Aus derStrahlenklinik

derFriedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. med. Rolf Sauer

Der prognostische Einfluss von tumorinfiltrierenden Lymphozyten in oropharyngealen Plattenepithelkarzinomen

Inaugural-DissertationZur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultätder

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

vorgelegt vonAlexander Dei Hung

ausErlangen

2

2

Gedruckt mit Erlaubnis der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Jürgen Schüttler

Referent: Prof. Dr. G. G. Grabenbauer

Korreferent: Prof. Dr. Rainer Fietkau

Tag der mündlichen Prüfung: 19.3.2010

3

3

Widmung

Ich widme diese Arbeit meinen Eltern ohne deren Unterstützung ich nicht so weit gekommen wäre.

4

4

Inhaltsverzeichnis...........................................................................1 Zusammenfassung 5

....................................................................................1.1 Hintergrund und Ziele 5

.......................................................................................................1.2 Methoden 5

....................................................................1.3 Ergebnisse und Beobachtungen 5

......................................................................1.4 Praktische Schlussfolgerungen 5

...............................................................................................2 Summary 6

....................................................................................2.1 Background and aims 6

..................................................................................2.2 Materials and Methods 6

..........................................................................................................2.3 Results 6

...................................................................................................2.4 Conclusions 6

..........................................................................................3 Einleitung 7

..............................................................................................4 Methoden 9

..........................................................................................4.1 Patientenauswahl 9

....................................................................................4.2 Behandlungsprotokoll 9

................................................4.3 "Tissue Microarray" und Immunhistochemie 10

...............................................................................................5 Statistik 15

.............................................................................................5.1 Labeling Index 15

............................................................................5.2 Kaplan - Meier - Methode 15

..............................................................................................5.3 Logrank - Test 16

.........................................................................................6 Ergebnisse 17

..........................................................................................7 Diskussion 26

...........................................................................8 Literaturverzeichnis 29

....................................................................9 Abkürzungsverzeichnis 32

.........................................10 Verzeichnis der Vorveröffentlichungen 32

.........................................................................11 Tabellenverzeichnis 33

....................................................................12 Abbildungsverzeichnis 33

......................................................................................13 Danksagung 34

.............................................................................................Lebenslauf 35

5

5

1 Zusammenfassung

1.1 Hintergrund und Ziele

Tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL) gelten in jüngster Zeit als potentielle

Prognosefaktoren bei Tumorpatienten. Ziel dieser Arbeit war es, bei Patienten

mit fortgeschrittenem Plattenepithelkarzinom des Kopf- und Halsbereichs die

Rolle von CD 8+ und CD 4+ T-Zellen, und speziell die Bedeutung

tumorinfiltrierender Lymphozyten mit regulatorischen Eigenschaften (Treg) zu

untersuchen.

1.2 Methoden

Tissue Microarrays, die Stanzen des Tumorgewebes von 53 nicht operierten

Patienten mit Plattenepithelkarzinom des Kopf- und Halsbereiches enthielten,

wurden immunhistochemisch mit monoklonalen Antikörpern gegen CD 3, CD 8

und foxp3+ gefärbt und semiautomatisch mit dem Bildanalyseprogramm Count

(Biomas, Erlangen, Germany) ausgewertet. Die Zahl der im Tumorgewebe

vorhandenen markierten Lymphozyten wurde ins Verhältnis zu 100 Tumorzellen

gesetzt. Durch Auftrennen dieses Quotienten an der 66% Percentile erhielten

wir zwei Patientengruppen – eine mit hohen und eine mit niedrigen

Lymphozytenzahlen – für die die NED-Überlebensrate und die lokoregionäre

Kontrollrate berechnet und mit Hilfe des Logrank-Tests verglichen wurden.

1.3 Ergebnisse und Beobachtungen

Eine niedrige Dichte von CD 3+ T-Lymphozyten war mit einer 5-Jahres

Überlebensrate von 72% assoziiert, während Patienten mit mehr CD 3+ T-

Lymphozyten ein 5–Jahres-Überleben von 38% zeigten (p=0.04). Für die foxp3+

Zellen ergab sich kein statistisch signifikanter Einfluss auf klinische

Zielparameter.

1.4 Praktische Schlussfolgerungen

CD3+ TIL können als Prognosefaktoren, ggf. auch als Zielzellen einer

therapeutischen Manipulation bei Kopf-Hals-Patienten dienen.

6

6

2 Summary

2.1 Background and aims

In the past 10 years Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) have been established

as markers for the prognosis of cancer patients, as well as a possible target for

specific tumor therapy. The purpose of this study was to establish the role of

TIL in advanced squamous cell cancers of the head and neck (HNSCC), in

conjunction with their CD 4 and CD 8 positive counterparts, especially with

regard to the prognostic value in advanced squamous cell cancer (SCC) of the

head and neck.

2.2 Materials and Methods

A high-risk group of 53 inoperable patients with advanced disease was treated

by primary radiochemotherapy. Two-hundred-forty biopsies were evaluated by

use of tissue-micro-array technique, using the following markers: CD 3, CD 4,

CD 8, foxp3. The prognostic impact of labeled TILs per 100 tumor cells (labeling

index, LI) was evaluated.

2.3 Results

In the high-risk-group CD 3+ TIL infiltration below the 66th percentile was

associated with a 5-year-NED survival rate of 72% as compared to 38% for

patients with higher CD 3+ numbers (p=0.04). As far as foxp3+ cells were

concerned a trend towards influence on outcome could be shown for the CD

3+ / foxp3+ ratio, but the significance was low with p at only 0.3.

2.4 Conclusions

A low number of CD 3+ TIL indicated significantly better survival among patients

with advanced disease. Presence or absence of foxp3 and CD 8 did not have

the anticipated influence on NED- survival.

7

7

3 Einleitung

Plattenepithelkarzinome machen ca. 95% der Tumoren des Kopf- und

Halsbereiches aus (Manual of Clinical Oncology5). Die Inzidenz der

Plattenepithelkarzinome des Oropharynx beträgt in den USA zwischen 0,5 und

2 pro 100.000. Männer sind bis zu vier mal häufiger betroffen als Frauen

(Canto and Devesa, 20024). Die Fortschritte der Medizin in den letzten

Jahrzehnten haben jedoch kaum zur Verbesserung der Therapieergebnisse

geführt. Betrachtet man die 5-Jahres-Überlebensrate von Patienten aller TNM-

Stadien zusammengenommen, so liegt sie bei lediglich 66% (Pericot et al.,

200020).

Mitentscheidend für dieses schlechte Ergebnis ist die Entstehung eines

lokoregionären Rezidives. Auf der Suche nach den Ursachen wurden eine

Reihe von unabhängigen Risikofaktoren identifiziert. Zum einen ein

Ungleichgewicht zwischen Apoptose und Proliferation auf Seiten der

Tumorzellen (Grabenbauer, Suckorada, et al. 200314) sowie eine hohe

Proliferationsrate, gemessen als Ki-67 Labeling Index, zum anderen eine

schwache p53-Aktivität (Grabenbauer et al., 200012).

Auf der Suche nach weiteren Einflussgrößen haben sich in letzter Zeit verstärkt

tumorinfiltrierende Lymphozyten als Ziel der Forschung erwiesen,

insbesondere die regulatorischen T-Zellen. Diese Untergruppe der T-Zellen

wurde erstmals 1971 durch Gershon und Kodno9 entdeckt und als

„suppressor“-T-Zellen bezeichnet. Mangels fehlendem spezifischem Antikörper

und widersprüchlichen Aussagen geriet die Forschung jedoch in eine

Sackgasse. Erst 1995 konnten Sakaguchi et al.22 mit Hilfe von CD 25, der

Interleukin-2-Rezeptor-Alpha Kette, eine Subgruppe der CD 4+ Lymphozyten

isolieren, die Autoimmunität verhindern konnten. Die jetzt als regulatorische T-

Zellen bezeichneten Zellen konnten weiter in eine CD25+-high- und CD25+-low -

Gruppe unterteilt werden, wobei die immunmodulierende Wirkung von ersteren

ausging. In diesen wurde dann der Transkriptionsfaktor forkhead box P3 (foxp3)

als unabdingbarer Marker der T-Zell-Subpopulation etabliert.

8

8

Darüber hinaus wurden in zahlreichen früheren Untersuchungen verschiedene

andere Entitäten der TIL untersucht: CD 8+ T-Lymphozyten (Leong et al.,

200616) stellten einen prognostisch günstigen Faktor dar, insbesondere gehen

intratumorale CD 8+-Lymphozyten bei Ösophagus- (Cho et al., 20036);

(Schumacher et al., 200125), Pankreas- (Ryschich, et al. 200522), Endometrium-

(Kondratiev, et al. 200413) und Ovarialkarzinomen (Sato et al., 200524) sowie

bei kolorektalen Tumoren (Menon, et al. 200415) und kleinzelligen

Lungentumoren (Eerola et al., 20009) mit einem längeren Gesamtüberleben

einher. Granzyme B+ und zytotoxische T-Lymphozyten wurden in Studien zu

Hodgkin-Lymphomen (Oudejans, et al. 199719), Nasopharynx- (Oudejans et al.,

200218) und Analkarzinomen (Grabenbauer et al., 200611) mit einer schlechten

Prognose in Verbindung gebracht.

Hieraus ergab sich als logischer Schritt die Untersuchung der prognostischen

Rolle der foxp3+ TIL. Diese waren teils mit einer schlechten Prognose assoziiert

( (Curiel et al., 20047); (Kono et al., 200614); (Wolf et al., 200527), da sie sowohl

über Zell-Zell-Kontakt als auch über die Sekretion der antiinflammatorischen

Zytokine IL-10 und TGF-β, CD8+ T-Lymphozyten sowie CD4+ T-Helferzellen in

ihrer Wirkung hemmen können (Yu et al., 200528).

9

9

4 Methoden

4.1 Patientenauswahl

Mit Hilfe des Tumorzentrums Erlangen-Nürnberg wurden insgesamt 110

Patienten der Jahre 1995 bis 2005 mit der histopathologischen Diagnose

P l a t t e n e p i t h e l k a r z i n o m d e s O r o p h a r y n x m i t p r i m ä r e r

radiochemotherapeutischen Behandlung identifiziert. Es wurde ein Kollektiv von

53 Patienten ausgewählt. Voraussetzungen für die Aufnahme in die Studie

waren ein oropharyngeal lokalisierter Primärtumor (unabhängig vom

Lymphknotenstatus) und der Verzicht auf eine Operation mit primär kurativer

Intention. Ein solches Vorgehen ist nur bei Patienten mit grossem Tumorbefund

angezeigt, so dass sich aus dieser Gruppe die Hochrisikogruppe der

gemeinsamen Publikation aus unserem Institut8 ergab. Ausschlusskriterien

waren eine unzureichende Dokumentation, sowie, bei einem Großteil der

Ausgeschlossenen, die mangelnde Qualität der Paraffinblöcke, die aufgrund

eines Wasserschadens im Pathologischen Institut Erlangen teilweise

unbrauchbar wurden. Von den nicht in unserer Universität vorgehaltenen

Probeblöcken wurden 2 eingesandt, bei insgesamt 6 angeschriebenen

Institutionen.

4.2 Behandlungsprotokoll

Im Rahmen der Staging-Untersuchung wurden eine Tracheoskopie und

Endoskopie des oberen Gastrointestinaltrakts durchgeführt. Beide Halsseiten

und die Supraclavicularregion wurden klinisch und sonographisch untersucht.

Alle Patienten mussten initial normale Leberwerte aufweisen, die

Lungenfunktion musste sich nahe den Normwerten befinden, hämatologisch

durften sich keine Auffälligkeiten zeigen, um aggressiv radiochemotherapeutisch

behandelt werden zu können. Ein CT von Kopf und Hals mit Kontrastmittel in

Maske wurde angefer t ig t , um die Behandlung zu p lanen. Die

Bestrahlungsplanung wurde 3d-konformal mit dem Planungssystem Pinnacle

10

10

(Philips, Eindhoven, Netherlands) durchgeführt. Die Bestrahlungsdosis für den

Primärtumor betrug 72 Gy, bereits befallene Lymphknoten wurden mit 60 Gy

und nicht befallene nodale Regionen mit 50 Gy bestrahlt. Die simultan

verabreichte Chemotherapie bestand aus Fluorouracil als Infusion

(kontinuierlich verteilt über 5 Tage während der ersten Woche, Dosis: 600 mg /

m2) und 10 mg /m2 Mitomycin C als iv. Bolus am 1. und 29. Tag. Die

Erfolgskontrolle wurde klinisch sowie über HNO- Endoskopie, Ultraschall und

CT des Halses 6 Wochen nach Abschluss der Behandlung und im Folgenden

dann alle 3 Monate durchgeführt.

4.3 "Tissue Microarray" und Immunhistochemie

Um eine rasche Verarbeitung mit einer einheitlichen Färbung der Proben zu

ermöglichen, wurden Tissue Microarrays erstellt. Lichtmikroskopisch wurden

Tumorlokalisationen im Paraffinschnitt identifiziert und auf dem dazugehörigen

Paraffinblock markiert. Anhand der Markierungen hat die Firma BioCat,

(Heidelberg, Deutschland) Zylinder mit einem Durchmesser von 2 mm

ausgestanzt und in einen Sekundärparaffinblock (Rezipientenblock) dem Tissue

Microarray (TMA, vgl. Bild 5), eingesetzt und miteinander verschmolzen.

Insgesamt wurden drei TMAs mit je durchschnittlich 60 Stanzen generiert. Die

Anzahl der individuell generierten Stanzen variierte, wegen der Qualität der

Paraffinblöcke, zwischen 2 und 5, und lag bei durchschnittlich 3,1. Die TMAs

wurden mit dem Mikrotom geschnitten und auf Objektträger aufgezogen. Die

TMAs wurden entwachst und die Proteine im Dampftopf für die Antikörper

zugänglich gemacht. Anschließend wurden die TMAs mit folgenden

monoklonalen Antikörpern gefärbt:

CD 4 (Novocastra, Newcastle upon Tyne, UK), CD 3, CD 8, (DakoCytomation,

Hamburg, Germany), foxp3 (abcam, Cambridge, UK).

Es wurde die Standardmethode streptavidin biotinylated alkaline phosphatase

(ABC-AP, DakoCytomation, Hamburg, Germany) verwendet, lediglich für foxp3

11

11

wurde zusätzlich eine Tyramide Signalamplifikation verwendet. Anschließend

wurden die gefärbten TMAs mit Hilfe einer CCD Kamera, die an ein

Lichtmikroskop angeschlossen wurde, in relevanten Abschnitten abfotografiert.

Die Bilder wurden dann mit Hilfe des Computerprogramms COUNT (Biomas,

Er langen, Deutschland) semiautomat isch ausgewertet . Posi t ive

tumorinfiltrierende Zellen wurden in Beziehung zu 100 Tumorzellen gesetzt.

Hieraus ergab sich der Labeling – Index (LI).

Abb. 1: CD8 positive Lymphozyten im Tumor

12

12

Abb. 2: CD3 positive Lymphozyten im Tumor

Abb. 3: CD4 positive Lymphozyten im Tumor

13

13

Abb. 4: foxp3 positive Lymphozyten im Tumor

14

14

Abb. 5: Tissue Micro Array in der Übersicht

15

15

5 Statistik

5.1 Labeling Index

Grundlage aller Berechnungen ist der Labeling - Index. Mathematisch ist dieser über die Formel:

definiert, wobei LI der Labeling - Index ist, L die intratumoralen Lymphozyten

und T die Tumorzellen, sodass ein prozentähnliches Verhältnis (keine

Auszählung der Gesamttumorzellen) resultiert.

5.2 Kaplan - Meier - Methode

Um den „Erfolg“ von hoher oder niedriger Treg - Infiltration zu vergleichen,

haben wir die Kaplan - Meier - Methode herangezogen. Um vergleichen zu

können, muss die Population geteilt werden. Wir haben uns für die Trennung an

der 66% Percentile des LI entschieden.

Mit Hilfe der Formel:

können wir nun das Überleben der Gruppen vergleichen, wobei Ŝ(t) die

Wahrscheinlichkeit ist, dass zu einem Zeitpunkt t einem Patienten aus der

Gruppe der noch vorhandenen Patienten ni das Ereignis di widerfährt. Hierbei

gilt zum Zeitpunkt Ŝ(0)= 1. Die Patienten ni sind solche, die zum Zeitpunkt ti

( i := 0,1,2...,) unter Risiko sind. Ausscheiden aus der Gruppe kann man

entweder dadurch, dass man das Ereignis erlebt, oder keine weiteren Daten

mehr vorhanden sind. Das Ereignis di ist für unsere Arbeit als das

posttherapeutische Auftreten eines Lokal-, Lymphknotens oder eines

Fernrezidives definiert, oder aber als durch eine senkrechte Linie markiertes

Fehlen von weiteren Daten. Ein Ausscheiden aus n ergibt graphisch eine Stufe.

16

16

Der Beobachtungszeitraum wurde auf 6 Jahre festgelegt, beginnend mit dem

ersten Tag der Therapie und endend nach Auftreten von di oder nach 6 Jahren.

Tod mit NED wurde aus der Berechnung genommen, es sei denn die Autopsie

ergab doch ein Rezidiv.

5.3 Logrank - Test

Um zu überprüfen, ob sich aus der unterschiedlichen Entwicklung der

Überlebenskurven eine statistische Signifikanz ergab, bedienten wir uns des

Logrank - Testes, da er nicht auf eine Standardverteilung oder besondere

Vollständigkeit der Daten angewiesen ist.

Es sei Erwartungswert für die Gruppe 1: E1j = O1j x (N1j/Nj) und

Varianz Vj = {E1j x( 1- N1j/Nj)x(Nj-Oj)} / (Nj-1) wobei Oj die Ereignisse in beiden

Gruppen zum Zeitpunkt tj sind. Nj ergibt sich aus N1j + N2j.

Mit der Formel:

ist es nun möglich, die beobachteten (O, observed) mit den nach der

Nullhypothese erwarteten (E, expected) Ereignissen zum Zeitpunkt tj zu

vergleichen. Die Summe der Differenzen geteilt durch die Wurzel der Summe

der Varianz V zum Zeitpunkt j ergibt den p - Wert ( = Z in der Formel).

17

17

6 ErgebnisseFür unsere Patienten ergaben sich die in den folgenden Tabellen und

Abbildungen zu sehenden Charakteristika:

N (%)GesamtGesamt 53 100Tumor LokalisationTumor Lokalisation

Hypopharynx 16 30Zungengrund 13 25Tonsille 5 9Oropharynx 19 36

T KategorieT Kategorie

T1 0 0T2 4 8T3 26 49T4 23 43

N KategorieN Kategorie

N0 5 9N1, NX 4 7N2a 0 0N2b 13 25N2c 29 55N3 2 4

Grading (WHO)Grading (WHO)

G1/2 38 72G3/4 15 28

UICC StadiumUICC Stadium

1 0 02 0 03 7 134A 43 814B/C 3 6

Tabelle 1: Statistische Verteilung der Patienten nach klinischen Gesichtspunkten.

18

18

Die Geschlechterverteilung spiegelt das Raucherverhalten von vor ca. 50

Jahren wieder (vgl. Altersverteilung, Abb 6.). 90% der Erkrankten sind Raucher.

Abb. 6: Patientenverteilung nach dem Geschlecht

Es steht zu erwarten (Beelte, Pritzkuleit und Katalinic 20083), dass sich die

Geschlechterverteilung zu Gunsten des Frauenanteils verändert.

Ein bekannter Amplifikator für die Entwicklung eines Plattenepithelkarzinoms ist

der Konsum von hochprozentigem Alkohol, sowie aller Wahrscheinlichkeit nach

eine schlechte Mundhygiene. Bei 10% der Patienten lässt sich eine erbliche

Dispos i t ion eru ieren (Rasse 200825) . Aufgrund der feh lenden

Screeningverfahren werden die meisten Karzinome erst ab einem Stadium ab

T2 diagnostiziert, was bei positivem Lymphknotenstatus schon einem

Hochrisikotumor gleichkommt.

10,0

43,0

Geschlecht Männer Frauen

19

19

Abb. 7: Altersstruktur der Patienten

Wie bei einem durch chemische Induktion ausgelösten Tumor zu

erwarten ,befinden sich die meisten Patienten schon in einem fortgeschrittenen

Lebensalter (siehe. Abb 7.). In Anbetracht der notwendigen radikalen Therapie

kommt es zwangsweise nicht immer zur Operation.

Für das Färbeverhalten der Antikörper der untersuchten TIL ergab sich folgende

Verteilung:

TIL-LI Median LI (Range) Mittelwert (LI ± SE)CD 3+ 10.9 (0-53.7) 15.5±13.7

CD 8+ 2.2 (0-9.5) 2.6±1.9

foxp3+ 10.0 (0-64.6) 11.8±8.1

Tabelle 2: Median und Mittelwert der tumorinfiltrierendenen Lymphozyten (TIL), bezogen auf den Labelling-Index(LI) für CD3+, CD8+ und foxp3+ TIL.

Die univariante Analyse mit einem „cut-off“ bei 66% bzw. am Median zeigte den

Einfluss der TIL auf das NED-Überleben: Tabelle 3 und 4 gibt hierzu die

Resultate.

20

20

Faktor NED-Überleben p-Wert

CD 3+ 72% vs. 38% 0,045

CD 8+ 56% vs. 71% 0,4

foxp3+ 62% vs. 59% 0,5

CD 3/foxp3+ 71% vs. 44% 0,3

CD 8/foxp3+ 66% vs. 50% 0,6

Tabelle 3: Univariante Analyse des NED-Überlebens und der Einfluss von verschiedenen TIL bei einem „cut-off“ bei 66.6%.

Faktor NED-Überleben (6a) p-Wert

CD 3+ 77% vs. 44% 0,09

CD 8+ 60% vs. 62% 0,8

foxp3+ 57% vs. 67% 0,7

CD 3/foxp3+ 74% vs. 49% 0,1

CD 8/foxp3+ 64% vs. 57% 0,7

Tabelle 4: Univariante Analyse des NED-Überlebens und der Einfluss von verschiedenen TIL bei einem „cut-off“ am Median.

Es wird deutlich, dass sich nur für CD3+ TIL ein signifikanter Einfluss postulieren

lässt. Natürlich gab es auch andere Einflussgrößen, wie bekannte klinische

Parameter.

21

21

Berücksichtigt man klinische Einflussgrößen, ergeben sich folgende Werte:

Klinische Faktoren NED-Überleben p

T Kategorie T1-2: 56% T3-4: 59% 0,7N Kategorie 69% vs. 51% 0,3

Alter 40% vs. 76% 0,01Geschlecht 60% vs. 52% 0,6

Tumor Lokalisation 66% vs. 60% vs. 47% 0,5

Tabelle 5: NED Überleben nach klinischen Kriterien

Die Ergebnisse aus Tabelle 5 lassen darauf schließen, dass eine

Haupteinflussgrösse auf das NED-Überleben das Alter der Patienten darstellt.

Faktor Lokoregionäre TumorkontrolleLokoregionäre TumorkontrolleTIL pCD 3+ 81% vs. 79% 0,7CD 8+ 79% vs. 82% 0,8foxp3+ 83% vs. 76% 0,2

CD 3+/foxp3+ 89% vs. 68% 0,4CD 8+/foxp3+ 88% vs. 64% 0,3

Tabelle 6: Univariante Analyse der lokoregionären Tumorrezidivkontrolle und der Einfluss verschiedener TIL bei einem cut-off value von 66%.

22

22

Faktor Lokoregionäre TumorkontrolleLokoregionäre Tumorkontrollep

CD 3+ 84% vs. 75% 0,9

CD 8+ 87% vs. 74% 0,4

foxp3+ 79% vs. 83% 0,7

CD 3/foxp3+ 89% vs. 71% 0,5

CD 8/foxp3+ 88% vs. 72% 0,5

Tabelle 7: Univariante Analyse der lokoregionären Tumorrezidivkontrolle und der Einfluss verschiedener TIL bei einem cut-off am Median.

Es zeigte sich, dass die lokoregionäre Tumorkontrolle als ein entscheidender

Faktor für das Überleben der Patienten in unserer Gruppe statistisch nicht

signifikant mit einem bestimmten TIL assoziiert ist (siehe Tabelle 6 und 7).

23

23

Abb. 8: NED-Überleben für Patienten mit unterschiedlicher Infiltration des Tumors mit CD3+ TIL.

Abbildung 8 zeigt die Überlebensraten für Patienten mit hoher und niedriger

Infiltrationsdichte des Tumors mit CD3+ TIL. Getrennt wurden die Gruppen ab

einem Labeling-Index von 0.15. Deutlich zeigt sich der statistisch signifikante

Unterschied (p=0,045) im Überleben. Patienten mit wenigen CD3 +

Lymphozyten im Tumorbett überlebten länger als solche mit vielen CD3 +

Lymphozyten. Von letzteren lebte nach zwei Jahren nur noch ca. ein Drittel.

24

24

Abb. 9: NED-Überleben für Patienten mit unterschiedlicher Infiltration des Tumors mit CD8+ TIL.

Für die Infiltration des Tumors mit CD8+ Zellen ließ sich kein statistisch

signifikanter Einfluss (p=0,4) feststellen.

25

25

Abb. 10: NED-Überleben für Patienten mit unterschiedlicher Infiltration des Tumors mit foxp3+ TIL.

Entgegen der initialen Annahme hat sich gezeigt, dass foxp3 positive T-

Lymphozyten keinen Einfluss auf das NED Überleben oder die lokoregionäre

Tumorkontrolle (vgl. oben sowie Tabellen 3,4,6 und 7) innerhalb unserer

Gruppe ausübten. Lediglich für CD3 positive Zellen zeigte sich eine Signifikanz

(Tabellen 3 und 4).

26

26

7 Diskussion

In den letzten Jahren hat sich gezeigt, dass über die Knutssonsche „2 hit“ -

Hypothese hinaus noch weitere Faktoren zur Tumorentstehung beitragen

können. Hierzu gehört auch eine Einflussnahme auf das Immunsystem durch

den Tumor selbst. Die in der Arbeit von Baecher-Allan und Anderson 20063

zusammengefasste Vermutung, dass ein hoher Anteil an foxp3+-Zellen das

Überleben der Erkrankten verkürzt, indem es Toleranz gegenüber der sonst als

fremd erkannten, entarteten Zelle herstellt, bestätigte sich in unserer Arbeit

nicht.

Die Arbeit von Badoual et al., (20062) , die einen ähnlichen Ansatz verfolgte wie

die hier vorgelegte, kommt zu dem Ergebnis, dass eine hohe foxp3+ TIL

Infiltration im Tumor mit einer besseren lokoregionären Kontrolle des

Tumorgeschehens assoziiert sei.

Diese Ergebnisse stehen den Resultaten, die bei anderen Tumorentitäten

gesehen wurden, diametral gegenüber, insbesondere auch der wegweisenden

Arbeit von Curiel et al., (20047), welche sich allerdings mit der foxp3+-TIL-

Konzentration im Aszites von an Ovarialkarzinom erkrankten Frauen befasste.

Curiel und Mitarbeiter konnten zeigen, dass offenbar diejenigen Patienten mit

hoher Treg-Konzentration im Aszites eine signifikant schlechtere Überlebenszeit

hatten. Die Autoren folgern, dass der Tumor infolge eines Immunprivilegs durch

regulatorische Zellen, die zytotoxische T-Zellen antagonisieren, unbeeinträchtigt

proliferieren kann.

Die tatsächliche Funktionalität der Treg ist ein entscheidender, allerdings selten

überprüfter Punkt, der von Strauss et al., (200725) an 10 Kopf-Hals-

Tumorpatienten und 5 Gesunden untersucht wurde. Auch hier zeigten die

Tumorpatienten eine deutlich höhere Rate an foxp3+ Zellen im peripheren Blut

im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die funktionelle Differenzierung erfolgte hier

27

27

nur anhand von CD4 und CD25, was die Aussagekraft relativieren könnte. Es

ergaben sich jedoch Hinweise, dass nur ein geringer Anteil der CD4+, CD25+

Zellen regulatorische Funktionen übernahm. In einer zweiten Arbeit mit größerer

Fallzahl konnte gezeigt werden, dass chemotherapeutisch vorbehandelte Kopf-

Hals-Tumorpatienten im NED – Status mehr Treg im Blutkreislauf beherbergten

als Patienten mit aktivem Tumor.

Aufgrund dieser Arbeiten könnte man annehmen, es ließe sich schlüssig

behaupten, dass hohe Konzentrationen an Treg in Kopf-Hals-Tumorpatienten

einen signifikanten negativen Prädikator für das Überleben darstellen. Alle

Arbeiten leiden an der problematischen Situation in Bezug auf die genaue

Differenzierung der Treg. Inzwischen kann man mehrere Arten von Treg

unterscheiden. Sogenannte natürliche Treg (nTreg) entstehen im Thymus, sind

von Anfang an stark CD4+-, CD25+-positiv und sofort funktionsfähig, Tr1

wiederum zählt man zu den generierten Treg, die in der Peripherie entstehen

(adaptive Treg, aTreg). Darüber hinaus gehören zu dieser Gruppe noch Th3

und Th2 ( Bacchetta et al., 20071, Baecher-Allan et al., 20063). Die drei

letztgenannten Typen können ohne direkten Zell – Zell - Kontakt Einfluss auf die

Immunantwort des Körpers nehmen (IL 10, IFN gamma, TNFß), so dass eine

Infiltration des Tumors für diese Treg nicht zwingend notwendig ist.

Diese Unklarheit ist insofern von Bedeutung, als man in foxp3+ Zellen nicht nur

einen unter Umständen prognostisch bedeutsamen Faktor sieht, sondern auch

ein therapeutisches Ziel. Auf der Suche nach einer Immuninduktion zur

Therapie von Kopf-Hals-Tumoren stellten Nitcheu-Tefit et al. (200716) fest, dass

sie die besten Erfolge unter anderem mit der Depletion von CD4+ - Zellen

erreichten. Daraufhin identifizierten sie CD4+-, foxp3+ - Zellen als entscheidend.

Im Mausmodell also konnte schon gezeigt werden, dass eine spezifische

immunologische Therapie möglich ist.

Auch beim Menschen gibt es erste klinische Therapieversuche, so zum Beispiel

durch eine Gruppe in Ulm (Riechelmann et al., 2007 21), die mit Catumaxomab,

einem bispezifischen Antikörper, der einerseits an CD3+ Zellen, andererseits an

28

28

EpCAM (epithelial cell adhesion molecule) bindet, 4 Patienten, die einen nicht

mehr therapierbaren Kopf-Hals-Tumor hatten, therapierte.

Um eine in vivo Ausschüttung von IFN gamma und TNF alpha zu umgehen,

gewannen die Autoren zunächst PBMCs (peripheral blood mononuclear cells)

und kultivierten diese zusammen mit dem Antikörper und Tumor unter

Auswaschung der Cytokine. Im Anschluss erfolgte dann die Replantation durch

i.v. Gabe an die Patienten. Immerhin einer der 4 Patienten erreichte eine

komplette Remission, was angesichts der sonst bei Hochrisikopatienten zu

erwartenden Resultate ein beachtlicher Erfolg ist. Natürlich musste zunächst

die positive Expression von EpCAM sichergestellt werden, jedoch ist zu

erwarten, dass in Zukunft noch zahlreiche spezifische Antikörper entdeckt

werden und eine spezifische Tumortherapie möglich werden wird.

Insgesamt lässt sich festhalten, dass die Ergebnisse dafür sprechen, dass bei

Tumorpatienten die Treg – Zahl erhöht ist und eine positive Korrelation

zwischen der Höhe der Treg und einer Verschlechterung der Prognose besteht.

Wahrscheinlich ist nicht die Infiltrationsdichte der Treg im Tumor entscheidend,

sondern es ist eher die Konzentration im peripheren Blut oder der umgebenden

Flüssigkeit ( z.B. Aszites ) prognostisch relevant. Eine Kombination aus der

Depletion von Treg und einer spezifischen Tumortherapie könnte der nächste

Durchbruch bei der Krebsbehandlung sein.

29

29

8 Literaturverzeichnis

1. Bacchetta, R., Gambineri, E., & Roncarolo, M. G. (2007). Role of regulatory T cells and FOXP3 in human diseases. J Allergy Clin Immunol,

120(2), 227-35; quiz 236-7.

2. Badoual, C., Hans, S., Rodriguez, J., Peyrard, S., Klein, C., Agueznay Nel, H., Mosseri, V., Laccourreye, O., Bruneval, P., Fridman, W. H., Brasnu, D.

F., & Tartour, E. (2006). Prognostic value of tumor-infiltrating CD4+ T-cell subpopulations in head and neck cancers. Clin Cancer Res, 12(2), 465-472.

3. Baecher-Allan, C., Wolf, E., & Hafler, D. A. (2006). MHC class II expression identifies functionally distinct human regulatory T cells. J

Immunol, 176(8), 4622-4631.

4. Canto, M. T., & Devesa, S. S. (2002). Oral cavity and pharynx cancer incidence rates in the United States, 1975-1998. Oral Oncol, 38(6),

610-617.

5. D. A. Casciato, Manual of Clinical Oncology, Auflage: 5, Lippincott Williams&Wilki, Mai 2004, 784 Seiten.

6. Cho, Y., Miyamoto, M., Kato, K., Fukunaga, A., Shichinohe, T., Kawarada,Y., Hida, Y., Oshikiri, T., Kurokawa, T., Suzuoki, M., Nakakubo, Y., Hiraoka, K., Murakami, S., Shinohara, T., Itoh, T., Okushiba, S., Kondo, S., & Katoh, H. (2003). CD4+ and CD8+ T cells cooperate to improve prognosis of patients with esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res, 63(7), 1555-1559.

7. Curiel, T. J., Coukos, G., Zou, L., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Evdemon-Hogan, M., Conejo-Garcia, J. R., Zhang, L., Burow, M., Zhu, Y.,

Wei, S., Kryczek, I., Daniel, B., Gordon, A., Myers, L., Lackner, A., Disis, M. L., Knutson, K. L., Chen, L., & Zou, W. (2004). Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts reduced survival. Nat Med, 10(9), 942-949.

8. Distel, L. V., Fickenscher, R., Dietel, K., Hung, A., Iro, H., Zenk, J., Nkenke, E., Büttner, M., Niedobitek, G., & Grabenbauer, G. G. (2009). Tumour infiltrating lymphocytes in squamous cell carcinoma of the oro- and hypopharynx: prognostic impact may depend on type of treatment and stage of disease. Oral Oncol, 45(10), e167-74.

9. Eerola, A. K., Soini, Y., & Paakko, P. (2000). A high number of tumor- infiltrating lymphocytes are associated with a small tumor size, low tumor

stage, and a favorable prognosis in operated small cell lung carcinoma. Clin Cancer Res, 6(5), 1875-1881.

10. Gershon, R. K., & Kondo, K. (1971). Infectious immunological tolerance. Immunology, 21(6), 903-914.

30

30

11. Grabenbauer, G. G., Lahmer, G., Distel, L., & Niedobitek, G. (2006). Tumor-infiltrating cytotoxic T cells but not regulatory T cells predict

outcome in anal squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res, 12(11 Pt 1), 3355-3360.

12. Grabenbauer, G. G., Muhlfriedel, C., Rodel, F., Niedobitek, G., Hornung, J., Rodel, C., Martus, P., Iro, H., Kirchner, T., Steininger, H., Sauer, R.,

Weidenbecher, M., & Distel, L. (2000). Squamous cell carcinoma of the oropharynx: Ki-67 and p53 can identify patients at high risk for local recurrence after surgery and postoperative radiotherapy. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 48(4), 1041-1050.

13. Kondratiev S, Sabo E, Yakirevich E, Lavie O, Resnick MB. (2004). Intratumoral CD8+ T lymphocytes as a prognostic factor of survival in

endometrial carcinoma. Clin Cancer Res,10,4450-6

14. Kono, K., Kawaida, H., Takahashi, A., Sugai, H., Mimura, K., Miyagawa, N., Omata, H., & Fujii, H. (2006). CD4(+)CD25high regulatory T cells

increase with tumor stage in patients with gastric and esophageal cancers. Cancer Immunol Immunother, 55(9), 1064-1071.

15. Menon AG, Janssen-van Rhijn CM, Morreau H, Putter H, Tollenaar RA, van de Velde CJ, Fleuren GJ, Kuppen PJ.(2004).Immune system and

prognosis in colorectal cancer: a detailed immunohistochemical analysis. Lab Invest,84,493-501

16. Leong, P. P., Mohammad, R., Ibrahim, N., Ithnin, H., Abdullah, M., Davis, W. C., & Seow, H. F. (2006). Phenotyping of lymphocytes expressing

regulatory and effector markers in infiltrating ductal carcinoma of the breast. Immunol Lett, 102(2), 229-236.

17. Nitcheu-Tefit, J., Dai, M. S., Critchley-Thorne, R. J., Ramirez-Jimenez, F., Xu, M., Conchon, S., Ferry, N., Stauss, H. J., & Vassaux, G. (2007).

Listeriolysin O expressed in a bacterial vaccine suppresses CD4+CD25high regulatory T cell function in vivo. J Immunol, 179(3), 1532-1541.

18. Oudejans, J. J., Harijadi, H., Kummer, J. A., Tan, I. B., Bloemena, E., Middeldorp, J. M., Bladergroen, B., Dukers, D. F., Vos, W., & Meijer, C. J.

(2002). High numbers of granzyme B/CD8-positive tumour-infiltrating lymphocytes in nasopharyngeal carcinoma biopsies predict rapid fatal outcome in patients treated with curative intent. J Pathol, 198(4), 468-475.

19. Oudejans JJ, Jiwa NM, Kummer JA, Ossenkoppele GJ, van Heerde P, Baars JW, Kluin PM, Kluin-Nelemans JC, van Diest PJ, Middeldorp JM,

Meijer CJ. (1997). Activated cytotoxic T cells as prognostic marker in Hodgkin's disease.",Blood,89,1376-82

20. Pericot, J., Escriba, J. M., Valdes, A., Biosca, M. J., Monner, A.,

31

31

Castellsague, X., Galiana, R., Piulachs, P., Escutia, E., & Mari, A. (2000). Survival evaluation of treatment modality in squamous cell carcinoma of the oral cavity and oropharynx. J Craniomaxillofac Surg, 28(1), 49-55.

21. Riechelmann, H., Wiesneth, M., Schauwecker, P., Reinhardt, P., Gronau, S., Schmitt, A., Schroen, C., Atz, J., & Schmitt, M. (2007). Adoptive therapy

of head and neck squamous cell carcinoma with antibody coated immune cells: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother, 56(9), 1397-1406.

22. Ryschich E, Nötzel T, Hinz U, Autschbach F, Ferguson J, Simon I, Weitz J, Fröhlich B, Klar E, Büchler MW, Schmidt J. (2005)., Control of T-cell-mediated immune response by HLA class I in human pancreatic carcinoma. Clin Cancer Res,11,498-504

23. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., & Toda, M. (1995). Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2

receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol, 155(3), 1151-1164.

24. Sato, E., Olson, S. H., Ahn, J., Bundy, B., Nishikawa, H., Qian, F., Jungbluth, A. A., Frosina, D., Gnjatic, S., Ambrosone, C., Kepner, J.,

Odunsi, T., Ritter, G., Lele, S., Chen, Y. T., Ohtani, H., Old, L. J., & Odunsi, K. (2005). Intraepithelial CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes and a high CD8+/regulatory T cell ratio are associated with favorable prognosis in ovarian cancer. Proc Natl Acad Sci U S A, 102(51), 18538-18543.

25. Schumacher, K., Haensch, W., Roefzaad, C., & Schlag, P. M. (2001). Prognostic significance of activated CD8(+) T cell infiltrations within

esophageal carcinomas. Cancer Res, 61(10), 3932-3936.

26. Strauss, L., Bergmann, C., & Whiteside, T. L. (2007). Functional and phenotypic characteristics of CD4+CD25highFoxp3+ Treg clones obtained

from peripheral blood of patients with cancer. Int J Cancer, 121(11), 2473-2483.

27. Wolf, D., Wolf, A. M., Rumpold, H., Fiegl, H., Zeimet, A. G., Muller-Holzner, E., Deibl, M., Gastl, G., Gunsilius, E., & Marth, C. (2005). The expression

of the regulatory T cell-specific forkhead box transcription factor FoxP3 is associated with poor prognosis in ovarian cancer. Clin Cancer Res, 11(23), 8326-8331.

28. Yu, P., Lee, Y., Liu, W., Krausz, T., Chong, A., Schreiber, H., & Fu, Y. X. (2005). Intratumor depletion of CD4+ cells unmasks tumor immunogenicity leading to the rejection of late-stage tumors. J Exp Med, 201(5), 779-791.

32

32

9 Abkürzungsverzeichnis

Ak: Antikörper

CD: cluster of differentiation

CT: Computer Tomographie

EpCAM: epithelial cell adhesion molecule

Foxp3+: forkhead box P3

Gy: Gray

HNSCC: head and neck squamous cell carcinoma

IFN gamma: Interferon Gamma

IL: Interleukin

iv. : intravenös

NED: no evidence of disease

PBMNC: peripheral blood mononuclear cells

SCC: squamous cell carcinoma

TMA: tissue micro array

TGF-β: Tumor growth factor ß

TIL: Tumorinfiltrierende Lymphozyten

Treg: Tumorinfiltrierende Lymphozyten mit regulatorischen Eigenschaften

UK: United Kingdom

USA : United States of America

10 Verzeichnis der Vorveröffentlichungen

Distel et al. Tumour infiltrating lymphocytes in squamous cell carcinoma of the

oro- and hypopharynx: prognostic impact may depend on type of treatment and

stage of disease. Oral Oncol (2009) vol. 45 (10) pp. 167-74

33

33

11 Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Statistische Verteilung der Patienten nach klinischen Gesichtspunkten. S 17

Tabelle 2: Median und Mittelwert der tumorinfiltrierendenen Lymphozyten (TIL), bezogen auf den Labelling-Index(LI) für CD3+, CD8+ und foxp3+ TIL. S 19

Tabelle 3: Univariante Analyse des NED-Überlebens und der Einfluss von verschiedenen TIL bei einem„cut-off“ bei 66.6%. S 20

Tabelle 4: Univariante Analyse des NED-Überlebens und der Einfluss von verschiedenen TIL bei einem „cut-off“ am Median. S 20

Tabelle 5: NED Überleben nach klinischen Kriterien S 21

Tabelle 6: Univariante Analyse der lokoregionären Tumorrezidivkontrolle und der Einfluss verschiedener TIL bei einem cut-off value von 66%. S 21

Tabelle 7: Univariante Analyse der lokoregionären Tumorrezidivkontrolle und der Einfluss verschiedener TIL bei einem cut-off am Median. S 22

12 Abbildungsverzeichnis

Abb. 1: CD8 positive Lymphozyten im Tumor S 11

Abb. 2: CD3 positive Lymphozyten im Tumor S 12

Abb. 3: CD4 positive Lymphozyten im Tumor S 12

Abb. 4: foxp3 positive Lymphozyten im Tumor S 13

Abb. 5: Tissue Micro Array in der Übersicht S 14

Abb. 6: Patientenverteilung nach dem Geschlecht S 18

Abb. 7: Altersstruktur der Patienten S 19

Abb. 8: NED-Überleben für Patienten mit unterschiedlicher Infiltration des Tumors mit CD3+ TIL. S 22

Abb. 9: NED-Überleben für Patienten mit unterschiedlicher Infiltration des Tumors mit CD8+ TIL. S 23

34

34

Abb. 10: NED-Überleben für Patienten mit unterschiedlicher Infiltration des Tumors mit foxp3+ TIL. S 24

13 Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen meiner

Arbeit beigetragen haben.

Hierbei ist an erster Stelle mein Betreuer Prof. Dr. G. G. Grabenbauer zu

nennen, der mir die Gelegenheit gegeben hat diese Arbeit aufzunehmen und

dessen beständiges Engagement entscheidenden Anteil am erfolgreichen

Abschluss dieser Arbeit hat.

Herrn Dr. L. Distel danke ich sowohl für die Hilfestellung bei der Planung dieser

Arbeit als auch für die fachkundige Unterstützung sowie die wertvollen

Ratschläge während ihrer Durchführung.

Ebenso danke ich Herrn Prof. Dr. R. Sauer, Direktor der Strahlenklinik der

Universität Erlangen-Nürnberg, für die Möglichkeit, diese Arbeit an der

Strahlenklinik abzuschliessen.

Ein besonderer Dank gilt Prof. Dr. G. Niedobitek sowie dessen Mitarbeiterinnen,

insbesondere Frau Christa Winkelmann und Dr. med. Maike Büttner, die mir mit

ihrer praktischen Erfahrung stets zur Seite gestanden haben.

Den größten Dank möchte ich meinen Eltern aussprechen, die mich stets

unterstützt haben und ohne die mein Studium in dieser Form nicht möglich

gewesen wäre.

35

35

Lebenslauf

Name: Hung, Alexander DeiGeburtsdatum: 26-09-1979Geburtsort: ErlangenStaatsangehörigkeit: DeutschFamilienstand: LedigEltern: Herr Chau Chun Hung (Dipl. Mathematiker)

Frau Dr. phil. Ute Rupprecht-Hung

Ausbildung:

September 1986 bis Juli 1990 Adalbert – Stifter Grundschule Erlangen

September 1990 bis Juni 1999 Emil-von-Behring Gymnasium Spardorf

Oktober 2000 bis Dezember 2007 Oktober 2000 bis Dezember 2007 Studium der Medizin an der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Beschäftigung

● August 1999 bis Juni 2000: Zivildienst am Institut für Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene

● 2002 – 2004: Videobearbeitung für die Gastroenterologie der Universitätsklinik der FAU

● Oktober 2005- 2007: Studentische Hilfskraft bei orthopädischen-Operationen in den Kliniken Dr. Erler GmbH und Unfallchirurgie des Klinikum Fürth

● seit Februar 2008: Weiterbildungsassistent Orthopädie / Unfallchirurgie BG- Kliniken Bergmannstrost Halle / Saale