BACTOTYPE PCR Amplification Kit Clostridium perfringens ...€¦ · BACTOTYPE® PCR Amplification Kit Clostridium perfringens Gebrauchsanweisung Technologie Die Produktgruppe BACTOTYPE®

BACTOTYPE® PCR Amplification Kit Clostridium perfringens

Gebrauchsanweisung Technologie Die Produktgruppe BACTOTYPE® PCR Amplification Kit umfasst optimierte Systeme zum Nachweis von pathogenen Bakterien mittels Polymerasekettenreaktion (PCR):

Hohe Sensitivität und Spezifität: Alle Komponenten sind genauestens aufeinander abgestimmt Einfache und praktikable Anwendung: Die Reagenzien sind inklusive Gel-Beladungspuffer vorpipettiert

Zuverlässige Ergebnisse: Das Testkit enthält eine interne Amplifikationskontrolle

Die Primer des Testkits sind spezifisch für sechs verschiedene Toxin-Genfragmente von Clostridium perfringens. Das PCR-Produkt wird auf einem herkömmlichen Agarosegel ausgewertet. Die ready-to-load Reagenzien erlauben eine direkte Auftragung auf das Gel ohne Zugabe von Gel-Beladungspuffer. Falsch-negative Ergebnisse werden durch eine interne Amplifikationskontrolle minimiert. Der Arbeitsaufwand im Labor reduziert sich damit auf ein Minimum. Mit Ausnahme der Taq DNA Polymerase enthält das Testkit alle benötigten Reagenzien.

Nur für Forschungszwecke geeignet // Stand 08/2012 Pathogener Erreger Clostridium perfringens ist ein in der Umwelt weit verbreiteter Erreger, der durch seine Toxinbildung gastroenterale Erkrankungen bei Menschen, Haus- und Wildtieren hervorruft. C. perfringens wird in fünf verschiedene Toxintypen (A–E) klassifiziert, die auf Produktion der Majortoxine α, β, ε und ι basieren. Einige Stämme erzeugen zusätzliche Toxine, die bei Menschen (cpe, Enterotoxin) Lebensmittelvergiftungen und bei Pferden, Schweinen, Hunden und Kälbern (cpb2+, β2-Toxin) ebenfalls Vergiftungserscheinungen hervorrufen. Der Nachweis der verschiedenen Toxintypen ist wichtig für ein besseres Verständnis der Epidemiologie von C. perfringens. Das BACTOTYPE® PCR Amplification Kit Clostridium perfringens ersetzt die Einteilung der Toxintypen durch ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) und ermöglicht, alle Toxintypen in einem Ansatz mittels Multiplex-PCR nachzuweisen. Der Prozess der DNA Isolation entfällt, da eine hitzebehandelte Bakteriensuspension direkt für die PCR verwendet wird. Bestellinformation

BACTOTYPE® Clostridium perfringens 10 Reaktionen Artikelnummer 21-17615-0010

BACTOTYPE® Clostridium perfringens 50 Reaktionen Artikelnummer 21-17615-0050

Biotype Diagnostic GmbH – Moritzburger Weg 67 – D-01109 Dresden – Germany Phone +49-351-8838400 – Fax +49-351-8838403 – [email protected] – www.biotype.de

Clostridium perfringens – 2 – 09/2012

Inhalt

10 Reaktionen 50 Reaktionen

PCR Mix (gelbe Verschlusskappe) PCR Puffer, dNTPs, Primergemisch (speziesspezifisch und Amplifikationskontrolle), DNA für Amplifikationskontrolle, NaN3

221 μL 935 μL

Magnesiumchlorid (grüne Verschlusskappe) MgCl2, Gel-Beladungspuffer 80 μL 300 μL

Positivkontrolle I (rote Verschlusskappe) nicht-infektiöse DNA mit erregerspezifischen Sequenzen (cpa, cpb, iap), NaN3

25 μL 25 μL

Positivkontrolle II (rote Verschlusskappe) nicht-infektiöse DNA mit erregerspezifischen Sequenzen (cpe, etx, cpb2), NaN3

25 μL 25 μL

Nuklease-freies Wasser (blaue Verschlusskappe) 1.0 mL 1.0 mL Lagerung Die Reagenzien zur Amplifikation sollten im Dunkeln bei -20°C gelagert werden. Bei vorschriftsmäßiger Lagerung ist das Testkit mindestens 12 Monate haltbar. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren sollte vermieden werden. Zusätzlich benötigte Reagenzien - Taq DNA Polymerase BACTOTYPE® Testkits werden mit der JumpStart™ Taq DNA Polymerase (Sigma-Aldrich, Art. Nr. D4184) validiert. Nur

bei Verwendung dieser Polymerase garantieren wir eine optimale Funktion der BACTOTYPE® Produkte. Für Bestellungen oder weitere Informationen zu der o.g. Taq Polymerase kontaktieren Sie bitte Sigma-Aldrich.

- Agarose und Ethidiumbromid (für Gelelektrophorese) - 100 bp DNA Leiter (für Gelelektrophorese) Warenzeichen und Patente - BACTOTYPE® ist ein eingetragenes Warenzeichen der Biotype Diagnostic GmbH. - JumpStart™ ist ein eingetragenes Warenzeichen von Sigma-Aldrich. - Die PCR ist patentrechtlich geschützt. Patentinhaber sind die Firmen Hoffmann-La Roche Inc. und F. Hoffmann-La Roche

(Roche).



Produktgarantie Der gesamte Inhalt des BACTOTYPE® Amplification Kit wurde einer intensiven Qualitätssicherung durch die Biotype Diagnostic GmbH unterzogen. Bitte melden Sie jedes aufgetretene Problem. Hinweise Die Einhaltung dieses Protokolls ist unbedingt erforderlich! Um Kontaminationen jeglicher Art auszuschließen, empfehlen wir alle Pipettiervorgänge mit gestopften Pipettenspitzen durchzuführen. DNA Probenvorbereitung, Amplifikation und Elektrophorese sollten in getrennten Räumlichkeiten stattfinden. Beachten Sie die Sicherheitsbestimmungen für das Arbeiten in Laboratorien und tragen Sie Handschuhe. Der PCR Mix und die Positivkontrolle enthalten Natriumazid (NaN3). Natriumazid ist ein Gefahrstoff: Sehr giftig beim Verschlucken, entwickelt bei Berührung mit Säure sehr giftige Gase (R28-32-50/53, S1/2- 28-45-60-61). Ebenso ist Ethidiumbromid ein Gefahrstoff. Bitte lesen Sie das entsprechende Sicherheitsdatenblatt und tragen Sie Nitrilhandschuhe. Für BACTOTYPE® Komponenten sind die Sicherheitsdatenblätter bei der Biotype Diagnostic GmbH erhältlich. Für Sicherheitsdatenblätter von Reagenzien, die nicht im Testkit enthalten sind, kontaktieren Sie bitte den jeweiligen Hersteller. Bakterien-Anreicherung Inkubieren Sie das Untersuchungsmaterial (Kotproben z. B. vom Hund) auf für die Clostridienanzüchtung geeigneten Nährboden (anaerobe Bebrütung) für 24 h bei 37°C. Aus dieser Kultur wird der Zellaufschluss durchgeführt. Zellaufschluss Nehmen Sie mit einer sterilen Impföse eine Bakterienkolonie auf und suspendieren Sie diese in 25 μL steriles Aqua dest. (1,5 mL Reaktionsröhrchen). Inkubieren Sie die Suspension für 15 min bei 98°C und anschließend direkt auf Eis. Diese hitzebehandelte Bakteriensuspension ist für die PCR zu verwenden.



Protokoll Vorbereitung der Reagenzien: Vor Verwendung der Reagenzien empfehlen wir, alle Röhrchen zu vortexen und ca. 5 s bei 3000 U/min zu zentrifugieren. Die blaue Farbe in der Magnesiumchlorid-Lösung ist durch den Gel-Beladungspuffer bedingt. Das PCR-Ergebnis wird hierdurch nicht beeinflusst. Vermeiden Sie zu intensives Zentrifugieren der Magnesiumchlorid-Lösung, das zu einer Aufkonzentrierung des Gel-Beladungspuffers im unteren Bereich des Röhrchens führen kann. 1. A) PCR Protokoll bei einer Probenanzahl ungleich der Verpackungseinheit (Multiplikator) Sollte die Probenanzahl kleiner als die der Verpackungseinheit des Testkits sein, so pipettieren Sie wie folgt in ein PCR-Gefäß (siehe auch Pipettierschema Tabelle 1):

17.0 μL PCR Mix + 4.5 μL Magnesiumchlorid + 0.6 μL Nuklease-freies Wasser + 0,4 μL Taq DNA Polymerase (hier: JumpStart™ 2.5 U/ μL)

- Pipettieren Sie von diesem Master-Mix 22.5 μL in ein PCR-Gefäß und fügen 2.5 μL der hitzebehandelten Bakteriensuspension bzw. der Kontrolle hinzu. - Hinweis: Das Reaktionsvolumen sollte immer in Abhängigkeit der verwendeten Taq Polymerase mit Nuklease-freiem Wasser auf 25 μL aufgefüllt werden.

1. B) PCR Protokoll bei einer Probenanzahl entsprechend der Verpackungseinheit Sollte Ihre Probenanzahl der Verpackungseinheit des Testkist entsprechen, empfehlen wir die direkte Zugabe von Magnesiumchlorid, Nuklease-freiem Wasser und Taq DNA Polymerase zum PCR Mix.

Für 10 Proben (entsprechend der Verpackungseinheit von 10 Reaktionen) PCR Mix + 58.5 μL Magnesiumchlorid + 7.8 μL Nuklease-freies Wasser + 5.2 μL Taq DNA Polymerase (hier: JumpStart™ 2.5 U/μL) Für 50 Proben (entsprechend der Verpackungseinheit von 50 Reaktionen) PCR Mix + 247.5 μL Magnesiumchlorid + 33 μL Nuklease-freies Wasser + 22 μL Taq DNA Polymerase (hier: JumpStart™ 2.5 U/μL)

- Pipettieren Sie von diesem Master-Mix 22.5 μL in ein PCR-Gefäß und fügen 2.5 μL der hitzebehandelten Bakteriensuspension bzw. der Kontrolle hinzu. 2. Positivkontrolle Im Testkit sind zwei gebrauchsfertige Positivkontrollen (rote Verschlusskappen) enthalten, die neben den DNA Proben stets mitgeführt werden sollten. Hierbei handelt es sich um nicht-infektiöse DNA mit erregerspezifischen Sequenzen (Positivkontrolle I: cpa, cpb, iap bzw. Positivkontrolle II: cpe, etx, cpb2 ). 3. Negativkontrolle Neben den DNA Proben sollte stets eine Negativkontrolle (z. B. Nuklease-freies Wasser) mitgeführt werden.



Tabelle 1: Pipettierschema

Probe (x1) Positivkontrolle I Positivkontrolle II PCR Kontrolle

PCR Mix 17.0 μL 17.0 μL 17.0 μL 17.0 μL

Magnesiumchlorid 4.5 μL 4.5 μL 4.5 μL 4.5 μL

DNA Proben 2.5 μL - - -

Positivkontrolle I und II - 2.5 μL 2.5 μL -

Nuklease-freies Wasser 0.6 μL 0.6 μL 0.6 μL 3.1 μL

Taq DNA Polymerase (1 U) * 0.4 μL 0.4 μL 0.4 μL 0.4 μL * 1 Unit pro Amplifikation verwenden (hier: JumpStart™ 2.5 U/μL). Die Menge der einzusetzenden DNA richtet sich nach ihrer Konzentration und kann zwischen 1 und 3 μL variiert werden. Die Menge an Nuklease-freiem Wasser ist entsprechend zu korrigieren, so dass das Gesamtvolumen des PCR-Ansatzes immer 25 μL beträgt. PCR Amplifikationsparameter Wir empfehlen unbedingt die Verwendung der Sigma JumpStart™ Taq DNA Polymerase. Temperatur Zeit

94°C 3 min Hot Start*

94°C 60 s

55°C (RAMPING 1°C/s**)

60 s

72°C 60 s

35 Zyklen

72°C 5 min

10°C ∞ Bis zum Ende

* Bei der Verwendung von „hot start“-Polymerasen sollten die vom Hersteller vorgegebenen Aktivierungszeiten eingehalten werden (für JumpStart™ Taq DNA Polymerase: 3 min). ** Dieser Wert ist bei den Thermocyclern gerätespezifisch einzustellen. Eine Kontrolle und ggf. Korrektur wird empfohlen. 4. Elektrophorese Die Analyse der PCR-Produkte erfolgt mit einem 2%igen Agarosegel und Anfärbung mit Ethidiumbromid (0.5-1.0 μg/mL) in TAE-Puffer. 10 μL des PCR-Ansatzes werden pro Bahn aufgetragen. Die Zugabe von Gel-Beladungspuffer entfällt, da dieser bereits im Master-Mix enthalten ist. Zum Größenvergleich wird ein Längenstandard im niedermolekularen Bereich empfohlen (100 bp DNA Leiter). Die Elektrophorese sollte gerätespezifisch durchgeführt werden.



5. Auswertung und Interpretation der Ergebnisse Die Größe der Amplifikate wird durch Vergleich mit dem DNA-Längenstandard bestimmt. Eine Fotodokumentation ist für Archivierungszwecke empfehlenswert. Schützen Sie Augen und Haut vor UV-Bestrahlung!

Positives Ergebnis: Der Toxintyp wird durch die Majortoxine bestimmt. Die Minortoxine können bei

verschiedenen Toxintypen auftreten. Anhand des Bandenmusters im Gel kann der Toxintyp der Tabelle entnommen werden. Andere Kombinationen von Major- und Minortoxinen sind möglich

Toxintyp Majortoxine Minortoxine (Beispiele)

Spur in Abbildung

A cpa (α-Toxin) 2

B cpa (α-Toxin); cpb (β-Toxin);

etx (ε-Toxin) 3

C cpa (α-Toxin); cpb (β-Toxin) cpb2+ (β2-Toxin) 4

D cpa (α-Toxin); etx (ε-Toxin) cpe (Enterotoxin) 5

E cpa (α-Toxin); iap (ι-Toxin) 6

A cpa (α-Toxin) cpe (Enterotoxin) 7

Negatives Ergebnis: Ist nur die Bande von 112 bp (Amplifikationskontrolle) sichtbar, ist das Resultat negativ. Ungültiges Ergebnis: Sollte keine der oben genannten Banden erkennbar sein, ist der Test nicht auswertbar

und muss wiederholt werden. Möglicherweise wurde die PCR inhibiert.

Spur 1: 100 bp DNA Leiter (Invitrogen) Spur 2-7: Beispiele verschiedener Toxintypen (siehe Tabelle) Spur 8: Positivkontrolle I (cpa, cpb, iap) Spur 9: Positivkontrolle II (cpe, etx, cpb2+) Spur 10: nur Amplifikationskontrolle sichtbar (112 bp); DNA Probe negativ

Bitte fragen Sie uns, wenn Sie weitere Informationen wünschen.

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BACTOTYPE® PCR Amplification Kit Clostridium perfringens Manual Technology The product group BACTOTYPE® PCR Amplification Kit comprises optimised systems for the identification of bacterial pathogens via polymerase chain reaction (PCR):

Highest sensitivity and specificity: All components are carefully developed and perfectly optimised

Easy and comfortable work: The reagents are ready-to-use and ready-to-load

Reliable results: The test kit contains an internal amplification control The primer pair of the test kit is specific for six different toxin gene fragments of Clostridium perfringens. PCR products are analysed on a conventional agarose gel. The ready-to-load reagents allow direct loading of the samples on the gel without addition of gel loading buffer. False negative results are minimized by using an internal amplification control. Manual work is reduced to a minimum. With exception of Taq DNA Polymerase, the test kit consists of all reagents necessary for the detection of the bacterial germs.

For research use only // 08/2012 Pathogenic Germ Clostridium perfringens is a widespread pathogenic bacterium which causes enteric diseases in humans, domestic and wild animals due to its toxin production. C. perfringens is classified in five different types of toxin (A–E) that based on the production of the major toxins α, β, ε, and ι. Some strains are able to induce additional toxins causing intestinal disorders in humans (cpe, enterotoxin) or horses, piglets, dogs, and calves (cpb2+, β2-toxin). The detection of different toxin types is essential for a better understanding of the epidemiology of C. perfringens. BACTOTYPE® PCR Amplification Kit Clostridium perfringens substitutes subtyping of the toxin types via ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays) and is able to identify all genotypes of the toxins in one optimised multiplex PCR without prior DNA purification. Simply use a heat lysed bacterial suspension of the cultured isolates. Ordering Information

BACTOTYPE® Clostridium perfringens 10 Reactions Cat. No. 21-17615-0010

BACTOTYPE® Clostridium perfringens 50 Reactions Cat. No. 21-17615-0050



Content

10 reactions 50 reactions

PCR Mix (yellow cap) PCR buffer, dNTPs, primer mix (species-specific and amplification control), DNA for amplification control, NaN3

221 μL 935 μL

Magnesium Chloride (green cap) MgCl2, gel loading buffer 80 μL 300 μL

Positive Control I (red cap) non-infectious DNA with germ-specific sequences (cpa, cpb, iap), NaN3

25 μL 25 μL

Positive Control II (red cap) non-infectious DNA with germ-specific sequences (cpe, etx, cpb2), NaN3

25 μL 25 μL

Nuclease-free Water (blue cap) 1.0 mL 1.0 mL Storage Conditions Reagents of the test kit are stable for at least 12 months when stored at -20 °C in darkness. Repeated freezing and thawing should be avoided. Additionally Reagents - Taq DNA Polymerase BACTOTYPE® test kits are validated with JumpStart™ Taq DNA Polymerase (Sigma-Aldrich, Cat. No. D4184). Solely, the

use of this DNA Polymerase assures precise function of the BACTOTYPE® products. For ordering and further information, please contact Sigma-Aldrich.

- Agarose and Ethidium bromide (for gel electrophoresis) - 100 bp DNA ladder (for gel electrophoresis) Trademarks and Patents - BACTOTYPE® is a registered trade mark of the Biotype Diagnostic GmbH. - JumpStart™ is a registered trademark of Sigma-Aldrich. - The PCR is under patent laws. Patentees are Hoffmann-La Roche Inc. and F. Hoffmann-La Roche (Roche).



Product Warranty All contents of the BACTOTYPE® PCR Amplification Kit are subjected to extensive quality procedures by Biotype Diagnostic GmbH. In case of any problem, please report immediately. Notes Please, carry out precisely the instructions of the protocol! In order to avoid any kind of contamination we recommend pipetting with filter tips. DNA preparation, amplification, and electrophoresis should be carried out in separate rooms. Take note of safety regulations for working in laboratories, and wear gloves. The PCR Mix and the Positive Control contain sodium azide (NaN3). Sodium azide is hazardous: Very toxic if swallowed, develops toxic gases when it gets in contact with acids (R28-32-50/53, S1/2-28-45-60-61). Ethidium bromide is hazardous, too. Please refer to the Material Safety Data Sheet (MSDS) and wear nitrile gloves. MSDS of all BACTOTYPE® components are available from Labor Diagnostic Leipzig. For MSDS of additional reagents to be needed, please contact the corresponding manufactures. Culturing of Bacteria Incubate the sample material (faeces e.g. from dogs) on agar plates suitable for Clostridia (anaerobic conditions) at 37°C for at least 24 h. Use these samples for cell lysis. Cell Lysis Resuspend a bacterial colony with a sterile tip in 25 μL sterile Aqua dest. (1.5 mL reaction tube). Incubate the suspension at 98°C for 15 min and transfer the tube on ice. Use the heat-treated suspension for PCR.



Protocol Preparation of the reagents: Before using the reagents of the test kit the first time, mix thoroughly and centrifuge the reagents for 5 sec at 3000 rpm. The blue colour in the magnesium chloride solution arises from the gel loading buffer and does not affect the PCR reaction. Please, avoid elongated centrifugation steps of the magnesium chloride solution. The gel loading buffer could be concentrated onto the bottom of the tube. 1. A) PCR Protocol for a Number of Samples different from the Packaging Unit (Multiplicator) If there are less samples than the packaging unit, pipette as followed into a PCR reaction tube (also see pipetting scheme table 1): 17.0 μL PCR Mix + 4.5 μL Magnesium Chloride + 0.6 μL Nuclease-free Water + 0.4 μL Taq DNA Polymerase (here: JumpStart™ 2.5 U/μL) - Pipet 22.5 μL of the master mix into a PCR reaction tube and add 2.5 μL of your DNA sample or control. - Attention: Depending on the used Taq Polymerase, complete with Nuclease-free Water to a total volume of 25 μL per

reaction.

1. B) PCR protocol for an Amount of Samples corresponding to Packaging Unit If the number of samples corresponds to the packaging unit, we recommend the addition of Magnesium Chloride, Nuclease-free Water, and Taq DNA Polymerase directly to the PCR Mix. For 10 samples (corresponding to the content of 10 reactions) PCR Mix + 58.5 μL Magnesium Chloride + 7.8 μL Nuclease-free Water + 5.2 μL Taq DNA Polymerase (here: JumpStart™ 2.5 U/μL)

For 50 samples (corresponding to the content of 50 reactions) PCR Mix + 247.5 μL Magnesium Chloride + 33 μL Nuclease-free Water + 22 μL Taq DNA Polymerase (here: JumpStart™ 2.5 U/μL) - Pipet 22.5 μL of the master mix into a PCR reaction tube and add 2.5 μL of your DNA sample or control. 2. Positive Control The test kit is provided with two ready-to-use Positive Controls (red caps) of non-infectious DNA with germ-specific sequences (Positive Control I: cpa, cpb, iap or Positive Control II: cpe, etx, cpb2). We strongly recommend performing positive controls for each run. 3. Negative Control It is strongly recommended to perform a negative control (e. g. Nuclease-free Water) for each run.



Table 1: Pipetting Scheme

Sample (x1) Positive Control I Positive Control II PCR Control

PCR Mix 17.0 μL 17.0 μL 17.0 μL 17.0 μL

Magnesium Chloride 4.5 μL 4.5 μL 4.5 μL 4.5 μL

Sample DNA 2.5 μL - - -

Positive Control I and II - 2.5 μL 2.5 μL -

Nuclease-free Water 0.6 μL 0.6 μL 0.6 μL 3.1 μL

Taq DNA Polymerase (1 U) * 0.4 μL 0.4 μL 0.4 μL 0.4 μL

* Use 1 Unit for amplification (here: JumpStart™ 2.5 U/μL). The volume of the DNA to be employed depends on its concentration and may be varied from 1 to 3 μL. Adjust the volume with Nuclease-free Water to a reaction volume of 25 μL in total.

PCR Amplification Parameters We strongly recommend the use of Sigma JumpStart™ Taq DNA Polymerase.

Temperature Time

94°C 3 min Hot Start*

94°C 60 s

55°C RAMPING 1°C/s**

60 s

72°C 60 s

35 Cycles

72°C 5 min

10°C ∞ hold

* For ”hot start“ Polymerase, please follow the activation time conditions specified by the manufacturer (for JumpStart™ Taq DNA Polymerase: 3 minutes).

** The value is adjusted for most of the thermocyclers. Cyclers that exceed the ramping rate should be monitored and corrected as required.

4. Electrophoresis PCR fragments are analysed on a 2% agarose gel and staining is done with ethidium bromide (0.5-1.0 μg/mL) in TAE buffer. Put 10 μL of the PCR product per lane onto the gel (gel loading buffer already included). In order to compare the molecular size of the amplification products a size standard (100 bp DNA ladder) is recommended. Run the electrophoresis as described in the manufacturer’s handbook.



5. Analysis and Interpretation of the Results Size designation of the PCR fragments is done by comparison with the DNA size standard on a transilluminator. Photographic documentation is recommended. Protect eyes and skin against UV-radiation! Positive result: The type of toxin is determined by the strain’s major toxin. Minor toxins occur in several toxin

producing strains. Based on the kind of PCR amplification products the type of toxins can be determined with the table below. Please note: Further combinations of Major and Minor Toxins are possible.

Negative result: If the 112 bp band (amplification control) appears only, germ detection is considered to be

negative. Invalid result: If none of the bands mentioned above are detectable, the assay is invalid and has to be repeated.

Possibly, the PCR has been inhibited.

Lane 1: 100 bp DNA ladder (Invitrogen) Lane 2-7: examples of different toxin types (see table) Lane 8: Positive Control I (cpa, cpb, iap) Lane 9: Positive Control II (cpe, etx, cpb2+) Lane 10: only the amplification control is visible (112 bp); sample is negative

Please contact us for further information.

Toxin Type Major Toxins Minor Toxins (examples) Lane in Figure

A cpa (α-Toxin) 2

B cpa (α-Toxin); cpb (β-Toxin);

etx (ε-Toxin) 3

C cpa (α-Toxin); cpb (β-Toxin) cpb2+ ( β2-Toxin) 4

D cpa (α-Toxin); etx (ε-Toxin) cpe (Enterotoxin) 5

E cpa (α-Toxin); iap (ι-Toxin) 6

A cpa (α-Toxin) cpe (Enterotoxin) 7

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