulose-Isolats

festgestellt werden. Der Überstand des Furunkulose-Isolats bewirkte die gleichen Effekte wie schon

für die Carrier-Isolate in Kap. 4.1.2 beschrieben.

Das optimierte RPMI ist kein bakterielles Nährmedium, S. aureus erreicht in diesem Medium

auch nur eine niedrige Bakteriendichte. Für relevante PVL-Konzentrationen sind aber

wahrscheinlich sehr hohe Bakteriendichten entscheidend, wie sie in nährstoffreichen

Wachstumsmedien in der stationären Phase erreicht werden [84].

4.2.3 Abhängigkeit der PVL-Expression von den Wachstumsbedingungen für

S. aureus

Die eben genannte Vermutung soll im Folgenden überprüft werden, indem S. aureus-

Überstände gewonnen in unterschiedlich reichhaltigen Medien analysiert werden. Für

Langzeit-Untersuchungen wären diese Medien ungeeignet, da sie wahrscheinlich wie schon

für TSB-Medium in Kap. 4.1.2 erläutert das Langzeit-Überleben der Neutrophilen in Kultur

beeinflussen würden. Für PVL wird aber ein rascher Effekt innerhalb der ersten 4 h erwartet,

wie es schon für rekombinantes PVL in diesem Kapitel (4.2.1) beobachtet werden konnte.

Ausgewählte Isolate der am Beginn dieses Kapitels vorgestellten Stammkollektion (Tab. 6)

sowie vier Referenzstämme wurden zur Gewinnung der Überstände in verschiedenen Medien

genutzt. Zu den Referenzstämmen zählten ein klinisches USA300-Isolat, also ein lukPV-

positivr CA-MRSA-Stamm (im Folgenden abgekürzt mit USA300 WT), sowie eine lukPV-

defiziente USA300-Mutante (USA300∆lukPV). Außerdem wurden ein lukPV-transfizierter

Staphylococcus carnosus-Stamm (TM+lukPV) und dessen lukPV-negativer Wildtyp-Stamm

4 Ergebnisse

52

(TM WT) genutzt. Die Ergebnisse der Standard-Multiplex-PCRs zum Screening auf wichtige

Genmarker und Virulenzgene sind im Anhang (Tab. A1) dargestellt.

Die eingesetzten Kultivierungsmedien waren neben optimiertem RPMI-Medium das TSB-

Medium, BHI-Medium und CCY-Medium. TSB-Medium ist ein Standard-Bakterienmedium,

das häufig zur Kultivierung von S. aureus benutzt wird. BHI-Medium ist ein reichhaltigeres

Medium zur Anzucht anspruchsvoller Mikroorganismen. CCY-Medium wurde in der

Literatur erstmals von Gladstone und van Heyningen [94] vorgestellt; später wurde

festgestellt, dass bei Kultivierung von lukPV-positivem S. aureus eine besonders hohe PVL-

Konzentration in diesem Medium erreicht werden kann [95].

Die Überstände wurden in der logarithmischen, der stationären und der poststationären

Wachstumsphase gewonnen, um die über den Kulturverlauf variierende

Genexpressionsregulation zu berücksichtigen.

Untersuchung der PVL-Expression von klinischen S. aureus-Isolate auf

Proteinebene

Das Vorhandensein der lukPV-Gene wurde für die betreffenden Furunkulose-Isolate (s. Tab.

6) und Referenzstämme (s. Anhang Tab. A1) in der PCR bestätigt. Mit den bakteriellen

Überständen der Furunkulose-Isolate in RPMI konnten bisher aber keine PVL-typischen

Effekte beobachtet werden; daher sollte der PVL-Gehalt der bakteriellen Überstände

seminquantitativ im Western Blot ermittelt werden.

Zunächst wurde der Färbeschritt mit dem Primärantikörper optimiert. Antiserum von PVL-

immunisierten Kaninchen bzw. die IgG-Fraktion hieraus wurden jeweils in den

Verdünnungsstufen 1:1.000, 1:10.000 und 1:100.000 eingesetzt. Das restliche Färbeverfahren

im Western Blot war bereits etabliert. Für die Optimierung wurden die Einzelkomponenten

LukF-PV, LukS-PV, beide Komponenten zusammen und die bakteriellen Überstände der vier

Referenzstämme in CCY-Medium in der poststationären Phase benutzt, um die PVL-

Bindungsstärke und -Spezifität der beiden Primärantikörper und der Titrationen zu

vergleichen.

Abb. 13 zeigt, dass die PVL-Bindung sowohl mit dem Antiserum als auch mit der IgG-

Fraktion erfolgreich war. Die LukF-PV- und LukS-PV-Banden waren bei den rekombinanten

PVL-Proben wie auch beim USA300-Wildtyp-Stamm und PVL-transfizierten S. carnosus

(TM+PVL) sichtbar. In CCY-Medium exprimieren diese Stämme also PVL. In den 1:1.000-

und 1:10.000-Verdünnungen waren jedoch auch andere Proteine der bakteriellen Überstände,

v.a. der S. aureus-Stämme, deutlich angefärbt. Dieser Hintergrund war in den 1:100.000-

4 Ergebnisse

Verdünnungen reduziert. Hier wies die Färbung mit Antiserum einen schwächeren

Hintergrund und schärfere PVL

Wahl des Primärantikörpers auf das Antiserum in der 1:100.000

Abb. 13: PVL-Antiserum vom Kanichen in der Verdünnung 1:10.000 bewirkte im Vorversuch die ausgewogenste Anfärbung zur LukFgeeignete Primärreagenz zur Anfärbung der Proteine LukF und LukS in

auszuwählen, wurden die IgG-Fraktion und das Antiserum von mit PVL immunisierten Kaninchen in

verschiedenen Verdünnungsstufen getestet. Aufgetragen wurden die Ein

LukS, das Toxin PVL und vier Referenzstämme, von denen USA300 WT und TM+PVL PVL

sind.

Mit der 1:10.000-Verdünnung des Antiserums wurde eine kräftige Anfärbung der LukF

Banden erreicht, ohne zu starke unspezifische

weiteren Versuche eingesetzt werden soll.

Nachfolgend wurden die bakteriellen Überstände der genannten Isolate und Referenzstämme

im Western Blot analysiert. Dafür wurden die Überstände aller Furunk

BHI- und CCY-Medium sowie die Überstände der vier Referenzstämme in optimiertem

53


Hintergrund und schärfere PVL-Banden als die Färbung mit der IgG-Fraktion auf, so dass

Wahl des Primärantikörpers auf das Antiserum in der 1:100.000-Verdünnung fiel.

Antiserum vom Kanichen in der Verdünnung 1:10.000 bewirkte im Vorversuch die ausgewogenste Anfärbung zur LukF- und LukS-Detektion im Western Blot

eignete Primärreagenz zur Anfärbung der Proteine LukF und LukS in S. aureus

Fraktion und das Antiserum von mit PVL immunisierten Kaninchen in

verschiedenen Verdünnungsstufen getestet. Aufgetragen wurden die Einzelkomponenten LukF und

LukS, das Toxin PVL und vier Referenzstämme, von denen USA300 WT und TM+PVL PVL

Verdünnung des Antiserums wurde eine kräftige Anfärbung der LukF

Banden erreicht, ohne zu starke unspezifische Signale zu erhalten, so dass diese Konstellation für die

weiteren Versuche eingesetzt werden soll.


analysiert. Dafür wurden die Überstände aller Furunkulose

Medium sowie die Überstände der vier Referenzstämme in optimiertem


Fraktion auf, so dass die

Verdünnung fiel.

Antiserum vom Kanichen in der Verdünnung 1:10.000 bewirkte im Vorversuch Western Blot. Um eine

-Kulturüberständen

Fraktion und das Antiserum von mit PVL immunisierten Kaninchen in

zelkomponenten LukF und

LukS, das Toxin PVL und vier Referenzstämme, von denen USA300 WT und TM+PVL PVL-positiv

Verdünnung des Antiserums wurde eine kräftige Anfärbung der LukF- und LukS-

Signale zu erhalten, so dass diese Konstellation für die


ulose-Isolate in TSB-,

Medium sowie die Überstände der vier Referenzstämme in optimiertem

4 Ergebnisse

54

RPMI-, TSB-, BHI- und CCY-Medium ausgewählt; alle Überstände stammten aus der

poststationären Wachstumsphase, weil in dieser am ehesten eine hohe PVL-Konzentration

erwartet wurde. Für die beiden lukPV-positiven Referenzstämme USA300WT und TM+PVL

wurden auch Überstände der logarithmischen Phase in CCY-Medium untersucht, falls PVL

auch schon in dieser Phase sezerniert wird. Außerdem wurde beispielhaft der bakterielle

Überstand eines lukPV-negativen Carrier-Isolats (SH10-1) der poststationären Phase in CCY-

Medium analysiert, um die spezifische PVL-Bindung des Antiserums zu überprüfen.

Die Überstände der Furunkulose-Isolate sind in der oberen Reihe von Abb. 14 dargestellt. Die

verschiedenen Medien der Überstände sind buchstabencodiert: (a) TSB-, (b) BHI- und (c)

CCY-Medium. Die LukF-PV- und LukS-PV-Banden traten am deutlichsten bei den

Überständen in CCY-Medium auf. Eine sehr schwache LukS-PV-Bande war auch bei den

Überständen der Isolate H678, H3163 und H7176 in BHI sichtbar. Überstände in TSB zeigten

keine PVL-Banden. Die beiden lukPV-negativen Isolate H6110 und H4764 waren auch im

Western Blot PVL-negativ. Auffälligerweise waren für das lukPV-positive Isolat H6754 keine

PVL-Banden sichtbar; möglicherweise sind die Gene für die Einzelkomponenten beschädigt,

so dass das Protein nicht exprimiert werden kann.

Oberhalb der Banden der PVL-Komponenten wurde bei fast allen Isolaten ein weiteres

Protein stark angefärbt. Die Intensität der Banden ist nicht Medium-abhängig.

Möglicherweise handelt es sich hierbei um Protein A oder ein anderes Adhärenzprotein von

S. aureus, das unspezifisch Immunglobuline bindet.

In der unteren Reihe von Abb. 14 sind die Ergebnisse mit den Referenzstämmen dargestellt,

die hier durchnummeriert wurden: (1) USA300 WT, (2) USA300∆lukPV, (3) TM WT,

(4) TM+lukPV. PVL-Banden waren nur bei dem USA300 WT-Stamm in CCY-Medium

deutlich sichtbar, außerdem sehr schwach ausgeprägt für den TM+lukPV-Stamm in BHI-

Medium. Die Überstände der beiden lukPV-positiven Referenzstämme aus der

logarithmischen Phase sowie das Carrier-Isolat SH10-1 blieben PVL-negativ. Wie bei den

Furunkulose-Isolaten in der oberen Reihe fiel auch hier bei den beiden S. aureus-Stämmen (1

und 2) eine zusätzliche Bande oberhalb der PVL-Komponenten auf.

4 Ergebnisse

Abb. 14: PVL-Nachweis in Kulturüberständen von FurunkuloseNährmedium. Bakterielle Überstände der Furunkulose

den Medien TSB (a), BHI (b) und CCY (c) gewonnen und im

Einzelkomponenten LukF und LukS untersucht. Außerdem wurden die Überstände de

Phase von den Referenzstämmen USA300 WT (1), USA300

verschiedenen Medien und einzelne Proben der logarithmischen Phase (USA300 WT CCY log,

TM+PVL CCY log) sowie ein Carrier

Bei den Überständen der in der PCR auf

Medium, geringfügig auch in BHI

Überstände der PVL-positiven Referenzstämme USA300 und TM+

positiv. Allerdings war das in der PCR positiv getestete Furunkulose

PVL-negativ. Die Überstände der beiden ausgewählten Referenzstämme aus der logarithmischen

Wachstumsphase und des Carrier

Diese Ergebnisse zeigen, dass die PVL

am stärksten in dem reichhaltigsten der hier genutzten Medien, dem CCY

Überstände wurden im Western Blot

PVL-Banden der CCY-Überstände nicht nur durch die etwas höheren Bakteriendichten und

damit höhere Konzentration der Sekretionsprodukte in den reichhaltigeren Medien erklärbar,

sondern müssen ein selektiver Effe

55

Nachweis in Kulturüberständen von Furunkulose-Isolaten in Abhängigkeit vom Bakterielle Überstände der Furunkulose-Isolate wurden in der poststationären Phase in

den Medien TSB (a), BHI (b) und CCY (c) gewonnen und im Western Blot auf ihren Gehalt an den

Einzelkomponenten LukF und LukS untersucht. Außerdem wurden die Überstände de

Phase von den Referenzstämmen USA300 WT (1), USA300∆PVL (2), TM WT (3), TM+PVL (4) in


TM+PVL CCY log) sowie ein Carrier-Isolat (SH10-1 CCY poststat) analysiert.

Bei den Überständen der in der PCR auf lukPV positiv getesteten Furunkulose-Isolate konnte in CCY

Medium, geringfügig auch in BHI-Medium, eine PVL-Expression festgestellt werden. Auch die

positiven Referenzstämme USA300 und TM+PVL waren in diesen Medien PVL

positiv. Allerdings war das in der PCR positiv getestete Furunkulose-Isolat H6754 im

negativ. Die Überstände der beiden ausgewählten Referenzstämme aus der logarithmischen

Wachstumsphase und des Carrier-Isolats zeigten keine PVL-Expression.

Diese Ergebnisse zeigen, dass die PVL-Expression also vom Kulturmedium abhängig ist und

am stärksten in dem reichhaltigsten der hier genutzten Medien, dem CCY-Medium, ist. Die

Western Blot zwar unverdünnt eingesetzt; trotzdem sind die deutlichen

Überstände nicht nur durch die etwas höheren Bakteriendichten und


sondern müssen ein selektiver Effekt des CCY-Mediums sein.

Isolaten in Abhängigkeit vom Isolate wurden in der poststationären Phase in

auf ihren Gehalt an den

Einzelkomponenten LukF und LukS untersucht. Außerdem wurden die Überstände der poststationären

∆PVL (2), TM WT (3), TM+PVL (4) in


Isolate konnte in CCY-

Expression festgestellt werden. Auch die

PVL waren in diesen Medien PVL-

Isolat H6754 im Western Blot

negativ. Die Überstände der beiden ausgewählten Referenzstämme aus der logarithmischen

Expression also vom Kulturmedium abhängig ist und

Medium, ist. Die

ünnt eingesetzt; trotzdem sind die deutlichen

Überstände nicht nur durch die etwas höheren Bakteriendichten und


4 Ergebnisse

56

Medium-abhängige Effekte der bakteriellen Überstände auf Neutrophile

Die bereits beschriebenen bakteriellen Überstände klinischer Isolate in verschiedenen

Nährmedien wurden nun zur Stimulation von Neutrophilen im Sytox-Assay eingesetzt. Dazu

wurden die Überstände immer auf die gleichen Bakteriendichten normalisiert, also die

jeweilige OD595 nm der Kultur bei Überstandsabnahme. Die bakteriellen Überstände der

stationären und poststationären Phase aller Medien lösten in hohen Konzentrationen (auf

OD595 nm = 0,2 bis 1 verdünnt) die DNA-Freisetzung der Neutrophilen innerhalb der ersten

Stunden aus (s. Anhang Tab. A2). In einer stärkeren Verdünnung (OD595 nm = 0,04) fielen

Unterschiede zwischen den Überständen eines Isolats in verschiedenen Medien auf: Bei

Furunkulose-Isolaten lösten die Überstände in CCY eine stärkere DNA-Freisetzung der

Neutrophilen aus als die Überstände in BHI oder TSB (Abb. 15). Mit Überständen von

Carrier-Isolaten fiel dieser Unterschied deutlich geringer aus oder trat gar nicht auf.

Abb. 15: Stärkere DNA-Freisetzung der Neutrophilen bei Stimulation mit Überständen eines Furunkulose-Isolats gewonnen in reichhaltigen Nährmedien. Neutrophile wurden im Sytox-Assay

mit Überständen des Carrier-Isolats SH10-1 oder des Furunkulose-Isolats H678 gewonnen aus der

stationären Phase und normalisiert auf OD595 nm = 0,04 in verschiedenen Nährmedien stimuliert.

Überstände des Furunkulose-Isolats in reichhaltigen Medien (BHI, CCY) lösten eine stärkere DNA-

Freisetzung der Neutrophilen aus als Überstände des Carrier-Isolats in den gleichen Medien.

Die Ergebnisse mit allen eingesetzten Überständen der potstationären Wachstumsphase sind

farbkodiert in Tab. A2 (s. Anhang) dargestellt.

4 Ergebnisse

Die Daten zu den Überständen

im CCY-Medium verdünnt auf OD

Hier ist die DNA-Freisetzung nach 4 h Inkubation mit den genannten Überständen dargestellt.

Es wird deutlich, dass die Isolate, die im

eine stärkere DNA-Freisetzung bei Neutrophilen hervorriefen als PVL

Unterschied war hochsignifikant (p = 0,0002).

Abb. 16: Stärkere DNA-Freisetzung der Neutrophilen nach Stimulation mit Kulturüberständen PVL-positiver S. aureus-Isolate gewonnen in CCYder Neutrophilen im Sytox-Assay

normalisiert auf OD595 nm = 0,04 in CCY

Die Überstände PVL-positiver Isolate verursachte eine

Freisetzung als die PVL-negativer Isolate. Lediglich bei dem Stamm TM+PVL fiel kein Unterschied

zum PVL-negativen Wildtyp-Stamm auf.

Eine stärkere Zelltodinduktion durch bakterielle Überstände von Furunkulose

primär PVL-vermittelt. PVL verursacht konzentrationsabhängig die Nekrose bzw. Apoptose

der Neutrophilen; S. aureus synthetisiert PVL in relevanten Konzentrationen aber nur unter

speziellen Wachstumsbedingungen und bei hohen Bakteriendichten, was für das Verständnis

des Infektionsverlaufs in vivo

57

Die Daten zu den Überständen der stationären Phase lukPV-positiver und -negativer Isolate

Medium verdünnt auf OD595 nm = 0,04 sind nochmals in Abb. 16 zusammengefasst.

Freisetzung nach 4 h Inkubation mit den genannten Überständen dargestellt.

late, die im Western Blot PVL-positiv getestet wurden (Abb. 1

Freisetzung bei Neutrophilen hervorriefen als PVL-negative Isolate, dieser

Unterschied war hochsignifikant (p = 0,0002).

Freisetzung der Neutrophilen nach Stimulation mit Kulturüberständen Isolate gewonnen in CCY-Medium. Übersicht über die DNA

Assay 4 h nach Stimulation mit Überständen aus der station

= 0,04 in CCY-Medium.

positiver Isolate verursachte eine signifikant (p = 0,0002) stärkere DNA

negativer Isolate. Lediglich bei dem Stamm TM+PVL fiel kein Unterschied

Stamm auf.

Eine stärkere Zelltodinduktion durch bakterielle Überstände von Furunkulose

vermittelt. PVL verursacht konzentrationsabhängig die Nekrose bzw. Apoptose

synthetisiert PVL in relevanten Konzentrationen aber nur unter


berücksichtigt werden sollte.

negativer Isolate

zusammengefasst.

Freisetzung nach 4 h Inkubation mit den genannten Überständen dargestellt.

positiv getestet wurden (Abb. 14),

negative Isolate, dieser

Freisetzung der Neutrophilen nach Stimulation mit Kulturüberständen Übersicht über die DNA-Freisetzung

4 h nach Stimulation mit Überständen aus der stationären Phase

stärkere DNA-

negativer Isolate. Lediglich bei dem Stamm TM+PVL fiel kein Unterschied

Eine stärkere Zelltodinduktion durch bakterielle Überstände von Furunkulose-Isolaten ist also

vermittelt. PVL verursacht konzentrationsabhängig die Nekrose bzw. Apoptose

synthetisiert PVL in relevanten Konzentrationen aber nur unter


4 Ergebnisse

58

4.3 Zelltodinduktion bei Neutrophilen durch lebende S. aureus-Zellen

Neben der Untersuchung der Sekretionsprodukte von S. aureus sollen auch die Wirkungen

der Bakterienzellen auf Neutrophile untersucht werden. Mögliche Interaktionen sind hier

vielfältiger, da sich Bakterien in Kokultur mit Neutrophilen weiter vermehren,

Sekretionsprodukte bilden, aber auch über zellständige Moleküle mit Neutrophilen

interagieren; außerdem können Neutrophile die Bakterien phagozytieren oder durch NETs

inaktivieren.

Lebende S. aureus-Zellen bewirkten einen Anstieg der extrazellulären DNA-Werte der

Neutrophilen im Sytox-Assay (Abb. 17). Je größer das eingesetzte Verhältnis der

Bakterienzahl zur Neutrophilen-Zahl (multiplicity of infection, MOI) war, desto rascher wurde

die DNA-Freisetzung beobachtet. Bei MOI 10 begann der Anstieg der DNA-Werte nach 3-4 h

Kokultur, die Werte stiegen über 4 h weiter an und blieben dann stabil. Lichtmikroskopisch

konnte in der Zeit eine Vermehrung der Bakterienzahl und ein zunehmender Zelluntergang

der Neutrophilen beobachtet werden. Bei niedrigeren MOIs setzte die DNA-Freisetzung

verzögerter ein, der sigmoidale Kurvenverlauf war jedoch ähnlich. Die Kurven aller MOIs

erreichten im Plateau-Bereich ein ähnliches Niveau extrazellulärer DNA-Werte.

Abb. 17: Keine Unterschiede zwischen Carrier- und Furunkulose-Isolaten in der Zelltodinduktion durch lebende Bakterien. Neutrophile wurden im Sytox-Assay mit lebenden

Bakterien des Carrier-Isolats SH27-1 und des Furunkulose-Isolat H6110 in verschiedenen MOIs

stimuliert.

Lebende Bakterien sowohl des Carrier- als auch des Furunkulose-Isolats lösten eine DNA-Freisetzung

der Neutrophilen aus. Die Geschwindigkeit der DNA-Freisetzung war abhängig von der eingesetzten

Bakterienzahl. Carrier- und Furunkulose-Isolate unterschieden sich nicht im Ausmaß der induzierten

DNA-Freisetzung.

Nach 6 h Kokultur der Bakterien und Neutrophilen wurde eine Immunfluoreszenzfärbung

durchgeführt (Abb. 18). Bei Stimulation mit Bakterien der MOI 0,1 konnten Zeichen der

4 Ergebnisse

Apoptose, wie ein Verlust der Kernlobulierung

werden, einige Zellen bildeten

erhebliche Nekrose der Neutrophilen (Bilder 4 und 5)

Abb. 18: Das Zelltodverhalten der Neutrophilen war abhängig von der eingesetzten MOI der lebenden S. aureus-Zellen. Neutrophile wurden mit

verschiedenen MOIs stimuliert und nach 6 h Kokultur fluoreszenzmikroskopisch analysiert.

wurde rot, NE grün eingefärbt.

Abhängig von der eingesetzten MOI zeigten die Neutrophilen Zeichen der Zellaktivierung, Apoptose

und NETose (MOI 0,1) bis hin zur Nekrose (MOI 1

4.3.1 Vergleichende Untersuchung von

Furunkulose-Isolaten

Bakterien der gesamten in Kap. 4.2.2

Sytox-Assay analysiert; es konnten keine Unterschiede zwischen Carrier

Isolaten festgestellt werden. Exemplarisch ist je ein Isolat jeder Gruppe in Abb.

In Abb. 19 sind die Ergebnisse der gesamten Stammkollektion zusammengestellt, di

sind nach CCs sortiert. Abgebildet ist die DNA

Kokultur mit Bakterien der verschiedenen Isolate in Start

59

ein Verlust der Kernlobulierung und ein Schrumpfen der Zelle, beobachtet

, einige Zellen bildeten auch NETs (Bild 6). Mit höheren MOIs (1-10) zeigte sich ein

der Neutrophilen (Bilder 4 und 5).

Das Zelltodverhalten der Neutrophilen war abhängig von der eingesetzten MOI der Neutrophile wurden mit vitalen Bakterien des Isolats SH10

verschiedenen MOIs stimuliert und nach 6 h Kokultur fluoreszenzmikroskopisch analysiert.


) bis hin zur Nekrose (MOI 1-10).

Vergleichende Untersuchung von S. aureus-Zellen von Carrier

Isolaten

Kap. 4.2.2 (Tab. 6) beschriebenen Stammkollektion wurden im

analysiert; es konnten keine Unterschiede zwischen Carrier- und Furunkulose

Isolaten festgestellt werden. Exemplarisch ist je ein Isolat jeder Gruppe in Abb.

sind die Ergebnisse der gesamten Stammkollektion zusammengestellt, di

sind nach CCs sortiert. Abgebildet ist die DNA-Freisetzung der Neutrophilen nach 7 h

Kokultur mit Bakterien der verschiedenen Isolate in Start-MOI 1. Es traten Isolat

und ein Schrumpfen der Zelle, beobachtet

10) zeigte sich eine

Das Zelltodverhalten der Neutrophilen war abhängig von der eingesetzten MOI der olats SH10-1 in

verschiedenen MOIs stimuliert und nach 6 h Kokultur fluoreszenzmikroskopisch analysiert. DNA


Zellen von Carrier- und

(Tab. 6) beschriebenen Stammkollektion wurden im

und Furunkulose-

Isolaten festgestellt werden. Exemplarisch ist je ein Isolat jeder Gruppe in Abb. 17 dargestellt.

sind die Ergebnisse der gesamten Stammkollektion zusammengestellt, die Isolate

Freisetzung der Neutrophilen nach 7 h

MOI 1. Es traten Isolat-spezifische

4 Ergebnisse

60

Unterschiede bei den Werten der extrazellulären DNA auf, jedoch keine Unterschiede

zwischen den beiden untersuchten Gruppen. Die Isolat-spezifischen Schwankungen waren

nicht durch die Zugehörigkeit zu unterschiedlichen CCs bedingt.

Abb. 19: Keine Unterschiede zwischen Carrier- und Furunkulose-Isolaten in der Zelltodinduktion durch lebende Bakterien. Übersicht über alle eingesetzten Carrier- und

Furunkulose-Isolate. Abgebildet ist die DNA-Freisetzung der Neutrophilen nach 7 h Kokultur mit

lebenden Bakterien der MOI 1 (s. Abb. 19).

Es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen Carrier- und Furunkulose-Isolaten hinsichtlich

der DNA-Freisetzung von Neutrophilen festgestellt werden. Es traten jedoch Isolat-spezifische

Unterschiede auf.

5 Diskussion

61

5 Diskussion

In der vorliegenden Arbeit wurde die Zelltodinduktion durch S. aureus bei neutrophilen

Granulozyten analysiert. Da die Bestimmung des Zelltods einige technische Störfaktoren

birgt, sollen zuerst die hier genutzten Methoden zur Zelltoddetektion kritisch beleuchtet und

verglichen werden.

Im Folgenden werden allgemeine Effekte der Interaktion von Neutrophilen mit bakteriellen

Sekretionsprodukten von S. aureus eingeordnet, um dann auf den Isolate-Vergleich aus

nasaler Besiedlung und Furunkulose-Infektion und die Rolle von Panton-Valentin-Leukocidin

einzugehen.

5.1 Methodik der Zelltodbestimmung: Wie aussagekräftig sind die

hier genutzten Assays?

Die einfachste und direkteste Bestimmung von Zelltod besteht in der Messung der DNA-

Freisetzung. Dazu werden DNA-Farbstoffe genutzt, die nicht membrangängig sind und so nur

extrazelluläre DNA detektieren. Damit kann aber nicht zwischen verschiedenen

Zelltodformen differenziert werden.

Zur longitudinalen Erfassung der DNA-Freisetzung wurde der Sytox-Assay verwendet. Durch

die erfasste Kinetik kann orientierend zwischen rascher Lyse oder induzierter Apoptose/

NETose unterschieden werden. Die Konzentration der quantifizierten DNA entspricht aber

nicht unbedingt der Zellzahl, die untergegangen ist: Bei der Nekrose liegt die DNA

dekondensiert vor und ist so besser erreichbar für den Farbstoff, dies könnte höhere

Messwerte der Nekrose-Kontrolle erklären.

Die bislang beste Methode, um NETs sicher nachzuweisen, ist die Immunfluoreszenzfärbung.

Durch die mikroskopische Beurteilung der Zellmorphologie können die Zelltodformen

unterschieden werden. Da die fixierten Zellen vor der Färbung permeabilisiert wurden, wird

auch die DNA vormals vitaler Zellen angefärbt, so dass die Kernmorphologie während

verschiedener Stimulationsbedingungen und in frühen Zelltodphasen ausgewertet werden

kann. Die Apoptose-Morphologie ist allerdings nicht immer ganz einfach festzustellen.

Außerdem werden bei Nekrose z.T. auch lange DNA-Fäden freigesetzt, die nicht mit NETs

verwechselt werden dürfen. Beim Färbevorgang müssen die Zellen mit Sorgfalt behandelt

werden, um während der Waschschritte die fragilen NETs nicht zu zerstören. Wurden die

5 Diskussion

62

Neutrophilen vorher, v.a. während der Isolation stärker gestresst, so können auch bei der

Anfärbung unstimulierter Zellen NETs beobachtet werden.

Als dritte Methode der Zelltodbestimmung wurde ein Apoptose-Assay genutzt, hier die

Detektion von Phosphatidylserin (PS) mittels Annexin V [96] und von extrazellulärer DNA

mittels 7’AAD. Durch diese Doppelfärbung kann die Apoptose (in frühen Stadien Annexin V-

positiv, 7’AAD -negativ) von Nekrose (Annexin V-positiv, 7’AAD -positiv) differenziert

werden.

Die Annexin V-Färbung ist wohl die am weitesten verbreitete Methode zur Apoptose-

Detektion, weil sie folgende Vorteile hat: Die PS-Verschiebung an die Außenmembran

geschieht innerhalb weniger Stunden nach dem apoptotischen Stimulus, durch die hohe PS-

Dichte und die hohe Affinintät von Annexin V zu PS ist sie besonders sensitiv [97] und

zudem verhältnismäßig preiswert. Zur Unterscheidung von nekrotischen Zellen, die ebenfalls

Annexin V-positiv anfärbbar sind, sollte zusätzlich eine Färbung extrazellulärer DNA

erfolgen, wie in dieser Arbeit durchgeführt. Zu beachten ist bei dieser Methode, dass auch

während der NETose die Detektion von PS beschrieben wurde [14], außerdem können ggf.

auch nekrotische Zellen Annexin V-positiv, aber noch negativ für den DNA-Farbstoff sein

[98, 99]. Zur Apoptose-Detektion und -Quantifizierung ist die Annexin V-Färbung also sehr

gut geeignet, sie garantiert allerdings keine absolut sichere Abgrenzung von anderen

Zelltodformen.

Andere Methoden zum Apoptose-Nachweis sind die TUNEL-Methode, dabei wird die DNA-

Fragmentierung quantifiziert [100, 101]: Diese Methode ist eher teuer, weniger sensitiv als

die Annexin V-Färbung und es sind falsch-positive Ergebnisse bei Nekrose, DNA-

Reparaturen und Gentranskriptionsvorgängen möglich [102].

Auch der Nachweis der Caspase-Aktivierung [103, 104] durch spezifische Antikörper wird

häufig genutzt; es wurde aber berichtet, dass die Caspase-Aktiverung kein sicheres Zeichen

für Apoptose ist, zudem sind für diese Methode relativ hohe Zellzahlen nötig [102].

Dies sind allesamt Eigenschaften der Apoptose, die somit spezifisch nachgewiesen werden

kann. Für Nekrose und NETose sind bisher keine spezifischen Marker bekannt. Die

Unterscheidung gelingt am ehesten durch die variierende Morphologie: Bei der Apoptose

schrumpfen die Zellen, die DNA kondensiert und die Zelle löst sich in kleine apoptotische

Körperchen auf; bei der Nekrose schwillt die Zelle an und zerplatzt; bei der NETose löst sich

der Kern auf und DNA-Fäden (NETs) werden freigesetzt.

5 Diskussion

63

Die morphologische Beurteilung ist daher die genaueste Methode, besonders die

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) gilt als Goldstandard zur Apoptosedetektion

[102]. Dieses Verfahren ist aber sehr teuer und aufwändig; meist ist eine lichtmikroskopische

Auswertung der Zellmorphologie mit histologischer oder immunfluoreszenter Färbung

ausreichend.

Da jede Methode Lücken beinhaltet, sollten verschiedene Prinzipien kombiniert werden. Im

Umgang mit Neutrophilen sollte bei der Auswahl zudem berücksichtigt werden, dass

Neutrophile leicht reagible Zellen sind, die möglicherweise schon auf Stimuli der technischen

Behandlung mit einer Aktivierung und Zelltodinduktion antworten und so einen hohen

Hintergrund verursachen können.

Aus diesen Gründen wurde hier der Sytox-Assay als Verfahren, bei dem die Neutrophilen in

der Zellkultur kaum beeinträchtigt werden, genutzt, weil er einen raschen Überblick über die

Kinetik und das Ausmaß des Zelltods unter verschiedenen Stimulationsbedingungen bietet.

Dies wurde kombiniert mit der Quantifizierung von Apoptose in der Annexin V-Färbung und

der qualitativen Beurteilung der Zellmorphologie in der Immunfluoreszenzmikroskopie.

5.2 Modulierung des Zelltods von neutrophilen Granulozyten durch

S. aureus

Zelltodinduktion durch Sekretionsprodukte von S. aureus

In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Kulturüberstände von S. aureus aus der

logarithmischen und der stationären Phase konzentrationsabhängig den Zelltod der

Neutrophilen auslösten. Bekanntermaßen schädigen zahlreiche sezernierte Faktoren von

S. aureus wie z.B. α-Hämolysin [45] oder die phenol-soluble modulins [46] Neutrophile.

Überraschend war jedoch die Beobachtung im Langzeitversuch: Bei Kultivierung über ca.

24 h war der natürliche Zelltod der Neutrophilen, die mit sublytischen Konzentrationen der

bakteriellen Überstände stimuliert wurden, zeitlich verzögert. Zudem war die

proinflammatorische Aktivierbarkeit der Neutrophilen, also die Fähigkeit, auf entsprechende

Stimuli mit einer oxidative burst-Reaktion zu antworten, besser erhalten.

Diese Effekte waren nur mit Überständen aus der stationären Wachstumsphase zu

beobachten, sie scheinen also von der Zusammensetzung der Kulturüberstände abzuhängen;

die Genexpression bei S. aureus wird abhängig von der Zelldichte, also Wachstumsphase

5 Diskussion

64

reguliert. In der logarithmischen Phase werden vor allem Adhärenzfaktoren gebildet, in der

stationären Phase eher Toxine. Dieses Phänomen der Zelltodverzögerung ist bisher wenig

untersucht, da es kaum Studien gibt, die die Effekte von S. aureus-Überständen in

sublytischen Konzentrationen auf Neutrophile über einen längeren Stimulationszeitraum

analysieren.

Ist die Zelltodverzögerung ein Artefakt durch Zellkontaminationen?

Die Gruppe um Moulding et al. hatte den Effekt der Zelltodverzögerung durch S. aureus-

Überstände auch schon beobachtet und konnten zeigen, dass dies indirekt durch Zytokine von

kontaminierenden Lymphozyten bedingt ist [90]. Dass zahlreiche Zytokine, wie IFNγ [90,

92], IL-6 [92, 105, 106], IL-1β [92], IL-2 [107], IL-15 [108], GM-CSF [92, 109, 110] oder in

niedrigen Konzentrationen TNFα [91, 92] den Zelltod der Neutrophilen verzögern und die

Fähigkeit zur burst-Reaktion erhalten können, ist bekannt.

Moulding et al. begründeten die Zytokinfreisetzung mit der Stimulation der Lymphozyten

durch S. aureus-Superantigene [90]. Superantigene bewirken eine polyklonale T-Zell-

Aktivierung, so dass in der Tat geringe Zellzahlen ausreichend für eine Produktion von

relevanten Zytokinmengen wären.

Diese Hypothese wurde in der vorliegenden Arbeit geprüft, konnte jedoch nicht bestätigt

werden: Die Kontamination durch Lymphozyten nach Neutrophilen-Isolation war in dieser

Arbeit um den Faktor 10 geringer als von Moulding et al. berichtet (hier 0,2 %, vgl. Moulding

et al.: < 3 %). Auch löste das Superantigen TSST-1, das kontaminierende T-Zellen zur

starken Zytokinsekretion stimuliert hätte, keine Zelltodverzögerung der Neutrophilen aus.

Zudem lagen die Konzentrationen der Zytokine (IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, TNF-α und IFN-γ) in

der Neutrophilenkultur, stimuliert durch S. aureus-Überstände unter der Detektionsgrenze.

Damit wird auch sehr unwahrscheinlich, dass andere möglicherweise kontaminierende

Zelltypen, wie Makrophagen mittels Zytokinproduktion den Zelltod der Neutrophilen

verzögern.

In Frage käme weiterhin eine Autoregulation der Neutrophilen, publiziert von Ocaña et al.:

Während der in vitro-Infektion mit S. aureus-Zellen wurden die Zytokine IL-6, TNFα und IL-

1β detektiert [78]. Diese Daten konnten wir für TNFα (s.o.) in der vorliegenden Arbeit nicht

bestätigen, IL-6 und IL-1β wurden hier nicht gemessen. In der Studie von Ocaña et al. wurde

allerdings der Anteil der kontaminierenden Lymphozyten nach der Neutrophilen-Isolation

nicht ermittelt, es ist also nicht gesichert, dass die gemessenen Zytokine von Neutrophilen

produziert wurden.

5 Diskussion

65

In der Literatur finden sich weitere Hinweise auf Faktoren, die eine Apoptoseverzögerung der

Neutrophilen bewirken: Dazu zählen Hypoxie [111], ein Faktor, der unter den

experimentellen in vitro-Bedingungen dieser Arbeit keine Rolle spielt, sowie die Aktivierung

von Leptin-Rezeptoren der Neutrophilen [112]. Leptin ist ein Hormon, das v.a. von

Adipozyten synthetisiert wird und den Fettstoffwechsel, das Hungergefühl, aber auch

neuroendokrine und immunologische Funktionen reguliert [113]. Eine Synthesequelle für

Leptin fehlt im experimentellen Design dieser Arbeit und eine Leptin-Produktion durch

Neutrophile selbst ist nicht belegt; dieser Faktor scheidet also ebenfalls aus.

Daher ist davon auszugehen, dass die in dieser Arbeit beobachtete Zelltodverzögerung der

Neutrophilen ein direkter Effekt der S. aureus-Überstände ist und kein Artefakt durch

Zellkontaminationen.

Apoptoseverzögerung im Zuge von intrazellulären Aktivierungsprozessen

Eine weitere Möglichkeit zur Erklärung der Apoptoseverzögerung könnte die Veränderung

von Ionenströmen sein: Bei erhöhtem Calcium-Einstrom [114] und der Verhinderung von

Kalium-Ausstrom, in der Studie von El Kebir et al. durch eine erhöhte extrazelluläre

Kaliumkonzentration erzeugt [115], wird die natürliche Apoptose von Neutrophilen verzögert.

Ein Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration lässt sich bei zahlreichen

Aktivierungsprozessen der Neutrophilen feststellen [116]. Calcium-aktivierbare Kaliumkanäle

wiederum fördern den Einstrom von Kalium in die Zelle [117]. Für andere Zelltypen ist

gezeigt, dass Kalium-Verlust ein Auslöser für Apoptose ist [118, 119]. Somit ist denkbar, dass

bakterielle Faktoren im Rahmen der Neutrophilen-Aktivierung einen Anstieg der

intrazellulären Calciumkonzentration auslösen, damit indirekt auch die Kaliumkonzentration

in der Zelle erhöhen und so vor Apoptose schützen.

Die Zelltodverzögerung könnte auch ein direkter Effekt bakterieller Produkte sein: Es ist für

Lipoteichonsäure (LTA) [120], einen Bestandteil der Zellwand von Staphylokokken, und

CpG-Motive bakterieller DNA (Cytosin-Phosphat-Guanin-Abfolge, besonders häufig in der

DNA von Bakterien und Viren) [121] gezeigt, dass sie die Apoptose von Neutrophilen

verzögern. Beide Substanzen werden allerdings nicht sezerniert, so dass sie sich nicht in den

Kulturüberständen wiederfinden dürften. In der stationären Wachstumsphase sterben

allerdings durch die Knappheit der Nährstoffe auch einige Bakterien ab und setzen diese

Substanzen frei, so dass Überstände der stationären Phase durchaus LTA und bakterielle DNA

enthalten können.

5 Diskussion

66

fMLP, ein chemotaktisches Peptid [122], bewirkt ebenfalls eine Apoptoseverzögerung der

Neutrophilen [92, 123], ebenso die phenol-soluble modulins (PSMs) in sublytischen

Konzentrationen [124].

Für all diese genannten bakteriellen Substanzen ist bekannt, dass sie auch eine

proinflammatorische Aktivierung von Neutrophilen bewirken, z.B. LTA und CpG-Motive

über Toll-like-Rezeptoren. Darüber wird ein Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration

vermittelt und die Substanzen könnten somit eine Verlängerung der Lebensspanne wie oben

beschrieben bewirken.

Apoptose durch Sauerstoffradikale

Denkbar ist auch der Schutz vor Apoptose durch die Reduktion von oxidativem Stress durch

bakterielle Faktoren: Die Superoxiddismutase, Katalase [42] und das Pigment

Staphyloxanthin [43, 125] von S. aureus wirken antioxidativ und schützen die Bakterien

somit vor den reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) der Neutrophilen. ROS sind aber auch für

Neutrophile selbst schädlich und induzieren Apoptose [126]. Durch die bakteriellen

antioxidativen Mechanismen wären sie also vor ihren eigenen Waffen geschützt. Die Gruppe

um Oishi et al. konnte bestätigen, dass Antioxidantien im Kulturmedium die natürliche

Apoptose der Neutrophilen verzögern [127].

Bringt es für S. aureus einen Überlebensvorteil, wenn der wichtigste Gegner

länger am Leben erhalten wird?

Bisher wurde eher die Apoptoseinduktion der Neutrophilen als Strategie verschiedener

Infektionserreger, dem Immunsystem zu entkommen und eine Persistenz im menschlichen

Körper zu ermöglichen [128, 129], angenommen. Man sollte daher annehmen: je geringer die

Apoptose der Neutrophilen, desto effektiver die Immunabwehr, wie auch im Peritonitis-

Modell gezeigt [130].

Gresham et al. zeigten allerdings, dass S. aureus innerhalb der Neutrophilen vital bleibt und

zur Etablierung einer Infektion führen kann [50]. Für mehrere intrazelluläre Erreger wie

Mykobacterium bovis [131], Anaplasma phagocytophilum [132, 133] und Leishmania major

[134] konnte gezeigt werden, dass sie die Apoptose von Neutrophilen verzögern und sich so

einen Ort für ihre intrazelluläre Vermehrung sichern. Die Neutrophilen dienen dabei als

trojanisches Pferd, denn wenn sie dann in Apoptose gehen, werden sie von Makrophagen, die

auf typische Erkennungszeichen der Apoptose wie die extrazelluläre Lokalisation von

Phosphatidylserin reagieren, phagozytiert. Die Makrophagen leiten dann mit entsprechenden

5 Diskussion

67

antiinflammatorischen Signalen die Resolution der Entzündung ein [135], obwohl die

Infektion weiterhin innerhalb der Makrophagen schwelt [134].

In den letzten Jahren wurde eine Rolle als intrazellulärer Erreger auch für S. aureus

zunehmend anerkannt; es gibt Studien, die die intrazelluläre Persistenz [136] und Vermehrung

[137] von S. aureus zeigen.

Auch für überwiegend extrazelluläre Erreger wurde belegt, dass sie mit bakteriellen Faktoren

die Apoptose der Neutrophilen verzögern können (Verotoxin-2 von E. coli [138], water-

soluble surface proteins von Helicobacter pylori [139], YopJ/P von Yersinia spp. [140]) und

dadurch die Entzündung verstärken [141] und dem Immunsystem entkommen können [140].

Die Regulation der Apoptose von Neutrophilen ist also entscheidend für den Ausgang der

Infektion. Da die Einleitung der Apoptose mit der extrazellulären Lokalisierung von

Phosphatidylserin von der NADPH-Oxidase reguliert wird, ist dieser Vorgang bei der

chronischen Granulomatose (CGD), einem genetischen Defekt der NADPH-Oxidase, gestört.

Im CGD-Modell ist folglich die Apoptose der Neutrophilen verzögert. Außerdem fehlt das

Apoptose-Erkennungszeichen für Makrophagen, die Phosphatidylserin-Aufdeckung, daher ist

das sichere Abräumen der sterbenden Neutrophilen beeinträchtigt; frei werdende aggressive

Substanzen der Neutrophilen verursachen eine stärkere und länger anhaltende Entzündung

[142]. Ähnliches ist gezeigt für Caspase-1-defiziente Mäuse: Die Apoptose der Neutrophilen

ist durch den genetischen Defekt dysreguliert, bei pulmonaler Entzündung durch LPS macht

sich dies mit einer längeren Inflammationsphase bemerkbar [143].

Die Apoptoseverzögerung der Neutrophilen bringt für S. aureus also durchaus einen

Überlebensvorteil, denn die Konzentrierung des Immunsystems auf die starke Inflammation

an der Eintrittspforte der Bakterien könnte S. aureus nutzen, um unterdessen unbemerkt zu

entkommen, über andere Zellen als Vehikel oder über den extrazellulären Weg.

Welches Agens von S. aureus nun für die Apoptoseverzögerung veranwortlich ist, ist noch

nicht vollständig geklärt. Da der Effekt der Apoptoseverzögerung mit allen in dieser Arbeit

genutzten Isolaten beobachtet wurde, scheint es ein unter den S. aureus-Linien weit

verbreiteter Faktor zu sein. Die Analyse des Sekretoms von S. aureus mit Hilfe der

Fraktionierung der Kulturüberstände kann hier weiterhelfen (persönliche Mitteilung von S.

Roiijakkers), auch das Spektrum der Oberflächenmoleküle von S. aureus sollte in die Analyse

miteinbezogen werden, die Arbeit von Dreisbach et al. zur Etablierung der surfaceomics

bietet hier einen vielversprechenden Ansatzpunkt [144].

5 Diskussion

68

5.3 Die Rolle von PVL

PVL-Effekte in vitro

Panton-Valentin-Leukocidin (PVL) ist ein porenbildendes Toxin von S. aureus, das

hochspezifisch neutrophile Granulozyten aktiviert und lysiert [55]. Es fiel in der

Vergangenheit auf, dass nekrotisierende Infektionen überrepräsentativ häufig durch PVL-

positive Isolate ausgelöst werden [59]. In Tiermodellen ist die Rolle von PVL in der

Pathogenese dieser Erkrankungen allerdings umstritten [67, 71]. Ein Ziel dieser Arbeit war es

daher, die Effekte auf die Zelltodinduktion von Neutrophilen durch klinische S. aureus-Isolate

aus Furunkulose-Infektion verglichen mit Isolaten aus nasaler Besiedlung zu beleuchten.

Um die Effekte von PVL selbst einzuschätzen, wurden zunächst rekombinantes PVL bzw.

dessen Einzelkomponenten zur Stimulation von Neutrophilen eingesetzt.

In allen verwendeten Assays zur Zelltodbeurteilung (Sytox-Assay, Apoptose-Assay,

Immunfluoreszenzfärbung) konnte gezeigt werden, dass PVL, nicht aber die

Einzelkomponenten LukF- und LukS-PV, bei Neutrophilen Nekrose bzw. in geringeren

Konzentrationen Apoptose induziert. Diese Daten finden Bestätigung in der Literatur: In

verschiedenen Arbeiten wurde berichtet, dass PVL konzentrationsabhängig zunächst die

proinflammatorische Aktivierung der Neutrophilen bewirkt [47, 145-148], in höheren

Konzentrationen die Zellen dann apoptotisch werden bzw. durch den porenformenden Effekt

von PVL lysiert werden [47, 55, 146].

NETs-Bildung konnte in der vorliegenden Arbeit nicht nach Stimulation mit PVL beobachtet

werden. Pilsczek et al., die erstmals über einen NETs-Mechanismus berichteten, bei dem

Neutrophile vital bleiben und der sich bereits nach zehnminütiger Stimulation beobachten

ließ, konnten dieses Phänomen auch nach PVL-Stimulation beobachten [149]. Zu so frühen

Zeitpunkten nach Stimulationsbeginn wurde in der vorliegenden Arbeit die

Zelltodmorphologie der Neutrophilen jedoch nicht untersucht. Für die Fragestellung dieser

Arbeit ist dieser NETs-Mechanismus aber auch nicht relevant.

Effekte von Furunkulose-Isolaten

Die PVL-Expression in den Kulturüberständen der Isolate bei denen die PVL-kodierenden

Gene (luk-PV) nachgewiesen wurden, und die beobachtete Lyse der Neutrophilen durch diese

Überstände waren abhängig vom genutzten Nährmedium zur Bakterienkultivierung: Nur in

besonders reichhaltigen Nährmedien wie BHI und CCY konnte eine PVL-Sekretion detektiert

werden; für das CCY-Medium ist bekannt, dass es selektiv eine hohe PVL-Expression fördert

5 Diskussion

69

[150], die Ursachen hierfür sind nicht geklärt. Die Kulturüberstände der lukPV-positiven

Kulturüberstände, die in CCY-Medium gewonnen wurden, verursachten selbst in niedrigen

Konzentrationen eine stärkere Lyse der Neutrophilen.

Die Abhängigkeit der zytolytischen Wirkung der Kulturüberstände vom Kulturmedium wurde

bereits durch Graves et al. beobachtet [84].

Mit ganzen Bakterienzellen konnten in der vorliegenden Arbeit keine Unterschiede zwischen

Furunkulose- und Carrier-Isolaten bezüglich der Zelltodinduktion von Neutrophilen

festgestellt werden. Damit konnten die Daten von Löffler et al. [47], die eine stärkere

Zelltodinduktion durch PVL-positive Isolate aus nekrotisierenden Infektionen belegt hatten,

nicht reproduziert werden. Selbst mit den Referenzstämmen, die mit den von Löffler et al.

genutzten identisch sind, gab es diese Abweichung in den Ergebnissen. Als Ursache für diese

Unterschiede können nur kleine Abweichungen in der technischen Durchführung

angenommen werden; Löffler et al. kultivierten die Bakterien für Versuche mit lebenden

S. aureus-Zellen in Müller-Hinton-Medium, einem ähnlich reichhaltigen Medium wie BHI,

über Nacht ohne Schütteln. In der vorliegenden Arbeit wurden die Bakterien dagegen bis zum

Erreichen der logarithmischen Phase im weniger reichhaltigen TSB-Medium kultiviert.

Allerdings konnten auch mit der alternativen Verwendung von BHI- oder CCY-Medium und

dem Kultivieren bis in die stationäre Phase keine Unterschiede in der Zelltodinduktion durch

die Bakterien festgestellt werden. Bei Löffler et al. fielen zudem die Unterschiede zwischen

PVL-positiven und -negativen Isolaten am stärksten bei sehr hohen multiplicities of infection

(MOIs), nämlich 50-200 Bakterien pro neutrophilem Granulozyt, auf. Mit MOI 10 dagegen,

einer Bakterienkonzentration, die auch in der vorliegenden Arbeit eingesetzt wurde, gab es

bei Löffler et al. keine Unterschiede in der Zelltodinduktion. Entweder sind also eine andere

Kultivierungsform und sehr hohe Bakteriendichten nötig, um einen Effekt von PVL bei der

Zelltodinduktion von Neutrophilen durch lebende Bakterien zu beobachten, oder aber andere

Virulenzfaktoren der PVL-positiven Isolate überdecken bei diesen hohen Bakteriendichten

den PVL-Effekt.

Wann wird PVL gebildet im Entzündungsgeschehen?

Wenn für die Bildung von PVL besondere Nährstoffbedingungen und möglicherweise eine

hohe Bakteriendichte benötigt werden, stellt sich die Frage, ob diese Bedingungen während

einer Infektion erfüllt sind und PVL tatsächlich in vivo gebildet wird. Mögliche Unterschiede

des in vitro-Sekretoms von S. aureus verglichen mit dem in vivo-Sekretom stellen eine nicht

zu vernachlässigende Limitation bei der Beurteilung von in vitro-Studien mit Staphylokokken

5 Diskussion

70

dar. PVL wird in vitro post-exponentiell exprimiert [151, 152] und dabei positiv agr-reguliert

[152, 153]. Eine hohe Bakteriendichte, wie sie sich auch in Abszessen finden lässt, ist also ein

begünstigender Faktor für die PVL-Expression. Zusätzlich verstärken einige Antibiotika die

PVL-Expression [154, 155], daher ist eine kritische Auswahl des Antibiotikums und

ausreichend hoch dosierte und lange antibiotische Therapie bei S. aureus-Infektionen wichtig.

Dass PVL tatsächlich in vivo gebildet wird, konnten mehrere Studien bestätigen: Der PVL-

Nachweis gelang in Eiterproben aus Abszessen [156] und Lungen-Nekropsien von Patienten,

die an einer nekrotisierenden Pneumonie verstorben waren [55]. Ein indirekter Nachweis ist

zudem die Existenz von PVL-Antikörpern im Menschen [157, 158].

Von PVL zur Gewebsnekrose

Warum treten nun bei Schädigung der Neutrophilen bei S. aureus-Infektionen mit PVL-

Beteiligung Gewebsnekrosen am Infektionsherd auf? Hierfür sieht man die neutrophilen

Granulozyten als Verursacher: Während ihrer starken proinflammatorischen Aktivierung und

vor allem durch ihre Nekrose setzen sie Sauerstoffradikale und destruierende Enzyme frei, die

das umliegende Gewebe schädigen. Möglicherweise bewirkt PVL in sublytischen

Konzentrationen auch eine Zelltodverzögerung der Neutrophilen im Zuge der

Aktivierungsprozesse wie in Kap. 5.2 erläutert und stört damit die Beendigung der

Inflammation durch das Immunsystem. Es konnte bereits beobachtet werden, dass

Neutrophile in der Abszessumgebung, also einem typischen Krankheitsbild mit PVL-

positiven Staphylokokken, eine verlängerte Lebensspanne aufweisen [159]. Zugleich zeigten

neutropene Kaninchen bei Behandlung mit PVL mildere Entzündungszeichen als Kaninchen

mit normalen Neutrophilen-Zahlen [148]. Ist der Beitrag von Neutrophilen zur Infektion mit

PVL-positiven Isolaten also nur als nachteilig anzusehen? Nein, denn wenn man Patienten,

die unter rezidivierender Furunkulose leiden, immunologisch untersucht, fällt auf, dass viele

von ihnen Beeinträchtigungen in den Abwehrfunktionen der Neutrophilen, wie Chemotaxis

[160] oder Stickoxid-Synthese [161], aufweisen; Neutrophile sind also durchaus relevant für

eine effektive Immunabwehr von PVL-positiven Staphylokokken.

Die umstrittene Rolle von PVL im Mausmodell

Es liegt am nächsten, von den in vitro-Versuchen zunächst den Schritt in das Mausmodell zu

gehen, in dem schon viele Virulenzfaktoren von S. aureus untersucht wurden [46, 162].

Für PVL sind die Effekte in der Maus jedoch umstritten. Löffler et al. zeigten, dass nur

neutrophile Granulozyten vom Menschen und Kaninchen, nicht aber von der Maus oder auch

5 Diskussion

71

von Primaten PVL-suszeptibel sind [47]. Dementsprechend wurde mehrfach gezeigt, dass

PVL keinen Effekt in Infektionsmodellen in der Maus hat [71, 77].

Dennoch gibt es auch mehrere Studien, die ein signifikant schlechteres Krankheitsbild in

Mäusen bei Infektionen mit lukPV-positiven S. aureus-Stämmen [67-69, 163] belegen. Für

eine dieser Studien [67], die gezeigt hatte, dass eine nekrotisierende Pneumonie bei der Maus

nur durch einen lukPV-positiven S. aureus-Stamm verursacht wurde, konnte später

nachgewiesen werden, dass eine Punktmutation im agr-Gen ursächlich für die höhere

Virulenz dieses Stamms war und sich bei Reparatur des Gendefekts keine Unterschiede im

Krankheitsverlauf mehr feststellen ließen [70].

Weitere Hinweise auf die abweichenden Ergebnisse könnten technische Unterschiede sein: In

den Studien, die einen Effekt von PVL im Mausmodell zeigten, wurde der gleiche

Mausstamm, nämlich BALB/c-Mäuse, verwendet [67-69, 163]. Tseng et al. beobachteten,

dass mit BALB/c- und CD1-Mäusen, nicht jedoch mit C57/BL6- oder SKH1-Mäusen ein

schwereres Krankheitsbild durch lukPV-positive Staphylokokken auftrat [69]. Der eingesetzte

Mausstamm scheint also eine wichtige Rolle zu spielen. Eine Lösung des Problems zeichnet

sich hier jedoch nicht ab, denn auch Bubeck-Wardenburg et al., die keinen Effekt mit lukPV-

positiven Stämmen feststellten, benutzten BALB/c-Mäuse [71].

Ein anderer technischer Unterschied ist die Wahl des bakteriellen Nährmediums: In den

Studien, die einen Effekt durch PVL belegen, wurden eher reichhaltige Medien wie CCY

[67], [163] oder Müller-Hinton [68] verwendet, in denen mit einem Negativergebnis dagegen

TSB-Medium [71, 77].

Del Giudice et al. sehen dagegen die Ursache für die Unterschiede in den Ergebnissen in der

Art der Infektion [60]: In den Studien, in denen eine Hautinfektion gesetzt wurde, wurde diese

sekundär verursacht, d.h. die Bakterien wurden auf die verletzte Haut oder subkutan appliziert

[71, 77]. PVL ist aber vor allem mit primären Hautabszessen assoziiert, also einer Infektion

auf vormals intakter Haut.

Solange keine eindeutige Ursache für die abweichenden Ergebnisse im Mausmodell gefunden

ist, sollte zur Charakterisierung von PVL auf ein anderes Modell zurückgegriffen werden, hier

brachte bisher das Kaninchen-Modell eindeutige Ergebnisse [47, 66, 148].

Trägt PVL zur hohen CA-MRSA-Virulenz bei?

PVL ist zwar epidemiologisch stark mit nekrotisierenden Infektionen, überwiegend verursacht

durch CA-MRSA-Stämme, assoziiert [62, 63, 74, 83], doch es konnte mehrfach belegt

werden, dass die Anwesenheit der PVL-kodierenden Gene nicht entscheidend für den

Krankheitsverlauf [74, 75] oder den Ausgang [164-166] der Infektionen ist; auch korrelierte

5 Diskussion

72

die Höhe der PVL-Produktion klinischer Isolate in vitro nicht mit der Schwere der Infektion

durch dasselbe Isolat in der Patientenstudie [74, 167].

Mitunter wurde sogar ein besserer Ausgang der Erkrankung beobachtet, wenn sie durch

lukPV-positive Isolate hervorgerufen wurde, verglichen mit lukPV-negativen Infektionen. Hay

et al. postulieren für dieses überraschende Ergebnis einen statistischen confounder-Effekt: Da

vor allem junge Patienten ohne Grunderkrankungen von lukPV-positiven Infektionen

betroffen sind[61, 62, 72, 73], sind durch die besseren gesundheitlichen Voraussetzungen der

Patientengruppe Parameter wie die Mortalität verzerrt.

Ein weiterer erschwerender Faktor bei der Beurteilung der Datenlage ist außerdem, dass

mindestens acht verschiedene Definitionen von CA-MRSA in der Literatur existieren [168].

Es wird daher mehrheitlich vermutet, dass eher der genetische Stammhintergrund der CA-

MRSA-Stämme verantwortlich ist für die besondere Virulenz [66, 77, 169] und nicht PVL

allein. Kobayashi et al. konnten beobachten, dass CA-MRSA-Stämme in vitro eine

programmierte Nekrose bei humanen neutrophilen Granulozyten auslösen [170]. Demnach

waren in der vorliegenden Arbeit möglicherweise keine Effekte mit Bakterien lukPV-positiver

Isolate sichtbar, weil es keine CA-MRSA-Stämme waren und die Anwesenheit von PVL

allein nicht krankheitsdeterminierend ist. Allerdings waren mehrere klinische lukPV-positive

Isolate, die in der Studie von Löffler et al. eine stärkere Lyse der Neutrophilen verursachten,

ebenfalls keine CA-MRSA-Stämme [47].

Trotz der Ergebnisse in in vitro-Studien kann PVL in vivo bisher keine klare Rolle in der

Pathogenese von nekrotisierenden Infektionen wie der Furunkulose zugewiesen werden. Es

gilt daher, nach weiteren Hinweisen zu suchen, die den Zusammenhang zwischen den lukPV-

Genen und der Furunkuloseinfektion erklären.

6 Zusammenfassung

73

6 Zusammenfassung

Staphylococcus (S.) aureus nimmt dem Menschen gegenüber eine ambivalente Rolle ein, da

er zum einen häufiger Kommensale ist, aber auch zum Pathogen werden kann. Zu den

bedeutendsten Gegnern von S. aureus zählen die neutrophilen Granulozyten. Sie haben eine

kurze Lebensspanne und weisen hochspezialisierte Zelltodstrategien, wie Apoptose oder

NETose auf. Auffälligerweise besitzen S. aureus-Isolate, die Furunkulose auslösen,

überproportional häufig das Gen für das Panton-Valentine-Leukozidin (PVL), welches

hochspezifisch humane neutrophile Granulozyten lysiert. Zu den Interaktionen zwischen

S. aureus und Neutrophilen sind noch viele Fragen ungeklärt.

Die Ziele dieser Arbeit waren deshalb (1) die Charakterisierung der Wirkung von S. aureus

auf das Zelltodverhalten von Neutrophilen und (2) der Vergleich dieser Mechanismen bei

kommensalen S. aureus-Isolaten und Isolaten von Patienten mit chronisch rekurrenter

Furunkulose. Dazu wurde der Zelltod von Neutrophilen mit einem DNA-Freisetzungstest

(Sytox-Assay) und mitttels Immunfluoreszenzfärbung analysiert.

Auffällig waren dabei folgende Beobachtungen:

(1) Hohe Konzentrationen der S. aureus-Kulturüberstände führten zur Nekrose der

Neutrophilen. In sublytischen Konzentrationen bewirkten Überstände der stationären

Wachstumsphase dagegen eine Verzögerung der natürlichen Apoptose der Neutrophilen in

Kultur, deren Fähigkeit zur proinflammatorischen Aktivierung dabei erhalten blieb. Es ist

vorstellbar, dass sich S. aureus, von dem inzwischen bekannt wurde, dass er auch intrazellulär

persistieren kann, auf diese Weise in den Neutrophilen eine Überlebensnische schafft.

Bei Stimulation mit lebenden Bakterienzellen konnten konzentrationsabhängig Nekrose,

Apoptose und geringfügig NETose der Neutrophilen beobachtet werden.

(2) Der Vergleich von S. aureus-Isolaten aus nasaler Besiedlung und Furunkuloseinfektion

zeigte, dass bakterielle Überstände von Furunkulose- Isolaten, die die PVL-kodierenden Gene

besaßen, eine deutlich stärkere Lyse der Neutrophilen verursachten. Dieser Effekt war nur

dann zu beobachten, wenn die Bakterien tatsächlich PVL bildeten, wozu sie nur in besonders

reichhaltigen Medien in der Lage waren. Dies ist ein starker Hinweis, darauf, dass der Zelltod

durch PVL verursacht wurde. Mit lebenden Bakterien konnten zwischen beiden Gruppen

keine Unterschiede in der Zelltodinduktion der Neutrophilen festgestellt werden.

Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass S. aureus neutrophile Granulozyten auf

verschiedene Weise beeinflussen kann: Neben der Induktion von Zelltod können die

Bakterien auch Substanzen freisetzen, die die Lebensspanne der Abwehrzellen verlängern.

6 Zusammenfassung

74

Außerdem stützen die Befunde das Konzept einer zentralen Rolle für PVL bei Haut- und

Weichteilinfektionen durch S. aureus, das bisher vor allem auf epidemiologischen Befunden

basierte.

7 Anhang

75

7 Anhang

Abb. A1: Keine Zelltodinduktion der Neutrophilen durch bakterielle Überstände der logarithmischen Wachstumsphase. Neutrophile wurden im Sytox-Assay mit Kulturüberständen des

Isolats SH1-2 aus der logarithmischen Wachstumsphase, normalisiert auf verschiedene ODs,

stimuliert.

Die eingesetzten Verdünnungen der Überstände aus der logarithmischen Phase lösten keine erhöhte

DNA-Freisetzung der Neutrophilen aus verglichen mit unstimulierten Zellen.

7 Anhang

76

Abb. A2: S. aureus-Kulturüberstände der stationären Phase bewirkten in hoher Konzentration (OD595 nm = 0,24) den Zelltod der Neutrophilen, in sublytischen Konzentrationen (OD595 nm = 0,1 bis 0,05) die Verzögerung des Zelltods der Neutrophilen. Neutrophile wurden im Sytox-Assay mit

Kulturüberständen der sechs Carrier-Isolate aus der stationären Wachstumsphase gewonnen in TSB

stimuliert. Dies ist ein anderes Experiment als in Abb. 6 dargestellt.

Hohe Konzentrationen (normalisiert auf OD595 nm = 0,24) der Überstände einiger Isolate (SH1-2,

SH10-1, SH27-1) verursachten eine erhöhte DNA-Freisetzung der Neutrophilen, in sublytischen

Konzentrationen (normalisiert auf OD595 nm = 0,1 bis 0,05) wurde dagegen nach ca. 20 h Kulturdauer

eine verzögerte DNA-Freisetzung verglichen mit unstimulierten Neutrophilen beobachtet.

7 Anhang

77

Abb. A3: Reduzierte DNA-Freisetzung der Neutrophilen durch TSB-Medium. Neutrophile

wurden im Sytox-Assay mit verschiedenen Verdünnungsstufen des Kulturüberstands des klinischen

Isolats SH10-1 aus der stationären Phase, gewonnen in TSB-Medium, oder nur mit TSB-Medium in

gleichen Anteilen wie im Überstand inkubiert.

Bei Zugabe von TSB-Medium – ob in Form vom Kulturüberstand oder dem Medium selbst – wurde

nach 19 h Kultur signifikant (p < 0,0001 für Verdünnungen 1:10) weniger freigesetzte DNA detektiert

als bei unstimulierten Neutrophilen.

Abb. A4: Keine veränderte DNA-Freisetzung der Neutrophilen durch Stimulation mit dem Superantigen TSST-1. Neutrophile wurden im Sytox-Assay mit 1 µg/ml TSST-1, einer

Konzentration, die bei Lymphozyten eine starke polyklonale Aktivierung und Zytokinfreisetzung

bewirkt [171], stimuliert.

TSST-1 hatte keinen Effekt auf die DNA-Freisetzung der Neutrophilen verglichen mit unstimulierten

Neutrophilen, ein verzögerter Zelltod nach langer Kulturdauer (24 h) konnte nicht festgestellt werden.

7 Anhang

78

7 Anhang

79

Abb. A5: PVL, nicht aber die Einzelkomponenten LukFbewirkte den Zelltod der Neutrophilen. verschiedenen Konzentrationen LukF-PV, LukS

und zu verschiedenen Zeitpunkten fluoreszenzmikroskopisch analysiert.

Dargestellt sind die Ergebnisse nach 1, 4 und 12 h.

eingefärbt.

Unter PVL-Stimulation konnte besonders bei hohen PVL

(200 und 40 ng/ml) die Schädigung bis hin zur Lyse der Neutr

festgestellt werden. Bei niedriger PVL-Konzentration (5 ng/ml) wurde eine

Zellschädigung erst verzögert (nach 12 h) beobachtet.

beobachtet werden. Die Einzelkomponenten LukF

verursachten keine Zellschäden, allenfalls

Neutrophilen. Zum 12 h-Zeitpunkt war auch ein Großteil der unstimulierten

Neutrophilen verdämmert.

Einzelkomponenten LukF- und LukS-PV, der Neutrophilen. Neutrophile wurden mit

PV, LukS-PV oder PVL stimuliert

en fluoreszenzmikroskopisch analysiert.

sind die Ergebnisse nach 1, 4 und 12 h. DNA wurde rot, NE grün

Stimulation konnte besonders bei hohen PVL-Konzentrationen

ng/ml) die Schädigung bis hin zur Lyse der Neutrophilen

Konzentration (5 ng/ml) wurde eine

Zellschädigung erst verzögert (nach 12 h) beobachtet. NETs konnten nicht

Einzelkomponenten LukF- und LukS-PV

verursachten keine Zellschäden, allenfalls eine leichte Aktivierung der

Zeitpunkt war auch ein Großteil der unstimulierten

7 Anhang

80

Tab. A1: Übersicht über die Ergebnisse der Multiplex-PCR mit den vier Referenzstämmen. Es fiel auf, dass das USA300 WT-Isolat mecA-negativ ist, also keine Methicillin-Resistenz trägt.

Möglicherweise ist diese im Zuge des fehlenden Selektionsdrucks unter Laborbedingungen verloren

gegangen; da dieser Eigenschaft für die nachfolgenden Versuche nicht von Bedeutung ist, wurde

dennoch mit diesem Isolat weiter gearbeitet.

S. aureus-Isolat

mecA MW1409 nuc MW756 arcA 16SrRNA seh etd PVL gyr

USA300 WT - + + - + + - - + +

USA300∆PVL + + + - + + - - - +

TM WT - - - - - + - - - -

TM+PVL - - - - - + - - + -

7 Anhang

81

Tabelle A2: Stärkere DNA-Freisetzung der Neutrophilen bei Stimulation mit Überständen der Furunkulose-Isolate gewonnen in reichhaltigen

Nährmedien. Übersicht über das Ausmaß der lichtmikroskopisch beobachteten Zelllyse nach Stimulation mit den Überständen eines Carrier-Isolats, den

Furunkulose-Isolaten bzw. den Referenzstämmen. Neutrophile wurden im Sytox-Assay mit Überständen des Carrier-Isolats SH10-1, der sieben Furunkulose-

Isolate bzw. der vier Referenzstämme stimuliert. Alle Überstände sind aus der poststationären Wachstumsphase und wurden auf die OD595 nm 1, 0,2 und 0,04

normalisiert eingesetzt. Dabei wurden Überstände aus den Medien TSB, BHI und CCY verglichen. Nach 4 h Stimulation wurde die Morphologie der stimulierten

Neutrophilen lichtmikroskopisch beurteilt und nach verschiedenen Schädigungsgraden farblich codiert.

Bakterielle Überstände, die in den reichhaltigeren Medien CCY und BHI gewonnen wurden, lösten bei gleicher Konzentration einen stärkeren Zelltod der

Neutrophilen aus. Besonders in niedrigen Konzentrationen (normalisiert auf OD595 nm = 0,04) fällt das stärkere zellschädigende Potential der PVL-positiven

Isolate auf.

pvl - - - + + + + +

SH10-1 H6110 H4764 H5313 H678 H3163 H7176 H6 754

OD: 1 0,2 0,04 1 0,2 0,04 1 0,2 0,04 1 0,2 0,04 1 0,2 0,04 1 0,2 0,04 1 0,2 0,04 1 0,2 0,04

TSB

BHI

CCY

pvl + - - +

nahezu vollständige Zelllyse

USA300 WT USA300∆PVL TM WT TM+PVL

starke Zelllyse

OD: 1 0,2 0,04 1 0,2 0,04 1 0,2 0,04 1 0,2 0,04

mittlere Zelllyse

TSB leichte Zelllyse

BHI Zellcluster

CCY abgeflachte Zellen

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93

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Publikationen

94

Publikationen

1. P. Döring, D. Grumann, J. Kolata, C. Goosmann, U. Völker, V. Brinkmann, B. M. Bröker,

„Neutrophil cell death induction by S. aureus from nasal colonization and chronic

furunculosis”, Tagung „host-pathogen-interactions in bacterial infections”, 31.05.-03.06.2010

in Greifswald (Poster)

2. P. Döring, D. Grumann, J. Kolata, C. Goosmann, B. Löffler, U. Völker, V. Brinkmann, B.

M. Bröker, „Neutrophil cell death induction by Staphylococcus aureus from nasal

colonization and chronic furunculosis”, 63. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für

Hygiene und Mikrobiologie (DGHM), 25-28.09.2011 in Essen (Poster)

Eidesstattliche Erklärung

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Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine

anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.

Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät, keiner anderen wissenschaftlichen

Einrichtung vorgelegt worden.

Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass eine

Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.

Greifswald, den 18.06.2013

Tabellarischer Lebenslauf

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Danksagung

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Danksagung

Documents

Aus der Abteilung für Immunologie (Leiterin Univ.- Prof ... fileAus der Abteilung für Immunologie (Leiterin Univ.- Prof. Dr. Barbara M. Bröker) des Instituts für Immunologie und