Bakterielle Phospholipid N-Methyltransferasen ... · benim hep yanimdaydin bunun icin sana tesekkür etmek istiyorum! Herrn Dr. Bernd Masepohl für seine stete Hilfsbereitschaft und

Fakultät für Biologie und Biotechnologie Lehrstuhl für Biologie der Mikroorganismen

Bakterielle Phospholipid N-Methyltransferasen: Charakterisierung enzymatischer

Eigenschaften und Substratspezifitäten

Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie und Biotechnologie der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt am

Lehrstuhl für Biologie der Mikroorganismen

vorgelegt von

Jan Gleichenhagen

aus

Essen

Referent: Prof. Dr. Franz Narberhaus Korreferent: Prof. Dr. Eckhard Hofmann

Bochum, 2012

Department for Biology and Biotechnology Microbial biology

Bacterial phospholipid N-methyltransferases: Characterisation of enzymatic properties and

substrate specificity

Dissertation to obtain the degree Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.) at the Faculty of Biology and Biotechnology

International Graduate School of Biosciences Ruhr-University Bochum

Department of Microbial Biology

submitted by

Jan Gleichenhagen

from

Essen

Referent: Prof. Dr. Franz Narberhaus Korreferent: Prof. Dr. Eckhard Hofmann

Bochum, 2012

Meinen Dank…

meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Franz Narberhaus für seine fortwährende

Unterstützung, die zahlreichen Anregungen und vielen Ideen, die zur Durchführung

und zum stetigem Fortgang dieser Arbeit beigetragen haben.

Herrn Prof. Dr. Eckhard Hofmann für seine Unterstützung, die stete Diskussions-

bereitschaft und die Übernahme des Zweitgutachtens.

Frau Prof. Dr. Nicole Frankenberg-Dinkel für die vielen Anregungen und Vorschläge

bei biochemischen Fragestellungen.

Frau Dr. Meriyem Aktas für die vielen konstruktiven Diskussionen, die Unterstützung

und Hilfe nicht nur in wissenschaftlichen Fragen: Benim sana ihtiyacim oldugunda

benim hep yanimdaydin bunun icin sana tesekkür etmek istiyorum!

Herrn Dr. Bernd Masepohl für seine stete Hilfsbereitschaft und hilfreichen

Ratschläge.

Frau Dr. Holländer-Czytko für die freundliche Unterstützung bei den radioakiven

Bindestudien und ihre Diskussionsbereitschaft.

Michael Schäkermann, Kai Westphal und Roman Moser für die stete Hilfs- und

Diskussionsbereitschaft und für die unterhaltsame Abwechslung neben dem

Laboralltag.

Christiane Fritz für die tatkräftige Unterstützung im Labor in der Endphase meiner

Arbeit.

„meinen“ Bachelorstudenten Linna M. Danne und Christian Harak für die gute

Zusammenarbeit und ihren Anteil an dieser Arbeit.

allen übrigen Mitarbeitern des Lehrstuhls für ein angenehmes Arbeitsklima und gute

Zusammenarbeit.

all meinen Freunden für ihr Verständnis in den letzen Jahren und die moralische

Unterstützung.

meinen Eltern und meiner Schwester, die mich immer unterstützt haben und zu mir

standen. Ohne Euch wäre ich nicht da, wo ich jetzt bin!

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

1.1 Lipide und Membranen 1

1.1.1 Lipide 1

1.2 Die Bedeutung von Phosphatidylcholin 5

1.2.1 Vorkommen und Bedeutung von Phosphatidylcholin 5

1.2.2 PC-Biosynthese in Eukaryoten 5

1.2.3 Bedeutung von PC für Bakterien-Wirts-Interaktionen 9

1.2.4 PC-Biosynthese in Prokaryoten 10

1.2.5 Die Phospholipid N-Methyltransferase PmtA aus Agrobacterium

tumefaciens 14

1.3 S-Adenosylmethionin-abhängige Methyltransferasen 16

1.3.1 S-Adenosylmethionin 16

1.3.2 Strukturelle Merkmale SAM-abhängiger Methyltransferasen 16

1.3.3 SAM-Bindemotive 18

1.4 Zielsetzung 21

2. Material und Methoden 22

2.1 Verwendete Stämme 22

2.2 Plasmide 22

2.3 Oligonukleotide 24

2.4 Anzucht von Bakterien 26

2.4.1 Nährmedien 26

2.4.2 Anzucht von Escherichia coli 27

2.4.3 Messung der optischen Dichte 27

2.5 Molekularbiologische Methoden 28

2.5.1 Isolierung von Plasmid-DNA 28

2.5.2 Hydrolytische Spaltung von DNA durch Restriktions-

endonukleasen 29

2.5.3 Agarose-Gelelektrophorese 29

Inhaltsverzeichnis

II

2.5.4 Amplifikation von DNA mittels Polymerasekettenreaktion und

ortsspezifische Mutagenese 30

2.5.5 Herstellen transformationskompetenter Zellen 32

2.5.6 Transformation 32

2.5.7 DNA-Konzentrationsbestimmung 33

2.6 Herstellung von Liposomen und Micellen 34

2.6.1 Herstellung von Liposomen 34

2.6.2 Herstellung von Mizellen 34

2.7 Proteinbiochemische Methoden 35

2.7.1 Überexpression rekombinanter Proteine in E. coli BL21(DE3) 35

2.7.2 Zellaufschluss und Gewinnung von Rohextrakt 35

2.7.3 Reinigung rekombinanter Proteine mittels Ni-IDA-Affinitäts-

chromatographie 36

2.7.4 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 36

2.7.5 Proteinkonzentrationsbestimmung 39

2.7.6 Umpufferung und aufkonzentrieren von Proteinen 39

2.7.7 Größenausschlusschromatographie 39

2.7.8 In vitro-Aktivitätsassay 40

2.7.9 S-Adenosylmethionin-Bindestudien 40

2.7.10 Circular Dichroismus-Spektroskopie (CD-Spektroskopie) 41

2.7.11 Tryptophanfluoreszenzmessung 42

2.7.12 Fluoreszenzmessung mit Hilfe von Fluorescein-

Phosphatidylethanolamin 43

2.7.13 Protein-Lipid-Overlay-Assay 44

2.7.14 Limitierte Proteolyse 45

2.7.15 Tryptischer Verdau im Gel und Massenspektrometrie 45

2.8 Lipidanalytik 47

2.8.1 Lipidextraktion 47

2.8.2 Dünnschichtchromatographie (DC) 47

2.9 Chemikalienliste 49

2.10 Geräteliste 50

2.11 Software - / Linkliste 51

Inhaltsverzeichnis

III

3. Ergebnisse 52

3.1 SAM-Bindeeigenschaften der Phospholipid N-

Methyltransferase aus Agrobacterium tumefaciens 52

3.1.1 Bioinformatische Identifizierung putativer SAM-Bindemotive in

PmtA 52

3.1.2 Einfluss von Punktmutationen in putativen SAM-Bindemotiven

auf die PmtA-Aktivität 54

3.1.3 Beeinflussen die Punktmutationen die Faltung von PmtA-

Derivaten? 55

3.1.4 SAM-Bindefähigkeit von PmtA und PmtA-Derivaten 57

3.2 Einfluss der Membranlipidzusammensetzung auf die

Aktivität und Membranbindung von PmtA 60

3.2.1 Negativ geladene Lipide stimulieren die PmtA-Aktivität 60

3.2.2 Haben anionische Lipide einen Einfluss auf die SAM-Bindung

von PmtA? 62

3.2.3 Substratspezifität von PmtA 64

3.2.4 Beeinflussen PC-Analoga/Derivate die PmtA-Aktivität? 66

3.2.5 Rekrutierung von PmtA zur Membran via elektrostatischer

Interaktionen 68

3.2.6 Etablierung von verschiedenen Methoden zur quantitativen und

qualitativen Analyse der Lipid-Bindeeigenschaften von PmtA 73

3.2.7 Limitierte Proteolyse von PmtA in Gegenwart von

Modellmembranen 73

3.2.8 Massenspektrometrische Analyse der PmtA-Fragmente 76

3.2.9 CD-spektroskopische Analyse von PmtA in Gegenwart von

verschiedenen Lipiden 78

3.2.10 Analyse der Lipidbindeeigenschaften von PmtA mittels

Fluorescein-Phosphatidylethanolamin 82

3.2.11 Tryptophanfluoreszenzspektroskopie zur Analyse der

Lipidinteraktion von PmtA 86

3.2.12 Bioinformatische Analyse putativer Lipidbindestellen in PmtA 89

3.2.13 Einfluss verschiedener Punktmutationen auf die PmtA-

Aktivität 90

3.2.14 Die Bedeutung der Aminosäure Threonin 36 für die Lipidbindung

von PmtA 93

Inhaltsverzeichnis

IV

4. Diskussion 96

4.1 SAM-Bindeeigenschaften der agrobakteriellen

Phospholipid N-Methyltransferase PmtA 96

4.2 PmtA-Lipid Interaktion 102

4.2.1 Anionische Lipide stimulieren die PmtA-Aktivität 102

4.2.2 Elektrostatische Interaktion von PmtA mit Membranen 103

4.2.3 Substratspezifität von PmtA 106

4.2.4 Inhibierung von PmtA durch PC-Analoga 108

4.2.5 Die Bedeutung des N-Terminus für eine PmtA-Membran-

Interaktion 109

4.2.6 Die PmtA-Lipid-Interaktion ist hoch-affin und führt zu einer

Konformationsänderung 113

4.2.7 Gibt es in PmtA essentielle Aminosäuren für eine

Lipidinteraktion? 118

4.2.8 Postuliertes Modell für die PmtA-Membran-Interaktion 121

5. Zusammenfassung 123

6. Summary 124

7. Literaturverzeichnis 125

8. Anhang 138

8.1 Vorveröffentlichungen der Dissertation 138

8.2 Lebenslauf 139

8.3 Erklärung 140

Abkürzungsverzeichnis

V

Abkürzungsverzeichnis

A. dest. Aqua destillata (destilliertes Wasser)

AS Aminosäure

C8-PE 1,2-Dioctanoyl-sn-Glycerin-3-Phosphoethanolamin

C-Terminus Carboxy-Terminus

CL Cardiolipin

Da Dalton

DC Dünnschichtchromatographie

DAG Diacylglycerin

DMPE Dimethylphosphatidylethanolamin

DMSO N,N-Dimethylsulfoxid

dNTP 2´-Desoxyribonukleinsäure

EZ Eppendorfzentrifuge

FPE Fluorescein-Phosphatidylethanolamin

LPE Lyso-Phosphatidylethanolamin

IPTG Isopropyl- -D-thiogalactopyranosid

MMPE Monomethylphosphatidylethanolamin

MT Methyltransferase

MW Molekulargewicht

N-Terminus Amino-Terminus

O.D. Optische Dichte

PA Phosphatidat

PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese

PCR Polymerase-Kettenreaktion (engl. polymerase chain reaction)

PC Phosphatidylcholin

Pcs Phosphatidylcholin-Synthase

PE Phosphatidylethanolamin

PEMT Phosphatidylethanolamin N-Methyltransferase

PG Phosphatidylglycerin

PS Phosphatidylserin

Pmt Phospholipid N-Methyltransferase

RNase Ribonuklease

RT Raumtemperatur

SAH S-Adenosylhomocystein

SAM S-Adenosylmethionin

SM Sphingomyelin

U Unit

ü.N. über Nacht

ÜK Übernachtkultur

UpM Umdrehung pro Minute

WT Wildtyp

Einleitung

- 1 -

1. Einleitung

1.1 Lipide und Membranen

1.1.1 Lipide

Lipide sind wasserunlösliche, organische Moleküle, die eine polare Kopfgruppe und

einen hydrophoben Kohlenwasserstoffrest besitzen (Abbildung 1). Dabei können die

hydrophoben Kohlenwasserstoffreste sowohl in ihrer Länge, als auch im Vorkommen

von Doppelbindungen variieren. Auch die Kopfgruppe ist variabel und kann zum

Beispiel positiv oder negativ geladen sein. Der Aufbau aus sowohl hydrophoben, als

auch hydrophilen Komponenten verleiht Lipiden einen amphiphilen Charakter.

Abbildung 1: Allgemeiner Aufbau eines Phospholipides.

Allgemein werden Lipide aufgrund ihrer strukturellen und chemischen Eigenschaften

in acht Klassen eingeteilt (Tabelle 1). Da für diese Arbeit die Klasse der

Glycerophospholipide eine besondere Bedeutung hat, werden im Folgenden der

Aufbau und die Funktion dieser Lipide näher betrachtet. Phospholipide sind ein

Hauptbestandteil biologischer Membranen und stellen eine der wichtigsten

Lipidklassen dar. Sie bestehen aus einer polaren Kopfgruppe, die über eine

Phosphorsäurediesterbrücke an ein Glycerin gekoppelt ist, sowie zwei Fettsäuren,

Einleitung

- 2 -

die jeweils mit dem Glycerin verestert sind (Abbildung 1). Ein Glycerophospholipid

kann aufgrund verschiedener Fettsäurekombinationen mehrere Molekülspezies

umfassen. Die Phosphatgruppe ist bei neutralem pH negativ geladen. Die

Kopfgruppe hingegen kann sowohl negativ, als auch positiv geladen sein.

Tabelle 1: Übersicht der verschiedenen Lipidklassen.

Klasse Beispiele

Fettsäuren Oleat, Stearoyl-Coa, Palmitoylcarnitin

Glycerolipide Di- und Triacylglycerine

Glycerophospholipide Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin

Sphingolipide Sphingomyelin, Gangliosid GM2

Sterinlipide Cholesterin, Progesteron, Gallensäuren

Prenyllipide Farnesol, Geraniol, Retinol, Ubichinon

Polyketide Tetracyclin, Aflatoxin B1

Saccharolipide Lipopolysaccharid

Beispiele für Lipide mit einer positiv geladenen Kopfgruppe sind

Phosphatidylethanolamin (PE) oder Phosphatidylcholin (PC). Bei einem

physiologischen pH sind diese Lipide neutral, da die positive Ladung der Kopfgruppe

(+1) die negative Ladung der Phosphatgruppe (-1) ausgleicht. Ferner werden daher

PE und PC als zwitterionische Lipide bezeichnet. Phosphatidylglycerin (PG) oder

Phosphatidylserin (PS) besitzen hingegen eine negativ geladene Kopfgruppe und

zählen deshalb zu den anionischen Lipiden.

Weiterhin ist für diese Arbeit das Sphingolipid Sphingomyelin wichtig. Der Aufbau von

Sphingolipiden ist Phospholipiden generell sehr ähnlich. Sie besitzen ebenfalls zwei

Fettsäuren und eine polare Kopfgruppe. Die Grundstruktur eines Sphingolipides

bezeichnet man als Ceramid. Die Besonderheit bei einem Ceramid ist, dass eine

Fettsäure über eine Amidbrücke an das C2-Atom geknüpft ist. Sphingomyelin besitzt

als Kopfgruppe Cholin, das auch über eine Phosphorsäurediesterbindung verbunden

ist. Die Struktur und die Ladung von Sphingomyelin ist PC sehr ähnlich.

Sphingomyeline sind insbesondere in Plasmamembranen von Nervenzellen zu

finden. Eine Übersicht ausgewählter Lipide ist in Abbildung 2 dargestellt.

Einleitung

- 3 -

Abbildung 2: Strukturformeln ausgewählter Phospholipide und Sphingomyelin. CL: Cardiolipin; DMPE: Dimethylphosphatidylethanolamin; DPPG: Lysyl-PG; LPE: Lyso-PE; MMPE: Monomethylphosphatidylethanolamin; PA: Phosphatidat; PC: Phosphatidylcholin; PE: Phosphatidyl-ethanolamin; PG: Phosphatidylglycerin; PI: Phosphatidylinositol; PS: Phosphatidylserin, SM: Sphingomyelin.

Einleitung

- 4 -

Aufgrund ihres amphiphilen Charakters können Lipide in wässrigen Lösungen

Membranen ausbilden, die zwei Kompartimente voneinander trennen. Neben der

strukturgebenden Funktion, dienen Lipide auch als Energiespeicher und haben eine

enorme Bedeutung für die Faltung, Stabilität und Regulation von integralen oder

assoziierten Membranproteinen (Dowhan, 1997; van Meer et al., 2008). So benötigt

beispielsweise der Multidrugtransporter LmpR aus Lactococcus lactis für seine

Transporterfunktion die Anwesenheit von PE. In Abwesenheit von PE ist LmpR

inaktiv (Hakizimana et al., 2008). Ein Beispiel für die regulatorische Funktion von

Lipiden ist die cytosolische Protease Lon aus E. coli. Lon wird durch Cardiolipin an

die Membran gebunden und dadurch inaktiviert (Minami et al., 2011). Neben der

Bedeutung für Membranproteine, können Lipide auch als Signalmoleküle dienen.

Exponiertes PS in der äußeren Membranschicht von Eukaryoten ist beispielsweise

ein Zeichen für den programmierten Zelltod (Bevers et al., 1983; Rosing et al., 1985;

Tait & Gibson 1994). In Abbildung 3 sind die wichtigsten Funktionen von Lipiden kurz

dargestellt.

Abbildung 3: Übersicht über die verschiedenen Funktionen von Lipiden. Lipide haben neben der Funktion als strukturgebendes Element biologischer Membranen noch weitere Bedeutung für Membranproteine, als Signalstoffe oder Energiespeicher.

Einleitung

- 5 -

1.2 Die Bedeutung von Phosphatidylcholin

1.2.1 Vorkommen und Bedeutung von Phosphatidylcholin

Phosphatidylcholin (PC) besitzt als Kopfgruppe Cholin, das eine positiv geladene,

quartäre Ammoniumverbindung ist. PC ist das häufigste membranbildende Lipid in

Eukaryoten (Kent, 1990; Vance, 2002). Neben der strukturgebenden Funktion für die

Membran reguliert PC auch zahlreiche zelluläre Prozesse. PC ist unter anderem bei

der lipidabhängigen Signalübertragung (engl. lipid signaling) und der Aktivierung von

membranassoziierten Proteinen beteiligt (Kent, 1990; Exton, 1994). PC dient zudem

als Reservoir für Cholin, das unter anderem für die Synthese des Neurotransmitters

Acteylcholin benötigt wird. Desweiteren ist PC ein Vorläufermolekül für sekundäre

Lipidbotenstoffe. Dazu zählen beispielsweise Lyso-PC, Phosphatidat, Diacylglycerin,

Lyso-Phosphatidat, Thrombozyten-aktivierender Faktor (PAF) oder Arachidonsäure

(Exton, 1994; Zeisel & Blusztajn, 1994). Ebenfalls ist PC das Hauptlipid von

Lipoproteinen im Blut (Kent, 1990; Leblanc et al., 1998). Im Gegensatz zu

Eukaryoten ist das Vorkommen sowie die Bedeutung von PC in prokaryotischen

Organismen bisher nur geringfügig untersucht. Ein Grund hierfür ist, dass die

Modellorganismen Bacillus substilis und Escherichia coli kein PC besitzen.

Bioinformatische Genomstudien haben allerdings gezeigt, dass wahrscheinlich 10 %

aller Bakterien PC synthetisieren können (Sohlenkamp et al., 2003). Häufig ist PC in

Bakterien präsent, die mit einem eukaryotischen Wirt interagieren, sodass PC

wahrscheinlich eine zentrale Rolle bei einer Bakterien-Wirts-Interaktion spielt

(López-Lara et al., 2003; Sohlenkamp et al., 2003; Aktas et al., 2010).

1.2.2 PC-Biosynthese in Eukaryoten

In Eukaryoten gibt es zwei PC-Biosynthesewege. Zum einen kann PC über einen

Methylierungsweg synthetisiert werden, zum anderen über einen Cytidindiphosphat-

Cholin (CDP-Cholin) Weg. Der Methylierungsweg ist eine de novo Synthese und

beruht auf einer dreifachen Methylierung von Phosphatidylethanolamin (PE) zu PC.

Dabei entstehen die Intermediate Monomethylphosphatidylethanolamin (MMPE) und

Dimethylphosphatidylethanolamin (DMPE). Der Methyldonor für diese Reaktion ist

Einleitung

- 6 -

S-Adenosylmethionin (SAM), der zu S-Adenosylhomocystein (SAH) umgewandelt

wird (Bremer & Greenberg, 1959; Vance & Ridgway, 1988; Ridgway et al., 1989).

In der Hefe Saccharomyces cerevisiae katalysieren zwei Phosphatidylethanolamin N-

Methyltransferasen (PEMT) den Methylierungsweg. Diese sind eingeteilt in Typ I und

Typ II PEMT (Kodaki & Yamashita, 1987; Kanipes & Henry, 1997;

Kanipes et al., 1998). Das Typ II Enzym PEMT1/CHO2 kann nur PE zu MMPE

methylieren. Die PEMT2/OPI3 katalysiert hingegen vorwiegend die nachfolgenden

Methylierungsschritte von MMPE zu DMPE und PC. Eine Methylierung von PE zu

MMPE ist auch durch PEMT2/OPI3 möglich, jedoch sehr ineffizient (Kodaki &

Yamashita, 1987; Kanipes & Henry, 1997). CHO2 und OPI3 sind Proteine, die im

endoplasmatischen Reticulum lokalisiert sind (Gaynor & Carman, 1990). Das

PEMT1-Enzym der Hefe ist homolog zu den Phospholipid N-Methyltransferasen

(Pmt) aus der Ratte und Maus (Vance, 2002). Weiterhin haben PEMT1 und 2

zueinander einen sehr hohen Verwandschaftsgrad (Kodaki & Yamashita, 1987).

Daher ist es wahrscheinlich, dass beide Proteine ursprünglich von einem

gemeinsamen Vorläufergen abstammen (Kanipes & Henry, 1997). Die Pmt-Enzyme

der Hefe konnten bisher nicht isoliert werden. Zur Analyse der enzymatischen und

kinetischen Eigenschaften von OPI3 und CHO2 wurden S. cerevisiae-

Deletionsmutanten verwendet. Die Enzyme OPI3 und CHO2 unterscheiden sich im

pH-Optimum, in den benötigten Kofaktoren und der Thermostabilität (Gaynor &

Carman, 1990).

Im Gegensatz zur Hefe besitzen höhere Säugetiere nur ein pemt-Gen, das für ein

ca. 20 kDa großes PEMT-Enzym kodiert. Dieses Enzym katalysiert alle drei

Methylierungsschritte von PE zu PC. Signifikante Methylierungsaktivität wurde

allerdings nur im Lebergewebe gefunden. Die PEMT der Rattenleber ist ein 18 kDa

großes, monomeres Protein, das in zwei Isoformen vorkommt. Die PEMT1 ist ein

integrales Membranprotein, das in der Membran des endoplasmatischen Reticulums

lokalisiert ist. Die PEMT2 ist hingegen in der mitochondrialen Membran lokalisiert

(Ridgway & Vance, 1987; Cui et al., 1993; Vance et al., 1997). Es wird vermutet,

dass posttranslationale Modifikationen für die unterschiedliche Lokalisation

verantwortlich sind (Vance et al., 1997). Die kinetischen Eigenschaften und der

Mechanismus dieser PEMT-Enzyme sind gut untersucht (Ridgway & Vance, 1987;

Ridgway & Vance, 1988; Ridgway & Vance, 1992; Vance et al., 1997). Die Katalyse

Einleitung

- 7 -

erfolgt nach einem Bi-Bi Mechanismus: d.h. das Lipid bindet als erster Ligand und

dissoziiert als letzter Ligand vom Enzym. Die Substrate PE, MMPE, DMPE und PC

konkurrieren dabei jeweils um die gleiche Bindestelle. Erst nach einer erfolgreichen

Substratbindung wird der Methyldonor SAM gebunden und die

Transmethylierungsreaktion kann durchgeführt werden (Ridgway & Vance, 1987;

Ridgway & Vance, 1988; Ridgway & Vance, 1992; Vance et al., 1997). Eine

Regulation der PEMT-Enzyme erfolgt sehr wahrscheinlich durch die inhibierenden

Endprodukte PC und SAH (Ridgway & Vance, 1988).

Im Gegensatz zum Methylierungsweg wird durch den alternativen PC-

Biosyntheseweg, dem CDP-Cholin-Weg, PC nicht de novo synthetisiert. Beim CDP-

Cholin-Weg wird CDP-Cholin mit 1,2-Diacylglycerin (DAG) direkt verknüpft. Freies

Cholin kann dafür aus exogenen Quellen stammen oder intern durch den Abbau von

PC durch die Phospholipasen C und D freigesetzt werden. Die Aufnahme von Cholin

erfolgt über Cholin-Transporter (Kent, 1990). Es sind drei Transportsysteme bekannt:

1. Hoch-affiner, Na+-abhängiger Transport; 2. Intermediäraffiner, Na+-unabhängiger

Transport und 3. Niedrig-affiner Transport (Michel et al., 2006). Sobald das Cholin in

die Zelle gelangt, wird es durch die Cholinkinase (CKI) phosphoryliert.

Cholinphosphat wird durch die CTP-Phosphocholin Cytidylyltransferase (CCT) unter

Verbrauch eines Moleküls Cytidintriphosphat (CTP) zu CDP-Cholin umgewandelt.

Die Cholingruppe wird dann durch die 1, 2-DAG Cholinphosphotransferase (CPT) mit

DAG zu PC verknüpft, wobei ein CMP-Molekül freigesetzt wird

(Kennedy & Weiss, 1956; Weiss et al., 1958; Kennedy, 1989). Die CKI ist im Cytosol

lokalisiert und kann neben Cholin auch Ethanolamin phosphorylieren (Brophy et al.,

1977; Yamashita & Hosaka, 1997). Die generelle Regulation des CDP-Cholin-Weges

erfolgt jedoch über die CCT (Vance, 2002). Die CCT ist ein amphitrophes Protein,

das in löslicher Form inaktiv im Nucleolus lokalisiert ist. Erst eine Rekrutierung und

Assoziation an die Membran des endoplasmatischen Reticulums aktiviert die CCT

(Cornell & Northwood, 2000).

Generell ist die präferierte Nutzung eines PC-Biosyntheseweges abhängig vom

Organismus oder vom Gewebetyp bei höheren Eukaryoten. Hefen und Pilze nutzen

hauptsächlich den Methylierungsweg (Kanipes & Henry, 1997). Säugetiere hingegen

nutzen bevorzugt den CDP-Cholin-Weg (Vance & Schneider, 1981;

Vance & Ridgway, 1988; Vance et al., 2007). Dieser ist essentiell in tierischen Zellen

Einleitung

- 8 -

(Walkey et al., 1998). Die PC-Synthese in Pflanzen ist bisher relativ unerforscht,

wobei PC hier vermutlich auch hauptsächlich über den CDP-Cholin-Weg synthetisiert

wird. In Abbildung 4 sind die hier vorgestellten PC-Biosynthesewege in Eukaryoten

schematisch dargestellt.

Abbildung 4: Gegenüberstellung der verschiedenen eukaryotischen PC-Biosynthesewege (nach Sohlenkamp et al., 2003) . In Hefen wird PC hauptsächlich über den Methylierungsweg synthetisiert. Die Enzyme CHO2 und OPI3 methylieren dafür PE über die Intermediate MMPE und DMPE zu PC. Säugetiere besitzen auch einen Methylierungsweg, diese gesamte Methylierungsreaktion wird jedoch nur von einem PEMT-Enzym katalysiert. Vorwiegend wird in höheren Säugetieren der CDP-Cholin-Weg zur PC-Biosynthese genutzt, bei dem CDP-DAG direkt mit Cholin verknüpft wird. ADP: Adenosindiphosphat; ATP: Adenosintriphosphat; CKI: Cholinkinase; CCT: CTP-Phosphocholin Cytidylyltransferase; CMP: Cytidinmonophosphat; CPT: Cholinphosphotransferase; CTP: Cytidintriphosphat; DAG: Diacylglycerin; DMPE: Dimethyl-PE; MMPE: Monomethyl-PE; PA: Phosphatidat; PC: Phosphatidylcholin; PE: Phosphatidylethanolamin; PEMT: PE N-Methyltransferase; PLC: Phospholipase C; PLD: Phospholipase D; PPi: Pyrophosphat; R: Kohlenwasserstoffrest; SAM: S-Adenosylmethionin; SAH: S-Adenosylhomocystein.

Einleitung

- 9 -

1.2.3 Bedeutung von PC für Bakterien-Wirts-Interaktionen

Eine bakterielle Membran setzt sich in der Regel aus den Phospholipiden PE

(70 - 80 mol%), PG (20 – 25 mol%) und CL (<5 mol%) zusammen (Dowhan, 1976;

Linde et al., 2004). Phototrophe Bakterien mit vielen internen Membranen und auch

Bakterien, die mit Eukaryoten assoziiert leben, besitzen meist zusätzlich PC

(Goldfine, 1984). Genomstudien haben gezeigt, dass wahrscheinlich 10 % aller

Bakterien PC synthetisieren können (López-Lara et al., 2001; Sohlenkamp et al.,

2003). Der Anteil von PC in der Membran ist dabei von Organismus zu Organismus

sehr variabel. Bei Pseudomonas aeruginosa beträgt der Anteil von PC nur einige

wenige Prozent der Gesamtlipidmenge (Goldfine, 1984), bei Acetobacter aceti

hingegen beträgt der PC-Gehalt in der Membran bis zu 73 % (Hanada et al., 2001).

Da die prokaryotischen Modellorganismen E. coli und B. subtilis kein PC besitzen,

wurde PC in Bakterien lange Zeit keine Aufmerksamkeit geschenkt.

Für das Überleben von Bakterien ist PC in der Membran nicht essentiell. Eine PC-

defiziente Mutante von Rhodobacter sphaeroides oder Zymomonas mobilis weist ein

normales Wachstum auf. Dementgegen gibt es Bakterien, die zwar ohne PC

überleben, aber einen deutlichen Phänotyp zeigen. Die Wachstumsrate und

maximale Zelldichte ist bei einer A. aceti PC-defizienten Mutante deutlich reduziert.

Eine Bradyrhizobium japonicum-Mutante, die nur sehr geringe Mengen an PC

besitzt, weist eine reduzierte Symbioseeffizienz mit seiner Wirtspflanze auf. Hierbei

werden weniger Bakteroide gebildet, was zu einer geringeren Stickstofffixierung

(18 % des Wildtyps) führt (Minder et al., 2001). Eine PC-Defizienz führt bei

Sinorhizobium meliloti zu einem noch drastischeren Symbiosedefekt. Ohne PC ist

S. meliloti nicht mehr in der Lage Knöllchen zu bilden, die für eine Symbiose

essentiell sind (Sohlenkamp et al., 2000). Neben symbiontischen Bakterien zeigen

auch pathogene Bakterien einen deutlichen Phänotyp in Abwesenheit von PC.

Brucella abortus hat zum Beispiel ohne PC einen deutlichen Virulenzdefekt (Comerci

et al., 2006). Legionella pneumophila produziert ohne PC weniger Flagellin, wodurch

die Motilität eingeschränkt ist und das Bakterium daher einfacher von Makrophagen

gebunden werden kann. Desweiteren ist die Funktion des Typ IV-

Sekretionssystemes Dot/Icm in L. pneumophila stark beeinträchtigt (Conover et al.,

2008). Eine PC-defiziente Mutante des pflanzenpathogenen Bakteriums

Agrobacterium tumefaciens zeigt ebenfalls einen gravierenden Virulenzdefekt. Das

Einleitung

- 10 -

Fehlen von PC führt zum Verlust des Typ IV-Sekretionssystems in der Membran.

Diese Beispiele zeigen, dass PC in bakteriellen Membranen eine wichtige Rolle für

eine effiziente Symbiose oder Infektion spielt. Bakterielle PC-Biosyntheseenzyme

sind daher potentielle Angriffspunkte für Antibiotika.

1.2.4 PC-Biosynthese in Prokaryoten

Bakterien können PC wie Eukaryoten über den Methylierungsweg synthetisieren,

wobei die bakteriellen PC-Biosyntheseenzyme des Methylierungsweges meist

cytosolisch lokalisiert sind. Bisher sind nur sehr wenige Bakterien bekannt, die einen

CDP-Cholin-Weg zur PC-Synthese nutzen. Ein Beispiel dafür ist Treponema

denticola (Kent, 2005). Ein Großteil der PC-synthetisierenden Bakterien nutzt

hingegen einen dem CDP-Cholin-Weg ähnlichen PC-Syntheseweg. Hier wird aus

Cholin und CDP-DAG PC produziert. Dieser Syntheseweg wird durch die

Phosphatidylcholinsynthase (Pcs), die bisher nur in Bakterien identifiziert wurde,

katalysiert. Viele Bakterien besitzen sowohl den Methylierungsweg, als auch den

Pcs-Weg (Sohlenkamp et al., 2000; Wessel et al., 2006) (Abbildung 5). Einige

Bakterien dagegen haben nur einen der beiden Wege (Arondel et al., 1993).

Beispielsweise synthetisieren Pseudomonas aeruginosa, B. abortus und Borrelia

burgdorferi PC nur über den Pcs-Weg (Wilderman et al., 2002; Martínez-Morales et

al., 2003; Comerci et al., 2006). Im Gegensatz dazu nutzen S. meliloti,

A. tumefaciens, Mesorhizobium loti und L. pneumophila sowohl den Pcs-Weg, als

auch den Methylierungsweg (Sohlenkamp et al., 2003; Wessel et al., 2006).

Einleitung

- 11 -

Abbildung 5: Bakterielle PC-Biosynthese (nach Wessel et al., 2006). Bakterien besitzen einen zu Eukaryoten homologen Methylierungsweg. Die PC-Biosynthese via Pcs ist wahrscheinlich exklusiv für Bakterien. CDP: Cytidindiphosphat; CMP: Cytidinmonophosphat; DAG: Diacylglycerin; Pcs: Phosphatidylcholinsynthase; Pmt: Phospholipid N-Methyltransferase; SAH: S-Adenosylhomocystein; SAM: S-Adenosylmethionin.

Phosphatidylcholinsynthase-Weg

Der Pcs-Weg unterscheidet sich vom Kennedy-Weg insofern, dass die Pcs kein

CDP-aktiviertes Cholin verwendet, sondern ein CDP-aktiviertes Phospholipid

(de Rudder et al., 1997; de Rudder et al., 1999; Sohlenkamp et al., 2000;

Martínez-Morales et al., 2003). Durch eine Kondensierung von Cholin mit CDP-

Diacylglycerin entsteht PC und das Nebenprodukt CMP. Pcs-Enzyme besitzen

6 - 8 Transmembranhelices und sind integrale Membranproteine. Üblicherweise

besitzen Pcs-Enzyme ein modifiziertes Motiv (DGx2ARx12Gx3Dx3D), das

charakteristisch für CDP-Alkoholphosphatidyltransferasen (CDP-OH-P)

(DGx2ARx8Gx3Dx3D) ist (Sohlenkamp et al., 2000; Sohlenkamp et al., 2003). Das

Pcs-Enzym aus S. meliloti wurde als erstes Enzym dieser Klasse charakterisiert. Es

weist eine Länge von 291 Aminosäuren auf, ist stark hydrophob und hat ein pH-

Optimum von 8. Desweiteren ist die Enzymaktivität abhängig von divalenten

Einleitung

- 12 -

Kationen wie Mg2+ oder Mn2+. Kinetische Analysen zeigen für sinorhizobielles Pcs

eine sigmoidale Bindungskurve für Cholin bei Konzentrationen über 100 mM.

Unterhalb einer Konzentration von 100 mM Cholin beobachtet man jedoch eine

Michaelis-Menten-Kinetik für Pcs. Daher ist zum einen möglich, dass die Pcs-Aktivität

einem positiven kooperativen Effekt unterliegt, d.h. die Bindung eines Moleküls

Cholin erleichtert die Bindung eines weiteren Moleküls Cholin, oder aber Pcs wird

durch Cholin inhibiert (de Rudder et al., 1999). Die Topologie der sinorhizobiellen

Pcs, sowie einige wichtige Aminosäuren für die Enzymaktivität wurden kürzlich

identifiziert. Konservierte Aminosäuren in den CDP-OH-P sind in einem

cytoplasmatischen Loop und teilweise in einer Transmembranhelix lokalisiert

(Solís-Oviedo et al., 2012). Pcs-Enzyme sind weiterhin homolog zu

Phosphatidylserinsynthasen (Pss). Die Pss katalysiert die Synthese von

Phosphatidylserin aus CDP-DAG und Serin.

Für die PC-Synthese benötigt die bakterielle Pcs freies Cholin. Dies ist

beispielsweise in tierischem und menschlichem Blut vorhanden (Sheard et al., 1986).

Die pathogenen Bakterien P. aeruginosa, B. abortus und L. pneumophila könnten

dieses Cholin als Quelle für die PC-Biosynthese nutzen. Darüber hinaus können

pathogene Organismen auch Phospholipasen sekretieren. Diese greifen die

eukaryotische Wirtsmembran an und können PC an spezifischen Stellen spalten,

sodass Cholin freigesetzt wird. Dieses freigesetzte Cholin kann wiederum für die PC-

Biosynthese genutzt werden. In P. aeruginosa wird beispielsweise die Expression der

Phospholipase C und einer Phosphatase durch Cholin induziert (Lisa et al., 1984;

Lucchesi et al., 1989).

Eine S. meliloti- oder A. tumefaciens-Mutante, deren Methylierungsweg

ausgeschaltet ist, kann PC in wildtypischen Mengen über den Pcs-Weg

synthetisieren (de Rudder et al., 1997; Wessel et al., 2006). S. meliloti kann hierbei

Cholin von der Wirtspflanze mit Hilfe eines hoch-affinen ABC-Transporters

aufnehmen (de Rudder et al., 1997; Dupont et al., 2004). In A. tumefaciens wurde

kürzlich ein ähnliches hoch-affines Cholin-Transportersystem (ChoXWV) identifiziert

und charakterisiert. Allerdings wird dieses System für eine PC-Synthese durch Pcs

nicht benötigt. Es ist daher sehr wahrscheinlich, dass Pcs extrazelluläres Cholin im

Periplasma binden und umsetzen kann (Aktas et al., 2011b).

Einleitung

- 13 -

Das Bereitstellen oder Vorkommen von freiem Cholin durch den Wirtsorganismus

scheint somit eine wichtige Rolle für die Nutzung des Pcs-Weges in Bakterien zu

spielen.

Methylierungsweg

Neben dem Pcs-Weg können Bakterien PC auch über einen Methylierungsweg

synthetisieren. Dafür katalysiert eine Phospholipid N-Methyltransferase (Pmt) die

schrittweise Methylierung von PE zu PC. Als Intermediate der PC-Biosynthese

entstehen MMPE und DMPE. Der Methyldonor für diese Reaktion ist SAM und nach

Abspalten der Methylgruppe entsteht SAH. Bakterielle Pmt-Enzyme unterscheiden

sich untereinander stark in ihrer Aminosäuresequenz. Die meisten bakteriellen Pmt-

Enzyme sind cytosolische Proteine, die an der Membran peripher assoziiert sind.

Bisher ist jedoch keine dreidimensionale Struktur eines bakteriellen Pmt-Enzyms

bekannt. Man unterscheidet bei bakteriellen Pmt-Enzymen zwischen zwei Familien.

Die sinorhizobiellen Pmt-Enzyme besitzen Sequenzhomologien zur Pmt aus

S. meliloti. Desweiteren haben diese Pmt-Enzyme Ähnlichkeit mit rRNA-

Methyltransferasen. Zum anderen gibt es die rhodobakteriellen Pmt-Enzyme, welche

auf Sequenzebene homolog zur Pmt aus R. sphaeroides sind (Sohlenkamp et al.,

2003). Rhodobakterielle Pmts zeigen zudem Homologien zu Ubiquinon/Menaquinon

Biosynthesemethyltransferasen. Die einzige Gemeinsamkeit zwischen

sinorhizobiellen, rhodobakteriellen und eukaryotischen Pmts ist das SAM-

Bindemotiv I (Abschnitt 1.3.3) (Haydock et al., 1991).

Als erstes bakterielles Pmt-Enzym wurde das Pmt aus R. sphaeroides (RPmt)

untersucht. RPmt ist ein monomeres 23 kDa großes Protein. In E. coli, das

natürlicherweise kein PC synthetisieren kann, wurde nach heterologer Expression

von RPmt PC-Synthese nachgewiesen. Allerdings wurden keine Intermediate

detektiert (Arondel et al., 1993). Weitere Vertreter dieses Pmt-Typs sind Pmt-Enzyme

aus A. aceti und L. pneumophila (Hanada et al., 2001; Martínez-Morales et al., 2003).

Später wurde das sinorhizobielle Pmt (SPmt) isoliert und charakterisiert. SPmt ist

22 kDa groß und synthetisiert deutliche Mengen an MMPE und PC nach

Überexpression in E. coli (Arondel et al., 1993; de Rudder et al., 2000). Weitere

Beispiele für SPmt-ähnliche Enzyme findet man in A. tumefaciens und B. japonicum.

Einen dritten, bisher relativ unbeschriebenen bakteriellen Pmt-Typ, besitzt

Einleitung

- 14 -

Zymomonas mobilis. Dieses Protein ist membrangebunden und als Homotrimer aktiv,

wobei eine Untereinheit dieses Trimers 42 kDa groß ist (Tahara et al., 1986; Tahara

et al., 1987a; Tahara et al., 1987b; Tahara et al., 1994).

Genomanalysen lassen vermuten, dass einige Bakterien zwei oder mehrere Pmt-

Enzyme für die PC-Biosynthese besitzen (López-Lara et al., 2003). Verschiedene

Pmts wurde in B. japonicum bereits nachgewiesen. Hierbei katalyisert PmtA

hauptsächlich den ersten Methylierungsschritt von PE zu MMPE

(Hacker et al., 2008). Die Methylierung von MMPE zu DMPE und PC erfolgt dann

über ein zweites Pmt-Enzym (PmtX1) (Minder et al., 2001; Hacker et al., 2008).

Wahrscheinlich synthetisieren auch Mesorhizobium loti, Rhizobium leguminosarum

und Rhodopseudomonas palustris PC durch mehrere Pmt-Enzyme

(López-Lara et al., 2003).

1.2.5 Die Phospholipid N-Methyltransferase PmtA aus

Agrobacterium tumefaciens

Im Vorfeld dieser Arbeit wurden grundlegende enzymatische Eigenschaften der

agrobakteriellen Phospholipid N-Methyltransferase (PmtA) untersucht. PmtA konnte

in E. coli heterolog überexprimiert und mittels Affinitätschromatographie isoliert

werden. Der Großteil des Proteins war jedoch unlöslich (Aktas & Narberhaus, 2009).

Die isolierte PmtA ist ein 22 kDa großes monomeres Protein, das sowohl heterolog in

vivo als auch in vitro aktiv ist. Es kann sowohl isolierte E. coli-Membranen, als auch

reines PE, MMPE und DMPE als Phospholipidsubstrat nutzen. Die

Methylierungsaktivität von PmtA wird durch PG stimuliert. Die Substratlipide PE,

MMPE, DMPE und das Produkt PC werden von PmtA in vitro gebunden. Darüber

hinaus bindet PmtA auch die anionischen Lipide PG und PI. Der Methyldonor für die

PC-Biosynthese ist SAM. Ähnlich wie dem eukaryotischen PEMT muss zunächst

eines der Phospholipidsubstrate gebunden werden, bevor der Kofaktor SAM

gebunden wird. Die katalysiert Mehrsubstratreaktion von PmtA unterliegt sehr

wahrscheinlich einem Bi-Bi Mechanismus: d.h. das Lipidsubstrat bindet als erster

Ligand an PmtA und dissoziiert als letzter Ligand vom Enzym. Die enzymatische

Aktivität von PmtA wird durch die Endprodukte PC und SAH inhibiert (Abbildung 6).

Einleitung

- 15 -

Abbildung 6: Reaktionsmechanismus und Regulation (-/+) des agrobakteriellen PmtA-Enzyms.

Einleitung

- 16 -

1.3 S-Adenosylmethionin-abhängige Methyltransferasen

Da bakterielle und eukaryotische Phospholipid N-Methyltransferasen zur Klasse der

SAM-abhängigen Methyltransferasen (SAM-MT) gehören, sollen in diesem Kapitel

die wichtigsten Eigenschaften dieser Enzymklasse kurz erläutert werden.

1.3.1 S-Adenosylmethionin

SAM ist ein Konjugat aus Adenosin und Methionin (Kresge et al., 2005). In der Zelle

ist SAM ein essentieller Metabolit (Loenen, 2006) und fungiert als Methyldonor für

verschiedenste Substrate. Es werden zum einen monovalente Ionen wie

beispielsweise Arsen, Chlorid oder Brom, zum anderen auch höher molekulare

Verbindungen wie tRNA, rRNA, DNA, Lipide und sogar Proteine methyliert (Kozbial &

Mushegian, 2005). Auf atomarer Ebene wird die Methylgruppe an ein Kohlenstoff-,

Sauerstoff-, Stickstoff- oder Schwefelatom gekoppelt. Durch diesen Methyltransfer

wird SAM zu SAH umgewandelt. Nach ATP ist SAM das häufigst genutzte

Enzymsubstrat und wird meist bevorzugt gegenüber anderen energetisch

ungünstigeren Methyldonoren wie beispielsweise Folat genutzt (Schubert et al.,

2003). Die physiologische Funktion einer Methylierung kann je nach Substrat

variieren. So ist beispielsweise die Methylierung der DNA ein Schutz gegen eigene

Restriktionsendonukleasen. Die Methylierung von Proteinen hat hingegen meist

regulatorische Wirkung.

1.3.2 Strukturelle Merkmale SAM-abhängiger Methyltransferasen

Der Großteil der SAM-abhängigen Methyltransferasen (SAM-MT) besitzt eine

Rossmann-Faltung, die charakteristisch für Nukleotid-bindende Enzyme ist. Nur ein

kleiner Teil zählt zur TIM-Barrel-Klasse, die sich durch acht alternierende α-Helices

und β-Faltblätter auszeichnet (Kozbial & Mushegian, 2005). Die Sequenzhomologie

von SAM-MTs beträgt teilweise nur 10 %. Es liegt jedoch eine hohe strukturelle

Konservierung vor. SAM-MTs sind in fünf verschiedene „Faltungsklassen“ eingeteilt

(Schubert et al., 2003). Die meisten der SAM-MTs gehören zur Faltungsklasse 1.

Diese bildet meist ein großes, zentrales β-Faltblatt aus. Es wird flankiert von jeweils

Einleitung

- 17 -

drei α-Helices. Eine allgemeine Anordnung der β-Faltblätter entspricht dem Muster

3 2 1 4 5 (7) 6 (Abbildung 7), wobei das siebte β-Faltblatt antiparallel zu den

restlichen β-Faltblättern angeordnet ist (Kozbial & Mushegian, 2005). Das N-

terminalste β-Faltblatt ist zentral lokalisiert. Einige wenige SAM-MTs besitzen eine

zusätzliche α-Helix (Martin & McMillan, 2002) oder bei anderen fehlen die β-

Faltblätter 6 und/oder 7 (Bujnicki, 1999).

Abbildung 7: Schematischer Aufbau von SAM-abhängigen Methyltransferasen. (A.) Strukturformel von S-Adenosylmethionin. (B.) Schematische Darstellung der Sekundärstruktur von SAM-MTs der Faltungsklasse 1. Im N-terminalen Bereich einer SAM-MT wird der Kofaktor SAM gebunden. Die Substratbinderegion ist C-terminal lokalisiert. N: Aminoterminus; C: Carboxyterminus. Gelbe Markierungen zeigen die Lokalisation der SAM-Bindemotive an. Rote Pfeile: β-Faltblatt; Blaue Zylinder: α-Helix

Weitergehend werden die SAM-MTs nach der Beschaffenheit ihres

Methylierungssubstrates eingeteilt (bspw. DNA- oder RNA- SAM-MT) (Martin &

McMillan, 2002). Vereinfacht betrachtet besteht eine SAM-MT aus einer SAM-

Bindedomäne und einer Substratbindedomäne. Die Bereiche und Aminosäuren der

Einleitung

- 18 -

Substratbindedomäne erkennen und binden das Methylierungssubstrat, sind jedoch

aufgrund der hohen Substratvielfalt sehr variabel. Die SAM-Bindedomäne wird aus

Aminosäuren gebildet, die den Kofaktor SAM binden und die Methylgruppe auf das

Substrat übertragen (Kozbial & Mushegian, 2005; Faumann et al., 1999). Eine der

ersten beschriebenen und charakterisierten SAM-MTs war die Catechol

O-Methyltransferase (COMT) (Vidgren et al., 1994). Es folgte die strukturelle

Aufklärung weiterer SAM-MTs, deren Substrate Nukleinsäuren, Proteine oder

kleinere Moleküle sind (Reinisch et al., 1995; Pattanayek et al., 1998; O’Gara et al.,

1999; Zhang et al., 2000). Die Aminosäurereste, die SAM binden, sind generell kaum

konserviert. Die SAM-Bindung ist jedoch immer an strukturell äquivalenten

Positionen lokalisiert. Diese Bereiche innerhalb der Protein-Struktur bezeichnet man

als SAM-Bindemotive, welche im nächsten Abschnitt näher beschrieben werden.

1.3.3 SAM-Bindemotive

Die SAM-Binderegion befindet sich im N-terminalen Bereich, der durch die Loops

und β-Faltblätter 1, 2 und 3 gebildet wird (Martin & McMillan, 2002). Bisher wurden

zehn SAM-Bindemotive (SAM-I – X-Motiv) beschrieben, wobei die ersten sechs für

alle SAM-MTs gelten (Cheng et al., 1993; Kumar et al., 1994; Malone et al., 1995;

Kozbial & Mushegian, 2005). Die Motive sieben bis zehn sind spezielle Bindemotive

für die Klasse der SAM-abhängigen DNA-Methyltransferasen (Kozbial & Mushegian,

2005). Die sechs universellen SAM-Bindemotive treten immer in der gleichen

linearen Abfolge auf. Dabei ist nicht die Aminosäure selbst, sondern die Eigenschaft

des Aminosäurerestes (sauer, hydrophob, basisch) immer an der strukturell

äquivalenten Position innerhalb der Sekundärstruktur konserviert. Das SAM-

Bindemotiv I (SAM-I-Motiv) ist ein glycinreicher Loop zwischen der α-Helix αA und β-

Faltblatt 1 (GxGxG). Die Glycine sind nicht universell konserviert und können durch

ähnlich kleine, unpolare Aminosäuren ersetzt sein (Kozbial & Mushegian, 2005).

Desweiteren gehört eine saure Aminosäure (D/E) im mittleren Bereich des β-

Faltblattes 1 und eine oder mehrere basische Aminosäuren am Ende des β-

Faltblattes 1 zum SAM-I-Motiv. Formell wird das SAM-I-Motiv durch D/ExGxGxG

beschrieben (Kozbial & Mushegian, 2005). Eine saure Aminosäure (D/E) am C-

Terminus des β-Faltblattes 2 oder im benachbarten Loop zeichnet das SAM-II-Motiv

Einleitung

- 19 -

aus. Das SAM-III-Motiv weist ebenfalls eine saure Aminosäure (D/E) im C-terminalen

Bereich des β-Faltblattes 3 auf.

Im N-terminalen Bereich des β-Faltblattes 4 oder den flankierenden Loops ist eine

saure Aminosäure (D/E) oder ein Asparagin (N) für die SAM-Bindung verantwortlich

(SAM-IV-Motiv). Auf das β-Faltblatt 5 folgt eine α-Helix (αD) mit außergewöhnlich

hohem Anteil an hydrophoben Aminosäuren. Diese stellt das SAM-V-Motiv dar. Ein

einzelnes oder auch doppeltes Glycin nach dem β-Faltblatt 4 ist das SAM-VI-Motiv

(Kozbial & Mushegian, 2005). Die Motive SAM-VII und SAM-VIII sind hinsichtlich der

Aminosäurereste kaum konserviert. Für die DNA-Methyltransferase M.HhaI besteht

das SAM-VII-Motiv aus einem Aspartat und einem Tyrosin zwischen der α-Helix αE

und dem β-Faltblatt 6. Das SAM-VIII-Motiv ist als ein konserviertes Phenylalanin

zwischen dem β-Faltblatt 6 und 7 oder als eine Aminosäuresequenz QxRxR

beschrieben (Malone et al., 1995).

Das aktive Zentrum bei SAM-MTs bilden die Motive SAM-I bis SAM-III. Das SAM-I-

Motiv interagiert dabei mit dem Carboxylterminus des Methionins von SAM. Neben

direkter ionischer Interaktion wird auch die Koordination über ein Wassermolekül

durch die saure Aminosäure des SAM-I-Motives diskutiert (Kozbial & Mushegian,

2005). Das SAM-II-Motiv interagiert über Wasserstoffbrückenbindungen mit den

Hydroxylgruppen der Ribose. Das SAM-III-Motiv interagiert mit dem freien Aminrest

des Adenins von SAM (Abbildung 8) (Kozbial & Mushegian, 2005). Das SAM-V-Motiv

interagiert mit dem Adeninringsystem (Sankpal & Rao, 2002). Die Motive SAM-IV

und SAM-VI sind direkt im aktiven Zentrum lokalisiert und sind wahrscheinlich für die

Katalyse verantwortlich. Es wird postuliert, dass außer dem SAM-IV-Motiv noch

weitere Aminosäuren C-terminal des β-Faltblattes 4 mit der Ammonium- und

Sulfoniumgruppe von SAM interagieren (Kozbial & Mushegian, 2005). Die

Aminosäuren der Motive SAM-V und SAM-VI sind hauptsächlich für die strukturelle

Stabilität der SAM-MT verantwortlich (Kumar et al., 1994; Malone et al., 1995;

Faumann et al., 1999).

Der durch SAM-MTs katalysierte Methyltransfer gleicht dem einer SN2-Reaktion. Die

Methylgruppe wird direkt auf das Substrat übertragen, während das Substrat

synchron deprotoniert wird (Kozbial & Mushegian, 2005). Eine besondere Funktion

könnte hierbei die saure Aminosäure des SAM-I-Motivs übernehmen. Es wäre

möglich, dass diese Aminosäure zu Beginn der Reaktion die positive Ladung des

Einleitung

- 20 -

Sulfoniumions stabilisiert. Gleichzeitig werden Wasserstoffbrückenbindungen zum

Substrat aufgebaut, um dieses zu binden. Wird das Substrat durch die saure

Aminosäure deprotoniert, kann die Methylgruppe auf das Substrat übertragen

werden (Kozbial & Mushegian, 2005).

Abbildung 8: Postulierte Interaktionsstellen der SAM-Bindemotive I-V mit S-Adenosylmethionin. Das SAM-I-Motiv interagiert mit der Carboxylgruppe von SAM. Das SAM-II-Motiv baut Wasserstoffbrückenbindungen zu den Hydroxylgruppen der Ribose auf. Das SAM-III-Motiv wechselwirkt mit der Amingruppe des Adeninrings. Das SAM-V-Motiv interagiert mit dem Adeninringsystem, wohingegen das SAM-IV-Motiv direkt an der Übertragung der Methylgruppe beteiligt ist.

Zielsetzung

- 21 -

1.4 Zielsetzung

Zu Beginn dieser Arbeit war bekannt, dass die Phospholipid N-Methyltransferase

PmtA aus A. tumefaciens PE zu PC methyliert. Der Methyldonor für diese Reaktion

ist SAM. PmtA gehört daher zu den SAM-abhängigen Methyltransferasen (SAM-MT)

(Aktas & Narberhaus, 2009).

In dieser Arbeit sollen die Lipid- und SAM-Bindeeigenschaften von PmtA näher

charakterisiert werden. Durch gezielte Mutagenese sollen PmtA-Derivate generiert

werden, um wichtige Aminosäuren für die Lipid- und SAM-Bindung zu identifizieren.

Dazu werden die PmtA-Derivate hinsichtlich ihrer enzymatischen Aktivität, Lipid- und

SAM-Bindefähigkeit untersucht, um die Bedeutung der jeweiligen mutierten

Aminosäure für die Lipid- bzw. SAM-Bindung zu klären.

Zudem soll geklärt werden, warum PmtA die Anwesenheit eines

Phospholipidsubstrates benötigt, um SAM binden zu können. Dazu sollen u.a.

spektroskopische Methoden zur Analyse der Sekundärstruktur von PmtA etabliert

und angewendet werden, da eine Substrat-abhängige Konformationsänderung

vermutet wird. Diese spektroskopischen Methoden sollen weiterhin zur

Quantifizierung und Bestimmung der Bindeaffinität von PmtA zu verschiedenen

Modellmembranen dienen.

Weiterhin ist bisher ungeklärt, weshalb PmtA neben den Substratlipiden auch PG

und PI bindet und die PmtA-Aktivität durch PG stimuliert wird (Aktas & Narberhaus,

2009). Mit Hilfe eines bereits etablierten in vitro-Aktivitätsassays soll geklärt werden,

ob PmtA durch PG spezifisch stimuliert wird oder ob dies auch durch andere Lipide

möglich ist. Mit den zuvor erwähnten spektroskopischen Methoden und einem

immunochemischen Detektionsverfahren soll die Bindung von PmtA an verschiedene

Lipide nachgewiesen werden.

Zudem sollen zur Analyse der Substratspezifität von PmtA verschiedene Substrat-

Derivate eingesetzt werden.

Material und Methoden

- 22 -

2. Material und Methoden

2.1 Verwendete Stämme

Tabelle 2: Genotyp der verwendeten Bakterienstämme.

Stamm Genotyp Referenz

Escherichia coli

DH5

supE44 Δ(lacZYA-argF)U196

(Φ80ΔlacZM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1

relA1

Woodcock et al., 1989

Escherichia coli

BL21(DE3)

F-

ompT hsdSB(r

B

-

mB

-)

gal dem (λIts857 indI Sam7 nin5 lacUV5-

T7gene1)

Studier & Moffatt, 1986

Agrobacterium tumefaciens C58

Wildtyp Baron C., Montreal,

Canada

2.2 Plasmide

Tabelle 3: Übersicht der in dieser Arbeit verwendeten Vektoren.

Vektoren für E. coli Charakteristika Referenz/Quelle

pET28b(+)

KanR, Expressionsvektor mit einem T7 lac-Promotor und die Möglichkeit, ein Fusions-Protein

mit sechs C- und/oder N-terminalen Histidin-Resten (His-

Tag) zu konstruieren

Novagen, Madison, USA


- 23 -

Tabelle 4: Übersicht der in dieser Arbeit verwendeten rekombinanten Plasmide. Die angegebene

Position des Aminosäureaustausch bezieht sich auf die primäre Aminosäuresequenz von PmtA.

Rekombinante Plasmide Bemerkung Referenze

pET28b_pmtA (pBO832)

Wildtyp PmtA Aktas & Narberhaus,

2009

pET28b_pmtA Q26A (pBO2717)

Austausch von Glutamin an Position 26 zu Alanin

Diese Arbeit

pET28b_pmtA K28A (pBO2718)

Austausch von Lysin an Position 28 zu Alanin

Diese Arbeit



Diese Arbeit

pET28b_pmtA K28A,K29A (pBO2732)

Austausch von Lysinen an Position 28 und 29 je zu Alanin

Diese Arbeit

pET28b_pmtA I33A (pBO1247)

Austausch von Isoleucin an Position 33 zu Alanin

Diese Arbeit

pET28b_pmtA T36A (pBO2720)

Austausch von Threonin an Position 36 zu Alanin

Diese Arbeit



Diese Arbeit



Diese Arbeit

pET28b_pmtA K42A,K43A (pBO2729)

Austausch von Lysinen an Position 42 und 43 je zu Alanin

Diese Arbeit

pET28b_pmtA E58A (pBO1222)

Austausch von Glutamat an Position 58 zu Alanin

Diese Arbeit

pET28b_pmtA G60A (pBO1228)

Austausch von Glycin an Position 60 zu Alanin

Diese Arbeit

pET28b_pmtA P61A (pBO1223)

Austausch von Prolin an Position 61 zu Alanin

Diese Arbeit



Diese Arbeit



Diese Arbeit

pET28b_pmtA E84A (pBO866)

Austausch von Glutamat an Position 84 zu Alanin

Aktas et al., 2011a

pET28b_pmtA F89A (pBO876)

Austausch von Phenylalanin an Position 89 zu Alanin

Aktas, unveröffentlicht

pET28b_pmtA D106A (pBO871)

Austausch von Aspartat an Position 106 zu Alanin

Aktas et al., 2011a


- 24 -

pET28b_pmtA D106E (pBO1244)

Austausch von Aspartat an Position 106 zu Glutamat

Diese Arbeit



Diese Arbeit

pET28b_pmtA V129T (pBO1249)

Austausch von Valin an Position 129 zu Threonin

Diese Arbeit

pET28b_pmtA Q158E (pBO1250)

Austausch von Glutamin an Position 158 zu Glutamat

Diese Arbeit

pET28b_pmtA Q158R (pBO2700)

Austausch von Glutamin an Position 158 zu Arginin

Diese Arbeit

pET28b_pmtA S160A (pBO2701)

Austausch von Serin an Position 160 zu Alanin

Diese Arbeit



Aktas et al., 2011a



Diese Arbeit

pET28b_pmtA P187T (pBO2703)

Austausch von Prolin an Position 187 zu Threonin

Diese Arbeit

pET28b_pmtA W192A (pBO867)

Austausch von Tryptophan an Position 192 zu Alanin


pET28b_pmtA Y194A (pBO874)

Austausch von Tyrosin an Position 194 zu Alanin


pET28b_pmtA T195A (pBO2730)

Austausch von Threonin an Position 195 zu Alanin

Diese Arbeit

pET28b_pmtA R196A (pBO2731)

Austausch von Arginin an Position 196 zu Alanin

Diese Arbeit

2.3 Oligonukleotide

Die synthetischen Oligonukleotide wurden von der Firma MWG Biotech AG in HPSF-

gereinigter und lyophilisierter Form bezogen. Nach Herstellerangaben wurden diese

im angegebenen Volumen A. dest. gelöst, um eine Konzentration von 100 pmol/µl zu

erhalten.


- 25 -

Tabelle 5: Übersicht über die in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide. Markiert sind die eingefügten Punktmutationen. Die Austausche wurden so ausgeführt, dass entweder eine zusätzliche Restriktionsschnittstelle eingefügt (+) oder deletiert (-) wurde, ohne die Aminosäureabfolge zu verändern. Unterstrichen ist die Erkennungssequenz der entsprechenden Restriktionsendonuklease.

Bezeichnung Nukleotidsequenz (5’ 3’)

Eingefügte/ Deletierte

Restriktions-schnitstelle

Q26A_fw ATGGTCAGCGCTCCGAAAAAA + Eco47III

Q26A_rv TTTTTTCGGAGCGCTGACCAT

K28A_fw AGCCAGCCGGCAAAAGTCGGC + NaeI /

+ NgoMIV K28A_rv GCCGACTTTTGCCGGCTGGCT

K29A_fw AGCCGAAAGCAGTCGGCGCAATTGTC + MunI

K29A_rv GACAATTGCGCCGACTGCTTTCGGCT

K28A,K29A_fw TGGTCAGCCAGCCGGCAGCAGTCG + NaeI /

+ NgoMIV K28A,K29A_rw ACAATGGCGCCGACTGCTGCCGGC

I33A_fw CGGCGCAGCTGTCCCGACATCGTCGA + PvuII

I33A_rv TCGACGATGTCGGGACAGCTGCGCCG

T36A_fw CCATTGTGCCGGCATCGTCGA + NaeI /

+ NgoMIV T36A_rv CGACGATGCCGGCACAATGG

K42A_fw CATCGTCGATCACCGCGGCAAAGA + SacII

K42A_rv ATGACGCTTGCCATCTTTGCCGCGG

K43A_fw CACGGCGAAAGCCATGGCAAG + NcoI

K43A_rv CTTGCCATGGCTTTCGCCGTG

K42A,K43A_fw CGTCGATCACGGCGGCAGCCATGG + NcoI

K42A,K43A_rv CCATGGCTGCCGCCGTGATCGACG

G60A_fw GCCGGTTCTGGAGCTCGCTCCCGGCACCGGCG + SacI

G60A_rv CGCCGGTGCCGGGAGCGAGCTCCAGAACCGGC

G62A_fw CCGGTTCTGGAGCTCGGTCCCGCCACCGGCGTC

+ SacI G62A_rv GACGCCGGTGGCGGGACCGAGCTCCAGAACCGG

G64A_fw CTCGGTCCCGGGACCGCCGTCATCACCAAGGCC + SmaI

G64A_rv GGCCTTGGTGATGACGGCGGTCCCGGGACCGAG

I126A_fw ACAGCGTTGCCTCCGCGGTGCCGAT + SacII /

+ EciI I126A_rv ATCGGCACCGCGGAGGCAACGCTGT


- 26 -

V129T_fw CGCCACGCCGATGCTGAATTTTCCCATGG + NcoI

V129T_rv CCATGGGAAAATTCAGCATCGGCGTGGCG

Q158E_fw GACCCGTAGTAGAAATATCCTACGG - EcoRV

Q158E_rv CCGTAGGATATTTCTACTACGGGTC

Q158R_fw GACCCGTAGTCCGGATATCC + AccIII

Q158R_rv GGATATCCGGACTACGGGTC

S160A_fw AGATAGCCTACGGTCCGATTTCCCCAATCG - PvuI

/ - EcoRV S160A_rv CGATTGGGGAAATCGGACCGTAGGCTATCT

I186A_fw ATCGTGCGCAATGCTCCGCCGGCG - SspI / + BsrDI I186A_rv CGCCGGCGGAGCATTGCGCACGAT

P187T_fw TCGTGCGCAATATTACACCGGCGCA - EciI / - NaeI / - NgoMIV P187T_rv TGCGCCGGTGTAATATTGCGCACGA

T195A_fw CTATGCCCGGGCCCTCGAGTGAGT + SmaI

T195A_rv ACTCACTCGAGGGCCCGGGCATAG

R196A_fw CTATACGGCGGCCCTCGAGTGAGT - ApaI

R196A_rv ACTCACTCGAGGGCCGCCGTATAG

2.4 Anzucht von Bakterien

Die verwendeten Nährmedien wurden vor dem Gebrauch bei 121 °C und 200 kPa für

20 min autoklaviert. Komponenten, die hitzelabil sind, wurden sterilfiltriert (Millipore

Membranfilter; Porendurchmesser von 0.2 µm) und den jeweiligen Medien nach dem

Autoklavieren hinzugegeben. Um auf die plasmidkodierten Resistenzen zu

selektieren, wurde dem Medium Kanamycin (Km) (Endkonzentration 50 µg/ml)

zugegeben.

2.4.1 Nährmedien

LB-Flüssigmedium (Sambrook et al., 1989):

Trypton 10 g

NaCl 10 g

Hefeextrakt 5 g

A. dest ad 1000 ml


- 27 -

LB-Agar:

Trypton 10 g

NaCl 10 g

Hefeextrakt 5 g

Agar 15 g

A. dest ad 1000 ml

2.4.2 Anzucht von Escherichia coli

Die Anzucht von E. coli erfolgte bei 37 °C auf LB-Agar oder in LB-Flüssigmedium auf

einem Rundschüttler bei 200 UpM. Kulturen mit einem Volumen bis zu 5 ml wurden

in einem Reagenzglas auf einem Brutroller bebrütet. Größere Kulturen wurden in

einem Erlenmeyerkolben (Kulturvolumen max. 1/5 des Gefäßvolumens) angezogen.

Übernachtkulturen wurden in LB-Medium mit einer Einzelkolonie inokuliert und für

mindestens 16 Stunden inkubiert.

Für Gefrierkulturen wurden Zellen einer 20 ml Übernachtkultur zunächst bei 4 °C und

4000 UpM (Heraeus Megafuge 1.0R) geerntet. Anschließend wurden die Zellen in

autoklaviertem Glycerin und LB-Medium in einem Verhältnis 1:1 resuspendiert und

bei -80 °C gelagert.

2.4.3 Messung der optischen Dichte

Das Zellwachstum wurde durch photometrische Messung der optischen Dichte (O.D.)

bei 580 nm verfolgt. Eine O.D.580 von 1 einer E. coli Kultur entspricht dabei ca.

2 x 109 Zellen/ml. Als Referenz diente zellfreies Medium.


- 28 -

2.5 Molekularbiologische Methoden

2.5.1 Isolierung von Plasmid-DNA

Die Plasmid-DNA-Isolierung aus E. coli erfolgte nach einer modifizierten Methode

von Birnboim (Birnboim & Doly, 1979), beruhend auf dem Prinzip der alkalischen

Lyse.

Aus einer 5 ml Übernachtkultur wurden 4 ml Zellen per Zentrifugation bei 13000 UpM

in einer Eppendorfzentrifuge (EZ) geerntet (1 min, RT). Der Überstand wurde restlos

abgenommen und die Zellen in 300 µl Mix I mit 3 µl RNase (20 mg/ml) resuspendiert.

Nach Inkubation von einer Minute bei Raumtemperatur (RT) wurden 300 µl Mix II

hinzugegeben und das Reaktionsgefäß 6 – 8 mal invertiert, bevor es für weitere

5 min bei RT inkubiert wurde. Anschließend wurden 300 µl Mix III hinzugegeben und

die Probe weitere 6 – 8 mal invertiert. Die entstandenen Protein-SDS-Präzipitate, die

gefällte chromosomale DNA, sowie Zelltrümmer wurden dann durch Zentrifugation

(15 min, 13000 UpM, EZ, RT) sedimentiert. Der Überstand wurde abgenommen und

ein zweites Mal zentrifugiert, um letzte Verunreinigungen der Plasmid-DNA zu

sedimentieren. Durch Zugabe von 630 µl Isopropanol und Inkubation von mindestens

30 min bei Raumtemperatur wurde die Plasmid-DNA gefällt. Nach Zentrifugation (10

min, 13000 UpM, EZ, RT) wurde der Überstand verworfen und das Pellet mit 400 –

500 µl kaltem 70 %igem Ethanol gewaschen (5 min, 13000 UpM, EZ, RT). Nach

vollständigem Abnehmen des Überstandes wurde das Pellet bei ca. 50 °C

getrocknet, bis sämtliches Ethanol verdunstet war.

Je nach Kopienzahl des Plasmides wurde das DNA-Pellet in 30 – 50 µl TE-Puffer

oder H2O bei ca. 50 °C für 10 min gelöst.

Mix I: pH 8.0 Mix II:

Tris-HCl 50 mM NaOH 200 mM

EDTA 10 mM SDS 1 % (w/v)

Mix III: pH 4.8 TE-Puffer: pH 8.0

Kaliumacetat 3 M Tris-HCl 10 mM

Formiat 1,8 M EDTA 1 mM


- 29 -

2.5.2 Hydrolytische Spaltung von DNA durch Restriktions-

endonukleasen

Zur gezielten hydrolytischen Spaltung von DNA wurden Restriktionsendonukleasen

des Typ II (Bindungsstelle identisch mit Schnittstelle) eingesetzt

(Sambrook et al., 1989). Um eine vollständige Hydrolyse zu gewährleisten, wurden

pro μg DNA 1 U der entsprechenden Endonuklease im Restriktionsansatz eingesetzt

und für 1 bis 2 Stunden bei der vom Hersteller angegebenen Temperatur inkubiert.

Die vom Hersteller mitgelieferten Restriktionspuffer sorgten für optimale

Reaktionsbedingungen. Doppelrestriktionen konnten in einem Schritt durchgeführt

werden, wenn die entsprechenden Enzyme genügend hohe Aktivitäten im

verwendeten Restriktionspuffer aufwiesen. Die Reaktion wurde durch Inkubation der

Ansätze für 20 min bei der vom den Hersteller angegebenen Temperatur gestoppt

und die hydrolytische Spaltung der DNA mittels Agarose-Gelelektrophorese

überprüft.

2.5.3 Agarose-Gelelektrophorese

Die Agarose-Gelelektrophorese diente der Analyse von DNA-Restriktionen, der

Mengen- und Größenabschätzung linearisierter DNA, sowie der präparativen

Isolierung von DNA-Fragmenten. Bei diesem Trennverfahren wird die

unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit verschieden großer Moleküle im

elektrischen Feld ausgenutzt. Die Proben wurden vor dem Auftragen mit

1/5 Volumen 5-fach konzentriertem DNA-Probenpuffer versetzt. Zur Auftrennung von

DNA-Fragmentgrößen bis 1 kb wurden Gele mit einer 2-%igen Agarosekonzentration

in 1-fachem TAE-Puffer verwendet, bei größeren Fragmenten ein 1-%iges

Agarosegel. Die Auftrennung erfolgte in einer horizontalen Gelkammer mit einer

maximalen Stromstärke von 500 mA und konstanten Spannung von 100 – 120 V.

Um die DNA-Fragmente sichtbar zu machen, wurde das Agarosegel nach der

gelelektrophoretischen Auftrennung in einem 0.05 % (w/v) Ethidiumbromidbad für

mindestens 15 min inkubiert und anschließend bei UV-Bestrahlung (λ=254 nm) unter

einer Videodokumentationsanlage fotografiert. Als Molekulargewichtsstandard diente

der “1-kb-ladder“ der Firma Invitrogen.


- 30 -

5-fach DNA-Probenpuffer: pH 8.0

Bromphenolblau 0.05 % (w/v)

EDTA 250 mM

Glycerol 43 % (v/v)

TAE-Puffer: pH 7.8

Tris-HCl 40 mM

Natriumacetat 10 mM

EDTA 1 mM

2.5.4 Amplifikation von DNA mittels Polymerasekettenreaktion und

ortsspezifische Mutagenese

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) dient generell der Amplifikation von DNA. In

dieser Arbeit wurde die PCR-Reaktion für die gerichtete Punktmutagenese des pmtA-

Gens aus A. tumefaciens verwendet. Bei der PCR-Reaktion vervollständigen DNA-

Polymerasen einzelsträngige Matrizen-DNA zu einem Doppelstrang, wenn ein kurzer

doppelsträngiger Bereich als Startpunkt für die DNA-Polymerase zur Verfügung

steht. Dieser doppelsträngige Bereich setzt sich zum einen aus der Matrizen-DNA

und zum anderen aus einem Primer zusammen. Primer sind chemisch synthetisierte

Oligonukleotide, die komplementär zu den Randbereichen der zu amplifizierenden

Sequenz sind und unter geeigneten Bedingungen spezifisch an den Matrizenstrang

binden.

Sequenzspezifische Mutationen des agrobakteriellen pmtA-Gens wurden nach der

QuikChange® Methode eingeführt. Dafür wurden die Primer so konstruiert, dass die

Mutation durch einen Basenaustausch mit dem Einfügen oder Deletieren einer

Restriktionsschnittstelle einhergeht. Als Template-DNA diente das Plasmid pBO832,

welches das wildtyp pmtA-Gen besitzt. Ein Standard-PCR Ansatz setzte sich wie

folgt zusammen:


- 31 -

Template DNA 15 ng

Primer 1 75 pmol

Primer 2 75 pmol

dNTPs 0.2 mM

10 x Pfu-Polymerase- Puffer 5 µl

Pfu – Polymerase 2 U

A. dest. ad 50 µl

Die PCR-Reaktion wurde in einem „Eppendorf Mastercycler personal“ mit

nachstehendem Programm durchgeführt:

Denaturierung der DNA 95 °C 2 min

Denaturierung der DNA 95 °C 0.5 min

Annealing 55 °C 1 min

Elongation 68 °C 2 min / kb Produktgröße

Die Elongationszeit wurde dabei so gewählt, dass die Template-DNA vollständig

repliziert werden konnte. Um die Transformationseffizienz für mutationstragende

Plasmide zu erhöhen, wurden 10 µl des PCR-Ansatzes entnommen und mit DpnI

verdaut. Dies ist eine Restriktionsendonuklease, die spezifisch nur methylierte DNA

an der Erkennungssequenz schneidet. Ein Standard-Ansatz setzte sich wie folgt

zusammen:

PCR-Ansatz 10 µl

DpnI (10U/µl) 1 µl

10 x Reaktionspuffer 1 µl

Der Ansatz wurde für eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden weitere

1 µl DpnI zugegeben und eine weitere Stunde restringiert.

Schließlich wurde der gesamte Ansatz für die Transformation in E. coli-Zellen

verwendet (Abschnitt 2.5.6).

x 16


- 32 -

2.5.5 Herstellen transformationskompetenter Zellen

Für die Herstellung kompetenter E. coli Zellen wurden 70 ml LB-Medium mit je 0.7 ml

einer 500 mM Lösung MgCl2, sowie MgSO4 versetzt und anschließend mit 0.7 ml

einer Übernachtkultur angeimpft. Die Bakterienzellen wurden in einem

Erlenmeyerkolben bei 37 °C bis zu einer optischen Dichte von ca. 0.5 bei 580 nm

inkubiert. Nun wurden je 25 ml der Kultur in einem sterilen Zentrifugenröhrchen bei

4 °C und 4000 UpM (Heraeus Megafuge 1.0R) für 10 min zentrifugiert. Der

Überstand wurde verworfen und die sedimentierten Zellen in je 12.5 ml kaltem TMF-

Puffer resuspendiert und eine Stunde auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die

Zellen 10 min bei 4 °C und 4000 UpM (Heraeus Megafuge 1.0R) zentrifugiert. Die

Zellpellets wurden in je 2.5 ml TMF-Puffer auf Eis resuspendiert und jeder Ansatz mit

750 µl autoklaviertem Glycerol gemischt. Die kompetenten Zellen wurden dann in

200 µl Portionen aliquotiert und bei -80 °C gelagert.

TMF-Puffer:

CaCl2 100 mM

MnCl 40 mM

RbCl 50 mM

2.5.6 Transformation

Für die Transformation eines Plasmides mit kompetenten E. coli Zellen, wurden

diese mit Plasmid-DNA oder 20 µl Ligationsansatz bei 4 °C für mindestens 30 min

inkubiert. Anschließend wurden die Zellen einem 2 minütigen Hitzeschock bei 42 °C

unterzogen. Nach weiteren 5 min Inkubation bei 4 °C wurde den Zellen 700 µl LB-

Flüssigmedium hinzugefügt und für mindestens zwei Stunden bei 37 °C auf einem

Roller inkubiert. Die transformierten Zellen wurden dann auf LB-Agar-Platten mit

entsprechendem Antibiotikum ausplattiert.


- 33 -

2.5.7 DNA-Konzentrationsbestimmung

Die DNA-Konzentration wurde mit einem Nano-Drop Spectrophotometer von der

Firma Peqlab bei 260 nm bestimmt, wobei eine Absorptionseinheit einer

Konzentration von 50 µg doppelsträngiger DNA/ml entspricht (Sambrook &

Russell, 2001). Die Reinheit der Nukleinsäure wurde durch Berechnung des

Quotienten 260/280 nm bestimmt. Für DNA sollte dieser bei ca. 1.8 liegen.


- 34 -

2.6 Herstellung von Liposomen und Micellen

2.6.1 Herstellung von Liposomen

Zur Herstellung von Liposomen wurde eine Lipidmenge eingesetzt, um eine finale

Konzentration von 1 mM Lipid im Ansatz zu erhalten. Im Falle von A. tumefaciens

oder E. coli Gesamtlipidextrakt wurden jeweils 4 ml einer Übernachtkultur geerntet

und die Lipide extrahiert. Die Gesamtlipidmenge der extrahierten Lipide wurde

anhand einer Dünnschichtchromatographie und im Vergleich zu einem definierten

Lipidstandard (3 µl 10 mg/ml PE) geschätzt. Zuerst wurden die in Chloroform

gelösten Lipide in einem Reagenzglas mittels Argon- oder Stickstoffbegasung

getrocknet, bis das Lösungsmittel vollständig verdampfte. Anschließend wurde 1 ml

Puffer (50 mM KH2PO4 oder 100 mM Tris-HCl, jeweils pH 8) hinzugegeben und die

Lösung für mindestens eine Stunde bei RT inkubiert, um eine Rehydrierung zu

ermöglichen. Für die Ausbildung von Liposomen wurde die Lösung mittels Ultraschall

für 30 min bei 30 °C beschallt. Um die Liposomen auf eine einheitliche Maximalgröße

einzustellen, wurde ein Extruder und eine Membran mit 100 nm Porengröße

verwendet. Die Liposomen passierten dabei den Extruder 10-mal. Die Liposomen

wurden maximal für 2 Wochen bei 4 °C gelagert.

2.6.2 Herstellung von Mizellen

Zur Herstellung von Mizellen wurde eine Lipidmenge eingesetzt, um eine finale

Konzentration von 400 µM Lipid zu erhalten. Zu den in Chloroform:Methanol gelösten

Lipiden wurde Triton X-100 (Endkonzentration 0.02% (v/v)) gegeben. Das Gemisch

wurden in einer SpeedVac (UNIV PO 100 H) getrocknet, bis das Lösungsmittel

vollständig verdampfte. Anschließend wurden die Lipide in 100 µl des jeweils

verwendeten Puffers gelöst.


- 35 -

2.7 Proteinbiochemische Methoden

2.7.1 Überexpression rekombinanter Proteine in E. coli BL21(DE3)

Für die Überexpression von PmtA oder PmtA-Derivaten wurde das jeweilige

Expressionsplasmid in den Expressionsstamm E. coli BL21(DE3) transformiert. 20 ml

einer Übernachtkultur der resultierenden Stämme wurden in 1 l selektivem LB-

Flüssigmedium verdünnt und bei 37 °C bis zu einer O.D.580 von 0.5 - 0.7 angezogen.

Die Expression des pmtA-Genes im verwendeten pET-System wird durch einen lac-

Promotor kontrolliert, der mit IPTG (Isopropyl- -D-thiogalactopyranosid) induzierbar

ist. Die Überexpression wurde durch Zugabe von 0.4 mM IPTG induziert und die

Kultur für 20 Stunden bei 18 °C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (10

min, 6000 UpM, SLA-3000, 4 °C) geerntet und mit LEW-Puffer gewaschen.

Anschließend wurde das Pellet bei -20 °C gelagert oder direkt weiter verarbeitet.

LEW-Puffer pH 8.0

NaH2PO4 50 mM

NaCl 300 mM

2.7.2 Zellaufschluss und Gewinnung von Rohextrakt

Das Zellpellet (2.7.1) wurde in 30 ml LEW-Puffer mit 200 µg/ml Lysozym sowie

5 µg/ml DNAse resuspendiert und mindestens 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend

erfolgte der Zellaufschluss mittels Constant Cell Disruption System (Constant

Systems Ltd), wobei die Probe zwei Aufschlussdurchgänge durchlief. Nach dem

Zellaufschluss wurde dem Ansatz Triton X-100 (Endkonzentration 0.05 % (v/v))

beigefügt und der Ansatz 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die

Zelltrümmer bei 20000 UpM (SS-34) bei 4 °C für 30 min sedimentiert.


- 36 -

2.7.3 Reinigung rekombinanter Proteine mittels Ni-IDA-Affinitäts-

chromatographie

Für die Überexpression und Reinigung mittels Metall-Ionen-Affinitätschromatographie

(IMAC) von Proteinen wurde das „Purification of Polyhistidine-Tagged Proteins“ -

System von Macherey & Nagel verwendet. Durch Klonierung geeigneter DNA-

Fragmente in den Expressionsvektor pET28b(+) werden „in-frame“-Fusionen

zwischen dem zu exprimierenden Zielgen und dem Vektor-kodierten His-Tag

erzeugt. Der His-Tag besteht aus sechs aufeinander folgenden Histidinen, die mit

einem immobilisierten Ni2+ - Ion interagieren und dadurch das Protein an die

Säulenmatrix binden.

Für die His-Tag-Affinitätschromatographie wurde der Rohextrakt auf eine mit LEW-

Puffer equilibrierte Protino® Ni-IDA Säule (2 ml Säulenvolumen) der Firma Macherey

& Nagel gegeben. Nach Beladen der Säule mit dem Proteinrohextrakt, wurde die

Säule mit 16 Säulenvolumen (SV) LEW-Puffer mit 10 mM Imidazol gewaschen.

Anschließend folgten weitere Waschschritte mit 16 SV LEW-Puffer mit 30 mM

Imidazol und 16 SV LEW-Puffer mit 50 mM Imidazol.

Die Elution der Proteine erfolgte mit Elutionspuffer (LEW mit 250 mM Imidazol).

Imidazol konkuriert mit dem His-Tag des überexprimierten Proteins um die Bindung

zum Ni2+ - Ion. Deshalb kann Imidazol im Überschuss eine gezielte Freisetzung des

Zielproteins bewirken und in niedrigeren Konzentrationen unspezifisch gebundene

Proteine verdrängen.

2.7.4 Denaturierende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Mit Hilfe der SDS-PAGE (Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese)

können Proteine entsprechend ihrem Molekulargewicht aufgetrennt werden. Das

anionische Detergenz Natriumdodecylsulfat (SDS) bindet an die durch

Hitzebehandlung denaturierten und in ihre Untereinheiten zerfallenen Proteine und

überdeckt ihre Eigenladung so effektiv, dass Mizellen mit konstanter negativer

Ladung pro Masseeinheit entstehen. Der Prozess der Denaturierung wird durch die

zusätzliche Zugabe von 2-Mercaptoethanol noch verstärkt, da dieses Reagenz

Cystein-Schwefelbrücken reduziert.


- 37 -

Durch diesen Effekt ist die Wanderungsrichtung und -geschwindigkeit im Gel von der

Eigenladung des Proteins unabhängig, so dass eine elektrophoretische Auftrennung

nach dem Molekulargewicht erfolgen kann.

Zur elektrophoretischen Auftrennung der Proteine wurden 12.5-%ige SDS-

Polyacrylamidgele nach Laemmli (Laemmli, 1970) eingesetzt. Die Elektrophorese

erfolgte in einer Mini-Protean II Zelle (Biorad) bei einer konstanten Spannung von

120 V in Elektrophorese-Puffer. Die Proteinproben (15 μl) wurden vor dem Auftragen

auf das Gel mit 5 µl SDS-Probenpuffer versetzt und 10 min aufgekocht.

Trenngel (Acrylamid-Konz. 12.5 %)

A. dest. 1.800 ml

4 x Trenngelpuffer 1.250 ml

40 % Acrylamid/Bisacrylamid 1.565 ml

87 % Glycerin 0.050 ml

10 % (w/v) SDS 0.050 ml

10 % (w/v) APS 0.038 ml

TEMED 1.7 μl

Sammelgel (Acrylamid-Konz. 6%)

A. dest. 1.570 ml

4 x Sammelgelpuffer 0.625 ml

40 % Acrylamid/Bisacrylamid 0.350 ml

10 % (w/v) SDS 0.025 ml

10 % (w/v) APS 0.025 ml

TEMED 3.8 μl

4-fach Sammelgelpuffer pH 6.8

Tris/HCl 0.5 M

4-fach Trenngelpuffer pH 8.8

Tris/HCl 1.5 M


- 38 -

10-fach Elektrophoresepuffer pH 8.3

Tris/HCl 0.25 M

Glycin 1.92 M

SDS 1 % (w/v)

5-fach SDS-Probenpuffer pH 6.8

4-fach Sammelgelpuffer 1.25 ml

Glycerin 10 % (v/v)

β-Mercaptoethanol 5 % (v/v)

SDS 3 % (w/v)

Bromphenolblau 1 % (w/v)

A.dest. ad 10 ml

Nach elektrophoretischer Auftrennung wurden die Proteine im Polyacrylamidgel mit

Coomassie angefärbt. Das in der Färbelösung enthaltene Methanol dient dazu, den

Coomassiefarbstoff zu lösen. Zusätzlich ist in der Färbelösung Essigsäure enthalten,

welche die Proteine im Polyacrylamidgel fixiert. Der Farbstoff Coomassie Brilliant

Blue R-250 besitzt die Eigenschaft, sich an basischen und aromatischen

Seitenketten von Aminosäuren anzulagern und färbt dadurch alle Proteine

unspezifisch an.

Die Färbung erfolgte 10 min bei Raumtemperatur. Anschließend wurde der

Gelhintergrund durch Inkubation in Entfärberlösung entfernt. Als

Molekulargewichtsstandard wurde “Benchmark Ladder“ der Firma Invitrogen

verwendet.

Coomassie-Färbelösung Entfärber

Methanol 50 % (v/v) Methanol 20 % (v/v)

Essigsäure 10 % (v/v) Essigsäure 7 % (v/v)

Coomassie Brilliant blue R 250 0.1 % (w/v)


- 39 -

2.7.5 Proteinkonzentrationsbestimmung

Die Konzentration von gereinigten Proteinen wurde spektrophotometrisch durch

Absorptionsmessung bei 280 nm bestimmt. Bei dieser Wellenlänge weisen die

aromatischen Aminosäurereste (vor allem Tryptophan) ein Absorptionsmaximum auf

(Nelson & Cox, 2009). Mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes (E280 = c . d . )

wurde die Proteinkonzentration errechnet. Der molare theoretische Extinktions-

koeffizient des jeweiligen Proteins wurde mit dem Programm ProtParam bestimmt.

2.7.6 Umpufferung und aufkonzentrieren von Proteinen

Proteinlösungen wurden mit Hilfe von Konzentratoren aufkonzentriert oder

umgepuffert. Das aufzukonzentrierende Protein wurde in ein Amicon Ultra 10-

Röhrchen (MWCO 10000) überführt und bei 2500 UpM (Heraeus Megafuge 1.0R) bei

4 °C zentrifugiert, bis die gewünschte Proteinkonzentration erreicht wurde.

2.7.7 Größenausschlusschromatographie

Die Größenausschlusschromatographie (oder auch Gelfiltration genannt) ist ein

säulenbasiertes Trennverfahren, das Moleküle aufgrund ihrer Größe und Form

voneinander separiert. Die Säulenmatrix besteht aus porösen Kugeln, deren Poren

eine definierte Größe besitzen. Diese limitieren die Permeation großer Moleküle in

die Kugeln, so dass sie einen kürzeren Weg durch die Matrix haben, als Moleküle,

die kleiner als die Poren sind. Daher eluieren große Moleküle früher als kleinere. Bei

einem Gemisch aus Molekülen unterschiedlicher Größe eluieren Moleküle, die die

Porengröße der Matrix überschreiten, im Ausschlussvolumen. Diese Moleküle

passieren die Säule mit der gleichen Geschwindigkeit, wie der Fluss des Puffers. Für

die Gelfiltration wurde eine Superdex 75 HR 10/30-Säule (Pharmacia) verwendet.

Die Säule hat ein Gesamtvolumen von 24 ml und ein Ausschlussvolumen von 8 ml.

Für die Gelfiltration von rekombinanten Proteinen, die mittels IMAC isoliert wurden,

wurden 2 ml Elutionsfraktionen aufgetragen und in 50 mM Kaliumdihydrogen-

phosphatpuffer (pH 8) oder 100 mM Tris-Puffer (pH 8) mit einer Fließgeschwindigkeit

von 0.4 ml/min bei 4 °C aufgetrennt.


- 40 -

2.7.8 In vitro-Aktivitätsassay

Die in vitro-Aktivitätsassays wurden nach Aktas (Aktas & Narberhaus, 2009)

durchgeführt. Dazu wurden 10 µM rekombinantes Protein in einem Volumen von

100 µl (100 mM Tris-HCl pH 8.0) mit 400 µM Liposomen und 1.84 mM SAM bei

30 °C für 1 Stunde inkubiert. Im Anschluss wurde eine Lipidextraktion (2.8.1) und

eine dünnschichtchromatographische Analyse der Reaktionsprodukte durchgeführt.

2.7.9 S-Adenosylmethionin-Bindestudien

Um die SAM-Bindefähigkeit von PmtA und PmtA-Derivaten zu untersuchen, wurde

ein Filterbindeassay mit radioaktiv markiertem SAM (S-[Methyl-14C] Adenosyl-L-

Methionin; Hartmann Analytics) verwendet (Aktas & Narberhaus, 2009). Das Prinzip

dieser Methode beruht auf einer Bindung eines Enzym-Radioliganden-Komplexes an

eine Filtermembran. Der ungebundene Radioligand wird weggewaschen und der

gebundene Anteil mittels Flüssig-Szintillationszähler quantifiziert. Dabei steht die

Bindung des Radioliganden in einem proportionalen Verhältnis zur detektierten

Radioaktivität. Ein Standard-Ansatz setzte sich wie folgt zusammen:

Protein 50 µM

Radioligand 2.5 µCi

Phospholipid 400 µM

Bindepuffer ad. 50 µl

Die spezifische Aktivität des Radioliganden betrug 48.8 mCi/mmol und die

radioaktive Konzentration 0.05 mCi/2.5 ml. Phospholipide wurden als Mizellen dem

Ansatz beigefügt. Der Ansatz wurde für 10 min bei 30 °C inkubiert und anschließend

auf eine zuvor mit Puffer equilibrierte Nitrozellulosemembran der Firma Millipore

(HAWP02500; 0.45 µm) gebunden. Nach viermaligem Waschen mit 0.3 ml

Bindepuffer (Tris-HCl 100 mM, pH 8.0) mittels einer Vakuumfiltrationsanlage, wurde

die Nitrozellulosemembran in 4 ml Szintillationsflüssigkeit Hydroluma (J.T. Baker)

aufgelöst (ca. 3 Stunden). Anschließend wurde die Probe bei einer Zählzeit von

10 min im Szintillationszähler LS-6000 TA (Beckman) gemessen.


- 41 -

2.7.10 Circular Dichroismus-Spektroskopie (CD-Spektroskopie)

Die Circular Dichroismus-Spektroskopie (CD-Spektroskopie) ist eine Methode zur

Aufklärung der Sekundärstruktur von optisch aktiven Molekülen. Optisch aktive

Moleküle wechselwirken mit polarisiertem Licht und absorbieren rechts- bzw.

linksgerichtetes zirkular polarisiertes Licht unterschiedlich stark. Die unterschiedlich

starke Absorption von links bzw. rechts gerichtetem Licht führt zu einer Drehung der

Polarisationsebene. Diese Drehung bzw. Differenz im unterschiedlichen

Absorptionsverhalten von rechts oder links gerichtetem Licht bezeichnet man als

Elliptizität. Die Elliptizität wird in Abhängigkeit zur Wellenlänge gemessen und als

CD-Spektrum aufgezeichnet (Nelson & Cox, 2009).

Proteine sind aufgrund des chiralen Cα-Atoms ihrer Aminosäuren optisch aktive

Moleküle. Daher kann die CD-Spektroskopie bei Proteinen und Peptiden zur Analyse

der Sekundärstruktur verwendet werden. Die einzelnen Sekundärstrukturelemente,

wie α-Helix, β-Faltblatt und Loops, haben ein unterschiedliches Absorptionsverhalten

gegenüber linear polarisiertem Licht. Ein CD-Spektrum eines Peptides/Proteins stellt

daher die Gesamtheit aller Sekundärstrukturelemente, deren Signale sich

überlagern, dar (Kelly & Price, 2000). Weiterhin können mittels CD-Spektroskopie die

Auswirkungen von beispielsweise pH, Temperatur oder Ligandeninteraktion auf die

Sekundärstruktur von Proteinen untersucht werden (Kelly & Price, 2000).

Für die CD-spektroskopischen Analysen von PmtA wurden 7.5 µM Protein in einem

50 mM Kaliumdihydrogenphosphatpuffer (pH 8.0) bei 20 °C mit einem Jasco J-715

CD-Spektrometer vermessen. Es wurde ein CD-Spektrum zwischen 190 – 260 nm in

0.5 nm Abständen aufgezeichnet, wobei das finale CD-Spektrum eine Akkumulation

aus 10 Einzelspektren darstellt. In Tabelle 6 sind die verwendeten Parameter

aufgelistet.

Für die Thermostabilitätsmessungen wurde das CD-Signal bei 222 nm in

Abhängigkeit zur Temperatur aufgezeichnet. Die Temperatur wurde in einem Bereich

von 5 - 80 °C in 2 °C-Schritten erhöht.

Für den Einfluss von Liposomen auf die PmtA-Sekundärstruktur wurden steigende

Konzentrationen an Liposomen in einem Bereich zwischen 0.5 und 150 µM hinzu

titriert.


- 42 -

Tabelle 6: Paramter für CD-spektroskopische Analysen.

Parameter Einstellungen

Empfindlichkeit 100 mdeg

Wellenlängenbereich 190 – 260 nm

Messpunktabstand 0.5 nm

Abtastgeschwindigkeit 50 nm/min

Antwortverhalten 1 s

Bandbreite 1 nm

Akkumulationen 10

2.7.11 Tryptophanfluoreszenzmessung

Ein photochemisch angeregtes Molekül kann entweder durch Relaxation

(Schwingungsenergie/Wärmeenergie) oder durch die Emmision eines Photons

wieder in seinen energetischen Grundzustand gelangen (Nelson & Cox, 2009).

Letzteres wird als Fluoreszenz bezeichnet und kann in einem Fluorimeter gemessen

und quantifiziert werden.

In dieser Arbeit wurde die intrinsische Fluoreszenz der Aminosäure Tryptophan

genutzt. Tryptophan wird spezifisch durch eine Extinktion von 295 nm angeregt,

sodass eine Fluoreszenzemission zwischen 300 – 350 nm beobachtet werden kann.

Die Tryptophanfluoreszenz bietet die Möglichkeit auf die Polarität der Umgebung in

Abhängigkeit des Emissionsmaximums zu schließen, da das Fluoreszenzmaximum

von Tryptophan in polarer bzw. unpolarer Umgebung unterschiedlich ist (Nelson &

Cox, 2009; Kraft et al., 2009). Die Tryptophanfluoreszenz ist weiterhin ein häufig

verwendetes Verfahren, um die Interaktion von Proteinen und Liganden zu

quantifizieren. Dazu zählt auch die Interaktion von Proteinen mit Lipiden

(Kraft et al., 2009). Um Bindungskonstanten zu bestimmen, kann sowohl eine

veränderte Fluoreszenzintensität, als auch die Verschiebung des

Fluoreszenzmaximums genutzt werden (Kraft et al., 2009).

Um den Einfluss von Lipiden auf die PmtA-Tryptophanfluoreszenz zu messen,

wurden 10 µM Protein in 100 mM Tris-HCl Puffer in einem Thermo Amicon Bowman

II Luminescence Spectrometer vermessen. Die Tryptophanfluoreszenz wurde mit

295 nm angeregt und das Emissionspektrum zwischen 300 – 400 nm aufgezeichnet.


- 43 -

Die Spaltbreite wurde auf 4 nm eingestellt. Die Abtastgeschwindigkeit betrug 5 nm/s

wobei Messpunkte im Abstand von 5 nm genommen wurden. Zum Protein wurden

steigende Konzentrationen von Liposomen in einem Bereich zwischen 0 – 100 µM

hinzutitriert, und anschließend die Änderung der relativen Fluoreszenzintensität

gegen die Liposomenkonzentration aufgetragen. Zur Korrektur des

Verdünnungseffektes wurden ein Ansatz mit Protein und Puffer als Titrand

verwendet. Dieser Ansatz und ein Ansatz ohne Protein dienten als Negativkontrollen,

wobei anhand von letzterem eine Eigenfluoreszenz der verwendeten Liposomen

ausgeschlossen werden konnte.

2.7.12 Fluoreszenzmessung mit Hilfe von Fluorescein-

Phosphatidylethanolamin

Das Lipid Fluorescein-Phosphatidylethanolamin (FPE) besteht aus einer

Fluoresceingruppe und Phosphatidylethanolamin (PE). Das Fluorescein ist dabei

über die Ethanolaminkopfgruppe an das PE gekoppelt. Dies ermöglicht die

Integration von FPE in eine Membran und somit die Quantifizierung des

elektrostatischen Potentials einer Membran (Wall et al., 1995). Wenn eine Membran,

die FPE beinhaltet, mit einem geladenen Molekül interagiert, führt dies zu einer

Änderung des Membranpotentials, was wiederum den Protonierungszustand des

Xanthenringes beeinflusst. Dies bewirkt eine Änderung der Fluoreszenzintensität und

kann zur Quantifizierung einer Membraninteraktion genutzt werden. Da diese

Methode jedoch auf einer Änderung des Membranpotentials basiert, können nur

geladene Modellmembranen verwendet werden. Membranen aus zwitterionischen

Lipiden können nicht verwendet werden, da diese kein Membranpotential aufweisen.

Proteine besitzen auf ihrer Oberfläche größtenteils geladene Aminosäuren und sind

daher auch geladene Moleküle. Eine Protein-Membran Interaktion führt daher auch

zu einer Änderung des Membranpotentials und kann mittels FPE gemessen werden.

Für eine Messung wurden 10 µM FPE-markierter Liposomen (0.5 mol-% FPE)

verwendet, zu denen PmtA (0 - 45 µM) hinzu titriert wurde. Die Fluoreszenz von FPE

wurde mit 490 nm angeregt und das Emissionsspektrum zwischen 500 – 600 nm

aufgezeichnet. Das Spektrum wurde mit einer Abtastgeschwindigkeit von 5 nm/s und

im Abstand von 2 nm aufgezeichnet. Die Spaltbreite wurde auf 4 nm eingestellt.


- 44 -

2.7.13 Protein-Lipid-Overlay-Assay

Der Protein-Lipid-Overlay-Assay wurde nach Dowler (Dowler et al., 2002)

durchgeführt. Dafür wurden zuvor getrocknete Lipide in einem

Methanol:Chloroform:Wasser Gemisch (2 : 1 : 0.8) aufgenommen und 2 oder

14 nmol auf eine C-Hybond Membran (Amersham) pipettiert. Als Kontrolle, um

Membranschäden auszuschließen, wurde auch das Lösungsmittel in äquivalentem

Volumen aufgetragen. Anschließend wurden die Membranen mind. 1 Stunde bei RT

getrocknet. Die Blockierung der Membran erfolgte mit TBST mit 2 mg/ml BSA für

1 Stunde. Nach erfolgreicher Blockierung, wurde in frische Blockierungslösung

25 µM PmtA hinzugegeben. Um eine Protein-Lipid-Interaktion zu ermöglichen

wurden die Ansätze für 2 Stunden auf einer Kippwaage inkubiert. Ungebundenes

Protein wurde mit zweimaligem Waschen mit TBST und dreimaligem Waschen in

TBS für jeweils 8 min weggewaschen. Zur Detektion der His-getaggeten PmtA wurde

ein Penta-His-Hrp-Konjugat nach Herstellerangaben der Firma Qiagen verwendet.

Der Nachweis erfolgte unter Verwendung des ECL-Systems (GE-Healthcare) nach

Angaben des Herstellers.

TBS-Puffer pH 8.0

Tris-HCl 150 mM

NaCl 50 mM

TBST-Puffer pH 8.0

Tris-HCl 150 mM

NaCl 50 mM

Tween-20 0.5 % (v/v)


- 45 -

2.7.14 Limitierte Proteolyse

Die limitierte Proteolyse ist eine Methode zur qualitativen Analyse einer Protein-

Liganden-Interaktion. Das Prinzip beruht auf dem unterschiedlichen Abbau eines

Proteins durch eine Protease in Ab- und Anwesenheit eines Liganden. Da ein Abbau

von Proteinen durch Proteasen sehr schnell erfolgt, wurde dieses Experiment unter

limitierenden Bedingungen für die Protease durchgeführt. Limitierende Bedingungen

sind beispielsweise die Temperatur oder die Dauer der Inkubation mit der Protease

(Fontana et al., 2004).

In dieser Arbeit wurde die limitierte Proteolyse zur Untersuchung der

Lipidbindeeigenschaften von PmtA verwendet. Dafür wurde der Abbau von PmtA in

An- und Abwesenheit von unterschiedlichen Lipiden untersucht. PmtA wurde mit

verschiedenen Liposomen für eine Stunde bei 4 °C vorinkubiert, um eine Anlagerung

von PmtA an die Liposomen zu gewährleisten. Die Konzentration an eingesetztem

Protein betrug 30 μM, die Konzentration der Phospholipide 150 μM. Als

Vergleichsansatz wurde ein Ansatz ohne Liposomen verwendet. Die Degradation

wurde durch Zugabe der Protease Chymotrypsin oder Trypsin initiiert. Die

Inkubationszeit mit der Protease erfolgte für 0, 2, 5, 7, 10, 15, und 30 min. Zur

Beendigung des Proteinverdaus wurden jeweils 20 μl aus den entsprechenden

Ansätzen entnommen, 5 µl SDS-Probenpuffer hinzugegeben und aufgekocht. Im

Anschluß wurden die Proben über eine SDS-PAGE aufgetrennt und die Proteine

mittels Coomassiefärbung visualisiert.

2.7.15 Tryptischer Verdau im Gel und Massenspektrometrie

Aus den Banden des SDS-Gels wurden mit einem Skalpell 1.5 – 3 mm große Stücke

ausgeschnitten. Zur Entfärbung und Dehydradation der Gel-Stücke wurde 150 μl

50 mM Ammoniumbicarbonat (pH 8.5) und 50 % Acetonitril hinzu gegeben. Die

Proben wurden dann für 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Lösung wurde nach der

Inkubation abgenommen. Danach wurden 5 μl 5 % Iodacetamid in 50 mM

Ammoniumbicarbonat (pH 8.5) zugegeben und für 20 min bei 37 °C inkubiert.

Anschließend wurden die Gel-Stücke 2-mal für 10 min mit 100 μl Wasser

gewaschen. Der Peptidverdau erfolgte durch Trypsin für 16 Stunden bei 37 °C. Um


- 46 -

daraufhin die Peptide aus dem Gel zu extrahieren wurden zu jedem Gel-Stück 15 μl

60 % Acetonitril / 1% Tetraflur-Essigsäure (TFA) zugegeben und für eine Stunde

inkubiert. Danach wurde die Lösung in neue Eppendorfgefäße überführt und bis zu

einem Volumen von 2 μl eingedampft. Anschließend wurde 1 μl der Probe auf ein

MALDI-ToF-Target gespottet und in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Redox

Proteomics (Ruhr-Uni Bochum, Jun. Prof. Lars Leichert) in einem

Massenspektrometer (Ultraflex II MALDI TOF/TOF) vermessen und ausgewertet.


- 47 -

2.8 Lipidanalytik

2.8.1 Lipidextraktion

Um die Membranlipidkomposition einer Überexpressionskultur oder die

Reaktionsprodukte eines in vitro-Aktivitätsassays zu analysieren, wurde eine

Lipidextraktion nach Bligh und Dyer durchgeführt (Bligh & Dyer, 1959). Dafür wurden

2 ml Zellen durch Zentrifugation (13000 UpM für 1 min, EZ, RT) geerntet. Der

Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 500 µl H2O gewaschen. Anschließend

wurden die Zellen in 100 µl H2O resuspendiert. Die resuspendierten Zellen oder der

Ansatz eines in vitro-Aktivitätsassays wurde mit 375 µl Methanol:Chloroform 2:1

versetzt. Nach 15 Sekunden Vortexen wurde die Probe 3 Minuten bei 13 000 UpM

zentrifugiert (EZ, RT). Der flüssige Überstand wurde vorsichtig abgenommen und in

ein neues Eppendorfgefäß überführt. Dieser Überstand wurde mit 100 µl Chloroform

und 100 µl H2O durch 15 sekündiges Vortexen gemischt. Nach einem weiteren

Zentrifugationsschritt (13000 UpM, 3 min, EZ, RT) wurde die Chloroformphase

(~200 µl untere Phase) abgenommen und in einer SpeedVac (UNIV PO 100 H)

getrocknet. Die getrockneten Lipide wurden in 20 µl Methanol:Chloroform 1:1 gelöst

und auf eine Dünnschichtchromatographieplatte aufgetragen.

2.8.2 Dünnschichtchromatographie (DC)

Die DC-Platten (Merck; HPTLC-Aluminiumfolien, 20 x 20 cm, Kieselgel 60;

Schichtdicke 0.2 mm) wurden in einem Laufmittel (3 : 2 : 2 : 1

n-Propanol : Propionsäure : Chloroform : Wasser) in einer DC-Kammer entwickelt.

Zur Visualisierung der Lipide wurde entweder das „Molybdenum Blue Spray“ der

Firma Sigma verwendet oder eine Kupfersulfat-Färbung durchgeführt. Die

Molybdänblau-Färbung ist ein spezifisches Nachweisverfahren für Phospholipide, bei

dem das Molybdänblau mit der Phosphatgruppe der Phospholipide reagiert.

Die Kupfersulfat-Färbung ist hingegen ein unspezifisches Nachweisverfahren, das

auf der Verkohlung von Kohlenstoffatomen basiert. Für die Kupfersulfat-Färbung

wurde die getrocknete DC-Platte für ca. 3 Sekunden in ein Kupfer-Sulfat-Reagenz

getaucht, getrocknet und anschließend bei 170 °C in einem Wärmeschrank erhitzt.


- 48 -

Phospholipide und eventuell noch andere organische Verbindungen wurden nach ca.

6 – 8 min sichtbar.

Kupfersulfat-Färbereagenz

Kupfersulfatpentahydrat 75 g

Phosphorsäure (85 %) 100 ml

H2O ad 1000 ml


- 49 -

2.9 Chemikalienliste

Chemikalien Hersteller

-Mercaptoethanol Merck

40 % Acrylamid/Bisacrylamid Biorad

Agar Roth

Ammoniumpersulfat Pharmacia Biotech

Ampicillin Serva

Borsäure J.T.Baker

Bromphenolblau Riedel-de Haën

C8-PE Avanti Polar Lipids

Calciumsulfat J.T.Baker

Chloroform Prolabo

Cholin Sigma Aldrich

Coomassie Brilliant Blue R 250 Serva

Dinatriumhydrogenphosphat J.T.Baker

DMSO J.T.Baker

EDTA Merck

Eisen(III)Chlorid Fulka

Essigsäure J.T.Baker

Formiat VWR Prolabo

Fluorescein-Phosphatidyltehanolamin Avanti Polar Lipids

Glycerin J.T.Baker

Glycin Applichem

Hefeextrakt Becton Dickinson

IPTG Applichem

Kaliumacetat J.T.Baker

Kaliumnitrat Riedel-de Haën

Kanamycin Serva

Kobaldchlorid Riedel-de Haën

Kupfersulfat Riedel-de Haën

Lysozym Serva

Lyso-Phosphatidylethanolamin Sigma Aldrich

Magnesiumchlorid J.T.Baker

Magnesiumsulfat Applichem

Manganchlorid J.T.Baker

Mangansulfat Riedel-de Haën

Methanol J.T.Baker

NaCl J.T.Baker

Natriumacetat J.T.Baker

Natriummolybdat Riedel-de Haën

Natriumnitrat Riedel-de Haën


- 50 -

Natronlauge Waldeck

Nitrilessigsäure Sigma

n-Propanol J.T.Baker

Dimethylphosphatidylethanolamin Sigma Aldrich

Monomethylphosphatidylethanolamin Sigma Aldrich

Phosphatidat Sigma Aldrich

Phosphatidylcholin Sigma Aldrich

Phosphatidylethanolamin Sigma Aldrich

Phosphorylethanolamin Sigma Aldrich

Phosphocholin Sigma Aldrich

Phosphorsäure J.T.Baker

Propionsäure J.T.Baker

Rubidiumchlorid Sigma

Schwefelsäure J.T.Baker

SDS Applichem

TEMED Pharmacia Biotech

Tris-HCl AppliChem

Triton X-100 Serva

Trypton Becton Dickinson

Zinksulfat Riedel-de Haën

2.10 Geräteliste

Gerät Hersteller

CD-Spektrometer Spectropolarimeter Jasco J-715

Elektrophoresekammern BioRad Mini-Protean Gelkammer II Dual Slab Cell

Ruhr-Universität Bochum Eigenbauten

Feinwaage Sartorius 2004 MP

Fluorimeter Thermo Amicon Bowman II Luminescence

Spectrometer

Constant Cell Disruption System

Constant Systems Ltd

Gelfiltrationssäule Pharmacia Superdex 200 HR 10/30

Gelfiltrationssystem Amersham Äkta Explorer

Inkubationsschüttler New Brunswick Scientific Innova 4230 Ruhr-Universität-Bochum Eigenbauten

Microplatereader Biotek µQuant


- 51 -

pH-Meter Mettler Toledo pH-Meter SevenEasy

Spannungsgeber Biometra Power Pack P25 T

BioRad PowerSupply 200V/2.0A

Spektralphotometer Amersham Biochrom Ultrospec II

Peqlab Nano-drop Pharmacia Biotech Novaspec II

Szintillationszähler Beckman Counter (LS-6000 TA)

Videodokumentationsanlage Alpha Innotech Multi Image Light Carbinet

Wärmeschrank Heraeus Instruments Typ UT6420

Zentrifugen

Eppendorf Tischzentrifuge 5415D Heraeus Biofuge Megafuge 1.0R

Sorvall Kühlzentrifuge RC-5B (Rotoren SS-34, SLA 3000)

Alle nicht aufgeführten Kleingeräte entsprechen dem allgemein üblichen

Laborstandard.

2.11 Software - / Linkliste

Programm Hersteller / Link

BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

Clonemanager Sci-Ed

ClustalW http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html

GeneDoc http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/index.html

I-TASSER http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/

K2D2 http://www.ogic.ca/projects/k2d2/

Peptidecutter http://web.expasy.org/peptide_cutter/

Protein Calculator http://www.scripps.edu/~cdputnam/protcalc.html

ProtParam http://www.expasy.org/tools/protparam.html

PSI Pred http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/

Pymol DeLano Scientific LLC; Version 0.99rc6b

Seqman DNASTAR

SigmaPlot 9.0 Systat

Stride http://webclu.bio.wzw.tum.de/cgi-bin/stride/stridecgi.py

Ergebnisse

- 52 -

3. Ergebnisse

Kapitel 1

3.1 SAM-Bindeeigenschaften der Phospholipid N-

Methyltransferase aus Agrobacterium tumefaciens

Die agrobakterielle Phospholipid N-Methyltransferase PmtA katalysiert die

Methylierung von PE zu PC. Als Methyldonor für diese Reaktion dient SAM, das zu

SAH umgesetzt wird. Putative SAM-Bindemotive wurden in PmtA bioinformatisch

identifiziert und die konservierten Aminosäuren mittels QuikChange® Mutagenese

ausgetauscht. PmtA und PmtA-Derivate wurden in E. coli heterolog überexprimiert

und mittels Affinitätschromatographie (Hexahistidin-Tag) isoliert, um die SAM-

Bindeeigenschaften zu analysieren.

3.1.1 Bioinformatische Identifizierung putativer SAM-Bindemotive

in PmtA

PmtA zählt aufgrund seiner Aminosäuresequenz zu den sinorhizobiellen Pmt-

Enzymen. Durch einen Aminosäuresequenzvergleich mit verschiedenen Enzymen

des sinorhizobiellen-Typs wurden putative SAM-Bindemotive für PmtA identifiziert.

Das SAM-Bindemotiv I (SAM-I-Motiv) ist in allen SAM-MTs hoch konserviert. Es

besteht aus einer sauren Aminosäure mit einem anschließenden glycinreichen Loop

(D/ExGxGxG). Dieses Motiv ist auch in allen Pmt-Enzymen hoch konserviert und im

N-terminalen Bereich lokalisiert (Abbildung 9). Die Aminosäuren E58, G60, G62 und

G64 bilden das putative SAM-I-Motiv in PmtA. Die Aminosäuren der weiteren SAM-

Bindemotive sind in verschiedenen SAM-MTs zum Teil sehr variabel. Einige

konservierte Aminosäuren dieser SAM-Bindemotive befinden sich in verschiedenen

Proteinen an strukturell äquivalenten Positionen. Daher wurden diese konservierten

Aminosäuren in PmtA mit Hilfe einer Sekundärstrukturvorhersage identifiziert

(I-TASSER; Zhang, 2008). Für das SAM-II-Motiv ist eine saure Aminosäure (D/E) am

Ende des β-Faltblattes 2 oder im daran angrenzenden Loop charakteristisch. An

Position 84 in PmtA befindet sich ein Glutamat (E), das diese Kriterien erfüllt. Für das

Ergebnisse

- 53 -

SAM-III-Motiv wird eine weitere saure Aminosäure im C-terminalen Bereich des β-

Faltblattes 3 als typisches Merkmal beschrieben. Das Aspartat (D) an Position 106 in

PmtA stellt die konservierte Aminosäure des putativen SAM-III-Motives für PmtA dar.

Abbildung 9: Aminosäuresequenzvergleich bakterieller Phospholipid N-Methyltransferasen (Pmt). Hoch konservierte Aminosäuren sind schwarz unterlegt. Die putativen SAM-Bindemotive sind eingezeichnet (SAM-I – III). Über der Aminosäuresequenz ist die vorhergesagte Sekundärstruktur (I-TASSER, Zhang, 2008) für PmtA eingezeichnet. *: unlösliche PmtA-Derivate; Atum: Agrobacterium tumefaciens; Smel: Sinorhizobium meliloti; Bjap: Bradyrhizobium japonicum; Mloti: Mesorhizobium loti;

Ml:mlr5374: putatives Pmt-Enzym aus Mloti; SAM-I / II / III: SAM-Bindemotiv I / II / III.

Um die Bedeutung der identifizierten Aminosäuren für die SAM-Bindung zu klären

(SAM-I-Motiv: E58, G60, G62, G64; SAM-II-Motiv: E84; SAM-III-Motiv: D106),

wurden diese mittels QuikChange® Mutagenese gegen ein Alanin ausgetauscht. Im

Folgenden wurde die enzymatische Aktivität, Faltung und SAM-Bindefähigkeit der

entstandenen PmtA-Derivate analysiert. Als Kontrolle diente ein PmtA-Derivat

(G162A) mit einem Aminosäureaustausch außerhalb der beschriebenen putativen

SAM-Bindemotive an Position 162.

Ergebnisse

- 54 -

3.1.2 Einfluss von Punktmutationen in putativen SAM-Bindemotiven

auf die PmtA-Aktivität

Die PmtA-Derivate E58A, G60A, P61A, G62A, G64A, E84A, D106A und G162A

wurden in E. coli BL21 (DE3) mittels des T7-Expressionssystems heterolog

überexprimiert. Alle PmtA-Derivate wurden erfolgreich überexprimiert (Abbildung

10A). Die Derivate G64A und D106A waren allerdings vollständig unlöslich. Im Falle

von D106A verbesserte auch ein Austausch von Glutamat zu Aspartat die Löslichkeit

des Proteins nicht. Daher konnten keine weiterführenden Analysen für diese PmtA-

Derivate durchgeführt werden. Alle anderen PmtA-Derivate konnten mittels

Affinitätschromatographie isoliert und näher charakterisiert werden.

Abbildung 10: Heterologe Überexpression und Enzymaktivität verschiedener PmtA-Varianten. (A.) Analyse der Synthese von verschiedenen PmtA-Derivate in E. coli BL21 (DE3) mittels SDS-PAGE. (B.) Dünnschichtchromatographische Auftrennung von Gesamtlipiden aus E. coli BL21 (DE3) Zellen, die verschiedene PmtA-Derivate exprimieren. Die Lipide wurden mit einem Kupersulfatreagenz visualisiert.

Die Aktivität der PmtA-Derivate wurde durch Nachweis der Biosyntheseprodukte

analysiert. Dafür wurden die Gesamtlipide der PmtA synthetisierenden E. coli

Stämme isoliert und mittels Dünnschichtchromatograhpie aufgetrennt. Mit einem

Kufpersulfatreagenz wurden die aufgetrennten Lipide visualisiert (Abbildung 10B).

Ergebnisse

- 55 -

E. coli ist natürlicherweise nicht in der Lage PC zu synthetisieren. Eine

Überexpression von PmtA in E. coli führt zur PC-Biosynthese, was für diesen

Versuch als Basis zur Aktivitätsanalyse genutzt wurde (Aktas & Narberhaus, 2009).

Es zeigte sich, dass das Kontroll-Derivat G162A wildtyp-ähnliche PmtA-Aktivität

besitzt (Abbildung 10B). P61 ist eine nur in Pmt-Enzymen konservierte Aminosäure

innerhalb des SAM-I-Motivs, jedoch hat diese Aminosäure vermutlich keine

Bedeutung für die SAM-Bindung (Abbildung 9 und Abschnitt 1.3.3). Eine

Punktmutation an dieser Position hat daher keinen Einfluss auf die enzymatische

Aktivität. Im Gegensatz dazu führt eine Mutation der konservierten Glycine an den

Postionen 60 und 62 zu einer drastischen Reduktion der PmtA-Aktivität (Abbildung

10B). Die PmtA-Derivate E58A und E84A waren vollständig inaktiv, da weder MMPE,

DMPE noch PC nachgewiesen werden konnten. Somit sind die Aminosäuren E58,

G60, G62 und E84 für die PmtA-Aktivität essentiell.

3.1.3 Beeinflussen die Punktmutationen die Faltung von PmtA-

Derivaten?

Im vorherigen Abschnitt wurde gezeigt, dass Punktmutationen einen erheblichen

Einfluss auf die PmtA-Aktivität haben. Um auszuschließen, dass der Aktivitätsverlust

auf einem strukturellen Defekt beruht, wurde die Faltung dieser Proteine überprüft.

Die Circular Dichroismus-Spektroskopie (CD-Spektroskopie) ist eine Methode, mit

der die Sekundärstruktur und Faltung eines Proteins untersucht werden kann (Kelly &

Price, 2000). Ein CD-Spektrum stellt dabei die Gesamtheit aller einzelnen

Sekundärstrukturanteile eines Proteins (α-Helices, β-Faltblätter und Loops) dar und

kann mithilfe eines passenden Algorithmus dekonvoliert werden. Dadurch erhält man

Informationen über den prozentualen Anteil an α-Helices, β-Faltblättern und

ungefalteten Regionen eines Proteins (Kelly & Price, 2000). Durch diese Methode ist

es daher möglich die PmtA-Derivate auf eventuelle strukturelle Unterschiede zu

untersuchen, die die Aktivität beeinflussen könnten.

Das CD-Spektrum für PmtA hat ein Minimum an Elliptizität bei ca. 208 - 210 nm

(Abbildung 11A). Das Spektrum weist auf einen hohen Anteil an α-Helices in der

Sekundärstruktur hin. Eine Dekonvolierung des CD-Spektrums mit CDSSTR und

K2D2 (Sreerama & Woody, 2000; Perez-Iratxeta & Andrade-Navarro, 2008) lässt auf

Ergebnisse

- 56 -

einen α-helikalen Anteil von ca. 42 % bzw. 39 % schließen. Der Anteil an β-

Faltblättern beträgt ca. 11 %. Die experimentell ermittelten Daten für die

Sekundärstruktur werden durch in silico-Vorhersagen gestützt (Abbildung 11B). Die

Programme GOR IV und PHD (Rost & Sander, 1993; Garnier et al., 1996) nutzen die

Primärsequenz von Proteinen, um den Sekundärstrukturanteil zu berechnen. Stride

hingegen nutzt eine Struktur oder ein Homologiemodell, um das α/β-Verhältnis zu

bestimmen (Heinig & Frishman, 2004) (Abbildung 11B).

Abbildung 11: CD-spektroskopische Analyse von PmtA. (A.) CD-Spektrum von PmtA. Die minimale Elliptizität liegt bei ca. 210 nm. (B.) Übersicht der prozentualen Anteile an Sekundärstrukturelementen in PmtA. GOR IV und PHD berechnen den Sekundärstrukturanteil anhand der Primärsequenz eines Proteins. Für eine Sekundärstrukturanalyse nutzt Stride bekannte Proteinstrukturen oder Homologiemodelle. CDSSTR und K2D2 sind Algorithmen zur Dekonvolierung von experimentellen CD-Spektren. Mdeg: millidegree

Die strukturelle Integrität der PmtA-Derivate E58A, G60A, G62A und E84A wurde

mittels CD-Spektroskopie untersucht und mit wildtyp PmtA verglichen. Alle PmtA-

Derivate wiesen ein wildtyp-ähnliches CD-Spektrum auf, was für eine native Faltung

der PmtA-Derivate spricht (Abbildung 12). Die eingefügten Mutationen hatten somit

keinen Einfluss auf die Sekundärstruktur von PmtA. Einen weiteren Hinweis für eine

native Faltung liefert das Aufschmelzverhalten von PmtA und der PmtA-Derivate. Der

Übergang von einer geordneten zu einer ungeordneten Struktur stellt den

Wendepunkt einer Schmelzkurve dar (Nelson & Cox, 2009). Der Schmelzpunkt (Tm)

von PmtA liegt bei ca. 35.9 °C. Alle PmtA-Derivate hatten einen vergleichbaren

Schmelzpunkt von ca. 35.5 °C (Abbildung 12B und C). Eine Missfaltung der Proteine

Ergebnisse

- 57 -

kann somit als Grund für den enzymatischen Aktivitätsverlust ausgeschlossen

werden. Sehr wahrscheinlich ist, dass durch den Aminosäureaustausch die SAM-

Bindung negativ beeinflusst wird. Daher wurde im Folgenden die SAM-Bindefähigkeit

der PmtA-Derivate untersucht.

Abbildung 12: Sekundärstrukturvergleich und Thermostabilität von PmtA und PmtA-Derivaten. (A.) CD-Spektrum von PmtA und den PmtA-Derivaten. Die Proteine weisen eine native Faltung auf. (B.) Thermostabilität von PmtA. Die Tm für PmtA beträgt ca. 35.9 °C. (C.) Vergleich der

Schmelzpunkte von PmtA und den PmtA-Derivaten.

3.1.4 SAM-Bindefähigkeit von PmtA und PmtA-Derivaten

Die PmtA-Derivate E58A, G60A, G62A und E84A zeigten einen deutlichen

enzymatischen Defekt (Abbildung 10), jedoch wiesen alle PmtA-Derivate eine native

Faltung auf (Abbildung 12). Um die SAM-Bindefähigkeit der PmtA-Derivate zu

untersuchen, wurde ein Filterbindeassay verwendet (Aktas & Narberhaus, 2009).

Dafür wurde PmtA bzw. die PmtA-Derivate mit radioaktiv markiertem SAM

(S-[methyl-14C]adenosyl-L-methionin) inkubiert und die gebundene Menge 14C-SAM

mittels Szintillationszähler detektiert. Die SAM-Bindefähigkeit des wildtyp PmtA (WT)

wurde als 100 % gesetzt. Für die Bestimmung der Dissoziationskonstanten (KD) von

SAM zu PmtA bzw. zu den PmtA-Derivaten wurden Ansätze mit steigenden SAM-

Konzentrationen verwendet.

Abbildung 13 zeigt einen relativen Vergleich der SAM-Bindefähigkeit von PmtA (WT)

und den PmtA-Derivaten. Die enzymatisch aktiven PmtA-Derivate P61A und G162A

waren in der Lage SAM vergleichbar effizient wie wildtyp PmtA (WT) zu binden (74 –

78 %). E58A, G60A und G62A konnten hingegen nur sehr geringe Mengen an SAM

Ergebnisse

- 58 -

binden. Einen drastischeren Effekt zeigte E84A, da dieses PmtA-Derivat nicht mehr

fähig war detektierbare Mengen an SAM zu binden.

Abbildung 13: Relative SAM-Bindung der PmtA-Derivate E58A, G60A, P61A, G62A, E84A und G162A. Es wurden 10 µM rekombinantes Protein mit 100 µM S-[methyl-

14C]adenosyl-L-methionin

(48.8 mCi/mmol) in Gegenwart von 100 µM PE inkubiert. 100 % an S-[methyl-14

C]adenosyl-L-

methionin entspricht 143 757 dpm.

Um die SAM-Bindung von PmtA zu charakterisieren, wurden Titrationsexperimente

mit radioaktiv markiertem SAM durchgeführt. Für PmtA (WT) und die PmtA-Derivate

P61A sowie G162A wurde eine Dissoziationskonstante im mikromolaren Bereich

ermittelt (P61A: 22 µM; G162A: 30 µM; PmtA: 25 µM). Da die PmtA-Derivate E58A,

G60A und G62A kaum SAM binden, konnten keine Dissoziationskonstanten

bestimmt werden.

Abbildung 14: SAM-Titrationskurven von PmtA (WT) und PmtA-Derivaten. Das Reaktionsvolumen betrug 50 µl, wobei 10 µM PmtA und 100 µM PE-Lipsosomen eingesetzt wurden. Aufgetragen wurde die Änderung von gebundenem

14C-SAM [dpm] gegen die Konzentration des eingesetzten

14C-SAM [µM]. Titrationskurve mit PmtA (A.), den PmtA-Derivate P61A und G162A (B.), sowie E58A,

G60A, G62A und E84A (C.).

Ergebnisse

- 59 -

In vorangehenden Experimenten wurde gezeigt, dass die SAM-Bindung durch PmtA

nur in Gegenwart von Phospholipidsubstraten erfolgt (Aktas & Narberhaus, 2009).

Möglicherweise wird erst durch die Lipidsubstratbindung die SAM-Bindetasche

zugänglich, sodass SAM gebunden werden kann. Um auszuschließen, dass der

Verlust der SAM-Bindung der PmtA-Derivate auf einem Verlust der Lipidsubstrat-

bindung beruht, wurde die Lipidbindung von PmtA und den PmtA-Derivaten mit

einem „Protein-Lipid-Overlay-Assay“ getestet. Dabei konnte gezeigt werden, dass

alle PmtA-Derivate in der Lage sind sowohl Gesamtlipidextrakt aus A. tumefaciens,

als auch kommerziell erhältliches PE zu binden (Abbildung 15).

Abbildung 15: Protein-Lipid-Overlay-Assay mit PmtA und den PmtA-Derivaten E58A, G60A, P61A, G62A, E84A und G162A. Als Lipidsubstrat wurden gleiche Mengen an Gesamtlipidextrakt aus A. tumefaciens oder 14 nmol Phosphatidylethanolamin verwendet. Gebundenes Protein wurde mit

einem Anti-Penta-His HRP-Konjugat der Firma Qiagen detektiert.

Die in diesem Kapitel präsentierten Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die

Aminosäuren E58, G60, G62 und E84 in PmtA für die SAM-Bindung essentiell sind

und höchstwahrscheinlich die SAM-Bindetasche formen. Eine solche Funktion wird

später anhand eines Strukturmodells diskutiert (Abschnitt 4.1).

Weiterhin konnten diese Aminosäuren den für SAM-MTs bekannten SAM-

Bindemotiven zugeordnet werden. Das SAM-I-Motiv bilden dabei die Aminosäuren

E58, G60 und G62. Die Aminosäure E84 konnte als konservierte Aminosäure des

SAM-II-Motivs für PmtA identifiziert und verifiziert werden.

Ergebnisse

- 60 -

Kapitel 2

3.2 Einfluss der Membranlipidzusammensetzung auf die

Aktivität und Membranbindung von PmtA

Das Membranlipid PE ist das natürliche Phospholipid-Substrat von PmtA. Das Enzym

PmtA gehört daher zu den peripheren Membranproteinen, deren Substrat ein

Bestandteil der bakteriellen Membran ist. Die detaillierte Funktionsweise bakterieller

Pmt-Enzyme ist jedoch bis heute relativ unklar. Bisher konnte gezeigt werden, dass

die Bindung eines Phospholipidsubstrates der erste Schritt der Transmethlyierungs-

reaktion ist (Aktas & Narberhaus, 2009). Unklar ist jedoch, warum eine

Phospholipidsubstratbindung als initialer Schritt erfolgen muss, damit der Kofaktor

SAM binden kann. Weiterhin stellt sich die Frage, wie Phosphatidylglycerin (PG) die

Aktivität von PmtA stimuliert, obwohl es die SAM-Bindung nicht begünstigt (Aktas &

Narberhaus, 2009). Daher soll im Folgenden die Protein-Lipid-Interaktion von PmtA

und der Einfluss der Membranlipidkomposition auf die Aktivität näher untersucht

werden.

3.2.1 Negativ geladene Lipide stimulieren die PmtA-Aktivität

Eine wichtige Fragestellung dieser Arbeit war, ob die PmtA-Aktivität spezifisch durch

PG stimuliert wird oder ob die PmtA-Aktivität auch durch andere Lipide beeinflusst

wird. PG ist ein anionisches Phospholipid, das in bakteriellen Membranen vorkommt.

Geladene Lipide wie PG können die Aktivität oder Lokalisation von membran-

assoziierten Proteinen beeinflussen (Cornell, 1991a; Johnson & Cornell, 1999;

Linde et al., 2004; Mulgrew-Nesbitt et al., 2006; Minami et al., 2011). Um zu klären

ob nur PG oder auch andere Lipide die enzymatische Aktivität von PmtA

beeinflussen, wurde die PmtA-Aktivität in Gegenwart verschiedener Lipide

untersucht. Eine Übersicht der Kopfgruppen der verwendeten geladenen Lipide ist in

Abbildung 16 dargestellt. Um die PmtA-Aktivität in An- und Abwesenheit dieser Lipide

zu untersuchen, wurde ein bereits etabliertes in vitro-Aktivitätsassay (Aktas &

Narberhaus, 2009) eingesetzt.

Ergebnisse

- 61 -

Abbildung 16: Übersicht der Kopfgruppen ausgewählter geladener Lipide. Rot (-) kennzeichnet

negativ geladene Lipidkopfgruppen, blau (+) hingegen positiv geladene Lipidkopfgruppen.

PmtA wurde mit PE als Substratlipid in Liposomenform und SAM als Methyldonor

inkubiert. Um den Effekt verschiedener geladener Lipide auf die PmtA-Aktivität zu

untersuchen, wurden diese mit dem Substratlipid vermischt und anschließend dem

Ansatz als „Mischmembranen“ hinzugegeben. Nach Ablauf der Reaktionszeit von

einer Stunde, wurden die Reaktionsprodukte isoliert, mittels Dünnschicht-

chromatographie (DC) aufgetrennt und mit spezifischen Färbemethoden visualisiert.

Abbildung 17A zeigt, dass PmtA PE-Liposomen als Substrat nutzen kann. Über die

Zwischenstufen MMPE und DMPE wird PE zum Endprodukt PC methyliert.

Rekonstituiert man in diese künstliche PE-Membran zusätzlich PG, so wird die PmtA-

Aktivität stimuliert und die Produkte MMPE, DMPE sowie PC werden vermehrt

gebildet. Dies wurde bereits in vorherigen Arbeiten (Aktas & Narberhaus, 2009)

gezeigt und konnte in dieser Arbeit bestätigt werden.

Ergebnisse

- 62 -

Abbildung 17: PmtA-Aktivitätsanalyse in An- bzw. Abwesenheit geladener Lipide. In einem Ansatz wurden 10 µM PmtA, 400 µM Phospholipidsubstrat, 100 µM anionisches Lipid und 1.84 mM SAM verwendet. Als Phospholipidsubstrat diente Phosphatidylethanolamin (PE). Die Reaktionsprodukte wurden dünnschichtchromatographisch aufgetrennt und anschließend mit Molybdänblau visualisiert. CL: Cardiolipin; DMPE: Dimethyl-PE; DPPG: Lysyl-PG; MMPE: Monomethyl-PE; PA: Phosphatidat; PG: Phosphatidylglycerin; PI: Phosphatidylinositol; PS: Phosphatidylserin.

Ersetzt man nun PG durch ein anderes anionisches Lipid wie beispielsweise

Phosphatidylserin (PS), Phosphatidylinositol (PI), Phosphatidat (PA) oder Cardiolipin

(CL), so beobachtet man ebenfalls eine Stimulation der PmtA-Aktivität. Die

Stimulation durch PG ist daher wahrscheinlich die Konsequenz einer negativ

geladenen Phospholipid-Kopfgruppe. Im Gegensatz dazu hat das kationische Lipid

DPPG keinen stimulierenden Effekt auf die PmtA-Aktivität (Abbildung 17). Da DPPG

und PC im verwendeten Laufmittel schwer voneinander zu trennen sind, wurden

diese Lipide in Abbildung 17 mit Pfeilen gekennzeichnet. Insgesamt zeigen diese

Ergebnisse, dass nur negativ geladene Lipide einen Einfluss auf die PmtA-Aktivität

haben.

3.2.2 Haben anionische Lipide einen Einfluss auf die SAM-Bindung

von PmtA?

Im Gegensatz zu den Phospholipidsubstraten PE, MMPE, DMPE und PC ermöglicht

PG keine SAM-Bindung von PmtA (Aktas & Narberhaus, 2009). Um zu klären, ob

dies auch für andere Nicht-Substratlipide zutrifft, wurde ein Filterbindeassay mit

Ergebnisse

- 63 -

radioaktiv markiertem SAM eingesetzt. Dabei wurde die durch PmtA gebundene

Menge an radioaktivem SAM (S-[methyl-14C]adenosyl-L-methionin) mittels

Szintillationszähler detektiert. Es wurde bereits gezeigt, dass die Anwesenheit eines

Phospholipidsubstrates für PmtA notwendig ist, um SAM binden zu können (Aktas &

Narberhaus, 2009). In dieser Arbeit wurde sowohl die Notwendigkeit der

Anwesenheit eines Phospholipidsubstrates für die SAM-Bindung durch PmtA, als

auch die Tatsache, dass PG keine SAM-Bindung ermöglicht, bestätigt. Weiterhin

wurde gezeigt, dass die anionischen Lipide CL, PS, PA und PI ebenfalls keinen

Einfluss auf die SAM-Bindung von PmtA haben. Auch die Anwesenheit des

kationische DPPG ermöglicht keine SAM-Bindung durch PmtA.

Abbildung 18: SAM-Bindefähigkeit von PmtA in An- und Abwesenheit verschiedener Phospholipide. Für ein Filterbindeassay wurden 10 µM PmtA und 100 µM

14C-SAM (S-[methyl-

14C]adenosyl-L-

methionin) (48.8 mCi/mmol) in Gegenwart von 100 µM Phospholipid inkubiert. 100 % S-[methyl-14

C]adenosyl-L-methionin entsprechen 188 583 dpm. CL: Cardiolipin; DMPE: Dimethyl-PE; DPPG: Lysyl-PG; MMPE: Monomethyl-PE; PA: Phosphatidat; PE: Phosphatidylethanolamin; PG: Phosphatidylglycerin; PI: Phosphatidylinositol; PS: Phosphatidylserin.

Die Stimulierung der PmtA-Aktivität durch anionische Lipide beruht demnach nicht

auf der Stimulierung der SAM-Bindung. Der Bedeutung anionische Lipide für PmtA

wird in Abschnitt 3.2.5 nachgegangen. Im Folgenden soll nun zunächst die

Substratspezifität von PmtA betrachtet werden.

Ergebnisse

- 64 -

3.2.3 Substratspezifität von PmtA

Als Phospholipidsubstrat kann PmtA sowohl natürliche E. coli-Membranen

verwenden, als auch käufliches PE, MMPE oder DMPE (Aktas & Narberhaus, 2009).

In diesem Abschnitt soll nun das Substratspektrum von PmtA näher betrachtet

werden. Im Vordergrund steht dabei die Notwendigkeit der Fettsäurekette für die

Substraterkennung. Um dies zu untersuchen wurde gereinigtes PmtA mit PE-

Derivaten inkubiert und die PmtA-Aktivität mittels DC analysiert. Als PE-Derivat

wurde C8-PE (1,2-Dioctanoyl-sn-Glycerin-3-Phosphoethanolamin) oder Lyso-PE

(LPE) verwendet und die PmtA-Aktivität in An- und Abwesenheit anionischer Lipide

untersucht (Abbildung 19).

Abbildung 19: In vitro PmtA-Aktivität in Gegenwart von PE-Derivaten. (A.) PmtA-Aktivität mit C8-PE als Substratlipid und in der Gegenwart anionischer Lipide. (B.) PmtA-Aktivität mit LPE als Substratlipid und in der Gegenwart anionischer Lipide. C8-PE: 1,2-Dioctanoyl-sn-Glycerin-3-Phosphoethanolamin; CL: Cardiolipin; DMPE: Dimethyl-PE; DPPG: Lysyl-PG; LPE: Lyso-PE; MMPE: Monomethyl-PE; PA: Phosphatidat; PE: Phosphatidylethanolamin; PG: Phosphatidylglycerin; PI: Phosphatidylinositol; PS: Phosphatidylserin.

C8-PE ist ein Phosphatidylethanolamin mit zwei verkürzten Fettsäureketten mit je nur

8 Kohlenstoffatomen (C8). In Abwesenheit anionischer Lipide wird C8-PE nicht als

Substrat erkannt. Bei Anwesenheit der anionischen Lipide PG, PS, PI, PA oder CL

kann C8-PE hingegen als effizientes Methylierungssubstrat verwendet werden

Ergebnisse

- 65 -

(Abbildung 19A). Man erkennt deutlich die Zwischenstufen C8-MMPE und C8-DMPE,

sowie das Endprodukt C8-PC. Ähnlich wie C8-PE kann auch LPE als Substrat

dienen. LPE ist ein Signallipid, das nur in sehr geringen Mengen in einer

Zellmembran vorhanden ist. Weiterhin ist LPE ein Abbauprodukt der

Phospholipase A. LPE besitzt im Vergleich zu PE oder C8-PE nur eine

Fettsäurekette. Dieses PE-Derivat kann in Abwesenheit anionischer Lipide nicht als

Phospholipidsubstrat genutzt werden. Die Gegenwart von PG, CL, PS, PI oder PA

führt hingegen zur Synthese von Lyso-MMPE, Lyso-DMPE und Lyso-PC (Abbildung

19B). Im Gegensatz zu diesen beiden PE-Derivaten wurde wasserlösliches

Phosphorylethanolamin (P-Etn) von PmtA nicht als Substrat erkannt.

Bei einem Filterbindeassay mit 14C-SAM wurde durch die Gegenwart von P-Etn wie

zu erwarten keine SAM-Bindung durch PmtA beobachtet. Die Anwesenheit von C8-

PE führte hingegen zur Bindung geringer SAM-Mengen durch PmtA. Dementgegen

wurde durch die Anwesenheit von LPE keine signifikante SAM-Bindung durch PmtA

begünstigt (Abbildung 20). Dies liegt wahrscheinlich daran, dass PmtA eine geringere

Spezifität zu LPE aufweist, als zu C8-PE.

Abbildung 20: SAM-Bindung von PmtA in Gegenwart von verschiedenen PE-Derivaten. Für ein Filterbindeassay wurden 10 µM PmtA und 100 µM

14C-SAM (S-[methyl-

14C]adenosyl-L-methionin)

(48.8 mCi/mmol) in Gegenwart von 100 µM Phospholipid inkubiert. 100 % S-[methyl-14

C]adenosyl-L-

methionin entsprechen 188 583 dpm.

Ergebnisse

- 66 -

Es konnte somit gezeigt werden, dass ein Phospholipidsubstrat für PmtA eine

Ethanolaminkopfgruppe und einen Fettsäureschwanz benötigt. Desweiteren wurde

gezeigt, dass die Katalyse generell durch anionische Lipide stimuliert wird.

3.2.4 Beeinflussen PC-Analoga/Derivate die PmtA-Aktivität?

Im vorherigen Abschnitt wurde gezeigt, dass PmtA in der Lage ist, verschiedene PE-

Derivate als Substrate zu erkennen, insofern diese als Phospholipid vorliegen.

Vorangehende Arbeiten zeigten, dass das Endprodukt PC PmtA inhibiert (Aktas &

Narberhaus, 2009). Es stellte sich nun die Frage, ob auch PC-analoge Lipide wie

z.B. Sphingomyelin (SM) die PmtA-Aktivität inhibieren können. Natürlicherweise

kommt SM nur in Säugetieren vor und ist strukturell dem PC sehr ähnlich. Ein

wichtiger Unterschied ist jedoch, dass eine Fettsäure am C2-Atom über eine

Amidbindung verknüpft ist (Abschnitt 1.1.1). Aufgrund der homologen Kopfgruppe

von PC und SM sollte der Einfluss von SM auf die PmtA-Aktivität untersucht werden

(Abbildung 21). Die Lipide eines in vitro-Aktivitätsassays wurden hierfür wie bereits

beschrieben isoliert, via DC aufgetrennt und visualisiert. Eine steigende

Konzentration an SM reduzierte die Effizienz der PC-Biosynthese durch PmtA

(Abbildung 21). Bei einem molaren Verhältnis von 0.5 von PE zu SM scheint PmtA

inaktiv zu sein.

Abbildung 21: Einfluss von Sphingomyelin auf die PmtA-Aktivität. Für die in vitro-Aktivitätsassays wurde die Sphingomyelinkonzentration schrittweise erhöht. In einem Ansatz wurden konstant 10 µM PmtA, 400 µM PE und 1.84 mM SAM eingesetzt. Für ein molares Verhältnis von 1 wurden 400 µM PE und 400 µM Sphingomyelin (SM) verwendet. Die Reaktionsprodukte wurden dünnschichtchromatographisch aufgetrennt und anschließend mit Molybdänblau visualisiert.

Ergebnisse

- 67 -

Die Inhibierung von PmtA durch PC basiert wahrscheinlich auf der Konkurrenz von

PC und PE um dieselbe Bindestelle (Aktas & Narberhaus, 2009). Aufgrund der

hohen strukturellen Ähnlichkeit von SM zu PC ist anzunehmen, dass SM ähnlich wie

PC wirkt und vermutlich die Substratbindestelle von PmtA blockiert.

Die Kopfgruppe scheint somit für eine Interaktion mit der Substratbindestelle wichtig

zu sein. Daher wurde untersucht, ob auch die wasserlöslichen Moleküle Cholin oder

Phosphocholin PmtA inhibieren können. Abbildung 22 zeigt das Ergebniss eines

in vitro-Aktivitätsassay mit optimalen Reaktionsbedingungen (PE:PG-Membran) und

einem 250-fachen Überschuss (100 mM) an Cholin oder Phosphocholin. Die PmtA-

Aktivität wurde jedoch durch Cholin oder Phosphocholin nicht beeinflusst. Die

wasserlöslichen Substanzen Cholin und Phosphocholin begünstigen ebenfalls keine

SAM-Bindung durch PmtA, sodass davon auszugehen ist, dass PmtA diese Moleküle

nicht binden kann.

Abbildung 22: In vitro PmtA-Aktivität in Gegenwart von Cholin und Phosphocholin. In einem Ansatz wurden 10 µM PmtA, 400 µM Phospholipidsubstrat, 100 µM PG und 1.84 mM SAM verwendet. Dem Ansatz wurden zusätzlich 100 mM Cholin oder 100 mM Phosphocholin hinzugegeben. Die Reaktionsprodukte wurden dünnschichtchromatographisch aufgetrennt und anschließend mit Molybdänblau visualisiert.

Ergebnisse

- 68 -

3.2.5 Rekrutierung von PmtA zur Membran via elektrostatischer

Interaktionen

In Abschnitt 3.2.2 wurde gezeigt, dass anionische Lipide die PmtA-Aktivität

stimulieren, aber keine SAM-Bindung durch PmtA begünstigen. Die Experimente des

folgenden Abschnittes sollen die Bedeutung von anionischen Lipiden für die PmtA-

Aktivität näher aufklären.

Für eine Protein-Membran-Interaktion gibt es verschiedene Interaktions-

möglichkeiten. Zum einen können Proteine fest in eine Membran integriert sein

(integrale Membranproteine) oder zum anderen peripher an eine Membran assoziiert

(periphere Membranproteine) vorliegen. Bei peripheren Membranproteinen

unterscheidet man weiterhin zwischen Proteinen, die einen Lipidanker besitzen und

Proteinen die mittels Lipidbindemotiven oder elektrostatischen Interaktionen an eine

Membran binden (Abbildung 23).

Abbildung 23: Protein-Membran-Interaktion. Man unterscheidet zwischen peripher-assoziierten Proteinen und integralen Membranproteinen. Periphere Membranproteine binden die Membran über spezifische Lipidbindemotive oder mit Hilfe eines Lipidankers, der eine sehr starke Membran-Protein Interaktion ermöglicht.

Die Interaktion via elektrostatischer Interaktionen ist ein weit verbreiteter

Mechanismus für die Membranassoziation von peripheren Membranproteinen

Ergebnisse

- 69 -

(Mulgrew-Nesbitt et al., 2006). PmtA ist ein lösliches Protein, das keinen Lipidanker

besitzt und dessen Substrat Bestandteil einer Membran ist. Möglicherweise wird

PmtA durch elektrostatische Interaktionen an die Membran gebunden. In silico-

Vorhersagen für PmtA mit dem Programm Proteincalculator zeigen, dass PmtA eine

Nettoladung von +7.4 bei einem physiologischen pH besitzt. Betrachtet man die

theoretische Oberflächenladung eines PmtA-Homologiemodells (erstellt mit I-

TASSER, Zhang, 2008), so fällt auf, dass es zwei stark positiv geladene Bereiche

gibt (Abbildung 24). Daher kann vermutet werden, dass PmtA mittels

elektrostatischer Interaktionen mit negativ geladenen Membranlipiden interagieren

könnte.

Abbildung 24: Die theoretische Oberflächenladung von PtmA wurde auf der Basis eines Homologiemodells von PmtA (I-TASSER, Zhang, 2008) mit Pymol (www.pymol.org) kalkuliert und visualisiert. Es fallen zwei stark positiv geladene Bereiche (blau) auf der PmtA-Oberfläche auf. Rot: negativ geladene Oberfläche; Weiß: ungeladene Oberfläche.

Um diese Hypothese zu prüfen, wurde zunächst die enzymatische Aktivität von PmtA

bei steigender ionischer Stärke in vitro untersucht. Dafür wurde die NaCl-

Konzentration in den in vitro-Ansätzen schrittweise erhöht. Als Modellmembran

diente eine künstliche Membran aus PE mit anionischen Lipiden, um eine

elektrostatische Interaktion zu ermöglichen. Beispielhaft ist in Abbildung 25 das

Ergebnis für PE:PG gezeigt. Anhand des Endproduktes PC ist deutlich zu erkennen,

dass die enzymatische Aktivität von PmtA bei steigender NaCl-Konzentration

abnimmt. PmtA ist bis zu einer NaCl-Konzentration von 0.1 M aktiv. Erhöht man die

Konzentration von NaCl auf 0.25 M, so sind nur noch Spuren an PC zu beobachten.

Ergebnisse

- 70 -

Abbildung 25: PmtA-Aktivität in Gegenwart von aufsteigender NaCl-Konzentration. Für das in vitro-Aktivitätsassay wurden 10 µM PmtA und 400 µM PE verwendet. Um eine elektrostatische Interaktion zu ermöglichen wurden 40 µM PG verwendet. Zu den einzelnen Ansätzen wurde NaCl in steigenden Konzentrationen hinzugegeben. Nach Inkubation von 1 Stunde wurden die Reaktionsprodukte isoliert und mittels Dünnschichtchromatographie aufgetrennt. Anschließend erfolgte eine Visualisierung mit Molybdänblau.

Betrachtet man jedoch die PmtA-Aktivität in Abwesenheit von anionischen Lipiden,

d.h. nur in Anwesenheit von PE als Substrat, so ist ebenfalls eine reduzierte

enzymatische Aktivität zu beobachten. Es waren nur leichte Spuren des

Endproduktes PC bei 0.5 M NaCl zu erkennen. Eine hohe ionische Stärke führt bei

PmtA daher generell zu einer reduzierten enzymatischen Aktivität.

Hohe Salzkonzentration können negative Auswirkungen auf die Hydrathülle eines

Proteins haben (Nelson & Cox, 2009). Um eine Missfaltung oder Denaturierung von

PmtA auszuschließen, wurde die Sekundärstruktur mittels CD-Spektroskopie bei

hohen Salzkonzentrationen untersucht. Da Chloridionen mit dem CD-Spektrum im

fernen UV-Bereich von <205 nm interferieren (Kelly & Price, 2000), wurde nur das

Spektrum zwischen 205 – 260 nm aufgenommen (Abbildung 26).

PmtA zeigte unter salzfreien Bedingungen eine negative Elliptizität mit einem

Minimum bei 208 und 222 nm. In Anwesenheit von 50, 150 oder 500 mM NaCl

wurden keine signifikanten Unterschiede im CD-Spektrum beobachtet, die eine

Denaturierung von PmtA unter diesen Bedingungen andeuten würden. Dies

bedeutet, dass PmtA auch bei hoher ionischer Stärke nicht denaturiert und eine

native Faltung besitzt.

Ergebnisse

- 71 -

Abbildung 26: CD-Spektrum von PmtA in An- und Abwesenheit verschiedener NaCl-Konzentrationen. Für ein CD-Spektrum wurden 7.5 µM PmtA verwendet. Die Spektren wurden bei RT aufgezeichnet und 10-fach akkumuliert. RT: Raumtemperatur.

Die vorangegangenen Experimente zeigen somit, dass hohe ionische Stärke die

PmtA-Aktivität reduziert, jedoch hat die hohe ionische Stärke keinen Einfluss auf die

PmtA-Faltung. Um zu überprüfen, ob die Lipidbindung von PmtA durch hohe ionische

Stärke beeinflusst wird, wurde ein „Protein-Lipid-Overlay-Assay“ bei hoher ionischer

Stärke durchgeführt (Dowler et al., 2002). Dafür wurden Lipide auf einer Membran

fixiert und diese mit PmtA inkubiert. PmtA, das an Lipide gebunden vorlag, wurde

immunochemisch detektiert. Da Lipide nicht wasserlöslich sind, wurden diese in

einem Chloroform-Methanol-Wasser – Gemisch gelöst. Als Kontrolle wurde auch das

verwendete Lösungsmittelgemisch auf die Membran aufgetragen, um chloroform-

bzw. methanolbedingte Membranbeschädigungen auszuschließen (Abbildung 27).

Weiterhin wurde PmtA direkt auf die Membran aufgetragen, um eine Beeinflussung

der immunochemischen Detektion durch hohe Salzkonzentrationen auszuschließen.

Eine Bindung von PmtA an PE oder an isolierte Lipide aus A. tumefaciens wurde bis

zu einer Konzentration von 150 mM NaCl deutlich nachgewiesen. Im Gegensatz

dazu unterschied sich die Bindefähigkeit von PmtA an die anionischen Lipide PG, CL

und PS. Bei einer NaCl Konzentration von 50 mM wurden noch signifikante Mengen

Ergebnisse

- 72 -

an PmtA detektiert. Erhöhte sich die ionische Stärke jedoch auf 150 mM NaCl, so

waren nur noch sehr geringe PmtA-Mengen detektierbar. Eine Konzentration von

500 mM NaCl verdrängte PmtA vollständig. Dies war auch für PE bzw.

A. tumefaciens-Lipide zu beobachten. Der enzymatische Aktivitätsverlust von PmtA

bei hoher ionischer Stärke ist daher vermutlich auf einen Verlust der Lipidbindung

gegenüber anionischen Lipiden zurückzuführen. Es ist daher wahrscheinlich, dass

die Bindung von PmtA an anionische Lipide auf einer elektrostatischen Interaktion

beruht.

Abbildung 27: Lipid-Bindung von PmtA in Gegenwart aufsteigender NaCl-Konzentrationen. Protein-Lipid-Overlay-Assay mit steigenden NaCl-Konzentrationen. Auf die Membran wurden gleiche Mengen an Lipiden fixiert. Die Membranen wurden mit 10 µM PmtA inkubiert und das gebundene Protein mit einem Anti-His Antikörper (Qiagen) detektiert.

Ergebnisse

- 73 -

3.2.6 Etablierung von verschiedenen Methoden zur quantitativen

und qualitativen Analyse der Lipid-Bindeeigenschaften von

PmtA

Um ein besseres Verständnis für die PmtA-Lipid-Interaktion zu bekommen, mussten

zunächst geeignete Methoden für eine sowohl qualitative, als auch quantitative

Analyse etabliert werden. Es wurde die PmtA-Lipid-Interaktion zunächst qualitativ

durch limitierte Proteolyse untersucht, um eine erste Vorstellung von dieser

Interaktion und der zugrunde liegenden Mechanismen zu bekommen. Um ein

weitaus detaillierteres Verständnis der Mechanismen der PmtA-Lipid-Interaktion zu

bekommen, wurden spektroskopische Verfahren zur Quantifizierung und Analyse

dieser Interaktion etabliert und angewendet.

3.2.7 Limitierte Proteolyse von PmtA in Gegenwart von

Modellmembranen

Die limitierte Proteolyse ist eine Methode, um den Einfluss einer Protein-

Substratbindung auf die Proteinstruktur zu untersuchen (Fontana et al., 2004). Dabei

wird der proteolytische Abbau eines Proteins in An- und Abwesenheit eines

Substrates analysiert. Der Proteaseverdau führt zu einer Fragmentierung des

Proteins, die gelelektrophoretisch aufgetrennt und anschließend visualisiert werden

kann. Durch eine Substratbindung des zu untersuchenden Proteins ist es zum einen

möglich, dass eine Proteaseschnittstelle blockiert wird. Zum anderen kann eine

Substratbindung eine Konformationsänderung bewirken, durch die eine

Proteaseschnittstelle entweder nicht mehr zugänglich ist oder dadurch zugänglich

wird (Abbildung 28). Da eine Proteolyse durch Proteasen sehr schnell erfolgt, wird

ein solches Experiment unter limitierten Bedingungen, wie z.B. eine Inkubation auf

Eis oder eine geringe Inkubationszeit, durchgeführt.

Um den Einfluss einer Phospholipidbindung auf die Proteolyse von PmtA zu

untersuchen wurde PmtA mit und ohne Lipid auf Eis mit Chymotrypsin oder Trypsin

verdaut. Zu definierten Zeitpunkten wurden Proben entnommen. Anschließend

wurden die Proben gelelektrophoretisch aufgetrennt und das Fragmentierungs-

muster analysiert. Da keine Unterschiede in der Fragmentierung durch Chymotrypsin

Ergebnisse

- 74 -

oder Trypsin erkennbar waren, werden nur die Ergebnisse für Chymotrypsin

präsentiert.

Abbildung 28: Das Prinzip der limitierten Proteolyse. Rote Punkte kennzeichnen mögliche Proteaseschnittstellen in PmtA. Das frei vorliegende Enzym bietet eventuell mehr zugängliche Proteaseschnittstellen (A.) als PmtA, das an eine Membran/Liposom gebunden ist (B.).

In Abwesenheit von Lipiden zeigten sich schon nach 2 min erste Abbauprodukte von

PmtA (~24 kDA). Nach 7 min sind nur noch sehr geringe Mengen an

Volllängenprotein vorhanden. Der Abbau erfolgt über eine Zwischenstufe

(ca. 20 kDa) zu einem Fragment mit einer ungefähren Größe von 18 kDa. Dieses

Fragment scheint stabil zu sein, da auch nach 30 min kein weiterer Abbau zu

kleineren Fragmenten erfolgte (Abbildung 29). Eine proteaseunabhängige

Degradation von PmtA in einem parallelen Ansatz wurde nicht beobachtet. In

Anwesenheit von PE schien PmtA stabiler gegenüber dem proteolytischen Abbau zu

sein. Unter diesen Bedingungen wurden erste deutliche Abbauprodukte nach 5 min

beobachtet. Nach 15 min waren im Gegensatz zum Ansatz ohne Lipid noch deutliche

Mengen an Volllängenprotein (~24 kDa) vorhanden. Erst nach 30 min lag PmtA

größtenteils als 18 kDa großes Abbaufragment vor. Ein Vergleich der Stabilität von

PmtA unter beiden Bedingungen zeigt, dass PmtA stabiler in Gegenwart von PE als

in Abwesenheit von Lipid ist. Eine noch höhere Stabilität zeigte sich mit PG oder PI.

Bei Anwesenheit dieser Lipide war kaum ein Abbau von PmtA zu erkennen. Auch

nach 30 min waren deutliche Mengen an Volllängenprotein vorhanden. Dies

Ergebnisse

- 75 -

bedeutet, dass durch die Lipidbindung von PmtA die Zugänglichkeit einer

Proteaseschnittstelle behindert wird. Die Anwesenheit der Substrate MMPE, DMPE

und des Endproduktes PC hingegen führten zu einem schnelleren Abbau von PmtA

durch Chymotrypsin. Bereits nach 5 min Inkubationszeit lag PmtA nur noch als 18

kDa großes Abbaufragment vor. Die Gründe für die destabilisierende Wirkung von

MMPE, DMPE und PC sind bisher unklar.

Abbildung 29: Limitierte Proteolyse von PmtA durch Chymotrypsin in Gegenwart verschiedener Lipide. Es wurden 50 µM isoliertes PmtA mit 150 µM Lipid auf Eis vorinkubiert, um eine Anlagerung zu ermöglichen. Nach Zugabe der Protease wurden zu definierten Zeitpunkten Proben entnommen und diese anschließend via SDS-PAGE aufgetrennt. MMPE: Monomethyl-PE; DMPE: Dimethyl-PE; PC: Phosphatidylcholin; PE: Phosphatidylethanolamin; PG: Phosphatidylglycerin; PI: Phosphatidylinositol (entnommen aus Danne, 2011).

Um auszuschließen, dass Lipide einen Proteinabbau durch Proteasen generell

verzögern oder die Lipide die Proteaseaktivität negativ beeinflussen, wurde in einem

Kontrollexperiment der Abbau eines anderen Proteins (lösliche FtsH-ATPase-

Domäne, Westphal, unveröffentlicht) in An- und Abwesenheit von PE untersucht.

Hierbei zeigte sich kein Unterschied im proteolytischen Abbau in An- oder

Abwesenheit von Lipid (Abbildung 30). Dies zeigt, dass PE die Proteaseaktivität nicht

beeinflusst und keine generelle Stabilisierung von Proteinen gegenüber Proteasen

bewirken. Die erhöhte Stabilität von PmtA gegenüber Chymotrypsin ist also auf eine

spezifische Protein-Lipid-Interaktion zurückzuführen. Das bedeutet, dass diese

Ergebnisse

- 76 -

Interaktion entweder zu einer Blockierung der Schnittstellen in PmtA führt oder eine

Lipidbindung eine Konformationsänderung der PmtA-Struktur induziert. Durch diese

Konformationsänderung wird eine Proteaseschnittstelle nicht mehr zugänglich, was

wiederum die PmtA-Stabilität erhöht.

Abbildung 30: Negativkontrolle mit der löslichen ATPase-Domäne von Thermotoga maritimaFtsH. Es wurden 50 µM isoliertes FtsH mit 150 µM Lipid auf Eis vorinkubiert. Nach Zugabe der Protease wurden zu definierten Zeitpunkten Proben entnommen und die Proteine anschließend via SDS-PAGE aufgetrennt (entnommen aus Danne, 2011).

3.2.8 Massenspektrometrische Analyse der PmtA-Fragmente

Im vorherigen Abschnitt wurde gezeigt, dass der proteolytische Abbau von PmtA bis

zu einem stabilem 18 kDa großen Fragment erfolgt. Da eine Spaltung von PmtA an

einer zentralen Position in der Peptidkette zu weitaus kleineren Fragmenten geführt

hätte, wird PmtA vermutlich am N- oder C-Terminus geschnitten. Um dies zu klären,

wurden Proben von dem Volllängenprotein und dem 18 kDa-Fragment aus dem

SDS-Gel ausgestochen, tryptisch verdaut und mittels Massenspektrometrie

analysiert (Abbildung 31). Für das Volllängenprotein wurde ein Peptidfragment

identifiziert, das im N-terminalen Bereich von PmtA liegt. Dieses Peptidfragment

konnte für das 18 kDa-Fragment nicht nachgewiesen werden. Jedoch wurde für das

18 kDa-Fragment ein Peptid identifiziert, das Bestandteil des C-Terminus von PmtA

ist. PmtA besitzt 15 vorhergesagte Schnittstellen für Chymotrypsin. Eine putative

Proteaseschnittstelle befindet sich an Position 38 (RFFKG). Ein Schnitt an dieser

Stelle würde ein 18.3 kDa und ein 6 kDa großes Fragment erzeugen. Diese

Ergebnisse

- 77 -

theoretischen Peptidgrößen stimmen mit den experimentell beobachteten

Fragmentgrößen überein.

Abbildung 31: Massenspektrometrische Analyse der PmtA-Fragmente. (A.) SDS-PAGE nach limitierter Proteolyse von PmtA in Gegenwart von PE. Es wurden aus dem Gel Proben ausgestochen und mittels MALDI-TOF analysiert. (B.) MS/MS-Spektren der ausgewählten Proben. Markiert sind die Peaks der identifizierten Peptide. (C.) Aminosäuresequenz von PmtA. Das identifizierte Peptid für das Vollängenprotein ist in Pink markiert. Es umfasst den N-terminalen His-Tag (Aminosäuren 2-17). Türkis markiert ist das identifizierte Peptid für das 18 kDa Abbauprodukt (Aminosäure 205-216) (entnommen aus Danne, 2011).

Die Degradation von PmtA erfolgt somit sehr wahrscheinlich N-terminal. Daher ist es

wahrscheinlich, dass der N-Terminus von PmtA durch eine Protein-Lipid-Interaktion

direkt oder indirekt beeinflusst wird. Eine mögliche Erklärung für die erhöhte Stabilität

gegenüber proteolytischem Abbau wäre, dass PmtA in Folge einer Protein-Lipid-

Interaktion eine Konformationsänderung vollzieht und dadurch die

Ergebnisse

- 78 -

Proteaseschnittstelle verdeckt wird. Um dies näher zu untersuchen, wurde die

Konformation von PmtA durch spektroskopische Methoden in An- und Abwesenheit

verschiedener Lipide analysiert.

3.2.9 CD-spektroskopische Analyse von PmtA in Gegenwart von

verschiedenen Lipiden

Die CD-Spektroskopie ist eine Methode zur Analyse der Sekundärstruktur von

Proteinen (Abschnitt 3.1.3). Mit Hilfe der CD-Spektroskopie können auch Einflüsse

von beispielsweise Substraten oder Kofaktoren auf die Sekundärstruktur von

Proteinen untersucht werden (Kelly & Price, 2000). Eine Bedingung dafür ist jedoch,

dass die Additive kein eigenes CD-Signal besitzen, welches das CD-Signal des

Proteins verfälscht. Phospholipide in Liposomenform weisen kein signifikantes CD-

Signal auf. Der Einfluss von Lipiden auf Protein-Sekundärstrukturelemente oder

ganze Proteine wurde bereits in vielen Arbeiten mittels CD-Spektroskopie untersucht

(Jo et al., 2000, Vallée et al., 2001; Constantinescu & Lafleur, 2004; Thomas et al.,

2006; Shih et al., 2011). Für PmtA ist bereits bekannt, dass für die SAM-Bindung

eine Substratlipidbindung essentiell ist (Aktas & Narberhaus, 2009). Möglicherweise

führt eine Substratlipidbindung zu einer Konformationsänderung von PmtA, sodass

eine SAM-Bindung begünstigt wird. Eine Möglichkeit, um solch eine Änderung der

PmtA-Konformation durch Lipide nachzuweisen, ist die CD-Spektroskopie.

Als Kontrolle diente ChoX (Aktas et al., 2011b) und HO3 (Gisk et al., 2010). ChoX ist

ein periplasmatisches Cholin-Bindeprotein und HO3 eine cytosolische

Hämoxygenase. Beide Proteine interagieren nicht mit der Membran oder mit

Phospholipiden. Die Zugabe von verschiedenen Phospholipiden hatte daher keinen

Einfluss auf das CD-Spektrum und somit auch nicht auf die Sekundärstruktur dieser

Proteine (Abbildung 32).

Ergebnisse

- 79 -

Abbildung 32: CD-Spektrum von HO3 (A.) und ChoX (B.) in An- und Abwesenheit von Lipiden. Es wurden jeweils 5 µM Protein und 100 µM Liposomen eingesetzt. Das Spektrum wurde bei RT gemessen und 10-fach akkumuliert. PL*: PE, MMPE, DMPE, PC, PG, CL, PS; CD [mdeg]: Elliptizität (engl. millidegree). CL: Cardiolipin, MMPE: Monomethyl-PE; DMPE: Dimethyl-PE; PC: Phosphatidylcholin; PE: Phosphatidylethanolamin; PG: Phosphatidylglycerin; PS: Phosphatidylserin.

Das CD-Spektrum für PmtA zeigte eine negative Elliptizität im Bereich von

240 - 200 nm. In diesem Bereich sind zwei Minima zu beobachten, zum einen bei

222 nm, zum anderen bei 208 nm. Eine positive Elliptizität zeigte das CD-Spektrum

für PmtA zwischen 190 – 200 nm, wobei ein Maximum bei ca. 195 nm ist (Abbildung

33). Die Zugabe der Phospholipidsubstrate PE, MMPE, DMPE oder des

Endproduktes PC führt zu einer Zunahme des Elliptizitätswertes (-11 -6 mdeg).

Dies zeigt, dass die Bindung der Substratlipide eine Konformationsänderung von

PmtA bewirkt. Eine Zugabe von Substratlipiden führte zu einer Änderung des CD-

Spektrums über den Wellenlängenbereich von 205 bis 230 nm. Eine CD-

spektroskopische Analyse in Gegenwart verschiedener Lipidkonzentrationen

ermöglicht daher eine Quantifizierung und Bestimmung von Bindungskonstanten für

PmtA gegenüber Lipiden. Im Folgenden wurden PE, MMPE, DMPE und PC zu PmtA

hinzu titriert, wobei bei äquimolaren Mengen (ca. 7.5 µM) von PmtA und Lipid eine

Sättigung beobachtet wurde (Abbildung 33).

Die Änderung im CD-Spektrum kann zur Bestimmung von Dissoziationskonstanten

(KD) von PmtA für verschiedene Lipide genutzt werden (Smith et al., 1993; Kelly &

Price, 2002; Thomas et al., 2006). Dabei wird die Differenz der Elliptizität bei einer

definierten Wellenlänge ( gegen die Konzentration des Titranden

aufgetragen. Da bei 208 nm ein deutliches Minimum der Elliptizität zu erkennen ist,

Ergebnisse

- 80 -

wurde diese Wellenlänge für die Quantifizierung der PmtA-Lipid-Bindung und

Bestimmung des KD-Wertes via SigmaPlot 9 genutzt.

Abbildung 33: Einfluss von Phospholipidsubstraten auf die Sekundärstruktur von PmtA (7.5 µM). Die Phospholipidsubstrate PE, MMPE, DMPE und PC wurden in steigenden Konzentrationen hinzutitriert. Eingeblendet ist jeweils die Auftragung der Elliptizitätsänderung des CD-Signals bei 208 nm gegen die Lipidkonzentration.

Die Auswertung der CD-spektroskopischen Daten zeigte, dass PmtA einen KD-Wert

von 0.72 µM gegenüber PE-Liposomen hat. Auch gegenüber MMPE, DMPE und PC

wurden vergleichbar niedrige KD-Werte für PmtA ermittelt (MMPE: 10.36 µM; DMPE:

4.84 µM; PC: 5.04 µM). Diese niedrigen KD-Werte bedeuten, dass PmtA eine sehr

hohe Affinität zu den Substratlipiden PE, MMPE, DMPE und dem Endprodukt PC

besitzt.

Wie in Abschnitt 3.2.1 beschrieben, stimulieren anionische Lipide die PmtA-Aktivität.

Der genaue Mechanismus dieser Stimulierung ist jedoch unbekannt. Möglicherweise

Ergebnisse

- 81 -

wird durch die Bindung von PmtA an solche Lipide, die Konformation so verändert,

dass PmtA in eine „aktivere“ Form überführt wird. Um diese Möglichkeit experimentell

zu testen, wurden CD-Spektren von PmtA in An- und Abwesenheit von anionischen

Lipiden aufgenommen.

Die anionischen Lipide PG, CL und PS führen ebenfalls zu einer Änderung des CD-

Spektrums und somit zu einer Konformationsänderung von PmtA (Abbildung 34). Es

ist ebenfalls eine Zunahme des Elliptizitätswertes zu beobachten. Jedoch ist diese

Änderung tendenziell nur im Bereich von 200 – 212 nm zu beobachten. Daher ist es

möglich, dass anionische Lipide eine Konformationsänderung von PmtA bewirken,

die sich von der durch Substratlipide bewirkten Konformationsänderung

unterscheidet.

Abbildung 34: Einfluss von geladenen Lipiden auf die Sekundärstruktur von PmtA (7.5 µM). Die geladenden Lipide wurden in steigenden Konzentrationen hinzutitriert. Eingeblendet ist jeweils die Auftragung der Elliptizitätsänderung des CD-Signals bei 208 nm gegen die Lipidkonzentration.

Ergebnisse

- 82 -

Weiterhin wurde die Bindungsaffinität von PmtA zu anionischen Lipiden mit Hilfe der

Elliptizitätsdifferenz untersucht. Die KD-Werte für PG-, PS- und CL-Liposomen

wurden analog wie für die Substratlipide bestimmt. Es zeigte sich, dass die Affinität

von PmtA zu anionischen Lipide vergleichbar mit der Affinität zu Substratlipiden ist.

Die ermittelten KD-Werte liegen in einem mikromolaren Bereich (PG: 2.64 µM;

CL: 7.27 µM; PS: 3.24 µM). Die Zugabe des kationischen Lipides DPPG hatte

hingegen keinen Einfluss auf das CD-Spektrum und somit auch nicht auf

Konformation von PmtA (Abbildung 34).

Durch CD-spektroskopische Analysen konnte somit gezeigt werden, dass sowohl

Phospholipidsubstrate (PE, MMPE, DMPE oder PC), als auch anionische Lipide (PG,

PS oder CL) eine Konformationsänderung von PmtA bewirken. Diese Ergebnisse

bestätigen somit die Vermutung, dass die SAM-Bindung von PmtA durch eine

Substrat-abhängige Konformationsänderung ermöglicht wird. Die Tatsache, dass

auch anionische Lipide eine Konformationsänderung von PmtA bewirken, obwohl

diese keine SAM-Bindung ermöglichen, wirft neue Fragen hinsichtlich der Bedeutung

anionischer Lipide für die PmtA-Aktivität auf.

3.2.10 Analyse der Lipidbindeeigenschaften von PmtA mittels

Fluorescein-Phosphatidylethanolamin

Als eine weitere Methode zur Bestimmung der PmtA-Lipid-Bindeeigenschaften wurde

ein auf Fluorescein-Phosphatidylethanolamin (FPE) basierende Bindestudie etabliert

und Bindeaffinitäten von PmtA gegenüber Modellmembranen bestimmt. Bei dieser

Methode wurde, im Gegensatz zur CD-Spektroskopie, PmtA zu einer definierten

Menge Liposomen hinzu titriert. Die verschiedenen Liposomen bestanden zu einem

0.5 % molaren Anteil aus FPE.

FPE ist ein PE-Derivat, an dessen Kopfgruppe eine Fluoresceingruppe geknüpft ist

(Abbildung 35). Diese Fluoresceingruppe fluoresziert nach Anregung mit einer

Wellenlänge bei 490 – 495 nm. Die Fluoreszenzeigenschaften ändern sich, abhängig

von einer Protonierung des Xanthenrings. Da FPE ein Lipid ist, kann es als eine Art

Sonde in eine Membran integriert werden, um mit Hilfe der Fluorescein-Kopfgruppe

Ergebnisse

- 83 -

Änderungen des elektrostatischen Potentials von geladenen Membranoberflächen zu

messen (Wall et al., 1995).

Abbildung 35: Strukturformel des Fluorescein-Phosphatidylethanolamin.

Interagiert ein geladenes Molekül/Protein mit einer Membran, so ändert sich das

elektrostatische Potential und dadurch die Fluoreszenzintensität von FPE. Die

Fluoreszenz von FPE wurde bei 490 nm angeregt und das Fluoreszenzspektrum im

spektralen Bereich von 500 – 600 nm aufgezeichnet. Ein Nachteil dieser Methode ist,

dass nur Membranen untersucht werden können, die ein Membranpotential besitzen.

PE, MMPE, DMPE oder PC sind zwitterionische Lipide und daher neutral. Eine

Titration von PmtA hatte daher wie erwartet keinen Einfluss auf die Fluoreszenz. Im

Folgenden wurden deshalb nur geladene Membranen verwendet. Dazu zählen

rekonstituierte Membranen aus isolierten A. tumefaciens-Lipiden (At) und E. coli-

Lipiden (Ec), sowie künstliche Membranen aus den anionischen Lipiden PG, CL und

PS.

Als Negativkontrolle diente das periplasmatische Cholin-Bindeprotein ChoX

(Aktas et al., 2011b). Eine Zugabe von ChoX in 10-fachem Überschuss hatte keinen

signifikanten Einfluss auf die Fluoreszenzintensität (Abbildung 36). Desweiteren

konnte ausgeschlossen werden, dass PmtA im Wellenlängenbereich von

500 - 600 nm eine Eigenfluoreszenz besitzt.

Ergebnisse

- 84 -

Abbildung 36: FPE-basiertes Membranbindeassay mit ChoX. FPE wurde mit 490 nm angeregt und das Emissionsspektrum zwischen 500 und 600 nm aufgezeichnet. Es wurden 10 µM Liposomen und ein 10-facher Überschuss an ChoX verwendet. Für die PmtA-Kontrolle wurde PmtA in steigenden Konzentrationen in Tris-Puffer titriert. At: Gesamtlipidextrakt aus A. tumefaciens, CL: Cardiolipin; Ec: Gesamtlipidextrakt aus E. coli; PG: Phosphatidylglycerin; PS: Phosphatidylserin

Eine Titration von PmtA zu einer FPE-markierten rekonstituierten A. tumefaciens

Membran führte zu einer deutlichen Erhöhung der Fluoreszenzintensität (Abbildung

37). Ein Maximum war dabei bei 525 nm zu erkennen. Die Fluoreszenzintensität

nahm um ca. 87 % zu. Im Vergleich dazu änderte sich die Fluoreszenzintensität bei

einer E. coli Membran um ca. 62 %. Für die Modellmembranen aus PG, CL und PS

wurde bei 525 nm eine Zunahme in der Fluoreszenzintensität um jeweils 32 %,

137 % und 95 % beobachtet.

Ergebnisse

- 85 -

Abbildung 37: FPE-basiertes Membranbindeassay mit PmtA. Es wurden 10 µM Liposomen verwendet. FPE wurde mit 490 nm angeregt und das Emissionsspektrum zwischen 500 - 600 nm aufgezeichnet. Zu den Liposomen wurde PmtA in steigenden Konzentrationen hinzutitriert. At: Gesamtlipidextrakt aus A. tumefaciens, CL: Cardiolipin; Ec: Gesamtlipidextrakt aus E. coli; PG:

Phosphatidylglycerin; PS: Phosphatidylserin.

Zur Bestimmung des KD-Wertes von PmtA zu der jeweiligen Membran wurde die

Änderung in der Fluoreszenzintensität bei 525 nm genutzt. Es wurde für PmtA

gegenüber einer rekonstituierten A. tumefaciens Membran ein KD-Wert von 3.20 µM

ermittelt. Gegenüber einer E. coli Membran beträgt der KD-Wert 1.6 µM. Auch

gegenüber PG (3.5 µM), CL (4.73 µM) und PS (5.72 µM) besitzt PmtA einen KD-Wert

Ergebnisse

- 86 -

in einem vergleichbaren mikromolaren Bereich. Die Ergebnisse dieses Abschnittes

bestätigen somit die zuvor bestimmte hohe Affinität von PmtA gegenüber

anionischen Lipiden.

3.2.11 Tryptophanfluoreszenzspektroskopie zur Analyse der

Lipidinteraktion von PmtA

Eine weitere Methode zur Analyse der PmtA-Lipid-Bindung ist die

Tryptophanfluoreszenzspektroskopie. Bei dieser Methode wird die Fluoreszenz der

Aminosäure Tryptophan zur Bestimmung von Protein-Liganden Affinitäten genutzt.

Da Tryptophan sehr sensibel gegenüber der Polarität seiner Umgebung ist, kann es

auch für die Bestimmung von Affinitäten von Proteinen zu Phospholipiden genutzt

werden (Hammel et al., 2001; Constantinescu & Lafleur, 2004; Grobenko et al., 2007;

Kraft et al., 2009). Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist, dass eine Änderung der

intrinsischen Tryptophanfluoreszenz von Proteinen oftmals eine Konformations-

änderung als Folge einer Substratbindung bedeutet. Desweiteren korreliert bei einer

Protein-Membran-Interaktion die Verschiebung des Fluoreszenzmaximums mit der

Tiefe der Insertion des Tryptophans in die Membran. Je größer die Verschiebung ist,

desto tiefer inseriert das Tryptophan in die Membran (Ren et al., 1997).

PmtA besitzt nur ein Tryptophan, das am C-Terminus an Position 192 lokalisiert ist.

Die Tryptophanfluoreszenz wurde mit 295 nm angeregt und das Fluoreszenz-

spektrum im Bereich von 300 – 400 nm aufgezeichnet. Für diese Methode wurde

zuvor ausgeschlossen, dass die verwendeten Lipide fluoreszieren. Die Lipidzugabe

störte die Messung somit nicht. Das Fluoreszenzspektrum von PmtA wies ein

Maximum bei ca. 340 nm auf (Abbildung 38). Titriert man PE-Liposomen hinzu, so

wurde die Fluoreszenzintensität bei einer Sättigung von PmtA mit Lipiden um 66 %

verringert (Abbildung 38). Auch die weiteren Phospholipidsubstrate führten zu einer

vergleichbaren Änderung der Fluoreszenzintensität (MMPE: 70 %; DMPE: 61 %; PC:

71 %). Die Änderung der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz von PmtA nach

Lipidzugabe bestätigt somit erneut, dass eine Interaktion von PmtA mit den Lipiden

PE, MMPE, DMPE und PC zu einer Konformationsänderung führt.

Anhand der Änderung der Fluoreszenzintensität wurden Dissoziationskonstanten

(KD) für die PmtA-Lipid-Interaktion ermittelt. Mittels der Fluoreszenzintensität wurde

Ergebnisse

- 87 -

für PmtA zu PE-Liposomen ein KD-Wert von 1.71 µM ermittelt. Zu MMPE, DMPE und

PC besitzt PmtA vergleichbare KD-Werte mit 1.19 µM, 0.84 µM und 1.57 µM. Alle

ermittelten KD-Werte liegen in einem vergleichbaren mikromolaren Bereich, ähnlich

zu den KD-Werten, die anhand der zuvor beschriebenen Methoden bestimmt wurden.

Abbildung 38: Tryptophanfluoreszenz von PmtA in Gegenwart von Substratlipiden und dem Endprodukt PC. Für die Tryptophanfluoreszenz wurden 10 µM PmtA mit steigender Konzentration von Liposomen inkubiert. Die Fluoreszenz wurde bei 290 nm angeregt und das Spektrum zwischen 300 - 400 nm aufgezeichnet. Für die Bestimmung der KD-Werte wurde die Abnahme der Fluoreszenz verwendet (F/F0).

Neben der Fluoreszenintensitätsänderung wurde auch eine geringfügige

Blauverschiebung des Fluoreszenzmaximums nach Lipidzugabe beobachtet

(ca. 4 nm). Dies könnte für eine nur geringfügige Insertion des Tryptophanrestes in

die Membran sprechen. Diese Verschiebung war jedoch nicht signifikant genug, um

diese für weitere Analysen oder Bestimmung von Bindeaffinität von PmtA zu Lipiden

zu nutzen.

Ergebnisse

- 88 -

Die Tryptophanfluoreszenz von PmtA wurde weiterhin dazu genutzt, um die

Interaktion mit PG, CL und PS zu untersuchen (Abbildung 39). Es zeigte sich hierbei,

dass diese Lipide ebenfalls eine Verringerung der Fluoreszenzintensität von PmtA

bewirken. PG führte dabei zu einer Verringerung der Fluoreszenzintensität um 66 %,

CL um 72 % und PS um 50 %, wenn eine Sättigung von PmtA mit Lipiden vorlag.

Abbildung 39: Tryptophanfluoreszenz von PmtA in Gegenwart anionischer Lipide. Für die Tryptophanfluoreszenz wurden 10 µM PmtA mit steigenden Konzentration PG-, CL- und PS-Liposomen inkubiert. Die Fluoreszenz wurde bei 290 nm angeregt und das Spektrum zwischen 300 - 400 nm aufgezeichnet. Für die Bestimmung der KD-Werte wurde die Abnahme der Fluoreszenz verwendet (F/F0).

Auch eine leichte Verschiebung der Fluoreszenzmaxima war zu beobachten, diese

war jedoch vergleichbar gering wie bei der Zugabe von Substratlipiden. Zur

Bestimmung der KD-Werte wurde daher die Fluoreszenzintensität verwendet. Für

PG, CL und PS wurden KD-Werte im mikromolaren Bereich (PG: 1.1 µM,

CL: 0.53 µM, PS: 2.25 µM) ermittelt.

Ergebnisse

- 89 -

3.2.12 Bioinformatische Analyse putativer Lipidbindestellen in PmtA

Die vorherigen Abschnitte haben gezeigt, dass PmtA eine hohe Affinität zu

Phospholipiden besitzt. Die Bindung von Substratlipiden durch PmtA beruht dabei

wahrscheinlich auf einer spezifischen Enzym-Substrat-Interaktion, wohingegen die

Bindung anionischer Lipide auf einer elektrostatischen Interaktion basiert. Die

Struktur und der detaillierte Ablauf der Transmethylierungsreaktion bakterieller

Phospholipid N-Methyltransferasen ist weitgehend unklar. Obwohl PmtA löslich ist

und für biochemische Analysen in ausreichenden Mengen isoliert werden kann, war

eine Strukturaufklärung mittels Röntgenstrukturanalyse oder NMR bisher nicht

möglich. Putative Aminosäuren, die für eine PmtA-Lipid-Interaktion essentiell sind,

konnten daher nicht auf struktureller Basis identifiziert werden. Weiterhin besitzten

Pmt-Enzyme kein bekanntes Phospholipidbindemotiv (bspw.: Ca2+-Domäne, FYVE

oder PH-Domäne). Daher wurden auf Basis eines Aminosäuresequenzvergleiches

konservierte Aminosäuren und strukturell benachbarte Aminosäuren, die

möglicherweise an der PmtA-Lipid-Interaktion beteiligt sind, mutiert (Abbildung 40).

Weiterhin wurden nur solche Aminosäuren ausgewählt, die vermutlich keine Rolle für

die SAM-Bindung spielen (Abschnitt 3.1), aber womöglich für eine Lipid-Interaktion

von Bedeutung sind. Die ausgewählten Aminosäuren wurden gegen ein Alanin oder

eine Aminosäure mit konträrer Ladung ausgetauscht.

Da PmtA wahrscheinlich auch über elektrostatische Interaktionen mit der Membran

interagiert, wurden zusätzlich basische Aminosäuren gegen ein Alanin ausgetauscht.

Diese Aminosäuren sind in den stark positiv geladenen Bereichen auf der PmtA-

Oberfläche des Homologiemodells lokalisiert (Abbildung 24). Die Mutation einer

positiv geladenen Aminosäure in diesem Bereich könnte die Membranbindung

beeinflussen.

Ergebnisse

- 90 -

Abbildung 40: Aminosäuresequenzvergleich mehrerer Pmt-Enzyme. Mit Pfeil gekennzeichnet sind die eingefügten Punktmutationen (schwarze Pfeile: putative Aminosäuren für eine PmtA-Substratlipid Interkation; blaue Pfeile: basische Aminosäuren innerhalb der positiv geladenen Bereiche der PmtA-Oberfläche des Homologiemodells). Pmt: Phospholipid N-Methyltransferase. Atum: Agrobacterium tumefaciens; Smel: Sinorhizobium meliloti; Bjap: Bradyrhizobium japonicum; Mloti: Mesorhizobium loti;

Ml:mlr5374: putatives Pmt-Enzym aus Mloti.

3.2.13 Einfluss verschiedener Punktmutationen auf die PmtA-

Aktivität

Die durch Quik-Change® Mutagenese generierten PmtA-Derivate wurden mittels T7-

Expressionssystem in E. coli BL21 (DE) überexprimiert. Durch eine SDS-PAGE

wurde bestätigt, dass alle PmtA-Derivate bis auf K42A, K43A und K42A,K43A

erfolgreich überexprimiert wurden (Abbildung 41A und C). Die Gründe für die

fehlende Expression der PmtA-Derivate K42A, K43A und K42A,K43A sind ungeklärt.

Eine mögliche Erklärung ist, dass durch eine Mutation in diesem Bereich die PmtA-

Struktur zu stark beeinflusst wurde. Dies würde dann wahrscheinlich zu einer

Missfaltung und sofortigen Degradation des Proteins führen.

Um den Einfluss der verschiedenen Punktmutationen auf PC-Bioysnthese von PmtA

zu analysieren, wurden die Lipide der Überexpressionskulturen isoliert,

dünnschichtchromatographisch aufgetrennt und die Reaktionsprodukte durch

Kupfersulfat visualisiert.

Ergebnisse

- 91 -

Ein Alaninaustausch der Aminosäuren Q26, K28, K29 und K28A,K29A beeinflusste

die PC-Synthese nicht, wohingegen die Punktmutation des T36 zu einer deutlichen

Akkumulation von MMPE im Vergleich zu PmtA (WT) führte (Abbildung 41B). Für die

PmtA-Derivate K42A, K43A und K42A,K43A konnte keine PC-Biosynthese

nachgewiesen werden, was aufgrund der fehlenden Expression zu erwarten war.

Abbildung 41: Überexpression und Einfluss von Punktmutationen konservierter oder basischer Aminosäuren in PmtA. Die Überexpression von PmtA (WT) oder der PmtA-Derivate wurde mittels SDS-PAGE analysiert (A. und C.). Die Lipide der Überexpressionskulturen wurden isoliert und mittels Dünnschichtchromatographie aufgetrennt. Anschließend erfolgte eine Visualisierung der Lipide mittels Kupfersulfat (B. und D.). LV: Überexpressionskultur mit Leervektor.

Die PmtA-Derivate I33A, I126A und S160A zeigten eine marginal reduzierte PC-

Biosynthese (Abbildung 41D). Jedoch wurden die Zwischenstufen MMPE und DMPE,

sowie das Endprodukt PC in deutlichen Mengen synthetisiert. Ein drastischer

enzymatischer Defekt war für die PmtA-Derivate F89A, V129T, Q158E/R, P187T und

Ergebnisse

- 92 -

W192A zu beobachten. Eine Mutation dieser Aminosäuren reduzierte die PC-

Biosynthese deutlich (F89A, V129T, P187A) oder bewirkte einen vollständigen

Verlust der PC-Biosynthesefähigkeit (Q158E, Q158R und W192A). Die PmtA-

Derivate V129T, Q158E/R, P187T und W192A waren jedoch bis auf F89A unlöslich.

Es ist daher sehr wahrscheinlich, dass die Aminosäuren V129, Q158, P187 und

W192 eine wesentliche Bedeutung für die Faltung und strukturelle Stabilität von

PmtA haben. Ein Alaninaustausch der Aminosäuren I186, Y194, T195 und R196

hatte hingegen keinen Einfluss auf die PC-Biosyntheseaktivität von PmtA.

Der Einfluss der verschiedenen Punktmutationen auf die PmtA-Aktivität ist in Tabelle

7 zusammengefasst. Auffällig ist, dass eine Mutation im N-terminalen Bereich

(Aminosäure 1-33) kaum einen Einfluss auf die Aktivität und Löslichkeit von PmtA

hat. Eine Mutation im Bereich von Aminosäure 42 – 159 führt meist zu einer

reduzierten PmtA-Aktivität. Punktmutationen in diesem Bereich haben jedoch oftmals

zur Folge, dass das generierte PmtA-Derivat unlöslich ist. Eine Punktmutation am C-

Terminus hat hingegen keinen Einfluss auf die PmtA-Aktivität.

Tabelle 7: Übersicht der Punktmutanten von PmtA. +: PmtA(-Derivat) ist aktiv/ wird überexprimiert/ ist löslich. -: PmtA(-Derivat) ist inaktiv/ wird nicht überexprimiert/ ist unlöslich. Klammern deuten eine geringe Aktivität/Löslichkeit an. Pfeil: Akkumulation.

PmA-Variante In vivo Aktivität Heterologe Expression In vitro Löslichkeit

WT + + +

Q26A + + +

K28A + + +

K29A + + +

KK28/29AA + + +

I33A + + +

T36A + (MMPE↑) + +

K42A - - -

K43A - - -

KK42/43AA - - -

F89A (+) + +

I126A + + (+)

V129T (+) + -

Q158E - + -

Q158R - + -

S160A + + (+)

I186A + + (+)

P187T ((+)) + -

W192A - + -

Y194A + + (+)

T195A + + (+)

R196A + + (+)

Ergebnisse

- 93 -

3.2.14 Die Bedeutung der Aminosäure Threonin 36 für die

Lipidbindung von PmtA

Ein Austausch der Aminosäure Threonin gegen ein Alanin an Position 36 in PmtA

führte in vivo zu einer Akkumulation von MMPE verglichen mit PmtA (WT) (Abbildung

41). Solch ein Einfluss einer Punktmutation wurde zuvor für PmtA noch nicht

beobachtet. Eine weiterführende Analyse dieser Mutante bietet die Möglichkeit zum

besseren Verständnis der Funktionsweise von PmtA. Das PmtA-Derivat T36A ist im

Gegensatz zu anderen PmtA-Derivaten löslich und wurde in ausreichenden Mengen

isoliert, um die enzymatische Aktivität in vitro zu untersuchen. Dafür wurde die

enzymatische Aktivität von PmtA und T36A in Gegenwart von PE und von PE+PG

verglichen. PmtA kann bei Anwesenheit von PE signifikante Mengen an PC

synthetisieren. Eine Zugabe von PG stimuliert wie erwartet die PmtA-Aktivität und es

wird mehr PC synthetisiert. T36A kann wie PmtA (WT) in vitro PC synthetisieren,

jedoch sind die PC-Mengen deutlich geringer. Um zu überprüfen, ob T36 eine

Bedeutung für die Bindung von PmtA an anionische Lipide hat, wurde die Aktivität in

Anwesenheit von PG untersucht. Eine Zugabe von PG stimulierte zwar die Aktivität

von T36A, jedoch wurden verglichen mit PmtA geringere Mengen an PC

synthetisiert. Weiterhin unterscheiden sich die Mengen an Reaktionsprodukten die

in vivo und in vitro beobachtet wurden. In vivo wurde eine deutlich höhere

Akkumulation von MMPE bei T36A im Vergleich zu PmtA detektiert. Dies konnte bei

einem in vitro Ansatz nicht beobachtet werden. Die Zwischenprodukte MMPE und

DMPE sind in vergleichbaren Mengen vorhanden (Abbildung 42).

Abbildung 42: In vitro-Aktitivät von PmtA (WT) und dem PmtA-Derivat T36A. Es wurden jeweils 10 µM Protein, 400 µM PE und 100 µM PG eingesetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1.8 mM SAM gestartet. Nach Reaktionszeit von 1 Stunde wurden die Lipide extrahiert und mittels Dünnschichtchromatographie aufgetrennt und mittels Kupfersulfat visualisiert.

Ergebnisse

- 94 -

Daher ist anzunehmen, dass eine Mutation des Threonins an Position 36 die

Reaktionsgeschwindigkeit der PC-Biosynthese beeinflusst. Denkbar wäre eine

Beeinträchtigung des katalytischen Prozesses, der Konformationsänderung oder

eine reduzierte Lipidbindeaffinität. Um die Konformation und die Lipidbindeaffinität zu

überprüfen, wurden die Lipidbindeeigenschaften von T36A mittels CD-Spektroskopie

untersucht (Abbildung 43).

Abbildung 43: Einfluss von geladenen Lipiden auf die Sekundärstruktur des PmtA-Derivates T36A. Zu 7.5 µM T36A wurden Liposomen in steigenden Konzentrationen hinzu titriert. Eingeblendet ist jeweils die Auftragung der Elliptizitätsänderung des CD-Signals bei 208 nm gegen die Lipidkonzentration und der ermittelte KD-Wert.

Ergebnisse

- 95 -

Das CD-Spektrum von T36A zeigte, dass dieses PmtA-Derivat eine native Faltung

wie PmtA besitzt. Weiterhin wies das CD-Spektrum eine negative Elliptizität und

Minima bei ca. 208 nm sowie bei 222 nm auf (Abbildung 43). Ein Maximum der

Elliptizität war bei ca. 195 nm zu beobachten. Anhand des CD-Spektrums kann somit

eine Missfaltung ausgeschlossen werden. Das Spektrum ist vergleichbar mit dem

CD-Spektrum von PmtA. Die Zugabe von PE, MMPE, DMPE, PC oder PG führte zu

einer Zunahme des Elliptizitätwertes. Die Änderung des CD-Spektrums ist

vergleichbar mit der für PmtA beschriebenen Änderung nach Lipidzugabe

(Abschnitt 3.2.9). Eine quantitative Analyse dieser Änderung zeigte weiterhin eine

hohe Affinität von T36A zu den getesteten Lipiden. Dafür wurde die

Elliptizitätsänderung bei 208 nm zur Bestimmung der Dissoziationskonstante (KD)

genutzt. T36A besitzt gegenüber PE-Liposomen einen KD-Wert von 5.25 µM. Dieser

liegt im mikromolaren Bereich, ist jedoch geringfügig höher, als der von PmtA

(0.72 µM). Die ermittelten KD-Werte für MMPE (9.82 µM), DMPE (3.39 µM),

PC (3.30 µM) und PG (1.59 µM) sind fast äquivalent zu denen von wildtyp PmtA

(MMPE: 10.36 µM; DMPE: 4.84 µM; PC 5.04 µM; PG: 2.64 µM).

Die CD-spektroskopischen Daten und die anhand dieser ermittelten KD-Werte legen

nahe, dass die Phospholipidbindung von T36A nicht beeinflusst ist. Weiterhin hat der

Austausch von Threonin zu Alanin keinen Einfluss auf die Faltung oder

Konformationsänderung. Es ist also eher wahrscheinlich, dass T36 ein Teil des

katalytischen Zentrums ist und die Mutation die Reaktionsgeschwindigkeit negativ

beeinflusst.

Diskussion

- 96 -

4. Diskussion

4.1 SAM-Bindeeigenschaften der agrobakteriellen

Phospholipid N-Methyltransferase PmtA

Das pflanzenpathogene Bakterium A. tumefaciens ist in der Lage, PC über den

Methylierungsweg oder den PC-Synthaseweg zu synthetisieren. PC ist für die

Virulenz von A. tumefaciens essentiell (Wessel et al., 2006), jedoch ist über die

Funktionsweise bakterieller PC-Biosyntheseenzyme bisher sehr wenig bekannt

(Wessel et al., 2006; Klüsener et al., 2009; Aktas & Narberhaus, 2009). Die

agrobakterielle Phospholipid N-Methyltransferase PmtA ist ein PC-

Biosyntheseenzym, das PE zu PC methyliert. Für diese Reaktion nutzt PmtA SAM

als Methyldonor und gehört daher zur Klasse der SAM-MT (Kaneshiro & Law, 1964;

Aktas & Narberhaus, 2009). Im Rahmen dieser Arbeit wurden die SAM-

Bindeeigenschaften von PmtA analysiert und essentielle Aminosäuren für die SAM-

Bindung identifiziert.

Mit Hilfe von radioaktiv markiertem SAM (14C-SAM) wurde die SAM-Bindeaffinität für

PmtA und für PmtA-Derivate bestimmt. PmtA besitzt einen KD-Wert von 25 µM

gegenüber SAM und somit eine hohe Affinität für den Kofaktor. Für die eukaryotische

Phosphatidylethanolamin N-Methyltransferase (PEMT) aus der Rattenleber wurde

ein vergleichbarer KD-Wert mit 30 µM ermittelt (Schneider & Vance, 1979; Vance &

Ridgway, 1988). Die KD-Werte der PmtA und eukaryotischen PEMT gegenüber SAM

liegen in einem für SAM-MT charakteristischen Bereich von 0.1 – 30 µM (Mashhoon

et al., 2004; Basturea & Deutscher, 2007; Savic et al., 2008). Eine alternative

Methode zur Bestimmung der Bindeaffinität für SAM via NMR-Spektroskopie zeigte

hingegen einen 3 – 4 fach höheren KD-Wert (91 µM) für PmtA gegenüber SAM

(Aktas et al., 2011a). Da eine Messung mittels NMR-Spektroskopie sehr zeitintensiv

ist, wurde dem Ansatz eine S-Adenosylhomocysteinnucleosidase hinzugefügt. Diese

wurde eingesetzt, um entstehendes SAH enzymatisch abzubauen, sodass SAH nicht

in Konkurrenz zu SAM steht und die Bindung von SAM an PmtA beeinflusst. Eine

mögliche Erklärung ist, dass zu geringe Mengen an SAH-Nucleosidase verwendet

wurden. Somit kann nicht ausgeschlossen werden, dass Reste von SAH vorhanden

waren und diese die Messung beeinflusst haben. Weitere Titrationsexperimente via

Diskussion

- 97 -

NMR-Spektroskopie mit SAH zeigten für PmtA einen KD-Wert von 25 µM. Dieser

Wert entspricht der KD für 14C-SAM. PmtA besitzt somit eine vergleichbare Affinität

gegenüber SAH und SAM. Der für SAM ermittelte Wert mittels NMR-Spektroskopie,

wurden sehr wahrscheinlich durch SAH-Reste verfälscht (Aktas et al., 2011a).

Durch Aminosäuresequenzvergleich und Topologieanalysen von PmtA konnten

putative SAM-Bindemotive (SAM-I-, SAM-II- und SAM-III-Motiv) identifiziert werden.

Das SAM-I-Motiv (D/ExGxGxG) bilden die Aminosäuren E58, G60, G62 und G64.

Die Aminosäure E84 ist die charakteristische Aminosäure des putativen SAM-II-

Motivs für PmtA. Das SAM-III-Motiv besteht wahrscheinlich aus der Aminosäure

D106 (Abbildung 44). Punktmutationen der identifizierten Aminosäuren führten zu

einem vollständigen Verlust oder zu einer drastisch reduzierten Enzymaktivität. Die

PmtA-Derivate G64A und D106A bzw. D106E konnten nicht gereinigt werden,

sodass eine weitere biochemische Charakterisierung nicht möglich war. Eine

mögliche Erklärung für die mangelnde Löslichkeit dieser PmtA-Derivate ist, dass

diese Aminosäuren eventuell eine bedeutende Rolle für die Faltung und Stabilität des

Proteins besitzen. Die Faltung und die Lipidbindung der übrigen PmtA-Derivate

wurden durch die Punktmutation nicht beeinflusst. Der enzymatische Defekt beruhte

allein auf dem Verlust der SAM-Bindefähigkeit. Die Phosphoethanolamin N-

Methyltransferase (PfPMT) aus Plasmodium falciparum ist ebenfalls eine SAM-MT,

die eine Methylgruppe auf Phosphoethanolamin transferiert. Das synthetisierte

Cholin kann unter anderem in Form von PC in die Membran eingebaut werden

(Witola et al., 2008). Die Motive SAM-I, SAM-II und SAM-III von PfPMT wurden in

einer ähnlichen Studie bioinformatisch identifiziert und anschließend die Bedeutung

konservierter Aminosäuren durch Punktmutationen analysiert. Die Strukturintegrität

wurde durch die Punktmutation nicht oder nur sehr geringfügig beeinflusst. Dies

zeigten CD-spektroskopische Analysen, sowie das Schmelzverhalten der PfPMT-

Varianten (Reynolds et al., 2008). Mutationen innerhalb des SAM-I-Motivs oder des

SAM-II-Motivs führten bei PfPMT ähnlich wie bei PmtA zu einer drastisch reduzierten

Enzymaktivität (Reynolds et al., 2008). Die Motive SAM I-III sind in eukaryotischen

Pmt-Enzymen nicht vorhanden oder nur schwach konserviert (Shields et al., 2003).

Punktmutationen haben jedoch eine ähnliche Auswirkung bei der humanen PEMT.

Mutationen im SAM-I-Motiv (G98 und G100) führten im Falle von G98 zu einer

Verringerung der SAM-Bindefähigkeit um ca. 25 %. Ein Alaninaustausch von G100

führte hingegen zu einem vollständigen Verlust der SAM-Bindefähigkeit (Shields et

Diskussion

- 98 -

al., 2003). Eine Abfolge saurer Aminosäuren (E180 und E181) ist ebenfalls wichtig

für die SAM-Bindung der PEMT. Eine Mutation von E180 zu Alanin bewirkte einen

vollständigen Verlust der SAM-Bindefähigkeit. Dies zeigt, dass die Aminosäuren

G100 und E180 essentiell für die SAM-Bindung der PEMT sind (Shields et al., 2003).

Diese Aminosäuren sind in räumlicher Nachbarschaft und bilden womöglich die

SAM-Bindestelle für PEMT (Shields et al., 2003).

Für bakterielle Pmt-Enzyme konnten bisher keine Proteinstrukturen gelöst werden.

Auf Basis der Aminosäuresequenz konnte jedoch ein Homologiemodell für PmtA

erstellt werden (I-TASSER; Zhang, 2008). Dieses Modell zeigt, dass die Reste der

Aminosäuren E58, G60, G62 und E84 in räumlicher Nähe zueinander orientiert sind

(Abbildung 44). Diese Aminosäuren könnten eine putative SAM-Bindetasche formen.

Um diese Vermutung zu bestätigen, wäre es nötig eine Strukturaufklärung von PmtA

inklusive gebundenem Kofaktor durchzuführen. Das Homologiemodell postuliert für

PmtA eine α-β-α Sandwichstruktur, was auch bereits bei anderen SAM-MTs

beobachtet wurde. Das zentrale, planare β-Faltblatt besteht aus 5 parallelen (β1-4)

und einem anti-parallelen β-Faltblatt (β5). Die α-Helices αE, αF, αG zum einen und

αB, αC, αD zum anderen flankieren das zentrale β-Faltblatt. Eine N-terminale α-Helix

(αA) ist über dem zentralen β-Faltblatt exponiert.

Die tertiäre Struktur und der Reaktionsmechanismus der PfPMT wurden kürzlich

aufgeklärt (Lee et al., 2012). Die Struktur der PfPMT ist homolog zu anderen SAM-

MTs. PfPMT besitzt ein zentrales, planares β-Faltblatt, das von mehreren α-Helices

flankiert wird. Zusätzlich besitzt dieses Enzym eine α-helicale Deckeldomäne, die für

die Substratbindung und Abgrenzung vom wässrigen Milieu der Umgebung von

enormer Bedeutung ist (Lee et al., 2012). Eine Strukturanalyse von PfPMT im

Komplex mit SAH ermöglichte die Identifizierung wichtiger Aminosäuren für die

Kofaktorbindung. Auf Basis dieses Strukturmodells sind die Aminosäuren D61, G63,

D85 und D110 essentielle Interaktionspartner für die SAM-Bindung der PfPMT.

Diskussion

- 99 -

Abbildung 44: Putative SAM-Bindetasche im PmtA-Homologiemodell. (A.): Cartoon-Darstellung des PmtA-Homologiemodells. Hervorgehoben sind essentielle Aminosäuren für die SAM-Bindung. (B.): Detailansicht der putativen SAM-Bindetasche mit gebundem SAM. (C.): Modell zur Interaktion wichtiger Aminosäuren mit SAM. SAM: S-Adenosylmethionin.

Dabei interagiert G63 mit dem Aminoanteil des Kofaktors über die Carboxylgruppe

des Glycins. Über D61 werden zwei Wassermoleküle koordiniert, die den Kofaktor in

die richtige Konformation orientieren. Diese Aminosäuren sind Teil des glycinreichen

Loops des SAM-I-Motivs.

Für andere SAM-MTs wurde ein ähnliches Interaktionsmodell des SAM-I-Motivs und

dessen Bedeutung für die Koordination von SAM postuliert (Cheng et al., 1993;

Kozbial & Mushegian, 2005). Für das SAM-II-Motiv wird eine Interaktion mit den

Ribosylhydroxylgruppen angenommen und das SAM-III-Motiv bindet den Adeninring

von SAM (Cheng et al., 1993; Kozbial & Mushegian, 2005). Dies wurde auch für die

Diskussion

- 100 -

PfPMT gezeigt, wobei D85 die konservierte Aminosäure des SAM-II-Motivs ist und

D110 die konservierte Aminosäure des SAM-III-Motivs (Lee et al., 2012). Die

Aminosäuren D61, G63, D85 und D110 formen so eine SAM-Bindetasche.

Untersuchungen von PfPMT-Derivaten mit Punktmutationen von Aminosäuren, die

für die SAM-Bindung wichtig sind, unterstützen das postulierte Interaktionsmodell.

(Lee et al., 2012). Ein Vergleich der PfPMT und des Homologiemodells von PmtA

zeigt, dass beide Proteine strukturell sehr ähnlich sind. Die kritischen Aminosäuren

für die SAM-Bindung sind teilweise an identischen Positionen innerhalb der Struktur

lokalisiert. Somit kann spekuliert werden, dass die Aminosäuren E58, G60, E84 und

D106 in PmtA eine analoge Funktion zu den Aminosäuren D61, G63, D85 und D110

in PfPMT einnehmen (Abbildung 45). Einen deutlichen Unterschied in der Struktur

zeigt sich am C-Terminus. PfPMT besitzt dort eine α-helicale Deckelstruktur, die für

die Substratbindung wichtig ist. Insgesamt stimmen die experimentell ermittelten

Daten zur SAM-Bindung von PmtA sehr gut mit den bisherigen bioinformatischen

Erkenntnissen und bekannten Daten anderer SAM-MTs überein. Somit konnte im

Rahmen dieser Arbeit Aminosäuren, die für die SAM-Bindung von PmtA essentiell

sind, identifiziert werden.

Abbildung 45: Strukturvergleich des Homologiemodells für PmtA (grau) und PfPMT (gelb). (A.): Vergleich der Tertiärstruktur auf Basis einer Cartoon-Darstellung. Bis auf den C-Terminus zeigen die beiden SAM-MTs hohe strukturelle Ähnlichkeiten. (B.): Detailansicht der SAM-Binderegion. Die essentiellen Aminosäuren der PfPMT sind in Gelb dargestellt, wobei schwarze Striche die Interaktionen skizzieren. In Grau sind die essentiellen Aminosäuren für die SAM-Bindung in PmtA dargestellt.

Diskussion

- 101 -

Neben der Bindung von SAM, spielt auch die Übertragung der Methylgruppe eine

wichtige Rolle für den enzymatischen Mechanismus. Die Transmethylierungsreaktion

durch SAM-MTs ähnelt einer SN2-Reaktion. Die saure Aminosäure des SAM-I-Motivs

koordiniert dafür ein Wassermolekül, um einen nukleophilen Angriff zu ermöglichen

(Bügl et al., 2000; Kozbial & Mushegian, 2005). Das Wassermolekül kann dabei als

Nukleophil dienen oder die Abspaltung der Methylgruppe vom Schwefelatom

begünstigen. Ein SN2-ähnlicher Reaktionsmechanismus wird auch für PfPMT

angenommen (Lee et al., 2012).

Es konnte gezeigt werden, dass das Tyrosin an Position 19 und das Histidin an

Position 132 essentiell für die Katalyse sind. Die Deprotonierung des Y19 durch das

H132 ermöglicht wiederum eine Deprotonierung der Amingruppe des Substrates

Phosphoethanolamin. Infolge der Substratdeprotonierung erfolgt eine Bindung der

Methylgruppe von SAM an das Stickstoffatom des Phosphoethanolamins

(Lee et al., 2012). Punktmutationen der Aminosäuren Y19 und H132 haben gezeigt,

dass die Substrat- und Kofaktorbindung durch diese Aminosäuren nicht beeinflusst

wird. Dies unterstützt die spezifische Bedeutung der Aminosäuren Y19 und H132 für

die Katalyse (Lee et al., 2012). Ein derartiger Reaktionsmechanismus lässt sich

zurzeit nicht direkt auf PmtA übertragen, da PmtA keine dazu homologen

Aminosäuren in ähnlicher räumlicher Anordnung aufweist.

Die Untersuchung der konservierten Aminosäuren des SAM-I- und SAM-II-Motivs in

PmtA haben gezeigt, dass die SAM-Bindemotive in PmtA ähnlich wie in anderen

SAM-MTs lokalisiert sind. Die SAM-Binderegion von PmtA konnte auf den N-

Terminus eingegrenzt werden und weiterhin wurden Aminosäuren identifiziert, die für

die SAM-Bindung essentiell sind. Die Phospholipidsubstratbindung könnte analog zu

anderen SAM-MTs am C-Terminus lokalisiert sein (Martin & McMillan, 2002; Kozbial

& Mushegian, 2005).

Diskussion

- 102 -

4.2 PmtA-Lipid Interaktion

PmtA synthetisiert PC durch dreifache Methylierung von PE. Der Mechanismus der

PmtA-Lipid Interaktion und die Bedeutung verschiedener Membranlipide für die

enzymatische Aktivität von PmtA ist bisher unbekannt. In Rahmen dieser Arbeit

wurden verschiedene Methoden angewendet, um die Interaktion von PmtA mit

Lipiden und die Bedeutung einer PmtA-Lipid Bindung näher zu charakterisieren.

4.2.1 Anionische Lipide stimulieren die PmtA-Aktivität

Vorangegangene Arbeiten zeigten, dass die PmtA-Aktivität durch das anionische

Lipid PG stimuliert wird (Aktas & Narberhaus, 2009). PG ist ein Bestandteil vieler

bakterieller Membranen und ist auch in der agrobakteriellen Membran präsent

(Sherr & Law, 1965; Karnezis et al., 2002). PG ist jedoch kein Substratlipid für PmtA.

In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass auch andere anionische Lipide wie CL, PA, PI

oder PS einen stimulierenden Effekt auf die PmtA-Aktivität haben. Im Gegensatz zu

den Substratlipiden vermitteln anionische Lipide jedoch keine SAM-Bindung. Das

kationische Lipid DPPG hat keinen Einfluss auf die PmtA-Aktivität. Daher ist davon

auszugehen, dass nur anionische Lipide einen Einfluss auf die PmtA-Aktivität haben.

Zukünftig könnte untersucht werden, ob auch pflanzliche Sulfolipide, die zu den

anionischen Lipiden gehören und nicht in Bakterien vorkommen, die PmtA-Aktivität in

vitro stimulieren.

Die Bedeutung und Wirkung von anionischen Lipiden auf andere Proteine ist bereits

gut untersucht. Oftmals üben anionische Lipide eine regulatorische Funktion auf

periphere Membranproteine aus, wie zum Beispiel auf die ATP-abhängige Protease

Lon, den Replikationsinitiator DnaA, die Phosphatidylserinsynthase Pss aus E. coli,

die eukaryotische CTP:Phosphocholin Cytidylyltransferase (CTP) oder die

Phosphatidylinositol-spezifische Phospholipase C aus Bacillus thuringiensis

(Cornell, 1991a; Sekimizu & Kornberg, 1987; Salamon et al., 2000;

Linde et al., 2004; Minami et al., 2011; Shih et al., 2011). Die Regulation dieser

Proteine erfolgt oftmals über die Lokalisation bzw. Bindung an die Membran. Die

cytosolische Protease Lon kann beispielsweise CL binden und wird durch die

Membranbindung inhibiert (Minami et al., 2011). Im Gegensatz dazu werden die

Diskussion

- 103 -

peripheren Membranproteine DnaA, Pss und CTP durch anionische Lipide aktiviert

bzw. die Aktivität stimuliert (Cornell, 1991a; Sekimizu & Kornberg, 1987;

Salamon et al., 2000; Linde et al., 2004). In E. coli spielt MinD bei der Zellteilung eine

wichtige Rolle und ist an den Zellpolen lokalisiert. Dabei assoziiert MinD vorwiegend

an das anionische CL. Weiterhin ist die Kurvatur der Membran, die durch Lipide wie

CL beeinflusst wird, für die Lokalisation von MinD von Bedeutung. (Szeto et al., 2002;

Renner et al., 2011). Das „high potential iron-sulfor protein“ (HiPIP) aus

Allochromatium vinosum ist ein periplasmatisches Protein, das aus dem Cytosol über

die Membran ins Periplasma transportiert werden muss. Es wurde gezeigt, dass das

cytoplasmatische Vorläuferprotein durch eine elektrostatische Interaktion der

Signalsequenz mit anionische Lipiden zuerst an die Membran rekrutiert wird, bevor

es über die Membran transportiert wird (Brehmer et al., 2012). Die PmtA-Aktivität und

Lokalisation an die Membran könnte auf ähnliche Weise durch anionische Lipide

beeinflusst werden. Potentielle Interaktionsstellen für anionische Lipide sind die stark

positiv geladenen Bereiche auf der Oberfläche des PmtA-Homologiemodells. Eine

derartige Wechselwirkung zwischen Lipiden und Proteinen bezeichnet man als

elektrostatische Interaktion und soll im Folgenden für PmtA diskutiert werden.

4.2.2 Elektrostatische Interaktion von PmtA mit Membranen

In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass nicht nur PG, sondern anionische Lipide generell

die PmtA-Aktivität stimulieren. Weiterhin wurde mittels CD-Spektroskopie und

Fluoreszenzstudien gezeigt, dass die Bindung von PmtA an anionische Lipide hoch-

affin ist. Die Bindung an anionische Lipide bewirkt zwar eine Konformations-

änderung, jedoch ist dadurch keine SAM-Bindung möglich. Anionische Lipide sind

zudem kein potentielles Substratlipid für PmtA, weshalb sich die Frage stellte: warum

bindet PmtA diese Lipide und weshalb wird die Aktivität stimuliert? Das für die

Zellform wichtige MARCKS-Protein, das Phosphatidylethanolaminbindeprotein

PEBP, die CTP: Phosphocholincytidylyltransferase, das Tumorsupressorprotein

PTEN oder des Saposin-ähnliche Protein Na-SLP-1 sind Beispiele für Proteine, die

ebenfalls mit anionischen Lipiden interagieren, obwohl diese kein Substrat für das

jeweilige Protein darstellen (Kim et al., 1994; Cornell & Northwood, 2000;

Das et al., 2002; Vallée et al., 2001; Willis et al., 2011). Die Bindung beruht dabei auf

Diskussion

- 104 -

einer elektrostatischen Interaktion zwischen basischen Aminosäuren und negativ

geladenen Lipiden. PmtA besitzt ein großes Cluster an basischen Aminosäuren auf

der Protein-Oberfläche. Das elektrostatische Potential der PmtA-Oberfläche,

basierend auf der Poisson-Boltzmann Gleichung, wurde für das Homologiemodell

mittels ABPS (Baker et al., 2001) bestimmt und mit Pymol visualisiert (Abbildung 46).

Abbildung 46: Elektrostatisches Potential der Oberfläche des PmtA-Homologiemodells basierend auf der Poisson-Boltzmann Gleichung. Die elektrostatische Potential wurde auf +5 kT/e (blau; positive Ladung), bzw. -5 kT/e (rot; negative Ladung) gesetzt.

Es ist ein stark positiv geladenes Potential (blau) auf der Oberfläche des PmtA-

Homologiemodells zu erkennen. Möglicherweise interagiert PmtA ähnlich wie die

oben aufgeführten Beispielproteine auch via elektrostatischer Interaktionen mit

anionischen Lipiden in einer Membran.

Um eine solche Interaktion nachzuweisen, wurde die Aktivität, Faltung und

Lipidbindung von PmtA bei hoher ionischer Stärke untersucht. Eine hohe ionische

Stärke führt dabei zu einer Minderung des negativen Membranpotentials, das durch

anionische Lipide ausgebildet wird. Die hohe ionische Stärke stört daher die

elektrostatischen Interaktionen zwischen Proteinen und Membranen

(McLaughlin, 1977; McLaughlin, 1989). Es wurde gezeigt, dass die PmtA-Aktivität bei

steigender ionischer Stärke abnimmt. Ähnliche Effekte sind für andere

membranassoziierte Proteine beschrieben. Die hohe ionische Stärke führte dabei zu

einer Dissoziation bzw. Beeinträchtigung der Membranbindung dieser Proteine.

Diskussion

- 105 -

Beispiele dafür sind die Phosphatidylserinsynthase aus E. coli, das MARCKS-

Protein, α-Synuclein, PEBP und das Gag-Protein des HIV-1 Virus (Louie et al., 1985;

Kim et al., 1994; Jo et al., 2000; Vallée et al., 2001; Dalton et al., 2007).

Die strukturelle Integrität von PmtA blieb durch hohe ionische Stärke unbeeinflusst.

Auch bei 500 mM NaCl war PmtA noch nativ gefaltet. Die Bindung von PmtA an die

Membran wurde jedoch durch hohe ionische Stärke gestört. PmtA konnte PE und

A. tumefaciens Lipidextrakt nur bis zu einer ionischen Stärke von 150 mM NaCl

binden. Eine Bindung an die anionischen Lipide CL, PG oder PS war jedoch nur bis

zu einer ionische Stärke von 50 mM NaCl effizient möglich. PmtA wird daher

vermutlich durch elektrostatische Interaktion basischer Aminosäuren und anionischer

Lipide an die Membran rekrutiert und gebunden. Durch die gestörte

Membraninteraktion bei hoher ionischer Stärke hat PmtA keinen Zugang zum

Substratlipid PE. Dies führte zu einer reduzierten Enzymaktivität. Jedoch war die

PmtA-Aktivität auch reduziert, wenn die Membran nur aus PE besteht. Hohe

Salzkonzentrationen können ebenfalls die spezifische Enzym-Substrat Bindung

beeinträchtigen, wenn diese auf ionischen Interaktionen oder

Wasserstoffbrückenbindungen basiert. Diese werden ebenfalls durch eine hohe

ionische Stärke beeinflusst. Eine reine PE-Membran ist jedoch eine nicht

physiologische Modellmembran. Eine physiologische Membran für E. coli besteht zu

ca. 75 % aus PE, 20 % aus PG und bis zu 5 % aus CL. Die agrobakterielle Membran

besitzt ebenfalls PG und sehr wahrscheinlich auch CL (Sherr & Law, 1965; Karnezis

et al., 2002). Eine Rekrutierung von PmtA via elektrostatischer Interaktionen ist daher

möglich.

Für periphere Membranproteine, die über elektrostatische Wechselwirkungen mit

einer Membran interagieren, ist bereits bekannt, dass diese oftmals durch

Lokalisation bzw. Delokalisation reguliert werden. Eine Delokalisation kann durch

Protein-Protein-Interaktion erfolgen, wenn das regulatorische Protein eine

ausgeprägte negative Ladung besitzt. Ein solcher Mechanismus ist für das

MARCKS-Protein bekannt, das aufgrund einer Interaktion mit dem stark negativ

geladenen Calmodulin von der Membran dissoziiert (Kim et al., 1994;

André et al., 2004). Für PmtA sind bisher keine Protein-Protein-Interaktionspartner

bekannt. Eine Alternative für die Regulation peripherer Membranproteine bietet eine

Phosphorylierung. Die stark negative Phosphatgruppe ändert dabei die

Diskussion

- 106 -

Oberflächenladung des Proteins, sodass die positive Ladung der kationischen

Aminosäurereste neutralisiert wird. Ein Beispiel dafür ist auch das MARCKS-Protein

oder das Tumorsuppressorprotein PETN (Kim et al., 1994; Das et al., 2002). Das

Programm NetPhosBac (Miller et al., 2009) postuliert putative Phosphorylierungs-

stellen in bakteriellen Proteinen. Für PmtA wurden sechs putative

Phosphorylierungsstellen vorhergesagt (S38, S52, S96, S124, S127, S160). Eine

putative Phosphorylierungsstelle für eine Neutralisierung des positiven

elektrostatischen Potentials bietet das S52. Dieses befindet sich in räumlicher Nähe

zu den basischen Aminosäuren K42 und K43, die eine positive Ladung auf der

Oberfläche des PmtA-Homologiemodells ausbilden. Eine Phosphorylierung an dieser

Position könnte das positive Ladungspotential der PmtA-Oberfläche mindern und

dadurch die Membranassoziation durch elektrostatische Interaktionen

beeinträchtigen.

4.2.3 Substratspezifität von PmtA

Neben der Bedeutung anionischer Lipide wurde auch die Substratspezifität von PmtA

anhand von PE-Derivaten untersucht. PmtA ist in der Lage sowohl Lyso-PE (LPE),

als auch 1,2-Dioctanoyl-sn-Glycerin-3-Phosphoethanolamin (C8-PE) als Substrate zu

nutzen. Das wasserlösliche Phosphorylethanolamin diente hingegen nicht als

Substrat. Modellmembranen, die nur aus LPE oder C8-PE bestehen, bieten jedoch

keine optimalen Methylierungsbedingungen. LPE und C8-PE sind in Abwesenheit

anionischer Lipide für PmtA kaum als Substrat nutzbar. Auch bindet PmtA 14C-SAM

in Gegenwart dieser Lipide nur sehr gering (C8-PE) oder nur in unspezifischen

Mengen (LPE). In Anwesenheit von anionischen Lipiden konnte jedoch gezeigt

werden, dass PmtA C8-PE und LPE als Substrate nutzen kann. Eine Abhängigkeit

der Enzymaktivität von der Fettsäurekettenlänge eines Lipides wurde bereits für

andere periphere Membranproteine gezeigt, wie beispielsweise für die eukaryotische

CTP:Phosphocholin Cytidylyltransferase (CTP) (Cornell, 1991b). Die CTP benötigt

für ihre enzymatische Aktivität eine Membran aus Lipiden, deren Fettsäureketten aus

mindestens 12 Kohlenstoffatome bestehen. Für optimale Aktivität sollte diese Kette

jedoch länger als 14 Kohlenstoffatome sein (Cornell, 1991b). Im Gegensatz dazu

benötigt die Proteinkinase C nur eine Fettsäurekettenlänge von 6 Kohlenstoffatomen

für optimale enzymatische Aktivität (Ebeling et al., 1985). Die Bedeutung der

Diskussion

- 107 -

Fettsäurenkettenlänge für die Enzymaktivität liegt womöglich in einer Stabilisierung

der Membranbindung. Über eine hydrophobe Interaktion von aromatischen

Aminosäuren mit den Fettsäureketten innerhalb der Membran wird das Protein

besser assoziiert (Lomize et al., 2007). Eine andere Bedeutung der

Fettsäurenkettenlänge ist für die PEMT der Hefe bekannt. Diese besitzt eine

Substratspezifität in Abhängigkeit zur Fettsäureketteneigenschaften und methyliert

hauptsächlich PE mit einer ungesättigten Fettsäurekette zu PC (Boumann et al.,

2004). Diese PEMT ist jedoch ein integrales Membranprotein. Als peripheres

Membranprotein, das an der Oberfläche einer Membran lokalisiert ist, sind die

Fettsäureketteneigenschaften der Lipide, wie beispielsweise Doppelbindungen, für

PmtA sehr wahrscheinlich von geringer Bedeutung.

Abbildung 47: Strukturformeln für das Etherlipid Plasmalogen (A.) oder N-(Acyl)-Sphing-4-Enin-1-Phosphoethanolamin (B.).

Es zeigt sich also, dass ein PmtA-Substrat sowohl eine Ethanolaminkopfgruppe, als

auch eine Fettsäurekette benötigt. Weiterhin muss dieses Substrat ein Bestandteil

einer Membran sein. Das Etherlipid Plasmalogen oder das Spingolipid N-(Acyl)-

Sphing-4-Enin-1-Phosphoethanolamin könnten weitere potentielle Substrate für

Diskussion

- 108 -

PmtA sein, die in zukünftigen Studien getestet werden können (Abbildung 47). Auch

sollte zukünftig untersucht werden, ob durch die Anwesenheit von anionischen

Lipiden und C8-PE bzw. LPE nicht nur die Aktivität von PmtA, sondern auch die

SAM-Bindefähigkeit erhöht wird.

4.2.4 Inhibierung von PmtA durch PC-Analoga

PmtA bindet neben seinen Substratlipiden PE, MMPE und DMPE auch das

Endprodukt PC. Weiterhin ist bekannt, dass PmtA neben SAH auch durch das

Endprodukt PC inhibiert wird. Dabei scheint PC mit PE um dieselbe

Substratbindestelle zu konkurrieren (Aktas & Narberhaus, 2009). Es stellte sich die

Frage, ob diese Inhibierung nur auf der Cholinkopfgruppe basiert. Daher wurde die

Wirkung des PC-homologen Sphingomyelins (SM) getestet. Die polare Kopfgruppe

von SM ist wie bei PC Cholin. Der einzige Unterschied zwischen PC und SM besteht

in der Verknüpfung der Fettsäuren. Bei SM ist eine Fettsäure über eine Amidbrücke

verknüpft. In Abschnitt 3.2.2 wurde gezeigt, dass steigende SM-Konzentrationen die

PmtA-Aktivität reduzieren. Da SM und PC strukturell sehr ähnlich sind, interagiert SM

möglicherweise ähnlich wie PC mit PmtA. Dies würde bedeuten, dass SM die

Substratbindestelle von PmtA besetzt und so in Konkurrenz zu PE steht. Im

Gegensatz zu SM hatte das wasserlösliche Cholin und auch Phosphocholin keinen

Einfluss auf die PmtA-Aktivität. Ähnliche Beobachtungen wurden für die pflanzliche

Phosphatidylethanolamin N-Methyltransferase gemacht. Sowohl Cholin als auch

Glycinbetain (ein Cholin-Analogon) reduzieren die enzymatischen Aktivität nicht (Jost

et al., 2009). Daher scheint es ähnlich wie bei den PE-Derivaten von entscheidender

Bedeutung zu sein, dass die polare Kopfgruppe an ein Lipid gekoppelt ist und in der

Membran integriert ist. Eine Inhibierung von PmtA ist daher auch durch andere

cholintragende Membrankomponenten denkbar. Ein putativer Kandidat wäre hierfür

das Isoprenoid Cholesterylphosphorylcholin. Dies könnte durch ein in vitro-

Aktivitätsassay in Gegenwart von PE und Cholesterylphosphorylcholin gezeigt

werden.

Diskussion

- 109 -

4.2.5 Die Bedeutung des N-Terminus für eine PmtA-Membran-

Interaktion

Um die Interaktion von PmtA mit Membranlipiden und die Konsequenzen einer

Protein-Lipid-Interaktion für PmtA näher zu charakterisieren, wurden sowohl

qualitative, als auch quantitative Methoden angewendet. Eine qualitative Methode

zum Nachweis der PmtA-Lipid-Interaktion ist die limitierte Proteolyse. Die Ergebnisse

dieser Methode lieferten erste Hinweise auf eine Konformationsänderung von PmtA

nach Lipidbindung. Weiterhin lassen sich aufgrund dieser Ergebnisse erste

Hypothesen aufstellen, welche Bereiche der PmtA-Struktur von der

Konformationsänderung betroffen sind. Es zeigte sich, dass PmtA durch

Membraninteraktion vor proteolytischer Degradation geschützt wird. PmtA wurde in

Gegenwart von Lipiden, mit Ausnahme von MMPE, DMPE und PC, nicht oder nur bis

zu einem 18 kDa großen Fragment abgebaut. Die Gründe für den schnelleren Abbau

von PmtA in Gegenwart von MMPE, DMPE und PC sind bisher unbekannt.

Eine massenspektrometrische Analyse der entstandenen Fragmente hat gezeigt,

dass der N-Terminus von PmtA in Gegenwart von Lipiden vor einem proteolytischen

Abbau geschützt wird. PmtA besitzt mit der Aminosäuresequenz 19FFK21 eine

putative Schnittstelle für Chymotrypsin im N-terminalen Bereich. Eine Spaltung an

dieser Stelle würde ein ca. 18 kDa großes PmtA-Fragment erzeugen. Durch die

Membranbindung könnte diese Schnittstelle blockiert werden und PmtA somit vor

einem proteolytischen Abbau geschützt werden. Entsprechend einer Sekundär-

strukturvorhersage für PmtA bilden die ersten 20 Aminosäuren eine α-Helix αA aus

(I-TASSER; Zhang, 2008). Das Homologiemodel für PmtA postuliert, dass diese

α-Helix über der globulären Kernstruktur exponiert ist (Abbildung 48). Einen

ähnlichen strukturellen Aufbau zeigt die eukaryotische CTP (Dunne et al., 1996). Die

N-terminale Helix der CTP ist ein Teil der Membranbindedomäne (Domäne M). Diese

Helix ist amphiphil und besitzt eine Nettoladung von +1. Basische Aminosäuren in

dieser Helix ermöglichen eine selektive Bindung an anionische Lipide (Taneva et al.,

2008). Die Selektivität für anionische Lipide basiert auf elektrostatischer Interaktion,

wobei die positiv geladenen Aminosäurereste mit den negativ geladenen

Lipidkopfgruppen interagieren (Johnson & Cornell, 1999). In der N-terminalen Helix

von PmtA sind ebenfalls basische Aminosäuren vorhanden (K6, R8, K12, R18 und

K21). Die Nettoladung dieser postulierten Helix αA beträgt +1. Möglicherweise

Diskussion

- 110 -

interagiert PmtA mit Hilfe dieser Helix auch über elektrostatische Interaktion mit der

Membran.

Abbildung 48: Putative Proteaseschnitstellen für PmtA. (A.): In magenta sind putative Schnittstellen für die Protease Chymotrypsin im PmtA-Homologiemodell markiert. (B.): Aminosäuresequenz von PmtA mit den putativen Schnittstellen für Chymotrypsin (via PeptidCutter; Gasteiger et al., 2003).

Das MinE Protein ist Teil des Min-Systems in E. coli, dass für die Lokalisierung des

Zellteilungsapperates wichtig ist. MinE und die eukaryotische Tyrosinhydroxylase

sind weitere Beispiele für Proteine, die mittels α-helikaler Strukturelemente mit

anionischen Lipiden interagieren (Halskau et al., 2009; Shih et al., 2011).

Desweiteren hat die N-terminale Helix von PmtA auch einen amphiphilen Charakter.

Sie besitzt mehrere Phenylalanine mit aromatischen Seitenketten. Diese könnten

nach Lipidbindung zur Membran hin orientiert werden und/oder teilweise in

hydrophobe Bereiche der Membran eintauchen. Eine hydrophobe Interaktion der

aromatischen Seitenketten und der Fettsäureketten könnte so die PmtA-

Membranassoziation stabilisieren.

Diskussion

- 111 -

Abbildung 49: PmtA-Homologiemodell mit Detailansicht der N-terminalen Helix αA von oben. Hervorgehoben sind die Phenylalanine der Helix αA. Hydrophobe Abschnitte der Helix sind in grün dargestellt, hydrophile Elemente sind blau dargestellt.

Eine solche Funktion konnte für die aromatische Aminosäure Tryptophan 142 im

humanen Glycolipidtransferprotein gezeigt werden (Kamlekar et al., 2010). Um in

Zukunft eine ähnliche Bedeutung für die Phenylalanine in PmtA nachzuweisen, bietet

sich ein Aminosäureaustausch der Phenylalanine zu Tryptophan an.

Tryptophanfluoreszenzmessungen der putativen N-terminalen α-Helix αA könnten

dann Aufschluss über eine derartige Membraninteraktion geben (Kraft et al., 2009).

Das Homologiemodell für PmtA zeigt, dass der hydrophobe Teil der Helix zum

Proteininneren hin orientiert ist (Abbildung 49). Durch eine Rotation der Helix über

den flexiblen Loop zwischen Aminosäure 24 bis 27 wäre es möglich, dass der

hydrophobe Teil der Helix zur Membran hin orientiert wird. Dadurch würde eine

Interaktion zwischen den aromatischen Seitenketten mit den Acylketten der Membran

ermöglicht. Ein solcher Mechanismus wird für das MinE-Protein aus Neisseria

gonorrhoeae postuliert (Shih et al., 2011).

Desweiteren könnte PmtA ähnlich wie andere Proteine durch eine Interaktion einer

amphiphilen Helix mit der Membran in seine korrekte Orientierung gebracht werden.

Ein Beispiel dafür ist das HIV-1 Gagprotein, das über elektrostatische Interaktionen

Diskussion

- 112 -

der N-terminalen Matrixdomäne mit der Membran interagiert. Diese elektrostatischen

Interaktionen sind notwendig, um das Protein auf der Membran funktional zu

orientieren (Lomize et al., 2007).

Die Bedeutung des N-Terminus für die PmtA-Aktivität zeigte sich bereits in

vorangegangenen Studien. N-terminale Deletionen von PmtA wirkten sich

unterschiedlich auf die PmtA-Aktivität aus, wobei generell eine erhöhte Löslichkeit

des Proteins zu beobachten war (Aktas, unveröffentlicht). Eine am N-Terminus um

10 Aminosäuren verkürzte PmtA-Variante (ΔN10) ist im Gegensatz zu einer Variante,

die um 20 Aminosäuren verkürzt ist (ΔN20), noch katalytisch aktiv. Beide Varianten

sind in der Lage Lipid zu binden (Aktas, unveröffentlicht). Die N-terminale Helix ist

daher wahrscheinlich nur partiell an der Membranbindung beteiligt. Möglicherweise

stabilisieren insbesondere die hydrophoben Aminosäurereste im N-Terminus von

PmtA die Membranassoziation und verhindern so eine rasche Dissoziation.

Eine alternative Funktion der N-terminalen Helix wäre die Blockierung des

katalytischen Zentrums. Eine solche Funktion ist für die Membranbindedomäne der

Phospholipase cPLA2 bekannt. Die N-terminale Domäne der cPLA2 gleicht einer

beweglichen Deckelstruktur und verhindert zunächst die Substratbindung. Durch

Membranassoziation erfolgt eine Konformationsänderung dieser Domäne, wodurch

eine Substratbindung im aktiven Zentrum möglich ist (Dessen et al., 1999). Die

Konformation von PmtA wird durch Membranbindung ebenfalls beeinflusst.

Möglicherweise ist von dieser Konformationsänderung auch der N-Terminus

betroffen. Die N-terminale Helix hätte dadurch eine entscheidende Bedeutung für die

Konformationsänderung. Die ΔN20-Variante ist zwar nativ gefaltet, aber es ist

möglich, dass durch die fehlenden N-terminalen Aminosäuren die Lipid-abhängige

Konformationsänderung nicht funktional ist. Auch eine negative Beeinflussung der

Substratspezifität kann durch die Deletion des N-Terminus nicht ausgeschlossen

werden.

Diskussion

- 113 -

4.2.6 Die PmtA-Lipid-Interaktion ist hoch-affin und führt zu einer

Konformationsänderung

Anhand von CD-spektroskopischen Stuiden wurde die Bedeutung von verschiedenen

Lipiden für die PmtA Struktur und Funktion näher analysiert. Die CD-Spektroskopie

ermöglicht die Analyse von Sekundärstrukturelementen ganzer Proteine oder

löslicher Proteindomänen (Kelly & Price, 2000). Auch kann die Interaktion von

Proteinen/Peptiden mit künstlichen Membranen in Form von Liposomen untersucht

werden (Vallée et al., 2001; Shih et al., 2011). Es konnte bereits gezeigt werden,

dass PmtA nur in Anwesenheit von Substratlipiden SAM bindet (Aktas &

Narberhaus, 2009). Eine mögliche Erklärung dafür ist, dass eine Substratlipidbindung

eine Konformationsänderung bewirkt, die die SAM-Bindung durch PmtA begünstigt

(Aktas & Narberhaus, 2009). Um dies zu klären, wurde mittels CD-Spektroskopie der

Einfluss von Lipiden auf die PmtA-Struktur untersucht. In Gegenwart von Liposomen

wurde die Elliptizität von PmtA beeinflusst, sodass sich der Elliptizitätswert erhöhte.

Dies war für die Substratlipide PE, MMPE, DMPE und PC über den gesamten

Bereich von 208 – 230 nm zu beobachten. Diese Veränderung des CD-Spektrums

könnte eine Erhöhung des β-Faltblattanteils und eine gleichzeitige Verringerung des

α-helikalen Anteils bedeuten. Auch könnten durch eine Lipidbindung bestimmte

Bereiche im Protein in flexible Loopregionen übergehen. Diese flexiblen

Loopregionen könnten eine Bindung von cytosolischem SAM ermöglichen. Für

eukaryotische PEMT ist beispielsweise bekannt, dass die SAM-Binderegion in

cytosolischen Loopregionen lokalisiert ist (Shields et al., 2003). PEMTs sind jedoch

integrale Membranproteine. Die Lipide PG, PS und CL führen auch zu einer

Änderung des CD-Spektrums. Die Änderung wurde jedoch tendenziell eher im

Bereich zwischen 208 – 210 nm beobachtet. Dies legt nahe, dass diese Lipide eine

geringfügig andere Konformationsänderung von PmtA im Vergleich zu den

Substratlipiden bewirken. Anhand der relativen Elliptizitätsänderung konnte die

Bindeaffinität von PmtA zu Modellmembranen bestimmt werden. Die

Dissoziationskonstanten (KD) lagen in einem mikromolaren Bereich zwischen

1 - 10 µM. Dies bedeutet, dass PmtA eine hohe Membranbindeaffinität besitzt. Eine

konformelle Änderung der Struktur durch Membraninteraktion ist eine bekannte

Konsequenz für periphere Membranproteine. Diese sind in cytosolischer oder

ungebundener Form oftmals inaktiv. Durch die Membranbindung und die daraus

Diskussion

- 114 -

resultierende Konformationsänderung gehen diese Proteine in eine aktive Form über.

Die Konformation der Pyruvatoxidase aus E. coli ändert sich beispielsweise erst nach

Membranbindung. Die Konformationsänderung führt zu einer Exponierung des

autoinhibierenden C-Terminus, wodurch eine Substratbindung möglich ist

(Neumann et al., 2008). Für die Phosphoethanolamin N-Methyltransferasen aus

Haemonchus contortus oder Plasmodium falciparum sind ähnliche konformelle

Änderungen bekannt (Lee et al., 2011; Lee et al., 2012). Durch Ligandenbindung

findet in der PfPMT aus P. falciparum eine Neuorientierung der N-terminalen Region

statt (Lee et al., 2012). Es konnte gezeigt werden, dass sich die Position und

Orientierung der Aminosäuren Y28, F31 und R179 der PfPMT ändert (Lee et al.,

2012). Eine homologe Aminosäure zu F31 befindet sich innerhalb des PmtA-

Homologiemodells nur an Position 20 (F20). Diese Aminosäure ist an einer ähnlichen

Position innerhalb der Struktur wie F31 der PfPMT lokalisiert. Möglicherweise übt

F20 in PmtA eine ähnliche Funktion wie in PfPMT aus und eine Umlagerung dieser

Aminosäure ist notwendig, um eine Substratbindung und Katalyse zu ermöglichen.

Die Glycin N-Methyltransferase, die Histamin Methyltransferase, die humane

Phenylethanolamin Methyltransferase oder die Guanidinoacetat Methyltransferase

sind weitere Beispiele für Proteine, deren Konformation sich nach Substratbindung

ändert (Horton et al., 2001; Takata et al., 2003; Komoto et al., 2004; Wu et al., 2005).

Speziell für periphere Membranproteine gibt es auch Beispiele für

Konformationsänderungen, die durch eine Interaktion mit Lipiden hervorgerufen wird.

So ändern beispielsweise Lysozyme, die cytosolische Domäne von Fis1, α-Synuclein

oder das Phosphatidylethanolaminbindeprotein (PEBP) ihre Struktur durch eine

Protein-Lipid Interaktion (Jo et al., 2000; Vallée et al., 2001; Gorbenko et al., 2007;

Wells & Hill, 2011). Im Gegensatz zu PmtA wird bei diesen Proteinen/Peptiden nach

einer Interaktion mit Lipiden meist eine Zunahme des α-helikalen Anteils beobachtet.

Die Sekundärstruktur von Peptiden ist größtenteils ungeordnet, wenn diese im

Cytosol lokalisiert sind oder in vitro in Lösung vorliegen. Erst durch eine

Membranbindung erfolgt die Ausbildung einer α-Helix. Dies gilt auch für das HiPIP-

Protein aus A. vinosum, dessen ungeordneter N-Terminus durch Membranbindung

α-helikale Strukturen ausbildet (Brehmer et al., 2012).

Die CD-spektroskopischen Daten für eine Lipid-abhängige Konformationsänderung

werden durch die Ergebnisse der PmtA-Tryptophanfluoreszenz gestützt. Eine

Lipidzugabe führt zur Abnahme der Fluoreszenzintensität und zu einer minimalen

Diskussion

- 115 -

Blauverschiebung des Fluoreszenzmaximums. Die Änderung der intrinsischen

Tryptophanfluoreszenz eines Proteins ist oftmals die Konsequenz einer

Konformationsänderung. (Kraft et al., 2009). Beispielsweise wurden für das humane

β2-Glycoprotein I (β2GPI), das wichtig für die Blutgerinnung ist (Brigthon et al., 1996),

eine deutliche Abnahme der Fluoreszenzintensität und eine Verschiebung des

Fluoreszenzmaximums nach Interaktion mit CL beobachtet (Hammel et al., 2001). Im

Gegensatz zu β2GPI besitzt PmtA nur ein Tryptophan (W192). Daher kann der

Ursprungsort der beobachteten Fluoreszenzänderung auf eine bestimmte Region

innerhalb der PmtA-Struktur eingegrenzt werden. Eine mögliche Erklärung für die

Fluoreszenzabnahme ist, dass eine Amidgruppe nach Lipidbindung in räumliche

Nähe zum Tryptophan hin orientiert wird. Arginin, Asparagin, Glutamin und Lysin sind

Aminosäuren mit einer Amidgruppe und können die Emmision der

Tryptophanfluoreszenz beeinflussen (Bushueva et al., 1975; Clark et al., 1996;

Henneke et al., 1997). Die Reste der Aminosäuren Q158, Q170, R184, N185 und

Q190 besitzen Amidgruppen, die in räumlicher Nähe von W192 lokalisiert sind

(Abbildung 50).

Abbildung 50: Detailansicht des Tryptophans in PmtA. Hervorgehoben ist das Tryptophan (rot) und amidgruppentragende Aminosäuren (blau) in der räumlichen Nachbarschaft. Grüne Striche zeigen den Abstand der Amidgruppen zum Tryptophan an. Ǻ: Angström.

Diese sind zwischen 3 und 11 Å von W192 entfernt und könnten durch eine

Konformationsänderung näher zum Tryptophan hin orientiert werden.

Diskussion

- 116 -

Neben der Fluoreszenzabnahme wurde eine Blauverschiebung des Fluoreszenz-

maximums nach Lipidzugabe beobachtet. Allerdings ist die Verschiebung um

maximal 4 nm sehr gering. Eine Blauverschiebung des Maximums bei einer Protein-

Lipid-Interaktion bedeutet, dass das Tryptophan in einer lipophilen Umgebung

exponiert ist. Dies könnte durch eine geringfügige Einbettung in die Membran

geschehen, ähnlich wie beim β-Glycoprotein I (Hammel et al., 2001;

Ren et al., 1997). Auch ist es möglich, dass das Tryptophan zur Acylkette des

gebunden Phospholipides hin orientiert wird. Ähnliche Beobachtungen wurden

mittels Tryptophanmessungen für das Phosphatidylethanolaminbindeprotein (PEBP)

oder der CTP gemacht (Vallée et al., 2001; Lavor et al., 2007).

Eine alternative Methode zur Quantifizierung der Protein-Lipid-Interaktion basiert auf

Fluorescein-PE (FPE). Dabei wird zu einer definierten Konzentration an FPE-

markierten Membranen das Zielprotein hinzu titriert. Anhand der Änderung der

Fluoreszenzintensität kann eine Protein-Lipid Interaktion quantifiziert werden. Die

Fluoreszenzintensität ist dabei abhängig vom Membranpotential, das wiederum

direkte Auswirkung auf den Protonierungsgrad des Xanthenringes der

Fluoresceingruppe hat. Eine Deprotonierung des Xanthenringes führt letztendlich zur

Änderung der Fluoreszenzintensität (O´Toole et al., 1999). Mit Hilfe von FPE wurde

bereits erfolgreich die Bindungsaffinität von Spectrin zu Modellmembranen bestimmt

(O´Toole et al., 1999). Die Zugabe von PmtA zu FPE-markierten Membranen

bewirkte eine Zunahme der Fluoreszenzintensität. Die Erhöhung der

Fluoreszenzintensität war jedoch für die verschiedenen Modellmembranen

unterschiedlich stark ausgeprägt. Dies ist wahrscheinlich auf ein unterschiedlich

großes Membranpotential der Modellmembranen zurückzuführen. Das

Ladungspotential einer Membran ist abhängig von der Beschaffenheit des

verwendeten Lipides. Beispielsweise ist CL doppelt so negativ geladen wie PG

(Abbildung 2). Eine Modellmembran aus CL ist daher wahrscheinlich insgesamt

negativer geladen, als eine Membran, die aus PG besteht. Möglicherweise ist daher

die Fluoreszenzzunahme bei CL-Membranen stärker, als bei PG-Membranen.

Anhand der relativen Fluoreszenzerhöhung wurden für PmtA Bindungskonstanten

gegenüber den jeweiligen Modellmembranen bestimmt. Die ermittelten KD-Werte (3 –

5 µM) sind in derselben Größenordnung wie die durch CD-Spektroskopie ermittelten

Werte (1 – 10 µM).

Diskussion

- 117 -

Die Ergebnisse der CD- und Fluoreszenzspektroskopie sind in Tabelle 8

zusammengestellt. Insgesamt zeigen die ermittelten Daten Bindungskonstanten im

mikromolaren Bereich für die PmtA-Lipid Interaktion. Dies bedeutet, dass die

Bindung von PmtA an Lipide hoch-affin ist.

Tabelle 8: Vergleich der Bindungsaffinitäten von PmtA zu verschiedenen Lipiden. At: A. tumefaciens-Lipide; CD: CD-Spektroskopie; CL: Cardiolipin; DMPE: Dimethyl-PE; Ec: E. coli-Lipide; FPE: Fluorescein-PE; KD: Dissoziationskonstante; MMPE: Monomethyl-PE; PC: Phosphatidylcholin; PE: Phosphatidylethanolamin; PG; Phosphatidylglycerin; PS: Phosphatidylserin.

Für Enzym-Substrat-Komplexe sind KD –Werte zwischen 10-7 bis 10-3 M üblich

(Nelson & Cox, 2009). Für periphere Membranproteine wurden KD-Werte von 500 µM

bis hin zu 33 nM gegenüber Membranen beschrieben (Johnson & Cornell, 1999). Die

ermittelten KD-Werte für PmtA liegen daher in einer bekannten Größenordnung für

die Interaktion eines peripheren Proteins mit einer Membran. PmtA besitzt also eine

hohe Affinität gegenüber Membranen und weiterhin führt die Interaktion mit Lipiden

zu einer Konformationsänderung von PmtA.

Diskussion

- 118 -

4.2.7 Gibt es in PmtA essentielle Aminosäuren für eine

Lipidinteraktion?

Für bakterielle Pmt-Enzyme konnten bisher keine Proteinstrukturen aufgeklärt

werden. Weiterhin besitzen bakterielle Pmt-Enzyme keine bekannten

Lipidbindemotive wie beispielsweise PH-Homologie oder das Ca2+-Motiv

(DiNitto el al., 2003). Daher konnten Aminosäuren, die für eine Lipidinteraktion

essentiell sind nur aufgrund von Aminosäuresequenzvergleichen identifiziert werden.

In silico-Analysen des PmtA-Homologiemodells postulieren darüber hinaus zwei

Bereiche auf der PmtA-Oberfläche, die stark positiv geladen sind. Basische

Aminosäuren, die diese positive Ladung ausbilden, sind potentielle

Interaktionspartner für anionische Lipide. Daher wurden, neben konservierten

Aminosäuren, basischer Aminosäuren dieser PmtA-Oberfläche mutiert und der

Einfluss der Punktmutation auf die PmtA-Aktivität untersucht.

Eine Mutation basischer und konservierter Aminosäuren im N-terminalen Bereich von

PmtA beeinflusste die PmtA-Aktivität nicht oder nur sehr geringfügig. Dies legt nahe,

dass diese Aminosäuren für die PmtA-Aktivität und Membranassoziation

wahrscheinlich nicht von Bedeutung sind. Nur eine Doppelmutante K28A,K29A

zeigte eine geringfügig reduzierte PmtA-Aktivität. Dies könnte strukturell bedingt sein,

da ein doppelter Aminosäureaustausch wahrscheinlich einen größeren Einfluss auf

die Faltung und Stabilität eines Proteins hat, als eine einzelne Punktmutation. Eine

Mutation der Aminosäuren K42 oder K43 führten hingegen zu einem drastischen

Aktivitätsverlust. Es konnte jedoch keine Überexpression dieser Proteine

nachgewiesen werden. Es ist daher möglich, dass diese Mutation die PmtA-Struktur

und Stabilität stark beeinflusst und wahrscheinlich zu einer Missfaltung des Proteins

führt. Das überexprimierte PmtA wird vermutlich durch Proteasen im Rahmen der

Qualitätskontrolle schnell degradiert. Eine Mutation von Lysin zu Alanin ist dabei ein

drastischer Austausch bezüglich der molekularen Größe der Aminosäure. Ein

Aminosäureaustausch von Lysin zu Glutamat oder Glutamin würde die Faltung

möglicherweise geringfügiger beeinflussen. Die konträre Ladung könnte

elektrostatische Interaktion mit anionischen Lipiden jedoch mindern. Die Bedeutung

von kationischen Aminosäuren für die Membranbindung konnte bereits für die

Phospholipase cPLA2 und die CTP: Phosphocholin Cytidylyltransferase gezeigt

werden (Snitko et al., 1997; Johnson et al., 2003). Eine Mutation von Lysin zu

Diskussion

- 119 -

Glutamin in der Domäne M der CTP reduziert die Membranassoziation. Durch diese

Mutation wurde die elektrostatische Bindung eliminiert (Johnson et al., 2003).

Weiterhin konnte gezeigt werden, dass auch drei aufeinanderfolgende Glutamate in

der Domäne M teilweise an der Membranassoziation beteiligt sind. Eine Mutation

dieser Aminosäuren führte zu einer stärkeren Membranbindung bei hoher ionischer

Stärke (Johnson et al., 2003). Eine Anordnung von drei aufeinanderfolgenden

Glutamaten ist auch in der N-terminalen Helix von PmtA lokalisiert. Möglicherweise

besitzen diese Aminosäuren eine ähnliche Bedeutung für die PmtA-Membran

Interaktion. In zukünftigen Arbeiten sollte daher auch die Bedeutung dieser

Glutamate näher aufgeklärt werden.

Einen interessanten und bisher unbekannten Effekt zeigte eine Mutation des

Threonins an Position 36 in PmtA. Eine Mutation der Aminosäure T36 zu Alanin

führte in vivo zu einer vermehrten Akkumulation von MMPE im Vergleich zu wildtyp

PmtA. Die Aminosäure T36 ist am N-Terminus und an der Oberfläche des PmtA-

Homologiemodells lokalisiert (Abbildung 51). T36A konnte im Gegensatz zu anderen

PmtA-Derivaten in ausreichenden Mengen isoliert werden. In vitro konnte jedoch

keine erhöhte Akkumulation von MMPE im Vergleich zu wildtyp PmtA nachgewiesen

werden. Verglichen mit PmtA synthetisierte T36A nur geringere Mengen des

Endproduktes PC. CD-spektroskopische Analysen zeigten, dass T36A nativ gefaltet

ist. Auch die Affinität zu Phospholipidsubstraten oder PG wurde durch die Mutation

nicht beeinflusst, sodass T36A möglicherweise im effizienten Transfer der

Methylgruppe von SAM auf das Phospholipidsubstrat oder generell in der

Reaktionsgeschwindigkeit beeinträchtig ist. Für das humane RAS-Proteine wurde

ebenfalls ein Threonin an Position 50 identifiziert, dass mit PC interagiert

(Cristea et al., 2009). Die Interaktion beruht dabei auf Wasserstoffbrückenbindungen

zwischen der Hydroxylgruppe des Threonins und der Phosphatgruppe des PCs. Eine

ähnliche Interaktion könnte auch T36 in PmtA ausführen. Eine Bedeutung von T36

für die Orientierung, Substratbindung oder auch Konformationsänderung von PmtA,

könnte nur durch eine Strukturaufklärung mit gebundenem Phospholipidsubstrat

eindeutig geklärt werden. Ein Strukturvergleich von PmtA mit PfPMT zeigt, dass T36

in PmtA an einer äquivalenten Position wie S37 in PfPMT lokalisiert ist. Die

Aminosäuren Threonin und Serin besitzen beide eine Hydroxylgruppe in ihrer

funktionellen Seitenkette.

Diskussion

- 120 -

Abbildung 51: Struktureller Vergleich von PmtA (grau) und PfPMT (gelb). Hervorgehoben sind die

Aminosäuren Threonin 36 in PmtA und Serin 37 in PfPMT.

Für PfPMT wird postuliert, dass S37 mit der Carboxylgruppe von SAM interagiert.

Dadurch wird SAM für die Transmethylierungsreaktion korrekt orientiert

(Lee et al., 2012). Eine derartige Funktion könnte T36 auch in PmtA übernehmen.

Daher ist es wahrscheinlich, dass T36 eher eine Bedeutung für die SAM-Bindung, als

für die Lipidbindung von PmtA hat.

Zudem wurden Punktmutationen konservierter Aminosäuren im zentralen und C-

terminalen Bereich der PmtA-Struktur eingefügt. Mutationen im zentralen Bereich der

(Aminosäure 44 – 160 und 187 – 192) bewirkte größtenteils eine stark reduzierte

Enzymaktivität von PmtA. Jedoch waren die generierten PmtA-Derivate unlöslich,

weshalb die Ursachen des enzymatischen Defektes vorerst ungeklärt bleiben.

Möglich ist es, dass die eingefügte Mutation die Stabilität der PmtA-Struktur zu sehr

beeinflusst. Mutationen am C-Terminus hatten bis auf das unlösliche PmtA-Derivat

W192A keinen Einfluss auf die PmtA-Aktivität. Zur Identifizierung essentieller

Aminosäuren von PmtA für die Interaktion mit Lipiden, scheint eine zukünftige

Strukturaufklärung von PmtA die vielversprechendste Basis zu bieten.

Diskussion

- 121 -

4.2.8 Postuliertes Modell für die PmtA-Membran-Interaktion

In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass PmtA an anionische Lipide durch

elektrostatische Interaktionen bindet. Die Bindung an anionische Lipide, sowie an

Substratlipide bewirkt eine Konformationsänderung von PmtA. Diese

Konformationsänderung ist wiederum notwendig, um den Methyldonor SAM binden

zu können. Anhand dieser Resultate, kann folgendes Modell zur Membran-

rekrutierung und Substratbindung von PmtA postuliert werden (Abbildung 52):

Abbildung 52: Das postulierte PmtA-Membran-Interaktionsmodell: PmtA wird durch elektrostatische Interaktionen zunächst an die Membran rekrutiert. Die Membran- und Substratbindung bewirken eine Konformationsänderung. Diese ermöglicht die Bindung des Kofaktors SAM und die Methylierungsreaktion, bei der PC synthetisiert wird. Als Nebenprodukt entsteht SAH. PC und SAH inhibieren PmtA. SAM: S-Adenosylmethionin. SAH: S-Adenosylhomocystein.

PmtA liegt zunächst als inaktives, cytosolisch lokalisiertes Protein vor. Durch

elektrostatische Interaktion basischer Aminosäuren mit anionischen Lipiden wird

PmtA an die Membran rekrutiert (Abbildung 52; 1.). Die elektrostatische Interaktion

beschleunigt jedoch nur die Membranassoziation und ist nicht essentiell für eine

Membranbindung, da PmtA die Substratlipide auch in Abwesenheit von anionischen

Lipiden binden kann. Nach der Membranbindung erfolgt eine konformelle

Diskussion

- 122 -

Umlagerung bzw. Neuordnung der PmtA-Struktur. Dadurch können die Reste

aromatischer Aminosäuren zur Membran hin exponiert werden, um die Bindung an

die Membran zu verstärken (Abbildung 52; 2.). Im nächsten Schritt bindet PmtA sein

Substratlipid, das ein Bestandteil der Membran ist. Die Bindung eines Substratlipides

ermöglicht dann die Bindung des Kofaktors SAM (Abbildung 52; 3.). Als letzter Schritt

erfolgt die Transmethylierungsreaktion, wobei die Methylgruppe von SAM auf das

Substratlipid übertragen wird. Dadurch entsteht das Nebenprodukt SAH und das

Endprodukt PC. Diese beiden Reaktionsprodukte inhibieren die PmtA-Aktivität.

Dieses Modell liefert einen ersten Einblick in die Funktionsweise bakterieller Pmt-

Enzyme. Auf Basis der etablierten Methoden und erzielten Resultate dieser Arbeit

können zukünftig die Auswirkungen von Mutationen auf die PmtA-Lipid-Interaktion

analysiert werden. Eine initiale Rekrutierung von PmtA an die Membran scheint

durch die Interaktion basischer Aminosäuren mit anionischen Lipiden von besonderer

Bedeutung zu sein. Es wäre daher lohnenswert die Rolle der positiv geladenen

PmtA-Oberfläche durch gezielte Mutagenese näher zu charakterisieren. Ebenfalls

bedarf die Bedeutung der N-terminalen Helix für die Lipidbindung weiterer Analysen.

Einen detaillierten Einblick in die Funktionsweise von PmtA und die Interaktion mit

Lipiden würde eine Strukturaufklärung in Anwesenheit von Lipiden liefern. Dies

würde weiterhin die Identifizierung wichtiger Aminosäuren für die spezifische PmtA-

Lipid-Interaktion erleichtern.

Zusammenfassung

- 123 -

5. Zusammenfassung

Für alle drei Domänen des Lebens sind biologische Membranen und deren

spezifische Lipidzusammensetzung essentiell. Eine bakterielle Membran besteht

meist aus den Lipiden Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylglycerin (PG) und

Cardiolipin (CL). Phosphatidylcholin (PC) ist hingegen eher selten und meist nur in

Membranen von Bakterien zu finden, die mit einem eukaryotischen Wirt interagieren.

Agrobacterium tumefaciens ist ein pflanzenpathogenes Bakterium, das in der Lage

ist, PC mittels einer Phospholipid N-Methyltransferase (PmtA) zu synthetisieren.

PmtA methyliert PE zu PC und nutzt als Methyldonor S-Adenosylmethionin (SAM).

Diese Reaktion wird durch das anionische Membranlipid PG stimuliert. Im Rahmen

dieser Arbeit sollten die SAM- und die Lipid-Bindeeigenschaften von PmtA näher

charakterisiert werden. Weiterhin sollte geklärt werden, auf welchem Mechanismus

der stimulierende Effekt von PG auf die PmtA-Aktivität beruht.

Mit Hilfe von Mutagenesestudien und bioinformatischen Analysen konnten

Aminosäuren in PmtA identifiziert werden, die für die SAM-Bindung spezifisch und

essentiell sind. Dabei konnte ausgeschlossen werden, dass die generierten

Punktmutationen die Proteinfaltung oder Lipidbindefähigkeit beeinflussten. Mit Hilfe

eines Homologiemodells von PmtA wurde die SAM-Bindetasche identifiziert, sowie

ein Bindungsmechanismus postuliert, der wichtige Grundlagen für die SAM-Bindung

durch bakterielle Pmt-Enzyme aufzeigt.

Zudem wurde durch verschiedene spektroskopische Methoden die Lipidbindung von

PmtA quantifiziert. Dissoziationskonstanten für die PmtA-Lipid-Interaktion liegen im

mikromolaren Bereich und deuten somit auf eine hoch-affine Bindung hin.

Basierend auf der in dieser Arbeit erzielten Resultate wurde ein Modell für die

Membran-Rekrutierung und Substratbindung von PmtA aufgestellt: Durch Bindung an

anionische Lipide wird der erste Kontakt zur Membran hergestellt. Die Bindung an

anionische Lipide führt zu einer Konformationsänderung, welche die Lipid-

Substratbindung erleichtert. Die Substratbindung wiederum geht mit einer weiteren

Konformationsänderung einher, die erst die Bindung des Methyldonors SAM

ermöglicht.

Die Resultate dieser Arbeit tragen somit zum Verständnis der Funktionsweise von

bakteriellen Phospholipid N-Methyltransferasen bei.

Summary

- 124 -

6. Summary

Biological membranes and their specific lipid composition are essential for all

domains of life. A typical bacterial membrane is composed of phosphatidyl-

ethanolamine (PE), phosphatidylglycerol (PG) and cardiolipin (CL).

Phosphatidylcholine (PC), a typical eukaryotic membrane lipid, is also present in a

restricted number of bacteria, especially in those interacting with eukaryotes. PC

plays a crucial role in bacteria-host interactions and is essential for the virulence of

the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Its phospholipid N-methyltransferase

PmtA catalyzes the formation of PC by a three-step methylation of PE. The methyl

group is provided by S-adenosylmethionine (SAM), which is converted to S-

adenosylhomocysteine. This reaction is stimulated by the anionic lipid PG.

The aim of this work was to characterise the SAM- and lipid-binding properties of

PmtA and to elucidate the mechanism for the stimulation of PmtA activity by PG.

Using bioinformatic and mutagenesis analysis residues essential for SAM binding by

PmtA were identified. The point mutations did not influence PmtA folding and lipid

binding as shown by CD spectroscopy. A PmtA homology model supported the

mutagenesis data and provided a useful basis for SAM-binding mechanism and

structure. The postulated SAM-binding mechanism for PmtA illustrates basic

principles for SAM binding by SAM-methyltransferases.

Furthermore, lipid binding of PmtA was analysed and quantified using different

independent spectroscopic approaches. These studies revealed binding constants

for the PmtA-lipid interaction in a low micromolar range indicating a high-affinity lipid

binding.

Based on these results, a model for membrane recruitment and substrate binding of

PmtA can be postulated: The initial contact between PmtA and the membrane

depends on anionic lipids. This interaction induces a conformational change in PmtA

facilitating lipid-substrate binding, which in turn causes a second conformational

change finally allowing SAM binding.

This study provides valuable insights into mechanism and structural features of

bacterial Pmt enzymes.

Literaturverzeichnis

- 125 -

7. Literaturverzeichnis

Aktas, M. and F. Narberhaus. 2009. In vitro characterization of the enzyme properties of the phospholipid N-methyltransferase PmtA from Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol. 191: 2033-2041.

Aktas, M., Gleichenhagen, J., Stoll, R., and F. Narberhaus. 2011a. S-Adenosylmethionine-binding properties of a bacterial phospholipid N-methyltransferase. J Bacteriol. 193: 3473-3481.

Aktas, M., Jost, K.A., Fritz, C., and F. Narberhaus. 2011b. Choline uptake in Agrobacterium tumefaciens by the high-affinity ChoXWV transporter. J Bacteriol. 193: 5119-5129.

Aktas, M., Wessel, M., Hacker, S., Klüsener, S., Gleichenhagen, J. and F. Narberhaus. 2010. Phosphatidylcholine biosynthesis and its significance in bacteria interacting with eukaryotic cells. Eur J Cell Biol. 89: 888-894.

André, I., Kesvatera, T., Jönsson, B., Akerfeldt, K.S. and S. Linse. 2004. The role of electrostatic interactions in calmodulin-peptide complex formation. Biophys J. 87: 1929-1938.

Arondel, V., Benning, C. and C.R. Somerville. 1993. Isolation and functional expression in Escherichia coli of a gene encoding phosphatidylethanolamine methyltransferase (EC 2.1.1.17) from Rhodobacter sphaeroides. J Biol Chem. 268: 16002-16008.

Baker, N.A., Sept, D., Joseph, S., Holst, M.J. and J.A. McCammon. 2001. Electrostatics of nanosystems: application to microtubules and the ribosome. Proc Natl Acad Sci USA. 98: 10037-10041.

Basturea, G.N. and M.P. Deutscher. 2007. Substrate specificity and properties of the Escherichia coli 16S rRNA methyltransferase, RsmE. RNA. 13: 1969-1976.

Bevers, E.M., Comfurius, P., and R.F.A. Zwaal. 1983. Changes in membrane phospholipid distribution during platelet activation. Biochim Biophy Acta. 736: 57-66.

Birnboim, H.C. and J. Doly. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523.

Bligh, E.G. and W.J. Dyer. 1959. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can J Biochem Physiol. 37: 911-917.

Boumann, H.A., Chin, P.T., Heck, A.J., De Kruijff, B. and Al. De Kroon. 2004. The yeast phospholipid N-methyltransferases catalyzing the synthesis of phosphatidylcholine preferentially convert di-C16:1 substrates both in vivo and in vitro. J Biol Chem. 279: 40314-40319.

Brehmer, T., Kerth, A., Graubner, W., Malesevic, M., Hou, B., Brüser, T. and A. Blume. 2012. Negatively charged phospholipids trigger the interaction of a bacterial tat substrate precursor protein with lipid monolayers. Langmuir. 28: 3534-3541.


- 126 -

Bremer, J. and D. M. Greenberg. 1959. Mono- and dimethylethanolamine isolated from ratliver phospholipids. Biochim Biophys Acta. 35: 287-288.

Brighton, T.A., Hogg, P.J., Dai, Y.P., Murray, B.H., Chong, B.H. and C.N. Chesterman. 1996. β2-glycoprotein I in thrombosis: evidence for a role as a natural anticoagulant. Br J Haematol. 93: 185-194.

Brophy, P.J., Choy, P.C., Toone, J.R. and D.E. Vance. 1977. Choline kinase and ethanolamine kinase are separate, soluble enzymes in rat liver. Eur J Biochem. 78: 491-495.

Bruscella, P., Cassagnaud, L., Ratouchniak, J., Brasseur, G., Lojou, E., Amilis, R. and V. Bonnefoy. 2005. The HiPIP from the acidophilic Acidithiobacillus ferrooxidans is correctly processed and translocated in Escherichia coli, in spite of the periplasm pH difference between these two micro-organisms. Microbiology. 151: 1421-1431.

Bujnicki, J. M. 1999. Comparison of protein structures reveals monophyletic origin of the AdoMet-dependent methyltransferase family and mechanistic convergence rather than recent differentiation of N4-cytosine and N6-adenine DNA methylation. In Silico Biol. 1: 175-182.

Bushueva, T.L., Busel, E.P. and E.A. Burstein. 1975. The interaction of protein functional groups with indole chromophore. III. Amine, amide and thiol groups. Studia Biophys 52: 41-52

Bügl, H., Fauman, E.B., Staker, B.L., Zheng, F., Kushner, S.R., Saper, M.A., Bardwell, J.C and U. Jakob. 2000. RNA methylation under heat shock control. Mol Cell. 6: 349-360.

Cheng, X., Kumar, S., Posfai, J., Pflugrath, J.W. and R.J. Roberts. 1993. Crystal structure of the HhaI DNA methyltransferase complexed with S-Adenosyl-L-methionine. Cell 74: 299-307.

Cirstea, I.C., Kutsche, K., Dvorsky, R., Gremer, L., Carta, C., Horn, D., Roberts, A.E., Lepri, F., Merbitz-Zahradnik, T., König, R., Kratz, C.P., Pantaleoni, F., Dentici, M.L., Joshi, V.A., Kucherlapati, R.S., Mazzanti, L., Mundlos, S., Patton, M.A., Silengo, M.C., Rossi, C., Zampino, G., Digilio, C., Stuppia, L., Seemanova, E., Pennacchio, L.A., Gelb, B.D., Dallapiccola, B., Wittinghofer, A., Ahmadian, M.R., Tartaglia, M. and M. Zenker. 2010. A restricted spectrum of NRAS mutations causes Noonan syndrome. Nat Genet. 42: 27-29.

Clark, P.L., Liu, Z.P., Zhang, J. and L.M. Gierasch. 1996. Intrinsic tryptophans of CRABPI as probes of structure and folding. Protein Sci. 5: 1108-1117.

Comerci, D.J., Altabe, S., de Mendoza, D. and R.A. Ugalde. 2006. Brucella abortus synthesizes phosphatidylcholine from choline provided by the host. J Bacteriol. 188: 1929-1934.


- 127 -

Conover, G.M., Martínez-Morales, F., Heidtman, M.I., Luo Z.Q., Tang, M., Chen, C., Geiger, O. and R.R. Isberg. 2008. Phosphatidylcholine synthesis is required for optimal function of Legionella pneumophila virulence determinants. Cell Microbiol. 10: 514-528.

Constantinescu, I. and M. Lafleur. 2004. Influence of the lipid composition on the kinetics of concerted insertion and folding of melittin in bilayers. Biochim Biophys Acta. 1667: 26-37.

Cornell, R.C. 1991a. Regulation of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase by lipids 1. Negative surface charge dependence for activation. Biochemistry. 30: 5873-5880.

Cornell, R.C. 1991b. Regulation of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase by lipids 2. Surface curvature, acyl chain length and lipid-phase dependence for activation. Biochemistry. 30: 5881-5888.

Cornell, R.B. and I.C. Northwood. 2000. Regulation of CTP:phosphocholine cytidyltransferase by amphitropism and relocclization. Trends Biochem Sci. 25: 441-447.

Cui, Z., Vance, J.E., Chen, M.H., Voelker, D.R. and D.E. Vance. 1993. Cloning and expression of a novel phosphatidylethanolamine N-methyltransferase. A specific biochemical and cytological marker for a unique membrane fraction in rat liver. J Biol Chem. 268: 16655-16663.

Dalton, A.K., Ako-Adjei, D., Murray, P.S., Murray, D. and V.M. Vogt. 2007. Electrostatic interactions drive membrane association of the human immunodeficiency virus type 1 Gag MA domain. J Virol. 81: 6435-6445.

Danne, L.M. 2010. In vitro characterization of the phospholipid-binding properties of the phospholipid N-methyltransferase PmtA from Agrobacterium tumefaciens. Bachelorarbeit, Ruhr-Universität Bochum.

Das, S. Dixon, J.E. and W. Cho. 2002. Membrane-binding and activation mechanism of PTEN. PNAS. 100: 7491-7496

de Rudder, K.E.E., Thomas-Oates, J.E. and O. Geiger. 1997. Rhizobium meliloti mutants deficient in phospholipid N-methyltransferase still contain phosphatidylcholine. J Bacteriol. 179: 6921-6928.

de Rudder, K.E.E., Sohlenkamp, C. and O. Geiger. 1999. Plant-exuded choline is used for rhizobial membrane lipid biosynthesis by phosphatidylcholine synthase. J Biol Chem. 274: 20011-20016.

de Rudder, K.E.E., López-Lara, I.M. and O. Geiger. 2000. Inactivation of the gene for phospholipid N-methyltransferase in Sinorhizobium meliloti: phosphatidylcholine is required for normal growth. Mol Microbiol. 37: 763-772.

Dessen, A., Tang, J., Schmidt, H., Stahl, M., Clark, J.D., Seehra, J. and W.S. Somers. 1999. Crystal structure of human cytosolic phospholipase A2 reveals a novel topology and catalytic mechanism. Cell. 97: 349-360.


- 128 -

DiNitto, J.P., Cronin, T.C. and D.G. Lambright. 2003. Membrane recognition and targeting by lipid-binding domains. Sci STKE. 2003:re16.

Dowhan, W. 1997. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: Why are there so many lipids? Annu Rev Biochem. 66: 199-232.

Dowler, S., Kular, G. and D.R. Alessi. 2002. Protein lipid overlay assay. Sci STKE. 2002: pl6.

Dunne, S.J., Cornell, R.B., Johnson, J.E., Glover, N.R. and A.S. Tracey. 1996. Structure of the membrane binding domain of CTP:phosphocholine cytidylyltransferase. Biochemistry. 35: 11975-11984.

Dupont, L., Garcia, I., Poggi, M.C., Alloing, G., Mandon, K. and D. Le Rudulier. 2004. The Sinorhizobium meliloti ABC transporter Cho is highly specific for choline and expressed in bacteroids from Medicago sativa nodules. J Bacteriol. 186: 5988-5996.

Ebeling, J.G., Vandenbark, G.R., Kuhn, L.J., Ganong, B.R., Bell, R.M and J.E. Niedel. 1985. Diacylglycerols mimic phorbol diester induction of leukemic cell differentiation. Prot Natl Acad Sci USA. 82: 815-819.

Exton, J.H. 1994. Phosphatidylcholine breakdown and signal transduction. Biochim Biophys Acta. 1212: 26-42.

Fauman E.B., Blumenthal R.M. and X. Cheng. 1999. Structure and evolution of AdoMetdependent MTases. In: Cheng X., Blumenthal, R. M. (ed.): S-Adenosylmethionine-dependent methyltransferases: structures and functions, vol. I. World Scientific Inc., Singapore: 38.

Fontana, A., de Lauretto, P.P., Spolaore, B., Frare, E. Picotti, P. and M. Zambonin. 2004. Probing protein structure by limited proteolysis. Acta Biochim Pol. 51: 299-321.

Garnier, J., Gibrat, J.F. and B. Robson. 1996. GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequence. Methods Enzymol. 266: 540-553.

Gastieger, E., Gattiker, A., Hoogland, C., Ivanyi, I., Appel, R.D. and A. Bairoch. 2003. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 31: 3784-3788.

Gaynor, P.M. and G.M. Carman. 1990. Phosphatidylethanolamine methyltransferase and phospholipid methyltransferase activities from Saccharomyces cerevisiae. Enzymological and kinetic properties. Biochim Biophys Acta. 1045: 156-163.

Gisk, B., Yasui, Y., Kohchi, T. and N. Frankenberg-Dinkel. 2010. Characterization of the haem oxygenase protein family in Arabidopsis thaliana reveals a diversity of functions. Biochem J. 425: 425-434.

Goldfine, H. 1984. Bacterial membranes and lipid packing theory. J Lipid Res. 25: 1501-1507.


- 129 -

Grobenko, G.P., Ioffe, V.M. and P.K. Kinnunen. 2007. Binding of lysozyme to phospholipid bilayers: evidence for protein aggregation upon membrane association. Biophys J. 93: 140-153.

Hacker S., Sohlenkamp C., Aktas M., Geiger O. and F. Narberhaus. 2008. Multiple phospholipid N-methyltransferases with distinct substrate specificities are encoded in Bradyrhizobium japonicum. J Bacteriol 190: 571-580.

Hakizimana, P., Masureel, M., Gbaquidi, B., Ruysschaert, J.M. and C. Govaerts. 2008. Interactions between phosphatidylethanolamine headgroup and LmrP, a multidrug transporter: a conserved mechanism for proton gradient sensing? J Biol Chem. 283: 9359-9376.

Halskau, Ø Jr., Ying, M. Baumann, A., Kleppe, R., Rodriquez-Larrea, D., Almås, B., Haavik, J. and A. Martinez. 2009. Three-way interaction between 14-3-3 proteins, the N-terminal region of tyrosine hydroxylase, and negatively charged membranes. J Biol Chem. 284: 32758-32769.

Hammel, M., Schwarzenbacher, R., Gries, A., Kostner, G.M., Laggner, P. and R. Prassl. 2001. Mechanism of the interaction of β2-glycoprotein I with negatively charged phospholipid membranes. Biochemistry. 40: 14173-14181.

Hanada, T., Kashima, Y., Kosugi, A., Koizumi, Y., Yanagida, F. and S. Udaka. 2001. A gene encoding phosphatidylethanolamine N-methyltransferase from Acetobacter aceti and some properties of its disruptant. Biosci Biotechnol Biochem. 65: 2741-2748.

Haydock, S.F., Dowson, J.A., Dhillon, N., Roberts, G.A., Cortes, J. and P.F. Leadlay. 1991. Cloning and sequence analysis of genes involved in erythromycin biosynthesis in Saccharopolyspora erythraea: sequence similarities between EryG and a family of S-Adenosylmethionine-dependent methyltransferases. Mol Gen Genet. 230: 120-128.

Heinig, M. and D. Frishman. 2004. STRIDE: a web server for secondary structure assignment from known atomic coordinates of proteins. Nucleic Acids Res. 32: W500-W502.

Hennecke, J., Sillen, A., Huber-Wunderlich, M., Engelborghs, Y. and R. Glockshuber. 1997. Quenching of tryptophan fluorescence by the active-site disulfide bridge in the DsbA protein from Escherichia coli. Biochemistry. 36: 6391-6400.

Horton, J.R., Sawada, K., Nishibori, M., Zhang, X., and X. Cheng. 2001. Two polymorphic forms of human histamine methyltransferase: structural, thermal, and kinetic comparisons. Structure. 9: 837–849

Jo, E., McLaurin, J., Yip, C.M., St. George-Hyslop, P and P.E. Fraser. 2000. α-Synuclein membrane interactions and lipid specificity. J Biol Chem. 275: 34328-34334.


- 130 -

Johnson, J.E. and R.B. Cornell. 1999. Amphitropic proteins: regulation by reversible membrane interactions (review). Mol Membr Biol. 16: 217-235.

Johnson, J.E., Xie, M., Singh, L.M., Edge, R. and R.B. Cornell. 2003. Both acidic and basic amino acids in an amphitropic enzyme, CTP:phosphocholine cytidylyltransferase, dictate its selectivity for anionic membranes. J Biol Chem. 278: 514-522.

Jost, R., Berkowitz, O., Shaw, J. and J. Masle. 2009. Biochemical characterization of two wheat phosphoethanolamine N-methyltransferase isoforms with different sensitivities to inhibition by phosphatidic acid. J Biol Chem. 284: 31962-31971.

Kamlekar, R.K., Gao, Y., Kenoth, R., Molotkovsky, J.G., Prendergast, F.G., Malinina, L., Patel, D.J., Wessels, W.S., Venyaminov, S.Y. and R.E. Brown. 2010. Human GLTP: Three distinct functions for the three tryptophans in a novel peripheral amphitropic fold. Biophys J. 99: 2626-2635.

Kaneshiro, T. and J.H. Law. 1964. Phosphatidylcholine synthesis in Agrobacterium tumefaciens. I. Purification and properties of a phosphatidylethanolamine N-methyltransferase. J Biol Chem. 239: 1705-1713.

Kanipes, M.I. and S.A. Henry. 1997. The phospholipid methyltransferases in yeast. Biochim Biophys Acta. 1348: 134-141.

Kanipes, M.I., Hill J.E., and S. A. Henry. 1998. The Schizosaccharomyces pombe cho1+ gene encodes a phospholipid methyltransferase. Genetics. 150: 553-562.

Karnezis, T., Fisher, H.C., Neumann, G.M., Stone, B.A. and V.A. Stanisisch. 2002. Cloning and characterization of the phosphatidylserine synthase gene of Agrobacterium sp. strain ATCC 31749 and effect of its inactivation on production of high-molecular-mass (1-->3)-β-D-glucan (curdlan). J Bacteriol. 184: 4114-4123.

Kelly, S.M. and N.C. Price. 2000. The use of circular dichroism in the investigation of protein structure and function. Curr Protein Pept Sci. 1: 349-384.

Kennedy, E.P. and S.B. Weiss. 1956. The function of cytidine coenzymes in the biosynthesis of phospholipids. J Biol Chem. 222: 193-214.

Kennedy, E.P. 1989. Discovery of the pathways for the biosynthesis of phosphatidylcholine. In: Vance D.E. (ed.): Phosphatidylcholine metabolism. CRC Press, Boca Raton, Florida, USA: 1-8.

Kent, C. 1990. Regulation of phosphatidylcholine biosynthesis. Prog Lipid Res. 29: 87-105.

Kent, C. 2005. Regulatory enzymes of phosphatidylcholine biosynthesis: a personal perspective. Biochim Biophys Acta. 1733: 53-66.

Kim, J., Shishido, T., Jiang, X., Aderem, A. and S. McLaughlin. 1994. Phosphorylation, high ionic strength, and calmodulin reverse the binding of MARCKS to phospholipid vesicles. J Biol Chem. 269: 28214-28219.


- 131 -

Klüsener, S., Aktas, M., Thormann, K.M., Wessel, M. and F. Narberhaus. 2009. Expression and physiological relevance of Agrobacterium tumefaciens phosphatidylcholine biosynthesis genes. J Bacteriol. 191: 365-374.

Kodaki, T. and S. Yamashita. 1987. Yeast phosphatidylethanolamine methylation pathway. Cloning and characterization of two distinct methyltransferase genes. J Biol Chem. 262: 15428-15435.

Komoto, J., Yamada, T., Takata, Y., Konishi, K., Ogawa, H., Gomi, T., Fujioka, M., and F. Takusagawa. 2004. Catalytic mechanism of guanidinoacetate methyltransferase: crystal structures of guanidinoacetate methyltransferase ternary complexes. Biochemistry. 43: 14385-14394

Kozbial, P.Z. and A.R. Mushegian. 2005. Natural history of S-Adenosylmethionine-binding proteins. BMC Struct Biol. 5: 19.

Kraft, C.A., Garrido, J.L., Leiva-Vega, L. and G. Romero. 2009. Quantitative analysis of protein-lipid interactions using tryptophan fluorescence. Sci Signal. 2: pl4.

Kresge, N., Tabor, H., Simoni, R.D. and R.L. Hill. 2005. An escape from Italy, the discovery of S-Adenosylmethionine, and the biosynthesis of creatine by Giulio L. Cantoni. J Biol Chem. 280: e35.

Kumar, S., Cheng, X., Klimasauskas, S., Mi, S., Posfai, J., Roberts R. J. and G.G. Wilson. 1994. The DNA (cytosine-5) methyltransferases. Nucleic Acids Res.

22: 1-10.

Laemmli, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.

LeBlanc M. J., Gavino V., Perea A., Yousef I. M., Levy E. and B. Tuchweber. 1998. The role of dietary choline in the beneficial effects of lecithin on the secretion of biliary lipids in rats. Biochim Biophys Acta. 1393: 223-234.

Lee, S.G., Haakenson, W., McCarter, J.P., Williams, D.J., Hresko, M.C. and J.M. Jez. 2011. Thermodynamic evaluation of ligand binding in the plant-like phosphoethanolamine methyltransferases of the parasitic nematode Haemonchus contortus. J Biol Chem. 286: 38060-38068.

Lee, S.G., Kim, Y., Alpert, T.D., Nagata, A. and J.M. Jez. 2012. Structure and reaction mechanism of phosphoethanolamine methyltransferase from the malaria parasite Plasmodium falciparum: an antiparasitic drug target. J Biol Chem. 287: 1426-1435.

Linde, K. Gröbner, G. and L. Rilfors. 2004. Lipid dependence and activity control of phosphatidylserine synthase from Escherichia coli. FEBS Lett. 575: 77-80.

Lisa, T.A., Garrido M.N. and C.E. Domenech. 1984. Pseudomonas aeruginosa acid phosphatase and cholinesterase induced by choline and its metabolic derivatives may contain a similar anionic peripheral site. Mol Cell Biochem. 63: 113-118.

Loenen, W.A. 2006. S-Adenosylmethionine: jack of all trades and master of everything? Biochem Soc Trans. 34: 330-333.


- 132 -

Lomize, A.L., Pogozheva, I.D., Lomize, M.A. and H.I. Mosberg. 2007. The role of hydrophobic interactions in positioning of peripheral proteins in membranes. BMC Struct Biol. 7: 44.

López-Lara, I.M., Sohlenkamp, C. and O. Geiger. 2003. Membrane lipids in plant-associated bacteria: their biosyntheses and possible functions. Mol Plant Microbe Interact. 16: 567-579.

Louie, K., Chen, Y.C. and W. Dowhan. 1986. Substrate-induced membrane association of phosphatidylserine synthase from Escherichia coli. J Bacteriol. 165: 805-812.

Lucchesi, G.I., Lisa, T.A. and C.E. Domenech. 1989. Choline and betaine as inducer agents of Pseudomonas aeruginosa phospholipase C activity in high phosphate medium. FEMS Microbiol Lett. 48: 335-338.

Malone, T., Blumenthal R.M. and X. Cheng. 1995. Structure-guided analysis reveals nine sequence motifs conserved among DNA amino-methyltransferases, and suggests a catalytic mechanism for these enzymes. J Mol Biol. 253: 618-632.

Martin, J.L. and F.M. McMillan. 2002. SAM (dependent) I AM: the S-adenosylmethionine dependent methyltransferase fold. Curr Opin Struct Biol. 12: 783-793.

Martínez-Morales, F., Schobert M., López-Lara, I.M. and O. Geiger. 2003. Pathways for phosphatidylcholine biosynthesis in bacteria. Microbiology. 149: 3461-3471.

Mashhoon, N., Carroll, M., Pruss, C., Eberhard, J., Ishikawa, S., Estabrook, R.A. and N. Reich. 2004. Functional characterization of Escherichia coli DNA adenine methyltransferase, a novel target for antibiotics. J Biol Chem. 279: 52075-52081.

McLaughlin, S. 1977. Electrostatic potentials at membrane-solution interfaces. Curr. Top. Membr. Transp. 9:71-144.

McLaughlin, S. 1989. The electrostatic properties of membranes. Annu Rev Biophys Biophys Chem. 18: 113-136.

Michel, V., Yuan, Z., Ramsubir, S. and M. Bakovic. 2006. Choline transport for phospholipid synthesis. Exp. Biol. Med. (Maywood) 231:490–504.

Miller, M.L., Soufi, B., Jers, C., Blom, N., Macek, B. and I. Mijakovic. 2009. NetPhosBac – a predictor for Ser/Thr phosphorlyation sites in bacterial proteins. Proteomics. 9: 116-125.

Minami, N., Yasuda, T., Ishii, Y., Fujimori, K. and F. Amano. 2011. Regulatory role of cardiolipin in the activity of an ATP-dependent protease, Lon, from Escherichia coli. J Biochem. 149: 519-527.

Minder, A.C., de Rudder, K.E., Narberhaus, F., Fischer, H.M., Hennecke, H. and O. Geiger. 2001. Phosphatidylcholine levels in Bradyrhizobium japonicum membranes are critical for an efficient symbiosis with the soybean host plant. Mol Microbiol. 39: 1186-1198.


- 133 -

Mulgrew-Nessbitt, A., Diraviyam, K., Wang, J., Singh, S., Murray, P., Li, Z., Rogers, L., Mirkovic, N. and D. Murray. 2006. The role of electrostatics in protein-membrane interactions. Biochim Biophys Acta. 1761: 812-826.

Nelson, D. and M. Cox. 2009. Lehninger Principles of Biochemistry (4th Ed). Springer-Verlag, Berlin Heidelberg.

Neumann, P., Weidner, A., Pech, A., Stubbs, M.T. and K. Tittmann. 2008. Structural basis for membrane binding and catalytic activation of the peripheral membrane enzyme pyruvate oxidase from Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA. 105: 17390-17395.

O`Toole, P.J., Morrison, I.E. and R.J. Cherry. 2000. Investigations of spectrin-lipid interactions using fluoresceinphosphatidylethanolamine as a membrane probe. Biochim Biophys Acta. 1466: 39-46.

O`Gara, M., Zhang, X., Roberts, R.J. and X. Cheng. 1999. Structure of a binary complex of HhaI methyltransferase with S-Adenosylmethionine formed in the presence of a short nonspecific DNA oligonucleotide. J Mol Biol. 287: 201-209.

Pattanayek, R., Newcomer, M.E. and C. Wagner. 1998. Crystal structure of apo-glycine N-methyltransferase (GNMT). Protein Sci. 7: 1326-1331.

Perez-Iratxeta, C. and M.A. Andrade-Navarro. 2008. K2D2: estimation of protein secondary structure from circular dichroism spectra. BMC Struct Biol. 8: 25.

Reinisch, K.M., Chen, L., Verdine, G.L. and W.N. Lipscomb. 1995. The crystal structure of HaeIII methyltransferase convalently complexed to DNA: an extrahelical cytosine and rearranged base pairing. Cell. 82: 143-153.

Ren, J., Lew, S., Wang, Z. and E. London. 1997. Transmembrane orientation of hydrophobic alpha-helices is regulated both by the relationship of helix length to bilayer thickness and by the cholesterol concentration. Biochemistry.

36: 10213-10220.

Reynolds, J.M., Takebe, S., Choi, J.Y., El Bissati, K., Witola, W.H., Bobenchik, A.M., Hoch, J.C., Voelker, D.R. and C.B. Mamoun. 2008. Biochemical and genetic analysis of the phosphoethanolamine methyltransferase of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. J Biol Chem. 283: 7894-7900.

Ridgway, N.D. and D.E. Vance. 1987. Purification of phosphatidylethanolamine N-methyltransferasefrom rat liver. J Biol Chem. 262: 17231-17239.

Ridgway N.D., Yao, Z. and D.E. Vance. 1989. Phosphatidylethanolamine levels and regulation of phosphatidylethanolamine N-methyltransferase. J Biol Chem. 264: 1203-1207.

Ridgway, N.D. and D.E. Vance. 1992. Phosphatidylethanolamine N-methyl-transferase fromrat liver. Methods Enzymol. 209: 366-374.

Rosing, J., van Rijn, J.L., Bevers, E.M., van Dieijen, G., Comfurius, P. and R.F. Zwaal. 1985. The role of activated human platelets in prothrombin and factor X activation. Blood. 65: 319-332.


- 134 -

Rost, B. and C. Sander. 1993. Prediction of protein secondary structure at better than 70% accuracy. J Mol Biol. 232:584-599.

Salamon, Z., Lindblom, G., Rilfors, L., Linde, K. and G. Tollin. 2000. Interaction of phosphatidylserine synthase from E. coli with lipid bilayers: coupled plasmon-waveguide resonance spectroscopy studies. Biophys J. 78: 1400-1412.

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Plainview, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Sambrook, J. and D.W. Russell. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Sankpal, U.T. and D.N. Rao. 2002. Mutational analysis of conserved residues in HhaI DNA methyltransferase. Nucleic Acids Res. 30: 2628-2638.

Savic, M., Ilic-Tomic, T., Macmaster, R., Vasilijevic, B. and G.L. Coon. 2008. Critical residues for cofactor binding and catalytic activity in the aminoglycoside resistance methyltransferase Sgm. J Bacteriol. 190: 5855-5861.

Schneider, W.J. and D.E. Vance. 1979. Conversion of phosphatidylethanolamine to phosphatidylcholine in rat liver. Partial purification and characterization of the enzymatic activities. J Biol Chem. 254: 3886-3891.

Schubert H.L., Blumenthal R.M. and X. Cheng. 2003. Many paths to methyltransfer: a chronicle of convergence. Trends Biochem Sci. 28: 329-335.

Sekimizu, K. and A. Kornberg. 1988. Cardiolipin activation of dnaA protein, the initiation protein of replication in Escherichia coli. J Biol Chem. 263: 7131-7135.

Sheard, N.F., Tayek, J.A., Bistrian, B.R., Blackburn, G.L. and S.H. Zeisel. 1986. Plasma choline concentration in humans fed parenterally. Am J Clin Nutr. 43: 219-224.

Sherr, S.I. and J.H. Law. 1965. Phosphatidylcholine synthesis in Agrobacterium tumefaciens. II. Uptake and utilization of choline. J Biol Chem. 240: 3760-3765.

Shields, D.J., Altarejos, J.Y., Wang, X., Agellon, L.B. and D.E. Vance. 2003. Molecular dissection of the S-Adenosylmethionine-binding site of phosphatidylethanolamine N-methyltransferase. J Biol Chem. 278: 35826-35836.

Shih, Y.L., Huang, K.F., Lai, H.M., Liao, J.H., Lee, C.S., Chang, C.M., Mak, H.M., Hsieh, C.W. and C.C. Lin. 2011. The N-terminal amphipathic helix of the topological specificity factor MinE is associated with shaping membrane curvature. PLoS One. 6: e21425.

Smith, L., Greenfield, N.J. and S.E. Hitchcock-DeGregori. 1994. The effects of deletion of the amino-terminal helix on troponin C function and stability. J Biol Chem. 269: 9857-9863.


- 135 -

Snitko, Y., Koduri, R.S., Han, S.K., Othman, R., Baker, S.F., Molini, B.J., Wilton, D.C., Gelb, M.H. and W. Cho. 1997. Mapping the interfacial binding surface of human secretory group IIa phospholipase A2. Biochemistry. 36: 14325-14333.

Sohlenkamp, C., de Rudder, K.E., Rohrs, V., López-Lara, I.M. and O. Geiger. 2000. Cloning and characterization of the gene for phosphatidylcholine synthase. J Biol Chem. 275: 18919-18925.

Sohlenkamp, C., López-Lara, I.M. and O. Geiger. 2003. Biosynthesis of phosphatidylcholine in bacteria. Prog lipid Res. 42: 115-162.

Solís-Oviedo, R.L., Martínez-Morales, F., Geiger, O. and C. Sohlenkamp. 2012. Functional and topological analysis of phosphatidylcholine synthase from Sinorhizobium meliloti. Biochim Biophys Acta. 1821: 573-581.

Sreerama, N. and R.W. Woody. 2000. Estimation of protein secondary structure from CD spectra: Comparison of CONTIN, SELCON and CDSSTR methods with an expanded reference set. Anal Biochem. 287: 252-260.

Studier, F.W. and B.A. Moffatt. 1986. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189: 113-130.

Szeto, T.H., Rowland, S.L., Rothfield, L.I. and G.F. King. 2002. Membrane localization of MinD is mediated by a C-terminal motif that is conserved across eubacteria, archaea and chloroplasts. Proc Natl Acad Sci USA. 99: 15693-15698.

Tahara, Y., Ogawa, Y., Sakakibara, T. and Y. Yamada. 1986. Phosphatidyl-ethanolamine N-methyltransferase from Zymomonas mobilis - purification and characterization. Agric Biol Chem. 50: 257-259.

Tahara, Y., Ogawa, Y., Sakakibara, T., and Y. Yamada. 1987a. Purification and characterizationof phosphatidylethanolamine N-methyltransferase from Zymomonas mobilis. Agric Biol Chem. 51: 1425-1430.

Tahara, Y., Yamashita, T., Sogabe, A., Ogawa, Y. and Y. Yamada. 1987b. Zymomonas mobilis mutant defective in phosphatidylethanolamine N-methyltransferase. Agric Biol Chem. 51: 3179-3181.

Tahara Y., Yamashita T., Sogabe A. and Y. Ogawa. 1994. Isolation and characterization of Zymomonas mobilis mutant defective in phosphatidylethanolamine N-methyltransferase. J Gen Appl Microbiol. 40: 389-396.

Tait, J.F. and D. Gibson. 1994. Measurement of membrane phospholipid asymmetry in normal and sickle-cell erythrocytes by means of annexin V binding. J Lab Clin Med. 123: 741-748.

Takata, Y., Huang, Y., Komoto, J., Yamada, T., Konishi, K., Ogawa, H., Gomi, T., Fujioka, M., and F. Takusagawa. 2003. Catalytic mechanism of glycine N- methyltransferase. Biochemistry. 42: 8394–8402


- 136 -

Taneva, S., Dennis, M.K., Ding, Z., Smith, J.L. and R.B. Cornell. 2008. Contribution of each membrane binding domain of the CTP:phosphocholine cytidylyltransferase-alpha dimer to its activation, membrane binding, and membrane cross-bridging. J Biol Chem. 283: 28137-28148.

Thomas, G.H., Southworth, T., León-Kempis, M.R., Leech, A. and D.J. Kelly. 2006. Novel ligands for the extracellular solute receptors of two bacterial TRAP transporters. Microbiology. 152: 187-198.

Vallée, B.S., Tauc, P., Brochon, J.C., Maget-Dana, R., Lelièvre, D., Metz-Boutique, M.H., Bureaud, N. and F. Schoentgen. 2001. Behaviour of bovine phosphatidylethanolamine-binding protein with model membranes. Evidence of affinity for negatively charged membranes. Eur J Biochem. 268: 5831-5841.

van Meer, G., Voelker, D.R. and G.W. Feigenson. 2008. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat Rev Mol Cell Biol. 9: 112-124.

Vance, D.E. and W.J. Schneider. 1981. Conversion of phosphatidylethanolamine to phosphatidylcholine. Methods Enzymol. 71: 581-588.

Vance D.E. and N.D. Ridgway. 1988. The methylation of phosphatidylethanol-amine. Prog Lipid Res. 27: 61-79.

Vance, D.E., Walkey, C.J. and Z. Cui. 1997. Phosphatidylethanolamine N-methyltransferase from liver. Biochim Biophys Acta. 1348: 142-150.

Vance, D.E. 2002. Phospholipid biosynthesis in eukaryotes. In: Vance D. E. & Vance J. E. (ed.): Biochemistry of lipids, lipoproteins and membranes (4th Edn.). Elsevier B V, Amsterdam, The Netherlands: 205-232.

Vance, D.E., Li, Z. and R.L. Jacobs. 2007. Hepatic phosphatidylethanolamine N-methyltransferase, unexpected roles in animal biochemistry and physiology. J Biol Chem. 282: 33237-33241.

Vidgren, J., Svensson, L.A. and A. Liljas. 1994. Crystal structure of catechol O-methyltransferase. Nature. 368: 354-358.

Walkey, C.J., Yu, L., Agellon, L.B. and D.E. Vance. 1998. Biochemical and evolutionary significance of phospholipid methylation. J Biol Chem. 273: 27043-27046.

Wall, J., Golding, C.A., Van Veen, M. and P. O´Shea. 1995. The use of fluoresceinphosphatidylethanolamine (FPE) as a real-time probe for peptide-membrane interactions. Mol Membr Biol. 12: 183-192.

Weiss, S.B., Smith, S.W. and E.P. Kennedy. 1958. The enzymatic formation of lecithin from cytidine diphosphate choline and D-1,2-diglyceride. J Biol Chem. 231: 53-64.

Wells, R.C. and R.B. Hill. 2011. The cytosolic domain of Fis1 binds and reversibly clusters lipid vesicles. PLoS One. 6: e21384.


- 137 -

Wessel, M., Klüsener, S., Gödeke, J., Fritz, C., Hacker, S. and F. Narberhaus. 2006. Virulence of Agrobacterium tumefaciens requires phosphatidylcholine in the bacterial membrane. Mol Microbiol. 62: 906-915.

Wilderman, P.J., Vasil, A.I., Martin, W.E., Murphy, R.C. and M.L. Vasil. 2002. Pseudomonas aeruginosa synthesizes phosphatidylcholine by use of the phosphatidylcholinesynthase pathway. J Bacteriol. 184: 4792-4799.

Willis, C., Wang, C.K., Osman, A., Simon, A., Pickering, D., Mulvenna, J., Riboldi-Tunicliffe, A., Jones, M.K., Loukas, A and A. Hofmann. 2011. Insights into the membrane interactions of the saposin-like proteins Na-SLP-1 and Ac-SLP-1 from human and dog hookworm. PLoS One. 6: e25369.

Witola, W.H., El Bissati, K., Pessi, G., Xie, C., Roepe, P.D. and C.B. Mamoun. 2008. Disruption of the Plasmodium falciparum PfPMT gene results in a complete loss of phosphatidylcholine biosynthesis via the serine-decarboxylase-phosphoethanolamine-methyltransferase pathway and severe growth and survival defects. J Biol Chem. 283: 27636-27643.

Woodcock, D.M., Crother, P.J., Doherty, J., Jefferson, S., DeCruz, E., Noyer-Weidner, M., Smith, S.S., Michael, M.Z. and M.W. Graham. 1989. Quantitative evaluation of Escherichia coli host strains for tolerance to cytosine methylation in plasmid and phage recombinants. Nucleic Acids Res. 17: 3469-3478.

Wu, Q., Gee, C. L., Lin, F., Tyndall, J.D., Martin, J.L., Grunewald, G.L., and M.J. McLeish. 2005. Structural, mutagenic, and kinetic analysis of the binding of substrates and inhibitors of human phenylethanolamine N-methyltransferase. J Med Chem. 48: 7243–7252

Yamashita, S. and K. Hosaka. 1997. Choline kinase from yeast. Biochim Biophys Acta. 1348: 63-69.

Zeisel, S.H. and J.K. Blusztajn. 1994. Choline and human nutrition. Annu Rev Nutr. 14: 269-296.

Zhang, X., Zhou, L. and X. Cheng. 2000. Crystal structure of the conserved core of protein arginine methyltransferase PRMT3. Embo J. 19: 3509-3519.

Zhang, Y. 2008. I-TASSER server for protein 3D structure prediction. BMC Bioionformatics. 9: 40.

Anhang

- 138 -

8. Anhang

8.1 Vorveröffentlichungen der Dissertation

Teilergebnisse aus dieser Arbeit wurden mit Genehmigung des Fachbereiches für

Biologie der Mikroorganismen, vertreten durch den Mentor dieser Arbeit, in folgenden

Beiträgen vorab veröffentlicht:

Publikationen

Aktas, M., Wessel, M., Hacker, S., Klüsener, S., Gleichenhagen, J. and F. Narberhaus. 2010. Phosphatidylcholine biosynthesis and its significance in bacteria interacting with eukaryotic cells. Eur J Cell Biol. 89: 888-894

10 % Anfertigung des Manuskriptes.

Aktas, M., Gleichenhagen, J., Stoll, R., and F. Narberhaus. 2011. S-Adenosylmethionine-binding properties of a bacterial phospholipid N-methyltransferase. J Bacteriol. 193: 3473-3481.

50 % Planung und Durchführung der Experimente, sowie

20 % Anfertigung des Manuskriptes.

Tagungsbeiträge

Gleichenhagen, J., Aktas, M., Hacker, S., Wessel, M. and F. Narberhaus. 2010. Poster: Pathogenic and symbiotic plant-microbe interaction require bacterial phosphatidylcholine. VAAM-Jahrestagung, Hannover, Book of Abstracts: 147

Gleichenhagen, J., Aktas, M., Köster, S., Stoll, R. and F. Narberhaus. 2011. Poster: Exploring Agrobacterium tumefaciens phosphatidylcholine biosynthesis enzymes. Annual Symposium - Recent advances in membrane biochemistry, Cambridge (UK), Book of Abstracts: 42

Gleichenhagen, J., Wessel, M., Aktas, M., Klüsener, S., Hacker, S., Fritz, C. and F. Narberhaus. 2011. Talk: A typical eukaryotic lipid in prokaryotic membranes: Synthesis and necessity of phosphatidylcholine in Agrobacterium tumefaciens. VAAM-Jahrestagung, Karlsruhe, Book of Abstracts: 178

Anhang

- 139 -

8.2 Lebenslauf

Name: Jan Gleichenhagen

Anschrift: Goebenstraße 32, 44866, Bochum

Geburtsdatum: 18.09.1982

Geburtsort: Essen

Familienstand: ledig

Staatsangehörigkeit: Deutsch

Schulbildung

1989 – 1993 Tuttmannschule in Essen-Stoppenberg

1993 – 2002 Gymnasium Essen Nord Ost

06/2002 Abitur

Wehrdienst

10/2002 – 12/2002 Marineoperationsschule Bremerhaven

01/2003 – 06/2003 Marinefernmeldegruppe 21 (Führungsunterstützungszentrum B)

Studium

10/2003 Beginn Biologiestudium an der Ruhr-Universität Bochum

09/2005 Vordiplom Biologie

10/2005 – 05/2007 Hauptstudium Biologie an der Ruhr-Universität Bochum

07/2007 – 05/2008 Diplomarbeit am Lehrstuhl Biologie der Mikroorganismen an der

Ruhr-Universität Bochum

Promotion

Seit 07/2008 Anfertigung der Doktorarbeit

Lehrstuhl Biologie der Mikroorganismen


Berufstätigkeit

11/2007-03/2008 Studentische Hilfskraft



Seit 07/2008 Wissenschaftlicher Mitarbeiter



Anhang

- 140 -

8.3 Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbständig verfasst und bei keiner anderen

Fakultät eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel

verwendet habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um

sechs in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare.

Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten

und in keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.

Bochum, den

___________________________

(Jan Gleichenhagen)

Documents

Bakterielle Phospholipid N-Methyltransferasen ... · benim hep yanimdaydin bunun icin sana tesekkür etmek istiyorum! Herrn Dr. Bernd Masepohl für seine stete Hilfsbereitschaft und