25
FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 1/25 Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion Ralf G. Berger Institut für Lebensmittelchemie Gottfried Wilhelm Leibniz Universität Callinstrasse 5 D-30167 Hannover www.lci.uni-hannover.de

Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

  • Upload
    domien

  • View
    222

  • Download
    5

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 1/25

BasidiomycetenBiokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion

Ralf G. Berger

Institut für LebensmittelchemieGottfried Wilhelm Leibniz Universität

Callinstrasse 5D-30167 Hannover

www.lci.uni-hannover.de

Page 2: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 2/25

complex biochemistryeasy bioprocessingedible species, GRASBasidiomycetes

CultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

Page 3: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 3/25

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

Page 4: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 4/25

Perilla frutescensPerilla citriodorata

Kondo and Yamaguchi 1919

Perillene: 3-(4-methylpent-3-enyl)furane

woody, flowery, citrus; character impact of rose oil; defense pheromone of Acaridae and Apocritae

O

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

Page 5: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 5/25

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

the biocatalyst

O

Pleurotus ostreatus

AIF 299 ZN LCI/JLG

and itssubstrate

Page 6: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 6/25

O

+ CH2OOO O

O

Dehydromelonal and perillene via dioxygenase catalysis

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

OOH O

HO

OOH

O

OH

OO

OO

OHH

D3

D3 D3

D3

D3 D3

D3

Page 7: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 7/25

MS- and 1H-spectra of epoxy- and hydoxy-perillene

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

Page 8: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 8/25

Orientation of hydrophobin interacting with air-water interface

Kwan AH et al. (2008) J. Mol. Biol. 382: 708-720

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

Page 9: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 9/25

Stabilisation of dispersions

n-Hexane/Hydrophobin

n-Hexane /RNase A

n-Hexane/ H2O

Reduction of surface tension

Stabilisation of an

emulsion

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

Page 10: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 10/25

CH3O

OH

CHCH

CH2OH

OO

OHOCH3

CCHCH2OH

OO

OCH3

CHOH

CH O

CH2OH

CH3O

O

HOH2COCH3

CHCH

CH2OH

O

O

CH

CH

CH2OH

H3CO OCH3

CHOHCH

CH2OH

O

OCH3

OCH3

OCH3

CHOHCH

CH2OH

O

white rot

brown rot

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

Page 11: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 11/25

Armillaria mellea Fomitopsis pinicolaGloeophyllum odoratumHericium erinaceusKuehneromyces mutabilisLaetiporus sulphureusLentinellus cochleatus Marasmius scorodonius Polyporus umbellatus Trametes versicolorWolfiporia cocos etc .........

KH Engel 2009

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

Page 12: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 12/25

O

OH

OH

OAcyl

O

OAcyl+ 2 HOH- 2 AcylOH

Capsanthin

Hydrolysis of xanthophyll esters: Is the enzymatic alternative viable?

LCI-LUH plus LCI-UHohenheim

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

Page 13: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 13/25

Hydrolysis of esters of (Z)/(E)-capsanthin, zeaxanthin, and β-cryptoxanthin by KOH vs. culture supernatant of

Pleurotus sapidus

6

6

6

6

0 10 20 30 40 50 60

0

1x10

2x10

3x10

4x10

native

t [min]

KOHenzymatic hydrolysisC

OOH

λ = 450 nm

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

Page 14: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 14/25

(A) SEC elution profile of total protein and esterolytic activity(B) SDS-PAGE of protein samples purified by ultrafiltration, IEX, and SEC(C) PCR screening with degenerated reverse-translated primers

(A) (B)

(C)

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

Page 15: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 15/25

Plasmid for the heterologous expression of Lip2 variants

72

230

95

28

36

56

130

17

[kDa]

SDS-PAGE anti-His blot

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

Page 16: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 16/25

HPLC-DAD: Hydrolysis of xanthophyll esters of C. annum:inactivated wild-type Lip2 (A),wild-type Lip2 (B), refolded s-Lip2-His (C) and refolded Lip2-His (D)

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

Page 17: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 17/25

ESI-MS/MSCharacterisationand cloning

cloningligationtransformation

SDS-PAGE HPLC, GC, MSinductionExpression, proof of function

Enzyme detection and isolation

FPLC SDS-PAGEScreeningvol [ml]

50 100 150 200 250 300

rel.

Akt

ivitä

t [%

]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

abs

[280

nm

]

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

Fraktion

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95

c N

aCl [

mol

/l]

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

1,1

rel. Aktiv itätAbs. [280] c NaCl [mol/l]

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

Page 18: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 18/25

Cross-linking glutelins and

arabinoxylanes

AIF 15305LCI/HDBI

Redox enzymesDiOX, vPOX, LOX, LnP, MnP, tyrosinases, laccases ......

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

Page 19: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 19/25

Separation of ferulic acid di- and trimers (Bunzel et al. 2003)Eurosphere 100-C18-5-HD, 0.05 % aqueous formic acid/MeOH, LC-MS (ESI)

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

Page 20: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 20/25

Polysaccharide solution after addition of laccase

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

Page 21: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 21/25

Enzyme purification options

centrifugation

HIC

ultrafiltration

ultrafiltration

IEX

SEC

ultrafiltration

pellet culture

purified enzyme

isoelectricfoam

fractionation

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

Page 22: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 22/25

Isoelectric foam fractionation

receiver and foam breaker

porous fritnitrogen enzyme solution

flow meter

column

foamate

glass bowl

patent blue

Ama-ranth

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

Page 23: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 23/25

2%

3%95%

Activity in foam [%]

residual activity in bioreactor medium [%]

activity lost during foaming [%]

Foaming of a lipase of Psa AIF 121 ZNLCI/CTA

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

Foaming

Page 24: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25

BasidiomycetesCultivationBioreactors

MetabolitesPerilleneHydrophobines

EnzymesEsteraseLaccase

FoamingYadav et al.: Purification and characterization of a regiospecific lipase from Aspergillus terreus. Biotechnol. Appl. Biochem. 1998, 28, 243-49

(NH4)2SO4 precipitationacetone precipitation (25%, 35%)SEC, IEX

R = 18%; P = 11,9

centrifugation

HIC

ultrafiltration

ultrafiltration

IEX

SEC

ultrafiltration

pellet culture

purified enzyme

one step, 50 min

R = 95%; P = 11,6

foam fractionation

Linke et al.: Separation of extra-cellular esterases from pellet cultures of Pleurotus sapidus JAOCS 2009, 86, 437–444

Page 25: Basidiomyceten Biokatalysatoren für eine … 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 24/25 Basidiomycetes Cultivation Bioreactors

FEI 09.09.2009 Basidiomyceten - Biokatalysatoren für eine nachhaltigere Lebensmittelproduktion 25/25