Embed Size (px)
Citation preview
Aus der
Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe
im Marienhospital Herne
- Universitätsklinik -
der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. Clemens Tempfer
Befall von Lymphknoten durch Endometriose – Genexpressionsanalyse
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Nadine Katharina Notscheid
aus Köln
2013
Dekan: Prof. Dr. med. Klaus Überla
Referent: Prof. Dr. med. Clemens Tempfer
Korreferent: Prof. Dr. med. Stephan Hahn
Tag der mündlichen Prüfung: 08.04.2014
ABSTRACT
Befall von Lymphknoten durch Endometriose – Genexpressionsanalyse
Nadine K. Notscheid
Problem. Über molekulare Mechanismen der Ausbreitung von Endometriose
auf das lymphatische System ist wenig bekannt. Daher wurde in dieser Arbeit
das Expressionsmuster eines Sets von Genen in unterschiedlichen Stadien des
Befalls von Lymphknoten (PSLN) durch Endometriose bestimmt. Es sollten so
Hinweise auf relevante Faktoren erhalten werden, die bei diesem Prozess eine
Rolle spielen.
Methode. Aus Formalin-fixierten/Paraffin-eingebetteten Gewebeproben (EL =
Primärläsionen, PSLN+/− = PSLN mit/ohne isolierten Endometriose-ähnlichen
Zellen, MEL = PSLN mit intranodulärer Endometrioseläsion) von Patientinnen
mit ovarieller bzw. peritonealer Endometriose wurde RNA extrahiert und die
Genexpression von 28 Genen mittels Real-Time PCR quantifiziert. Zusätzlich
wurde in einigen Fällen die Expression auf Proteinebene immunhistochemisch
verifiziert.
Ergebnis. Die Genexpression wurde in EL (n=13), IELC-negativen (n=8) bzw.
positiven (n=11) PSLN sowie in einer MEL (n=1) untersucht. Gene, die in EL
hoch exprimiert waren, aber nicht in PSLN−, und die bekannterweise in IELC
exprimiert sind (wie ESR1 und PGR) zeigten den erwarteten
Verdünnungseffekt. Interessanterweise zeigten CXCR4, CD68, MKI67 und
CD44 in PSLN+ (und MEL) eine höhere Expression als in PSLN− (bei
geringster Expression in EL). Im Gegensatz dazu waren EpCAM und E-
Cadherin, die in EL und MEL stark exprimiert waren nicht in IELC-positiven
PSLN nachweisbar.
Diskussion. Die Daten deuten darauf hin, dass die Ausbreitung von
Endometriose auf das lymphatische System von einer differenzierten
Expression einiger Gene (CD44s, CD44v6, CD68, CXCR4, CDH1 und EPCAM)
begleitet ist und somit Parallelen zu malignen Transformationen und
Metastasierung aufweist.
Meiner Familie gewidmet.
1
INHALTSVERZEICHNIS
Einleitung ........................................................................................................... 8
Endometriose ................................................................................................. 8
Prävalenz / Risikofaktoren .............................................................................. 9
Einteilung und Klassifizierung ....................................................................... 11
Klinik / Symptome ......................................................................................... 13
Diagnostik ..................................................................................................... 14
Makroskopisches Bild ................................................................................... 17
Therapie ....................................................................................................... 18
Ätiologie / Pathophysiologie .......................................................................... 23
Malignitätskriterien und Lymphknotenbeteiligung ......................................... 27
Fragestellung und Zielsetzung ......................................................................... 31
Materialien und Methoden ................................................................................ 32
Patientengut ................................................................................................. 32
Gewebeproben ............................................................................................. 33
RNA-Extraktion aus FFPE-Proben ............................................................... 34
Photometrische Konzentrationsbestimmung von RNA ................................. 36
Synthese der komplementären DNA (cDNA)................................................ 36
Quantitative Real-Time PCR ........................................................................ 37
Immunhistochemie ....................................................................................... 41
Statistische Auswertung ............................................................................... 44
Berechnung des Recurrence-Scores ............................................................ 44
Ergebnisse ....................................................................................................... 46
Proben .......................................................................................................... 46
Extraktion von RNA auf FFPE-Gewebe. Methodenvergleich ....................... 48
RNA-Isolation, Qualität der erhaltenen RNA bzw. cDNA .............................. 50
Quantitative Real-Time PCR ........................................................................ 50
Unterschiede in der Genexpression zwischen den Probengruppen ............. 52
EPCAM ist in MEL stark exprimiert, jedoch nicht in IELC-positiven PSLN ... 56
Überexpression von CXCR4, CD68, MKI67 und CD44-Spleißvarianten in
IELC-positiven PSLN und PSLN mit MEL .................................................... 57
Keine Expression von CTSL2 und SCUBE2 in MEL? .................................. 58
2
Immunhistochemie bestätigt die Expression von CXCR4 und CD44v6 und
die Abwesenheit von E-Cadherin in Östrogenrezeptor-positiven IELCs ....... 58
Anwendbarkeit des Oncotype DX Tests bei Endometriose? ........................ 60
Teilweise Publikation der Ergebnisse ........................................................... 61
Diskussion ........................................................................................................ 62
Auswahl der Gene ........................................................................................ 62
Bewertung des Materials / Kritische Betrachtung der Methode
(Limitationen) ................................................................................................ 65
Lymphknotenbefall durch Endometriose ist problematisch ........................... 67
Rolle der EMT bei der Ausbreitung von Endometriose ................................. 70
Veränderte Expression von CD44 Spleißvarianten ...................................... 75
Wird der Befall des lymphatischen Systems mit endometrioiden Zellen
durch CXCL12-induzierte Chemotaxis begünstigt? ...................................... 78
Tragen Makrophagen zur Ausbreitung von Endometriose bei? .................... 79
Verlust der SCUBE2-Expression in der MEL? .............................................. 79
Betrachtungen zur Expression weiterer Gene .............................................. 80
Anwendbarkeit eines Oncotype DX-ähnlichen Recurrence-Scores bei
Endometriose ............................................................................................... 82
Schlussbemerkungen ................................................................................... 83
Literaturverzeichnis .......................................................................................... 84
Danksagung
Lebenslauf
3
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
A
AFS American Fertility Society (seit 1995 als American Society
for Reproductive Medicine bekannt)
Art.-Nr. Artikelnummer
C
CA-15-3 Cancer-Antigen 15-3
CA-72 Cancer-Antigen 72
CA-125 Cancer-Antigen 125
cDNA Complementary DNA (Komplementäre
Desoxyribonukleinsäure)
COX-2 Cyclooxygenase-2
CSC Cancer stem cells (Krebs-Stammzellen)
Ct Cycle treshold
CXCL12 (SDF1α) CXC-Motiv-Chemokin 12 (stromal cell-derived factor α)
D
DAB 3,3’-Diaminobenzidin
dATP Desoxyadenosintriphosphat
dCTP Desoxycytidintriphosphat
dGTP Desoxyguanosintriphosphat
dTTP Desoxythymidintriphosphat
DNA Desoxyribonukleinsäure
E
ECM Extracellular matrix (extrazelluläre Matrix)
EL Endometriotic lesion (Endometriose-Primärläsion)
EMT Epithelial-mesenchymale Transition
ER Estrogen receptor (Östrogenrezeptor)
ESR1 Östrogenrezeptor-Gen
4
F
FFPE Formalin-fixiert, Paraffin-eingebettet
G
GnRH Gonadotropin-freisetzendes Hormon
GRB7 Growth factor receptor-bound protein 7
GUS β-Glucuronidase
H
H2O2 Wasserstoffperoxid
HER2 Humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor 2
HE-Schnitt Hämatoxylin-Eosin-gefärbter Schnitt
HGNC HUGO Gene Nomenclature Committee
I
IELC Isolated endometriosis-like cells (Isolierte Endometriose-
ähnliche Zellen)
IgG Immunglobulin-G
IHC Immunhistochemie
K
Kat.-Nr. Katalognummer
Ki-67 Proteinprodukt des MKI67-Gens
L
LYVE-1 Lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor
M
MEL Metastatische Endometrioseläsion (PSLN mit
intranodulärer Endometrioseläsion)
MET Mesenchymal-epitheliale Transformation
MMP Matrix-Metalloproteinase
mRNA Boten-RNA
MRT Magnetresonanztomographie
5
N
n Anzahl
NK-Zellen Natürliche Killer-Zellen
O
OD Optische Dichte
P
PCR Polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
PGE2 Prostaglandin E2
PGR Progesteronrezeptor
PP-14 Plazentales Protein 14
PRLPO Prolactin-like protein O
Prox-1 Prospero homeobox protein 1
PSLN Pelvic sentinel lymph node (Pelvine Wächtelymphknoten)
PSLN+ PSLN mit isolierten Endometriose-ähnlichen Zellen
PSLN- PSLN ohne isolierte Endometriose-ähnliche Zellen
Q
qPCR Quantitative PCR
R
rAFS American Fertility Society Revised Classification of
Endometriosis
rASRM Revised classification of the American Society of
Reproductive Medicine
RNA Ribonukleinsäure
RS Recurrence-Score
RSU Unskalierter Recurrence-Score
S
SLN Sentinel lymph node (Wächterlymphknoten)
6
T
TAG-72 Tumor-assoziiertes Glykoprotein-72
TAM Tumor-assoziierte Makrophagen
TBS Tris-gepufferte Salzlösung
TBS-Tx TBS mit 0,025% Triton X-100
TFRC Gen, welches für Transferrin Rezeptor Protein 1 kodiert
TIAR Tissue-Injury and Repair
TNFα Tumornekrosefaktor α
Typ-2-17-β-HSD 17 β-Hydroxysteroiddehydrogenase vom Typ 2
U
UV Ultraviolett
V
VEGF Vaskulär-endothelialer Wachstumsfaktor
VEGFR VEGF-Rezeptor
7
ABBILDUNGEN UND TABELLEN
Abb. 1 H&E-gefärbte Schnitte der Gewebeblöcke, aus denen
mittels einer Stanze Proben für die RNA-Extraktion gezogen
werden........................................................................................... 47
Abb. 2 Grafische Darstellung der Genexpressionsniveaus .................. 54-55
Abb. 3 Repräsentative immunhisotochemische Färbungen eines
Wächterlymphknoten mit eingestreuten IELCs, des PSLN
mit ausgebildeter Endometrioseläsion (MEL) und einer
Endometriose Primärläsion ........................................................... 59
Tab. 1 Gene, Primersequenzen und Amplikons ................................. 39-40
Tab. 2 Probengruppen .............................................................................. 46
Tab. 3 Vergleich der RNA Extraktionsmethoden ...................................... 49
Tab. 4 Gene und Expression ............................................................... 50-52
Tab. 5 ΔCt-Werte ausgewählter Gene in einer Reihe von Proben
aus derselben Patientin ................................................................. 57
Tab. 6 Oncotype DX-ähnliche Scores ...................................................... 60
8
EINLEITUNG
Endometriose
Endometriose ist eine Erkrankung des Uterus und dessen Gewebe, definiert als
das Vorkommen von endometrialen und endometriumähnlichen Drüsen- und
Stromagewebe außerhalb des physiologischen Endometrium im Cavum uteri
(Halis et al., 2010; Olive und Schwartz, 1993). Endometriose gilt als chronische
entzündliche Erkrankung und ist zudem eine der häufigsten gutartigen
proliferativen Krankheiten der Frau im gebärfähigen Alter. Die häufigsten
Lokalisationen der Endometrioseherde stellen das Ovar, das Peritoneum, das
uterosakrale Ligament, der Douglas-Raum und das rektovaginale Septum dar.
Endometrioseläsionen außerhalb des kleinen Beckens, wie beispielsweise am
Bauchnabel oder am Zwerchfell, sind eher selten (Farquhar, 2000).
Kurioserweise scheinen sich die Endometrioseläsionen häufiger auf der linken
Körperhälfte zu bilden, allerdings existiert dafür keine Begründung (Hsu et al.,
2010). Das Gewebe der atop gelegenen Endometrioseherde entspricht dabei
biologisch dem basalen Endometrium. Es kann sich einerseits um
Absiedlungen und andererseits um Neubildung von endometrialem Gewebe
handeln. Oft finden sich in den Endometrioseläsionen auch Muskelzellen und
die Implantationen sind zudem durch Nerven sowie Blut- und Lymphgefäße
versorgt (Halis et al., 2010; Oehmke et al., 2007). Zusätzlich können
Endometrioseherde auch andere Ausprägungen des Müller’schen Epithels
imitieren, in Form von z.B. tuboiden (Endosalpingeose), isthmusähnlichen oder
zervikoiden (Zervikose) Differenzierungsarten. Bestehen die Implantationen rein
aus zytogenem Stroma, so spricht man von einer Stromatose (Schweppe,
2011). Innerhalb der endometrioiden Läsionen sind außerdem im glandulären
Anteil und im Stroma Östrogenrezeptoren (ER α/β) und Progesteronrezeptoren
(PR A/B) exprimiert, sodass die ektopen Endometrioseherde ähnlichen
proliferativen und aktivierenden zyklusabhängigen Veränderungen wie das
physiologische Endometrium unterliegen (Bloski und Pierson, 2008; Halis et al.,
2010; Neukomm und Mueller, 2007). Endometriose ist daher als eine
östrogenabhängige Erkrankung zu sehen (Giudice und Kao, 2004).
9
Die anteilige Verteilung der Steroidhormonrezeptoren unterscheidet sich jedoch
von der im eutopen Endometrium, was sich auch in einem unterschiedlichen
Effekt durch therapeutisch verabreichte Hormone zeigt. Es wirkt sowohl das in
den Gonaden produzierte als auch das peripher durch Aromatisation von C19-
Steroiden entstandene Östrogen auf die Endometrioseläsionen. Gewisse Gene,
die für Aromatase sowie für die sogenannten „Steroidogenic-acute-regulatory“-
Proteine kodieren, werden verstärkt exprimiert und spielen für die lokale
Östradiolproduktion eine wichtige Rolle. Zudem werden diese durch
Prostaglandin E2 (PGE2) stimuliert. Durch eine erhöhte Konzentration des
Enzyms Cyclooxygenase 2, welches wiederum unter Einfluss von Östradiol,
Interleukin 1β und PGE2 stimuliert wird, kommt es zu einem Anstieg des PGE2.
Es entsteht also ein Circulus vitiosus, der letztendlich eine vermehrte
Östradiolproduktion bewirkt. Des Weiteren besteht bei Patientinnen mit
Endometriose ein verringerter Abbau des Östradiols, weil die 17β-
Dehydrogenase, welche Östradiol in das inaktivere Östron umwandelt, eine
Fehlfunktion aufweist. Dies führt in Summe zu einem besonders starken
östrogenen Einfluss auf die Endometrioseherde (Neukomm und Mueller, 2007).
Prävalenz / Risikofaktoren
Endometriose ist eine häufige Erkrankung und zählt neben den Myomen der
weiblichen Gebärmutter als zweithäufigste, als gutartig charakterisierte,
proliferative Erkrankung der Frau. In Deutschland gibt es ungefähr 1,5 Millionen
Endometriosepatientinnen; die Inzidenz der Endometriose liegt nach
Schätzungen zufolge bundesweit bei circa 40.000/Jahr (Schweppe, 2011). Das
Durchschnittsalter zum Zeitpunkt der Diagnosestellung beträgt 28 Jahre.
Hauptsächlich tritt die Erkrankung im gebärfähigem Alter auf, aber es sind
jedoch auch Fälle von Endometriose bei prämenarchealen sowie
postmenopausalen Frauen bekannt (Haas et al., 2012; Pritts und Taylor, 2003).
Die in der Literatur anzutreffenden epidemiologischen Daten in Bezug auf
Endometriose sind recht uneinheitlich. Das liegt daran, dass diese Erkrankung
durch sehr variable klinische Symptome bzw. Ausprägungen gekennzeichnet
ist. Patientinnen mit sehr ausgeprägten Endometrioseherden können nur
geringe Symptomatik beklagen oder sich gar asymptomatisch zeigen, während
10
andere Patientinnen auch trotz vergleichsweise gering ausgeprägter Läsionen
unter schweren Beschwerden leiden können.
Da die chirurgische Beurteilung mittels Laparoskopie bzw. Laparotomie somit
letztlich die einzige objektive Methode zur Diagnosestellung der Endometriose
darstellt, ist es praktisch nicht möglich, die tatsächliche Prävalenz der
Endometriose in der unselektierten weiblichen Bevölkerung zu ermitteln. Damit
stellen die Daten zur allgemeinen Prävalenz, die mit 6-10% angenommen wird,
nur Schätzwerte dar (Bloski und Pierson, 2008; Giudice und Kao, 2004; Olive
und Schwartz, 1993). In der Literatur finden sich jedoch zahlreiche Angaben zur
Häufigkeit innerhalb verschiedener Subpopulationen, mit großen
Schwankungen, je nachdem nach welchen Gesichtspunkten die Einteilung
erfolgte (z.B. klinische Symptomatiken oder Altersklassen). Bei Frauen mit
chronischen Unterbauchschmerzen und / oder Infertilität liegt die Endometriose-
Prävalenz bei 35–50% (Giudice und Kao, 2004). Haas et al. untersuchten die
Prävalenz von Endometriose bei Patientinnen in diversen Altersklassen und
verglichen die Häufigkeit der Endometriose zwischen diesen Gruppierungen.
Die Ergebnisse zeigten, dass Endometriose bei Patientinnen vor dem
zwanzigsten Lebensjahr eher selten bis sehr selten auftritt. Es fiel jedoch ein
sprunghafter Anstieg der Prävalenz ab dem zwanzigsten Lebensjahr auf,
sodass in der reproduktionsfähigen Altersgruppe der 20 – 45-Jährigen eine
Häufigkeit von etwa 78% existierte. In der postmenopausalen Patientengruppe
(im Alter zwischen 55 und 95 Jahren) hingegen fiel die Prävalenz auf ca. 2,5%
herab (Haas et al., 2012).
Bei Endometriosepatientinnen besteht eine familiäre Häufung der Erkrankung,
sodass eine über sechsfach erhöhte Prävalenz bei Verwandten ersten Grades
vorliegt (Simpson et al., 1980). Zudem gibt es bei eineiigen Zwillingen eine noch
größere Übereinstimmung (75%), was auf eine genetische Prädisposition
hinweist (Hadfield et al., 1997; Moen, 1994).
Die oben genannte Tatsache, dass Endometriose vor allem im gebärfähigem
Alter, d.h. unter dem Effekt des Steroidhormons Östrogen auftritt unterstützt die
Definition der Erkrankung als östrogenabhängig (Bloski und Pierson, 2008).
Daraus ergibt sich auch der Risikofaktor Östrogeneinfluss, der sich aus der
11
Menstruations- bzw. Reproduktionsanamnese ableitet und als besonders
einflussreich gestaltet, wenn eine frühe Menarche bzw. eine späte Menopause
eintreten. Eine zusätzliche Risikoerhöhung entsteht bei verkürzter Länge des
weiblichen Zyklus (<27 Tage). Dagegen reduziert die Einnahme von oralen
Kontrazeptiva die Wahrscheinlichkeit, an Endometriose zu erkranken (Cramer
und Missmer, 2002; Farquhar, 2007). Schwangerschaften bzw. Stillphasen
wirken ebenfalls risikoreduzierend. Klinischen Beobachtungen zufolge wird also
das Risiko an Endometriose zu erkranken durch einen verlängerten
Blutungszeitraum und einer erhöhten Blutungsfrequenz gesteigert. Aber auch
spontane oder induzierte Schwangerschaftsabbrüche steigern besonders bei
jüngeren Patientinnen die Erkrankungswahrscheinlichkeit (Schweppe, 2011).
Ein weiterer sehr stark mit dem Vorhandensein von Endometriose korrelierter
Risikofaktor ist Dysmenorrhoe, wobei diese jedoch generell eher als ein
Symptom der Erkrankung angesehen wird. Eine hohe Körpergröße scheint
statistisch ebenso eine erhöhte Wahrscheinlichkeit für Endometriose zu bergen
wie auch Exposition gegenüber Alkohol und Koffein. Raucherinnen hingegen
weisen ein verringertes Risiko auf (Cramer und Missmer, 2002).
Einteilung und Klassifizierung
Endometriose kann nach unterschiedlichen Aspekten eingeteilt werden,
beispielsweise nach der Lokalisation der Endometrioseherde. Diese hat sich im
klinischen Alltag bewährt und ist vor allem im deutschsprachigem Raum weit
verbreitet (Halis et al., 2010).
Bei der Endometriosis genitalis interna können sich Herde einerseits in den
intramuralen und proximalen Abschnitten der Tuben befinden (auch bekannt als
Salpingitis isthmica nodosa), andererseits können Endometrioseläsionen in das
Myometrium der Uteruswand einwachsen (Adenomyosis uteri) (Genss, 2009).
Die Adenomyosis uteri unterscheidet sich jedoch von der klassischen
Endometriose hinsichtlich pathogenetischer, epidemiologischer sowie
symptomatischer Aspekte, sodass diskutiert wird, sie als eigene Entität
anzusehen (Olive und Schwartz, 1993). Unter den Oberbegriff Endometriosis
genitalis externa fallen Herdlokalisationen im Ovar, in der Vagina bzw. der
Vulva, am Perineum sowie an uterinen Ligamenten und im Douglasraum. Eine
12
weitere Form ist die Endometriosis extragenitalis bei der man Herde
beispielsweise an Darm und Blase bzw. Harnleiter, im Leistenkanal, an
Episiotomie- und Hautnarben, aber auch am Nabel, in der Leber und an der
Pleura sowie der Lunge und im zentralen Nervensystem vorfinden kann
(Genss, 2009). Eine weitere Einteilung nach der Herdlokalisation ist die
Unterteilung in peritoneale, ovarielle und tief infiltrierende Endometriose. In über
50% der Fälle findet man jedoch sogenannte Endometriosemischformen vor
(Neukomm und Mueller, 2007). Die tief infiltrierende Endometriose findet sich
insbesondere am Septum rectovaginale, der hinteren Fornix vaginae und im
Retroperitoneum, ist aber zum Beispiel auch in Darm, Harnblase oder
Harnleitern anzutreffen (Renner et al., 2006).
1979 veröffentlichte die American Fertility Society (AFS, seit 1995 als American
Society for Reproductive Medicine bekannt) das Klassifikationssystem rAFS zur
Stadieneinteilung der Endometriose, das 1985 als rASRM modifiziert wurde und
in dieser Form bis heute gültig ist (American Society for Reproductive Medicine,
1997). Das rASRM-Klassifikationssystem unterteilt die Endometriose in vier
Stadien aufsteigend von I = minimal bis IV = schwer. Hierbei wird während einer
Laparoskopie bzw. einer Laparotomie ein Punktescore errechnet, der unter
Anderem Lokalisation, Durchmesser und Infiltrationstiefe der intraperitoneal
sichtbaren Endometrioseherde, aber auch das Ausmaß der Adhäsionen an
Ovar und Tube und im Douglasraum berücksichtigt. Doch auch die
überarbeitete rASRM-Klassifikation weist Mängel auf und stellt nur eine
suboptimale Klassifikationsmöglichkeit dar. So werden beispielsweise die tiefer
liegenden extraperitonealen Herde und die tief infiltrierende Endometriose nicht
beachtet. Ebenso wenig werden Aktivitätszustände der Herde oder eine
mögliche Infertilität berücksichtigt, sodass eine schlechte Korrelation zwischen
Schweregrad der Erkrankung und klinischer Erscheinung besteht, da besonders
diese Formen und Erscheinungsbilder der Endometriose zum Teil gravierende
klinische Symptome verursachen (Coccia und Rizzello, 2011; Renner et al.,
2006).
Aufgrund dieser Mängel erarbeitete eine Arbeitsgruppe der Stiftung der
Endometriose Forschung den sogenannten ENZIAN-Score, der vor allem einer
13
optimierten Klassifikation der organübergreifenden, tief infiltrierenden
Endometriose dient und sich bei der Ausdehnung in verschiedenen
Kompartimenten (beispielsweise Retroperitoneum) an der onkologischen
Stadieneinteilung orientiert (Keckstein et al., 2007; Tuttlies et al., 2005).
Klinik / Symptome
Endometriose weist ein sehr vielgestaltiges klinisches Erscheinungsbild auf.
Manche Patientinnen können sich auch als asymptomatisch erweisen und es
besteht keine Korrelation zwischen Ausprägung und Größe der
Endometrioseherde und der von der Patientin geschilderten Symptomatik. Des
Weiteren existieren keine pathognomischen Symptome, die konkret auf die
Erkrankung hinweisen können. Es gibt jedoch gewisse klinische Anzeichen, die
typischerweise häufig bei bestehender Endometriose vorliegen und somit auf
die Erkrankung hinweisen können, aber dennoch nicht obligat vorhanden sein
müssen. Beispielsweise gilt Infertilität als eine häufige Symptomatik der
Endometriose (Bloski und Pierson, 2008; Olive und Schwartz, 1993). Bei
Patientinnen, die unter Sterilität litten, wurde in 30-50% der Fälle histologisch
Endometriose nachgewiesen. Als ursächlich für das Sterilitätsproblem kommen
unter anderem Adhäsionen mit konsekutivem Tubenverschluss bzw. Tuben-
Motilitätsstörungen in Betracht, aber auch Autoimmunmechanismen, eine
herabgesetzte Oozytenqualität oder auch ein verändertes eutopes
Endometrium mit Störungen des Spermientransportes und Hemmung einer
regelrechten Einnistung (Renner et al., 2006).
Ein weiteres charakteristisches und häufiges Symptom der Erkrankung ist der
Unterbauchschmerz, welcher sich unterschiedlich ausgeprägt darstellen kann.
Oft äußert er sich als sekundäre oder auch als progressive primäre
Dysmenorrhoe, aber auch als Dyspareunie oder zyklusunabhängige Unterleibs-
oder Rückenschmerzen. Die Dysmenorrhoe ist häufig vergesellschaftet mit
Adhäsionen im Douglasraum und kann teils prämenstruell (ca. zwei Tage vor
der Menstruation) einsetzen und während der Menstruation bereits wieder
rückläufig werden. Dyspareunie tritt vor allem bei Beteiligung des uterosakralen
Ligaments im Rahmen einer tief infiltrierenden Endometriose auf (Hsu et al.,
2010; Olive und Schwartz, 1993; Renner et al., 2006). Bei einigen Patientinnen,
14
die unter besonders schwerwiegenden Schmerzen leiden, kommt es als Folge
häufig zu einer negativen Beeinflussungen des Sexuallebens, der
Lebensqualität sowie der Arbeitsfähigkeit (Ferrero et al., 2011). Es liegen
jedoch auch Studienergebnisse vor, die nahelegen, dass Endometriose bei
Unterbauchschmerzen nur ein Epiphänomen, jedoch nicht die Begründung der
Schmerzsymptomatik darstellt (Schweppe, 2011).
Bei der seltenen Manifestation der Endometrioseherde an atypischen
Lokalisationen können außerdem auch außergewöhnlichere Symptome
entstehen. Bei pulmonaler Beteiligung können z.B. Pleuraergüsse,
Pneumothoraces sowie Hämoptysen auftreten. Ebenso kann es bei Sitz des
Endometrioseherdes im Hirn zu zyklusabhängigen Cephalgien und
Krampfanfällen kommen. Eine Lumboischalgie kann bei Sitz des Herdes im
Retroperitoneum beschrieben sein (Olive und Schwartz, 1993). Bei Befall von
Blase und Darm kann es insbesondere perimenstruell zu Dysurie oder
Dyschezie sowie Blähungen, Diarrhoen oder Obstipation kommen. Allen
Symptomatiken gemein ist, dass sie insbesondere bei ausgedehntem Befall vor
allem menstruationsabhängig auftreten (Renner et al., 2006).
Endometriosepatientinnen berichten teilweise zusätzlich von Fatigue-ähnlichen
Symptomen, depressiver Verstimmung und Angststörungen (Halis et al., 2010).
Endometriosepatientinnen weisen ein erhöhtes Risiko auf, zusätzlich an
malignen Entitäten zu erkranken. Hierzu zählen vor allem ovarielle Tumoren
sowie Non-Hodgkin-Lymphome, aber auch das Mammakarzinom. Allerdings
können auf dem Boden einer Endometriose, d.h. direkt aus einem
Endometrioseherd heraus trotz des invasiven Proliferationscharakters nur
selten (ca. in 1% der Fälle) maligne Tumore entstehen. Dabei sind zu 80% das
Ovar und nur zu 20% extragonadale Manifestationen betroffen, bei Letzteren
am häufigsten das Rektosigmoid sowie das Septum rectovaginale (Ulrich et al.,
2003; Melin et al., 2007).
Diagnostik
Wie weiter oben bereits beschrieben, besteht bei Endometriose ein Mangel an
Kongruenz zwischen klinischer Symptomatik und dem anatomischen Ausmaß
15
der Endometrioseherde. Darüber hinaus fehlt es an pathognomonischen
Beschwerden. Es gibt jedoch diverse differentialdiagnostische Erkrankungen,
die ebenfalls wie Endometriose chronischen Unterbauchschmerz verursachen
können. Darunter fallen z.B. entzündliche Erkrankungen der benachbarten
Organe im kleinen Becken wie Zystitiden (Bloski und Pierson, 2008). Hierdurch
wird die Stellung der Diagnose erschwert, was dazu führt, dass das Intervall
zwischen Auftreten der ersten Symptome und Diagnosestellung in Deutschland
im Durchschnitt sechs Jahre beträgt (Schweppe, 2003).
Die immense Variabilität der Symptomatik erfordert deshalb eine exakte sowie
differenzierte Anamneseerhebung (Oehmke et al., 2007). Fallen in der
Anamnese einer Patientinnen Dysmenorrhoe, Dyspareunie oder Sterilität auf,
so sollte zumindest differentialdiagnostisch an eine mögliche Endometriose
gedacht werden. Jedoch sollten zusätzlich differentialdiagnostische
Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes und des Urogenitaltraktes ins Auge
gefasst und gleichzeitig möglichst ausgeschlossen werden (Hsu et al., 2010).
Obwohl die klinische vaginale bimanuelle Untersuchung nur geringe
Sensitivität, Spezifität und wenig Vorhersagewert aufweist, können dennoch
livide Verfärbungen der Fornix vaginae, Narben, aber auch Adhäsionen, Zysten
und Indurationen auffallen. Eine fixierte Retroflexion des Uterus oder eine
sogenannte „frozen pelvis“ können z.B. auf ausgedehnte Adhäsionen
hindeuten. Zystisch vergrößerte, druckdolente Adnexen können Hinweis auf ein
Endometriom geben. Außerdem kann besonders bei Beteiligung der
Sakrouterinligamente ein Portioschiebeschmerz provoziert werden. Auch die
rektovaginale Untersuchung sollte obligater Bestandteil im Rahmen der
Endometriosediagnostik sein, denn hierbei können die häufig befallenen
Sakrouterinligamente und mögliche Darmbeteiligung evaluiert werden. Die
klinischen Untersuchungen können jedoch beispielsweise bei nur
geringgradigem Befall auch völlig unauffällig und schmerzlos verlaufen
(Farquhar, 2007; Hsu et al., 2010; Renner et al., 2006). Im Rahmen der
Diagnostik der Endometriose stehen zusätzlich auch bildgebende Verfahren zur
Verfügung. Diese weisen jedoch Limitationen in der diagnostischen Anwendung
16
auf, denn es mangelt an adäquater Auflösung, um kleinere Herde, Adhäsionen
oder oberflächliche peritoneale Läsionen darzustellen.
Die Ultraschalluntersuchung stellt eine kostengünstige Möglichkeit zur
Diagnostik dar, ist jedoch stark abhängig vom jeweiligen Untersucher.
Endometrioseherde stellen sich sonographisch als echoärmere, lineare
Verdickungen oder Verklumpungen mit oder ohne glatter Begrenzung dar. Bei
einer transvaginalen Ultraschalluntersuchung durch einen erfahrenen
Untersucher können mit hoher Sensitivität und Spezifität Endometriome, Herde
in der Blase und Läsionen einer tief infiltrierenden Endometriose beispielsweise
am rektovaginalem Septum dargestellt werden. Endometriome, die auch als
Schokoladenzysten bezeichnet werden, stellen sich als glatt begrenzte Zyste
mit verdickter Wandstruktur und Binnenechos bzw. Granulationen und je nach
Zysteninhalt mit dorsaler Schallverstärkung dar. In Bezug auf die Endometriome
kommen im Rahmen einer Ultraschalluntersuchung z.B. auch Dermoidzysten
oder Neoplasien in Betracht. Die transrektale Sonographie kann Anwendung
finden, um rektale Beteiligung bei Endometriose oder Implantationen an der
hinteren Blasenwand zu visualisieren (Hsu et al., 2010; Renner et al., 2006).
Die Magnetresonanztomographie (MRT) ist zwar kostenintensiver, jedoch
hilfreich bei der bildgebenden Diagnostik der tief infiltrierenden Endometriose
sowie bei der Visualisierung von Läsionen, die sich an atypischen Stellen
befinden. Eine MRT wird jedoch aufgrund der hohen Kosten meist nur im
Rahmen einer Studie oder bei fraglichem sonographischen Befund
durchgeführt. Die Computertomographie hingegen weist nur eine
unzureichende Darstellung der Organe im kleinen Becken auf. Sie findet
dennoch unter Kontrastmittelgabe Anwendung, um Beteiligungen des Ureters
und die eventuell daraus resultierende Niereninsuffizienz zu bestimmen. Im
Falle einer Beteiligung von Blase und/oder Darm können zusätzlich eine
Zystoskopie sowie eine Sigmoidoskopie bzw. eine Koloskopie durchgeführt
werden (Hsu et al., 2010).
Verschiedene Serummarker wurden auf ihre Nützlichkeit bei der Diagnostik der
Endometriose bzw. bei der Charakterisierung der Aktivität bzw. des Verlaufs der
Endometriose untersucht. So ist beispielsweise CA-125 bei Patientinnen mit tief
17
infiltrierender Endometriose im Serum erhöht, während bei Frauen mit milder
Endometriose keine signifikante Erhöhung feststellbar ist. Daher kann CA-125
nur ein stützender Parameter im Algorithmus der Endometriosediagnostik
darstellen. Zurzeit existiert kein adäquater Marker, der für die Erkrankung
spezifisch ist bzw. mit deren Symptomen korreliert (Hsu et al., 2010;
Muyldermans et al., 1995). Damit sind Serummarker (z.B. CA-72, CA-15-3,
TAG-72, PP-14) und Marker im Douglasraum bzw. direkt aus den
Endometrioseläsionen (z.B. CA-125, TNFα, Ki-67, Interleukine) weiterhin nur
bedingt einsetzbar (Oehmke et al., 2007).
Die sogenannte diagnostische Laparoskopie, bei der die Diagnose histologisch
gesichert wird, stellt somit den Goldstandard dar, um die Endometriose exakt zu
diagnostizieren (Renner et al., 2006). Während der Laparoskopie können die
Endometrioseimplantate direkt angeschaut werden, wobei es sich bei der tief
infiltrierenden Endometriose als günstig herausstellt, durch präoperative
Bildgebung die genaue Ausdehnung der Infiltration in Erfahrung zu bringen, da
dies ohne vorherige Bildgebung intraoperativ nur schwer abzuschätzen ist. Die
Farbe, Größe und Morphologie der Herde zeigen eine große Variabilität und
sind von Patientin zu Patientin unterschiedlich ausgeprägt. Die definitive
Diagnose kann anschließend durch eine histopathologische Untersuchung der
Läsion eindeutig gestellt werden (Hsu et al., 2010). Meist werden einzeitig, das
heißt in der gleichen operativen Sitzung, die makroskopisch sichtbaren Herde
chirurgisch entfernt, sodass es sich in der Regel um eine diagnostisch-
therapeutische Laparoskopie handelt.
Makroskopisches Bild
Das makroskopische Erscheinungsbild der Endometriose ist ebenfalls variabel
und gestaltet sich je nach Lokalisationsherd. Bei der Peritonealendometriose
beispielsweise unterscheidet man sogenannte rote, schwarze bzw. braune und
weiße Herde. Die roten Herde werden allgemein als aktive Form der
Endometriose gesehen, während die schwarzen Herde, die sich oftmals blasig
darstellen, als inaktiv angesehen. Letztere können auch eine bläuliche oder
bräunliche Färbung aufweisen und werden auch als „Gunpowder-lesions“
bezeichnet. In derartigen Endometrioseherden finden sich histologisch oft
18
Hämosiderinablagerungen. Weiße Herde scheinen ebenfalls inaktive
Endometrioseläsionen darzustellen, die jedoch im Laufe der Zeit vernarbt sind
(Hsu et al., 2010; Renner et al., 2006). Man vermutet eine Art Lebenszyklus der
Herde, beginnend mit roten Herden, welche sich im Verlauf in schwarze
Läsionen und letztendlich in weiße narbige Läsionen verwandeln (Nisolle und
Donnez, 1997). Unklar ist dennoch, ob bzw. wie sich die jeweiligen
Erscheinungsformen der Endometrioseläsionen hinsichtlich Schmerzintensität,
Auswirkungen auf Fertilität und Ansprechen auf diverse medikamentöse
Therapien unterscheiden. Sind die Eierstöcke befallen, so äußert sich dies
durch Invagination der Endometrioseherde in die Rinde des Ovars in Form von
ovariellen Pseudozysten. Diese werden auch als Endometriome oder
sogenannte Schokoladenzysten beschrieben, da ihr Inhalt oft dichte und
schokoladenartige Flüssigkeit enthält. Sind die Ovarien hierbei beidseits
befallen und derart vergrößert, dass sie sich medial berühren spricht man auch
von „kissing ovaries“. Bei der tief infiltrierenden Endometriose, die
beispielsweise die Fornix vaginae, aber auch oft das uterosakrale Ligament
sowie das rektovaginale Septum betrifft, stellen sich die Läsionen als bläuliche
Knötchen dar und bestehen unter anderem aus fibromuskulärem
Narbengewebe (Hsu et al., 2010; Renner et al., 2006).
Therapie
Die Ätiologie und Pathogenese der Endometriose sind bisher nur ansatzweise
geklärt und teils sogar noch unverstanden. Daher stehen zurzeit keine sicher
kurativen Therapieansätze zur Verfügung, und daraus resultieren auch die
hohen Rezidivraten. Bei der Erstellung eines Therapiekonzepts muss der
behandelnde Arzt die individuelle Situation der Patientin erfassen, indem er
diverse Faktoren berücksichtigt, wie beispielsweise die Schmerzsymptomatik,
die Infertilitätsanamnese, die Lokalisation und den Aktivitätsgrad der Herde,
sowie das Alter der Patientin bei Diagnosestellung. Die Therapie soll dazu
dienen, die Lebensqualität der Patientinnen zu verbessern. Generell ist eine
individualisierte Langzeittherapie erforderlich, da die Endometriose oft
chronischen Charakter und eine hohe Rezidivneigung aufweist. Es gibt
19
verschiedene Therapieansätze, die in operative und konservative bzw.
medikamentöse Therapien unterteilt werden.
Im Rahmen der medikamentösen Behandlung werden nichtsteroidale
Antiphlogistika und Spasmolytika eingesetzt, um symptomatisch die Schmerzen
zu lindern. Hier mangelt es jedoch an wissenschaftlichen Nachweisen, die
einen Effekt auf die Endometrioseherde selbst belegen. Zusätzlich stehen bei
der medikamentösen Therapie diverse Hormonpräparate zur Verfügung, deren
gemeinsame Wirkung darin liegt, die proliferative Aktivität von Östrogenen zu
mindern bzw. auszuschalten. Eine solche Medikation ohne vorherige invasive
Diagnostik sollte nur in ganz bestimmten Fällen erfolgen. Hierzu zählen unter
anderem schwere Komorbiditäten der Patientin, die mit einem hohen operativen
Risiko einhergehen oder der explizite Wunsch der Patientin nach einem
individuellen Heilversuch nach eingehender vorheriger Aufklärung.
Kontraindikationen wie thrombembolische Geschehen etc. verbieten den
Einsatz einer hormonellen Behandlung der Endometriose (Renner et al., 2006).
GnRH-Agonisten wie Goserelinacetat stellen die wirksamste Substanzgruppe
zur Regression der Endometrioseläsionen und zur Linderung der endometriose-
bedingten Beschwerden dar. Durch eine irreversible Bindung an hypophysäre
GnRH-Rezeptoren erfolgt nach einem initialen Anstieg der FSH- und LH-
Konzentrationen („Flare-up-effekt“) eine Herunterregulierung der Expression der
betroffenen Rezeptoren. Dies führt langfristig durch Hemmung der hypo-
physären LH-/ FSH- Freisetzung zu einem hypogonadotropen Hypogonadismus
mit Hypoöstrogenämie. Diese ovarielle Suppression erklärt auch die Neben-
wirkungen dieser Medikation im Sinne menopausaler Symptomatiken.
Insbesondere sind hier der beschleunigte Knochenmineralverlust und die
daraus resultierende Osteoporosegefahr zu erwähnen. Aufgrund dieser teils
gravierenden Beschwerden und der damit verbundenen Minderung der
Lebensqualität sollte eine Behandlung mit GnRH-Analoga für maximal sechs
Monate durchgeführt werden. Eine weitere Option besteht darin, zeitgleich eine
sogenannte Add-back-Therapie in Form von konjugierten Östrogenen und
Medroxyprogesteronacetat durchzuführen, wobei die Östradiolwerte jedoch
unter dem proliferierenden Bereich liegen müssen (Schwellenwerthypothese
20
nach Barbieri) Die Add-back-Behandlung dient dazu, die durch die Hypo-
östrogenämie verursachten unerwünschten Nebenwirkungen zu mildern und
eine osteoprotektive Wirkung zu ermöglichen. Unter zeitgleicher Add-back-
Medikation darf die GnRH-Analoga-Einnahme maximal zwölf Monate erfolgen.
GnRH-Antagonisten sind im Rahmen eines „off-label-use“ eine weitere
Möglichkeit ähnlich der Wirkweise der GnRH-Agonisten einen hypogonado-
tropen Hypogonadismus zu bewirken. Allerdings findet die Suppression der
FSH- und LH-Spiegel unmittelbar ohne Auftreten des sogenannten „Flare-up-
Effekts“ statt (Oehmke et al., 2007).
Eine andere, jedoch dauerhafte medikamentöse Therapieoption stellen
monophasische, gestagenbetonte Kombinationspräparate dar, die im
Langzyklus, das heißt durchgehend über sechs Monate eingenommen werden
können (siehe auch Oehmke et al., 2007; Renner et al., 2006). Hierdurch wird
die Östrogenproduktion gehemmt und eine antigonatrope Wirkung erzielt, was
wiederum eine Amenorrhoe einleitet. Bei einem reduzierten Neben-
wirkungsspektrum im Vergleich zu den anderen medikamentösen Therapie-
optionen weisen orale Kontrazeptiva eine nicht zu unterschätzende Effektivität
in Bezug auf die Schmerzsymptomatiken und die Rezidivrate auf. Die
Differenzen zwischen den diversen gestagenbetonten Kontrazeptiva liegen in
ihren Nebenwirkungsspektren und den Kosten, jedoch nicht in ihrer Effektivität
in Bezug auf die Schmerzreduktion bei Endometriose.
Reine Gestagenpräparate wie Progesteron- und Nortestosteronderivate
verursachen eine Suppression der Gonadotropinsekretion. Des Weiteren
bewirken sie eine Endometriumatrophie und zeigen eine antiinflammatorische
Wirkung (Oehmke et al., 2007). Sie besitzen eine ähnliche Potenz zur
Linderung der Schmerzproblematiken wie GnRH-Analoga. Ihre Effektivität auf
die Regression der Endometrioseherde ist jedoch geringer als die der GnRH-
Analoga (Renner et al. 2006). Die verschiedenen Derivate unterscheiden sich
durch ihr Wirkungsprofil und ihre Wirkungsintensität. Außerdem weisen sie
unterschiedliche Partialwirkungen auf. So zeigen Progesteronderivate eine
östrogene Wirkung, Nortestosteronderivate hingegen haben einen androgenen
Effekt. Die Gestagentherapie kann sowohl systemisch als auch lokal erfolgen.
21
Die systemische Variante ist jedoch mit zahlreichen Nebenwirkungen wie
Gewichtszunahme oder irreguläre Menstruationsblutungen assoziiert, sodass
ihr Einsatz nur für ein bestimmtes Patientenkollektiv und zudem nur in einer
niedrigen Dosierung vorgesehen werden sollte. Die lokale Anwendung kann
beispielsweise in Form eines Levonorgestrel-freisetzenden Intrauterinpessars
durchgeführt werden und wirkt besonders effektiv auf lokale benachbarte
Läsionen im Sakrouterinligament.
Danazol, ein 17α-Ethinyltestosteron-Derivat, bewirkt durch eine erzielte
Hyperandrogenämie sowie Östrogenmangel eine Amenorrhoe bzw.
Anovulation. Es mindert zwar die Schmerzsymptomatik der Endometriose
vergleichbar effektiv wie GnRH-Analoga und hat zudem positive Wirkungen auf
den Knochenstoffwechsel, dennoch darf es nur nach ausführlicher Aufklärung
und nur unter sehr enger Indikationsstellung angewendet werden, da es
schwerwiegende, teils sogar irreversible androgene und anabole
Nebenwirkungen (beispielsweise Stimmvertiefung) verursacht (Oehmke et al.,
2007; Renner et al., 2006).
Die sogenannten Aromatasehemmer bilden einen neuen Therapieansatz der
Endometriose, der sich zurzeit noch in der Erprobung befindet.
Aromatasehemmer sollen der lokalen Hyperöstrogenämie durch Aromatase-
überexpression sowie verminderte Typ-2-17-β-HSD im Endometriosegewebe
entgegenwirken.
Ebenfalls in der Erprobungsphase sind sogenannte COX-2-Inhibitoren. Diese
sollen die Effekte des vermehrt in Endometrioseläsionen exprimierten COX-2
reduzieren und somit die gesteigerte Angiogenese und Adhäsionsneigung, die
Zunahme der Zellproliferation sowie die verminderte NK-Zell-Aktivität positiv
beeinflussen.
Antiangiogenetische Medikamente wie Inhibitoren des vaskulären epithelialen
Wachstumsfaktors (VEGF) mindern ebenfalls die Gefäßneubildung, was
wiederum dazu führt, dass Entstehung und Progression der Endometriose-
läsionen erschwert werden. Dieser Behandlungsansatz ist jedoch bisher nur
Bestandteil von Studien (Schweppe, 2011).
22
In Bezug auf die operative Therapie stellt die Laparoskopie den Goldstandard
dar. Dieser Eingriff kann einerseits diagnostischen, andererseits auch
therapeutischen Nutzen aufweisen und sollte spätestens dann erfolgen, wenn
eine symptomatische Therapie mit monophasischen Ovulationshemmern und
nichtsteroidalen Antiphlogistika keinen ausreichenden Erfolg aufweist. Während
des Eingriffs sollte neben der genauen und strukturierten Inspektion des
Bauchraums eine komplette, möglichst radikale Sanierung der Endometriose-
läsionen inklusive histologischer Diagnosesicherung stattfinden, um die
Schmerzen der Patientin bestmöglich zu lindern und das Rezidivrisiko nach
dem Eingriff zu minimieren. Dennoch ist in Bezug auf die operative Radikalität
eine Abwägung zwischen den oben genannten Zielen der chirurgischen
Behandlung und möglichem Kinderwunsch sowie Komorbiditäten nötig.
Die Endometrioseläsionen werden durch Exzision der betroffenen peritonealen
Anteile, Koagulation oder Laserbehandlung möglichst komplett und in sano
entfernt bzw. zerstört. Zudem können mögliche Adhäsionen oder Destruktionen
anatomischer Strukturen gelöst bzw. wieder hergestellt werden. So kann zum
Beispiel eine rekonstruktive Tubenchirurgie angewandt werden, wenn
Verwachsungen im Bereich der Eileiter vorliegen. Bei peritonealen sowie bei
der tief infiltrierenden Endometriose besteht häufig das Problem, dass die
präoperative Bildgebung mittels Ultraschall oder Magnetresonanztomographie
nur selten bzw. ungenau die definitiven Ausmaße der Endometrioseherde
wiedergibt, sodass die exakte Ausdehnung der Herde meist erst intraoperativ
dargestellt werden kann. Insbesondere bei organübergreifendem Befall im Zuge
einer tief infiltrierenden Endometriose ist ein interdisziplinäres Vorgehen
(chirurgisch, urologisch, gynäkologisch) in speziellen Endometriose-Zentren
anzustreben. Unter gegebenen Umständen ist bei Blasen- oder Ureterbefall
eine Teilexzision des entsprechenden Areals nötig.
Eine präoperative medikamentöse Therapie wird diskutiert, um die Läsionen zu
verkleinern und hierdurch das operativ verursachte Trauma des angrenzenden
Gewebes zu reduzieren. Bei ovarieller Endometriose sollte eine vollständige
einzeitige Entfernung der Zyste samt Zystenbalg erfolgen, um die Rezidivrate
zu minimieren. Eine individualisierte postoperative medikamentöse Behandlung
23
sollte allen Patientinnen angeboten werden. Sie dient der Rezidivprophylaxe
oder im Falle einer Nicht-in-sano-Entfernung der Herde während der Operation
als Baustein eines multimodalen Therapiekonzeptes. Ausnahmen zur Indikation
einer postoperativen medikamentösen Rezidivprophylaxe bilden Frauen mit
milder, in-sano entfernter Endometriose, Patientinnen mit Kinderwunsch sowie
Frauen, bei denen Kontraindikationen gegen die hormonelle Therapie wie
beispielsweise thrombembolische Ereignisse in der Anamnese vorliegen
(Renner et al., 2006).
Bei eventuell vorliegenden psychischen Beschwerden kann ebenso eine
psychotherapeutische Mitbehandlung in Betracht gezogen werden.
Endometriose zeigt eine sehr individuelle Prognose (Halis et al., 2010). Die
Erkrankung weist auch nach einem operativen Eingriff bzw. unter
medikamentöser Behandlung eine hohe Rezidivrate auf. So zeigte sich, dass
fünf Jahre nach Therapieende je nach Stadium der Erkrankung bei 20 bis 80%
der Patientinnen Rezidive auftreten (Schweppe, 2011). Bei einem
fortgeschrittenen Stadium der Erkrankung treten Rezidive früher und häufiger
auf. Ebenso ist das Risiko für ein frühes Auftreten des Rezidivs bei jungen
Patientinnen erhöht. Zusätzlich weist dieses Kollektiv ein vermehrtes Risiko für
eine zukünftige Sterilität auf (Renner et al., 2006).
Ätiologie / Pathophysiologie
Bereits 1690 beschrieb Daniel Shroen in seiner Promotionsschrift „Disputatio
Inauguralis Medica de Ulceribus Uteri“ die Morphologie und Klinik der
Endometriose. Dies stellt die zurzeit älteste bekannte Schrift über das
Krankheitsbild dar. Im Jahre 1860 wird von Karl von Rokitansky im Zentralblatt
der Gesellschaft der Ärzte in Wien unter dem Titel „Über Uterusdrüsen-
neubildung in Uterus- und Ovarialsarkomen“ eine weitere Beschreibung über
Endometriose veröffentlicht. Bis dato jedoch sind trotz über 100-jähriger
intensiver Forschung die Ätiologie der Endometriose weitgehend unbekannt
.Auch die Pathophysiologie der Endometriose ist bisher nur in Ansätzen geklärt.
Es gibt jedoch diverse Ansätze und Theorien, die das Krankheitsbild erklären
sollen. Dennoch vermutet man, dass keine der folgenden Hypothesen die
komplexe Erkrankung alleine erklären kann. Daher muss von einem
24
multimodalen Konzept aus den diversen bisher bekannten Ansätzen
ausgegangen werden, bei dem verschiedene Faktoren zusammenspielen und
so zur Entstehung und Progredienz der Endometriose führen (Oehmke et al.,
2007; Schweppe, 2011). Endometriose ist also vielmehr als eine systemische
Krankheit zu sehen, bei der diverse gesundheitliche Probleme inklusive
hormonelle und immunologische Störungen zusammenwirken (Bloski und
Pierson, 2008).
Die Transplantationstheorie, die bereits im Jahre 1924 durch J.A. Sampson
postuliert wurde und insbesondere im angloamerikanischen Sprachraum
akzeptiert ist besagt, dass lebensfähige endometriale Zellen im Rahmen einer
retrograden Menstruation transtubar in den Bauchraum gelangen (Sampson,
1927). Hier implantieren sich anschließend diese Zellen und bilden in der Folge
Endometrioseherde aus. Dies wird auch durch Studien gestützt, bei denen
gezeigt wurde, dass vitales Endometrium an gesundem intakten peritonealen
Mesothel adhärieren und dieses binnen 24 Stunden infiltrieren kann
(zusammengefasst in Neukomm und Mueller, 2007). Es gibt einige weitere
Untersuchungen zu diesem Thema, in denen die Transplantationstheorie
einerseits bestätigt, andererseits aber auch in Frage gestellt wird. So fanden
Halme et al. heraus, dass bei nahezu 90% der Frauen, bei denen um den
Zeitpunkt der Menstruation herum eine Laparoskopie durchgeführt wurde, Blut
in der Peritonealflüssigkeit vorlag (Halme et al., 1984). Zudem scheinen Frauen,
bei denen Bedingungen vorliegen, die einen Reflux des menstruellen Blutes in
den Bauchraum begünstigen (z.B. Anomalien der Müllerschen Ganges), eine
erhöhte Wahrscheinlichkeit aufzuweisen, an Endometriose zu erkranken
(Mahmood und Templeton, 1990). Ein Gegenargument zu dieser These stellt
jedoch die Tatsache dar, dass zwar viele oder gar alle Frauen retrograde
Menstruation aufweisen, aber nicht alle an Endometriose erkranken (Halis et
al., 2010).
Die Metaplasietheorie nach R. Meyer kann im Gegensatz zur Transplantations-
theorie Lokalisationen der Endometrioseläsion an atypischen Stellen außerhalb
des Bauchraums erklären. Es wird hierbei angenommen, dass sich pluripotente
Zellen des Zölomepithels direkt an Ort und Stelle zu endometroiden Zellver-
25
bänden entwickeln, was durch infektiöse Einflüsse oder hormonelle bzw.
immunologische Dysfunktionen begünstigt werden kann (Meyer, 1919; siehe
auch Review von Schweppe, 2011). Die Metaplasietheorie wird des Weiteren
durch die Beobachtung gestützt, dass es in männlichen Patienten, die an einem
Prostata-Karzinom erkrankt sind unter einer hoch dosierten Östrogen-Therapie
ebenfalls zu Endometriose kommen kann (Olive und Schwartz, 1993).
Das sogenannte Stammzellkonzept vereint die Transplantations- und die
Metaplasie-Theorie (Wolf et al., 2009). Mit Hilfe diverser Oberflächenmarker
wurden embryonale und erwachsene Stammzellen in dem Regelblut, das durch
die retrograde Menstruation in das kleine Becken gelangt ist, gefunden. Diese
Stammzellen sind in der Lage dort Implantate zu bilden und entwickeln sich in
der Folge dann zu endometroiden Zellen (Schweppe, 2011).
Leyendecker postulierte zunächst das Archimetrakonzept, welches er später
zum aktuellen „Tissue-Injury and Repair“-Konzept (kurz TIAR) weiterentwickelte
(Leyendecker et al., 2009; referiert in Halis et al., 2010). Während der
Embryonalentwicklung entsteht die Gebärmutter aus einem Zusammenspiel der
sogenannten Archimetra bzw. der Neometra. Die Archimetra setzt sich aus
Drüsen und Stroma des Endometriums und dem Stratum subvasculare
zusammen. Die Neometra hingegen besteht aus dem Stratum vasculare sowie
supravasculare. Bei beginnender Ovarialfunktion kommt es zu östrogen-
gesteuerten Uteruskontraktionen. Dies führt beispielsweise im Areal der
fundocornealen Raphe zu Mikrotraumata an der Grenze zwischen Archimetra
und Neometra. Die nachfolgenden Reparaturvorgänge im Bereich der Basalis
führen zu einer gesteigerten Aromatase-Expression und einem damit
verbundenen regionalen bzw. parakrinen Hyperöstrogenismus. Dies wiederum
begünstigt weitere Hyper- und Dysperistaltik der Gebärmutter, sodass es im
Rahmen eines entstandenen Circulus vitiosus zur Desquamation von basalen
Endometriumanteilen kommt. Diese Zellen können dann im Anschluss
einerseits über die Eileiter in den Bauchraum gelangen und hier Endometriose-
herde verursachen oder andererseits direkt kontinuierlich bzw. proliferativ in das
Myometrium des Uterus vordringen und hier zu einer Adenomyosis uteri führen.
Das „Tissue-Injury and Repair“-Konzept bietet einen stützenden Ansatz dafür,
26
dass es nur bei manchen Patientinnen mit retrograde Menstruation zur
Entwicklung einer Endometriose kommt, denn man nimmt an, dass die
abgeschilferten Zellen der Basalis einen Stammzellcharakter aufweisen und
somit die besondere Potenz besitzen sich zu Endometrioseläsionen weiter zu
entwickeln.
Besonders bei der Entstehung peritonealer Endometrioseherde spielen
immunologische Faktoren eine wichtige Rolle. Es wird vermutet, dass bei Endo-
metriosepatientinnen Störungen des Immunsystems vorliegen, die Studien
zufolge zu weiteren Autoimmun-Komorbiditäten, wie beispielsweise Allergien
oder Schilddrüsenunterfunktion führen. Bei gesunden Frauen werden atop
lokalisierte endometriale Zellen durch das Immunsystem erkannt und beseitigt
und somit die Entstehung von Endometrioseherden verhindert. So könnte dies
auch die Frage beantworten, warum laut Transplantationstheorie nur bei einem
Teil der Patientinnen mit retrograder Menstruation Endometrioseläsionen
entstehen. Es besteht die Theorie, dass bei Endometriosepatientinnen
entweder eine verstärkte Persistenz der endometrialen Zellen oder aber eine
verminderte Immunität gegenüber diesen Zellen bestehen. Tatsächlich kann
man im eutopen, physiologischen Endometrium von Endometriosepatientinnen
eine vergleichsweise verringerte Apoptoserate im Gegensatz zu jener bei
gesunden Frauen beobachten. Außerdem besteht bei Endometriose sowohl
eine verminderte Aktivität als auch eine geringere Zytotoxizität der natürlichen
Killerzellen (NK-Zellen), deren Aufgabe es ist, die in den Bauchraum gelangten
endometrialen Zellen zu vernichten. So konnte des Weiteren bei einem In-vitro-
Experiment gezeigt werden, dass peritoneale Flüssigkeit einer Endometriose-
patientin, im Vergleich zu Proben gesunder Frauen die Fähigkeit besaß NK-
Zellen zu hemmen. Bei Endometriose besteht zudem eine erhöhte Anzahl an
aktivierten peritonealen Makrophagen, sodass die Konzentration
entsprechender Zytokine und Wachstumsfaktoren erhöht ist. Diese und weitere
Entzündungsfaktoren beeinflussen die Entwicklung, Progression und Invasivität
der Endometrioseläsionen in nicht zu unterschätzender Weise (Bloski und
Pierson, 2008; Neukomm und Mueller, 2007).
27
In mehreren großen epidemiologischen Studien zeigte sich eine familiäre
Häufung von Endometriose, was auf das Vorhandensein genetischer Faktoren
hinweist, die das Auftreten dieser Erkrankung begünstigen. Es wurden zudem
bereits potentielle Genloci mit direkter Assoziation zur Endometrioseentstehung
gefunden (Chromosomen 7p und 10q) und zahlreiche Arbeitsgruppen suchen
derzeit nach weiteren involvierten Genen.
Umweltnoxen scheinen bei der Krankheitsentwicklung ebenso eine Rolle zu
spielen. So wurde bei Endometriosepatientinnen ein erhöhter Dioxin-
Serumspiegel im Vergleich zu Kontrollgruppen vorgefunden. Im Tierexperiment
wurde beobachtet, dass Exposition gegenüber Dioxinen die Entstehung von
Endometriose begünstigt. Zwar konnten In-vitro-Versuche am humanen
Endometrium beweisen, dass Dioxine einen unmittelbaren Effekt auf das
Gewebe haben, jedoch ist die Datenlage beim Mensch bezüglich des
Einflusses durch Dioxine zwiegespalten (Neukomm und Mueller, 2007).
Die Verbreitung bzw. Vermehrung der Endometrioseläsionen innerhalb einer
Patientin wird durch die Beteiligung von Lymph- und Blutgefäßen erklärt. Über
diese haben endometriale Zellen die Möglichkeit, an weiter vom Uterus
entfernte Stellen zu gelangen. Durch diese These erklären sich auch atypische
Lokalisationen wie z.B. von Herden in Lunge oder Haut (Bloski und Pierson,
2008).
Malignitätskriterien und Lymphknotenbeteiligung
Endometriose wird als eine gutartige Erkrankung angesehen, teilt jedoch einige
Charakteristika mit bösartigen Entartungen, wie zum Beispiel dereguliertes
Wachstum und atypische Morphologie (Munksgaard und Blaakaer, 2012). Des
Weiteren wurden innerhalb von Endometrioseherden genetische
Veränderungen beobachtet, etwa DNA-Aneuploidie im glandulären Epithel der
Läsionen (Ballouk et al., 1994). Darüber hinaus konnte der aufgrund von In-
vitro-Versuchen vermutete monoklonale Ursprung der Herde nachgewiesen
werden (Jimbo et al., 1997). Durch somatische Mutationen verursachter Verlust
der Heterozygotie (Thomas und Campbell, 2000) konnte ebenso gefunden
werden wie Mutationen in den Genen bcl-2 und p53 als weitere maligne
28
Kriterien (Nezhat et al., 2002). Es ist bekannt, dass Endometriose zu
entzündlichen Reaktionen führt, die wiederum unter anderem in einer
gesteigerten Neoangiogenese, Zellproliferation sowie Apoptose-Inhibition
resultieren. Inflammatorische Vorgänge spielen aber in der Entstehung maligner
Entartungen eine wichtige Rolle. Endometrioseläsionen verfügen außerdem
ähnlich wie maligne Tumore die Fähigkeit, sowohl lokale als auch weit entfernte
Metastasen auszubilden, indem sich Endometriose-Zellen an fremde Gewebe
anlagern, in diese eindringen und sie letztendlich sogar zerstören können
(Munksgaard und Blaakaer, 2012).
Wie bei der Krebsmetastasierung sind auch bei der Ausbreitung der
Endometriose offenbar die regionalen Lymphknoten maßgeblich beteiligt. Ries
beschrieb bereits im Jahr 1897 erstmals sogenannte „Drüseneinschlüsse“ in
Beckenlymphknoten von Frauen mit Zervix-Karzinom, die heute eindeutig als
Endometrioseimplantationen anzusehen sind (Ries, 1897, referiert in Regidor-
Brandau et al., 1994). Auch Halban erwähnte 1925 dieses Phänomen der
Ausbreitung der Endometriose auf pelvine Lymphknoten (Halban, 1925).
Auch eine Reihe aktueller Arbeiten belegen, dass die Ausbreitung der
endometrioiden Herde auf die regionalen bzw. pelvinen Lymphdrüsen
besonders bei der rektosigmoidalen und rektovaginalen Endometriose keine
Einzelfälle darstellen. So beschrieben Insabato und Pettinato drei Fälle von
Patientinnen mit rektosigmoidalem Darmbefall, bei denen ebenfalls regionale
Lymphknoten von Endometriose befallen waren (Insabato und Pettinato, 1996).
Eine weitere Fallbeschreibung über die Ausbreitung der endometroiden Herde
auf pelvine Lymphknoten stellten Lorente Poyatos et al. dar (Lorente Poyatos et
al., 2003). Thomakos et al. berichteten ebenso über eine Patientin mit
rektovaginaler Endometriose, bei der Implantationen innerhalb pelviner
Lymphdrüsen vorgefunden wurden (Thomakos et al., 2006). Abrao et al. fanden
bei Frauen mit tief infiltrierender rektosigmoidaler Endometriose eine
Beteiligung der perikolischen Lymphknoten in 26% der Fälle und stellten fest,
dass dabei unter anderem die Dicke der Darmwandläsionen ein Faktor ist
(Abrao et al., 2006). Zu ähnlichen Erkenntnissen führte eine weitere Arbeit, die
sich mit dem Befall der mesokolischen Lymphknoten bei rektosigmoidaler
29
Endometriose beschäftigte. Hier zeigte sich sogar eine Lymphknotenbeteiligung
in 42% der Fälle (Noël et al., 2008). Auch Mechsner et al. registrierten in einer
retrospektiven Studie einen Befall der (zufällig entfernten) parakolischen
Lymphknoten bei 33% der Patientinnen, die unter tief infiltrierender rekto-
sigmoidaler Endometriose litten (Mechsner et al., 2010).
In einem weiteren Projekt entnahmen Mechsner et al. gezielt sogenannte
Wächterlymphknoten (sentinel lymph node = SLN) von Patientinnen mit tief
infiltrierender rektovaginaler Endometriose, indem sie diese zuvor mittels
blauem Farbstoff intraoperativ identifiziert hatten. Ein Wächterlymphknoten ist
derjenige Lymphknoten, der als erster Lymphknoten ein definiertes
anatomisches Areal drainiert. Immunhistochemische Analysen (ER, PR, CD10,
CDK) ergaben, dass ein Lymphknotenbefall in Form von intranodulären
endometrioden Läsionen in 22% der entnommenen SLN vorlag, und dass
darüber hinaus vereinzelte, eingesprengte bzw. isolierte Zellen in 88,9% (PR-
positiv) bzw. 58% (ER-positiv) der SLN vorhanden waren. Diese Zellen lagen
vor allem im subkapsulären Sinus sowie im oberflächlichen Kortex bzw. im
Mark und ließen sich nur in seltenen Fällen mittels CD10 oder CK anfärben.
Solche isolierten ER- bzw. PR-positiven Zellen, wie sie in 83,3% der
Patientinnen identifizierbar waren, konnten in Kontroll-Lymphknoten von
gesunden Frauen nicht nachgewiesen werden. Die Anzahl disseminierter
endometrioider Zellen sowie intranodulärer Endometrioseläsionen korrelierte
auch in diesem Fall mit der Größe der Primärläsionen. Mechsner et al.
postulierten, dass die isolierten Endometriose-ähnlichen Zellen eine
Zwischenstufe im Rahmen eines metaplastischen Differenzierungsprozesses
widerspiegeln könnten, an dessen Ende die Entwicklung intranodulärer
Endometrioseläsionen steht. Weiter spekulierten sie, dass die disseminierten
endometrioseähnlichen Zellen bzw. Endometrioseherde innerhalb der
Lymphknoten die Ursache für ein erhöhtes Potential für Rezidive darstellen
könnten (Mechsner et al. 2008).
Die oben genannten Arbeiten beziehen sich allesamt auf die Lymphknoten-
beteiligung bei rektosigmoidaler bzw. rektovaginaler Endometriose bzw.
Endometrioseformen, die den Darm befallen. In Bezug auf die am weitesten
30
verbreitete Form der Erkrankung, die ovarielle bzw. peritoneale Endometriose,
bei der die Lymphadenektomie grundsätzlich nur experimentell durchgeführt
wird, lagen keine Daten vor.
Deshalb führten Tempfer et al. 2011 eine prospektive Studie durch, bei der die
Prävalenz von Endometrioseläsionen in pelvinen Wächterlymphknoten von
Frauen mit ovarieller und / oder peritonealer Endometriose untersucht wurde.
Hierzu rekrutierte man 26 Frauen, bei denen der klinische Verdacht auf
Endometriose bestand. Intraoperativ wurde durch eine Schnellschnitt-
untersuchung bei 7 Frauen eine peritoneale, bei 8 Frauen eine ovarielle und bei
weiteren 8 Patientinnen beide Formen der Endometriose diagnostiziert. Nach
Injektion von blauem Farbstoff fand man bei 19 der 23 Endometriose-
patientinnen vor allem nahe der Venae iliacae externa, aber auch in der Fossa
obturatoria pelvine Wächterlymphknoten (pelvic sentinel lymph nodes, PSLN)
vor. Insgesamt wurden daraufhin 37 Lymphknoten entnommen. Die Prävalenz
von endometroiden Herden, die jeweils im peripheren Sinus der PSLN
lokalisiert waren und sich positiv für ER, PR, CK und CD-10 anfärben ließen,
betrug 11%. Auch bei dieser Studie konnte man im peripheren
Lymphknotensinus isolierte Endometriose-ähnliche Zellen (isolated
endometriotic-like cells, IELC) identifizieren, die immunhistochemisch positiv für
ER (80%) und PR (70%) waren. Diese Zellen waren CK-negativ, zeigten jedoch
in 80% der PSLN eine Anfärbbarkeit für CD-10, was auf eine stromale Herkunft
dieser Zellen hindeutete (Tempfer et al., 2011).
31
FRAGESTELLUNG UND ZIELSETZUNG
Wie die oben aufgeführten Studien belegen, ist das Vorkommen von
intranodulären Endometrioseläsionen bzw. von IELC im peripheren Sinus von
Lymphknoten sowohl bei rektovaginaler bzw. rektosigmoidaler als auch bei
peritonealer und ovarieller Endometriose ein häufig anzutreffendes Phänomen.
Dennoch ist über den Prozess des Lymphknotenbefalls bei Endometriose nur
wenig bekannt. Insbesondere über die molekularen Vorgänge, die (gewissen)
endometroiden Zellen die Fähigkeit verleihen, sich von den Primärläsionen
abzuspalten und sich anschließend innerhalb von Lymphknoten anzusiedeln
existieren bisher kaum Informationen.
Ziel der vorliegenden Arbeit war daher, in Probenmaterial, das im Laufe der
Studie „Lymphatic spread of endometriosis to pelvic sentinel lymph nodes: a
prospective clinical study“ (Tempfer et al., 2011) gewonnen wurde, die
Expression einer Reihe von Genen mit Hilfe von quantitativer PCR zu
analysieren. Die Proben wurden dazu in vier Gruppen eingeteilt: Primärläsionen
der Endometriose, IELC-negative PSLN, IELC-positive PSLN und intranoduläre
Endometrioseherde.
Durch Vergleich der Genexpressionsprofile zwischen den Probengruppen
sollten mögliche Kandidatengene identifiziert werden, die im Prozess des
Lymphknotenbefalls durch Endometriose eine Rolle spielen.
32
MATERIALIEN UND METHODEN
Patientengut
Das in dieser Arbeit verwendete Patientenmaterial wurde im Rahmen der
Studie „Lymphatic spread of endometriosis to pelvic sentinel lymph nodes: a
prospective clinical study” gewonnen (Tempfer et al., 2011). Bei dieser
prospektiven Kohortenstudie, die durch die Ethikkommission der Medizinischen
Universität Wien genehmigt worden war (Protokollnummer 473/2009) wurden
im Zeitraum von 2009 bis 2010 Patientinnen der ambulanten Frauenklinik Wien
im Alter zwischen 18 und 50 Jahren rekrutiert. Bei diesen Frauen bestand
aufgrund Endometriose-typischer Symptome wie beispielsweise sekundäre
Dysmenorrhoe oder Dyspareunie der Verdacht auf eine Endometriose. Von
jeder Patientin wurde nach vorheriger eingehender Aufklärung eine schriftliche
Einverständniserklärung eingeholt. Ausschlusskriterien von der Studie waren
unter anderem bekannte Allergien gegenüber blauem Farbstoff (Patent Blue V,
CAS 3536-49-0, Guerbet), bekannte Vorerkrankungen des lymphatischen
Gewebes sowie die Diagnosen Vaginitis oder Zervizitis. Außerdem wurden
einerseits Frauen, deren Endometrioseläsionen nur auf die Ovarien begrenzt
waren und andererseits Patientinnen mit nur gering ausgeprägter Symptomatik
unabhängig vom Krankheitsstadium ausgeschlossen.
Bei den teilnehmenden Patientinnen wurde schließlich eine diagnostische
Laparoskopie durchgeführt, bei der nach einem standardisierten Protokoll, das
in der Wiener Institution etabliert worden ist, vorgegangen wurde. Alle Eingriffe
wurden durch die im Bereich der laparoskopischen Lymphadenektomie
erfahrenen Studienteammitglieder Clemens Tempfer und Alexander Reinthaller
durchgeführt. Hierbei wurden sichtbare Endometrioseherde wie beispielsweise
Schokoladenzysten, rote bzw. weiße Implantationen oder Gunpowder-Läsionen
am Ovar sowie dem Peritoneum durch vollständige Resektion und/oder
Thermokoagulation behandelt. Im Falle der Diagnose Endometriose im rAFS
Stadium III – IV bei der intraoperativen Inaugenscheinnahme wurde ein
Gefrierschnitt von dem mutmaßlichen Endometriosegewebe angefertigt, um die
Diagnose zusätzlich histologisch zu sichern. Anschließend wurden auch die
33
Lymphknoten in Hinsicht auf sichtbare Vergrößerungen oder endometriale
Veränderungen untersucht und der jeweilige Befund dokumentiert. Weiterhin
wurde ca. 1,5 ml blauer Farbstoff in das den Endometrioseherd umgebende
Gewebe bzw. die vier Quadranten der Zervix subepidermal injiziert. Des
Weiteren wurde nach zehnminütiger Wartezeit und unter der Bedingung der
histologischen Diagnosessicherung das Peritoneum parallel zu den
Iliakalgefäßen inzidiert. Die externen und internen Iliakalgefäße sowie die Fossa
obturatoria wurden nun auf eventuell blau angefärbte pelvine
Wächterlymphknoten (PSLN) hin abgesucht. Nur unter der Voraussetzung,
dass solche PSLN identifiziert werden konnten, wurden diese exzidiert. Am
Ende dieser Prozedur wurde die Hämostase sorgfältig überprüft und
gegebenenfalls wiederhergestellt, wobei bei keiner Patientin eine
retroperitoneale Drainage nötig war. Es traten außerdem bei keiner Patientin
intraoperative Komplikationen auf. Alle Patientinnen waren für den Fall einer
eventuellen Schädigung durch die Studienteilnahme abgesichert/versichert und
wurden drei Monate nach dem Eingriff nochmals gynäkologisch untersucht.
Hierin inbegriffen war eine transvaginale Sonographie.
Patientinnen sowie Gewebeproben wurden anonymisiert und fortlaufend
nummeriert. Die Patientendaten wurden in ebenfalls anonym verschlüsselter
Form elektronisch gespeichert. Nur die Versuchsleiter hatten Zugriff auf diese
Daten.
Gewebeproben
Alle Proben waren mit Formalin fixiert und anschließend in Paraffin eingebettet
worden (formalin-fixed, paraffin-embedded = FFPE). Die FFPE Proben wurden
von Wien nach Herne geschickt und hier weiteren molekularbiologischen und
immunhistologischen Analysen unterzogen. Alle verwendeten Chemikalien und
Reagenzien erfüllten die Qualitätsstufe für molekularbiologische Analysen.
Entsprechende Vorsichtsmaßnahmen wurden ergriffen, um Kontamination mit
ubiquitär vorkommenden RNasen zu verhindern bzw. zu minimieren. Sämtliche
Plastikware (Reaktionsgefäße etc.) wurden vor Verwendung autoklaviert und
ausschließlich Pipettenspitzen mit Filter verwendet.
34
Von den FFPE-Proben der endometrialen Läsionen bzw. der Lymphknoten
wurden Hämatoxylin-Eosin-Schnitte (HE-Schnitte) angefertigt. Darauf wurden
bestimmte Areale unter einem Lichtmikroskop (Axioskop2mot plus, Zeiss,
Oberkochen, Deutschland) aufgesucht und markiert. Zu diesen Arealen zählten
charakteristische primäre Endometrioseläsionen sowie periphere Areale bzw.
Randsinus (mit oder ohne isolierte Endometriose-ähnlichen Zellen) in den
Lymphknotenpräparaten. Es entstanden somit vier Gruppen von Proben: 1)
metastatische Endometrioseläsion im Lymphknoten, 2) Lymphknoten mit IELC
im Randsinusbereich, 3) Lymphknoten ohne IELC im Randsinusbereich, 4)
Endometriose-Primärläsionen.
Im folgenden Arbeitsschritt wurde mit Hilfe des markierten HE-Schnittes das
betroffene Areal auf dem entsprechenden Paraffinblock aufgesucht und mit
einer Punchbiopsie-Stanze (Biopsy Punch, 3 mm Durchmesser, Stiefel
Laboratorium GmbH, Offenbach a.M., Deutschland) vorsichtig ausgestanzt.
Anschließend wurde die Stanze samt darin enthaltenem Probenzylinder in ein
2-ml-Reaktionsgefäß positioniert und in einem Thermocycler (Eppendorf,
Hamburg) auf ca. 62°C erwärmt. So dehnte sich der Stanzzylinder aufgrund der
thermischen Materialeigenschaften des Paraffins aus und schob sich somit
unversehrt aus der Punchbiopsie-Stanze hervor.
RNA-Extraktion aus FFPE-Proben
Materialien und Reagenzien:
RNeasy FFPE- Kit (Qiagen, Hilden, Germany; Kat.-Nr. 73504)
Deparaffinierungslösung (Qiagen, Kat.-Nr. 19093)
Punchbiopsie-Stanze (Biopsy Punch, 3 mm Durchmesser; Stiefel
Laboratorium GmbH, Offenbach a.M., Deutschland)
RNase-freies Wasser
Mittels Skalpell und Pinzette wurde in einer Petrischale überschüssiges Paraffin
von den ausgestanzten Proben entfernt sowie übriggebliebene Gewebeanteile
sorgfältig zerkleinert und in 1,5-ml-Reaktionsgefäße überführt. Hierbei war zu
35
beachten, dass ungefähr eine Menge von ca. 3 mg bis max. 10 mg an
Füllgewicht eingehalten wurde, um optimale Erträge aus der RNA-Extraktion zu
erhalten. Im Falle einer zu großen Gewebemenge war die Deparaffinierung und
der Proteinase-K-Verdau nicht effizient genug, sodass am Ende der RNA-
Extraktion nur sehr geringe Mengen RNA eluiert werden konnten. Deshalb
wurden die zerkleinerten Proben gegebenenfalls auch auf zwei oder drei
Reaktionsgefäße bzw. Ansätze pro Probe aufgeteilt. Für jede Probe wurde
jeweils eine neue Punchbiopsie-Stanze, eine neue Skalpellklinge sowie ein
neues “Kulturgefäß” und neue Eppendorfgefäße verwendet.
Alle Proben wurden gemäß den Protokollangaben des Herstellers Qiagen wie
folgt bearbeitet: Zunächst wurde das Paraffin mit Hilfe der
Deparaffinierungslösung entfernt, in dem Gewebestücke und
Deparaffinierungslösung sorgfältig miteinander vermengt und für drei Minuten
bei 56°C inkubiert wurden. Nach Beifügen der Lyse-Lösung PKD sowie der
Proteinase K zur unteren, klaren Phase fand bei 56°C ein 15-minütiger Verdau
statt, bei dem die RNA aus der Probe heraus gelöst wurde. Hierbei schloss sich
eine weitere 15-minütige Inkubation bei 80°C an, in der durch die
Formalinfixierung der Proben verursachte Quervernetzungen der Nukleinsäuren
rückgängig gemacht wurden. Die untere, klare Phase wurde nun in ein weiteres
Reaktionsgefäß gegeben. Nach Zentrifugation und Überführen des
entstandenen Überstandes in ein neues weiteres Eppendorfgefäß wurden
DNase Booster Buffer und DNase I Stock hinzugefügt und bei Raumtemperatur
für 15 Minuten inkubiert, um sämtliche vorhandene genomische DNA zu
eliminieren. Des Weiteren wurden Buffer RBC und Ethanol hinzugegeben,
damit die Bindungsbedingungen für die RNA verbessert wurden. Anschließend
wurde die Lösung schrittweise auf die RNeasy MinElute Spin Column gegeben
und zentrifugiert, sodass die gesamte RNA an die Membran binden konnte.
Durch Zugabe der RPE-Lösung und weitere Zentrifugationsschritte wurden
noch vorhandene Verunreinigungen entfernt. Nach einem letzten
Zentrifugationsschritt zur Trocknung der Membran, wurde die RNeasy MinElute
Spin Column schließlich in ein neues Eppendorfgefäß gesetzt, in dem die im
Eluationsschritt gewonnene RNA (20 µl) gesammelt wurde.
36
Photometrische Konzentrationsbestimmung von RNA
Geräte und Materialien:
RNase-freies Wasser
UV-transparente Einmal-Küvette (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland)
BioPhotometer 6131 (Eppendorf, Hamburg, Deutschland)
Die photometrische Konzentrationsmessung von RNA dient dazu in der
folgenden reversen Transkription zur cDNA annähernd gleiche Mengen RNA
bzw. annähernd gleiche Mengen cDNA in der PCR einzusetzen. Hierzu wurden
je 2 µl RNA-Eluat und 48 µl RNase-freies Wasser kurz durch Pipettieren
vermengt und in eine UV-transparente Einmal-Küvette gegeben. Es wurde nun
im Photometer bei 260 nm sowie 280 nm Wellenlänge die Lichttransmission
ermittelt. Die bei einer Wellenlänge von 260 nm gemessenen
Transmissionswerte ergeben nach Verrechnung des Verdünnungsfaktors (1:25)
die Konzentration der RNA in der vorliegenden Probe, wobei gilt dass eine OD
von 1 einer Konzentration von 40 μg/ml RNA entspricht. Das Verhältnis der OD-
Werte bei 260 nm und 280 nm stellt ein Maß für die Reinheit eine
Nukleinsäurelösung dar (bzw. den Grad der Verunreinigung mit Proteinen). Es
gilt, dass reine Nukleinsäurelösungen ein OD260/OD280-Verhältnis von 2,0
aufweisen (Sambrook und Russel, 2001). Falls die nächsten Arbeitsschritte
nicht unmittelbar im Anschluss stattfanden, wurde die RNA bis zur zeitnahen
weiteren Verarbeitung bei -20°C gelagert bzw. für die längerfristige
Aufbewahrung bei -80°C.
Synthese der komplementären DNA (cDNA)
Reagenzien:
Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR (ThermoScientific,
St. Leon-Rot, Deutschland)
RNase-freies Wasser
Bei der Umschreibung der gewonnenen RNA in komplementäre DNA kam das
Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR zur Verwendung. Um
37
aus der bei der zuvor stattgefundenen RNA-Extraktion gewonnen RNA mittels
reverser Transkriptase cDNA zu synthetisieren, wurden gemäß den
Herstellerangaben je ein µg RNA als Template sowie 5x Reaction Mix, Maxima
Enzyme Mix und nukleasefreies Wasser in einem Reaktionsgefäß gemischt
(20 μl Gesamtvolumen). Die Lösung wurde für zehn Minuten bei Raum-
temperatur und anschließend für 15 Minuten bei 50°C inkubiert. Um die
Reaktion letztlich zu beenden, wurde die Lösung für fünf Minuten auf 85°C
erhitzt. Die DNA wurde gegebenenfalls bei -20°C bis zur weiteren Verarbeitung
gelagert oder direkt weiterverwendet.
Quantitative Real-Time PCR
Die Polymerase-Ketten-Reaktion (polymerase chain reaction, PCR) dient dazu,
gewisse DNA-Abschnitte (Templates), die zu Beginn nur in sehr kleinen
Mengen vorliegen, zu amplifizieren. Dies geschieht durch zahlreiche Wieder-
holung des folgenden Zyklus: zunächst wird durch Erhitzen die doppelsträngige
DNA denaturiert und in die Einzelstränge aufgetrennt (Initialphase), damit im
nächsten Schritt Oligonukleotide, die komplementär zu den Enden des zu
amplifizierenden DNA-Stücks sind (sog. Primer), bei etwas geringerer
Temperatur an die Einzelstränge hybridisieren können (Annealing-Phase). Um
zu verhindern, dass sich die DNA-Einzelstränge in dieser Phase zunächst
wieder aneinanderlagern können, liegen die Primer im Überschuss in der
Reaktionslösung vor. In der nun folgenden Elongations-Phase verlängert eine
hitzestabile DNA-Polymerase sowohl am Plus- als auch am Minus-Strang die
Primer in Richtung 5’ nach 3’ durch Einbau von im Ansatz vorliegender
Nukleotide (dATP, dTTP, dCTP, dGTP). Damit wird ein zur Zielsequenz
komplementärer Strang synthetisiert. Folglich verdoppelt sich die Menge an
DNA theoretisch pro Zyklus und die Zunahme an DNA ist exponentiell, da die
im vorherigen Zyklus neu entstandene doppelsträngige DNA im folgenden
Zyklus ebenfalls als Template dienen kann. Nach ungefähr 30 Zyklen erreicht
die Vermehrungskurve jedoch ein Plateau, da unter anderem die
Nukleotidbausteine in der Reaktionslösung verbraucht sind.
Bei der Real-Time PCR besteht die Möglichkeit während der Amplifikation des
Templates den Reaktionsablauf direkt zu beobachten. Dies ist möglich, in dem
38
der in der Reaktionslösung enthaltene Farbstoff SYBR-Green ein verändertes
Fluorenszenzverhalten zeigt, wenn dieser in doppelsträngiger DNA eingelagert
ist. Das Real-Time PCR-Gerät regt die Fluoreszenz mit Lasern der
entsprechenden Wellenlänge an und misst die Intensität der Emission, aus der
sich die Menge der vorliegenden doppelsträngigen DNA berechnen lässt.
Dadurch ist letztlich eine Quantifizierung der Expression eines Gens auf mRNA-
Ebene möglich.
Materialien, Reagenzien und Geräte:
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA)
384-Well-Platten (weiß) und Verschlussfolien (BIOplastics, Landgraaf,
Niederlande)
Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2x) (Thermo Scientific,
St. Leon-Rot, Deutschland)
Oligonukleotidprimer
Beim Design der Primer wurde darauf geachtet, dass die resultierenden
Amplikons wenn möglich Intron-überspannend (d.h., dass die Primerstellen sich
in unterschiedlichen Exons befanden) und nicht größer als etwa 110
Basenpaare waren. Kurze Amplikons sind insbesondere bei cDNA wichtig, die
aus FFPE-Proben gewonnen wurde, bei denen mit einer erheblichen
Fragmentation der RNA zu rechnen ist. Alle Oligonukleotidprimer wurden von
der Microsynth AG (Balgach, Schweiz) hergestellt. Als Housekeeping-Gene
(Referenzgene) dienten bei der RT-PCR ACTB (β-Actin) und GAPDH
(Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase). In Tabelle 1 sind sämtliche
Primersequenzen aufgelistet.
39
Tabelle 1. Gene, Primersequenzen und Amplikons.
Symbola Name (Accession No.)
Primerb
Länge Tm
c
ACTB Beta-Actin (NM_001101) AGCAAGCAGGAGTATGACG, GAAAGGGTGTAACGCAACT
90
80,2
AURKA Aurora Kinase A (NM_198433) CCACCTTCGGCATCCTAATA, TCCAAGTGGTGCATATTCCA
91
74,0
BAG1 BCL2-associated athanogene (NM_004323) GAAATGGAAACACCGTTGTC, AACCTCTTCCTGTGGACTGT
90
76,4
BCL2 B-cell CLL/lymphoma 2 (NM_000633) AAGCCCCAAAAGGAGAAGAA, GTCATTCTGGCCTCTCTTGC
90
80,4
BIRC5 Survivin (NM_001168) TGCAACCGCCTAGACTTTCT, TCACAACCCTTCCCAGACT
90
76,2
CCNB1 Cyclin B1 (NM_031966) ATGGTCTCCTGCAACAACCT, CGGGAAGTCACTGGAAACAT
86
76,0
CD24 CD24 Molekül (NM_013230) GACTCAGGCCAAGAAACGTC, CCTGTTTTTCCTTGCCACAT
92
76,7
CD44
(s)
CD44 Molekül (NM_000610) GGTTACATCTTTTACACCTTTTCTAC, GAATGTGTCTTGGTCTCTGGTAG
111
79,6
CD44
(v6)
CD44 Molekül (NM_000610) GGTTACATCTTTTACACCTTTTCTAC, TAGGAGTTGCCTGGATGGTAG
109
80,2
CD68 CD68 Molekül (NM_001251) ACTTTGCTGCCATCCTTCAC, GTGGTGGTTTTGTGGCTCTT
92
81,0
CDH1 E-Cadherin (NM_004360) TTGACGCCGAGAGCTACAC, GACCGGTGCAATCTTCAAA
93
84,0
CDH2 N-Cadherin (NM_001792) GTGCATGAAGGACAGCCTCT, CCACCTTAAAATCTGCAGGC
100
76,0
CTSL2 Cathepsin L2 (NM_001333) CTACGTGACGCCAGTGAAGA, TTCCGGAACATCTGTCCTTC
90
78,4
CXCR4 Chemokin (C-X-C Motif) Rezeptor 4 (NM_003467) TACCATGGAGGGGATCAGTATATAC, AGGGTTCCTTCATGGAGTCATAGT
86
76,4
EPCAM Epitheliales Zelladhäsions-Molekül (NM_002354) GCTGTTATTGTGGTTGTGGTG, CCCATCTCCTTTATCTCAGCC
110
76,7
ESR1 Östrogenrezeptor 1 (NM_000125) TCCAGCACCCTGAAGTCTCT, GCCATCAGGTGGATCAAAGT
86
78,5
GAPDH Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (NM_002046) ACAGTCAGCCGCATCTTCTT, ACGACCAAATCCGTTGACTC
94
82,5
GSTM1 Glutathion-S-Transferase mu 1 (NM_000561) GGGACGCTCCTGATTATGAC, GTGAGCCCCATCAATCAAGT
98
79,2
ICAM1 Interzelluläres Adhäsions-Molekül 1 (NM_000201) TGATGGGCAGTCAACAGCTA, AGGGTAAGGTTCTTGCCCAC
108
82,1
MMP11 Matrix-Metallopeptidase 11 (Stromelysin 3) (NM_005940) CCTGGAGGCTGCAACATACC, TACAATGGCTTTGGAGGATAGCA
90
80,5
40
Tabelle 1. Gene, Primersequenzen und Amplikons (Fortsetzung).
Symbola Name (Accession No.)
Primerb
Länge Tm
c
MKI67 Antigen des Antikörpers Ki-67 (NM_001145966)
CTTTGGGTGCGACTTGACGA, GGCCAGAAGCAAATTTACAAC
90
82,3
MUC1 Mucin 1 (NM_002456) AGACGTCAGCGTGAGTGATG, GACAGCCAAGGCAATGAGATAG
139
85,1
MYBL2 v-myb myeloblastosis viral oncogene homolog-like 2 (NM_002466) TGGATGAGGATGTGAAGCTG, GGTGAGGCTGGAAGAGTTTG
89
79,1
NOTCH1 Notch 1 (NM_017617) GGTGAGACCTGCCTGAATG, GTTGGGGTCCTGGCATCG
102
86,4
PGR Progesteronrezeptor (NM_001202474) GCATCAGGCTGTCATTATGG, AGTAGTTGTGCTGCCCTTCC
85
77,8
ROBO1 Roundabout axon guidance receptor homolog 1 (NM_133631) GCCAAATATCAGATCCAGTGAAAA, GTGGAGGTGCAGAACAGCATT
107
83,7
SCUBE2 Signal peptide, CUB domain, EGF-like 2 (NM_020974) TGACAATCAGCACACCTGCAT, GCCTCCTTGCAGATGTGACT
90
80,5
SLIT2 Slit homolog 2 (Drosophila) (NM_004787) AGTGGTGAAGTGCGGCTGTAC, TCATTAGTCCCACATGGTCAAGA
102
79,1
SNAI1 Snail homolog 1 (Drosophila) (NM_005985) CCTTCTCTAGGCCCTGGCT, AGGTTGGAGCGGTCAGC
106
84,9
VEGF-C Vaskulär-endothelialer Wachstumsfaktor C (NM_005429) CGGACTCGACCTCTCGG, TGGACACAGACCGTAACTGC
92
84,4
a Von den Primern spezifisch detektierte Spleißvarianten sind in Klammern angegeben.
b Primersequenzen (5’-->3’), Forward (F) und Reverse (R) Primer.
c Länge (bp) und Schmelztemperatur (°C) der Amplikons.
Für jede PCR-Reaktion (ein Well) wurde folgender Ansatz (Gesamtvolumen
10 µl) erstellt und durch Auf-/Abpipettieren gemischt: 2 µl cDNA-Verdünnung
(bzw. für Kontrollreaktionen RNA oder Wasser), 5 µl 2x SYBR-Green Master
Mix, 3 µl Primermix. Die Proben wurden in Triplikaten aufgetragen. Auf jeder
384-Well-Platte wurden zudem jeweils -RT-Kontrollen zum Ausschluss der
Kontamination mit (genomischer) DNA sowie Negativkontrollen (No Template
Control) als Duplikate zu den Proben aufgetragen. Hierzu wurde im Falle der
-RT-Kontrollen anstelle der cDNA mit RNA der entsprechenden Probe und im
Falle der Negativkontrollen RNase-freies Wasser anstatt der cDNA hinzugefügt.
Nachdem die Platte befüllt war, wurde sie mit einer transparenten
selbstklebenden Folie verschlossen, kurz zentrifugiert und in das PCR-Gerät
geladen. Folgendes PCR-Programm wurde verwendet: Initiale Denaturierung
41
(95°C, 10 Minuten), dann 40 Zyklen bestehend aus einem Denaturierungsschritt
(95°C, 15 Sekunden) und einer kombinierten Annealing/Extension-Phase
(60°C, 1 Minute). Anschließend wurde eine Schmelzkurve aufgezeichnet.
Hierzu wurde zunächst für 15 Sekunden auf 95°C erhitzt. Danach wurde auf
eine Temperatur von 60°C abgekühlt, die ebenfalls 15 Sekunden konstant
gehalten wurden. Im Folgenden wurde langsam wieder auf 95°C erwärmt.
Während dieser langsamen Erwärmung wurde kontinuierlich die
Fluoreszenzintensität gemessen und somit eine Schmelzkurve erstellt, anhand
derer überprüft werden konnte, ob in jedem Well der Platte auch nur ein
spezifisches Amplikon, also nur ein Peak in der Schmelzkurve, vorhanden war.
Die ermittelten Schmelztemperaturen wurden zudem mit den entsprechenden
Angaben aus dem Programm OligoCalc verglichen, um verifizieren zu können,
ob es sich bei dem jeweiligen Amplikon auch um das spezifische, gewünschte
Amplifikat handelt (Kibbe, 2007). Zusätzlich wurden einmalig je Primerpaar die
entstandenen Produkte mittels Agarosegelelektrophorese verifiziert.
Die Real-Time PCR-Daten wurden mit den Computerprogrammen SDS 2.4.1
und RQ Manager 1.2.1 (Applied Biosystems) ausgewertet. Die ermittelten Ct-
Werte wurden dann in Excel 2003 (Microsoft, Redmond, WA) weiter
aufgearbeitet sowie unter Verwendung von SigmaPlot 12 (Systat Software, San
Jose, CA) und Illustrator CS4 (Adobe Systems, San Jose, CA) visualisiert.
Immunhistochemie
Die Immunhistochemie (IHC) auch Immunhistologie oder Immun- bzw. Anti-
körperfärbung genannt, dient der Darstellung und Lokalisierung bestimmter
Proteine in einem intakten Gewebe. Das Prinzip der IHC beruht auf einer
Antigen-Antikörper-Bindung, welche durch eine anschließende chromogene
Reaktion sichtbar gemacht werden kann. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine
indirekte Methode der Immunhistochemie verwendet. Dabei wird in einem
ersten Schritt ein sogenannter Primärantikörper auf das zu untersuchende
Gewebe aufgetragen. Dieser Antikörper ist gegen ein spezifisches Protein-
molekül (Antigen) gerichtet und geht mit diesem eine Antigen-Antikörper-
Wechselwirkung ein. Nicht-gebundene Antikörper werden im anschließenden
Waschschritt entfernt. Dann wird der Gewebeschnitt mit einem zweiten Anti-
42
körper, dem sogenannten Sekundärantikörper, inkubiert. Dieser wiederum
erkennt spezifische Epitope im konstanten Teil des Primärantikörpers und geht
somit ebenfalls eine Antigen-Antikörper-Bindung mit diesem ein. Der Sekundär-
antikörper ist außerdem über eine kovalente Bindung mit einem Enzym ver-
bunden, welches in weiteren Schritten nun die Farbreaktion zur Visualisierung
der Antigen-Antikörper-Reaktion ermöglicht. In diesem Versuch wurden mit
Meerrettich-Peroxidase konjugierte Sekundärantikörper verwendet. Nachdem
mehrere Waschschritte stattfanden, um überschüssige Sekundärantikörper, die
nicht spezifisch an den Primärantikörpern gebunden haben zu entfernen, wurde
3,3’-Diaminobenzidin (DAB) hinzugegeben, das durch die Meerrettich-
Peroxidase gespalten wurde. Dabei entsteht ein schwerlösliches bräunlich
gefärbtes Produkt, das sich auf dem Gewebeschnitt niederschlägt und somit die
Stellen kennzeichnet, wo das primäre Antigen vorliegt.
Reagenzien und Geräte:
Ethanol
Xylol
Natriumcitrat-Lösung (10 mM, pH 6)
3% H2O2
Tris-gepufferte Salzlösung (TBS)
TBS-Tx (TBS mit 0,025% Triton X-100)
Ziegenserum (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA,
USA)
DAB (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)
Hämatoxylin QS (Vector Laboratories)
Mountex (Medite, Burgdorf, Deutschland)
Mikrotom (HM 355 S, Microm International, Walldorf, Deutschland)
Dampfgarer (haushaltsübliches Tischgerät)
Antikörper: Hasen-anti-Östrogen-Rezeptor (SP1, 1:100); Maus-anti-
CD44s (156-3C11, 1:150); Maus-anti-CD44v6 (VFF-7, 1:200); Maus-anti-
E-Cadherin (36B5, 1:50) (alle von Thermo Scientific); Maus-anti-CXCR4
(MAB170, 1:50; R&D Systems)
Peroxidase-konjugierte AffiniPure Ziegen-anti-Maus oder Ziegen-anti-
Hasen-Sekundärantikörper (1:500 Jackson ImmunoResearch)
43
Um die immunhistochemische Untersuchung durchzuführen, wurden von den
FFPE-Gewebeblöcken jeweils 4 µm dicke Schnitte angefertigt. Die Gewebs-
schnitte wurden zunächst mittels Xylol deparaffiniert und anschließend durch
Spülen zuerst in einer Serie mit absteigendem Ethanolgehalt (100%, 96%, 85%,
70%) und zuletzt mit fließendem Leitungswasser rehydriert. Es wurde sorgfältig
darauf geachtet, dass die Schnitte stetig feucht gehalten wurden und nicht
trockneten, um eine nicht-spezifische Antikörperbindung und eine hiermit
verbundene erhöhte Hintergrundfärbung zu verhindern. Im folgenden Arbeits-
schritt fand eine Inkubation der Schnitte in einer Natriumcitrat-Lösung bei 100°C
für 30 Minuten statt. Hierzu wurde ein haushaltsüblicher Dampfgarer verwendet.
Diese Inkubation dient dazu, die während der Fixierung in Paraffin
entstandenen Methylenbrücken, die die Proteine untereinander quervernetzen
und folglich die Antigenepitope maskieren rückgängig zu machen. So werden
die Antigenoberflächenstrukturen wieder exponiert, um eine Antigen-Antikörper-
Bindung zu ermöglichen. Nachdem die Schnitte nun für 10 Minuten unter
kaltem, fließendem Wasser gekühlt worden sind, wurden diese in 3%-iger H2O2-
Lösung inkubiert, um im Gewebe vorhandene endogene Peroxidasen zu
blocken und so unspezifische Färbereaktionen zu verhindern. Des Weiteren
wurden die Schnitte zweimal für jeweils fünf Minuten mit TBS-Tx gewaschen.
Im Anschluss erfolgte ein Blockschritt mit Ziegenserum (5% in TBS) zur
Absättigung von unspezifischen IgG-Antikörper-Bindungstellen im Gewebe.
Nun wurden die primären Antikörper in für den jeweiligen Antikörper
charakteristischen Konzentrationsverhältnissen in TBS-Tx hinzugegeben und
bei 4°C über Nacht inkubiert. Am darauffolgenden Tag wurden zuerst weitere
Waschschritte mit TBS-Tx durchgeführt, um überschüssige Primärantikörper,
die nicht spezifisch gebunden haben, zu entfernen. Dann wurde für 60 Minuten
bei Raumtemperatur mit den Sekundärantikörpern inkubiert (1:500 in TBS-Tx).
Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde erneut ein Waschschritt mit TBS-Tx
durchgeführt. Die Visualisierung der Antigen-Antikörper-Bindungen erfolgte
mittels Inkubation mit DAB-Lösung für 10 Minuten. Nach Waschen mit Wasser
wurde gegebenenfalls noch eine Gegenfärbung (blau) mit Hämatoxylin QS
durchgeführt, welches dann nach 15 Sekunden ebenfalls wieder mit Wasser
abgewaschen wurde. Schließlich wurden die Schnitte in einer aufsteigenden
Ethanolreihe (70%, 85%, 100%) dehydriert, mit Xylol gespült und mit Mountex
44
eingedeckelt. Zur Sichtung und Dokumentation der gefärbten Schnitte wurde
ein Axioskop2mot plus (Zeiss, Oberkochen, Deutschland) mit einer AxioCam
HRc und AxioVision 3.1 Software (Zeiss) verwendet. Die Aufnahmen wurden in
Photoshop CS4 (Adobe Systems, Palo Alto, CA, USA) zu fertigen Abbildungen
weiterverarbeitet.
Statistische Auswertung
Die Erfassung und weitere Aufarbeitung der Real-Time PCR Daten erfolgte mit
Hilfe von Excel 2003 (Microsoft, Redmond, WA). Für die statistische
Auswertung wurde der Mann-Whitney-U-Test (Rangsummentest) verwendet
(SigmaPlot 12, Systat Software). Die Visualisierung der Daten als Box-Plots
erfolgte in SigmaPlot 12 und Illustrator CS4 (Adobe Systems).
Berechnung des Recurrence-Scores
Der Recurrence-Score wurde entwickelt, um RT-PCR Messwerte einer
einfachen, vergleichbaren klinischen Interpretation zugänglich zu machen. Er
wird durch eine einzelne Zahl im Bereich 0 bis 100 dargestellt, die wie folgt
berechnet wird (Cronin et al., 2007; Paik et al., 2004): Zunächst werden die
Messwerte der einzelnen Gene mit Hilfe eines Sets von fünf Referenzgenen
(ACTB, GAPDH, GUS, RPLPO, TFRC) normalisiert. Das heißt, dass für jede
Probe die normalisierten Expressionswerte (ΔCt) berechnet wurden, indem vom
mittleren Ct-Wert der Referenzgene die mittleren Ct-Werte von Triplikats-
bestimmungen der einzelnen Gene abgezogen wurden. Anschließend werden
die normalisierten Expressionswerte über einen Bereich von 0 bis 15 Einheiten
skaliert, wobei eine Einheit in etwa einer Verdopplung der RNA-Menge
entspricht.
Neben den Referenzgenen berücksichtigt der Recurrence-Score weitere 16
Gene, die basierend auf Funktion, korrelierter Expression, oder beidem, in vier
Gruppen und drei Einzelgene unterteilt sind: Proliferation (AURKA, BIRC5,
CCNB1, MKI67, MYBL2), Invasion (CTSL2, MMP11), ER (BCL2, ESR1, PGR,
SCUBE2), HER2 (GRB7, HER2), sowie GSTM1, CD68 und BAG1. Für jede der
Gruppen wird ein Score berechnet.
45
HER2-Gruppe: 0,9x GRB7 + 0,1x HER2 (falls der Wert kleiner als 8 ist,
wird der Wert 8 angenommen)
ER-Gruppe: 0,25x (0,8x ESR1 + 1,2x PGR + BCL2 + SCUBE2);
Proliferations-Gruppe: 0,2x (BIRC5 + MKI67 + MYBL2 + CCNB1 +
AURKA) (wenn der Wert kleiner als 6,5 ist, wird 6,5 angenommen)
Invasions-Gruppe: 0,5x (CTSL2 + MMP11)
Als nächstes wird aus den Gruppen-Scores der sogenannte unskalierte
Recurrence-Score (RSU) berechnet:
RSU = 0,47x HER2 – 0,34x ER + 1,04x Proliferation + 0,1x Invasion +
0,05x CD68 – 0,08x GSTM1 – 0,07x BAG1.
In einem letzten Schritt wird der eigentliche Recurrence-Score (RS) aus dem
RSU nach folgenden Regeln gebildet:
RS = 0 falls RSU < 0
RS = 20x (RSU – 6,7) falls 0 ≤ RSU ≤ 100
RS = 100 falls RSU > 100
Die Recurrence-Scores in dieser Arbeit wurden in Anlehnung an den oben
beschriebenen Algorithmus berechnet, wobei allerdings für die Normalisierung
der Mittelwert aus nur zwei Referenzgenen (ACTB und GAPDH) verwendet
wurde und für die HER2-Gruppe der Score von 8 angenommen, da für die
betreffenden keine Genexpressionswerte bestimmt wurden. Die Skalierung der
normalisierten auf den Bereich 0 bis 15 erfolgte nach folgenden Regeln:
Wert = 0 falls der ursprüngliche Ct-Wert der Probe ≥ 40 war (keine
nachweisbare Expression) oder ΔCt ≤ -15 war (was im wesentlichen
ebenfalls einer nicht nachweisbaren Expression entspricht)
Wert = ΔCt + 15, aber maximal 15
46
ERGEBNISSE
Proben
Das für diese Arbeit verwendete Material wurde im Rahmen einer am
Allgemeinen Krankenhaus der Stadt Wien (Medizinische Universität Wien)
durchgeführten Studie gewonnen und bestand aus Formalin-fixierten, Paraffin-
eingebetteten (FFPE) Proben von primären Endometrioseläsionen und pelvinen
Wächterlymphknoten (pelvic sentinel lymph nodes, PSLN) aus dem
Lymphabflussbereich dieser Herde (Tempfer et al., 2011). Von ursprünglich in
zwei Patientinnen identifizierten Lymphknoten mit etablierter endometrioider
Metastase stand für die im Weiteren beschriebenen Analysen nur eine einzige
Probe zur Verfügung, von der jedoch zur Absicherung der Ergebnisse drei
unabhängige Stanzproben entnommen, aufgearbeitet und quantitativ analysiert
wurden. Diese Probe ist im Folgenden als MEL bezeichnet (metastatische
Endometrioseläsion). Die restlichen Lymphknoten wurden in zwei Gruppen
eingeteilt, je nachdem ob in ihnen isolierte Endometriose-ähnlichen Zellen
(isolated endometriosis-like cells, IELC) nachweisbar waren. Dies erfolgte
anhand bereits vorliegender immunhistochemischer Färbungen (Prof. Horvat,
Institut für Pathologie, Medizinische Universität Wien) für Östrogen- und
Progesteronrezeptoren (positiv in IELCs, negativ in Lymphozyten). IELCs
befanden sich dabei überwiegend im Randsinus betroffener Lymphknoten. Die
Primärläsionen stellten die vierte Gruppe dar.
Tabelle 2. Probengruppen
Gruppe Bezeichnung N
Primäre Endometrioseherde EL 13
IELC-negative PSLN PSLN− 11
IELC-positive PSLN PSLN+ 8
Lymphknoten mit Endometrioseläsion MEL 1
Abkürzungen: PSLN−/PSLN+ = Lymphknoten ohne bzw. mit nachgewiesenen isolierten
Endometriose-ähnlichen Zellen (IELC = isolated endometriotic-like cells) im Randsinus;
EL = endometriotic lesion; MEL = metastatic endometriotic lesion.
47
Abbildung 1. H&E-gefärbte Schnitte der Gewebeblöcke, aus denen mittels einer
Stanze Proben für die RNA-Extraktion gezogen werden. Die Tafeln zeigen typische
Stanzregionen in einer Endometriose-Primärläsion (A), dem Randsinusbereich
eines Lymphknotens (B) sowie einer Endometrioseläsion innerhalb eines
Lymphknotens (C). Balken: 200 µm.
48
Tabelle 2 gibt einen Überblick über die Probengruppen und Abbildung 1 zeigt
typische Stanzregionen innerhalb einer Primärläsion (Tafel A), im Randsinus
eines Lymhknoten (Tafel B), sowie im Lymphknoten mit etablierter
Endometrioseläsion (Tafel C).
Extraktion von RNA auf FFPE-Gewebe. Methodenvergleich
Die Fixierung mittels Formalin und die anschließende Einbettung in Paraffin ist
die im Allgemeinen am häufigsten angewandte Methode, Gewebeproben
langfristig zu lagern. Die Gewebeintegrität bleibt dabei weitgehend erhalten.
Allerdings ist insbesondere die Konservierung der von sich aus recht instabilen
RNA-Moleküle problematisch. Bereits unmittelbar nach Entnahme bis zur
Fixierung des Gewebes findet eine Degradierung der RNA durch endogene und
in der Umwelt ubiquitär vorkommenden RNasen statt (Krafft et al., 1997).
Zusätzlich verursacht die Behandlung mit Formalin erhebliche weitere Schäden
an Nukleinsäuren, indem sie Quervernetzungen zwischen den Nukleinsäuren
und Proteinen sowie kovalente Modifikationen der RNA durch Hinzufügen von
Monomethylolgruppen an die Basen bewirkt, was die RNA-Extraktion und
anschließende reverse Transkription erschwert (Farragher et al., 2008).
Zahlreiche Anbieter bieten Kits an, die spezifisch für die Isolation von RNA aus
FFPE-Proben entwickelt wurden. Trotz zahlreicher Bemühungen und ständiger
Weiterentwicklungen auf diesem Gebiet scheint es zurzeit keine einheitliche
und in allen Fällen erfolgreiche Methode zu geben. Wir führten daher
Vorexperimente durch, um die für unser Probenmaterial am besten geeignete
RNA-Extraktions-Methode zu ermitteln. Dazu verwendeten wir unter
Handhabung laut Herstellerangaben das RNeasy FFPE-Kit der Firma Qiagen
(Hilden, Germany; Kat.-Nr. 73504) sowie das NucleoSpin-FFPE-RNA-Kit der
Firma Macherey-Nagel (Düren, Germany, Art.-Nr.: 740969.10) und verglichen
die RNA-Ausbeute. Das Ausgangsmaterial stellte eine FFPE-Probe einer
primären Endometrioseläsion dar. Es wurden pro Kit jeweils drei Ansätze
angefertigt. Dabei wurde die Probe zunächst entweder wie unter „Material und
Methoden“ beschrieben mittels Skalpell zerkleinert oder es wurden mit Hilfe
eines Mikrotoms Dünnschnitte (5 μm) angefertigt, oder aber die Probe wurde in
flüssigem Stickstoff tiefgefroren und mit Hilfe eines Mörsers zerstoßen. Das auf
49
die unterschiedlichen Arten vorzerkleinerte Probenmaterial wurde dann in
jeweils zwei Portionen aufgeteilt und mit den beiden Kits aufgearbeitet. Die
erzielten RNA-Erträge sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Die mit dem Qiagen RNeasy FFPE-Kit erzielten RNA-Ausbeuten waren
erheblich größer als jene nach Verwendung des Macherey-Nagel NucleoSpin
FFPE-Kits. Außerdem kam es bei den RNA-Proben, die mit dem Macherey-
Nagel-Kit gewonnen wurden, zu einer Amplifikation in der -RT-Kontrolle. Daraus
kann man schließen, dass die RNA mit genomischer DNA kontaminiert war.
Dieses Problem trat mit dem Qiagen RNeasy FFPE-Kit nicht auf. Aufgrund der
Ergebnisse wurde entschieden, für alle weiteren RNA-Extraktionen das RNeasy
FFPE-Kit der Firma Qiagen zu verwenden. Die Zerkleinerung mittels Skalpell
war hinsichtlich der RNA-Ausbeute zwar der Zerkleinerung mit Hilfe von
flüssigem Stickstoff unterlegen (etwa 20% weniger RNA-Ausbeute), allerdings
methodisch und zeitlich wesentlich weniger aufwändig. Außerdem zeigte sich
schließlich in Bezug auf die Referenzgene ACTB (β-Actin) und GAPDH
(Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase), dass bei Einsatz gleicher
Mengen RNA für die cDNA-Synthese die mittels Skalpell zerkleinerten Proben
(und auch die Dünnschnitte) in der Real-Time PCR niedrigere Cycle threshold
(Ct)-Werte ergaben als jene, die mit der Stickstoff-Methode zerkleinert wurden
(Differenz von ca. 2). Beim Zermahlen in flüssigem Stickstoff scheinen folglich
die RNA-Moleküle weiter fragmentiert worden zu sein. Daher wurden alle
weiteren Proben mittels Skalpell zerkleinert.
Tabelle 3. Vergleich der RNA-Extraktionsmethoden
Zerkleinerung Kita Eingesetzte
Menge
(mg)
Eluierte RNA
b
(µg)
Spezifische Ausbeute
(µg RNA / mg Gewebe)
Skalpell Q 13,9 3,56 0,256
MN 14,5 0,40 0,027
Dünnschnitt Q 17,0 1,37 0,081
MN 7,1 0,02 0,003
fl. Stickstoff Q 11,8 3,69 0,312
MN 10,8 0,45 0,041
a Q = Qiagen RNeasy FFPE, MN = Macherey-Nagel NucleoSpin FFPE-RNA
b Das Elutionsvolumen war bei beiden Kits 20 µl.
50
RNA-Isolation, Qualität der erhaltenen RNA bzw. cDNA
Nach dem Stanzen wurde überschüssiges Paraffin von den Gewebeanteilen
entfernt. RNA wurde aus im Mittel (6,7±3,9) mg Probenmaterial isoliert. Je mg
eingesetzter Probe konnten im Durchschnitt (0,64±0,41) μg RNA gewonnen
werden. Anschließend wurde jeweils 1 μg RNA unter Verwendung des „First
Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR“ (Fermentas, Thermo Scientific) in
komplementäre DNA (cDNA) transkribiert. Nach 100-facher Verdünnung wurde
diese letztlich als Template für die Real-Time PCR eingesetzt. Die
resultierenden Ct-Werte für die verwendeten Referenzgene ACTB und GAPDH
lagen bei 22,2±1,1 bzw. 26,9±1,1. Die mittlere Differenz der Ct-Werte der
beiden Referenzgene betrug 4,75±0,64. Daraus ließ sich ableiten, dass die aus
den Proben gewonnene mRNA von ausreichender Qualität für die quantitative
Genexpressionsanalyse war.
Quantitative Real-Time PCR
Für insgesamt 30 Gene wurde mittels quantitativer Real-Time PCR die
Expressionshöhe auf mRNA-Ebene bestimmt (Tabelle 4 und Abbildung 2; siehe
auch Primer-Sequenzen in Tabelle 1).
Tabelle 4. Gene und Expression
Gruppe Symbol Bezeichnunga ΔCt-Werte
b
EL PSLN- PSLN+ MEL
Referenz ACTB Actin, beta
GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
Hormonab-hängigkeit
BCL2 B-cell CLL/ lymphoma 2
6,7±0,8 5,3±1,0 5,0±0,5 4,9±0,5
PGR Progesterone receptor
4,6±1,5 11,4±3,7 7,8±1,4 7,3±1,0
SCUBE2 Signal peptide-, CUB domain-, and EGF-like domains-containing protein 2
10,9±4,4 11,5±3,9 12,0±3,8 16,5±0,2
ESR1 Estrogen receptor 1 5,5±1,5 8,1±1,0 7,9±0,9 6,8±0,9
51
Tabelle 4. Gene und Expression (Fortsetzung)
Gruppe Symbol Bezeichnunga ΔCt-Werte
b
EL PSLN- PSLN+ MEL
Pro-liferation und Wachstum
CCNB1 Cyclin B1 9,3±2,6 9,0±2,5 7,5±1,0 7,3±1,0
MKI67 Antigen identified by monoclonal antibody Ki-67
10,9±2,5 8,7±1,2 8,4±0,6 7,7±0,4
MYBL2 v-myb myeloblastosis viral oncogene ho-molog (avian)-like 2
9,3±0,7 6,0±0,8 6,5±1,0 5,8±0,5
AURKA Aurora kinase A 10,9±2,4 10,1±1,8 9,4±1,7 10,8±2,1
BAG1 BCL2-associated athanogene
6,0±0,6 6,1±0,7 5,7±0,5 6,3±0,7
BIRC5 Baculoviral IAP repeat containing 5 (Survivin)
13,7±3,0 12,0±2,9 12,5±3,2 12,2±3,7
Invasion und Migration
CTSL2 Cathepsin L2 13,3±2,2 12,7±2,2 13,1±1,6 17,8±1,8
MMP11 Matrix metallo-peptidase 11 (stromelysin 3)
1,0±2,2 5,8±1,6 4,1±1,7 3,2±2,6
CXCR4 Chemokine (C-X-C motif) receptor 4
8,3±1,1 6,6±1,4 5,6±1,0 4,3±0,6
Adhäsion CD24 CD24 molecule (small cell lung carcinoma cluster 4 antigen)
3,8±1,9 3,2±1,0 2,6±0,7 2,5±0,3
CD44s CD44 molecule, standard variant
2,8±1,0 1,8±0,8 1,4±0,3 1,1±0,2
CD44v6 CD44 molecule variant 6
13,5±3,0 13,3±3,4 11,5±3,1 8,4±0,6
CDH1 Cadherin 1 (E-cadherin, CD324)
7,3±1,4 8,3±1,0 8,2±1,0 7,4±1,1
CDH2 Cadherin 2 (N-Cadherin, CD325)
4,2±2,5 10,2±4,3 6,2±0,9 5,8±0,6
EPCAM Epithelial cell adhesion molecule (CD326)
8,7±5,5 15,1±1,1 15,6±1,1 7,9±2,7
ICAM1 intercellular adhesion molecule 1 (CD54)
7,0±0,9 6,5±1,1 6,7±0,8 6,2±0,1
52
Tabelle 4. Gene und Expression (Fortsetzung)
Gruppe Symbol Bezeichnunga ΔCt-Werte
b
EL PSLN- PSLN+ MEL
Sonstige CD68 CD68 molecule (macrophage antigen CD68, macrosialin)
1,0±1,4 0,8±0,8 0,2±0,7 -0,1±0,4
GSTM1 Glutathione S-transferase mu 1
3,8±1,1 5,4±0,6 5,4±0,7 3,8±0,2
MUC1 Mucin 1, cell surface
associated
8,1±2,0 14,0±2,5 13,9±2,8 13,2±4,2
NOTCH1 Notch 1 6,0±0,3 5,4±0,7 6,0±0,6 6,0±0,4
SNAI1 Snail homolog 1 6,6±2,2 7,6±1,2 7,5±1,6 7,1±0,5
VEGF-C Vascular endothelial
growth factor C
12,4±2,6 12,8±2,2 13,0±1,7 11,3±0,5
SLIT2 Slit homolog 2 5,5±1,4 6,6±0,8 5,9±0,8 5,5±0,9
ROBO1 Roundabout, axon
guidance receptor,
homolog 1
3,9±1,6 3,1±1,6 2,8±1,8 4,7±0,3
a Offizielle Genbezeichnung lt. HGNC (HUGO Gene Nomenclature Committee)
b ΔCt-Werte (Mittelwert±Standardabweichung) relativ zum Mittelwert der beiden Referenzgene.
Unterschiede in der Genexpression zwischen den Probengruppen
Unter der Annahme vergleichbarer Genexpressionsniveaus in IELC und Zellen
der Primärläsionen, würde man, bedingt durch die von uns verwendete Technik
der Gewebeentnahme (Stanzen aus Paraffinblöcken unter Zuhilfenahme einer
Punchbiopsie-Nadel mit 3 mm Durchmesser), bei der quasi eine „Verdünnung“
der eigentlich relevanten Zellen passiert (durch Lymphozyten, Lymphknoten-
kapsel und potentiell anderes umliegendes Gewebe), erwarten, dass bei einem
großen Unterschied in der Expressionshöhe eines Genes zwischen Zellen der
Primärläsion (hoch) und Lymphknoten (niedrig) in den IELC-positiven PSLN
eine mittlere Expressionshöhe zu beobachten ist.
53
Das ist beispielsweise im Fall des Östrogenrezeptors (ESR1) und des
Progesteronrezeptors (PGR) belegt. Beide dienten ursprünglich dazu, isolierte
Endometriose-ähnliche Zellen in den PSLN zu identifizieren; in normalen
Lymphknoten sind beide nicht oder nur wesentlich schwächer exprimiert als in
den primären Endometrioseläsionen. Erwartungsgemäß war demnach für beide
Gene in den IELC-positiven PSLN eine höhere Expression als in den IELC-
negativen PSLN zu beobachten, wenn auch die Unterschiede nicht statistisch
signifikant waren (Abbildung 2).
Ein ähnliches Bild, das heißt eine abfallende Expression von Primärläsion über
IELC-positive PSLN bzw. MEL hin zu IELC-negativen PSLN, bot sich auch bei
CDH2 (N-Cadherin), GSTM1, MMP11 und MUC1.
Im umgekehrten Fall, wenn also ein Genprodukt in Lymphozyten generell höher
exprimiert ist als in Zellen eines primären Endometrioseherds, würde dadurch
eine mögliche niedrig(er)e Expression in IELC überdeckt, wie beispielsweise bei
BCL2, MKI67 oder MYBL2.
Für eine Reihe von Genen (AURKA, BAG1, BIRC5, CCNB1, CTSL2, ICAM1,
NOTCH1, SCUBE2, SLIT2 und SNAI1) bestanden hingegen keine signifikanten
Unterschiede zwischen der Expressionshöhe in PSLN (unabhängig von deren
IELC-Status) und primären Endometrioseimplantationen.
Zusammengefasst kann man jedoch aus dieses Ergebnissen schließen, dass
es trotz der durch die verwendete Technik der Probenentnahme bedingte hohe
Kontamination der IELC mit Lymphozyten (und eventuell weiteren Zelltypen)
gelang, in den IELC stark exprimierte Genprodukte spezifisch nachzuweisen.
54
Abbildung 2. Grafische Darstellung der Genexpressionsniveaus (Teil 1).
55
Abbildung 2. Grafische Darstellung der Genexpressionsniveaus (Teil 2).
56
EPCAM ist in MEL stark exprimiert, jedoch nicht in IELC-positiven
PSLN
Das Expressionsniveau der EPCAM-mRNA zeigte eine große Heterogenität in
den Primärläsionen, wobei es jedoch relativ hoch war (mittleres ΔCt =
8,67±1,54, Median = 4,97). Im Gegensatz dazu war eine nur sehr geringe oder
keine Expression in IELC-positiven und IELC-negativen Wächterlymphknoten
nachweisbar. In der PSLN-Probe mit MEL war EPCAM jedoch vergleichsweise
ähnlich exprimiert wie in den primären Endometrioseherden (ΔCt = 7,92±1,36;
Mittelwert aus den Ergebnissen von drei Stanzproben aus dieser Gewebe-
probe). In einer Reihe von drei Proben, die alle von derselben Patientin
stammten, waren die ΔCt-Werte relativ zum Mittelwert der Referenzgene
3,75±0,15 für die Primärläsion, 7,92±1,37 für die MEL und 16,02±0,26 für die
IELC-positiven Wächterlymphknoten (siehe Tabelle 5). Ein ΔCt-Wert von 16
(relativ zum Mittelwert der Referenzgene) entspricht in etwa einem Ct-Wert von
40, das heißt, eine Expression konnte nicht nachgewiesen werden. Demnach
scheint EPCAM in IELCs nicht, in ausgebildeten endometrioiden Läsionen
innerhalb der Lymphknoten jedoch sehr wohl (wieder) exprimiert zu werden.
Abbildung 2. Grafische Darstellung der Genexpressionsniveaus. Für die jeweilige
Probengruppe sind der Median (schwarze Linien), die 25./75. Perzentilie (graue
Boxen), sowie die 10./90. Perzentilie (Whiskers) der ΔCt-Werte relativ zum
Mittelwert der beiden Referenzgene (ACTB und GAPDH) gezeigt. Höhere Werte
bedeuten ein geringeres Expressionsniveau. EL = Endometriose-Primärherde,
PSLN− = IELC-negative pelvine Wächterlymphknoten (PSLN), PSLN+ = IELC-
positive PSLN. Die Rangsummenstatistik (Mann-Whitney-U Test) wurde Für EL
gegen PSLN− (schwarz) und PSLN+ gegen PSLN− (rot) berechnet. Signifikante
Unterschiede sind durch Sterne gekennzeichnet (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001).
Die roten Punkte mit Whiskers zeigen Mittelwert ± Standardabweichung der für den
einzelnen Wächterlymphknoten mit ausgebildeter Endometrioseläsion (MEL)
ermittelten ΔCt-Werte.
57
Überexpression von CXCR4, CD68, MKI67 und CD44-Spleißvarianten
in IELC-positiven PSLN und PSLN mit MEL
CXCR4, CD68, MKI67 und CD44 waren in den Primärlasionen deutlich geringer
exprimiert als in Lymphozyten. Interessanter Weise zeigte der direkte Vergleich
zwischen IELC-positiven und IELC-negativen PSLN jedoch eine stärkere
Expression dieser Gene in den IELC-positiven PSLN (Abbildung 2). Außer im
Fall von CXCR4 (P=0,025) waren die Unterschiede jedoch nicht statistisch
signifikant. Diese Gene waren auch in der MEL Probe vergleichsweise stark
exprimiert. Betrachtet man eine Serie von Proben (Primärläsion, IELC-positiver
PSLN, PSLN mit MEL) aus derselben Patientin, waren alle Gene in der
Primärläsion am niedrigsten und in der MEL am höchsten exprimiert oder
zumindest gleich stark wie in der Probe des IELC-positiven PSLN (Tabelle 5).
Tabelle 5. ΔCt-Wertea ausgewählter Gene in verschiedenen Proben
b aus derselben Patientin.
Gen EL PSLN+ MEL
CD44s 2,42±0,05 0,96±0,06 1,14±0,12
CD44v6 9,39±0,19 8,44±0,16 8,45±0,32
CDH1 5,71±0,18 7,46±0,15 7,37±0,63
CTSL2 16,59±0,69 16,27±0,78 17,76±0,81
CXCR4 8,44±0,15 4,42±0,19 4,31±0,25
EPCAM 3,75±0,15 16,02±0,26 7,92±1,37
SCUBE2 7,8±0,21 8,27±0,08 16,45±0,14
a Relativ zum Mittelwert der beiden Referenzgene ACTB und GAPDH. Ein ΔCt-Wert ab etwa
15 bedeutet, dass die entsprechende mRNA nicht nachweisbar war (Ct-Wert >40). Angegeben
sind Mittelwert ± Standardfehler.
b Primäre Endometrioseläsion (EL), IELC-positiver PSLN (PSLN+) und ein PSLN mit
ausgeprägter Endometrioseläsion (MEL).
Im Rahmen der Analyse von CD44 wurden die Expressionsniveaus sowohl der
Standard-Isoform (CD44s) als auch der Spleißvariante CD44v6, die das
variable Exon 6 enthält, bestimmt. CD44s war in Primärläsionen und in
Lymphozyten exprimiert, während die Expression von CD44v6 in diesen Proben
deutlich (500 bis 1000-fach) geringer war. Allerdings schienen sowohl CD44s
58
als auch CD44v6 in den Lymphknotenproben mit IELC oder MEL stärker
exprimiert als in PSLN ohne IELC.
Keine Expression von CTSL2 und SCUBE2 in MEL?
Bei der Betrachtung der Genexpressionsniveaus in der MEL-Probe fiel auf,
dass zwei Gene, CTSL2 und SCUBE2, in dieser Probe nicht exprimiert waren
(siehe Abbildung 2). Im Fall von CTSL2 war es jedoch so, dass in allen Proben
(Primärläsion, IELC-positiver PSLN, PSLN mit MEL) aus derselben Patientin
keine Expression von CTSL2 nachweisbar war. Mögliche Gründe dafür wurden
nicht weiter verfolgt. SCUBE2 war interessanterweise jedoch in den beiden
anderen Proben aus dieser Patientin (Primärläsion und IELC-positiver PSLN)
sehr wohl exprimiert. Auch hier wurden die möglichen Ursachen nicht weiter
ergründet
Immunhistochemie bestätigt die Expression von CXCR4 und
CD44v6 und die Abwesenheit von E-Cadherin in Östrogenrezeptor-
positiven IELCs
Um die beobachtete Hochregulierung von mRNA-Expression der Gene CXCR4
und CD44v6 als tatsächlich von den IELCs herrührend zu bestätigen, wurden
immunhistochemische Färbungen mit spezifisch gegen CD44s, CD44v6,
CXCR4 und E-Cadherin (das Proteinprodukt des CDH1-Gens) gerichteten
Antikörpern durchgeführt. Eine positive Östrogenrezeptor-Färbung diente zur
Identifikation von Endometriosezellen (in primären bzw. metastatischen
Läsionen) bzw. von IELCs in PSLN (Abbildung 3).
Bevorzugt im Randsinus von Lymphknoten eingestreute IELC zeigten eine
deutliche Expression von CD44s und CD44v6; die umliegenden Lymphozyten
waren negativ oder nur sehr schwach gefärbt. Die Zellen in MEL und der
Primärläsionen waren hingegen deutlich positiv. CXCR4 war sowohl in den
Primärherden und der MEL als auch in den IELC deutlich positiv, wobei IELC
stärker gefärbt waren als CXCR4-exprimierende Lymphozyten. Eine Färbung
für E-Cadherin war wie erwartet in den Primärläsionen und der MEL stark
positiv, allerdings blieben ER-positive IELCs ungefärbt.
59
Abbildung 3. Repräsentative immunhisotochemische Färbungen eines Wächter-
lymphknoten mit eingestreuten IELCs (erste Spalte), des PSLN mit ausgebildeter
Endometrioseläsion (MEL; zweite Spalte) und einer Endometriose-Primärläsion
(dritte Spalte). Die Gegenfärbung erfolgte mit Hämatoxylin. Pfeilspitzen: IELCs;
Balken: 100 µm.
60
Anwendbarkeit des Oncotype DX Tests bei Endometriose?
Das in dieser Arbeit verwendete Genpanel überlappt zu einem großen Teil mit
jenem des Oncotype DX Tests, der bei Brustkrebs ein Maß für die
Wahrscheinlichkeit eines Rezidivs darstellt. Da Endometriose und Brustkrebs
eine Reihe von Eigenschaften teilen (beides sind hormonabhängige
Erkrankungen, die involvierten Zellen exprimieren Östrogen- und Progesteron-
rezeptoren, und es kommt zu Angiogenese sowie DNA-Aneuploidie und Verlust
der Heterozygotie) sollte getestet werden, ob ein analog zum durch den
Oncotype DX Test definierter Recurrence-Score bei Endometriose eine
mögliche Aussagekraft besitzt.
Der Recurrence-Score ist eine Zahl zwischen 0 und 100. Für Brustkrebs wird
bei Werten <18 von einem geringen Risiko eines Rezidivs ausgegangen. Werte
zwischen 18 und 31 stellen ein intermediäres, Werte >31ein hohes Risiko dar
(Cronin et al., 2007).
Basierend auf unseren Genexpressiondaten haben wir Recurrence-Score-
ähnliche Werte berechnet (siehe Material und Methoden) und die Proben (13
Primärläsionen und 19 IELC-positive bzw. IELC-negative PSLN, sowie eine
intranoduläre metastatische Endometrioseläsion) je nach errechnetem
„Recurrence-Score“ entweder in die Gruppe „niedriges/mittleres Risiko“ oder die
Gruppe „hohes Risiko“ eingeteilt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt.
Tabelle 6. Oncotype DX-ähnliche Scores
Gruppe Recurrence-Scorea Medium/Low Risk High Risk P
b
EL 27,7 ± 9,7 (26,1; 12,5-45,9) 9/13 (69,2%) 4/13 (30,8%)
PSLN 3/19 (15,8%) 16/19 (84,2%) <0,01
PSLN− 47,4±17,2 (47,0; 30,2–79,4) 2/11 (18,2%) 9/11 (81,8%) <0,02
PSLN+ 40,9±12,2 (34,0; 30,2–61,6) 1/8 (12,5%) 7/8 (87,5%) <0,02
MEL 25,6±5,9 (27,4; 17,3–30,4) 1/1 (100%) 0/1 (0%)
a Mittelwert ± Standardabweichung. In Klammer sind Median und Bereich angegeben.
b Statistische Signifikanz (Chi-Quadrat Test), jeweils gegenüber EL (Primärläsionen).
61
Bezüglich der Primärherde ergab dies in 30,8% (4/13) und im Falle der PSLN in
84,2% (16/19) einen Oncotype DX „High Risk“-Typus. Zwischen IELC-positiven
(87,5%, 7/8) und IELC-negativen PSLN (81,8%, 9/11) bestand kein
Unterschied. Die Lymphknotenprobe mit der metastatischen Endometriose-
implantation ergab wie die Mehrzahl der Primärläsionen einen „Medium/Low
Risk“-Typ.
Teilweise Publikation der Ergebnisse
Teile der Daten, die im Rahmen dieser Arbeit erhoben wurden, wurden in dem
Artikel “Spread of endometriosis to pelvic sentinel lymph nodes: gene
expression analysis“ publiziert (Bürkle, Notscheid, et al. 2013. Eur. J. Obstet.
Gynecol., doi:10.1016/j.ejogrb.2013.03.029).
Ich, Nadine Katharina Notscheid, habe hierbei maßgeblich sowohl zur
Erhebung der Daten als auch zu deren Auswertung und Interpretation
beigetragen. Unter anfänglicher Anleitung und im weiteren Verlauf auch
selbstständig habe ich sowohl RNA-Extraktion und cDNA-Synthese als auch die
quantitative PCR-Analyse durchgeführt. Die immunhistochemischen Analysen
habe ich unter Hilfestellung durch J. Scheich durchgeführt; die Auswertung der
Daten erfolgte unter Anleitung durch Dr. G. Rezniczek.
62
DISKUSSION
Auswahl der Gene
Die Zielsetzung dieser Arbeit bestand darin, Gene zu identifizieren, die am
Befall von Lymphknoten durch Endometriose beteiligt sind bzw. diesen Prozess
im Sinne einer „malignen“ Transformation eventuell begünstigen könnten. In
Tabelle 4 sind die Gene, die im Rahmen dieser Studie untersucht wurden,
aufgelistet und in funktionelle Gruppen eingeteilt, die im Folgenden kurz
besprochen werden.
Wachstum: BAG1, BCL2 und Survivin wirken hemmend auf apoptotische
Vorgänge und begünstigen das Zellwachstum (Nasu et al., 2011; Takayama et
al., 1995; Zhang et al., 2012). CCNB1 und MYBL2 begünstigen durch
promitotische Wirkung ebenfalls das Zellwachstum (Martinez und Dimaio, 2011;
Singhal et al., 2005). Das Proteinprodukt des Gens AURKA, Aurora Kinase A,
trägt unter physiologischem Expressionsniveau zum ordnungsgemäßen Ablauf
der Mitose bei. Die bei vielen Tumorarten beobachtete erhöhte Expression
dieses Gens resultiert ebenfalls in einer gesteigerten Proliferation (Carmena
und Earnshaw, 2003). Ki-67 stellt einen weit verbreiteten Proliferationsmarker
dar (de Azambuja et al., 2007).
Adhäsion: Diese Gruppe umfasst Gene, deren Produkte bei der interzellulären
Adhäsion bzw. an Zell-Matrix-Kontakten beteiligt sind. Einerseits kann es so bei
verringerter Expression dieser Gene zu einem erhöhten
Metastasierungspotential durch vereinfachtes Herauslösen der Zellen aus ihrem
Verband kommen, andererseits können die so wandernden Zellen jedoch
aufgrund veränderter Expressionsmuster dieser Gene auch wieder an neuer
Lokalisation adhärieren und dort eine Metastase ausbilden. So kann es bei
Überexpression von CD24 zu einer verstärkten Anhaftung an Endothelzellen
bzw. Thrombozyten kommen, was in einem erhöhten hämatogenen
Metastasierungspotential resultiert (Jaggupilli und Elkord, 2012). Die
verminderte Expression von CDH1 bzw. der damit assoziierte Mangel des
epithelialen Markers E-Cadherin führt über kaskadenartige Vorgänge zu einem
63
ungehemmten Wachstum und invasiven Eigenschaften eines Karzinoms
(Thiery, 2002). Die Expression von CDH2 (N-Cadherin) resultiert in einer
geschwächten interzellulären Kohäsion bzw. einem vermehrt migrativen
Verhalten betroffener Zellen (Natalwala et al., 2008; Thiery, 2002). EpCAM ist
ein Marker für epitheliale Gewebe und Tumoren und wirkt unter anderem
stabilisierend auf die Adhäsion eines Tumorzellverbandes (Patriarca et al.,
2012). ICAM1 ist ein Mitglied der Familie der Cell adhesion molecules (CAM),
das unter anderem an pathologischen Prozessen wie der Tumordissemination
oder Metastasierung beteiligt ist (Lyons und Jones, 2007). Es gibt auch
Hinweise, dass erhöhte Produktion und proteolytische Spaltung von ICAM1
durch Matrix-Metalloproteasen (MMP11) nach Stimulation durch TNFα zur
Pathophysiologie der Endometriose, ihrer Invasivität und hohen Rezidivrate
beitragen könnte (Pino et al., 2009). CD44 kodiert für ein multifunktionelles
Zelloberflächenmolekül, das in Form mehrerer Isoformen (Spleißvarianten)
exprimiert wird, die unterschiedliche Funktionen aufweisen. CD44 wird häufig
von Tumorzellen aberrant exprimiert und ist mit hämatogener Metastasierung
korreliert (Jaggupilli und Elkord, 2012). In dieser Arbeit wurde die Standard-
Isoform CD44s sowie die Isoform CD44v6, die das variable Exon 6 beinhaltet,
untersucht.
Invasion: CTSL2 (Cathepsin V) gehört zur Familie der lysosomalen Cystein-
proteinasen (Kinoshita et al., 2001). Es wird unter anderem von malignen Zellen
sezerniert und in pathologischen Vorgängen der Tumorprogression involviert,
indem es umliegende extrazelluläre Matrix abbaut (Nomura und Katunuma,
2005). Das von MMP11 kodierte Protein ist eine Matrix-Metalloproteinase und
besitzt somit ebenfalls die Fähigkeit, Elemente der extrazellulären Matrix
abzubauen. MMP11 wird nahezu von allen humanen invasiven Karzinomen
exprimiert und ist im Allgemeinen mit einer schlechten Prognose assoziiert
(Matziari et al., 2007; Wei und Shi, 2005).
Hormonabhängigkeit: Östrogen- sowie Progesteronrezeptorexpression auf der
Zelloberfläche deutet auf eine Hormonabhängigkeit hin bzw. dass
entsprechende Zellen bei Präsenz der jeweiligen Hormone (Östrogene bzw.
Progesterone) durch Regulation verschiedener Zielgene reagieren (Mulac-
64
Jericevic und Conneely, 2004; Puzianowska-Kuźnicka, 2012). In
Endometrioseläsionen ist der Östrogenrezeptor vermehrt exprimiert, was oft mit
einer vermehrten Koexpression von BCL2, einem antiapoptotisch wirkenden
Gen, verbunden ist (Nasu et al., 2011). SCUBE2 wirkt als Tumorsuppressorgen
beim Mammakarzinom (Lin et al., 2011), indem es das Zellwachstum hemmt
(Cheng et al., 2009).
Sonstige: CD68 ist ein Marker für sogenannte Tumor-assoziierte Makrophagen
(TAM) (Tang, 2013). GSTM1 (Glutathion-S-Transferase) ist ein metabolisches
Enzym, das hauptsächlich für die Detoxifikation verschiedener Metabolite
wichtig ist. Sein Expressionsniveau lässt beispielsweise Aussagen bezüglich
Effektivität und Nebenwirkungen von Chemotherapien zu (Guo, 2006; Kurose et
al., 2012; Vella et al., 2011). MUC1 kodiert für ein transmembranöses
Glykoprotein, das in Epithelzellen verschiedener Organe auf einem basalen
Niveau exprimiert wird. In malignen Tumoren ist es jedoch oft überexprimiert
und aberrant glykosyliert, was bei der Tumorinvasion und Metastasierung eine
Rolle spielt (Yonezawa et al., 2011). Notch1 ist unter anderem wichtig für die
Embryonalentwicklung und scheint ebenfalls eine tumorfördernde Wirkung zu
besitzen. Es ist bei hoher Expression mit einem schlechten Outcome bei
krebskranken Patienten assoziiert. Die Notch1-Aktivierung korreliert mit dem
Ras-Status in Mammakarzinomen und scheint den karzinogenen Effekt des
onkogenen Ras-Proteins zu vermitteln (Weijzen et al., 2002). Snail (SNAI1)
triggert die epithelial-mesenchymale Transition (EMT). So führt eine erhöhte
SNAI1-Expression in Tumorzellen unter direkter Repression der E-Cadherin-
Expression und anderer epithelialer Marker bzw. Hochregulierung
mesenchymaler Marker zur EMT. Dies resultiert wiederum in einer vermehrten
Invasivität und Tumorprogression. Des Weiteren kann Snail den Zellzyklus
blockieren, was die malignen Zellen vor dem Zelltod bewahrt (Becker et al.,
2007). Vaskulär-endotheliale Wachstumsfaktoren (VEGFs) haben während der
Entwicklung des Kreislaufsystems unter physiologischen Bedingungen eine
herausragende Rolle (Takahashi, 2011). VEGF-C erzielt über Interaktionen mit
dem entsprechenden Tyrosinkinaserezeptoren (VEGFR-3) einen
lymphangiogenetischen bzw. angiogenetischen Effekt. VEGFR-3 ist auf der
Oberfläche von Endothelzellen, aber auch bei einer Vielzahl von maligne
65
entarteten Zellen exprimiert, sodass es eine bedeutende Rolle für das
Wachstum und die Metastasierung von bösartigen Erkrankungen spielt. Es
liegen außerdem Hinweise vor, dass es durch diverse Signalübertragungswege
der VEGF-C/VEGFR-3-Achse zur Steigerung der Mobilität und invasiven
Eigenschaften maligner Zellen sowie zu einer erhöhten Resistenz gegenüber
Chemotherapien kommt (Su et al., 2007). Die Interaktion zwischen CXCR4 und
seinem Liganden CXCL12 (SDF1α) bewirkt chemotaktische Prozesse (Kuil et
al., 2012). Die Wechselwirkung zwischen ROBO1, einem Mitglied der
Roundabout-Rezeptor-Familie, und seinem Liganden SLIT2 besitzt eine
wichtige Rolle bei der neuronalen Entwicklung, indem sie das axonale
Wachstum leitet. Des Weiteren scheint sie unter anderem auch im Rahmen der
Zellmigration sowie der Angiogenese involviert zu sein. Ein Funktionsverlust
durch Inaktivierung von SLIT2- bzw. ROBO1-Genen zeigt sich in maligne
entarteten Geweben und äußert sich in aberrantem Wachstum sowie durch
aberrante Zellmigration (Dickinson und Duncan, 2010; Legg et al., 2008).
Bewertung des Materials / Kritische Betrachtung der Methode
(Limitationen)
Im Rahmen der Studie „Lymphatic spread of endometriosis to pelvic sentinel
lymph nodes: a prospective clinical study“ am Allgemeinen Krankenhaus der
Stadt Wien (Medizinische Universität Wien) wurden Primärläsionen der
Endometriose und sogenannte pelvine Wächterlymphknoten aus dem
Lymphabflussgebiet der jeweiligen Herde von Patientinnen mit peritonealer
und/oder ovarieller Endometriose entnommen (Tempfer et al., 2011).
Bei einem Sentinel- oder auch Wächterlymphknoten (sentinel lymph node, SLN)
handelt es sich um jenen Lymphknoten, der als erstes die Lymphe aus einem
definiertem Gewebeareal (oder auch Tumor) drainiert. Der SLN stellt somit den
ersten Lymphknoten dar, in den bösartige Zellen eines Primärtumors
metastasieren. Das Konzept der SLN-Biopsie zur Identifizierung nodulärer
Metastasierung findet auch innerhalb der gynäkologischen Onkologie
zunehmend Anklang. Besonders im Rahmen von Mamma- und Vulva-
Karzinomen, aber auch bei Endometrium- und Zervixmalignomen, spielt die
66
SLN-Biopsie zur Prognoseeinschätzung, aber auch zur Therapieplanung, eine
Rolle (Ayhan et al., 2008). Mechsner et al. zeigten in einer Studie, bei der SLN
von Patientinnen mit tief infiltrierender Endometriose ektomiert wurden, dass
sich die Lymphknotenbeteiligung bei Endometriose in topographischer Hinsicht
ähnlich zu jener bei Malignomen verhält (Marnitz et al., 2006; Mechsner et al.,
2008).
Ursprünglich wurde während der Studie, aus der das hier analysierte
Probenmaterial stammt, in zwei Patientinnen pelvine Wächterlymphknoten
vorgefunden, die jeweils eine etablierte endometrioide Metastase (MEL)
enthielten (Tempfer et al., 2011). Bei den dort durchgeführten Untersuchungen
wurde jedoch von einem dieser zwei Lymphknotenpräparate so viel Material
verbraucht, dass für die im Rahmen dieser Dissertation durchgeführten
Analysen neben acht Lymphknoten mit und elf Lymphknoten ohne IELCs nur
noch ein einzelnes Lymphknotenpräparat, welches eine MEL beinhaltete, zur
Verfügung stand. Dieser Sachverhalt (nur eine Probe) könnte zu eventuellen
„Zufallsbefunden“ führen, die wiederum die Validität der erhobenen Daten
einschränken könnten. Aufgrund dessen wurden jedoch zur Absicherung der
Ergebnisse drei unabhängige Stanzproben dieses Lymphknotenpräparats,
welches die intranoduläre metastatische Endometrioseläsion enthielt,
angefertigt, aufgebarbeitet sowie quantitativ analysiert.
Die zur Verfügung stehenden Proben waren Formalin-fixierte, Paraffin-
eingebettete Gewebe. Dies ist insofern problematisch, als das die RNA durch
diese Fixierungsmethode stark degradiert wird, sodass die RNA-Extraktion und
folgende reverse Transkription erschwert ist (Farragher et al., 2008). Die
Ergebnisse der RNA-Extraktion, die mit Hilfe des RNeasy FFPE-Kits der Firma
Qiagen durchgeführt wurde, sowie die mittels Real-Time-PCR erzielten Ct-
Werte der Referenzgene deuten jedoch darauf hin, dass die aus den Proben
gewonnene mRNA eine ausreichende Qualität zur quantitativen Gen-
expressionsanalyse aufwies.
Da es mittels der verwendeten Stanztechnik nicht möglich war, einzelne
Zellarten (IELCs, Lymphozyten, etc.) zu selektieren, ist es zudem zu gewissen
Verdünnungseffekten der Genexpressionsunterschiede durch umliegende
67
Zellen gekommen. Dies war unter anderem auffällig, wenn man die
Expressionsniveaus einzelner Genprodukte zwischen Primärläsionen und IELC-
positiven PSLN bzw. isolierten Endometriose-ähnlichen Zellen verglich. Vor
allem kleine Unterschiede zwischen den Expressionsniveaus der jeweiligen
Proben (besonders beim Vergleich der Genexpressionsmuster zwischen den
IELC-positiven und. IELC-negativen PSLN) könnten durch diesen
Verdünnungseffekt maskiert sein. Dennoch ist es uns gelungen, gewisse
Expressionsunterschiede zwischen den Wächterlymphknoten mit und ohne
IELCs zu detektieren, die teilweise statistisch signifikant waren.
Da Aufgrund der Probenahme und Real-Time-PCR-Analyse eine spezifische
Zuordnung der Expressionsdaten zu einzelnen Zelltypen nicht möglich war,
wurden zusätzlich immunhistochemische Analysen durchgeführt. Anhand der
immunhistochemischen Färbungen kann so zumindest eine qualitative
Zuordnung der jeweiligen Proteine zu den dazugehörigen Zelltypen stattfinden.
Eine immunhistochemische Färbung konnte aufgrund der limitierten Anzahl an
Dünnschnitten, die uns je Probe zur Verfügung standen, lediglich in Bezug auf
ausgesuchte Proteine (CXCR4, CD44s, CD44v6, CDH1, sowie
Östrogenrezeptor als Marker für IELCs) ausgeführt werden.
Lymphknotenbefall durch Endometriose ist problematisch
Endometriose ist eine der häufigsten Erkrankungen von Frauen im
gebärfähigen Alter und hat aufgrund ihrer Häufigkeit und ihrer teils gravierenden
Symptome wie Unterbauchschmerzen und Sterilität eine hohe klinische
Relevanz. Dennoch sind einige Kriterien dieser Erkrankung wie beispielsweise
die Pathogenese und Ätiologie bis dato nicht genau geklärt (Oehmke et al.,
2007).
Zwar wird Endometriose im Allgemeinen als gutartig angesehen, doch im
Rahmen diverser Arbeiten wurden bei Endometriose auch Charakteristika
entdeckt, wie sie ebenfalls bei malignen Erkrankungen auftreten. Dazu zählen
beispielsweise dereguliertes Wachstum, atypische Morphologien, DNA-
Aneuploidien oder der Verlust der Heterozygotie (Ballouk et al., 1994;
Munksgaard und Blaakaer, 2012; Thomas und Campbell, 2000). Des Weiteren
68
konnten ein monoklonaler Ursprung der Endometrioseimplantate sowie
Veränderungen in den Onko- bzw. Tumorsupressorgenen Bcl-2 und p53 als
weitere bösartige Charakteristika der Endometriose nachgewiesen werden
(Jimbo et al., 1997; Nezhat et al., 2002). Außerdem ist bekannt, dass
Endometrioseherde, ähnlich wie bösartige Erkrankungen, die Fähigkeit
besitzen, lokale - aber auch weit entfernte Metastasen auszubilden. Dabei
lagern sich endometrioide Zellen an fremde Gewebe an, dringen in diese ein
und zerstören letztendlich das fremde Gewebe (Munksgaard und Blaakaer,
2012). Bereits 1949 gab es Aussagen dazu, dass endometrioides Material über
das lymphatische System migrieren kann (Javert, 1949). Diese Fähigkeiten der
Implantation an entfernten Lokalisationen bzw. der Invasion in fremde Gewebe
legt nahe, dass endometrioide Zellen ein Verhalten zeigen, das zumindest dem
von prämalignen Tumoren, wie Borderline-Tumoren oder malignen
Ovarläsionen, ähnelt (Daraï et al., 1998).
Im Rahmen der Metastasierung bei Endometriose sind ebenfalls regionale
Lymphknoten beteiligt. Ries berichtete schon im Jahre 1897 über
„Drüseneinschlüsse“ in pelvinen Lymphknoten bei Patientinnen mit
Zervixkarzinom (Ries, 1897). Ähnliche Beobachtungen wurden anschließend
beispielsweise auch als „Endometriose-ähnliche Formationen“ innerhalb von
Lymphknoten betitelt und wurden demzufolge mit Endometriose in
Zusammenhang gebracht (Lange, 1955; Regidor-Brandau et al., 1994). So
wurde in diversen Studien Lymphknotenbefall bei den unterschiedlichen
Formen der Endometriose (rektosigmoidal, rektovaginal bzw. rektal, pelvin,
peritoneal und ovariell) festgestellt. Teils gestaltete sich dieser
Lymphknotenbefall in Form von intranodulär etablierten endometrioiden
Läsionen. In anderen Fällen waren innerhalb der Lymphdrüsen, vor allem im
Randsinus, IELCs vorhanden. Insabato und Pettinato berichteten über drei
Fälle, Lorente Poyatos über einen Fall von Lymphknotenbeteiligung bei
Endometriose (Insabato und Pettinato, 1996; Lorente Poyatos et al., 2003).
Auch bei rektosigmoidaler Endometriose wurde in 26%, 33% bzw. bei 42% der
Fälle perikolischer Lymphknotenbefall gefunden (Abrao et al., 2006; Mechsner
et al., 2010; Noël et al., 2008). Ebenso bezüglich rektovaginaler Endometriose
existieren sowohl eine Fallbeschreibung (Thomakos et al., 2006) als auch
69
Studien, die Lymphknotenläsionen in 25% der pelvinen Wächterlymphknoten
darlegen, wobei zu einem beträchtlich höherem Anteil vereinzelte
Endometriose-ähnliche Zellen im Randsinus der Lymphdrüsen identifiziert
werden konnten (Mechsner et al., 2008). Eine Lymphknotenbeteiligung wurde
auch in einem Fall einer rektalen Endometriose beschrieben (Namkung et al.,
2011).
Das Vorliegen von intranodulären endometrioiden Zellen weist auf das Potential
der Endometriose hin, eine systemische Erkrankung darzustellen (Keichel et al.,
2011). Da im Rahmen der allgemeinen operativen Sanierung der Endometriose
lediglich sichtbare Läsionen entfernt werden, eine Lymphadenektomie hingegen
nur bei experimentellen Studien durchgeführt wird, verbleiben somit
endometrioide Zellen innerhalb der Lymphknoten und können dadurch eine
Quelle für ein Rezidiv der Erkrankung darstellen (Tempfer et al., 2011).
Keichel et al. konnten in einer Studie anhand von immunhistochemischen
Färbungen von Markern für Lymphgefäße (Podoplanin, LYVE-1, Prox-1, VEGF-
C und VEGF-D) zeigen, dass in Läsionen von tief infiltrierender bzw.
rektovaginaler Endometriose eine signifikant höhere Dichte an lymphatischen
Gefäßen vorlag als im entsprechenden gesunden Gewebe (Keichel et al.,
2011). Sehr ähnliche Beobachtungen machten Reichelt et al. bei peritonealen
Endometrioseherden. Auch hier zeigte die immunhistoschemische Analyse eine
signifikant höhere Dichte an Lymphgefäßen innerhalb der peritonealen
Endometrioseimplantate (Reichelt et al., 2012). Weiters beschrieben Noël et al.
das Vorliegen einer lymphovaskulären Invasion in 4/11 Endometriose-
Patientinnen mit Lymphnotenbefall (Noël et al., 2008). Man kann daraus
schlussfolgern, dass diese in den endometrioiden Primärherden vermehrt
vorkommenden Lymphgefäße eine mögliche Route darstellen, auf der die
endometrioiden Zellen von den Primärläsionen hin zum nächsten Lymphknoten
wandern und dort Metastasen ausbilden können (Keichel et al., 2011).
Obwohl in zahlreichen Fällen eine Beteiligung der Lymphknoten bei
Endometriose bzw. das vermehrte Vorhandensein von lymphatischen Gefäßen
innerhalb von Primärläsionen als mögliche Wanderroute für endometrioide
Zellen vorgefunden wurde, ist bisher über die funktionellen, morphologischen
70
und molekularen Mechanismen des Lymphknotenbefalls bzw. über mögliche
Faktoren, die diesen Prozess beeinflussen oder begünstigen, nur wenig
bekannt.
Die in dieser Arbeit gewonnenen Daten belegen, dass der Prozess des
Lymphknotenbefalls bei Endometriose mit einer veränderten Genexpression in
den endometrioiden Zellen einhergeht. Zu den betroffenen Genen zählen
beispielsweise CD44, CD68, CXCR4, CDH1 und EPCAM. Die Ergebnisse
stützen des Weiteren die zunehmend anerkannte Hypothese, dass bei der
lymphatischen Metastasierung der Endometriose Vorgänge ablaufen, die einer
malignen Transformation im Sinne einer epithelial-mesenchymalen Transition
(EMT) ähneln. Diese erlaubt einigen endometrioiden Zellen die Ablösung von
der Primärläsion und die Ansiedlung in regionalen pelvinen
Wächterlymphknoten. Voraussetzungen für diese Transition scheinen eine
Heraufregulierung des Chemokinrezeptor CXCR4 und der CD44-Isoformen und
ein Verlust der Genexpression von epithelialen Markern wie E-Cadherin und
EpCAM zu sein. Der folgende Schritt, das heißt das Ansiedeln der
endometroiden Zellen innerhalb der Lymphknoten wird von einer Re-Expression
der epithelialen Marker (E-Cadherin, EpCAM) begleitet. Eventuell findet hier
auch ein Verlust der SCUBE2-Expression statt.
Rolle der EMT bei der Ausbreitung von Endometriose
Die EMT stellt einen reversiblen biologischen Prozess dar, während dem
polarisierte epitheliale Zellen, die üblicherweise über ihre basale Oberfläche mit
der Basalmembran und lateral mit benachbarten Zellen interagieren, eine Reihe
von biochemischen Veränderungen durchlaufen und so einen mesenchymalen
Phänotyp erlangen. Durch die EMT verliert eine Zelle epitheliale Marker (z.B. E-
Cadherin) und exprimiert im Gegenzug mesenchymale Marker (z.B. N-
Cadherin). Durch den Verlust von Zell-Zell-Adhäsionen und Zellpolarität
erlangen die Zellen ein erhöhtes Migrations- und Invasions-Potential. Außerdem
zeigen sie eine erhöhte Resistenz gegenüber apoptotischen Prozessen und
bilden vermehrt Komponenten der extrazellulären Matrix (extracellular matrix,
ECM) ab. Solche Zellen besitzen also die Fähigkeit, sich von ihren
71
ursprünglichen Zellverbänden bzw. Geweben heraus zu lösen und fort zu
wandern.
Eine Reihe von verschiedenen molekularen Prozessen muss ablaufen, um eine
EMT zu initiieren bzw. zu vervollständigen. Dazu zählen die Aktivierung von
Transkriptionsfaktoren, die Expression von spezifischen Zelloberflächen-
markern, die Reorganisation bzw. Expression von zytoskelettären Proteinen,
die Produktion von ECM-zerstörenden Enzymen und die Veränderung der
Expression spezifischer microRNAs. Die involvierten Faktoren können als
Biomarker dienen und so den Ablauf der EMT verfolgbar machen.
Über den umgekehrten Prozess der Differenzierung von mesenchymalen Zellen
zu epithelialen Zellen, die mesenchymal-epitheliale Transformation (MET), ist
bisher nur relativ wenig bekannt.
EMT und MET spielen eine wesentliche Rolle im Rahmen der Morphogenese
und sind eng verknüpft mit der Entwicklung von Geweben und Organen
während der Embryonalentwicklung (Typ 1 EMT). Zudem ist die EMT auch im
Erwachsenenalter noch bei der Wundheilung relevant (Typ 2 EMT). Außerdem
ist bekannt, dass eine EMT ebenso bei Neoplasien auftritt (Typ 3 EMT). Hier
werden im Unterschied zu Typ 1 und Typ 2 EMTs besonders solche Gene
abweichend exprimiert, die mit klonalem Wachstum und der Bildung von
lokalisierten Tumoren in Zusammenhang stehen. Diese Expressions-
änderungen betreffen somit vor allem Onkogene und Tumorsupressorgene.
Karzinomzellen, die eine Typ-3-EMT durchlaufen haben, besitzen einen
Stammzell-ähnlichen Charakter und können aufgrund ihrer invasiven bzw.
migrierenden Eigenschaften zur Tumor Progression beitragen und Metastasen
ausbilden. Weitere Kriterien, die mit einer EMT im Rahmen von Malignomen in
Zusammenhang stehen, sind die Suppression der Seneszenz und Apoptose,
die Minderung der Zell-Zyklus-Progression sowie eine gesteigerte Selbst-
Erneuerungstendenz und Resistenz der Karzinomzellen gegenüber Chemo-
und Radiotherapien (De Craene und Berx, 2013; Gao et al., 2012; Kalluri und
Weinberg, 2009; Thiery et al., 2009).
72
Das eutope Endometrium entwickelt sich während der Entstehung des Uro-
genitaltraktes nach einer MET aus dem intermediären Mesoderm. Durch diese
ursprüngliche Herkunft besteht die Möglichkeit, dass die endometrialen Zellen
anfälliger dafür sind, durch eine EMT mesenchymalen Charakter zu erlangen
(Matsuzaki und Darcha, 2012). Vorherige Arbeiten konnten zeigen, dass sich im
Vergleich zum gesunden Endometrium in peritonealen Endometrioseherden
vermehrt E-Cadherin-negative Zellen befinden. Solche E-Cadherin-negativen,
N-Cadherin-positiven Zellen zeigten in In-vitro-Versuchen ein invasives
Verhalten (Gaetje et al., 1997; Zeitvogel et al., 2001). Ein Verlust der E-
Cadherin-Expression gepaart mit einem zeitgleichen Cadherin-Switch, bei dem
E-Cadherin durch mesenchymale Cadherine wie N-Cadherin ersetzt wird, gilt
als ein fundamentales Ereignis und damit als ein Kennzeichen der EMT
(Matsuzaki und Darcha, 2012; Thiery et al., 2009). Endometriale Zellen, die
durch den Mechanismus der retrograde Menstruation in die Peritonealhöhle
gelangen, könnten durch EMT- bzw. MET-ähnliche Vorgänge in der
Pathogenese der pelvinen Endometriose involviert sein (Matsuzaki und Darcha,
2012).
Unsere qPCR- Daten zeigen, dass die Expression von CDH1 (E-Cadherin) in
IELC-positiven PSLN und in der MEL im Vergleich zu jener in Primärherden
herabgesetzt war, wobei E-Cadherin in den IELC-positiven PSLN vergleichs-
weise niedriger exprimiert war als in der MEL. Immunhistochemische Analysen
haben dies bestätigt. Sowohl in den Primärläsionen als auch in der MEL war
eine starke Anfärbung zu beobachten, wohingegen die IELC in den PSLN
negativ waren.
E-Cadherin ist ein wesentlicher Bestandteil der Zonulae adhaerens
(Gürteldesmosomen) und sorgt somit für den Zellzusammenhalt in epithelialen
Geweben. Der Verlust von E-Cadherin ist in diversen Malignomen beobachtet
worden und erlaubt bösartigen Zellen, sich den Wachstumskontrollen zu
entziehen. Dies wiederum resultiert dann im Rahmen des neoplastischen
Prozesses zum Verlust der Differenzierung sowie zu ungehemmtem Wachstum.
So entsteht ein invasiver Charakter der malignen Zellen (Tsanou et al., 2008).
Auch in Bezug auf Endometriose zeigte eine Untersuchung, dass sich die E-
73
Cadherin-Expression aberrant verhält. Allerdings gibt es hierzu jedoch
divergente Untersuchungsergebnisse. So berichteten van der Linden et al.,
dass sich endometrioide Zellen zwar in allen Proben von eutopen Endometrium,
aber nur in zwei von acht endometrioiden Primärherden bei der immunhisto-
chemischen Färbung positiv für E-Cadherin anfärben ließen. Somit zeigte sich
der Großteil der Primärherde als E-Cadherin-negativ (van der Linden et al.,
1994). Poncelet et al. beobachteten hingegen in etwa 80% der Fälle eine
positive immunhistochemische Anfärbung für E-Cadherin in peritonealen
Endometrioseherden. Es zeigte sich jedoch besonders bei höhergradigen
Endometriosestadien eine im Vergleich zu geringergradigen Endometriose-
stadien eine niedrigere E-Cadherin-Expression in epithelialen Zellen innerhalb
der peritonealen Endometrioseimplantate (Poncelet et al., 2002). In einer
weiteren Studie konnte gezeigt werden, dass nur in 20% der untersuchten
Endometriome keine Expression von E-Cadherin zu verzeichnen war. Des
Weiteren konnte kein Unterschied in der E-Cadherin-Genexpression zwischen
Endometriomen, Borderline-Tumoren und Karzinomen des Ovars gefunden
werden (Daraï et al., 1998). Gaetje et al. berichteten, dass innerhalb von
peritonealen Endometrioseläsionen vergleichsweise vermehrt epitheliale Zellen
vorlagen, die E-Cadherin-negativ waren als in den Proben des eutopen
Endometriums. Diese E-Cadherin-negativen Zellen aus den endometrioiden
Läsionen stellten sich im Gegensatz zu solchen aus dem eutopen Endometrium
in in-vitro- Versuchen als stärker invasiv dar (Gaetje et al., 1995; Gaetje et al.,
1997).
Es gibt diverse Polymorphismen, die in Zusammenhang mit Endometriose zu
stehen scheinen (Tempfer et al., 2009), darunter auch ein Polymorphismus im
E-Cadherin-Gen, der häufig bei Endometriosepatientinnen vorlag (Yoshida et
al., 2012).
Zusammenfassend kann man daraus schließen, dass der Verlust von E-
Cadherin bei endometrialen Zellen eine Rolle in der Pathogenese der
Endometriose spielt. Ob der während der EMT üblicherweise stattfindende
Switch von E-Cadherin (epithelial) auf N-Cadherin (mesenchymal) hier
stattfindet, lässt sich anhand unserer qPCR-Daten nicht beantworten. N-
74
Cadherin war in allen Probengruppen (sehr heterogen) exprimiert. N-Cadherin
wird während der proliferativen Phase des weiblichen Zyklus sowohl von
epithelialen als auch von stromalen Zellen des eutopen Endometriums
exprimiert, in der sekretorischen Phase jedoch nur von den epithelialen Zellen
(Poncelet et al., 2002). Zeitvogel et al. zeigten, dass N-Cadherin-positive
endometrioide Zellen aus peritonealen Läsionen in In-vitro-Versuchen einen
invasiven Charakter besaßen. Die Autoren vermuteten, dass Endometriose,
obwohl als nicht-neoplastisch definiert, einige maligne Kriterien aufweist und
ihre Metastasierung einige Mechanismen mit der Mikrometastasierung von
Malignomen teilt (Zeitvogel et al., 2001). In einer weiteren Studie wurde
beobachtet, dass N-Cadherin in 70% der untersuchten Endometriome ähnlich
stark wie in Zystadenomen und Borderline-Tumoren des Ovars exprimiert war,
woraus sich ein gewisses neoplastisches Potential der Endometriome ableiten
lässt (Daraï et al., 1998).
In Bezug auf EpCAM (ebenfalls ein Marker für epitheliale Gewebe und
Tumoren) zeigten sich vergleichsweise ähnliche Ergebnisse wie für E-Cadherin.
Hier war die Expression in der MEL ähnlich hoch wie in Primärläsionen. In den
PSLN, unabhängig vom IELC-Status, war nur eine geringe bzw. keine
Expression detektierbar. EpCAM ist ein interzelluläres Adhäsionsmolekül in
epithelialen Geweben, scheint aber unter anderem auch in Signal-
transduktionswegen oder während der Differenzierung eine Rolle zu spielen,
sodass vermutet wird, dass EPCAM ein pleiotropes Gen darstellt. Es wirkt bei
hohem Expressionslevel stabilisierend auf die Adhäsion innerhalb eines
Zellverbandes. Zeitgleich sorgt es jedoch auch für vermehrtes Wachstum und
eine metastatische Tendenz des Malignoms (Patriarca et al., 2012).
Dass die epithelialen Marker E-Cadherin und EpCAM zwar in Endometriose-
zellen der Primärläsionen, aber nicht in den IELCs in den PSLN exprimiert
waren, könnte ein Hinweis darauf sein, dass bei Lymphknotenbefall durch
Endometriose ein Prozess abläuft, der einer EMT ähnelt. Der Verlust dieser
epithelialen Marker in den IELC resultiert in einer verminderten Zell-Zell-
Adhäsion und verleiht diesen Zellen die (mesenchymale) Fähigkeit, sich aus
dem Zellverband der Primärläsion herauszulösen, in das lymphatische System
75
einzuwandern und sich dort zu verbreiten. In der MEL jedoch, so deuten es
unsere Daten an, werden E-Cadherin und EpCAM in einem weiteren,
gegenläufigen Schritt (ähnlich der MET) wieder exprimiert. Die zuvor in den
Randsinus der Lymphknoten eingewanderten endometrioiden Zellen erlangen
wieder einen epithelialen Charakter, schließen sich zu einem intakten,
adhäsiven Zellverbund zusammen und tragen damit zur Ausbildung einer
intranodulären Endometrioseläsion bei.
Van den Berg et al. untersuchten, potentielle Biomarker für Endometriose-
läsionen, die intraoperativ zur Verbesserung der chirurgischen Therapie durch
bessere Visualisierung der makroskopisch schlecht sichtbaren Endometriose-
herde beitragen könnten. Dabei fanden sie, dass EpCAM in allen untersuchten
Endometrioseherden stark anfärbbar war, nicht jedoch das die Herde
umgebende Gewebe (van den Berg et al., 2013). Da EpCAM eine starke
Expression in der MEL zeigte, könnte also im Rahmen einer möglichen
intraoperativen immunhistochemischen Färbung von EpCAM auch selektiv eine
Lymphdrüse mit etablierter intranodulärer Endometrioseläsion angefärbt bzw.
visualisiert werden. So könnte das Rezidivrisiko, welches eine postoperativ in
situ verbliebene intranoduläre Läsion birgt, gesenkt werden. Allerdings legen
unsere Daten nahe, dass EpCAM von den IELCs in den pelvinen
Wächterlymphknoten nicht exprimiert wird. Ob und inwiefern diese IELC zu
einem Rezidivrisiko beitragen ist ungeklärt.
Veränderte Expression von CD44 Spleißvarianten
CD44 umfasst zwanzig Exons, wovon die ersten fünf und die letzten fünf
konstant exprimiert werden. Die Isoform CD44s stellt die kleinste Variante dar
und beinhaltet keines der zehn alternativ gespleißten variablen Exons 6-15 (v1
bis v10). Die resultierenden Proteinprodukte erfahren unterschiedliche post-
translationale Modifikationen (Glykosylierung) und weisen unterschiedliche
Funktionen auf und fungieren als Rezeptoren für Hyaluronsäure, Kollagen,
Laminin sowie Fibronectin und sind somit an der Ausbildung und Regulation
von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen beteiligt, aber auch an Migration,
Proliferation und Zellwachstum. In vielen Krebsarten sind sowohl CD44s als
auch diverse andere Isoformen stark exprimiert. Sie fördern beispielsweise
76
durch Wechselwirkungen mit P- und L-Selektinen die hämatogene Streuung
von Malignomen. CD44 wird (neben CD24 und EpCAM) als Oberflächenmarker
für sogenannte Krebs-Stammzellen (cancer stem cells, CSC) bei diversen
Karzinomen verwendet, darunter auch Mamma- und Ovarialkarzinom. Die CSC
haben die Fähigkeit zur Selbstregeneration bzw. zur Differenzierung und sind
mit dem Entstehen und der Progression von Tumoren assoziiert und auch mit
der Invasivität und Metastasierung von Malignomen (Goodison et al., 1999;
Heider et al., 2004; Jaggupilli und Elkord, 2012). CD44v6 ist in besonderem
Maße mit Invasivität bzw. dem metastatischen Potential eines bösartigen
Tumors assoziiert. Es wurden bereits einige klinische Versuche mit
radiomarkierten CD44v6-spezifischen Antikörpern durchgeführt, um eine
mögliche CD44v6-zielgerichtete Karzinomtherapie zu finden (Biamonti et al.,
2012; Heider et al., 2004). CD44 ist auch an der EMT beteiligt.
Überraschenderweise stellte sich dabei jedoch heraus, dass zur Ausführung
einer EMT ein Switch von den CD44v-Isoformen hin zur CD44-Standardisoform
notwendig ist (Biamonti et al., 2012).
Es existieren hinreichende Beweise dafür, dass differente CD44-Expressionen
in unterschiedlichen funktionellen Eigenschaften von eutopen Endometrium
sowie Endometrioseherden resultiert. So ist zum Beispiel CD44s im
endometrialen Epithel sowie Stroma während der sekretorischen Phase des
weiblichen Zyklus exprimiert. Während der proliferativen Phase hingegen findet
sich eine Expression von CD44s nur im stromalen Anteil des Endometrium
(Poncelet et al., 2002).
Bei malignen Veränderungen konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte
Expression von CD44 in ovariellen Karzinomzellen in vitro zu einer verstärkten
Adhärenz an peritoneales Gewebe führte und in einem kürzeren krankheits-
freien Überlebensintervall der Patienten resultierte (Cannistra et al., 1993;
Jones et al., 1995; Uhl-Steidl et al., 1995). In Bezug auf Vulvakarzinome im
Frühstadium wurde beobachtet, dass eine Expression speziell von CD44v6
(und CD44v3) mit einem kürzeren rezidivfreien Intervall bzw. einem kürzeren
Gesamtüberleben verbunden war. Auch im Fall des Endometriumkarzinoms
77
bestand eine Assoziation zwischen der CD44v6-Expression und einem
verkürzten Gesamtüberleben (Tempfer et al., 1998a; Tempfer et al., 1998b).
Hinsichtlich Endometriose wurde beschrieben, dass in endometrialen Epithel-
bzw. Stroma-Zellen betroffener Patientinnen eine vermehrte Expression von
CD44-Varianten vorlag, was mit einer erhöhten Adhäsion der Endometriose-
zellen an peritoneale Mesothelzellen in Verbindung gebracht wurde (Griffith et
al., 2010). Ähnliche Expressionsniveaus von CD44-Isoformen wurden auch in
Endometriomen, Borderline-Tumoren und Karzinomen des Ovars beobachtet.
Auch endometriale Adenokarzinome weisen im Vergleich zum eutopen
Endometrium eine Überexpression diverser CD44-Isoformen auf, wobei
CD44v6 jedoch keine spezifischen Expressionsunterschiede aufzuweisen
schien (Daraï et al., 1998; Leblanc et al., 2001). Hong et al. fanden zwar eine
Expression von CD44v6 in endometrialen Karzinomen vor, konnten aber keine
signifikante Korrelation mit einem Befall des lymphovaskulären Systems
feststellen (Hong et al., 2006). Allerdings wurde eine CD44-Varianten-
Expression in Lymphknotenmetastasen bei einer Reihe von bösartigen
Erkrankungen beschrieben. Darunter fand sich beispielsweise eine signifikant
hochregulierte CD44v6-Expression bei Lymphknotenmetastasen von
Magenkarzinomen (Okayama et al., 2009), Ösophaguskarzinomen (Shen et al.,
2012), Adenokarzinomen der Lunge (Afify et al., 2011) sowie bei
Blasenkarzinomen (Omran und Ata, 2012). In Bezug auf das Magenkarzinom
konnte CD44v6 hier sogar als ein Marker für Mikrometastasen identifiziert
werden (Ru et al., 2012). In Ovarial- oder Endometrium-Karzinomen jedoch
wurde dieses Phänomen nicht beobachtet (Schröder et al., 1999; Tokumo et al.,
1998).
In dieser Arbeit haben wir sowohl die Standard-Isoform CD44s als auch die
Isoform CD44v6, die das variable Exon 6 enthält, untersucht. Im Hinblick auf die
oben zitierte Literatur geben unsere Daten Anlass zu spekulieren, dass eine
Hochregulierung von CD44s und CD44v6 eine funktionelle Rolle beim Befall
des lymphatischen Systems bzw. der Ausbildung von endometrioiden
intranodulären Metastasen spielt.
78
Wird der Befall des lymphatischen Systems mit endometrioiden
Zellen durch CXCL12-induzierte Chemotaxis begünstigt?
Der Chemokinrezeptor CXCR4 und sein Ligand CXCL12 (SDF-1α) sind bei der
gerichteten Zellmigration (Chemotaxis) an diversen physiologischen und
pathophysiologischen Vorgängen beteiligt. So wird CXCR4 unter
physiologischen Bedingungen von diversen Zellen, wie beispielsweise
Endothelzellen oder phagozytären Zellen (Makrophagen), exprimiert. Aber auch
in diversen Karzinomarten, darunter auch das Ovarialkarzinom, wurde im
Gegensatz zum korrespondierenden Normalgewebe eine Expression von
CXCR4 beobachtet, die zu einer Chemotaxis bzw. Invasion der malignen Zellen
entlang eines CXCL12-Gradienten führt. Beim Mammakarzinom wurden
beispielsweise hohe CXCL12-Niveaus in axillären Lymphknoten vorgefunden.
Eine CXCR4-Überexpression in Karzinomzellen ist unter anderem mit einem
vermehrten Tumorwachstum, einer erhöhten Tumoraggressivität, einem
vermehrten Metastasierungsrisiko, einer schlechteren Prognose und einer
höheren Wahrscheinlichkeit für Rezidive assoziiert (Domanska et al., 2013; Kuil
et al., 2012).
CXCR4 wird auch im Endometrium von gesunden Frauen exprimiert, wobei das
CXCR4-Niveau während der sekretorischen Phase am niedrigsten ist
(Dominguez et al., 2003). Bisher existiert nur wenig Literatur über mögliche
Funktionen der CXCL12-CXCR4-Signalkaskade bei Endometriose. So zeigte
eine Untersuchung von Endometrioseherden, dass sich epitheliale Zellen
sowohl für CXCL12 als auch für CXCR4 positiv färbten. Zusätzlich gab es eine
Expression von CXCL12 in Stromazellen und im kapillären Endothel,
wohingegen nur eine geringe Expression von CXCR4 im Endothel vorlag
(Furuya et al., 2007). Ruiz und Kollegen fanden eine im Vergleich zum
Endometrium von gesunden Frauen signifikant erhöhte Menge von CXCR4
sowohl im Stroma als auch im Epithel von endometrioiden Läsionen (Ruiz et al.,
2010).
Unsere Ergebnisse stehen im Einklang mit diesen Daten, deuten aber darauf
hin, dass CXCR4 in IELC und in intranodulären Metastasen noch weiter
hochreguliert ist. Es gibt Hinweise, dass EMT-assoziierte Vorgänge über
79
Aktivierung der CXCL12-CXCR4-Achse die lymphatische Metastasierung
fördern. Hierbei lockt CXCL12, das zum einen von Endothelzellen des
lymphatischen Systems in den subkapsulären Sinus sezerniert wird und zum
anderen von lymphknotenständigen Makrophagen produziert wird, CXCR4-
exprimierende Tumorzellen gezielt an (Ji, 2012).
Tragen Makrophagen zur Ausbreitung von Endometriose bei?
Endometriose wird als eine inflammatorische Erkrankung angesehen (Burney
und Giudice, 2012). Konno et al. beobachteten in diesem Zusammenhang eine
erhöhte Expression von CXCR4 in ovariellen Endometrioseherden im Vergleich
zu gesundem ovariellen Gewebe (Konno et al., 2003). Das könnte durch eine in
Endometrioseherden beobachtete signifikant erhöhte Menge von Makrophagen
begründet sein (Khan et al., 2004; Tran et al., 2009).
Unsere Daten demonstrieren eine erhöhte Expression von CD68 in den IELC-
positiven PSLN und in der intranodulären Metastase, was auf eine erhöhte
Anzahl von Makrophagen hindeutet, da CD68 ein Marker für Makrophagen ist
(Ashley et al., 2011), auch für sogenannte Tumor-assoziierte Makrophagen
(TAM). Klinische Studien belegen, dass das Vorliegen von TAM bei diversen
Karzinomen (unter anderem der Brust-, der Zervix- und des Ovars) mit einer
schlechten Prognose vergesellschaftet ist. TAM fördern die Tumorprogression
und die Metastasierung, indem sie die Angiogenese bzw. Lymphangiogenese
steigern und die Antitumor-Immunität hemmen (Ji, 2012; Pollard, 2004; Tang,
2013). Ein möglicher Makrophagen-IELC-Crosstalk könnte daher ebenfalls eine
Rolle beim Befall des lymphatischen Systems durch Endometriose spielen.
Verlust der SCUBE2-Expression in der MEL?
Der von uns beobachtete Verlust der SCUBE2-Expression in der intranodulären
endometrioiden Läsion könnte zwar ein Produkt des Zufalls sein, was aber eher
unwahrscheinlich ist, da jeweils drei unabhängige Proben bzw. Analysen
durchgeführt wurden und SCUBE2 in zwei weiteren Proben (EL und IELC-
positiver PSLN) der Patientin, aus der die MEL-Probe stammte, exprimiert war.
Das sogenannte Signal-peptide-CUB-epidermal growth factor-like domain-
80
containing protein 2 (SCUBE2) ist in vielen Geweben, darunter auch gesundes
Brustgewebe, exprimiert. Eine verringerte Expression dieses Gens in Tumoren
der Mamma ist mit einer schlechteren Prognose assoziiert. Der antiproliferative
Effekt von SCUBE2 ist wohl mit einer protektiven Wirkung verknüpft (Cheng et
al., 2009; Yang et al., 2002). Nähere Daten zu SCUBE2 im Zusammenhang mit
Endometriose existieren bisher nicht, aber sein Verlust könnte einen weiteren
Schritt in der Transformation der Endometriose in Richtung Malignität
darstellen. Zur Erhärtung dieser Hypothese müssten allerdings noch weitere
Proben von MELs untersucht werden.
Betrachtungen zur Expression weiterer Gene
MMP11 (Stromelysin 3) gehört zur Familie der Matrix-Metalloproteinasen
(MMP), deren Mitglieder vor allem bei der Zersetzung der extrazellulären Matrix
bzw. beim Gewebe-Remodelling beteiligt sind. Verschiedene MMP, darunter
auch MMP11, sind auch in den menstruellen Abbruch involviert und weisen
eine entsprechende zyklusabhängige Genexpression auf. Eine Reihe von
Experimenten offenbarte, dass eine Östradiol-Exposition zu gesteigerter MMP-
Expression führt, was wiederum in einem vermehrten Wachstum resultiert. Eine
Rolle bei der Entstehung und Verbreitung von Endometriose liegt somit nahe.
Progesterone hingegen hemmen die MMP-Expression (Osteen et al., 1999).
MMP11 ist in normalen adulten Geweben nur gering exprimiert. In vielen
humanen Karzinomen jedoch ist es zum Teil stark exprimiert, und ist mit
erhöhter Tumorprogression und schlechter Prognose korreliert (Matziari et al.,
2007; Wei und Shi, 2005). Interessanterweise wurde auch gezeigt, dass
MMP11 die unter MMPs einzigartige Eigenschaft besitzt, antiapoptotisch zu
wirken (Matziari et al., 2007).
Uzan et al. konnten demonstrieren, dass die MMP11-Expression innerhalb des
Endometrium von Frauen ohne Endometriose und Endometriosepatientinnen
ähnlich ist. Interessanterweise zeigte sich jedoch, dass die Expressionsniveaus
von MMP11 in den unterschiedlich lokalisierten Endometrioseherden
unterschiedlich hoch waren. So war das Expressionsniveau von MMP11 in
kolorektalen Endometrioseimplantationen am höchsten. Im Vergleich zwischen
peritonealen und ovariellen Herden stellte sich die Genexpression in den
81
peritonealen Läsionen als höher heraus (Uzan et al., 2004). Unsere Daten
zeigen, dass MMP11 in Primärläsionen zwar am höchsten exprimiert war, das
Expressionsniveau in der MEL jedoch im Vergleich zu den PSLN ebenfalls
relativ hoch war. Im Vergleich zwischen den PSLN-Probengruppen zeigte sich,
dass IELC-positive PSLN ein höheres Expressionsniveau aufwiesen. Daraus
kann man schließen, dass MMP11 unabhängig von der Pathogenese
(EMT/MET) einer MEL durchgängig exprimiert wird.
Die Mitglieder der BCL2-Familie sind Regulatoren der Apoptose mit sowohl pro-
als auch antiapoptotischer Wirkung. Die antiapoptotisch wirkenden Proteine der
BCL2- Familie, wozu auch Bcl-2 zählt, gelten daher als Proto-Onkogene. Sie
fördern nicht nur das Tumorwachstum, sondern auch die Resistenz gegenüber
Chemotherapeutika (Nasu et al., 2011). Bcl-2 gilt als eines der am besten
erforschten Apoptose-assoziierten Proteine. Es blockiert die Apoptose, in dem
es die Funktion der mitochondrialen Membran reguliert ohne die
Zellproliferation zu fördern. Dabei ist die Aktivität von Bcl-2 abhängig von der
Interaktion mit dem antagonistisch-wirkenden Protein Bax, das ebenfalls zur
BCL2-Familie gehört. Bei Überexpression von Bcl-2 wird der Zelltod reprimiert.
So ist die Empfänglichkeit einer Zelle gegenüber der Apoptose durch das
Konzentrationsverhältnis zwischen Bcl-2 und Bax bestimmt. In Bezug auf die
Bcl-2-Expression in endometrioiden Läsionen gibt es diverse Daten, die sich je
nach Lokalisation der Herde jedoch unterscheiden. So war in ovariellen
Endometrioseherden keine Bcl-2-Expression nachweisbar, wohingegen sich
beispielsweise in peritonealen Endometrioseläsionen eine signifikant
gesteigerte Genexpression von Bcl-2 sowohl in epithelialen als auch stromalen
Anteilen zeigte. Weitere Studien zeigten, dass die Bcl-2-Expression in
zystischen Endometrioseimplantaten geringer war als in nicht-zystischen
Endometrioseläsionen (Nasu et al., 2011). Unsere Daten zeigen einen Trend
erhöhter BCL2-Expression in IELC-positiven PSLN, was darauf hindeuten
könnte, dass die Population endometrioider Zellen, die das lymphatische
System zu infiltrieren vermögen, über eine erhöhte Apoptose-Resistenz
verfügen. Weitere Untersuchungen in diese Richtung sollten durchgeführt
werden.
82
Anwendbarkeit eines Oncotype DX-ähnlichen Recurrence-Scores
bei Endometriose
Das in der hier beschriebenen Studie verwendete Genpanel überlappt zu einem
großen Teil mit jenem des Oncotype DX Assays (Paik et al., 2004). Mit
Ausnahme von zwei Genen zur Bestimmung des HER2-Status (HER2, GRB7)
und dass hier anstelle von fünf (ACTB, GAPDH, PRLPO, GUS und TFRC) nur
zwei Referenzgene (ACTB und GAPDH) bestimmt wurden, sind alle Gene des
Oncotype DX Assays auch in unserer Genauswahl enthalten. Das und die
Beobachtung, dass Endometriose und das Mammakarzinom eine Reihe von
Charakteristika teilen, wie beispielsweise die Abhängigkeit von Steroid-
hormonen, bewog uns, die mögliche Aussagekraft eines analog zum
Recurrence-Score berechneten Wertes im Rahmen der Endometriose zu
erkunden.
Für die Recurrence-Score-Bestimmung wird in dieser Arbeit für die HER2-
Gruppe daher der im Berechnungsalgorithmus vorgesehene Default-Wert (8)
angenommen (Paik et al., 2004). Eine Bestimmung des HER2-Status bei der
Endometriose scheint auch nicht allzu relevant. So fanden beispielsweise Uzan
et al. nur in fünf von zwanzig kolorektalen Endometrioseherde im stromalen
Anteil eine schwache Anfärbung für HER2. In allen anderen untersuchten
Endometrioseläsionen (ovariell, peritoneal und kolorektal) war keine HER2-
Expression nachweisbar (Uzan et al., 2009).
Die für unsere Proben berechneten Recurrence-Scores unter Anwendung der
Oncotype DX-Klassifikation zeigten, dass Lymphknotengewebe grundsätzlich
Werte im High-Risk Bereich ergeben, während Endometrioseläsionen in die
Low-Risk Klasse fallen. Insofern ist die Übertragung des Oncotype DX Tests
auf Endometriose nicht sinnvoll. Auch gab es keinen Unterschied zwischen
IELC-positiven und IELC-negativen PSLN. Interessanterweise ergab sich
jedoch für den Lymphknoten mit MEL trotz der analysebedingten „Verdünnung“
durch umliegende Lymphozyten ein Score, der dem der Primärläsionen
entsprach.
83
Schlussbemerkungen
In einer vorherigen Studie, bei der in einem Tiermodell (Ratte) Endometrium
autolog von der Gebärmutter in die Ileocoecalregion transplantiert wurde,
gelang es zwar, Darm-Endometriose zu induzieren, jedoch konnte
anschließend keinerlei Beteiligung regionaler Lymphknoten (im Sinne einer
ausgebildeten MEL oder dem Vorhandensein von IELC in den Randsinen)
nachgewiesen werden (Gong et al., 2011). Im Hinblick auf die oben diskutierten
molekularen Vorgänge könnte dies durch das Fehlen genau dieser molekularen
Schritte begründet sein. Eine Herauslösung der endometrioiden Zellen aus der
Primärläsion und die Invasion in die PSLN sind nur nach Herunterregulierung
von EpCAM und E-Cadherin und Heraufregulierung von CXCR4 und CD44-
Isoformen möglich. Die Transplantation von eutopen Endometrium, das diese
molekularen Alterationen nicht durchlaufen hat, reicht also nicht aus, auch
einen Befall des lymphatischen Systems zu induzieren.
Zusammenfassend kann man aus den in der hier beschriebenen Arbeit
erzielten Daten schließen, dass der Befall von PSLN durch Endometriose von
einer abweichenden Expression einer Reihe von Genen, darunter EPCAM,
CDH1, CXCR4 und CD44, begleitet ist.
Diese neu gewonnenen Einblicke in die molekulare Ätiologie der Endometriose
könnten sowohl für die Diagnostik, die Klassifizierung des individuellen
Patientenrisikos, als auch die Entwicklung neuer zielgerichteter Therapien
relevant sein.
84
LITERATURVERZEICHNIS
Abrao, M.S., Podgaec, S., Dias, J.A., Averbach, M., Garry, R., Ferraz Silva,
L.F., und Carvalho, F.M. (2006). Deeply infiltrating endometriosis affecting the
rectum and lymph nodes. Fertil Steril. 86, 543-7
Afify, A.M., Tate, S., Durbin-Johnson, B., Rocke, D.M., und Konia, T. (2011).
Expression of CD44s and CD44v6 in lung cancer and their correlation with
prognostic factors. Int J Biol Markers. 26, 50-7
American Society for Reproductive Medicine (1997). Revised American Society
for Reproductive Medicine classification of endometriosis: 1996. Fertil Steril. 67,
817-21
Ashley, J.W., Shi, Z., Zhao, H., Li, X., Kesterson, R.A., und Feng, X. (2011).
Genetic ablation of CD68 results in mice with increased bone and dysfunctional
osteoclasts. PLoS One. 6, e25838
Ayhan, A., Celik, H., und Dursun, P. (2008). Lymphatic mapping and sentinel
node biopsy in gynecological cancers: a critical review of the literature. World J
Surg Oncol. 6, 53
Ballouk, F., Ross, J.S., und Wolf, B.C. (1994). Ovarian endometriotic cysts. An
analysis of cytologic atypia and DNA ploidy patterns. Am J Clin Pathol. 102,
415-9
Becker, K.F., Rosivatz, E., Blechschmidt, K., Kremmer, E., Sarbia, M., und
Höfler, H. (2007). Analysis of the E-cadherin repressor Snail in primary human
cancers. Cells Tissues Organs. 185, 204-12
Biamonti, G., Bonomi, S., Gallo, S., und Ghigna, C. (2012). Making alternative
splicing decisions during epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). Cell Mol
Life Sci. 69, 2515-26
Bloski, T., und Pierson, R. (2008). Endometriosis and Chronic Pelvic Pain:
Unraveling the Mystery Behind this Complex Condition. Nurs Womens Health.
12, 382-95
85
Burney, R.O., und Giudice, L.C. (2012). Pathogenesis and pathophysiology of
endometriosis. Fertil Steril. 98, 511-9
Cannistra, S.A., Kansas, G.S., Niloff, J., DeFranzo, B., Kim, Y., und
Ottensmeier, C. (1993). Binding of ovarian cancer cells to peritoneal
mesothelium in vitro is partly mediated by CD44H. Cancer Res. 53, 3830-8
Carmena, M., und Earnshaw, W.C. (2003). The cellular geography of aurora
kinases. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, 842-54
Cheng, C.J., Lin, Y.C., Tsai, M.T., Chen, C.S., Hsieh, M.C., Chen, C.L., und
Yang, R.B. (2009). SCUBE2 suppresses breast tumor cell proliferation and
confers a favorable prognosis in invasive breast cancer. Cancer Res. 69, 3634-
41
Coccia, M.E., und Rizzello, F. (2011). Ultrasonographic staging: a new staging
system for deep endometriosis. Ann N Y Acad Sci. 1221, 61-9
Cramer, D.W., und Missmer, S.A. (2002). The epidemiology of endometriosis.
Ann N Y Acad Sci. 955, 11-22; Diskussion 34-6, 396-406
Cronin, M., Sangli, C., Liu, M.L., Pho, M., Dutta, D., Nguyen, A., Jeong, J., Wu,
J., Langone, K.C., und Watson, D. (2007). Analytical validation of the Oncotype
DX genomic diagnostic test for recurrence prognosis and therapeutic response
prediction in node-negative, estrogen receptor-positive breast cancer. Clin
Chem. 53, 1084-91
Daraï, E., Leblanc, M., Walker-Combrouze, F., Bringuier, A.F., Madelenat, P.,
und Scoazec, J.Y. (1998). Expression of cadherins and CD44 isoforms in
ovarian endometrial cysts. Hum Reprod. 13, 1346-52
de Azambuja, E., Cardoso, F., de Castro, G., Colozza, M., Mano, M.S.,
Durbecq, V., Sotiriou, C., Larsimont, D., Piccart-Gebhart, M.J., und Paesmans,
M. (2007). Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of
published studies involving 12,155 patients. Br J Cancer. 96, 1504-13
86
De Craene, B., und Berx, G. (2013). Regulatory networks defining EMT during
cancer initiation and progression. Nat Rev Cancer. 13, 97-110
Dickinson, R.E., und Duncan, W.C. (2010). The SLIT-ROBO pathway: a
regulator of cell function with implications for the reproductive system.
Reproduction. 139, 697-704
Domanska, U.M., Kruizinga, R.C., Nagengast, W.B., Timmer-Bosscha, H., Huls,
G., de Vries, E.G., und Walenkamp, A.M. (2013). A review on CXCR4/CXCL12
axis in oncology: no place to hide. Eur J Cancer. 49, 219-30
Dominguez, F., Galan, A., Martin, J.J., Remohi, J., Pellicer, A., und Simón, C.
(2003). Hormonal and embryonic regulation of chemokine receptors CXCR1,
CXCR4, CCR5 and CCR2B in the human endometrium and the human
blastocyst. Mol Hum Reprod. 9, 189-98
Farquhar, C. (2007). Endometriosis. BMJ. 334, 249-53
Farquhar, C.M. (2000). Extracts from the "clinical evidence". Endometriosis.
BMJ. 320, 1449-52
Farragher, S.M., Tanney, A., Kennedy, R.D., und Paul Harkin, D. (2008). RNA
expression analysis from formalin fixed paraffin embedded tissues. Histochem
Cell Biol. 130, 435-45
Ferrero, S., Gillott, D.J., Venturini, P.L., und Remorgida, V. (2011). Use of
aromatase inhibitors to treat endometriosis-related pain symptoms: a systematic
review. Reprod Biol Endocrinol. 9, 89
Furuya, M., Suyama, T., Usui, H., Kasuya, Y., Nishiyama, M., Tanaka, N.,
Ishiwata, I., Nagai, Y., Shozu, M., und Kimura, S. (2007). Up-regulation of CXC
chemokines and their receptors: implications for proinflammatory
microenvironments of ovarian carcinomas and endometriosis. Hum Pathol. 38,
1676-87
Gaetje, R., Kotzian, S., Herrmann, G., Baumann, R., und Starzinski-Powitz, A.
(1995). Invasiveness of endometriotic cells in vitro. Lancet. 346, 1463-4
87
Gaetje, R., Kotzian, S., Herrmann, G., Baumann, R., und Starzinski-Powitz, A.
(1997). Nonmalignant epithelial cells, potentially invasive in human
endometriosis, lack the tumor suppressor molecule E-cadherin. Am J Pathol.
150, 461-7
Gao, D., Vahdat, L.T., Wong, S., Chang, J.C., und Mittal, V. (2012).
Microenvironmental regulation of epithelial-mesenchymal transitions in cancer.
Cancer Res. 72, 4883-9
Genss, E.-M. (2009). Endometriose. Klinikmanual Gynäkologie und Geburts-
hilfe. Springer Verlag; Berlin, Heidelberg. 85-88
Giudice, L.C., und Kao, L.C. (2004). Endometriosis. Lancet. 364, 1789-99
Gong, Y., Hong, L., Zheng, C.C., Tong, X.W., und Tempfer, C.B. (2011).
Endometriosis and regional lymph node involvement in a rat model. Wien Klin
Wochenschr. 123, 432-5
Goodison, S., Urquidi, V., und Tarin, D. (1999). CD44 cell adhesion molecules.
Mol Pathol. 52, 189-96
Griffith, J.S., Liu, Y.G., Tekmal, R.R., Binkley, P.A., Holden, A.E., und
Schenken, R.S. (2010). Menstrual endometrial cells from women with
endometriosis demonstrate increased adherence to peritoneal cells and
increased expression of CD44 splice variants. Fertil Steril. 93, 1745-9
Guo, S.W. (2006). The association of endometriosis risk and genetic
polymorphisms involving dioxin detoxification enzymes: a systematic review.
Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 124, 134-43
Haas, D., Chvatal, R., Reichert, B., Renner, S., Shebl, O., Binder, H., Wurm, P.,
und Oppelt, P. (2012). Endometriosis: a premenopausal disease? Age pattern
in 42,079 patients with endometriosis. Arch Gynecol Obstet. 286, 667-70
Hadfield, R.M., Mardon, H.J., Barlow, D.H., und Kennedy, S.H. (1997).
Endometriosis in monozygotic twins. Fertil Steril. 68, 941-2
88
Halban, J. (1925). Hysteroadenosis metastatica Die lymphogene Genese der
sog. Adenofibromatosis heterotopica. Archiv für Gynäkologie. 124, 457-482
Halis, G., Mechsner, S., und Ebert, A.D. (2010). Diagnose und Therapie der
tief-infiltrierenden Endometriose. Deutsches Ärzteblatt. 107, 446-456
Halme, J., Hammond, M.G., Hulka, J.F., Raj, S.G., und Talbert, L.M. (1984).
Retrograde menstruation in healthy women and in patients with endometriosis.
Obstet Gynecol. 64, 151-4
Heider, K.H., Kuthan, H., Stehle, G., und Munzert, G. (2004). CD44v6: a target
for antibody-based cancer therapy. Cancer Immunol Immunother. 53, 567-79
Hong, S.C., Song, J.Y., Lee, J.K., Lee, N.W., Kim, S.H., Yeom, B.W., und Lee,
K.W. (2006). Significance of CD44v6 expression in gynecologic malignancies. J
Obstet Gynaecol Res. 32, 379-86
Hsu, A.L., Khachikyan, I., und Stratton, P. (2010). Invasive and noninvasive
methods for the diagnosis of endometriosis. Clin Obstet Gynecol. 53, 413-9
Insabato, L., und Pettinato, G. (1996). Endometriosis of the bowel with lymph
node involvement. A report of three cases and review of the literature. Pathol
Res Pract. 192, 957-61; Diskussion 962
Jaggupilli, A., und Elkord, E. (2012). Significance of CD44 and CD24 as Cancer
Stem Cell Markers: An Enduring Ambiguity. Clin Dev Immunol. 2012, 708036
Javert, C.T. (1949). Pathogenesis of endometriosis based on endometrial
homeoplasia, direct extension, exfoliation and implantation, lymphatic and
hematogenous metastasis, including five case reports of endometrial tissue in
pelvic lymph nodes. Cancer. 2, 399-410
Ji, R.C. (2012). Macrophages are important mediators of either tumor- or
inflammation-induced lymphangiogenesis. Cell Mol Life Sci. 69, 897-914
Jimbo, H., Hitomi, Y., Yoshikawa, H., Yano, T., Momoeda, M., Sakamoto, A.,
Tsutsumi, O., Taketani, Y., und Esumi, H. (1997). Evidence for monoclonal
89
expansion of epithelial cells in ovarian endometrial cysts. Am J Pathol. 150,
1173-8
Jones, L.M., Gardner, M.J., Catterall, J.B., und Turner, G.A. (1995). Hyaluronic
acid secreted by mesothelial cells: a natural barrier to ovarian cancer cell
adhesion. Clin Exp Metastasis. 13, 373-80
Kalluri, R., und Weinberg, R.A. (2009). The basics of epithelial-mesenchymal
transition. J Clin Invest. 119, 1420-8
Keckstein, J., Hucke, J., und Ulrich, U. (2007). Operative Therapie der
Endometriose. Der Gynäkologe. 40, 536-546
Keichel, S., Barcena de Arellano, M.L., Reichelt, U., Riedlinger, W.F.,
Schneider, A., Köhler, C., und Mechsner, S. (2011). Lymphangiogenesis in
deep infiltrating endometriosis. Hum Reprod. 26, 2713-20
Khan, K.N., Masuzaki, H., Fujishita, A., Kitajima, M., Sekine, I., und Ishimaru, T.
(2004). Differential macrophage infiltration in early and advanced endometriosis
and adjacent peritoneum. Fertil Steril. 81, 652-61
Kibbe, W.A. (2007). OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator.
Nucleic Acids Res. 35, W43-6
Kinoshita, S., Adachi, W., Sotozono, C., Nishida, K., Yokoi, N., Quantock, A.J.,
und Okubo, K. (2001). Characteristics of the human ocular surface epithelium.
Prog Retin Eye Res. 20, 639-73
Konno, R., Yamada-Okabe, H., Fujiwara, H., Uchiide, I., Shibahara, H.,
Ohwada, M., Ihara, T., Sugamata, M., und Suzuki, M. (2003). Role of
immunoreactions and mast cells in pathogenesis of human endometriosis--
morphologic study and gene expression analysis. Hum Cell. 16, 141-9
Krafft, A.E., Duncan, B.W., Bijwaard, K.E., Taubenberger, J.K., und Lichy, J.H.
(1997). Optimization of the Isolation and Amplification of RNA From Formalin-
fixed, Paraffin-embedded Tissue: The Armed Forces Institute of Pathology
Experience and Literature Review. Mol Diagn. 2, 217-230
90
Kuil, J., Buckle, T., und van Leeuwen, F.W. (2012). Imaging agents for the
chemokine receptor 4 (CXCR4). Chem Soc Rev. 41, 5239-61
Kurose, K., Sugiyama, E., und Saito, Y. (2012). Population differences in major
functional polymorphisms of pharmacokinetics/pharmacodynamics-related
genes in Eastern Asians and Europeans: implications in the clinical trials for
novel drug development. Drug Metab Pharmacokinet. 27, 9-54
Lange, P. (1955). Endometriosis-like formations in the lymph nodes of the pelvic
wall. Acta Obstet Gynecol Scand. 34, 111-9
Leblanc, M., Poncelet, C., Soriano, D., Walker-Combrouze, F., Madelenat, P.,
Scoazec, J.Y., und Darai, E. (2001). Alteration of CD44 and cadherins
expression: possible association with augmented aggressiveness and
invasiveness of endometrial carcinoma. Virchows Arch. 438, 78-85
Legg, J.A., Herbert, J.M., Clissold, P., und Bicknell, R. (2008). Slits and
Roundabouts in cancer, tumour angiogenesis and endothelial cell migration.
Angiogenesis. 11, 13-21
Leyendecker, G., Wildt, L., und Mall, G. (2009). The pathophysiology of
endometriosis and adenomyosis: tissue injury and repair. Arch Gynecol Obstet.
280, 529-38
Lin, Y.C., Chen, C.C., Cheng, C.J., und Yang, R.B. (2011). Domain and
functional analysis of a novel breast tumor suppressor protein, SCUBE2. J Biol
Chem. 286, 27039-47
Lorente Poyatos, R., Palacios Pérez, A., Bravo Bravo, F., López Caballero, F.J.,
Bouhmidi, A., Huertas Nadal, C., und Ruiz Escolano, E. (2003). Rectosigmoid
endometriosis with lymph node involvement. Gastroenterol Hepatol. 26, 23-5
Lyons, A.J., und Jones, J. (2007). Cell adhesion molecules, the extracellular
matrix and oral squamous carcinoma. Int J Oral Maxillofac Surg. 36, 671-9
Mahmood, T.A., und Templeton, A. (1990). Pathophysiology of mild
endometriosis: review of literature. Hum Reprod. 5, 765-84
91
Marnitz, S., Köhler, C., Bongardt, S., Braig, U., Hertel, H., Schneider, A., und ,
G.A.o.G.O. (2006). Topographic distribution of sentinel lymph nodes in patients
with cervical cancer. Gynecol Oncol. 103, 35-44
Martinez, I., und Dimaio, D. (2011). B-Myb, cancer, senescence, and
microRNAs. Cancer Res. 71, 5370-3
Matsuzaki, S., und Darcha, C. (2012). Epithelial to mesenchymal transition-like
and mesenchymal to epithelial transition-like processes might be involved in the
pathogenesis of pelvic endometriosis. Hum Reprod. 27, 712-21
Matziari, M., Dive, V., und Yiotakis, A. (2007). Matrix metalloproteinase 11
(MMP-11; stromelysin-3) and synthetic inhibitors. Med Res Rev. 27, 528-52
Mechsner, S., Weichbrodt, M., Riedlinger, W.F., Bartley, J., Kaufmann, A.M.,
Schneider, A., und Köhler, C. (2008). Estrogen and progestogen receptor
positive endometriotic lesions and disseminated cells in pelvic sentinel lymph
nodes of patients with deep infiltrating rectovaginal endometriosis: a pilot study.
Hum Reprod. 23, 2202-9
Mechsner, S., Weichbrodt, M., Riedlinger, W.F., Kaufmann, A.M., Schneider,
A., und Köhler, C. (2010). Immunohistochemical evaluation of endometriotic
lesions and disseminated endometriosis-like cells in incidental lymph nodes of
patients with endometriosis. Fertil Steril. 94, 457-63
Melin, A., Sparén, P., und Bergqvist, A. (2007). The risk of cancer and the role
of parity among women with endometriosis. Hum Reprod. 22, 3021-6
Meyer, R. (1919). Über den Stand der Frage der Adenomyositis, Adenomyome
im Allgemeinen und insbesondere über Adenomyositis seroepithelialis und
Adenomyositis sarcomatosa. Zentralbl Gynäkol. 36, 745-750
Moen, M.H. (1994). Endometriosis in monozygotic twins. Acta Obstet Gynecol
Scand. 73, 59-62
Mulac-Jericevic, B., und Conneely, O.M. (2004). Reproductive tissue selective
actions of progesterone receptors. Reproduction. 128, 139-46
92
Munksgaard, P.S., und Blaakaer, J. (2012). The association between
endometriosis and ovarian cancer: a review of histological, genetic and
molecular alterations. Gynecol Oncol. 124, 164-9
Muyldermans, M., Cornillie, F.J., und Koninckx, P.R. (1995). CA125 and
endometriosis. Hum Reprod Update. 1, 173-87
Namkung, J., Kim, S.J., Kim, J.H., Kim, J., und Hur, S.Y. (2011). Rectal
endometriosis with invasion into lymph nodes. J Obstet Gynaecol Res. 37,
1117-21
Nasu, K., Nishida, M., Kawano, Y., Tsuno, A., Abe, W., Yuge, A., Takai, N., und
Narahara, H. (2011). Aberrant expression of apoptosis-related molecules in
endometriosis: a possible mechanism underlying the pathogenesis of
endometriosis. Reprod Sci. 18, 206-18
Natalwala, A., Spychal, R., und Tselepis, C. (2008). Epithelial-mesenchymal
transition mediated tumourigenesis in the gastrointestinal tract. World J
Gastroenterol. 14, 3792-7
Neukomm, C., und Mueller, M.D. (2007). Neues zur Pathophysiologie der
Endometriose. Gynäkologisch-geburtshilfliche Rundschau. 47, 113-117
Nezhat, F., Cohen, C., Rahaman, J., Gretz, H., Cole, P., und Kalir, T. (2002).
Comparative immunohistochemical studies of bcl-2 and p53 proteins in benign
and malignant ovarian endometriotic cysts. Cancer. 94, 2935-40
Nisolle, M., und Donnez, J. (1997). Peritoneal endometriosis, ovarian
endometriosis, and adenomyotic nodules of the rectovaginal septum are three
different entities. Fertil Steril. 68, 585-96
Noël, J.C., Chapron, C., Fayt, I., und Anaf, V. (2008). Lymph node involvement
and lymphovascular invasion in deep infiltrating rectosigmoid endometriosis.
Fertil Steril. 89, 1069-72
Nomura, T., und Katunuma, N. (2005). Involvement of cathepsins in the
invasion, metastasis and proliferation of cancer cells. J Med Invest. 52, 1-9
93
Oehmke, F., Deisting, C., und Tinneberg, H.-R. (2007). Konservative Therapie
der Endometriose. Gynäkologisch-geburtshilfliche Rundschau. 47, 118 - 123
Okayama, H., Kumamoto, K., Saitou, K., Hayase, S., Kofunato, Y., Sato, Y.,
Miyamoto, K., Nakamura, I., Ohki, S., Sekikawa, K., und Takenoshita, S.
(2009). CD44v6, MMP-7 and nuclear Cdx2 are significant biomarkers for
prediction of lymph node metastasis in primary gastric cancer. Oncol Rep. 22,
745-55
Olive, D.L., und Schwartz, L.B. (1993). Endometriosis. N Engl J Med. 328,
1759-69
Omran, O.M., und Ata, H.S. (2012). CD44s and CD44v6 in diagnosis and
prognosis of human bladder cancer. Ultrastruct Pathol. 36, 145-52
Osteen, K.G., Keller, N.R., Feltus, F.A., und Melner, M.H. (1999). Paracrine
regulation of matrix metalloproteinase expression in the normal human
endometrium. Gynecol Obstet Invest. 48 (Suppl 1), 2-13
Paik, S., Shak, S., Tang, G., Kim, C., Baker, J., Cronin, M., Baehner, F.L.,
Walker, M.G., Watson, D., Park, T., Hiller, W., Fisher, E.R., Wickerham, D.L.,
Bryant, J., und Wolmark, N. (2004). A multigene assay to predict recurrence of
tamoxifen-treated, node-negative breast cancer. N Engl J Med. 351, 2817-26
Patriarca, C., Macchi, R.M., Marschner, A.K., und Mellstedt, H. (2012).
Epithelial cell adhesion molecule expression (CD326) in cancer: a short review.
Cancer Treat Rev. 38, 68-75
Pino, M., Galleguillos, C., Torres, M., Sovino, H., Fuentes, A., Boric, M.A., und
Johnson, M.C. (2009). Association between MMP1 and MMP9 activities and
ICAM1 cleavage induced by tumor necrosis factor in stromal cell cultures from
eutopic endometria of women with endometriosis. Reproduction. 138, 837-47
Pollard, J.W. (2004). Tumour-educated macrophages promote tumour
progression and metastasis. Nat Rev Cancer. 4, 71-8
94
Poncelet, C., Leblanc, M., Walker-Combrouze, F., Soriano, D., Feldmann, G.,
Madelenat, P., Scoazec, J.Y., und Daraï, E. (2002). Expression of cadherins
and CD44 isoforms in human endometrium and peritoneal endometriosis. Acta
Obstet Gynecol Scand. 81, 195-203
Pritts, E.A., und Taylor, R.N. (2003). An evidence-based evaluation of
endometriosis-associated infertility. Endocrinol Metab Clin North Am. 32, 653-
67
Puzianowska-Kuźnicka, M. (2012). ESR1 in myocardial infarction. Clin Chim
Acta. 413, 81-7
Regidor-Brandau, P.A., Pfaffenbach, B., Metz, K.A., und Schindler, A.E. (1994).
Endometriosis in retroperitoneal lymph nodes. Geburtshilfe Frauenheilkd. 54,
372-4
Reichelt, U., Keichel, S., Barcena de Arellano, M.L., Chiantera, V., Schneider,
A., und Mechsner, S. (2012). High lymph vessel density and expression of
lymphatic growth factors in peritoneal endometriosis. Reprod Sci. 19, 876-82
Renner, S.P., Oppelt, P., Binder, H., und Beckmann, M.W. (2006).
Endometriose. Geburtshilfe und Frauenheilkunde. 66, R61-R88
Ries, E. (1897). Eine neue Operationsmethode des Uteruscarcinoms
Ru, Y., Zhang, L., Chen, Q., Gao, S.G., Wang, G.P., Qu, Z.F., Shan, T.Y., Qian,
N., und Feng, X.S. (2012). Detection and clinical significance of lymph node
micrometastasis in gastric cardia adenocarcinoma. J Int Med Res. 40, 293-9
Ruiz, A., Salvo, V.A., Ruiz, L.A., Báez, P., García, M., und Flores, I. (2010).
Basal and steroid hormone-regulated expression of CXCR4 in human
endometrium and endometriosis. Reprod Sci. 17, 894-903
Sambrook, und Russel (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold
Spring Harbor Laboratory Press
95
Sampson, J.A. (1927). Peritoneal endometriosis due to menstrual dissemination
of endometrial tissue into the peritoneal cavity. Am J Obstet Gynecol. 14, 422-
469
Schröder, W., Rudlowski, C., Biesterfeld, S., Knobloch, C., Hauptmann, S., und
Rath, W. (1999). Expression of CD44(v5-10) splicing variants in primary ovarian
cancer and lymph node metastases. Anticancer Res. 19, 3901-6
Schweppe, K.W. (2003). Endometriose – Eine Erkrankung ohne Lobby.
Zentralbl Gynakol. 125, 233
Schweppe, K.W. (2011). Endometriose - Entstehung, Diagnostik
Behandlungsmöglichkeiten und Probleme in Klinik und Praxis. Journal für
Reproduktionsmedizin und Endokrinologie. 8, 180-194
Shen, W.D., Ji, Y., Liu, P.F., Xiang, B., Chen, G.Q., Huang, B., und Wu, S.
(2012). Correlation of E-cadherin and CD44v6 expression with clinical
pathology in esophageal carcinoma. Mol Med Rep. 5, 817-21
Simpson, J.L., Elias, S., Malinak, L.R., und Buttram, V.C., Jr. (1980). Heritable
aspects of endometriosis. I. Genetic studies. Am J Obstet Gynecol. 137, 327-31
Singhal, S., Vachani, A., Antin-Ozerkis, D., Kaiser, L.R., und Albelda, S.M.
(2005). Prognostic implications of cell cycle, apoptosis, and angiogenesis
biomarkers in non-small cell lung cancer: a review. Clin Cancer Res. 11, 3974-
86
Su, J.L., Yen, C.J., Chen, P.S., Chuang, S.E., Hong, C.C., Kuo, I.H., Chen,
H.Y., Hung, M.C., und Kuo, M.L. (2007). The role of the VEGF-C/VEGFR-3 axis
in cancer progression. Br J Cancer. 96, 541-5
Takahashi, S. (2011). Vascular endothelial growth factor (VEGF), VEGF
receptors and their inhibitors for antiangiogenic tumor therapy. Biol Pharm Bull.
34, 1785-8
96
Takayama, S., Sato, T., Krajewski, S., Kochel, K., Irie, S., Millan, J.A., und
Reed, J.C. (1995). Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-
binding protein with anti-cell death activity. Cell. 80, 279-84
Tang, X. (2013). Tumor-associated macrophages as potential diagnostic and
prognostic biomarkers in breast cancer. Cancer Lett. 332, 3-10
Tempfer, C., Haeusler, G., Kaider, A., Hefler, L., Hanzal, E., Reinthaller, A.,
Breitenecker, G., und Kainz, C. (1998a). The prognostic value of CD44 isoform
expression in endometrial cancer. Br J Cancer. 77, 1137-9
Tempfer, C., Sliutz, G., Haeusler, G., Speiser, P., Reinthaller, A., Breitenecker,
G., Vavra, N., und Kainz, C. (1998b). CD44v3 and v6 variant isoform
expression correlates with poor prognosis in early-stage vulvar cancer. Br J
Cancer. 78, 1091-4
Tempfer, C.B., Simoni, M., Destenaves, B., und Fauser, B.C. (2009). Functional
genetic polymorphisms and female reproductive disorders: part II--
endometriosis. Hum Reprod Update. 15, 97-118
Tempfer, C.B., Wenzl, R., Horvat, R., Grimm, C., Polterauer, S., Buerkle, B.,
Reinthaller, A., und Huber, J.C. (2011). Lymphatic spread of endometriosis to
pelvic sentinel lymph nodes: a prospective clinical study. Fertil Steril. 96, 692-6
Thiery, J.P. (2002). Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression.
Nat Rev Cancer. 2, 442-54
Thiery, J.P., Acloque, H., Huang, R.Y., und Nieto, M.A. (2009). Epithelial-
mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-90
Thomakos, N., Rodolakis, A., Vlachos, G., Papaspirou, I., Markaki, S., und
Antsaklis, A. (2006). A rare case of rectovaginal endometriosis with lymph node
involvement. Gynecol Obstet Invest. 62, 45-7
Thomas, E.J., und Campbell, I.G. (2000). Molecular genetic defects in
endometriosis. Gynecol Obstet Invest. 50 (Suppl 1), 44-50
97
Tokumo, K., Kodama, J., Seki, N., Miyagi, Y., Yoshinouchi, M., und Kudo, T.
(1998). CD44 exon v6 is not implicated in the progression and metastasis of
endometrial cancer. Cancer Lett. 125, 221-5
Tran, L.V., Tokushige, N., Berbic, M., Markham, R., und Fraser, I.S. (2009).
Macrophages and nerve fibres in peritoneal endometriosis. Hum Reprod. 24,
835-41
Tsanou, E., Peschos, D., Batistatou, A., Charalabopoulos, A., und
Charalabopoulos, K. (2008). The E-cadherin adhesion molecule and colorectal
cancer. A global literature approach. Anticancer Res. 28, 3815-26
Tuttlies, F., Keckstein, J., Ulrich, U., Possover, M., Schweppe, K.W., Wustlich,
M., Buchweitz, O., Greb, R., Kandolf, O., Mangold, R., Masetti, W., Neis, K.,
Rauter, G., Reeka, N., Richter, O., Schindler, A.E., Sillem, M., Terruhn, V., und
Tinneberg, H.R. (2005). ENZIAN-score, a classification of deep infiltrating
endometriosis. Zentralbl Gynakol. 127, 275-81
Uhl-Steidl, M., Müller-Holzner, E., Zeimet, A.G., Adolf, G.R., Daxenbichler, G.,
Marth, C., und Dapunt, O. (1995). Prognostic value of CD44 splice variant
expression in ovarian cancer. Oncology. 52, 400-6
Ulrich, U., Richter, O., Wardelmann, E., Valter, M., Schmutzler, R., Sillem, M.,
Possover, M., und Mallmann, P. (2003). Endometriosis and malignoma.
Zentralbl Gynakol. 125, 239-42
Uzan, C., Cortez, A., Dufournet, C., Fauvet, R., Siffroi, J.P., und Daraï, E.
(2004). Eutopic endometrium and peritoneal, ovarian and bowel endometriotic
tissues express a different profile of matrix metalloproteinases-2, -3 and -11,
and of tissue inhibitor metalloproteinases-1 and -2. Virchows Arch. 445, 603-9
Uzan, C., Darai, E., Valent, A., Graesslin, O., Cortez, A., Rouzier, R., und Vielh,
P. (2009). Status of HER1 and HER2 in peritoneal, ovarian and colorectal
endometriosis and ovarian endometrioid adenocarcinoma. Virchows Arch. 454,
525-9
98
van den Berg, L.L., Crane, L.M., van Oosten, M., van Dam, G.M., Simons, A.H.,
Hofker, H.S., und Bart, J. (2013). Analysis of biomarker expression in severe
endometriosis and determination of possibilities for targeted intraoperative
imaging. Int J Gynaecol Obstet. 121, 35-40
van der Linden, P.J., de Goeij, A.F., Dunselman, G.A., van der Linden, E.P.,
Ramaekers, F.C., und Evers, J.L. (1994). Expression of integrins and E-
cadherin in cells from menstrual effluent, endometrium, peritoneal fluid,
peritoneum, and endometriosis. Fertil Steril. 61, 85-90
Vella, N., Aiello, M., Russo, A.E., Scalisi, A., Spandidos, D.A., Toffoli, G., Sorio,
R., Libra, M., und Stivala, F. (2011). 'Genetic profiling' and ovarian cancer
therapy (review). Mol Med Report. 4, 771-7
Wei, L., und Shi, Y.B. (2005). Matrix metalloproteinase stromelysin-3 in
development and pathogenesis. Histol Histopathol. 20, 177-85
Weijzen, S., Rizzo, P., Braid, M., Vaishnav, R., Jonkheer, S.M., Zlobin, A.,
Osborne, B.A., Gottipati, S., Aster, J.C., Hahn, W.C., Rudolf, M., Siziopikou, K.,
Kast, W.M., und Miele, L. (2002). Activation of Notch-1 signaling maintains the
neoplastic phenotype in human Ras-transformed cells. Nat Med. 8, 979-86
Wolf, M., Kiesel, L., und M., G. (2009). Stammzellen im Endometrium.
Potentielle Relevanz für die Pathogenese der Endometriose. Gyn Endokrinol. 7,
185-189
Yang, R.B., Ng, C.K., Wasserman, S.M., Colman, S.D., Shenoy, S., Mehraban,
F., Komuves, L.G., Tomlinson, J.E., und Topper, J.N. (2002). Identification of a
novel family of cell-surface proteins expressed in human vascular endothelium.
J Biol Chem. 277, 46364-73
Yonezawa, S., Higashi, M., Yamada, N., Yokoyama, S., Kitamoto, S., Kitajima,
S., und Goto, M. (2011). Mucins in human neoplasms: clinical pathology, gene
expression and diagnostic application. Pathol Int. 61, 697-716
Yoshida, K., Yoshihara, K., Adachi, S., Haino, K., Nishino, K., Yamaguchi, M.,
Nishikawa, N., Kashima, K., Yahata, T., Masuzaki, H., Katabuchi, H., Ikuma, K.,
99
Suginami, H., und Tanaka, K. (2012). Possible involvement of the E-cadherin
gene in genetic susceptibility to endometriosis. Hum Reprod. 27, 1685-9
Zeitvogel, A., Baumann, R., und Starzinski-Powitz, A. (2001). Identification of an
invasive, N-cadherin-expressing epithelial cell type in endometriosis using a
new cell culture model. Am J Pathol. 159, 1839-52
Zhang, L.Q., Wang, J., Jiang, F., Xu, L., Liu, F.Y., und Yin, R. (2012).
Prognostic value of survivin in patients with non-small cell lung carcinoma: a
systematic review with meta-analysis. PLoS One. 7, e34100
DANKSAGUNG
Zunächst möchte ich mich bei meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. med.
Clemens Tempfer, für die freundliche Überlassung des Themas bedanken. Ich
bin sehr froh, dass er es mir ermöglicht hat, diese Arbeit durchzuführen.
Ausserdem gebührt Herrn Dr. rer. nat. Günther Rezniczek größter Dank für die
wirklich einzigartige Betreuung. Er hat mich in allen Phasen der Arbeit begleitet,
stand mir mit Rat und Tat zur Seite und hat alle meine Fragen beantwortet. Ich
weiss diese durchaus nicht selbstverständlichen Mühen wirklich sehr zu
schätzen. Desweiteren möchte ich mich sowohl bei ihm, als auch bei Jan
Scheich für die Einarbeitung in die bzw. für Hilfestellungen und praktische Tipps
bei der Versuchsdurchführung bedanken. Auch den gesamten Teams der
Forschungslabore in der Düngelstraße möchte ich ein Dankeschön für die
vielen netten Stunden aussprechen. Ich habe mich dort sehr wohl gefühlt.
Herrn Prof. Dr. Reinhard Horvat danke ich dafür, dass er mir das Proben-
material für diese Arbeit zur Verfügung gestellt hat.
Ganz besonderer Dank gilt allen Menschen in meiner Umgebung, die mich
während der Doktorarbeit unterstützt haben. Meine Familie und Freunde haben
mich immerzu in meinem Engagement bestärkt, wofür ich mich nun herzlich
bedanken möchte.
Unendlich dankbar bin ich besonders meinen Eltern, die mich auf meinen
Lebensweg immer unterstützt und mir das Studium ermöglicht haben. Danke
von ganzem Herzen an euch für euren grenzenlosen und liebevollen Beistand
auf meinem Weg!
LEBENSLAUF
Persönliche Daten
Name Nadine Katharina Notscheid
Geburtstag/-ort 01.08.1987 in Köln
Schulausbildung
1994-1998 Donatus Grundschule Erftstadt-Liblar
1998-2007 Ville-Gymnasium Erftstadt-Liblar
2007 Abitur
Hochschulausbildung
2007-2013 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität
Bochum
09/2009 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
2012/2013 Praktisches Jahr:
- Innere Medizin, Marienhospital Herne
- Frauenklinik am Marienhospital Herne
- Chirurgische Klinik am Marienhospital Herne
2013 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Dissertation
09/2011 Beginn der Dissertation in der Frauenklinik am
Marienhospital Herne bei Herrn Prof. Dr. med. C. Tempfer
![Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe Elternschule · PDF fileAKUPUNTUR 2 [Kompatibilitätsmodus] Author: stelte Created Date: 11/30/2011 4:09:12 PM](https://img.pdfslide.org/doc/110x75/5a7a8af77f8b9a05348cc0b4/klinik-fr-frauenheilkunde-und-geburtshilfe-elternschule-2-kompatibilittsmodus.jpg)
