Wintersemester 2008/2009

Vorlesung zum Mastermodul

Bakterien-Pflanze Interaktionen

Frederik Börnke – Lehrstuhl für Biochemie, AG Molekulare Netzwerke

Email: fboernke@biologie.uni-erlangen.de

Bakterielle Typ-III Effektorproteine

Wege der Interaktion zwischen Wirt und Pathogen

Kompatibel Inkompatibel

Virulentes Pathogen

Suszeptibler Wirt

Krankheit

Avirulentes Pathogen

Resistenter Wirt

Resistenz

(nicht-Wirt oder

rassenspezifisch)

flg22

MAPKKK

MAPKK

MAPK

ER

Nucleus

FLS2

PR

PAMP – vermittelte Immunität (PTI)

modified after Speth, E.B. et al., Current Opinion in Plant Biology, 10, 2007, 580-586

Secretory pathway

PR-proteins

Zellwandverstärkung

PAMP – vermittelte Immunität (PTI)

•!PTI umfasst d ie Gesamthei t der durch PAMPs ausgelösten

Abwehrreaktionen.

•!PAMPs stimulieren eine sehr schnelle aber nur vorübergehende

Abwehrantwort, die sich auf verschiedenen Ebenen abspielt, z.B. präinvasiv

(schließen der Stomata) und post-invasiv (Oxidative-Burst H2O2; Sekretion

antimikrobieller Proteine, Zellwandverstärkung durch Kallose Einlagerung)

•!PTI ist Teil der Nicht-Wirts-Resistenz und reicht in den meisten Fällen aus

potentielle Pathogene abzuwehren. Sie geht i.d.R. nicht einher mit der

Entwicklung von makroskopisch sichtbaren Symptomen

flg22

MAPKKK

MAPKK

MAPK

ER

Nucleus

FLS2

Secretory pathway

PR

PR-proteins

TTSS

Bakterielle Effektorproteine supprimieren die Abwehr der Pflanzenzelle

modified after Speth, E.B. et al., Current Opinion in Plant Biology, 10, 2007, 580-586

Die Injektion von Effektorproteinen in die Wirtszelle

erfolgt über ein Typ-III Sekretionsystem (T3SS)

•! S e k r e t i o n s a p p a r a t , d e r Effek torpro te ine d i rek t in d ie Wirtszelle injiziert

•! Kommt in einer Vielzahl gram-negativer pathogener Bakterien vor

•!Komponenten in Phytopathogenen von sog. hrp-Genen (hypersensitive response and pathogenicity) codiert

•!Aus ca. 20 Proteinen aufgebaut, neun Komponenten des T3SS sind sehr stark konserviert zwischen den Organismen

•!Evolutionär wahrscheinlich aus den Flagellen hervorgegangen

•!Die translozierten Effektoren besitzen eine Vielzahl von z.T. unbekannten aber auch überlappenden Funktion in der Virulenz (Virulenzfaktoren)

Identifizierung von Typ III Effektoren pflanzlicher

Pathogene war sehr schwierig

Ursachen:

•! Expression des T3SS erfolgt erst nach Kontakt mit der Wirtspflanze

•! Effektoren werden nicht ins Medium abgegeben

•! kein einheitliches Sekretionssignal bekannt

•! viele Effektoren haben redundante Funktionen und tragen daher

einzeln nur wenig zur Virulenz bei

•! haben keine oder geringe Ähnlichkeit zu bekannten Proteinen

Unterdrückung der Abwehrreaktionen Nutzung von Nährstoffen Bakterielles Wachstum Ausprägung der Krankheit

HR and Abwehr Kein bakterielles Wachstum

Bacterium

hrp F

Plant cell

Hrp genes

R

Type III secretion system

avr

Effector proteins

Kompatibilität Inkompatibilität

Typ III Effektoren können verschiedenen zelluläre

Antworten hervorrufen

Erste Ansätze zur Identifizierung von Typ III Effektoren

beruhten auf ihrer Avirulenz-Funktion

Gen- für - Gen

Hypothese

“Effector-triggered Immunity” ETI

•!ETI wird nach der Ekennung von

Elicitioren (Avirulenzfaktoren) durch

R-Proteine ausgelöst

•!Dabei wird zum einen die PTI

extrem verstärkt und verlängert und

zusätzlich eine hypersensitive

Reaktion (HR; Zelltod) ausgelöst

(makroskopisch sichtbar)

•!ETI führt zu einer inkompatiblen

Interaktion und wird auch als

rassen-spezi f ische Resis tenz

bezeichnet.

Erste Ansätze zur Identifizierung von Typ III Effektoren

Collmer et al. (2002), Trends Microbiol. (10)

Erster Typ III Effektor war ein Avr-Gen

Staskawicz et al. (1984), PNAS (81)

Erster Typ III Effektor war ein Avr-Gen

Staskawicz et al. (1984), PNAS (81)

•! Identifizierung eines Klons (pPg6L3), der Inkompatibilität von Psg5 in cv. Harosoy und Peking verursacht •! Restriktionskartierung von pPg6L3 •!Tn5-Mutagenese und anschließender RE-Verdau führte zur Identifizierung des verantwortlichen Locus •! 1.4 kb Fragment kodiert für ein Avr-Gen

Buell et al. 2003, PNAS 100 (18)

Entschlüsselung des Genome von

Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000

•! Pathogen von A. thaliana

•! Modellsystem zum Studium der Pflanze-Bakterium-Interaktion

•! vollständige genomische Sequenz

•! 6.5 MBP: zirkuläres Chromosome

+ 2 Plasmide

•! kodieren für 5763 ORFs

•! 3520 (61%) mit Funktionszuweisung

•! ca. 300 involviert in Virulenz

Gleiche Regulation

-! Expression in planta

-! Zugehörigkeit zum Hrp-Regulon

Sekretion/

Translokationsfähigkeit

-! gleiche Sequenzmerkmale

Weitere Ansätze basierten auf einer Kombination von bioinformatischer Analyse

und experimentellen Daten

Verfügbarkeit von Sequenzinformationen hat die

Identifizierung von Typ III Effektoren sehr erleichtert

Identifizierung von 13 Typ III Effektoren über die HR-

auslösende Interaktion von avrRpt2 und RPS2

Guttman and Vinatzer et al. (2002), Science (295)

•! Interaktion zwischen P. syringae AvrRpt2 und

A. thaliana RPS2 (R-Protein) induziert HR

•! AvrRpt2- C-Terminus ist für Auslösung der HR

verantwortlich

•! N-Terminus kann durch den anderer Effektoren

ersetzt werden (z.B. avrRpm1)

•! Eigenschaft wurde ausgenutzt und ein N-

terminal verkürztes AvrRpt2 (81-255) als Reporter

benutzt um Typ III sekretierte Proteine zu finden

Identifizierung von 13 Typ III Effektoren über die HR-

auslösende Interaktion von avrRpt2 und RPS2

Guttman and Vinatzer et al. (2002), Science (295)

•! Konstruktion eines Transposons, enthält verkürztes AvrRpt2 und Km-Resistenzgen •! Insertion des Transposons in P. syringae

•! translationale Fusion mit hop Genen (unbekannte Effektoren) löst HR nach

Infektion in A. thaliana aus •! ca. 10.000 Pflanzen mit Pools von 8 Km-resistenten Isolaten infiziert

•! 25 Pflanzen zeigten HR •! Isolation einzelner HR-induzierender Stämme •! Identifizierung von 13 Effektoren •! Überprüfung: Auslösen der HR ist RPS- und T3SS - abhängig

Vergleichende Sequenzanalyse führte zur Identifizierung

neuer Typ III sekretierter Proteine

Guttman and Vinatzer et al. (2002), Science (295)

•! Analyse der identifizierten hop‘s und bekannter Typ III sekretierter Proteine

offenbarte einen hohen Ser-Gehalt innerhalb der ersten 50 AA (N-terminal),

sowie einen niedrigen Gehalt von Asp, Leu, Lys

•! Durchmustern des P.s. Genoms nach diesem Merkmal und dem

konservierten hrp-Box Motiv

38 sekretierte Proteine (15 unbekannte)

Erste Ansätze zur Identifizierung von Typ III Effektoren

beruhten auf ihrer Avirulenz-Funktion

Gen- für - Gen

Hypothese

R- Proteine können in 2 Klassen eingeteilt werden

Chisholm et al (2006), Cell 124

Einteilung basiert auf Organisation verschiedener Domänen

NB-LRR (nucleotide binding and Leucin rich repeats), größte Gruppe - CC (coiled-coil) - TIR (Toll interleukin receptor) - RRS1-R (novel class)

eLRR (extracellular LRR) - RLP (receptor-like) - RLK (receptor like kinase) - PGIP (Polygalacturonase inhibiting

protein)

AvrPto und AvrPtoB

interagieren in Tomate mit

dem Pto Resistenzgen

Jones & Dangl (2006), Nature 44 (16)

Es gibt nur wenige Beispiele für eine direkte Interaktion

zwischen Avr- und R-Proteinen

„Guard Hypothesis“

1- Effector is recognized by receptor protein leading to defence 2 - Modified target is recognized by receptor protein leading to defence

McDowell & Woffenden (2003) TRENDS in Biotechnol. 21, 178.

1

2

Chisholm et al (2006), Cell 124

Effektor-vermittelte Modifikationen von RIN 4 werden von 2 verschiedenen R-Proteinen erkannt

-RPM1 (NB-LRR) erkennt hyper- phopshoryliertes RIN4 - Mechanismus wird durch AvrRpm1 und AvrB ausgelöst

- RPS2 (NB-LRR) erkennt gespaltenes RIN4

- Proteolytische Spaltung von RIN4 wird durch AvrRpt2 vermittelt

Wenn Effektoren Avirulenzfunktion haben, warum gibt es sie dann?

Sie müssen dem Bakterium einen Selektionsvorteil

vermitteln um evolutionär stabil zu sein. Besitzen sie

also im Normalfall Virulenzfunktion?

AvrRpm1 und AvrRpt2 unterdrücken die basale Abwehr

Kim et al. 2005, Cell 121(3)

•! Infektion von Wildtyp-Pflanzen und transgenen Pflanzen die entweder AvrRpt2 oder AvrRpm1 induzierbar exprimieren mit Pst DC 3000 TTSS- Mutante

AvrRpt2 und AvrRpm1 verbessern das

bakterielle Wachstum einer TTSS-defizienten Pst DC3000 Mutante

AvrRpm1 und AvrRpt2 unterdrücken die basale Abwehr

Kim et al. 2005, Cell 121(3)

AvrRpt2 und AvrRpm1 inhibieren Callose-Ablagerungen

AvrPto interagiert in Tomate

mit dem Pto Resistenzgen

Jones & Dangl (2006), Nature 44 (16)

Es gibt nur wenige Beispiele für eine direkte Interaktion

zwischen Avr- und R-Proteinen

Ko-Kristallisation von AvrPto und Pto deutet darauf hin, dass AvrPto ein Kinaseinhibitor ist. (Xing et al., (2007) Nature 449: 243)

Die Bindungsstelle von AvrPto an Pto ist in anderen Kinasen konserviert

•!FLS2 und EFR sind „pattern-recognition“ Rezeptoren,

die für die Wahrnehmung von PAMPs verantwortlich

sind (Flagellin bzw. EfTu)

•!Biochemische Experimente konnten eine Interaktion

von AvrPto mit FLS2 bzw. EFR in vitro und in vivo

zeigen

flg22

MAPKKK

MAPKK

MAPK

ER

Nucleus

FLS2

PR

AvrPto inhibiert die Signalweiterleitung von PRRs

und verhindert damit basale Abwehr

modified after Speth, E.B. et al., Current Opinion in Plant Biology, 10, 2007, 580-586

Secretory pathway

PR-proteins

Zellwandverstärkung

AvrPto

Der Pst DC3000 Effektor HopAI-1 inhibiert MAPK Signaltransduktion

-!MPK3 und MPK6 werden zur

Signalweiterleitung an

spezifischen Threonin-Resten

phosphoryliert

-!HopAI-1 besitzt

Phosphothreonin-Lyase Aktivität

-!HopAI-1 interagiert spezifisch

mit MPK3 und MPK6

-!HopAI-1 vermittelte

dephosphorylierung verhindert

die Signalweiterleitung von MPK3

und MPK6

Der Pst DC3000 Effektor HopU1 destabilisiert mRNAs

flg22

MAPKKK

MAPKK

MAPK

Nucleus

FLS2

PR

TTSS

modified after Speth, E.B. et al., Current Opinion in Plant Biology, 10, 2007, 580-586

AAAAAAA

Induktion von Abwehrgenen

RBP

Kallose, HR, etc.

RBP = RNA-binde Protein

Der Pst DC3000 Effektor HopU1 destabilisiert mRNAs durch

Ribosylierung von RNA-binde Proteinen

flg22

MAPKKK

MAPKK

MAPK

Nucleus

FLS2

PR

TTSS

modified after Speth, E.B. et al., Current Opinion in Plant Biology, 10, 2007, 580-586

AAAAAAA

RBP

RBP = RNA-binde Protein

RBP HopU1

ADP-

mRNA Abbau

Der Xcv Effektor AvrBs3 wird in den pflanzlichen Zellkern transportiert

Der Xcv Effektor AvrBs3 fungiert als Transkriptionsfaktor und induziert

einen „Cell-Size“ Regulator

+ AvrBs3 + AvrBs3 - AvrBs3

upa20

AvrBs3

upa 20 promotor

•!AvrBs3 induziert die Expression des Transkriptionsfaktors upa20 durch Bindung an dessen Promotor

•!Upa20 aktiviert Gene die zur Hypertrophie führen, die vergrößerte Zelloberfläche ist offensichtlich von Vorteil für das Bakterium

Der Pst DC3000 Effektor HopM1 inhibiert die Proteinsekretion

TGN

PM

HopM1 Zytosol

Apoplast

PR-Proteine

•!HopM1 interagiert mit dem ARF-GEF Protein AtMIN7 und vermittelt dessen Abbau über das Proteasom

•!AtMIN7 ist notwendig für die Abschnürung sekretorischer Vesikel vom Golgi-Apparat

•!HopM1 verhindert die Sekretion von Abwehrmolekülen

Jones & Dangl (2006) Nature 444; Chisholm et al (2006), Cell 124

Time

Evolutionäres „Wettrüsten“ zwischen Pathogen und Wirt