8
Europ. 07. Cancer Vol. 1, pp. 295-298. Pergamon Press 1965. Printed in Great Britain Autoradiographische Untersuchungen des RNS- und DNS- Stoffwechsels in menschlichen Tumoren W. OEHLERT und R. LESCH Ludwig-Aschoff-Haus, Pathologisches Institut der Universit~t Freiburg i.Br. IN ]~INER Reihe von autoradiographischen, Untersuchungen konnte gezeigt werden, dab in menschlichem Excisionsmaterial aus der Haut dem Bronchialsystem und dem weiblichen Genitaltrakt nach kurzzeitiger Inkubation mit EiweiB- oder NukleinsAurevorliiufern ein Einbau in Proteine und Nucleins~uren erfolgt, dessen AusmaB als MaBstab ftir die in vivo ablaufenden Stofl~vechselprozesse genommen werden kann (Oehlert, Lesch und D6rmer [1] ; Lesch, Sehie,Me und Oehlert [2] ; Fetfig und Oehlert [3]). Von systematisch durch- gefiihrten Untersuchungen, in denen jeweils neben der Routinehistologie der Einbau von 8H-Thymidin und aH-Cytidin autoradio- graphisch bestimmt wurde, liegen nun so umfangreiche Erge.bnisse vor, dab Grenzen und M6glichkeiten der Inkubationsmethode zu tiberblicken sind. TECHNIK DER INKUBATION UND AUTORADIOGRAPHIE Bei der Inkubation der Gewebsproben gingen wir folgenderma~;en vor. Unmittelbar nach der Entnahme wurden noch im Operationssaal die ldeinen Gewebsbr6ckel oder die durch Katheterbiopsie, bzw. durch die Abrasio gewonnenen Schleim- und Gewebsanteile in sterile Ringerl6sung gebracht, der entweder 8H-Thymidin oder 3H-Cytidin in einer Konzentration vo:a 4 gC/ml zugesetzt worden war. Bei K6rpertemperatur wurde 30 Minuten lang inkubiert. Anschliessend erfolgte die Fixation in iiblicher Weise in 10% igem neutralem Formalin und die Einbettung in Paraffin. Von jeder Gewebsprobe wurden zwei Objekttriiger mit meist 5-6 Gewebssehnitten der Routinehistologie zugefiihrt. Ftinf weitere Objekttriiger mit jeweils der gleiehen Anzahl einzelner Sehnitte wurden mittels der dipping --Teehnik unter Verwendung der Emulsion Ilford G5 zu Autoradiogrammen verarbeitet. Nach Beliehtungszeiten yon 5-10 Tagen und ansehliessender photographiseher Entwieklung und Fixierung erfolgte die F~rbung mit Hiimatoxylin -- Eosin und die Auswertung der Autoradiogramme. ERGEBNISSE Etwa 70% der angefertigten Priiparate waren fiir eine qualitative und nur etwa 40% ftir eine quantitative Auswertung durch Zell- zRhlungen brauehbar. In etwa 30% der Autoradiogramme war eine Markierung, d.h. ein Einbau der markierten Nucleinsiiure- vorliiufer DNS oder RNS der untersuchten Zellen nieht naehweisbar. Hierbei handelte es sieh fast ausschlieBlieh um Priiparate, in denen Schnitte besonders grosser Gewebsbr6ekel zur Untersuchung gekommen waren. Die Eindringtiefe des Inkubationsmediums betrug etwa 200-300 mg, sie war umso gr6sser, 295

Autoradiographische Untersuchungen des RNS- und DNS-Stoffwechsels in menschlichen Tumoren

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Autoradiographische Untersuchungen des RNS- und DNS-Stoffwechsels in menschlichen Tumoren

Europ. 07. Cancer Vol. 1, pp. 295-298. Pergamon Press 1965. Printed in Great Britain

Autoradiographische Untersuchungen des RNS- und DNS- Stoffwechsels in menschlichen Tumoren

W. OEHLERT und R. LESCH

Ludwig-Aschoff-Haus, Pathologisches Institut der Universit~t Freiburg i.Br.

IN ]~INER Reihe von autoradiographischen, Untersuchungen konnte gezeigt werden, dab in menschlichem Excisionsmaterial aus der Haut dem Bronchialsystem und dem weiblichen Genitaltrakt nach kurzzeitiger Inkubation mit EiweiB- oder NukleinsAurevorliiufern ein Einbau in Proteine und Nucleins~uren erfolgt, dessen AusmaB als MaBstab ftir die in vivo ablaufenden Stofl~vechselprozesse genommen werden kann (Oehlert, Lesch und D6rmer [1] ; Lesch, Sehie,Me und Oehlert [2] ; Fetfig und Oehlert [3]). Von systematisch durch- gefiihrten Untersuchungen, in denen jeweils neben der Routinehistologie der Einbau von 8H-Thymidin und aH-Cytidin autoradio- graphisch bestimmt wurde, liegen nun so umfangreiche Erge.bnisse vor, dab Grenzen und M6glichkeiten der Inkubationsmethode zu tiberblicken sind.

TECHNIK DER INKUBATION UND AUTORADIOGRAPHIE

Bei der Inkubation der Gewebsproben gingen wir folgenderma~;en vor. Unmittelbar nach der Entnahme wurden noch im Operationssaal die ldeinen Gewebsbr6ckel oder die durch Katheterbiopsie, bzw. durch die Abrasio gewonnenen Schleim- und Gewebsanteile in sterile Ringerl6sung gebracht, der entweder 8H-Thymidin oder 3H-Cytidin in einer Konzentration vo:a 4 gC/ml zugesetzt worden

war. Bei K6rpertemperatur wurde 30 Minuten lang inkubiert. Anschliessend erfolgte die Fixation in iiblicher Weise in 10% igem neutralem Formalin und die Einbettung in Paraffin. Von jeder Gewebsprobe wurden zwei Objekttriiger mit meist 5-6 Gewebssehnitten der Routinehistologie zugefiihrt. Ftinf weitere Objekttriiger mit jeweils der gleiehen Anzahl einzelner Sehnitte wurden mittels der dipping - - T e e h n i k unter Verwendung der Emulsion Ilford G5 zu Autoradiogrammen verarbeitet. Nach Beliehtungszeiten yon 5-10 Tagen und ansehliessender photographiseher Entwieklung und Fixierung erfolgte die F~rbung mit Hiimatoxylin - - Eosin und die Auswertung der Autoradiogramme.

ERGEBNISSE

Etwa 70% der angefertigten Priiparate waren fiir eine qualitative und nur etwa 40% ftir eine quantitative Auswertung durch Zell- zRhlungen brauehbar. In etwa 30% der Autoradiogramme war eine Markierung, d.h. ein Einbau der markierten Nucleinsiiure- vorliiufer DNS oder RNS der untersuchten Zellen nieht naehweisbar. Hierbei handelte es sieh fast ausschlieBlieh um Priiparate, in denen Schnitte besonders grosser Gewebsbr6ekel zur Untersuchung gekommen waren.

Die Eindringtiefe des Inkubationsmediums betrug etwa 200-300 mg, sie war umso gr6sser,

295

Page 2: Autoradiographische Untersuchungen des RNS- und DNS-Stoffwechsels in menschlichen Tumoren

296 W. Oehlert und R. Lesch

je lockerer die untersuchten Gewebe aufgebaut waren. Nur solche Pr~iparate, bei denen gr6sse- re Anteile markierte Zellen enthielten, sodaB Zellz~ihlungen durchffihrbar waren, konnten ffir eine quantitative Bestimmung des Markier- ungsindex herangezogen werden.

Das Markierungsmuster der Gewebe und Zellen entsprach bei den Inkubationsversuchen in jeder Hinsicht demjenigen, das nach parente- raler Applikafion yon 3H-Thymidin oder 3H-Cytidin im Tierversuch gefunden wird. So waren nach Inkubation mit 3H-Thymidin jeweils nur einzelne Zellkerne markiert. Die autoradiographischen Silberk6rner lagen dabei ausschlieBlich tiber dem Zellkern der markier- ten Zellen, wobei bei gfinstiger Schnittebene der Nucleolus unmarkiert innerhalb des mit Silberk6rnern bedeckten Caryoplasmas lag (Abb. la). Nach Inkubation mit sH-Cytidin, welches vorwiegend in die RNS eingebaut wird, beobachtet man eine Markierung aller Zellen im Bereiche der Eindringtiefe des Inkubations- mediums, wobei jedoch die Silberkorndichte fiber verschiedenen Zellarten auf ein und demselben Pr~iparat unterschiedlich war. Bei der yon uns gew~thlten Inkubationszeit yon 30 Min war nur der Zellkern mit Silberk6mern bedeckt, wobei jedoch im Gegensatz zur Markierung mit 8H-Thymidin die Silber- korndichte fiber dem Nucleolus gr6ger als fiber dem fibrigen Kernraum war (Abb. lb).

Bei der bisher durchgeffihrten autoradio- graphischen Untersuchung yon insgesamt 196 Biopsiepr~iparaten yon 110 Patienten nach 30 Min Inkubation in 8H-Thymidin oder 8H- Cb/tidin konnten wir Aufschlfisse fiber die Proliferationsrate bei verschiedenen Formen der Hyperplasie und Metaplasie des Bronchial- epithels und in Bronchuscarcinomen gewinnen.

Im normalen Bronchialepithel (Abb. 2) beobachtet man nut einige wenige markierte Zellkerne der sogenannten Ersatzzellen, die an der Basis des zum Teil mehrreihigen Zylinder- epithels liegen. Im sogenannten regeneratori- schen ~bergangsepithel des Bronchus, das h~iufig bei chronischen Bronchitiden zur Beobachtung kommt, bestand praktisch stets eine Vermehrung der D N S - - synthetisierenden Zellen, die nicht nut in der Basalzellschicht sondern auch in oberen Epithelschichten aufzufinden waren (Abb. 3). Das gleiche gait yon metaplastisch umgewandeltem Bronchial- epithel. Hier fanden sich stets zahlreiche Zellelemente markiert, die zum Teil im Stratum basale zum Teil aber auch in oberen Zellschich- ten lokalisiert waren (Abb. 4). Durch die Inkubation mit ~H-Thymidin konnte in einer ganzen Reihe von Bronchuscarcinomen die

Zahl DNS - - synthetisierender Zellen bestimmt werden. Sowohl im Plattenepithelcarcinom als auch im kleinzelligen Bronchuscarcinom wurde dabei im allgemeinen eine groBe Zahl D N S - synthetisierender Zellen aufgefunden (Abb. 5 und 6). Bei mehreren Carcinomen konnte durch eine quantitative Auswertung der Auto- radiogramme der Markierungsindex (Zahl der markierten Zellen pro Gesamtzellzahl) ermittelt werden. Unter Berficksichtigung dieser Werte und einer DNS - - Synthesezeit von 6 Stunden war es m6glich, die Generationszeit, d.h. die Wachstumsgeschwindigkeit derartiger Tumor- en abzusch~itzen.

Der R N S - Umsatz, gemessen am Einbau yon 8H-Cytidin, war im Tumorgewebe stets gr6sser als im normalen Bronchialepithel (Abb. 7).

~hnliche Untersuchungen wurden am gyn/ikologischen Abrasionsmaterial und an Portioexcisionen durchgeffihrt. Auch hier wurde mit zunehmender Entdifferenzierung des mehrschichtigen Plattenepithels der Portio eine Vermehrung DNS - - synthetisierender Zellen in allen Epithelschichten nachgewiesen.

BESPRECHUNG DER ERGEBNISSE

Sowohl das an Hand einiger Beispiele besprochene Einbaumuster der untersuchten Gewebe und Zellen nach Inkubation mit 3H-Thymidin und aH-Cytidin als auch das an anderer Stelle mitgeteilte Ergebnis von Ver- gleichsuntersuchungen (Oehlert, Lesch und D6rmer 1963) und die Versuchsergebnisse, die yon Herrn Rajewski in einem vorhergehenden Vortrag mitgeteilt wurden, dfirfen als Beweis daffir gelten, dab der autoradiographischen Schw~irzung in unseren Inkubationsversuchen ein Einbau von 8H-Thymidin in DNS bzw. eine Incorporation von 3H-Cytidin in RNS zugrunde liegen. Wir k6nnen also mit unseren Versuchen die im fiberlebenden menschlichen Gewebe auslaufenden Stoffwechselvorg/inge fassen, die uns Hinweise aufdie Verh~iltnisse in vivo geben k6nnen. Die von uns angewandte Technik mit kurzer Inkubafionszeit und schonender Behandlung der inkubierten Gewebe sowie mit verh~iltnism/iBig indifferentem Inkubations- medium bietet unseres Erachtens nach bessere Aussagem6glichkeiten als die von anderen Autoren angegebenen Verfahren. Bei diesen wurden relativ lange Inkubationszeiten, Kultur- medien, die ffir Gewebekulturen verwandt werden, bzw. nach Einfrieren dfinne Gewebs- scheiben verwandt (Wolberg und Brown [4]; Veenema, Fingerhut und Girgis [5]).

Page 3: Autoradiographische Untersuchungen des RNS- und DNS-Stoffwechsels in menschlichen Tumoren

Autoradiographische Untersuchungen des RNS- und DNS-Stoffwechsels in menschlichen Tumoren 297

Schwierigkeiten in der Auswertung der Ergebnisse bereitet die Tatsache, dab nur in einem Teil der untersuchten FMle so grosse Gewebsanteile in engen Kontakt mit dem Inkubationsmedium kommen, dab quantitative Aussagen fiber den Markierungsindex durch Zellziihlungen m6ghch sind. Durch sorgi'~dtiges Einblocken der inkubierten Gewebe in Paraffin und v611iges Aufschneiden in Serien wird man jedoch die Anzahl negativer Autoradiogramme gering halten k6nnen.

Soweit die bisher vorliegenden Ergebnisse eine Aussage fiber den Wert unserer Methode erlauben, kann man Folgendes sagen. Die Grenzen der autoradiographischen Untersuch- ungstechnik an inkubiertem menschlichem Gewebe werden durch die verh/fltnismiiBig geringe Eindringtiei~ des Inkubationsmediums in das zu untersuchende Gewebe gesteckt. Kleine Gewebsbr6ckel eignen sich besser als gr6ssere, zusammenhiingende Gewebspartien. Hierdurch werden sowohl die qualitative als auch die quantitative Auswertung der Auto- radiogramme erschwert und die Aussagem6g- lichkeiten eingeschr,Ankt. Trotz der genannten Nachteile sind von systematisch durchgefiihrten autoradiographischen Stoffwechseluntersuch- ungen bei entzfindlichen Prozessen, Pr~ican- cerosen und Carcinomen Aufschlfisse fiber die Vorstadien des Carcinoms beim Menschen und fiber die Wachstumsgeschwindigkeit bestimm- tar Tumoren zu erwarten.

Die autoradiographische Untersuchung am Inkubationsmaterial unter Verwendung von 3H-Thymidin erbringt Aufschlfisse fiber die Proliferafionsaktivit/it bestimmter menschlicher Gewebe und Tumoren, die welt tiber diejenigen hinausgehen, die mit Hilfe yon Mitoseziih- lungen erhalten werden k6nnen.

Die beschriebene Untersuchungsmethode kann vor allem bei der histologischen Beurteil- ung yon Katheterbiopsien und eventuell auch von Ausstrichpr/iparaten, von Spfilflfissigkeiten und Sputum erhebliche Bedeutung erlangen, wenn es gelingt, den Zeitraum zwischen Geweb- sentnahme und histologischer Untersuchung der Autoradiogramme entsprechend zu verkfirzen.

Die Inkubadon von Gewebsproben mit 14C-markiertem Thymidin statt des 3H-markier- ten Thymidin wtirde zum Einbau eines Beta- strahlers mit gr6sserer Reichweite ffihren und damit die M6glichkeit des leichteren Nach- weises der eingebauten Aktivit/it mit Hilfe des Z/ihlrohres geben. Unter diesen Voraussetzun- gen liesse sich dann eine Methodik entwickeln, welche den vollautomatischen Nachweis DNS --synthetisierender Zellen in einer grossen Zahl von Ausstrich-oder Abstrichpriiparaten gestattet. Dies wiederum wfirde dem Kliniker die schnelle und leichtere Anwendung zur Auswertung einer grossen Zahl yon cytologi- schen Priiparaten, wie sie bei routinem/issigen Untersuchungen in der Gynlikologie oder bei Sputumuntersuchungen anfallen, erm6glichen.

RESUME

Ayant examind, au moyen d'auto-radiographies, le mgtabolisme de I 'ADN et de I 'ARN d' environ 500 biopsies gyngcologiques et bronchiques, apr~s incubation in vitro de ceUes-ci, les auteurs discutent la valeur de cette mgthode.

Si l'on .y apporte certaines modifications, on peut s'attendre ~ obtenir de prgcieuses indications quant gl la tendance prolifgrative de diffdrents tissus au cours d'un prg-screening de grandes sgries de frottis cytologiques.

SUMMARY

RNA and DNA metabolism of about 500 human tissue specimens obtained by gynecological and bronchial biopsy has been studied by means of autoradiography after in vitro incuba- tion. The value of this method is discussed.

With suitable modifications, the method may be expected to give valuable information on cell proliferation in different tissues through pre-screening of large series of gynecological smears.

ZUSAMMENFASSUNG

dVach autoradiographischer Untersuchung zum DaVS- und RWS-Stoffwechsel von etwa 500 gyn~kologischen und bronchologischen Biopsien menschlichen Gewebes mit Hilfe der in vitro-Inkubation wird iiber den Wert dieser Methode berichtet.

Page 4: Autoradiographische Untersuchungen des RNS- und DNS-Stoffwechsels in menschlichen Tumoren

298 IV. OeMert und R. Lesch

Bei entsprechender Modifizierung sind wertvolle Hinweise auf die Proliferationstendenz verschiedenster Gewebe durch ein "praescreening" grosset Serien cytologischer A~striche ZU erwarten.

LITERATURVERZEICHNI8

1. W. OEI-ILERT, R. LESCH U. P. D6mt~l% Autoradiographische Untersuchungen des DNS- und RNS- Stoffwechsels an menschlichem Excisionsmaterial. dgaturwiss. 50, 713 (1963).

2. R. L~.SCH, W. SCHImSLE U. W. O~.HL~.RT, Autoradiographische Untersuchungen zur DNS.-- Synthese an menschlichem Excisionsmaterial aus dem Bronchial- baum. Bdtr. path. Anat. 129, 295 (1963/64).

3. O. Fr.TTm, U. W. O~HL~RT, Autoradiographische Untersuchungen der DNS- und Eiweil3-Neubildung im gyniikologischen Untersuchungsmaterial. Arch. Gyniikol. 199, 649 (1964).

4. W. H. Wolm~Ro u. R. R. BRowN, Autoradiographic Studies of In Vitro In- corporation of Uridine and Thymidine by Human Tumor Tissue. Cancer Res. 22~ 1113 (1962)

5. R . J . VEENEMA, B. FINOERHUT U. A. S. GIRots, A Possible Guide to Therapy of Bladder Tumors. 07. Urology 90~ 736 (1963).

Page 5: Autoradiographische Untersuchungen des RNS- und DNS-Stoffwechsels in menschlichen Tumoren

Abb. I. Autoradiogramme von <ellen aus einem nicht verhornenden Plattene~ithelcarcinom des Bronchus, 30 Minutes nach Inkubation (a) mit 3H-Thymidin: AusschlieJBliche Markierung des zellkernes mit Aussfiarung des Jvucleolus; (b) mit 3H-Cytidin: Fast ausschlieJliche Markierung des <ellkernes, griiJte Silberkorndichte iiber dem Nucleolus (Hiimatoxylin-Eosin, Emulsion IEford G5, Belichtung 10 Tage,

1600 x )

(to face p. 298) Refer to p. 296

Page 6: Autoradiographische Untersuchungen des RNS- und DNS-Stoffwechsels in menschlichen Tumoren

Abb. 2. Autoradiogramm eines normalen Bronchialepithels mit DNS - synthetisierenden Ersatzzellen. 30 Minuten nach Inkubation mit 3H- Thymidin (Hamatoxylin-Eosin, Emulsion Il$ord G5, Belichtung

10 Tage, 360 x )

Abb. 3. Autaradiogramm eines regeneratorischen iibergangsefiithels des Bronchus mit rahlreichen DNS - synthetisierenden <ellen in mittleren zellagen, keine Mitosen nachweisbar. 30 Minuten nach Inkubation

mit aH- Thymidin. (Hiimatoxylin-Eosin, Emulsion Ilford G5, Belichtung 10 Tage, 250 x )

Page 7: Autoradiographische Untersuchungen des RNS- und DNS-Stoffwechsels in menschlichen Tumoren

Abb. 4. Autoradiogramm ekes metaplastisch umgewandelten Bronchialepithels; zahlreiche DNS - synthetisierende zellen in Stratum basale und oberen zellagen. 30 Minuten nach Inhubation mit

oH- Thpidin. (Hiimatoxylin-Eosin, Emulsion Iford G.5, Belichtung 10 Tage, 360 x )

Abb. 5. Autoradiogramm ekes Plattenepithelcarcinoms des Bronchus mit zahlreichen unregelmiissig verteilten D3VS - synthetisierenden <ellen. 30 Minuten nach Inkubation mit 3H- Thymidin. (Hiimatoxylin

Eosin, Emulsion IFord G5, Belichtung 10 l-age, 460 x )

Page 8: Autoradiographische Untersuchungen des RNS- und DNS-Stoffwechsels in menschlichen Tumoren

Abb. 6. Autoradiogramm eines kleinzelligen Bronchuscarcinom; zahlreiche unregelmijig uerteilte DNS

- synthetisierende zellen. 30 Minuten nach Inhubation mit 3H- Thymidin. (Hiimatoxylin-Eosin, Emulsion Ilfird G5, Belichtung 10 Tage, 150 x )

Abb. 7. Autoradiogramm eines ~ellverbandes eines kleinzelligen Bronchuscarinoms; starke R.NS - .Neubildung in Carcinomrellen, geringere in meseruhymalen /zellen der Umgebung. 30 Mtnuten nach

Inhubation mit 3HXytidin. (Hiimatoxylin-Eosin, Emulsion Ilford G5, Belichtung 10 Tage, 320 x )