256 G. Lehmann et al.: Beitr~ige zur Analy$il yon Farbsteffen. I I

3. Sunshine, J., Fi le , W. W., Landesmann, H. : J. Forensic Sci. II (3), 428 (1966). 4. Giallo, U. : Boll chim..farm. 89, 499 (1950); zit. bei 1VI. W. Lindner: Warenkunde und Unter-

suchung yon Kaffee, Kaffee-Ersatz und Zusatzsteffen. Berlin: A. W. Hayn's Erben 1955. 5. GKnshirt, H. (unverSffentlicht) : zit. in E. Stahl: Diinnschichtehromatographie. S. 338. Berlin-

GSttingen-Heidelberg 1962. 6. Purdy, S. J., Truter, E. V. : Chem. and Ind. 11, 506 (1962).

Dipl.-Ing. Dr. J. Washfittl Institut ffir Botanil , technische Milroskopie und organisehe Rohstefflehre der Technisehen Hochsehule A-1060 Wien, Getreidemarkt 9

Beitr/ige zur Analytik von Farbstoffen

II. Mitteilung* $ c h n e l l m e t h o d e zu r B e s t i m m u n g wasse r lSs l i ehe r F a r b s t o f f e in L e b e n s m i t t e l n * *

Gff~T~.R LV.HMAN~, HANs-GEaT H A ~ , Pv.T~a COLLV.T, B~BWT, S ~ I F F ~ R T - E I s T ~ n n d M~RCO Mo~JIN***

Mitteilung aus dem Insti tut fiir Organische Chemic der Universit~t des Saarlandes, Saarbriicken 1

Eingegangen am 26. Juli 1969

Cont r ibu t ions to the Ana lys i s of Dyes I I . A R a p i d P rocedure for t he D e t e r m i n a t i o n of Wate r -So lub le Dyes in F o o d s

Summary. A procedure has been described for the enrichment and isolation of synthetic acid and basic dyes and for any water-soluble natural-dyes. Particularly a simple and rapid method for the isolation of dyes from albuminos foods has been quoted.

Zusammen]assung. Es werden Veffahren zur Anreicherung und Isolierung yon synthetisehen sauren und basisehen Farbstoffen sowie einiger wasserlSslicher lqaturfarbsteffe beschrieben. Ins- besondere wird ein einfaches und schnelles Verfahren zur Farbsteffisolierung aus protein- haltigen Lebensmittelzubereitungen angegeben. Die Trennung und Identifizierung der Farbstoffe effolgt nach herkSmmliehen Methoden.

1. Z u m Problem der Farbs tof fanalyf ik

Einleitung Zur B e s t i m m u n g der Fa rbs to f fe in versehiedenen Lebensmi t t e l zube re i tungen

werden bis heu te Vorsehr i f ten angewandt , die n ieh t mehr den wissensehaf t l iehen E rkenn tn i s s en auf dem Gebie te der A n a l y t i k entspreehen. Der in de r s t aa t l i ehen l~?berwaehung t~t ige Chemiker i s t also auf Methoden angewiesen, die zu Fehlentsehei - dungen f i ihren k5nnen [1 ].

* I. l~Iitteilung: Z. anal. Chem. 288, 445 (1968). ** Herrn Prof. Dr. O. Neunheeffer zum 65. Geburtstag in Verehrung gewidmet.

*** DAAD-Stipendiat am Insti tut fiir Organische Chemic des Saarlandes yon der Universidad Central del Ecuador in Quito.

1 Den Herren Professoren Dr. B. Eistert, Dr. O. Neunhoeffer und Dr. H. Thaler danken wit fiir Hinweise uud Ratsch1~ige, den Firmen Dr. F. K. marcus K. G., Geesthacht, Ringe & Kuhl- mann, Hamburg, und Deutsche Hoffmann-La Roche A. G., Grenzach, fllr ~berlassung yon Parb- stoffmustern. I)er Deutsehen Forschungsgemeinschaft, Farbstoffkommission, gilt unser Dank fiir die Bereitstellung yon Sachmitteln.

Beitr~ge zur Analy~ik yon Farbstoffen. II 257

Viel grSl3ere Sehwierigkeiten ergeben sich, worm Farbstoffe in Bedarfsgegenst~n- den zu ermitte]n sind, ObwoM bier Vorschriften zur Identifizierung yon •arbstoffen ffir k0smetische Zwecke vorliegen, ist fiber eine Anreicherung, Abtrennung und Reini- gung dieser Farbstoffe au s kosmetisehen Praparaten nur wenig berichte$ worden.

~hnlich wie man den ehemischen ~ntersuehungsansta!ten zur Reinheitspriifung der synthetisehen Lebensmittelfarbstoffe Methoden vorschlagt [2], sollten auch ver- bindliehe AnleiSungen zur ~berprfifung der Zul~ssigkeit der den Lebensmitteln und Bedarfsgegens~nden zugese~zten Farbst0ffe ausgearbeitet und yon einer zentralen Stelle (Farbstoffkommissi0n der DI~G, Bundesgesundheitsam$) bekanntgegeben werden. Nut dann ist es mSglich, dab einheitliehe Analysenverfahren bei der Kon- tr011e durehgeffihrt werden, die Fehlbeurteilungen, die auf Grund unspeziiiseher AnalysenffihrUng mSglieh w~ren, weiSgehend aussehalten wiirdem

Saenz.Lascano-Ruiz [3] versuchte vor einiger Zeit dem Mangel, dab bisher kein Analysengang zur Bestimmung der Farbst0ffe bestand, dutch eine Methode, die sich der Ionenaustauscher und des Aluminiumoxids als starker adsorbierende Stoffe zur Isolierung der synthetischen Farbstoffe bedient, zu begegnen. Das Verfahren weist gegeniiber der Wollfadenmethode erhebliche Vorteile auf, ist n. E. noch zu auLvendig und erfordert zu viel Zeit zur Durchfiihrung.

In einer Reihe yon MiSteilungen zur Analytik yon Farbstoffen werden wit fiber die yon uns zur Bes$imraung yon synthetisehen und natfirlichen Farbstoffen in Lebensmitteln und Gebrauehsgegenst~nden entwiekelten Verfahren beriehten. Naeh den yon uns ausgearbeiteten Methoden wird nur noeh ein Bruehteil der Zeit zur Identifizierung der Farbstoffe benStigt als naeh dan bisher fiblichen Verfahren.

Probleme der FarbstoUanrelcherung Da die F£rbekraft de r Farbst0ffe , besonders der synthetisehen Produkte, ihre

Anwendung in geringsten Konzentrationen erlaubt, um Lebensmitteln oder Bedarfs- gegenst~nden den gev~finsehten Farbton zu geben, mug zur Identiilzierung der l~arb- stoffe deren Anreicherung aus der zu untersuehenden Probe v0rhergehen.

Entsprechend der groBen Zahl und unterschiedliehen Zusammensetzung der Lebensmittel oder Bedarfsgegenst~nde, die gef~rbt werden diirfen, sind zur Anreicherung und Erfassung der Farbstoffe verschiedene Aufbereitungs- und Extraktionsverfahren notwendig, denn je nach der Art der gef~rbten Probe liegen die Farbstoffe als Lfsung in Wasser, verdiinntem Alkohol oder Fett, adsorbiert an Kohlenhydraten oder Pektinen oder dutch Chemisorption an Proteinen fixiert vor.

• Wenu diese Inhaltsstoffe nieht wei~gehend yon den Farbstoffen abge~rennt wer- den, l~Bt sieh die zur Identifizierung efforderliche Chromatographie auf Papier oder der Dfinnsehieht nur sehwierig ausffihren, da diese Subs~anzen schon als Verunreini- gungen des Farbstoffs einen groBen EinfluB auf den Rf-Wert und die Fleekenausbil- dung des Cbromatogramms ausiiben, wie Thaler [4] schon vor l~ngerer Zeit berichtete.

Man is~ also aus teehnisehen Grfinden gezwungen, zwisehen den Arbeiten zur Trenuung un d Anreieherung sowie Isoliertmg und Identifizierung des in dem Unter. suehungsmaterlal vorhandenen Farbst0ffs Zu untersehelden.

Trennun~l und Anreicherung Sehwierigkeiten zur Trennung and Anreieherung der Farbstoffe liegen darin,

da~ es kein genereUes Verfahren ffir die Trennung der Farbstoffe yon ihrem Substrat fiir alle Zubereitungen oder Pr~parate geben kann. Die ilblichen Verfahren der Struk- ~urzerstSrung des Untersuehungsmaterials durch S~ureaufschluB, Alkalihydrolyse oder enzyma£isehen:Abbau kSnnen kaum allgemein angewand~ werden, da sigh die Farbstoffmolekfile aueh unter diesen~ Verarbeitungsbedingungen irreversibel ver- ~ndern, was zu Fehlentseheidungen AnlaB geben kSnute. • Eine Ab~rennung der l~arbstoffe aus gef~rbten Proben gelingt am besten, wenn man die Farbstoffe mit geeigneten LSsungsmi~teln vom Substrat ablSst und danach 17 Z. Lebensmitt .-Untersuch., Band 143

258 G. Lehmann et al.:

entweder das Subsbrat entfernt oder ein Adsorbens hinzuffigt, das fiber eine gr56ere Adsorptionsff~higkeit zum Farbstoff vefffigt als die Inhaltsstoffe der Probe.

Es sind also zur Anreieherung folgende Arbeitsabschnitte auszuffihren: 1. Vorbereitung des zu untersuchenden Materials (Trocknen, Zerkleinern, Entfetten, LSsen,

Verdfinnen oder Konzentrieren je nach der Eigenschait der Probe). 2. Extraktion der ~arbsteffe (HerauslSsen mit Wasser, organischen oder alkalischen LSsungs-

mitteln). 3. Vorax~reicherung der Farbsteffe (Adsorption an Sorptionsmittel, Ausschiitteln mit organi-

schen LSsungsmittein). 4. Abtrennung unerwiinsehter und stSrender Begleitsteffe der Probe (spezifische Desorption

yore Sorptionsmittel oder selektive Extraktion). 5. Anreicherung und Konzentrierung der FarbstofflSsung (Elution yore Sorptionsmittel,

Einengen der LSsung, Wiederholung des Adsorptions- und Elutionsvorganges bei zu groBer Ver- unreinigung).

Als brauehbare Sorptionsmittel, die fiber eine grSl3ere Affinit~t verffigen als die Begleitstoffe der Probe, haben sich Polyamidpulver zur S~ulenehromatographie, Carboxymethyl-ceUulose, Bentonit und Fuller-Erde bew~ihrt.

l~ber das Verhalten yon Polyamidpulver gegenfiber sauren Lebensmittelfarb- stoffen berichteten wit bereits [5, 6].

Isolierung und Identifizierung Nach der Desorption der Farbstoffe yon den Sorptionsmitteln und Konzentrieren

der LSsungen werden die Farbstoffe mit tLilfe der Diinnsehichtehromatographie voneinander getrennt. Die Identifizierung effolgt durch Vergleieh der Rf-Werte mit authentisehen Standardsubstanzen. In Zweifelsf~llen oder bei Sehiedsanalysen kommt die Aufnahme der Absorptionsspektren hlnzu, die ebenfalls einen Vergleieh mit authentisehen Substanzen gestatten. U m b e i Farbstoffgemisehen fiir die Spektro- skopie ausreiehende Mengen Substanz zu erhalten, ist mitunter eine preparative Dfinnsehiehtehromatographie zur Trennung der Farbstoffgemische unumg~inglieh, wobei man sich des yon uns ausgearbeiteten Veffahrens zur quantitativen Dfinn- sehiehtehromatographie bedienen kann [7, 8].

2. Durchfiihrung der Farbstoffanreicherung und -bestimmung a) Reagentien

Polyamidpulver zur S~ulenchromatographie (M~ SC 6, Maeherey, Hagel & Co., Diiren; Woclm, Eschwege),

Carboxymethyl-eellulose (Kationenaustauscher M~ 2100 CM, Macherey, Hagel & Co.; Dfiren; Whatman CM 22, L. Hormuth, Heidelberg 1),

Bentonit (Roth-Chemie GmbH, Karlsruhe), Fuller-Erde (Serva-Entwicklungslabor, Heidelberg), Celite 545 (Serva-Entwicklungslabor, Heidelberg), Seesand (Merck AG, Darmstadt), Glaswolle, Cellulosepulver zur Dfinnschichtchromategraphie (M~ 300, Macherey, Hagel & Co., Diiren), Kieselgel G zur Dfinnschichtchromatographie (E. Merck AG, Darmstadt), Palmin, Methylalkohol, Petrol~ther (Sdp. 100--140 ° C), Carr-Price-Reagens, Essigs~urelSsung: I Teil konz. Essigs~ure -t- 1 Teil Methylalkohol, Ameisens~urelSsung: 4 Tefle konz. Ameisens~ure 99%ig -}- 6 Teile Methylalkohol, Elutionsgemisch 1:95 Teile Methylalkohol -~ 5 Teile konz. AmmoniaklSsung; Elutions-

gemisch 2:1 g hTatriumhydroxid in 1000 m170~oigem Methylalkohol; Elutionsgemisch 3: 20 Teile Pyridin ~- 2 Teile konz. Essigs~ure ~ 80 Teile dest. Wasser;

l~lieBmittelgemisch 1 : 80 ml 2,5% ige w~Brige HatriumcitratlSsung ~- 20 ml konz. Ammoniak- 15sung -{- 12 ml Methylalkohol; l~liel3mittelgemisch 2:80 ml Petrol~ther (40 ° C) -~ 20 ml Benzol -{- 5 ml Aceton Jr 5 ml konz. Essigs~iure; Fliei3mittelgemisch 3: 20 ml Aceton -~ 60 ml Methyl- alkohol ~ 4 ml (lest. Wasser.

Beitr~ge zur Analytik yon Farbstoffen. I I 259

b) Material Mikroehromatographierohre 15 × 150 mm mit einem Auslaufrohr 3 × 100 mm anstelle eines

Auslaufrohres mR Sehliffhahn, MeBpipetten, 10 ml Fassungsverm5gen, Pipette, weitlumig (Tropfpipette), Dfinnsehlehtehromatographisehe Ausriistung.

c) Vorbereitung der Mikrochromatographierohre Das als S~ulenabschluB dienende Kapillarrohr des Rohres wird mit wenig Glaswolle abgedieh-

te tund soviel Seesand daraufgegeben, bis der eingezogene Tefl des angeschmolzenen weiten Rohres damit angeffillt ist.

d) An/ertlgung yon Mikrosgulen Zum Aufbau der S~ulen werden die Sorptionsmittel in Wasser aufgeschl~mmt und in die vor-

bereiteten Chromatographierohre mit Hflfe einer weitlumigen Pipette fiberfiihrt, so dab sich S~ulen yon ungefi~hr 1--1,5 cm HShe aufbauen. Wenn Bentonit oder Fuller-Erde als Sorptions- mittel angewandt werden, dann sind diese mit der vierfachen Menge Celite gut zu vermisehen, beret sie mit Wasser angesehl~mmt werden.

Naehdem das zur Aufsehl~mmung dienende Wasser durch das Kapfllarrohr abgetropft ist, werden auf die S~'ulenffillung weitere 10 ml dest. Wasser gegeben, urn das Sorptionsmittel veto Feinstkorn zu befreien. Dabei wird zweckm~i3igerweise das Adsorbens mit einem Glasstab um- geriihrt, bis sieh eine glatte S~ulenoberfl~che ausgebfldet hat. Wenn das Wasser die S~iulenffillung durchlaufen hat, ist das Rohr einsatzbereit.

Die so bereiteten Mikrochromatographies~ulen kSnnen stets vorr~tig gehalten werden, da sie sich in mit dest. Wasser geffillten Gef~Ben fiber einige Tage hinweg olme Ver~nderung aufbewahren lassen. I)abei soll~e der Wasserspiegel im GeI~B mit der oberen S~ulenhShe im Rohr fiberein- stimmen, um ein Austrocknen der Sorptionsmittel zu verhindern. Diese Sorptionsmittel, die sich in einem Mikrorohr befinden, das ein Kapillarrohr als unteren Abschlul~ besitzt, laufen nicht ,,leer" trod bilden aueh keine Risse aus.

e) Anreicherung der mit Wasser mischbaren oder in Wasser 16di~hen Farbsto~e au~ Lebensmitteln ~) Konfiti~ren, Marmeladen, J~rausen, Heifl- und KalSgetr~inke, Lilc6re und Zuckerwaren Je naeh der vorhandenen Farbstoffmenge werden 0,5--5 g oder ein geniigend grol~er Anteil

der Probe mit der 10faehen Menge dest. Wasser versetzt und die Mischung erw~rmt, bis sieh die 15sliehen Bestandteile aufgelSst haben. UnlSsliehe Anteile werden dureh Filtration fiber Glas- wolle beseitigt. Von flfissigen Proben werden 2--5 ml mit 25 ml dest. Wasser verdiinnt.

Die resultierenden LSsungen werden wie folgt weiterverarbeitet: Man erw~rmt die LSsung, gibt 0,5--1 g Polyamidpulver hinzu, sehiittelt die Misehung mehr-

reals um und l~Bt das Sorptionsmittel absitzen. Wenn die fiberstehende Flfissigkeit noeh farbig ist, enthglt die Misehung entweder zu wenig Sorptionsmittel zur Adsorption der Farbstoffe oder es sind natfirliehe oder basische Farbstoffe vorhanden. Eine bestehende Fgrbung naeh weiterer Zugabe yon Polyamidpulver kann yon Naturfarbstoffen oder synthetisehen basisehen Farbstoffen herrfihren.

Die Misehung wird nun in das vorbereitete Chromatographierohr fibefffihrt und das Sorptions- mittel naeh dem Abtropfen der w~rigen L6sung 6real mit je 10 ml hei0em dest. Wasser und da- nach mit Aeeton in Anteilen yon je 3 ml behandelt.

Durch das Wasser werden Inhaltsstoffe der Lebensmittelzubereitung, wie Zueker, S~uren, Aromastoffe usw. aus dem Sorptionsmittel entfernt. W~rend des Reinigungsprozesses wird die S~ule mehrmals mit einem G|asstab aufgewirbelt bzw. umgerShrt, um eine bessere Wirkung zu erzielen. Mit Aeeton lassen sich evtl. vorhandene basische Farbstoffe, wasserlTsliehe Carotinoide und ein Tell der Anthoeyane eluieren. Die w~Brig-aeetonische LTsung dient zur weReren Bestim- mung anderer evtL vorhandener Farbstoffe.

Yore Polyamidpulver werden folgende Farbstoffe adsorbiert- 1. Alle synthetischen, sauren Farbstoffe, 2. die Naturfarbstoffe Betanin, Chlorophyll, Traubensaftrot, Carmin (wasserl5slieh), Anatto

(wasserl5slich) und Alkannarot (wasserlSslich). Um die adsorbierten Farbstoffe zu eluieren, wird das Polyamidpulver mit 5 ml des ammoniaka-

lischen Elutionsgemisches behandelt, l~aeh dem Eindringen der LTsung in das Sorptionsmittel beobaehtet man, ob sich die Farbstoffe restlos vom Polyamid ablTsen. Wenn das nicht der Fall ist, mug die Elution mit methylalkoholischer l~atriumhydroxydlSsung wiederholt werden. Zur Entfernung der restliehen alka|ischen LTsung aus dem Polyamid spfilt man die S~ule mit 5 ml ~Iethy|alkohol nach.

Das alkalisehe Eluat wird mit halbkonzentrierter methanolischer Essigs~ure anges~uert und im Rotationsverdampfer bei Wasserstrahlvakuum auf ca. 1 ml eingeengt (nieht zur Trockne!). Dieses Konzentrat dient zur Anfertigung der Chromatogramme.

260 O. Lehmann et al. :

Sollten die Farbs~offflecke auf den Chromatogrammen verzerrt ausfallen, befinden sieh noeh Fremdsubstanzen in der FarblTsung. In dem Falle wird das Konzentrat mit 25 ml dest. Wasser verdiinnt und erneut mit Polyamidpulver versetzt. Die weitere Verarbeitung kann dannebenso erfolgen wie vorstehend beschrieben wurde.

Fiir die Anreicherung yon Farbstoffen aus anthocyanhaltigen Lebensmitteln hat es sich als giinstig erwiesen, die hergestellte LTsung mit Hilfe einer Pipette auf eine vorbereitete Polyamid- saule zu geben, deren Anfertigung vorstehend beschrieben wurde. Dieses Verfahren benTtigt zwar etwas mehr Zeit, gestattet aber eine fibersichtlichere Abtrennung anderer Farbstoffe yon den sauren Lebensmittelfarbstoffen. l~aeh dem Auswasehen der S~ule mit heil3em Wasser und Aeeton kann die Desorption der Farbstoffe mit den alkalisehen Elutionsmitteln genauso vorgenommen werden, wie sehon vorstehend besehrieben wurde. Die Identifizierung der synthetisehen Lebens- mittelfarbstoffe wird bei der Papier- oder Diinnsehichtchromatographie dureh natiirliehe Farbstoffe rdcht gestSrt.

fl) Gefgrbtes Obst und Konserve~ 1--2 Friiehte werden im PorzellanmTrser zerMeinert und mit einer Mischung aus 25mi

hei~em dest. Wasser und 2 ml konz, AmmoniaklSsung behandelt. Den alkalischen Extrakt filtrier~ man dureh GlaswoUe und gibt zum Filtrat halbkonzentrierte methanolisehe Essigs~ure bis zum pH 5=--6. In die sehwach saure LTsung werden 0,5---1 g Potyamidpulver eingetragen unct die Mischung mehrmals umgesehiittelt. Danaeh verf~hrt man wie unter ~) beschrieben.

~) St~rkehaltige ZubereltuneJe~ 5--10 g der nTtigenfalls zerldeinerten Probe werden mit 30~50 ml ammonial~aliseher Elu-

tionslTsung in der K~lte behandelt, bis sieh der Farbstoff darin gelTst hat. l~ach dem Absetzen der St~rkekTrne r wird die LTsung dureh Glaswolle filtriert und, falls sieh der Farbstoff n0eh nieht restlos herausgelTst hat, die Extraktion mit einer geringen Menge der ammoniakalischen LTsung wiederholt.

Die klaren Filtrate werden vereinigt, mit halbkonzentrierter methanoliseher Essigs~ure auf pH 5--6 gebracht und die LSsung mit desk. Wasser auf das Doppelte ihres Volumens verdfinat. Nach der Zugabe yon 0,5---1 g Polyamidpulver wird, wie unter ~) besehrieben, wefterverfahren.

3 ) Pektinhaltige Zubereitunge~ •• •• 5--10 g der Probe werden gut zerkleiner~ und mit ca, 30 ml dest. Wasser erhitzt, bis eine

klare LSsung ist. In die noeh warme LTsung gibt man 0,5~1 g Polyamidpulver, schiittelt einige Male gut um und l~Bt das Pulver absitzen. Danach wird so Verfahren wie unter ~) beschrieben wurde.

]) Anreieherung der FarbStoffe aus elweiflhaltigen Zubereltunge~ a) Gelatlnehaltige Zubereitunge~

1--5 g der Probe werden weitgehend zerkleinert und mit ca. 30~50 ml dest. Wasser erhitzt, bis eine LTsung entstanden ist. Falls die Menge des Wassers zum LTsen des Materials nieht aus- reieht, karm beliebig welter verdiinnt werden, ~aeh dem Ansguern mit Essigs~ure gibt man in die noeh warme LTsung 0,5--1 g Polyamidpulver, sehfittelt die Mischung gut um und l~13t das Pulver mit dem adsorbierten Farbstoff absitzen. Danach wird wie unter e) a) beschrieben weiter- behandelt. Man aehte jedoeh darauf, dab die LTsung stets warm genug bleibt, um eh~ Ers~arren der Gelatine]Tsung zu vermeiden.

fl) Andere eiwei[3haltlge Lebensmlttei (Lachsersatz, Kaviarersatz, Krabben, Flelsch usw.) 0,5--1 g zerkleinerten Laehsersatz ( 1,5~2 g Kaviarersatz oder 4--5 g Krabben) werden zun~ichst

durch Abpressen mit Filterpapier yon der Hauptmenge des anhaftenden 01es befreit, Danach zerreibt man das Material im PorzeUanmTrser viermal mit je 20 ml Ace~on, Um das Fett und das Wasser zu entfernen. Die aeetonisehe LTsung wird naeh jeder Behandlung dekantiert und auf, bewahrt. Naeh der Acetonbehandlung wird das restlithe LTsungsmittel dureh Erw~irmen des M6rsers im Troekensehrank und Zerreiben der Masse mit dem Pistill vertriebem Es bleibt danach ein trockenes, weitgehend fettfreies Material zurfiek, das sieh im MTrser pulverisieren l~Bt,

Das Pulver der Probe wird danach mit 6--7 g Celi~e gut vermischt und yon dieser Mischung 2 g in ein mit Glaswolle und Seesand abgediehtetes Mikroehroma~ographierohr fibeffiihrt. Durch Zugabe yon 5 ml des ammoniakalisehen Elutionsgemisches werden die an EiweiI3 fixierten Farb- stoffe desorbiert. Danaeh durehspfilt man das Materialin dem Rohr mit Methylalkohol. Der Elu- tionsvorgang ist so oft zu wioderholen, bis der gesamte Farbstoff in LTsung gegangen ist. Es ist zweckm~Big, wenn man die Fiillung im Chromatographierohr wghrend des Desorptionsvorganges mit dem Gl~sstab gelegentlieh durehmischt. Das alkalisehe Eluat stellt man mit halbkonzentrierte Essigsgure auf einen pi t 5--6 ein und gibt dann 0,5--1 g P olyamidpulver hinzu. Naeh mehrmali- gem Umschfitteln wird das Sorptionsmittel in ein vorbereitetes Chromatographierohr iiberffibxt und zur Anreieherung des Farbstoffs wie unter e) ¢~) beschrieben welter veffahren.

Der Aeetonextrakt mit dem gelSsten Fett der Probe ist hgufig gef~rbt. Er wird filtriert, am l~otationsverdampfer im Vakuum auf ca. 3--4 ml eingeengt, mit 10 ml dest. Wasser versetzt ~md

Beitr~ge zur Analytik yon Farbstoffen. I I 261

dureh ein angefeuehtefes Filter filtriert. Dann gibt man 0,5--1 g Polyamidpulver hinzu, sehiittelt um und iiberffihrt das Sorptionsmittel ebenfalls in ein vorbereitetes Chromatographierohr. Die Gewinnung und Anreieherung des Farbstoffes erfolgt danaeh ebenso wie schon beschrieben wurde. Zur Identifizierung werden die Faxbstoffkonzentrate aus dem Aceton- als auch aus dem ammonia- kalischen Extrakt wie fiblich ehromatographiert. Schwarze Farbstoffe im Kaviarersatz kSnnen mitunter durch Inhaltsstoffe veri~ndert werden, so da$ der Acetonextrakt dann Spaltprodukte dieser' Farbstoffe enth~lt. Wi~hrend die sehwarzen Farbst~ffe selbst sich nur mit alkalisehen LSsungen yore EiweiB ablSsen lassen, werden die Spaltprodukte schon dutch Aceton desorbiert.

g) Anrei~herun9 der vom Polyamldpulv~r nlcht adsorbierten Farb~t@e Vom Sorptionsmittel Polyamid werden nicht adsorbiert oder dutch Aceton desorbiert: 1. WasserlSsliehe basisehe Farbstoffe, 2. wasserlSsliehes Carotin und wasserlSsliehe Carotinoide, 3. Riboflavin.

~) Anreicherung basischer 2'arbsto~e (z. B. Methylvlolett, Viktoriablau R und B, Auramln) Der nach der Polyamidbehandlung anfallende acetonhaltige I)urehlauf wird gegebenenfalls

mib w~Brigem Ammoniak neutralisiert (pH-Papier) und auf eine vorbereitete S~ule aus Carboxy- methyl-cellulose in einem Mikrochromatographierohr gegeben, das nur mit Glaswolle (keinen Seesand verwenden i) abgediehtet wurde. Von der Carboxymethyl-eellulose werden alle basischen Farbstoffe dureh Ionenaustausch festgehalten. Beim Auswaschen des Ionenaustauschers mit 25 ml dest. Wasser werden wasserlSsliehe Naturfarbstoffe entfernt. Zur Isolierung der basisehen Faxbstoffe wird das Sorptionsmittel mit 2 ml halbkonzentrierte Essigs~ure in Methylalkohol versetzt und nach dem Eindringen dieser LSsung in das S~ulenmaterial weitere 5- - I0 ml Methyl- alkohol zugegeben. Die FarbstofflSsung wird am Rotati0nsverdampfer im Vakuum eingeengt und dient dann zur Anfertigung der Identifizierungsehromatogramme.

fl) Anreicherung der wasserlSslichen Natur/arbsto~e Der Durehlauf aus der Ionenaustauschers~ule wird am Rotationsverdampfer im Vakuum Yore

Aeeton befreit, die wi~Brige FarbstofflSsung danaeh auf eine vorbereitete Bentonit-Celite-Saule gegeben und das Sorptionsmittel mit 10 ml dest. Wasser ausgewaschen. Im Durchlauf kann sich Riboflavin befinden, das nut teflweise yore Bentonit in der Si~ule festgehalten wird.

Die Elution der Carotine und Carotinoide erfolgt mit 10 ml Aeeton. Die resultierende LSsung wird am Rotationsverdampfer im Vakuum auf 1--2 ml eingedampft and dient zur Anfertigung der Identifizierungsehromatogramme.

~) Ent/ernung des Biboflavins Fulls der I)urehlanf aus der Bentonit-Celite-S~ule gelb ist, kann Riboflavin darin gelSst sein. Die LSsung wird mit verd. Essigs~iure auf den pH 6 eingestellt (ptt-Papier) und mit 2g

Fuller-Erde gesehfittelt. Naeh 2--3 rain und n0chmaligem Umsehfitteln zentrifugiert man die Mischung. Die fiberstehende LSsung wird dekantiert, die Fuller-Erde 4real mit je 5~10 ml dest. Wasser aufgewirbelt, jedesmal erneut zentrifugiert und der Uberstand dekantiert.

Zur Elution des Riboflavins verwendet man das pyridinhaltige Elutionsgemisch in Anteilen zu je 10 ml, indem man jeweils diese Menge auf die Fuller-Erde 10 rain lung einwirken l~Bt. Die vereinigten Eluate werden nochmals zentrifugiert trod der ~berstand dient naeh dem Ein- engen am Robationsverdampfer zum Naehweis des Riboflavins.

h) Identifizierung der wasserlSslichen Farbsto~e Zur Identifiziertmg eignet sich vor alien Dingen die Dfinnschichtehromatographie auf Cellu-

lose. und Kieselgel-Schichten. ~) Saure 8ynthetlsche Farbsto~e

~aeh dem Einengen der essigsauren FarbstofflSsung wird diese filtriert, um evtl: vorhandenes Feinstkorn des Sorpgionsmittels ZU entfernen.

Fiir die Identifizierung der Farbstoffe eignet sich das FlieBmittelgemisch aus 80 Teilen 2,5~o iger ~atriumcitratlSsung, 20 Teflen 25% iger AmmoniaklSsung und 12 Teilen Methylalkohol ~[9] auf Celluloseschichten. . . . .

Wiihrend sieh die synthetischen Farbsf~ffe bei der Chromatographie entspreehend ihrer Rf- Werte verhalten, bleiben Chlorophyll (wasserlSslich); Anatto (wasserl6slieh) und Alkannarot (wasserlSslich) am Startpunkt und Betanin und Carmin laufen mit der Flieilmittelffont. Lediglich das Traubensaftrot kann in HShe des Lebensmittelfarbstoffes Rot 4 auf der Cellul0seschicht er- sqheinen und mit den iiblichen Reaktionen nachgewiesen werden.

fl) Natur/arbsto~e Die wasserlSslichen Naturfarbstoffe lassen sich am glinstigsten mit Hilfe der Spektroskopie

identifizieren. Verfahren zur ehromatographischen Identifizierung der wasserlSslichen bzw. wasserlSslichen Form dieser Farbstoffe liegen unseres Wissens nur in beseheidenem Umfange vor , :

262 G. Lehmann et al.: Beitr~ge zur Analytik yon Farbstoffen. II

~') Baslsche Farbsto~e Zur Iden~ifizierung der basischen Farbstoffe ist die DiinnschichtchromaCographie auf Kiesel-

gel-Schichten geeignet [I0], jedoch ist es schwierig, z. B. die beiden konstitutionsm~Big ~hnlichen Farbstoffe Methylviolett und Kristallviolett eindeutig voneinander zu trennem

~) Carotin nnd Carognoide (wasserl6sliche Formen) Farbstoffe dieser Gruppe werden am besten auf mit Fett impr~gnierten Celluloseschichten

identifiziert [11]. e) Riboflavin

Die Identifizierung des Riboflavins effolgt auf Kieselgel-Schichten nach bereits bekanntem Verfahren (10).

3, Ergebnisse und Diskussion

Naeh den beschriebenen Methoden wird nur noch ein Bruchtefl der Zeit zur Farb- stoffidentifizierung benStigt, als nach den bisher iiblichen Veffahren, wenn die Farb- stoffe wie folgt in LSsung gebracht werden:

1. Lebensmittel, die mit Wasser mischbar oder in Wasser 15slich sind, werden mit dest. Wasser behandelt,

2. gef~rbtes Obst und Konservenfrfichte mit heiBer AmmoniaklSsung behandelt und die FarbstofflSsung mit Essigs~ure anges~uert,

3. st~rkehaltige Zubereitungen mit methanolischer AmmoniaklSsung extrahiert und die FarbstofflSsung mit Essigs~ure angesi~uert,

4. pektinhaltige Zubereitungen mit einem hohen WasserfiberschuI3 erw~rmt, 5. gelatinehaltige Lebensmittel ebenfalls mit einem hohen WasseriiberschuB er-

wi~rmt, 6. eiwefl3haltige Zubereitungen durch Behandeln mit Aceton yore Fet t und Was-

ser befreit, zum Pulver zerrieben und die Farbstoffe mit alkalischem Methylalkohol vom Eiweil3 desorbiert. Die alkalische Farbs~offlSsung wird danach mit Essigs~ure anges~uert.

Aus den so hergestellten LSsungen der Farbstoffe werden adsorbiert: 1. durch Polyamidpulver alle synthetischen sauren Farbstoffe und wasserlSslichen

Formen der Naturfarbstoffe Chlorophyll, Carmin, Anatto, Alkannarot sowie Betanin und Traubensaftrot,

2. durch Ionenaustausch an Carboxymethyl-cellulose alle basischen Farbstoffe, 3. durch Bentonit Carotin und Carotinoide (wasserlSsliche Formen) sowie ein Teil

des Riboflavins, 4. durch Fuller-Erde das Riboflavin. Die Dcsorption der Farbstoffe zum Zwecke der Anreicherung erfolgt aus Polyamid

durch alkalischen Methylalkohol, Carboxymethyl-cellulose durch essigsauren Methyl- alkohol, Bentonit dutch Aceton und Fuller-Erde dureh pyridinhaltige Essigs~ure.

Die FarbstofflSsungen werden evtl. nach dem Ans~uern im Vakuum eingeengt und die Identifizierung nach bekannten Veffahren der Papier. oder Diinnschicht- chromatographie vorgenommen.

Die an feste Tr~ger adsorbierten Farbstoffe lassen sich dutch Auswaschen des Sorptionsmittels yon stSrenden Inhaltsstoffen befreien, so da]3 die nach der Elution vorzunehmende Identifizierungschromatographie durch Verunreinigungen nicht be- einfluBt wird.

Die an Polyamid adsorbierten Farbstoffe kSnnen mit alkalischer LSsung in der K~lte verlustlos und zerstSrungs~rei eluiert werden, was bei tier Wollfadenmethode bekanntlich nicht immer der Fall ist.

Zur Isolierung saurer Farbstoffe aus proteinhaltigen Lebensmittelzubereitungen sind ffir ein ungestSrtes Aus~rben auf Wolle groBe Schwierigkeiten zu fiberwlnden und andere Verfahren wegen der schlechten Ausbeute oder schwierigen und lang- wierigen Reinigungen der Extrakte wenig geeignet. Sowohl die Extraktion im sauren

V. Kyzlink und D. ~urda: Oxydationsverlauf der L-Ascorbins~ure im fliissigen Medium 263

als aueh ira alkalischen Milieu sowie der Einsatz yon Ionenaustauschern brachte keine bessere LSsung. Perdih u. Prihavee [12] sehlugen deshalb die Extraktion yon sauren Farbstoffen aus proteinhaltigen Proben naeh Reaktion des Eiweites mit Formaldehyd vor. Als Extraktionsmittel verwendeten die Auteren Chloroform in Gegenwart quart/~rer Ammoniumverbindungen.

Naeh dem bier besehriebenen Verfahren tier Entw/~sserung und Entfettung pro- teinhaltiger Zubereitungen mit Aeeten und Elution des Farbstoffs aus dem gepulver- ten und mit Celite gemisehten Lebensmittel dutch methanolisehe AmmoniaklSsung kSnnen diese Sehwierigkeiten dadureh fiberwunden werden, dab aus dem mit Essig- s~ure anges/~uerten Eluat beim pH 4--5 mi$ herausgelSstes EiweiB noeh 15slieh ist und die Farbstoffe yore festen Polyamid bereits adsorbiert werden.

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Priv.-Doz. Dr. Giinter Lehmann Insti tut fiir organische Chemie der Univcrsit~t des Saarlandes D-6600 Saarbriieken 15

EinfluB der Saccharose und der Zug/inglichkeit des Sauerstoffs auf den Oxydationsverlauf der r-Ascorbins iure im flfissigen Medium

VLADIMIR KYZLI'NK und Du~A~ 0URDA

Mitteilung vom Lchrstuhl fiir Lebensmittelhaltbarmachnng der Chemisch-teehnologisehen Hoch- schule zu Praha

Eingegangen am 7. ffuli 1969

I n f l u e n c e of Sucerose C o n c e n t r a t i o n a n d O x y g e n Access on t h e Course of L-Ascorbie Acid Oxidation in Liquid Medium

~qummary. The influence of succrose concentration catalysed by Cu 2+, Fe ~+ and enzymaticly, upon the reaction velocity, with regard to the accessibility of atmospheric oxygen was studied.

1. I t was proved, that the increasing concentration of succrose in the reaction mixture leads to the retardation of the oxidation process, even under the conditions of sufficient or - - better to say - - superfluous transfer of oxygen between the atmosphere and the liquid reaction media. The specific velocity of the reaction, characterized by the reaction constant of the first order, decreases with increasing suecrose concentration.