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Aus dem Institut für Virologie der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig und dem Zoologischen Garten Leipzig Beitrag zum Bösartigen Katarrhalfieber bei Wiederkäuern in zoologischen Gärten Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.) durch die Veterinärmedizinische Fakultät der Universität Leipzig eingereicht von Talena Matzat aus Göttingen Leipzig, 2012

Beitrag zum Bösartigen Katarrhalfieber bei Wiederkäuern in ... · nPCR Nested PCR . V . Nr. Nummer ORF Open reading frame OvHV-2 Ovines Herpesvirus 2 PCR Polymerase chain reaction

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Aus dem Institut für Virologie

der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig

und

dem Zoologischen Garten Leipzig

Beitrag zum Bösartigen Katarrhalfieber

bei Wiederkäuern in zoologischen Gärten

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Grades eines

Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)

durch die Veterinärmedizinische Fakultät

der Universität Leipzig

eingereicht von

Talena Matzat

aus Göttingen

Leipzig, 2012

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Mit Genehmigung der Veterinärmedizinischen Fakultät der Universität Leipzig

Dekan: Prof. Dr. Uwe Truyen

Betreuer: Prof. Dr. Klaus Eulenberger, Prof. Dr. Hermann Müller

Gutachter:

Prof. Dr. Klaus Eulenberger, Zoo Leipzig GmbH, Pfaffendorfer Straße 29, 04105 Leipzig

Prof. Dr. Hermann Müller, Institut für Virologie, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig,

An den Tierkliniken 29, 04103 Leipzig

Prof. Dr. Mathias Ackermann, Universität Zürich, Virologisches Institut, Winterthurerstraße 266 a,

CH-8057 Zürich

Tag der Verteidigung: 29.11.2011

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Meiner Familie

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I

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis IV

Abbildungsverzeichnis VI

Tabellenverzeichnis VIII

1 Einleitung 1

2 Literaturübersicht 3

2.1 Geschichtliches 3

2.2 Herpesviren 3

2.2.1 Unterteilung der Herpesviren 3

2.2.2 Die Latenz – eine Besonderheit der Herpesviren 4

2.2.3 Unterteilung der Gammaherpesviren 4

2.2.3.1 Genus Macavirus 5

2.2.4 Allgemeiner Aufbau der Herpesviren 5

2.2.4.1 Aufbau und Größe der DNS von Herpesviren 6

2.2.4.2 Aufbau der DNS von BKF-Viren 7

2.2.4.3 Open reading frames (ORF) in der Diagnostik 7

2.3 Übertragung von BKF-Viren 8

2.3.1 Übertragung von AlHV-1 unter Gnus 8

2.3.1.1 Übertragung von AlHV-1 auf Fehlwirte 9

2.3.1.2 Übertragung von OvHV-2 unter Schafen 9

2.3.1.3 Übertragung von OvHV-2 auf Fehlwirte 10

2.3.1.4 Übertragung anderer BKF-Viren 10

2.3.1.5 Übertragung von BKF-Viren unter Fehlwirten 11

2.3.2 Vorgänge in der Wirtszelle 11

2.3.2.1 Verhalten von BKF-Viren im Reservoirwirt 12

2.3.2.2 Verhalten von BKF-Viren im Fehlwirt 12

2.3.3 Anfälligkeit für klinisches BKF bei Fehlwirten 13

2.4 Symptome 14

2.4.1 Klinik 14

2.4.1.1 Kopf-Augen Form 14

2.4.1.2 Perakute Form 15

2.4.1.3 Intestinale Form 15

2.4.1.4 Abortive Form 16

2.4.1.5 Hautform 16

2.4.1.6 Leichtere Formen 16

2.4.2 Pathologisch-anatomische Befunde 16

2.4.3 Histopathologische Befunde 17

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II

2.5 Differentialdiagnosen 18

2.6 Nachweis von BKF 19

2.6.1 Gesamtdiagnose 19

2.6.2 Polymerasekettenreaktion 19

2.6.2.1 Prinzip 19

2.6.2.2 Nested und semi-nested PCR 19

2.6.2.3 Consensus PCR 20

2.6.2.4 Realtime-PCR nach CUNHA et al. (2009) 20

2.6.2.5 Probenmaterial für die PCR 21

2.6.2.6 Weiterverarbeitung der PCR-Produkte 21

2.6.3 CI-ELISA 21

2.6.4 In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie 22

2.6.5 Tierversuche 22

2.6.6 Blutbild 23

2.7 Therapie 23

2.8 Prophylaxe 23

3 Tiere, Material und Methoden 25

3.1 Tiere 25

3.2 Material 30

3.2.1 Geräte 30

3.2.2 Verbrauchsmaterial 30

3.2.3 Vorgefertigte Systeme (Kits) 31

3.2.4 Software 31

3.2.5 Reagenzien und Herstellung der Gebrauchslösungen 31

3.2.5.1 Reagenzien 31

3.2.5.2 Medium für die Probenlagerung 32

3.2.5.3 Mastermix für die Realtime PCR (Rt-PCR) 32

3.2.5.4 Mastermix für die cPCR 32

3.2.6 Primer und Sonden 34

3.2.7 Molekulargewichtsmarker λHaeIII 38

3.2.8 Positivkontrollen 38

3.2.8.1 OvHV-2 38

3.2.8.2 AlHV-1 39

3.3 Methoden 40

3.3.1 Probenentnahme 40

3.3.2 DNS-Isolierung 40

3.3.3 Spektrophotometrie zur Bestimmung des DNS-Gehalts 41

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III

3.3.4 Rt-PCR Protokoll nach CUNHA et al. (2009) 41

3.3.5 cPCR Protokoll nach ROVNAK et al. (1998) 42

3.3.6 Agarosegel-Elektrophorese 42

3.3.7 Aufreinigung der PCR Produkte und Sequenzierung 42

4 Ergebnisse 43

4.1 Vorversuche 43

4.1.1 Positivkontrollen 43

4.2 Ergebnisse der Probenuntersuchungen 48

4.2.1 Ergebnisse der Rt-PCR 48

4.2.2 Ergebnisse der cPCR 54

4.2.3 Messung des Gesamt-DNS-Gehalts bei positiven Proben 54

4.2.4 Ergebnisse der Sequenzierung 55

4.2.5 Zusätzliche Untersuchungen und Ergebnisse 60

4.2.6 Anzahl der Tiere 61

4.2.7 Unterteilung der Proben 61

4.2.8 Altersverteilung der beprobten Tiere 63

4.3 Zusammenfassung der Ergebnisse 67

4.3.1 Nachweis von AlHV-1 67

4.3.2 Nachweis von OvHV-2 67

4.3.3 Nachweis von CpHV-2 67

4.3.4 Nachweis von MCFV-WTD 68

5 Diskussion 69

5.1 Methodik der Probenuntersuchung 69

5.2 Ergebnisse der Probenuntersuchung 70

5.3 Schlussbetrachtung 74

6 Zusammenfassung 76

7 Summary 78

8 Literaturverzeichnis 80

9 Anhang 93

10 Danksagung 98

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IV

Abkürzungsverzeichnis

A Adenin

a Jahre

AlHV Alcelaphines Herpesvirus

ASS Acetyl-Salicylsäure

BHQ Blackhole quencher

BHV Bovines Herpesvirus

BKF Bösartiges Katarrhalfieber

BLAST Basic local alignment search tool

CpHV Caprines Herpesvirus

ds-DNS Doppelstrang-Desoxyribonukleinsäure

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

C Cytosin

CD Cluster of differentiation

CI-ELISA Competitive inhibitory enzyme linked immunosorbent as-say

cPCR Consenus PCR

Ct Cycle of treshold

CY5 TM Cyanin 5

d Tage

et al. et alii

f. Forma

FAM TM 6-FAM-phosphoramidit

G Guanin

H Heavy

HEX TM 5-Hexachloro-Fluorescein

HiHV Hippotragines Herpesvirus

HV Herpesvirus

IE Internationale Einheiten

ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses

IHC Immunhistochemie

ISH In-situ-Hybridisierung

Kbp Kilobasenpaare

L Light

Ln., Lnn. Lymphknoten

LUA Landesuntersuchungsanstalt

MCF Malignant catarrhal fever

MCFV Malignant catarrhal fever virus

MHC Major histocompatibility complex

MKS Maul- und Klauenseuche

n Anzahl

NCBI National Center for Biotechnology Information

neg. Negativ

nPCR Nested PCR

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V

Nr. Nummer

ORF Open reading frame

OvHV-2 Ovines Herpesvirus 2

PCR Polymerase chain reaction

pos. Positiv

RNA Ribonukleinsäure

Rt-PCR Realtime PCR

snPCR Semi-nested PCR

sp Subspezies

SpHV Springbock-Herpesvirus

SuHV Suides Herpesvirus

T Thymin

TAE Tris-Acetat-EDTA-Puffer

Tr Texas Red TM

WTD White-tailed deer

ZNS Zentrales Nervensystem

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VI

Abbildungsverzeichnis

Abbildung Titel Seite

1 Weltweite Verbreitung von BKF 1

2 Herpesvirion, Skizze 6

3 Herpesviren, Elektronenmikroskop 6

4 Mitteleuropa, Herkunft der Tiere 25

5 OvHV-2 und partielles DNS-Polymerasegen mit Angabe der Nukleotidposi-

tionen der Primer- und Sondenbindungsstellen

36

6 AlHV-1 und partielles DNS-Polymerasegen mit Angabe der Nukleotidpositi-

onen der Primer- und Sondenbindungsstellen

36

7 CpHV-2 und partielles DNS-Polymerasegen mit Angabe der Nukleotidposi-

tionen der Primer- und Sondenbindungsstellen

37

8 MCFV-WTD und partielles DNS-Polymerasegen mit Angabe der Nukleotid-

positionen bekannter Primerbindungsstellen der cPCR

37

9 Molekulargewichtsmarker λHaeIII 38

10 Positivkontrollen B1, B2, B3, B4 in der Rt-PCR 45

11 Standardkurve Positivkontrollen B1, B2, B3, B4 in der Rt-PCR 45

12 Positivkontrollen J1, J2, J3, J4 in der Rt-PCR 46

13 Standardkurve Positivkontrollen J1, J2, J3, J4 in der Rt-PCR 46

14 Gelelektrophoresebilder der Positivkontrollen B0-B4, G1 und J 2-4 cPCR 47

15 Proben 17N, 22N, 23N, 26N, 29N Rt-PCR und cPCR 49

16 Proben 126N, 127A, 127N, 127R, 129A, 129N Rt-PCR und cPCR 50

17 Proben 132N, 136N, 242N Rt-PCR und cPCR 51

18 Proben 243N, 245N, 248N, 261N, 264A, 265A, 265N Rt-PCR und cPCR 52

19 Proben 266N, 267N, 268R, 270N, 270R, 272N Rt-PCR und cPCR 53

20 Probe 17N verglichen mit GenBanknummer AF387516 MCFV-WTD 55

21 Probe 26N verglichen mit GenBanknummer AF387516 MCFV-WTD 56

22 Probe 243N verglichen mit GenBanknummer AF283477 CpHV-2 56

23 Probe 265N verglichen mit GenBanknummer EU309723 56

24 Probe 266N verglichen mit GenBanknummer EU309723 57

25 Probe 267N verglichen mit GenBanknummer EU309723 57

26 Probe 270R verglichen mit GenBanknummer EU309723 57

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VII

27 Probe 272N verglichen mit GenBanknummer EU309723 58

28 Gesamtübersicht über Anzahl und Prozentsatz positiver und negativer Tiere 61

29 Gesamtübersicht über Anzahl und Prozentsatz positiver und negativer Pro-

ben

61

30 Aufteilung positiver Proben 62

31 Positive Proben 62

32 Altersverteilung der beprobten Tiere 63

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VIII

Tabellenverzeichnis

Tabelle Titel Seite

1 BKF-Viren 93

2 Tierarten, die Reservoirwirte für BKF-Viren sind bzw. die Antikörper gegen

BKF-Viren ohne Symptomatik aufwiesen; Tierarten, bei denen BKF sympto-

matisch auftrat

94

3 Art, Anzahl und Alter der untersuchten Tiere 26

4 Primer- und Sondensequenzen für die Rt-PCR und cPCR 34

5 Probenanzahl und Aufteilung 40

6 Vergleich Sensitivität cPCR und Rt-PCR der Proben A bis J 43

7 Liste der positiven Proben in der Rt-PCR 48

8 Tiere und Probennummer der positiven Proben in der Rt-PCR und cPCR 54

9 Vergleich der Ergebnisse der Rt-PCR und der Sequenzierung von positiven

Proben

55

10 Übersicht über die Ergebnisse aus Rt-PCR, cPCR und Sequenzierung 59

11 Ergebnisse zusätzlicher Untersuchungen 60

12 Art, Anzahl und Alter aller beprobten Tiere sowie Art, Anzahl und Alter der

positiven Tiere

64

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Literaturübersicht

1

1 Einleitung

Bösartiges Katarrhalfieber (BKF) ist eine Viruskrankheit, die weltweit bei verschiedenen Arten der

Ordnung Artiodactyla auftreten kann und meist tödlich verläuft. Die Morbidität ist im Allgemeinen

gering. Dennoch kann es zu Epidemien kommen, die schwere ökonomische Verluste, beispiels-

weise auf Farmen und in zoologischen Gärten, nach sich ziehen.

Die Symptomatik der Krankheit ist sehr vielfältig und wird pathophysiologisch durch Lympho-

proliferation und Vaskulitis bedingt. Auslöser von BKF sind eng verwandte BKF-Viren aus der Fa-

milie der Gammaherpesviren. Zu den latenten Trägern und auch zu Überträgern der Viren zählen

Wiederkäuer verschiedener Arten, wie zum Beispiel Gnus, Schafe und Ziegen. Unter ihnen schei-

nen Jungtiere, aber auch immunschwache Adulte, maßgeblich an der Verbreitung beteiligt zu sein,

wobei die Übertragungswege nur teilweise bekannt sind. Die Abbildung 1 zeigt die weltweite

Verbreitung von BKF.

Abbildung 1: Weltweite Verbreitung von BKF Länder, in denen von BKF berichtet wurde, sind schwarz markiert.

ALBINI et al. 2003, BARNARD et al. 1994, BRENNER et al. 2002, CLARK et al. 1970, COLLERY u. FOLEY 1996, CRAWFORD et al. 2002, DECARO et al. 2003, DRIEMEIER et al. 2002, FRITZ et al. 1992, FRÖLICH et al. 1998,

GULLAND et al. 1989, HÄNICHEN et al. 1998, HATKIN 1980, KALUNDA et al. 1981, KIUPEL et al. 2004, LI et al. 2006, LØKEN et al. 1998, MACKINTOSH 1992, MÜLLER-DOBLIES et al. 2001, SYRJÄLÄ et al. 2006, WANI et al. 2006,

WIYONO et al. 1994, ZARNKE et al. 2002

Problemstellung der hier vorliegenden Arbeit:

Bei Wildtieren und in zoologischen Gärten im deutschsprachigen Raum traten immer wieder Fälle

von BKF auf, bei denen der Reservoirwirt nicht ermittelt werden konnte, wie beispielsweise bei

einer Giraffe eines deutschen Zoos. Da dieser Zoo weder Gnus noch Schafe in unmittelbarer Um-

gebung der Giraffen hält, lag die Vermutung nahe, dass eventuell noch andere Wiederkäuer als

bisher unerkannte latente Träger von BKF-Viren in Frage kommen, da beispielsweise bei gesun-

den Säbelantilopen und Kuhantilopen BKF-Viren nachgewiesen wurden (siehe Tabelle 1). Unter-

suchungen von FLACH et al. (2002) erhärten diesen Verdacht, da sie nachwiesen, dass verschie-

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Literaturübersicht

2

dene Wiederkäuerarten Gammaherpesviren asymptomatisch beherbergen. Unklar ist allerdings,

ob und unter welchen Bedingungen diese Wirte (Tabelle 1) BKF-Viren ausscheiden und so andere

Wiederkäuer gefährden.

Die hier vorliegende epidemiologische Studie sollte untersuchen, inwiefern unterschiedliche

Wiederkäuer in verschiedenen Zoos und Wildparks Träger und Ausscheider der momentan wich-

tigsten BKF-Viren sind. Dazu wurden von neugeborenen und adulten Wiederkäuern, die im Rah-

men der Jungtierprophylaxe bzw. anderer notwendiger Behandlungen gefangen wurden, Tupfer-

proben von Nasen-, Augen und Analschleimhaut genommen und mittels Polymerasekettenreaktion

(PCR) auf Alcelaphines Herpesvirus 1 (AlHV-1), Ovines Herpesvirus 2 (OvHV-2), Caprines Her-

pesvirus 2 (CpHV-2) und Malignant catarrhal fever virus – White–tailed deer (MCFV-WTD) unter-

sucht.

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Literaturübersicht

3

2 Literaturübersicht

2.1 Geschichtliches

BKF war in Deutschland früher als so genannte Kopfkrankheit des Rindes bekannt (MOEBIUS

1887). GÖTZE et al. (1930) erkannten erstmals einen Zusammenhang zwischen dem Auftreten

von BKF bei Rindern und gesunden Schafen (Ovis sp.), die scheinbar verantwortlich für das Auf-

treten der Krankheit waren. Im Gegensatz dazu entdeckte 1904 ein afrikanischer Viehzüchter den

Zusammenhang zwischen dem Auftreten von BKF bei Rindern (Bos sp.), die engen Kontakt zu

Gnus hatten, da sie Ammen für Kälber von Weißschwanzgnus (Connochaetes gnou) waren

(BARNARD et al. 1994). Weitere frühe Berichte über BKF stammen aus Südafrika (DU TOIT und

ALEXANDER 1938; DE KOCK und NEITZ 1950), Kenia (DAUBNEY und HUDSON 1936) und der

Schweiz (WYSSMANN 1934).

2.2 Herpesviren

2.2.1 Unterteilung der Herpesviren

Die Familie der Herpesviridae gehört mit den Familien Alloherpesviridae und Malacoherpesviridae

zur Ordnung der Herpesvirales.

Nach dem Internationalen Komitee für die Taxonomie von Viren (ICTV) werden die Herpesviri-

dae aufgrund ihrer biologischen Eigenschaften in die Unterfamilien Alphaherpesvirinae, Betaher-

pesvirinae und Gammaherpesvirinae unterteilt:

• Alphaherpesviren haben breite Wirtsspektren, kurze Replikationszyklen, vermehren sich

schnell in vitro, zerstören ihre Wirtszelle sehr effizient und können in Ganglienzellen per-

sistieren (ROIZMAN et al. 1981).

• Betaherpesviren haben im Gegensatz zu den Alphaherpesviren enge Wirtsspektren, einen

langsamen Replikationszyklus, breiten sich in Zellkultur nur langsam aus und führen bei in-

fizierten Zellen regelmäßig zu Zytomegalie. Viren dieser Familie persistieren in Zellen

lymphoretikulärer Organe und möglicherweise auch in Zellen von Speicheldrüsen, Nieren

und anderen Geweben (ROIZMAN et al. 1981).

• Gammaherpesviren lassen sich häufig mit einer bestimmten Tierfamilie oder – art, die die

Viren latent beherbergen, assoziieren (ROIZMAN et al. 1981). Darüber hinaus können sie

Tiere anderer Arten infizieren und bei diesen schwere klinische Reaktionen hervorrufen (so

genannte Fehlwirte) (ACKERMANN 2006). Gammaherpesviren haben unterschiedlich lan-

ge Replikationszyklen und lassen sich schwer oder gar nicht auf Zellkultur anzüchten. Da-

her stellen genaue Studien dieser Unterfamilie eine große Herausforderung dar

(ACKERMANN 2006). Einige Gammaherpesviren replizieren in vitro in Lymphozyten, man-

che auch in Epithelzellen oder Fibroblasten (ROIZMAN et al. 1981).

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Literaturübersicht

4

2.2.2 Die Latenz – eine Besonderheit der Herpesviren

Während Alpha- und Betaherpesviren dazu tendieren sich zu replizieren, sobald sie eine Zelle infi-

ziert haben und nur ein Teil der Viren ins latente Stadium übergeht, gehen Gammaherpesviren

häufig erst in die latente Phase über (ACKERMANN 2006). Latente Infektionen durch Gammaher-

pesviren wurden in vivo in B- und T- Lymphozyten sowie in Monozyten nachgewiesen (ROIZMAN

et al. 1981; ACKERMANN 2006). Durch den Übergang in das latente Stadium können sich die

Viren der Reaktion des Immunsystems entziehen. Außerdem werden während der Latenz be-

stimmte Proteine produziert, mit denen das Virus die Immunreaktion der Wirtes manipuliert (FIELD

et al. 2003). Während der Latenz liegt das Genom zirkulär, in der Replikationsphase hingegen li-

near vor (PFOFFENBERGER et al. 1985). OEHMIG (2004) hat festgestellt, dass sich Gammaher-

pesviren im Wirt seltener in der lytischen als in der latenten Phase befinden, und dass eine sym-

ptomatische Erkrankung eher durch Viren im lytischen Stadium zu befürchten ist.

Auf die Latenzzeit folgt eine Phase der Virusvermehrung, die mit der Freisetzung der Viren en-

det. Diese Phase geht unweigerlich mit der Zerstörung der Wirtszelle einher (ROIZMAN et al. 1992;

ACKERMANN 2006). Dies scheint aber nicht nur für das Auftreten von klinischen Symptomen

beim Fehlwirt verantwortlich zu sein. Vielmehr scheint die Modulation des Immunsystems durch

das Virus eine bedeutende Rolle in der Entwicklung der Symptomatik zu spielen (MC CORMICK

und GANEM 2005).

2.2.3 Unterteilung der Gammaherpesviren

Durch den Vergleich der Nukleinsäure- und Proteinsequenzen, der Genomstruktur sowie der im-

munologischen Reaktion auf bestimmte Virusoberflächenantigene können die Gammaherpesviren

weiter in verschiedene Genera unterteilt werden (ROIZMAN et al. 1992).

Zu den Gammaherpesviren gehören die Genera Lymphocryptovirus, Rhadinovirus, Macavirus,

Percavirus sowie noch nicht eindeutig zugeordnete Gammaherpesviren (ICTV 2009). Zum Genus

Macavirus gehören die meisten BKF-Viren.

Li et al. (2005a) untersuchten die Desoxyribonukleinsäure (DNS) von verschiedenen Gamma-

herpesviren im offenen Leserahmen (ORF) 9 bzw. die mitochondriale DNS der zugehörigen Re-

servoirwirte auf Parallelen. Dabei stellte sich heraus, dass die Verwandtschaftsgrade unter den

Gammaherpesviren weitgehend mit denen ihrer Reservoirwirte übereinstimmen. Vermutlich muss-

ten die Viren sich während der Evolution stets an Veränderungen ihrer Reservoir-Wirte anpassen

und sich zeitgleich mit diesen weiterentwickeln. So bekamen Virus und Wirt die Möglichkeit, sich

aneinander anzupassen. Aus dieser Anpassung resultiert womöglich, dass heute fast jede Tierart

ihr eigenes Herpesvirus beherbergt ohne zu erkranken. Infiziert sich ein artfremdes Tier mit dem

Herpesvirus einer anderen Tierart, hat das meist fatale Folgen für diesen Fehlwirt (CRAWFORD et

al. 2002). Es ist noch wenig darüber bekannt, welche Tierarten Reservoirwirte für Herpesviren dar-

stellen (HÄNICHEN et al. 1998).

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Literaturübersicht

5

2.2.3.1 Genus Macavirus

Zum Genus Macavirus gehören laut ICTV (2009) folgende Virusarten:

Alcelaphines Herpesvirus 1 und 2 (AlHV-1,2), Bovines Herpesvirus 6 (BHV-6), Caprines Her-

pesvirus 2 (CpHV-2), Hippotragines Herpesvirus 1 (HiHV-1), Ovines Herpesvirus 2 (OvHV-2) und

Suides Herpesvirus 3, 4 und 5 (SuHV-3, 4, 5). Aus diesem Genus sind folgende Viren für bestimm-

te Tierarten (siehe Tabelle 2 im Anhang) pathogen und es gibt Berichte über natürliche Infektionen,

die BKF auslösten: OvHV-2, AlHV-1 und CpHV-2 (LI et al. 1999b; PLOWRIGHT 1960; KEEL et al.

2003).

Im Gegensatz dazu ist für HiHV-1 und ein OvHV-2-ähnliches Virus von Säbelantilopen bisher

nur bekannt, dass sie im Tierversuch bei Kaninchen BKF auslösten (SCHOCK und REID 1995;

FLACH et al. 2002). Von natürlichen Infektionen durch diese Viren gibt es bisher keine Fallberichte.

Weitere Gammaherpesviren, die BKF auslösen (Tabelle 1), konnten bisher nicht eindeutig ei-

nem Genus zugeordnet werden. Dazu gehört u.a. ein AlHV-2 ähnliches Virus und das MCFV-WTD,

das bei einem Rothirsch (KLIEFORTH et al. 2002) bzw. bei Weißwedelhirschen (LI et al. 2000) zu

BKF führte. Die Tabelle 1 im Anhang liefert einen Überblick über die bisher bekannten BKF-Viren.

Hier ist angegeben, um welches Virus es sich handelt, welches der Reservoirwirt ist und ob eine

Pathogenität für andere Tierarten bekannt ist. Außerdem ist angegeben, in wieweit die Viren un-

tereinander verwandt sind, basierend auf der Homologie des hochkonservierten DNS-Polymerase-

Gens (siehe Punkt 2.2.4.3) im ORF 9. Auch sind Viren aufgeführt, von denen bisher nicht bekannt

ist, ob sie BKF auslösen, obwohl diese aufgrund ihrer deutlichen Homologie im ORF 9 zu anderen

BKF-Viren sowie dem Vorhandensein der Epitop 15 A (siehe Punkt 2.2.4) auf der Virushülle zu

den BKF-Viren zählen.

In Tabelle 2 im Anhang sind Tierarten aufgelistet, von denen bekannt ist, dass sie latente Trä-

ger eines BKF-Virus sind oder bei denen BKF symptomatisch auftrat. Außerdem sind Tiere aufge-

listet, die Träger von Gammaherpesviren sind, die eng mit den BKF-Viren verwandt sind und ver-

mutlich zu den BKF-Viren gehören (FLACH et al. 2002). Diese Gammaherpesviren sind noch nicht

endgültig taxonomisch zugeordnet. Der Virusnachweis erfolgte mittels PCR. War dies nicht mög-

lich, wurde anhand der Gegebenheiten auf den wahrscheinlichen Erreger rückgeschlossen: z. B.

AlHV-1 bei Anwesenheit von Gnus, OvHV-2 bei Anwesenheit von Schafen. Die Diagnose der

Krankheit wurde anhand der histopathologischen Befunde bestätigt1.

2.2.4 Allgemeiner Aufbau der Herpesviren

Die Zuordnung eines Virus zur Familie Herpesviridae basiert auf der Architektur der Virions, die

sich bei allen Herpesviren gleicht. Das Virion besteht aus mehreren Einheiten:

1. einer linearen ds-DNS mit 124-235 Kilobasenpaaren (Kbp), die auf einen bikonkaven In-

nenkörper (engl. Core) aufgewickelt ist (FURLONG et al. 1972).

1 siehe 2.4.3 Histopathologische Befunde

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Literaturübersicht

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2. einem ikosaedrischen Kapsid aus 162 Polypeptidketten, an dem die DNS durch Fibrillen fi-

xiert ist. Die Polypeptidketten des Kapsids werden im Nukleus der Wirtszelle gebildet und

finden sich hier zum Kapsid zusammen (MC COMBS et al. 1971; ROIZMAN 1992).

3. dem Tegument, welches aus globulären Proteinen besteht und das Kapsid umgibt

(ROIZMAN und FURLONG 1974). Sowohl die Dicke des Teguments als auch der Zustand

der Hülle (s. 4.) bestimmen letztendlich die Gesamtgröße des Virions, welche 120 bis 300

nm betragen kann (ROIZMAN und FURLONG 1974). Dabei erscheint ein Virion mit be-

schädigter Hülle im Elektronenmikroskop größer als ein Virion mit intakter Hülle (ROIZMAN

1992).

4. einer lipidhaltigen Hülle, die das Virion umschließt. Sie entsteht durch das sogenannte

Budding an der Kernmembran, ein Vorgang bei dem sich das Kapsid an die Kernmembran

anlagert, diese nach außen stülpt und schließlich ganz von ihr umhüllt wird. Durch Ab-

schnürung wird das vollständige Viruspartikel frei. Die Hülle ist mit viralen Glykoprotein-

peplomeren besetzt und ruft die Immunreaktion des Wirtes hervor (FALKE et al. 1959;

STANNARD et al. 1987). Eines dieser Glykoproteine, das Epitop 15A, ist bei BKF-Viren

hochkonserviert. Von Plasmazellen gebildete Antikörper richten sich bei der Immunreaktion

des Wirtes gegen dieses Glykoprotein (LI et al. 1994).

Die folgenden Abbildungen zeigen eine schematische Darstellung eines Herpesvirus (Abbildung 2),

sowie ein Bild von Herpesviren unter dem Elektronenmikroskop (Abbildung 3).

Abbildung 2:

Herpesvirion, Skizze (BUTLER 2005)

Abbildung 3:

Herpesviren, Elektronenmikroskop (FENNER 2009)

2.2.4.1 Aufbau und Größe der DNS von Herpesviren

Die Länge des viralen Genoms ist abhängig von der Art des Herpesvirus und kann 124 bis 235

Kbp betragen. Die Anzahl der Basenpaare kann innerhalb einer Virusart in bis zu 10 Kbp variieren

(ROIZMAN et al. 1992). Die ds-DNS lässt sich in einen Abschnitt mit niedrigem G-C-Gehalt, L

(light) -DNS, und mehrere repetitive Abschnitte mit hohem G-C-Gehalt, H (heavy) -DNS, einteilen.

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Literaturübersicht

7

Der Abschnitt mit niedrigem G-C-Gehalt kodiert für über einhundert Proteine, die durch sich zum

Teil überlappende offene Leserahmen exprimiert werden (WAGNER 1999). Die repetitiven Se-

quenzen im Abschnitt mit hohem G-C-Gehalt sind für die Verpackung des Genoms notwendig

(STAMMINGER et al. 1987). Sie können auf sechs verschiedene Weisen angeordnet sein und sich

am Ende des DNS-Stranges befinden oder den kodierenden Abschnitt mit niedrigem G-C-Gehalt

unterbrechen (ROIZMAN et al. 1992).

2.2.4.2 Aufbau der DNS von BKF-Viren

Die DNS ist nur bei wenigen Herpesviren vollständig sequenziert, unter den BKF-Viren bisher nur

die DNS des AlHV-1 und des OvHV-2 (ENNSER et al. 1997; HART et al. 2007). Beim CpHV-2 und

MCFV-WTD konnten bisher nur Abschnitte der viralen DNS veröffentlicht werden. Dabei handelt

es sich um die Gene für das Glykoprotein B (LI et al. 2003b) und die DNS-Polymerase (LI et al.

2001b, KLEIBOEKER et al. 2002) vom CpHV-2 und MCFV-WTD sowie dem Gen für ein Packa-

ging Protein (MCFV-WTD, KLEIBOEKER et al. 2002) bzw. für eine Terminase (CpHV-2,

CHMIELEWICZ et al. 2001).

Das Genom vom AlHV-1 weist 70 ORF auf, von denen 61 signifikante Ähnlichkeiten mit ande-

ren Herpesviren haben. Die anderen neun ORF sind spezifisch für AlHV-1. Diese spezifischen

ORF sind vermutlich für die spezielle Symptomatik von BKF im Vergleich zu anderen, ebenfalls

von Herpesviren ausgelösten Krankheiten verantwortlich (COULTER et al. 2001).

Das Genom von OvHV-2 enthält 73 ORF, von denen 62 Homologien mit den ORF anderer Her-

pesviren und neun ORF Homologien mit den ORF vom AlHV-1 aufzeigen. Drei spezifische ORF

kommen nur beim OvHV-2 vor (HART et al. 2007).

Bei einigen ORF von AlHV-1 und OvHV-2 konnte ebenfalls ermittelt werden, für welche Protei-

ne sie kodieren (ENSSER et al. 1997). Hierbei handelt es sich um für das Virus wichtige Struktur-

proteine und Enzyme – z. B. DNS-Polymerase, Helikase, Primase, Origin-binding-Protein – welche

für die Nukleinsäuresynthese, den DNS-Metabolismus, die Vermehrung und Verbreitung des Virus

gebraucht werden. Interessanterweise bildet jedes Herpesvirus eine für sich spezifische Protease

und eine variable Anzahl an Proteinkinasen (ROIZMAN et al. 1992), so auch AlHV-1 und OvHV-2

(ENSSER et al. 1997).

2.2.4.3 ORF in der Diagnostik

Einige ORF sind evolutionär bei allen Herpesviren hochkonserviert und können mittels Polymera-

sekettenreaktion nachgewiesen zu werden. Für den Nachweis von viraler DNS in mit BKF-Viren

infiziertem Gewebe eignen sich unter anderem:

- ORF 75, welcher für ein Tegumentprotein kodiert (BAXTER et al. 1993; CHMIELEWICZ

et al. 2001) und

- ORF 8, welcher für das Glykoprotein b auf der Virushülle kodiert (DUNOWSKA et al.

2001).

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Literaturübersicht

8

Momentan ist allerdings der ORF 9 für die Diagnostik von BKF von größter Bedeutung. Der ORF 9

kodiert für die DNS-Polymerase (ENNSER et al. 1997; VAN DEVANTER et al. 1996; ROVNAK et

al. 1998) und wurde bereits bei vielen verschiedenen Herpesviren sequenziert und in der internati-

onalen Datenbank ‚GenBank’ des National Center for Biotechnology Information (NCBI) erfasst.

VAN DEVANTER et al. (1996) entwickelten eine Consensus PCR (cPCR), die auf der Erkennung

und Vervielfältigung des DNS-Polymerase-Gens im OFR 9 basiert. Durch diese cPCR lassen sich

bis dato unbekannte Herpesviren identifizieren. Diese können anschließend sequenziert und einer

der drei Herpesvirenfamilien zugeordnet werden. Für die endgültige phylogenetische Einteilung der

Viren in Form eines Stammbaums sind diese Methoden jedoch noch zu ungenau, da jeweils nur

ein kleiner Teil der viralen DNS nachgewiesen wird (MC GEOCH und COOK 1994).

2.3 Übertragung von BKF-Viren

Über die genauen Übertragungswege der BKF-Viren ist noch wenig bekannt. Sie wurden bisher

beim AlHV-1, OvHV-2 und CpHV-2 genauer untersucht, wenngleich die Informationen keinesfalls

vollständig genug sind, um ein komplettes Bild von den möglichen Übertragungswegen zu erhalten.

Die Tabellen 1 und 2 liefern zwar einen Überblick über weitere bisher bekannte BKF-Viren und

deren Reservoirwirte, ob und unter welchen Bedingungen diese Reservoirwirte aber Virus aus-

scheiden und somit empfängliche Tierarten gefährden, ist noch nicht bekannt. Unterschiedliche

Inkubationszeiten erschweren die Erforschung der Übertragungswege. Es kann vorkommen, dass

ein Fehlwirt an BKF erkrankt, die Infektion aber so weit zurückliegt, dass weder der Reservoirwirt

noch der Übertragungsweg eindeutig identifiziert werden können (MÜLLER-DOBLIES et al. 1998).

2.3.1 Übertragung von AlHV-1 unter Gnus

Gnukälber (Connochaetes sp.) können bereits intrauterin im Zuge der peripartalen Immunsuppres-

sion des Muttertieres infiziert werden (PLOWRIGHT 1965a, 1965b; CASTRO et al. 1984). Nach

der Geburt erfolgt die Infektion horizontal durch Nasen- und Augensekrete anderer, meist unter

vier Monate alter Kälber. Dies wurde durch den Nachweis von AlHV-1 mittels In-situ-Hybridisierung

(ISH) in Lungenalveolen bei Kälbern von Streifengnus (Connochaetes taurinus) (MICHEL et al.

1993) sowie in Nasen- und Augensekret von gesunden Gnukälbern (MUSHI et al. 1980a, 1980b)

untermauert. In Speichel und Urin von Gnukälbern konnte hingegen kein AlHV-1 nachgewiesen

werden (MUSHI et al. 1980a).

Bei über vier Monate alten Kälbern sinkt die Anzahl der zellfreien Viren im Sekret und steigt

später nur noch bei Gnus, die hochgradig durch Gravidität, hohe Temperaturen oder Gefangen-

schaft gestresst sind (PLOWRIGHT 1986; RWEYEMAMU et al. 1974). Die auffallende Saisonalität

von gnuassoziierten BKF Fällen ist wahrscheinlich durch die Kalbesaison der Gnus bedingt

(BARNARD et al. 1989).

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Literaturübersicht

9

2.3.1.1 Übertragung von AlHV-1 auf Fehlwirte

Mit dem aus einem Gnu isolierten Virus ist es gelungen, experimentell per Aerosol Rinder zu infi-

zieren. Eine horizontale Übertragung des Virus von diesen Rindern auf weitere Artgenossen fand

aber nicht statt, obwohl im Nasensekret und im Speichel der Rinder virale DNS nachgewiesen

wurde. Die Vermutung liegt daher nahe, dass Fehlwirte ungenügend zellfreies Virus ausscheiden,

oder dass das ausgeschiedene Virus nicht stabil genug ist, um Artgenossen zu infizieren

(KALUNDA et al. 1981a). Dagegen ist die Übertragung von AlHV-1 von Rind zu Rind mit infizier-

tem Blut oder Gewebe experimentell gelungen, natürlicherweise findet die Übertragung von Rind

zu Rind über den Blutweg aber nicht oder extrem selten – und dann transplazentar – statt

(PLOWRIGHT 1972).

Da auch über eine Übertragung von AlHV-1 von Gnus auf Rinder über eine größere Entfernung

berichtet wurde, kann man die Übertragung durch Vektoren nicht ausschließen (BARNARD 1984).

Für BKF empfängliche Wildwiederkäuer in zoologischen Gärten erkrankten ebenfalls durch

AlHV-1 an BKF2. Meist handelte es sich hierbei um Zootiere, die in der Nähe von Gnus gehalten

wurden. Allerdings wurde bisher nicht von BKF Fällen bei empfänglichen Wildwiederkäuern in der

Wildbahn berichtet (BARNARD et al. 1994).

2.3.1.2 Übertragung von OvHV-2 unter Schafen

OvHV-2 wird unter Schafen hauptsächlich respiratorisch und sexuell übertragen (ACKERMANN

2005; HÜSSY et al. 2002; LI et al. 2001a). Große Mengen viraler DNS wurden außerdem im

Dünndarm von latent infizierten Schafen gefunden (HÜSSY et al. 2002). Eine Infektion über die

Fäzes kann somit nicht ausgeschlossen werden, obwohl OvHV-2 bisher nicht in Kotproben nach-

gewiesen wurde. Ein Bericht über durch OvHV-2 erkrankte Rentiere festigt diese These. Diese

Rentiere hielten sich nachts in einem Gehege auf, zu dem tagsüber Lämmer Zugang hatten. Es

bestand kein direkter Kontakt zwischen den beiden Tierarten, dennoch wurden die Rentiere infi-

ziert, möglicherweise durch den Kot der Lämmer (KIUPEL et al. 2004).

Lämmer scheinen ohnehin eine übergeordnete Rolle bei der Verbreitung von OvHV-2 zu spie-

len. Im Alter von sechs bis neun Monaten erreicht die Virusausscheidung über das Nasensekret

ihren Höhepunkt (LI et al. 2004). Die Ausscheidung erfolgt phasenweise. Eine Phase dauert weni-

ger als 24 Stunden. In dieser Zeit lassen sich ein signifikanter Anstieg und ein darauf folgender

Abfall der Virusmenge im Nasensekret nachweisen. Lämmer durchlaufen innerhalb von drei Mona-

ten mindestens eine Ausscheidungsphase, adulte Schafe scheiden weniger häufig OvHV-2 aus (LI

et al. 2004). Die intermittierende Virusausscheidung ist eine mögliche Erklärung für das sporadi-

sche Auftreten von BKF mit unterschiedlichen Inkubationszeiten innerhalb einer Herde von Fehl-

wirten (LI et al. 2001a). Auch im Augensekret von Schafen wurde OvHV-2 nachgewiesen. Ein

deutlicher Anstieg und Abfall der Virusmenge während einer Ausscheidungsphase bestand aber

nicht (LI et al. 2004).

Noch bevor virale DNS im Nasen- und auch im Augensekret nachweisbar ist, kann sie mittels PCR

in Leukozyten nachgewiesen werden (HÜSSY et al. 2002). Die Zeit zwischen der Infektion und

2 siehe Tabelle 2, Anhang

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Literaturübersicht

10

dem ersten Auftreten von viraler DNS im Blut scheint direkt von der Infektionsdosis, der die Tiere

ausgesetzt waren, abhängig zu sein (TAUS et al. 2005).

Die Infektion über infizierte Muttermilch oder Kolostrum wie auch die diaplazentare sind theore-

tisch möglich, allerdings konnten in entsprechenden Proben keine signifikanten Mengen an infekti-

ösem Virus nachgewiesen werden. Diese Übertragungswege spielen daher eine untergeordnete

Rolle (LI et al. 2004; HÜSSY et al. 2002).

Schafe jeden Alters können sich bei ihren Artgenossen infizieren und das Virus horizontal durch

Kontakt oder Aerosol verbreiten. Die Infektion findet jedoch selten vor dem zweiten bis dritten Le-

bensmonat statt (LI et al. 1999a; WANI et al. 2006).

2.3.1.3 Übertragung von OvHV-2 auf Fehlwirte

Fehlwirte, darunter viele Wildwiederkäuer, werden wahrscheinlich ebenfalls durch das Nasensek-

ret von Virus ausscheidenden Schafen infiziert (HÜSSY et al. 2002; LI et al. 2006a; ALBINI et al.

2003), wobei sowohl das Alter als auch die Anzahl der infizierten Schafe einen Einfluss auf den

Infektionsdruck der empfänglichen Tiere haben (LI et al. 2006a).

Da BKF auch ohne Kontakt zu Schafen bei empfänglichen Spezies auftrat, wird über einen indi-

rekten Übertragungsweg, womöglich durch Vektoren, spekuliert (BARNARD et al. 1989). Auch die

Übertragung von OvHV-2 via Aerosol über große Distanzen von bis zu fünf Kilometern hinweg wird

für möglich gehalten (IMAI et al. 2001; LI et al. 2006a; LI et al. 2008). Weiteren Einfluss könnten

mechanische Übertragungswege wie Fahrzeuge, außerdem gemeinsame Wasserquellen und kli-

matische Bedingungen haben (LI et al. 2006a).

Zur Saisonalität gibt es keine aussagekräftigen Beobachtungen. Es existieren Berichte über ge-

häuftes Auftreten von BKF im Sommer und Herbst, einige Monate nach der Ablammzeit von Scha-

fen (CRAWFORD et al. 1999), im Frühjahr (MÜLLER-DOBLIES et al. 2001a) sowie ganzjährig (LI

et al. 2001a).

2.3.1.4 Übertragung anderer BKF-Viren

CpHV-2 wird wahrscheinlich hauptsächlich durch Nasensekrete auf andere Ziegen und Fehlwirte

übertragen. Hierbei besteht ein Zusammenhang zwischen dem Alter der Ziegen und der Inkubati-

onszeit. Einen Hinweis darauf gibt die Nachweisbarkeit viraler DNS im Blut: Bei adulten Ziegen ist

das Virus schon 14 Wochen post infectionem im Blut nachweisbar, bei Jungtieren erst nach 40

Wochen. Unklar ist jedoch, ob dies ausschließlich mit dem Alter der Tiere zusammenhängt, oder

ob die Infektionsdosen, denen die Tiere ausgesetzt waren, unterschiedlich hoch waren. Ein weite-

rer Grund für die unterschiedlichen Inkubationszeiten könnte sein, dass bei Jungtieren eventuell

maternale Antikörper vorhanden waren, die zu einer verlängerten Inkubationszeit führten. Eine

transplazentare Übertragung bei Ziegen konnte bisher nicht nachgewiesen werden (LI et al.

2005b). Das CpHV-2 hat bisher bei Sika- und Weißwedelhirschen zu BKF geführt (CRAWFORD et

al. 2002; KEEL et al. 2003; LI et al. 2003b).

Das bei Jackson Kuhantilopen nachgewiesene AlHV-2-ähnliche Virus wird höchstwahrscheinlich

ebenfalls über Nasensekret verbreitet (KLIEFORTH et al. 2002).

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Literaturübersicht

11

Wie beim AlHV-1 und OvHV-2 könnten auch bei anderen BKF-Viren mechanische Übertragungs-

wege eine Rolle spielen (LI et al. 2006a).

2.3.1.5 Übertragung von BKF-Viren unter Fehlwirten

Fehlwirte können BKF-Viren wahrscheinlich nicht weiterverbreiten (ACKERMANN 2006; REID et al.

1986; FRÖLICH et al. 1998; LI et al. 2006a). Rinder und auch Sitatungas, welche sich von der

Krankheit erholten, blieben zwar persistent mit OvHV-2 infiziert, weitere Fälle bei Herdenmitglie-

dern traten aber nicht auf (BAXTER et al. 1993; O´TOOLE et al. 1997; FLACH et al. 2002). Das

liegt laut KLEIBOEKER et al. (2002) vermutlich daran, dass Fehlwirte keine ausreichenden Men-

gen an zellfreiem, infektiösem Virus ausscheiden, um Herdenmitglieder zu infizieren, oder dass

das ausgeschiedene Virus nicht stabil genug ist (KALUNDA et al. 1981a, b).

Hingegen haben ALBINI et al. (2003) bei erkrankten Schweinen auf der Nasenschleimhaut vira-

le DNS nachgewiesen und schließen nicht aus, dass Schweine OvHV-2 auf ihre Artgenossen

übertragen können. Dagegen spricht allerdings auch hier das nur sporadische Auftreten der Krank-

heit.

LI et al. (2001a) stellten fest, dass auch Ziegen OvHV-2 inapparent beherbergen können. Ob

sie aber auch infektiöses Virus ausscheiden, ist ungewiss. Eine Übertragung von OvHV-2 unter

Ziegen findet aber wahrscheinlich nicht statt (LI et al. 2005b).

2.3.2 Vorgänge in der Wirtszelle

Das Verhalten des Virus in der Wirtszelle scheint bei Reservoir- und Fehlwirten unterschiedlich zu

sein, weshalb erstere nicht erkranken, letztere aber fast immer der Krankheit erliegen

(ACKERMANN 2006). Aus mehreren Gründen ist über die Vorgänge in infizierten Zellen noch we-

nig bekannt (DEWALS et al. 2006; THONUR et al. 2007):

Von den BKF-Viren konnte bisher nur das AlHV-1 in Zellkultur vermehrt werden (PLOWRIGHT

et al. 1975). Nach mehreren Passagen verliert es allerdings durch Genomumstrukturierung seine

Virulenz, wodurch die Erforschung der Pathogenese erschwert wird (WRIGHT et al. 2003).

DEWALS et al. (2006) ist es allerdings kürzlich gelungen, AlHV-1 so zu klonen, dass es seine Viru-

lenz in Zellkultur aufrechterhält, wodurch weitere Forschungen zur Pathogenese von BKF möglich

werden.

OvHV-2 kann durch die Vermehrung infizierter T-Lymphozyten aus Fehlwirten angezüchtet

werden. Es ist jedoch noch nicht gelungen, es wie AlHV-1 in Zellkultur zu vermehren (SCHOCK

und REID 1996; SWA et al. 2001).

Dennoch wird davon ausgegangen, dass das Verhalten der verschiedenen Gammaherpesviren

sehr ähnlich ist, sobald sie ihre Zielzellen erreicht haben, und man kann so einige Ergebnisse zur

Pathogeneseforschung über andere Gammaherpesviren auf BKF-Viren übertragen (ACKERMANN

2006).

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Literaturübersicht

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2.3.2.1 Verhalten von BKF-Viren im Reservoirwirt

Über das Verhalten von OvHV-2 im Reservoirwirt ist momentan am meisten bekannt. Nachdem

das OvHV-2 in die Zielzellen des Reservoirwirtes – CD4+- und CD8+-T-Zellen sowie B-

Lymphozyten – gelangt ist, geht es in das latente Stadium über (ACKERMANN 2006; HÜSSY et al.

2002; BAXTER et al. 1997). Im latenten Stadium zirkularisiert das virale Genom. Dieser Mecha-

nismus scheint bei Viren allgemein sehr verbreitet zu sein und dient vermutlich der DNS zum

Schutz vor eukaryotischen Exonukleasen. Wie genau die Zirkularisierung vonstatten geht, ist noch

unbekannt (ROIZMAN et al. 1992; PFOFFENBERGER et al. 1985; ROIZMAN 1985). Während der

Latenz werden nur wenige Gene exprimiert. Die Proteine, für die sie kodieren, sichern unter ande-

rem das Überleben der infizierten Zelle und modulieren die Immunantwort des Wirtes (FIELD et al.

2003). Vermutlich kann das Virus die Antigenprozessierung in der Reservoirwirtszelle unterdrü-

cken, wodurch die Antigene nicht durch den Haupthistokompatibilitätskomplex I (MHC+) präsen-

tiert werden. Die infizierte Zelle wird von den CD 8+ Zellen nicht zerstört (BRAATEN et al. 2005).

Vermutlich wechselt das Virus dann zu einem geeigneten Zeitpunkt, gefördert durch noch un-

bekannte Mechanismen, von den Lymphzellen in die Schleimhautepithelzellen über. Dort repliziert

es sich und wird schließlich als infektiöses Virus ausgeschieden (LI et al. 2004). Wahrscheinlich

kann es aber nicht von einer Epithelzelle aus die nächste infizieren, wodurch der Epithelschaden

beim Reservoirwirt gering ist (LI et al. 2004). Die in dieser Phase ablaufenden immunologischen

Prozesse dämmen die lokale Infektion schließlich wieder ein, vermögen aber nicht, die latent infi-

zierten Zellen zu beseitigen. Dadurch kommt es vermutlich zu der beobachteten phasenweisen

Ausscheidung (BRAATEN et al. 2005; LI et al. 2004).

AlHV-1 infiziert ebenfalls CD4+- und CD8+-T-Zellen latent. Eine Zirkularisierung des Genoms

wurde bisher nicht gezeigt (DEWALS et al. 2008), ist aber wahrscheinlich (ACKERMANN 2006).

Ob AlHV-1 wie OvHV-2 beim Wechsel zwischen dem latenten ins lytische Stadium ebenfalls die

Zellart wechselt, bleibt zu erforschen.

2.3.2.2 Verhalten von BKF-Viren im Fehlwirt

Die Mechanismen, mit denen das Virus beim Fehlwirt die schweren Epithel- und Gefäßläsionen

sowie die Lymphzellproliferation auslöst, sind noch nicht ausreichend geklärt. Mehrere Untersu-

chungen zu diesem Thema wurden im Tierversuch mit AlHV-1 durchgeführt.

In T-Lymphozyten konnte dabei vermehrt lineare DNS – typisch für das lytische Stadium des Vi-

rus – nachgewiesen werden (ROSBOTTOM et al. 2002). CD8+-Lymphozyten wurden mit der

Vaskulitis in Verbindung gebracht und werden teilweise selbst infiziert (SIMON et al. 2003; ELLIS

et al. 1992). Durch die Immunantwort des Wirtes gegen diese infizierten, proliferierenden T-Zellen

sowie durch die eigene Zytotoxizität kommt es schließlich zu den Gewebeschäden (DEWALS et al.

2008).

Im lytischen Stadium in den Zellen des Fehlwirtes werden andere Gene exprimiert als im latenten

Stadium im Reservoirwirt. Es handelt sich hierbei vor allem um virusspezifische Gene. Wie genau

dies mit der Pathologie von BKF zusammenhängt, ist noch unbekannt (THONUR et al. 2007).

OEHMIG (2004) hat bei anderen Gammaherpesviren festgestellt, dass sie sich seltener in der

lytischen als in der latenten Phase befinden, und dass eine Erkrankung eher durch Viren im lyti-

schen Stadium zu befürchten ist.

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Literaturübersicht

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2.3.3 Anfälligkeit für klinisches BKF bei Fehlwirten

Die Anfälligkeit, an BKF zu erkranken, variiert unter den Fehlwirten. Als nicht anfällig gelten Tiere,

die seropositiv, aber klinisch unauffällig waren (TRAUL et al. 2007a).

Rinder scheinen generell nicht so leicht zu erkranken wie Bisons (Bison sp.) oder Hirsche, die

Mortalität ist geringer, der Krankheitsverlauf häufig chronisch und die Rate der Rekonvaleszenz ist

höher (CRAWFORD et al. 2002; O´TOOLE et al. 1997). Bei Rindern, gelegentlich aber auch bei

den empfindlicheren Bisons sowie bei Sitatungas, kommen asymptomatische Infektionen vor. Das

Balirind als exotische Rinderrasse ist sehr anfällig, verglichen mit den europäischen Rassen (LI et

al. 2006a; FLACH et al. 2002).

Unter den Zerviden ist die Anfälligkeit unterschiedlich. Sehr empfänglich sind Milus (Elaphurus

davidianus), Weißwedel- (Odocoileus virginianus) Axis- (Axis axis) (LI et al. 2000), Sika- (Cervus

nippon) und Sambarhirsche (Cervus unicolor) (FRÖLICH et al. 1998), mittelgradig empfänglich

sind dagegen Rothirsche (Cervus elaphus) und Elche (Cervus canadensis) (MACKINTOSH 1993).

Relativ resistent sind Damhirsche (Dama dama) (CRAWFORD et al. 2002; MACKINTOSH 1992).

Die experimentelle Übertragung von außergewöhnlich hohen Dosen OvHV-2 auf Schafe indu-

zierte auch bei dieser Tierart die typische Symptomatik des BKF (LI et al. 2005c).

Die variierende Empfänglichkeit gegenüber der Krankheit äußert sich durch: 1. variable Inkubationszeiten,

2. unterschiedlich lange Krankheitsverläufe und

3. unterschiedlich schwere bis gar keine Symptomatik (LI et al. 2006a).

Die Gründe für diese Variationen sind unbekannt. Es kann zum einen an der unterschiedlichen

Virulenze der verschiedenen Viren liegen, zum anderen kann es genetisch bedingt sein, dass eine

Tierart empfänglicher ist als die andere (LI et al. 2000; CRAWFORD et al. 2002). Der MHC spielt

bei der Empfänglichkeit für BKF, wie auch für andere Infektionskrankheiten, wahrscheinlich eben-

falls eine Rolle (TRAUL et al. 2007a).

Zudem begünstigen weitere Faktoren vermutlich den Ausbruch von BKF bei Fehlwirten: 1. die während einer Trächtigkeit teilweise herabgesetzte Immunantwort (SYRJÄLA et al. 2006),

2. die Menge der vom Reservoirwirt ausgeschiedenen Viren (LI et al. 2006a; KALUNDA et al.

(1981b),

3. der Abstand zwischen Reservoir- und Fehlwirt (LI et al. 2006a),

4. Umweltverhältnisse (KLEIBOEKER et al. 2002) und

5. Vorerkrankungen (LI et al. 1999b).

Die bei den Fehlwirten hervorgerufene Symptomatik ist dennoch sehr ähnlich3. Das Alter der

Fehlwirte scheint keinen Einfluss auf den zeitlichen Verlauf der Krankheit von drei bis 23 Tagen zu

haben (KALUNDA et al. 1981a).

3 siehe 2.4 Symptome

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Literaturübersicht

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2.4 Symptome

2.4.1 Klinik

BKF äußert sich in verschiedenen Verlaufsformen. Je nach Verlaufsform zeigen sich bei den ver-

schiedenen Fehlwirten weitgehend ähnliche Symptome, die für sich genommen aber nicht pa-

thognomisch sind (LIGGITT und DE MARTINI 1980). Die Einteilung in vier verschiedene Verlaufs-

formen basiert auf den Beobachtungen bei Rindern, bei denen BKF erstmals beschrieben wurde

(GÖTZE 1930). Die folgenden Symptombeschreibungen beziehen sich daher hauptsächlich auf

Befunde bei dieser Tierart, sie können aber wahrscheinlich bei allen BKF-anfälligen Tierarten in

unterschiedlicher Ausprägung gefunden werden. Die Formen sind manchmal schwer von einander

abzugrenzen, da sich die Symptomatik überschneiden kann (ROSENBERGER et al. 1994; DAVID

et al. 2005; MULUNEH et al. 1993). Meist erkranken nur einzelne Tiere einer Herde. Dennoch gibt

es bei allen Tierarten immer wieder Berichte, bei denen die gesamte Herde erkrankte (BEDELIAN

et al. 2007; BRENNER et al. 2002; BROWN und BLOSS 1992; HÄNICHEN et al. 1998; HATKIN

1980; LI et al. 2006a; ORR et al. 1988; TOMKINS et al. 1997).

Die am häufigsten auftretende Kopf-Augen Form wird von der perakuten, der intestinalen und

der abortiven Form abgegrenzt. Es gibt außerdem Berichte von chronischen Verlaufsformen bei

Rindern und Bisons (O´TOOLE et al. 1997; SCHULTHEISS et al. 1998) und Hautformen

(CRAWFORD et al. 2002; DAVID et al. 2005). Außerdem kommen subakute und chronische

Krankheitsverläufe gelegentlich bei Hirschen und Schweinen (Sus sp.) vor (WILSON et. al 1983,

KEEL et al. 2003; LØKEN et al. 1998; ALBINI et al. 2003), hier sind aber in der Regel kürzere Ver-

läufe typisch (CRAWFORD et. al 2002). Der Ausgang aller Formen ist fast immer tödlich. Es gibt

aber auch Berichte von Tieren, z. B. Rindern, Bisons und Schweinen, welche die Krankheit über-

lebt haben (O`TOOLE et al. 1997; LI et al. 2006a; SYRJÄLÄ et al. 2006).

2.4.1.1 Kopf-Augen Form

Nach einer Inkubationszeit von zwei Wochen bis zehn Monaten treten die ersten Symptome auf

und entwickeln sich allmählich (GÖTZE et al. 1930; MÜLLER-DOBLIES et al. 1998; SELMAN et al.

1978). In den ersten zwei bis sieben Tagen erhöht sich die Körpertemperatur auf 40°C bis 42°C

und hält sich über mehrere Tage. Muskelzittern, Fressunlust und starker Durst kommen hinzu. Das

Wiederkauen wird eingestellt. Die Tiere speicheln und schmatzen (ROSENBERGER et al. 1994).

Es ist ein serös-schleimiger, weißlich trüber, später kruppöser, rötlicher und schließlich eitrig-

gelber Nasenausfluss sichtbar. Die Nasenschleimhaut ist gerötet und teils verkrustet. Die Maul-

schleimhaut ist ebenfalls hyperämisch und ödematös. In der Maulhöhle sind häufig unregelmäßig

begrenzte, oberflächliche Schleimhautdefekte zu sehen, auch Petechien oder stecknadelkopfgro-

ße Bläschen kommen vor. Diese Bereiche werden bald nekrotisch (KALUNDA et al. 1981a).

Beidseitige Veränderungen der Augen treten auf. Zuerst ist muköser Augenausfluss zu sehen,

der später eitrig wird und dann verkrustende Sekretstraßen bildet. Konjunktivitis mit stark injizierten

Episkleralgefäßen kommt vor. Die Augenlider sind geschwollen und die Tiere zeigen eine Photo-

phobie (KALUNDA et al. 1981a). Nach fünf bis sechs Tagen kommen Keratitis, Iridozyklitis und

Korneatrübung bis hin zu Erblindung hinzu (LEUPOLD et al. 1989). DAVID et al. (2005) berichten

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Literaturübersicht

15

zudem von Exophthalmus. Bei Weißwedelhirschen kamen periokuläre und nasale Epithelerosio-

nen, aber keine Korneatrübung vor (LI et al. 2000).

Infolge der durch Schleim verlegten Atemwege kommt es zur Dyspnoe. Der Atem hat einen üb-

len Geruch (MULUNEH et al. 1993). Einige Tiere zeigten auch ein submandibuläres Ödem

(KALUNDA et al. 1981a).

Häufig sind durch eine Enzephalitis bedingte zentralnervöse Störungen wie schwere Depressi-

on, Erregung, Zwangsbewegungen (ROSENBERGER et al. 1994), Paralyse der Halsmuskulatur,

Inkoordination, Nystagmus (KALUNDA et al. 1981a), Ataxien bis hin zum Festliegen und Hype-

rästhesien (ALBINI et al. 2003) zu beobachten. Bei Ziegen kam es zu tonisch-klonischen Krämpfen,

Tremor und Desorientierung (JACOBSEN et al. 2007).

Häufig kommt Diarrhoe hinzu, die sich mit Kotverhalten abwechselt. Die Scheidenvorhof-

schleimhaut ist stets mehr oder weniger stark gerötet und verdickt (DECURTINS 1940). Eine Hä-

maturie kann auftreten (MÜLLER-DOBLIES et al. 2001b; SYRJÄLÄ et al. 2006).

Die Lymphknoten sind mittel- bis hochgradig geschwollen. Beim chronischen Verlauf der

Krankheit können die Lymphknoten wieder abschwellen (KALUNDA et al. 1981a). Der Tod tritt

innerhalb von zehn (ROSENBERGER et al. 1994) bzw. 25 bis 50 Tagen (KALUNDA et al. 1981a;

LI et al. 2000) ein. Schweine mit der Kopf-Augen Form verendeten bereits innerhalb von 24 Stun-

den (SYRJÄLÄ et al. 2006), Mähnenspringer nach einer Woche (YERUHAM et al. 2004).

2.4.1.2 Perakute Form

Diese Form verläuft zu Beginn ähnlich wie die Kopf-Augen Form mit hohem Fieber und schlechtem

Allgemeinbefinden. Die Episkleralgefäße sind injiziert. Der Kot ist mitunter wässrig, übel riechend

und blutig. Fibrilläres Muskelzittern tritt auf. Der Kreislaufzustand verschlechtert sich rapide und die

Atemfrequenz steigt stark an. Die Tiere sterben am ersten bis dritten Tag nach Beginn der Krank-

heit (KALUNDA et al. 1981a; LI et al. 1999b; LI et al. 2006; KIUPEL et al. 2004). Ausgeprägte

Schleimhautveränderungen zeigen sich dann noch nicht. Es kommt vor, dass Tiere noch vor dem

Auftreten ausgeprägter Symptome verenden (REID et al. 1989; CRAWFORD et. al 2002; LI et al.

1999b). Bei akuten und perakuten Fällen kann es außerdem vorkommen, dass die Tiere bei der

Sektion nur untypische Läsionen aufweisen (LØKEN et al. 1998).

Bei Hirschen wurde beobachtet, dass die perakute Form häufiger auftritt als die Kopf-Augen

Form (HEUSCHELE 1988).

2.4.1.3 Intestinale Form

Diese Form zeichnet sich durch ihren akuten Verlauf mit starkem, wässrigem, übel riechendem, oft

hämorrhagischem Durchfall aus. Die Maulschleimhaut und die Konjunktiven sind diffus gerötet. Es

kommt zu Tränenfluss und Lichtscheu. Gelegentlich ist die Nasenschleimhaut gerötet und es ent-

steht schleimiger Nasenausfluss (HEUSCHELE 1988). Die palpierbaren Lymphknoten können

leicht vergrößert sein. Nach vier bis neun Tagen sterben die Tiere.

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Literaturübersicht

16

2.4.1.4 Abortive Form

Diese Form verläuft vergleichsweise harmlos. MULUNEH et al. (1993) berichten lediglich von ei-

nem leichten Anstieg der Körpertemperatur. Beim abortierten Fetus einer Giraffe war in Brust- und

Bauchhöhle blutiges Sekret zu sehen (POL et al. 1993). Schweine, die aufgrund einer BKF-

Erkrankung abortierten, erholten sich und zeigten auch ohne Behandlung keine weiteren Sympto-

me (SYRJÄLÄ et al. 2006).

2.4.1.5 Hautform

Diese chronische, ebenfalls letal verlaufende Form wurde bei Sikahirschen und Rindern beobach-

tet (CRAWFORD et al. 2002; DAVID et al. 2005). An der wenig behaarten Haut, wie am Hornan-

satz, am Interdigitalspalt, an Zitzen und Hoden, treten zunächst kleinfleckige Rötungen auf. Später

entstehen meist einzeln an den Zitzen, am Euter und an den Schenkelinnenfläche flache, klein-

knopfgroße Papeln mit eintrocknendem Zentrum (CRAWFORD et al. 2002). Eine exsudative Der-

matitis mit haarlosen Stellen wurde von DAVID et al. (2005) beobachtet und breitete sich über den

gesamten Körper aus. Die Haut wurde bräunlich und trocken. Dazu kamen mehrere kleine Ulzera-

tionen an Zunge und Nasenschleimhaut.

2.4.1.6 Leichtere Formen

Neben den schweren Fällen können auch leichtere Erkrankungen vorkommen, bei denen die klini-

schen Erscheinungen weniger kennzeichnend sind. Diese beschränken sich dann oft auf ein bis

zwei Tage anhaltendes Fieber mit geringgradiger katarrhalischer Entzündung und Hyperämie der

Augen-, Nasen- und Maulschleimhaut. Außerdem können hierbei Erytheme und leichte Schwel-

lungen der Haut mit nachfolgendem, länger anhaltendem, schuppendem Exanthem vorkommen.

Allgemeinbefinden und Fresslust der Tiere sind nur mäßig gestört. Diese Fälle gehen nach drei bis

neun Tagen fast immer in Heilung über (KALUNDA et al. 1981a; O´TOOLE et al. 1997). Genesene

Tiere bleiben lange Zeit, wenn nicht sogar lebenslang, immun (O´TOOLE et al. 1997).

2.4.2 Pathologisch-anatomische Befunde

Bei allen Formen fällt eine leichte Leber- und Milzschwellung auf. Die Lymphknoten, besonders die

Mesenteriallymphknoten, sind aufgrund von Ansammlungen mononukleärer Zellen fast regelmäßig

geschwollen und ödematös (KALUNDA et al. 1981a).

Bei der Kopf-Augen Form sind die Befunde sehr deutlich. Die starken inflammatorischen Ver-

änderungen der Nasen- und Maulschleimhaut sowie der Konjunktiven entsprechen den klinischen

Symptomen (s.o.). Es kann auch zu Blutungen aus Maul- und Nasennebenhöhlen und am Augen-

lid kommen (POL et al. 1993). Erhebliche entzündliche Auflockerung der Rachenschleimhaut,

Herzmuskeldegeneration und gelegentlich Zystitis kommen vor. Ödeme und Petechien in Trachea

und Lunge treten auf (YERUHAM et al. 2004).

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Literaturübersicht

17

Bei der perakuten Form sind bis auf die oben genannten klinischen Erscheinungen nur wenige

Veränderungen wie partielle Darmentzündungen, Herzmuskelentartungen und geringgradiger Ka-

tarrh der Kopfschleimhäute zu sehen (KALUNDA et al. 1981a). Von Belägen auf der Maulschleim-

haut und dem Pharynx bei Schweinen berichten ALBINI et al. (2003).

Bei der intestinalen Form sieht man regelmäßig eine katarrhalische bis hämorrhagische

Gastroenteritis mit verdickter Darmwand (POL et al. 1993; SCHENZ et al. 2000). Gelegentlich las-

sen sich auch eine Blasenentzündung sowie eine geringgradige katarrhalische Inflammation der

Kopf- und Scheidenschleimhäute beobachten (HÄNICHEN et al. 1998; ROSENBERGER et al.

1994).

Die pathologisch-anatomischen Befunde der Hautform entsprechen den klinischen Symptomen.

Unabhängig von der Verlaufsform berichten KALUNDA et al. (1981) von Erosionen und Ulzera

im Labmagen bei 84%, Erosionen im Ösophagus bei 64%, Perikarditis bei 50% und Herde in den

Nieren bei 20 % der Tiere. Eine Verdickung der Darmwand kam vor.

Bei Giraffen fielen zudem eine pseudomembranöse Entzündung der Trachea und Blutungen

des Epi- und Endokards auf. Ähnliche Befunde kommen auch bei abortierten Feten vor (POL et al.

1993).

Bei Schweinen fallen außerdem meistens hyperämische Nieren sowie Aufhellung und intersti-

tielle Zeichnung des Leberparenchyms und bei Abortfällen eine hyperämische Uterusschleimhaut

auf (SYRJÄLÄ et al. 2006).

2.4.3 Histopathologische Befunde

Berichte von Lymphoproliferation, Vaskulitis und Perivaskulitis mit lymphozytärer Zellinfiltration in

den Gefäßen diverser Organe sind überall in der Literatur, auch bei perakuten Fällen, als histologi-

sche Hauptbefunde zu finden (LIGGITT und DE MARTINI 1980; LI et al. 2006a; KLEIBOEKER et

al. 2002). Die Vaskulitis kann in ihrem Erscheinungsbild variieren. Von lediglich geringgradiger

Hypertrophie des Endothels über Zerstörung der Lamina elastica interna (LI et al. 2000) oder der

Tunica media (KLEIBOEKER et al. 2002), bis hin zur proliferativen Arteriopathie, die diese Befun-

de vereint und zusätzlich eine Hypertrophie und Hyperplasie der Adventitia aufweist, wurde berich-

tet (LI et al. 2000). Bei Schweinen betraf die Vaskulitis vornehmlich die Media und Adventitia von

mittelgroßen und kleinen Arterien (LØKEN et al. 1998).

Je länger die Krankheit andauerte, desto fortgeschrittener war die Vaskulitis (KALUNDA et al.

1981a; POL et al. 1993). Sie kann in verschiedenen Organen vorkommen, u. a. im Respirations-,

Verdauungs- und Urogenitaltrakt. Bei Rentieren waren die Läsionen in Nieren, Ösophagus, Tra-

chea, Konjunktiva, Abomasum und Vagina besonders prominent (KIUPEL et al. 2004), bei Sikahir-

schen dagegen in Nieren und Netzmagen (CRAWFORD et al. 2002; KEEL et al. 2003). Auch in

der Skelettmuskulatur war die Vaskulitis nachweisbar (KLEIBOEKER et al. 2002). LI et al. (2000)

beobachteten verschiedene Grade von Vaskulitis und Perivaskulitis, fibrinoide arterielle Nekrose

und Gefäßthrombosen außerdem in Herz, Nebennieren, Leber, Milz, Hypophyse, Mesenterial-

lymphknoten und Schilddrüse. Bei Schweinen wurde die typische Vaskulitis auch in der Harnblase

und erstmals im Uterus gefunden (SYRJÄLÄ et al. 2006).

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Literaturübersicht

18

Bei keinem der von KLIEFORTH et al. (2002) untersuchten Atlashirsche war die typische Vaskulitis

nachzuweisen. Dies lag vermutlich daran, dass die Tiere bereits 48 Stunden nach Auftreten der

ersten Symptome euthanasiert wurden.

Die histopathologische Untersuchung der Nieren ergab eine Glomerulonephritis und eine multi-

fokale, interstitielle Nephritis (KALUNDA et al. 1981a). Viele mitotische Stadien von mononukleä-

ren Zellen waren sichtbar, typisch für eine lymphoproliferative Erkrankung. In den Gefäßen waren

venöse Thromben und Endothelproliferationen der Arterien zu sehen. Diese Nierenveränderungen

waren auch bei infizierten, klinisch noch unauffälligen Hirschen zu erkennen (LI et al. 2000).

Auch die Hirngefäße, besonders im Kleinhirn, zeigten eine mononukleäre Infiltration mit gleich-

zeitiger Meningoenzephalitis. Von einer stark ausgeprägten disseminierten, nichteitrigen Enzepha-

litis als regelmäßiger Befund berichten auch ROSENBERGER et al. (1994) und DAVID et al.

(2005). Bei Schweinen wurde eine Perivaskulitis der Meningen des Rückenmarks festgestellt

(ALBINI et al. 2003).

Die Sinusoide in Leber und Nebennieren waren bei Rindern zum Teil dilatiert (ROSENBERGER

et al. 1994). Bei Mähnenspringern, die an der Kopf-Augen Form litten, kamen Blutungen im Hoden

vor (YERUHAM et al. 2004).

KLEIBOEKER et al. (2002) beschreiben bei Weißwedelhirschen grau-weiße Knoten in Herz,

Niere und Leber, in denen in histologischen Schnitten Lymphozyten nachzuweisen waren.

KLIEFORTH et al. (2002) fielen bei Atlashirschen mit neutrophilen Granulozyten gefüllte Sinus

der Lymphknoten auf.

Bei der Hautform konnte eine diffuse Hyperkeratose mit neutrophiler und histiozytärer Infiltration,

vorwiegend in Schweißdrüsen und an den Haarwurzeln, festgestellt werden (CRAWFORD et al.

2002; DAVID et al. 2005).

2.5 Differentialdiagnosen

Als Differentialdiagnosen sind bei Wiederkäuern folgende Krankheiten in Betracht zu ziehen: Maul-

und Klauenseuche, Bovine Virusdiarrhoe, Rinderpest, Salmonellose, zu schwerer Enteritis führen-

de Vergiftungen (ROSENBERGER et al. 1994), Stomatitis vesiculosa (DIRKSEN 2002), Blauzun-

genkrankheit und Infektiöse Bovine Rhinotracheitis (BRENNER et al. 2002) wegen der erosiven

und ulzerierenden Veränderungen am Atmungs- bzw. Verdauungstrakt; Listeriose und Bovine

Spongiforme Enzephalopathie (MÜLLER-DOBLIES et al. 2001b) beim Auftreten zentralnervöser

Störungen; Infektiöse Keratokonjunktivitis (ROSENBERGER et al. 1994).

Beim Schwein kommen folgende Differentialdiagnosen in Frage: Europäische Schweinepest,

Aujeszky´sche Krankheit, Teschen-Talfan-Disease (Porcines Enterovirus Typ 1), Parvovirose

(ALBINI et al. 2003).

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Literaturübersicht

19

2.6 Nachweis von BKF

2.6.1 Gesamtdiagnose

Besteht der Verdacht einer BKF-Erkrankung bei einem Fehlwirt, sollte zunächst geklärt werden, ob

dieser mit einem Reservoirwirt Kontakt hatte. Zur Abklärung der Diagnose haben sich als intra vi-

tam Methoden die PCR (s.u.) und der CI-ELISA (s.u.) bewährt (CLARK et al. 1970; LI et al. 2000;

MÜLLER-DOBLIES et al. 1998; YERUHAM 2004). Das Differentialblutbild ist weniger geeignet, da

es stark variieren kann (s.u.). Bevor moderne Labormethoden etabliert waren, wurden zur

Diagnostik Kaninchen mit dem Blut des erkrankten Tieres infiziert (s.u.) (POL et al. 1993).

Die post mortem Diagnose erfolgt durch die histopathologische Untersuchung in Kombination

mit der PCR, da makroskopische Befunde häufig nicht eindeutig sind 4 . Auch die In-situ-

Hybridisierung und die Immunhistochemie (IHC) wurden zur Diagnostik herangezogen.

2.6.2 Polymerasekettenreaktion

2.6.2.1 Prinzip

Die PCR dient dazu, DNS Abschnitte zu vervielfältigen = amplifizieren. Ist ein Virus mit anderen

Methoden in einer Zelle nicht nachweisbar, weil es in zu geringen Mengen vorliegt, ermöglicht die-

se Methode, aus dem Originalstück der viralen DNS mehrere Kopien herzustellen und diese an-

schließend nachzuweisen. Voraussetzung ist, dass die Sequenz der viralen DNS bekannt ist. An-

hand dieser Sequenz wird ein Vorwärts- und ein Rückwärtsprimer synthetisiert, der aus bis zu 30

Nukleotiden besteht, die die selbe Reihenfolge aufweisen wie der Anfang bzw. das Ende der

nachzuweisenden DNS Stücke. Die Primer binden an die DNS Sequenz und geben so der DNS-

Polymerase das Signal zur Vervielfältigung des Abschnitts, der zwischen den Primern liegt.

Der Virusnachweis mittels PCR ist schon bei sehr geringen Mengen von viraler DNS in der Pro-

be möglich, sogar bereits in der Inkubationszeit und bis zu zwei Jahre nach dem Abklingen der

klinischen Symptome bei Fehlwirten (LI et al. 2005c; MÜLLER- DOBLIES et al. 1998).

2.6.2.2 nPCR und snPCR

Die nested5 bzw. semi-nested PCR (nPCR bzw. snPCR) dient dazu, die Spezifität und Sensitivität

der PCR zu erhöhen. Sie ist eine Kombination aus zwei aufeinander folgenden, kombinierten PCR-

Reaktionen. Die erste PCR-Reaktion wird wie oben beschrieben durchgeführt. Anschließend wird

das in dieser Reaktion entstandene Amplifikat in einer 2. Reaktion als Vorlage = Template genutzt.

In der 2. Reaktion werden neue Primer benutzt, basierend auf der neu erkannten Nukleotidse-

quenz, die innerhalb der Primerpositionen der 1. Reaktion liegen.

Die snPCR ist eine Modifikation der nPCR, bei der in der 2. Reaktionsrunde ein Primerpaar aus

einem Primer der 1. Runde und einem neuen „internen“ Primer verwendet wird.

4siehe 2.4.3 Histopathologische Befunde 5 nested= verschachtelt

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Literaturübersicht

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Für den Nachweis vom AlHV-1 und OvHV-2 wurde eine snPRC von HSU et al. (1990) bzw. von

BAXTER et al. (1993) entwickelt. Für AlHV-1 und AlHV-2 entwickelten KATZ et al. (1991) eine

nPCR. Diese Methode hat die Diagnostik von klinischen Fällen präziser und einfacher gemacht

(CRAWFORD et al. 1999; MÜLLER-DOBLIES et al. 1998; MURPHY et al. 1994; O´TOOLE et al.

2002). Die snPRC ist sehr spezifisch und sehr sensitiv und gilt daher als „Goldstandard“ zur Dia-

gnostik von BKF (BAXTER et al. 1993; MÜLLER-DOBLIES et al. 1998). Bereits in der Inkubations-

zeit und bis zu zwei Jahre nach dem Abklingen der klinischen Symptome konnte mittels PCR virale

DNS in Organmaterial nachgewiesen werden (LI et al. 2005c; MÜLLER-DOBLIES et al. 1998).

BAXTER et al. (1993) konnten mit der OHV-2 spezifischen PCR 35 Genomäquivalente nachwei-

sen. Die Spezifität ihrer Primer lag bei 94 bis 100 % (MÜLLER-DOBLIES et al. 1998).

Zur Identifikation von möglichen Reservoirwirten ist die snPCR ebenfalls geeignet, wobei jedoch

vorher bekannt sein muss, welches BKF-Virus nachgewiesen werden soll (LAHIJANI et al. 1994).

Die Kombination mit einem CI-ELISA zur serologischen Untersuchung ist von Vorteil (LI et al.

2003a).

2.6.2.3 cPCR

VAN DEVANTER et al. (1996) entwickelten eine cPCR, mit der bisher unbekannte Herpesviren

nachgewiesen werden können, die möglicherweise klinische Erkrankungen und latente Infektionen

auslösen (LI et al. 2000; LI et al. 2003a). Diese PCR wurde von ROVNAK et al. (1998) weiterent-

wickelt und für die Diagnostik von BKF-Viren etabliert. Anschließend an die PCR bietet sich eine

Sequenzierung der PCR Produkte an, um zu bestimmen, um welches BKF-Virus es sich sich han-

delt.

VAN DEVANTER et al. (1996) konnten mit ihrer cPCR virale DNS im Bereich von 100 Virusko-

pien pro 100 ng DNS detektieren.

Die cPCR ist eher durch Kontaminationen gefährdet als die nested- oder die Realtime-PCR (Rt-

PCR).

2.6.2.4 Rt-PCR nach CUNHA et al. (2009)

Eine deutliche Erleichterung der Diagnostik wurde durch die Entwicklung der Rt-PCR geschaffen.

Bei dieser Methode kann schon während der Reaktion festgestellt werden, ob sich die gesuchte

DNS in der Probe befindet. Für die PCR werden ein Vorwärts- und ein Rückwärtsprimer sowie je

eine Sonde für jede gesuchte Virusart verwendet. Die Sonden sind mit unterschiedlichen Farbstof-

fen markiert. Befindet sich eines der gefragten Viren in der Probe, bindet die Sonde zwischen den

beiden Primern. Während die Polymerase die DNS-Sequenz zwischen den Primern amplifiziert,

verdrängt sie die Sonde, der fluoreszierende Farbstoff wird frei und kann gemessen werden. Da

die Farbstoffe alle eine unterschiedliche Wellenlänge haben, lässt sich anhand der gemessenen

Wellenlänge auf den Farbstoff und damit auf die Sonde und das in der Probe vorhandende Virus

rückschließen.

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Literaturübersicht

21

Die Rt-PCR ist durch die speziellen Sonden sehr spezifisch und kann sogar 50 Viruskopien pro

100 ng DNS detektieren. Durch Verdünnungsreihen konnten CUNHA et al. (2009) eine Sensitivität

von 97,2% in Proben von klinisch erkrankten Tieren bestimmen.

Die Rt-PCR eignet sich daher für die Diagnostik klinischer Fälle (TRAUL et al. 2007b). Sie ist

weiterhin eine wertvolle Methode zur Erforschung des Ausscheidungsverhaltens und der Übertra-

gungsmechanismen, da sie über die Quantität der Viren in einer Probe Auskunft geben kann (LI et

al. 2004).

2.6.2.5 Probenmaterial für die PCR

Als Probenmaterial eignet sich die Leukozytenfraktion aus EDTA-Blut von Reservoir- und Fehl-

wirten (BAXTER et al. 1993; LI et al. 2000; MÜLLER-DOBLIES et al. 1998) sowie frische, ge-

frorene und paraffinfixierte Gewebeproben von Milz (LI et al. 2000; KLEIBOEKER et al. 2002) und

Lymphknoten (Ln. parotideus, Ln. mesenterialis, Ln. tracheobronchialis) (KLEIBOEKER et al. 2002;

SCHENZ et al. 2000; MÜLLER-DOBLIES et al. 2001b) erkrankter Fehlwirte (LI et al. 2003b;

CRAWFORD et al. 1999). In geringeren Mengen wurde virale DNS bei Fehlwirten in Niere, Leber,

Gehirn, Ganglion Trigeminale, Nebenniere (KALUNDA et al. 1981a; SCHENZ et al. 2000), bei ei-

nigen Tieren auch im Nasensekret nachgewiesen (KALUNDA et al. 1981a).

Zur intra vitam Identifikation von Reservoirwirten mittels PCR eignet sich als Ausgangsmaterial

Nasen-, Augensekret und Blut (TRAUL et al. 2005; HÜSSY et al. 2002; LI et al. 2001a;

KLIEFORTH et al. 2002), zur Diagnose post mortem Organproben aus Dünndarm, Lymphknoten,

Milz, Lunge (HÜSSY et al. 2002), Kornea (BAXTER et al. 1997) und Speicheldrüsen (KLIEFORTH

et al. 2002).

2.6.2.6 Weiterverarbeitung der PCR-Produkte

Eine Verarbeitungsmöglichkeit ist die Anwendung von Restriktionsendonukleasen. Sie erkennen

an den DNS Stücken bestimmte Sequenzen und schneiden sie an dieser Stelle durch. Jede Endo-

nuklease wählt eine spezifische Schnittstelle aus, weshalb meistens zwei oder drei verschiedene

Endonukleasen benutzt werden. Die amplifizierte DNS wird in kleinere Stücke geschnitten. Diese

Stücke haben je nach genutzter Endonuklease eine bestimmte Länge. Die erhaltenen Stücke wer-

den durch Gelelektrophorese ihrer Größe nach aufgetrennt. Dadurch entstehen Balken in dem

Elektrophoresegel, die mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht werden können. Jede Art von DNS

zeigt ihr ganz spezifisches Schnittmuster.

2.6.3 CI-ELISA

Der CI-ELISA (competitive inhibitory enzyme linked immunosorbent assay) für die Detektion von

Antikörpern gegen BKF-Viren im Serum wurde von LI et al. (1994) entwickelt. Er basiert auf einem

monoklonalen Antikörper gegen das Epitop 15A in der Hülle der BKF-Viren. Andere Viren haben

dieses Protein nicht in ihrer Außenhülle und können selbst dann nicht zu falsch positiven Ergeb-

nissen führen, wenn ein Tier mit mehreren Viren gleichzeitig infiziert ist (CRAWFORD et al. 2002).

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Literaturübersicht

22

Da aber alle BKF-Viren das Epitop 15 A tragen, lässt sich durch den CI-ELISA nicht feststellen, um

welchen BKF-Virus es sich bei dem infizierten Tier handelt: Die Antikörper reagieren kreuz. Der CI-

ELISA hat sich besonders bei epidemiologischen Übersichtsstudien bewährt, in denen mit hoher

Spezifität eine große Anzahl an Tieren in kurzer Zeit identifiziert werden kann, die Kontakt zu BKF-

Viren hatten (FRÖHLICH et al. 1998; LI et al. 1994; MÜLLER-DOBLIES et al. 1998).

Zur Diagnostik klinischer Fälle sollten die Ergebnisse immer im Zusammenhang mit einer PCR

oder einer histopathologischen Untersuchung interpretiert werden. Beim perakuten oder akuten

Verlauf der Krankheit verenden die Tiere häufig bevor sie Antikörper bilden konnten und reagieren

im CI-ELISA trotz bestehender Infektion negativ (LI et al. 2006a). Dies kommt auch bei inapparent

infizierten Tieren vor, wenn sie keine Antikörper ausbilden (LI et al. 1999a; O´TOOLE et al. 1997).

Bei einer positiven Reaktion im CI-ELISA muss die Todesursache nicht zwingend BKF gewesen

sein. Die Antikörper können auch von einer früheren BKF-Virus Infektion herrühren, von der sich

das Tier erholt hat (LI et al. 2006a).

2.6.4 In-situ-Hybridisierung und Immunhistochemie

Mit ISH und IHC können BKF-Viren in Gewebeproben nachgewiesen werden. Versuche von

BRIDGEN et al. (1992) (ISH), PATEL und EDINGTON (1981) und ROSSITER (1980) haben aber

gezeigt, dass das Gewebe virale DNS teilweise in zu geringen Mengen enthält, als dass diese mit

den oben genannten Methoden nachgewiesen werden könnte. Die PCR ist in dieser Hinsicht viel

sensitiver.

KIUPEL et al. (2004) wiesen vor allem im Bereich der perivaskulären Infiltrationen und der Epi-

thelläsionen Viren in Lymphozyten nach. Auch in Gewebeproben von Speicheldrüsen

(KLIEFORTH et al. 2002) und Lungenalveolen (MICHEL et al. 1993) konnte der Virusnachweis

erbracht werden. Für die ISH und die IHC wird standardmäßig ein anti-AlHV-1 Antikörper benutzt.

Daher können BKF-Viren nicht differenziert werden. Diese Methoden sind sehr zeitaufwändig und

fehleranfällig. Die nötigen Gewebeproben können in der Regel nur vom toten Tier entnommen

werden. Deswegen eignen sie sich nicht zur intra vitam Diagnostik von BKF (MÜLLER-DOBLIES

et al. 1998).

2.6.5 Tierversuche

Bevor moderne Labormethoden etabliert waren, wurden zur Diagnostik Kaninchen mit dem Blut

des erkrankten Tieres infiziert (POL et al. 1993; KALUDA 1981). Sobald typische Symptome auf-

traten, wurden sie seziert und makroskopisch sowie histopathologisch auf BKF-typische pathologi-

sche Veränderungen untersucht6.

6 siehe 2.4.1 Klinik und 2.4.3 Histopathologische Befunde

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Literaturübersicht

23

2.6.6 Blutbild

Beim BKF wurde bei einem Teil der Tiere eine Leukopenie in Korrelation mit dem ersten Tempera-

turanstieg nach der Infektion nachgewiesen (BRENNER et al. 2002; LEUPOLD et al. 1989;

PLOWRIGHT 1964). Die Anzahl der neutrophilen Granulozyten und der Lymphozyten sank. Dar-

auf folgte eine Leukozytose mit Mononukleose und Neutropenie (PLOWRIGHT 1964).

Bei anderen Tieren wurde eine initiale Leukozytose mit Linksverschiebung beobachtet (REID et

al. 1985; ROSSITER 1985).

In der Endphase der Erkrankung konnte eine Eosinopenie beobachtet werden (ROSSITER

1985; BLOOD et al. 1999). Bei Exsikkose durch Diarrhoe stieg der Hämatokrit an (REID et al. 1985;

PLOWRIGHT 1990).

2.7 Therapie

In der Literatur gibt es nur wenige Berichte über die erfolgreiche Behandlung von Tieren mit BKF.

Da keine Virostatika für Tiere erhältlich sind, bleibt nur die Möglichkeit der symptomatischen Be-

handlung. Beim perakuten Verlauf kommt jeglicher Behandlungsversuch zu spät, was unter ande-

rem darauf zurückzuführen ist, dass die Tiere keine eindeutigen Symptome zeigen (LI et al. 1999b).

Rinder mit chronischem Krankheitsverlauf erholten sich in seltenen Fällen von der Krankheit, wo-

bei genaue Aufzeichnungen zur Behandlung nur teilweise vorhanden sind (O´TOOLE et al. 1997).

ROBERTSON (1961) berichtet von der erfolgreichen Behandlung erkrankter Rinder mit Tetracyclin

zum Schutz vor Sekundärinfektionen und Infusionen mit Glukose- und Elektrolytlösungen. Sulfa-

methazin und Antihistaminika zeigten keine Effekte. Auch andere Autoren verwendeten zum

Schutz vor Sekundärinfektionen Antibiotika wie Neomycin, Penicillin und Gentamicin (MILNE und

REID 1990; SHULAW und OGLESBEE 1989). Nasen- und Maulspülungen mit milden Desinfekti-

onslösungen können Linderung verschaffen (ROSENBERGER et al. 1994). Zusätzlich wurden

nicht-steroidale Antiphlogistika wie Phenylbutazon oder Acetyl-Salicylsäure (ASS) verwendet

(MILNE und REID 1990; KIUPEL et al. 2004) sowie Dexamethason- und Betamethason-haltige

Augentropfen appliziert (MILNE und REID 1990).

Die systemische Gabe von Kortikosteroiden ist umstritten. Diese führte zwar zum Abschwellen

der Schleimhäute und es tritt eine, wenn auch nur kurzfristige, Besserung ein (CRAWFORD et al.

2002; ROSENBERGER et al. 1994), aber sie kann den Ausbruch von BKF induzieren oder bei

einem latent infizierten Tier den Wechsel des Virus vom latenten ins lytische Stadium fördern

(HEUSCHELE et al. 1985). WIESNER (1978) berichtet von der erfolgreichen Behandlung eines

Gaurs, dem Levamisol subkutan verabreicht wurde.

2.8 Prophylaxe

Ein Impfstoff ist bislang nicht verfügbar (LI et al. 2006a). Immunisierungsversuche bei Rindern wa-

ren sowohl bei der gnu-assoziierten als auch bei der schaf-assoziierten Form bisher erfolglos

(PLOWRIGHT 1975; MULUNEH 1993).

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Literaturübersicht

24

Es bleibt die Möglichkeit, empfängliche Arten von Reservoirwirten zu trennen. Dies gilt besonders

für zoologische Gärten und Wildparks. Hier werden viele verschiedene Tierarten auf relativ engem

Raum, in benachbarten oder vergesellschaftet in demselben Gehege, gehalten. Dadurch ist der

Infektionsdruck sehr viel höher als in der Wildbahn (HÄNICHEN et al. 1998).

Es ist außerdem möglich, Lämmer virusfrei aufzuziehen. Dazu müssen sie im Alter von unge-

fähr zweieinhalb Monaten von der Herde abgesondert und nur mit OvHV-2 negativen Schafen zu-

sammengehalten werden (LI et al. 1999a).

Auch bei CpHV-2 ist es möglich, Jungtiere von virustragenden Ziegen virusfrei aufzuziehen,

wenn man sie im Alter von ca. sieben Tagen von latent infizierten Herdenmitgliedern absondert

und den Kontakt zu Virusträgern unterbindet (LI et al. 2005b). Die Aufzucht von virusfreien Tieren

scheint, z. B. für Streichelzoos, eine sinnvolle Maßnahme zu sein. Außerdem sollte darauf geach-

tet werden, bei der Versorgung der verschiedenen Tierarten unterschiedliche Betreuer einzusetzen,

die Kleidung vor dem Betreten des Geheges zu wechseln und nicht dieselben Geräte für unter-

schiedliche Tierarten zu verwenden, um eine indirekte Übertragung zu vermeiden (LI et al. 2006a).

Gnus durch die Trennung von Jung- und Muttertier virusfrei aufzuziehen, ist durch die mögliche

intrauterine Übertragung von AlHV-1 nicht realisierbar.

Durch Sonneneinstrahlung können die Viren relativ schnell inaktiviert werden (ROSSITER et al.

1983). In Fällen, in denen nicht verhindert werden kann, dass Reservoir- und Fehlwirt dieselbe

Weide nutzen (KIUPEL et al. 2004), kann möglicherweise die Inzidenz der BKF-Fälle gesenkt wer-

den, indem den Tierarten zeitlich getrennt Zugang zu dem Gelände gewährt wird. Zwischen den

Weideperioden sollte eine Zeitspanne von drei Stunden liegen, in der die Weide nicht genutzt wird

und die Viren durch die UV-Einstrahlung unschädlich gemacht werden (ROSSITER et al. 1983).

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Tiere, Material und Methoden

25

3 Tiere, Material und Methoden

3.1 Tiere

Insgesamt wurden 218 Wiederkäuer unterschiedlicher Art und Altersklassen aus sieben deutschen,

einem schweizer und drei niederländischen Wildparks und zoologischen Gärten untersucht. Die

folgende Karte von Mitteleuropa zeigt die Herkunft der Tiere (Abbildung 4).

Abbildung 4:

Mitteleuropa (www.demil.nl); die roten Punkte (A-K) stellen die Tierparks und zoologischen Gärten dar, aus denen die 218 Wiederkäuer für diese Studie stammen.

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Tiere, Material und Methoden

26

In der Tabelle 3 sind die untersuchten Tiere mit Art, Rasse, Anzahl und Alter am Tag der Proben-

entnahmen aufgeführt. Einige Tiere wurden mehrfach beprobt.

Tabelle 3: Art, Anzahl und Alter (a=Jahre, d=Tage, mo=Monate) der untersuchten Tiere

Anzahl Tier

gesamt Probenentnahme 1-7 Tage alt

Probenentnahme

unter 12 Monate

Probenentnahme über 12 Monate

Alpensteinbock

Capra ibex

5 5 (0,0,1,1,1d)

Anoa

Bubalus depressicornis

1 1 (3d) 1 (11mo)

Axishirsch

Axis axis

2 1 (3d) 1

Bongo

Tragelaphus eurycerus

1 1 (0d)

Burenziege

Capra aegagrus f. hircus

10 6 (2d) 4

Chinesischer Muntjak

Muntjacus reevesi

2 1 (1d) 1 (1,5a)

Coburger Fuchsschaf

Ovis orientalis f. aries

2 1 (3d) 1

Dahomey Rind

Bos primigenius f. taurus

1 1 (3d)

Dallschaf

Ovis dalli

5

3 (0,1,7d) 1 (40d) 2

Dik Dik

Madoqua sp.

1 1 (3d)

Dybowskihirsch

Cervus nippon hortulorum

5 5 (0,0,1,1,1d)

Elch

Alces alces

1 1 (4,5a)

Elen

Taurotragus oryx

2 1 (2d) 1 (8d)

Giraffe

Giraffa cameloparadalis rot-schildi

6 4 (0,0,0,1,2,3d) 2 (12,16d)

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Tiere, Material und Methoden

27

Tier Anzahl

gesamt Probenentnahme 1-7 Tage alt

Probenentnahme unter 12 Monate

Probenentnahme über 12 Monate

Girgentanaziege

Capra aegagrus f. hircus

4 4 (0,0,1,1d)

Goral

Naemorhedus goral

1 1 (7d)

Großer Kudu

Tragelaphus strepsiceros

2 2

Guanako

Lama guanicoe

2 2 (1,2d)

Heidschnucke

Ovis orientalis f. aries

6 1 (114d) 5 (3,5a,3,5a,4a,6,5a, 6,5a)

Hirschziegenantilope

Antilope cervicapra

3 3 (0,0,1d)

Impala

Aepyceros melampus

8 8 (1,1,1,1,1,1,2,2d)

Kamerunschaf

Ovis orientalis f. aries

24 13 (0d), 3 (1,1,2d) 8

Kleinkantschil

Tragulus javanicus

1 1 (4mo)

Kleiner Kudu

Tragelaphus imberbis

1 1 (23d)

Leierhirsch

Cervus eldii

1 1 (1,5a)

Mähnenspringer

Ammotragus lervia

1 1

Mergellandschaf

Ovis orientalis f. aries

2 1 (2d) 1

Moschusochse

Ovibos moschatus

2 2

Nyala

Tragelaphus sp.

3 3 (0,0,1d)

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Tiere, Material und Methoden

28

Tier Anzahl

gesamt Probenentnahme 1-7 Tage alt

Probenentnahme unter 12 Monate

Probenentnahme über 12 Monate

Oryx

Oryx leucoryx

1 1 (2d)

Ovamboziege

Capra aegagrus f. hircus

2 2 (1d)

Pfauenziege

Capra aegagrus f. hircus

6 1 (47d) 5 (2,5a,3a,4a, 9,5a,10,5a)

Reh

Capreolus capreolus

3 3 (0d)

Rentier

Rangifer tarandus

5 4 (0,1,1,1,d) 1 (17d)

Rotbüffel

Syncerus caffer nanus

1 1 (1d)

Rotkopfschaf

Ovis orientalis f. aries

5 3 (1,1,2d) 2

Säbelantilope

Oryx dammah

13 5 (0d),

7 (1,1,1,3,5,5,6,7d)

5 (11,65,72,117,122d)

Schraubenziege

Capra falconeri

8 8

Sikahirsch

Cervus nippon

1 1

Sitatunga

Tragelaphus sitatunga

1 1 (1,5a)

Skudde

Ovis orientalis f. aries

18 7 (0d)

6 (1,1,2,2,2,7d)

5

Spießbock

Oryx gazella

2 1 (1d) 1

Springbock

Antidorcas marsupialis

4 2 (0d) 3 (1a,1,5a,3a)

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Tiere, Material und Methoden

29

Tier Anzahl

gesamt Probenentnahme 1-7 Tage alt

Probenentnahme unter 12 Monate

Probenentnahme über 12 Monate

Tahr

Hemitragus sp.

3 3 (0d)

Takin

Budorcas taxicolor

1 1 (0d)

Texel-Walliser Schaf

Ovis orientalis f. aries

2 2

Ungarisches Steppen-rind

Bos primigenius f. taurus

1 1 (1d)

Waldren

Rangifer tarandus fenni-cus

4 4 (2,4,5,5a)

Wapiti

Cervus canadensis

1 1 (1d)

Wasserbock

Kobus ellipsiprymnus

1 1 (9d)

Watussirind

Bos primigenius f.taurus

3 3 (1,1,3d)

Weißbartgnu

Connochaetes taurinus

1 1 (0d)

Weiße Deutsche Edel-ziege

Capra aegagrus f. hircus

8 8

Wisent

Bison bonasus

3 1 (1d) 1 (95d) 2

Yak

Bos mutus f. grunniens

5 1 (2d) 4

Zwergziege

Capra aegagrus f. hircus

12 3 (0,1,1) 2 (95,107d) 7

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Tiere, Material und Methoden

30

3.2 Material

3.2.1 Geräte

Geräte zur Aufbewahrung:

Kühl- und Gefrierschränke (Liebherr, Ochsenhausen)

Geräte zur Herstellung des Mediums für die Probenaufbewahrung:

Sterilwerkbank (Haraeus, Hanau)

Magnetrührer (Ikamag®, Staufen)

pH-Elektrode (WTW, Weilheim)

Pipetten (Eppendorf, Hamburg; Abimed, Langenfeld)

Pipettierhilfe (Hirschmann, Ettlingen)

Autoklav (Getinge, Rastatt)

Geräte zur DNS-Isolierung:

Thermomixer 5436 (Eppendorf, Hamburg)

Vortexer (Bender & Hobein, Zürich)

Zentrifuge (Haraeus, Hanau)

PCR-Geräte:

Thermocycler PTC-200 (MJ Research, Hess. Oldendorf)

Rt-PCR Gerät MxPro (Stratagene, Amsterdam)

Gerät zur Messung des DNS-Gehalts:

Spektrophotometer (Beckmann, München)

Geräte für die Agarosegel-Elektrophorese:

Elektrophoresekammern (Keutz, Reiskirchen)

Stromversorgung Elektrophorese (BioRad, München)

Transilluminator (Alpha Innotec Corporation)

3.2.2 Verbrauchsmaterial

Abstrichbesteck (Nerbe, Winsen/Luhe)

Agarose (Eurogentec, Köln)

Aktivkohle (Merck, Darmstadt)

EDTA-Röhrchen (Braun, Melsungen)

Filterpapier (Macherey-Nagel, Düren)

Filterpipettenspitzen (Greiner, Frickenhausen)

Glaskolben (Brand, Wertheim)

Glaspipette (Brand, Wertheim)

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Tiere, Material und Methoden

31

Magnetrührstab (IKA, Staufen)

Pipettenspitzen (Greiner, Frickenhausen)

0,5 ml Reaktionsgefäße für die PCR (Stratagene, Amsterdam)

Spritzenfilter (TPP, Trasadingen)

sterile Spritzen (Braun, Melsungen)

1,5 ml und 2 ml Reaktionsgefäße (Greiner, Frickenhausen)

3.2.3 Vorgefertigte Systeme (Kits)

Aufreinigungskit High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Mannheim)

DNS-Isolierkit Invisorb® Spin Tissue Mini Kit (Invitek, Berlin)

3.2.4 Software

BLAST (basic local alignment search tool) (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)

Chromas (Southport Australien)

EditSeq (GATC Biotech, Konstanz)

MegAlign (GATC Biotech, Konstanz)

MxPro (Stratagene, Amsterdam)

NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)

AlphaImager 1220 (Cell Biosciences™, St. Clara)

3.2.5 Reagenzien und Herstellung der Gebrauchslösungen

3.2.5.1 Reagenzien

Reagenzien:

Bovines Serum Albumin pH 7 (PAA, Cölbe)

NaHCO3 (AppliChem, Darmstadt)

Lösungen:

DNS-Ladepuffer: Bromphenolblau 0,25 %, Glycerol 50 % in TAE

Dream TaqTM Puffer inkl. 20 mM MgCl2 (Fermentas, St.-Leon-Rot)

Ethidiumbromid 10mg/ml

Hanks-Salts Lösung (Biochrom, Berlin)

TAE: Zusammensetzung TAE 50x: Tris-Base 2 M, Eisessig 5,7 %, EDTA 100 mM, pH 8,5

RNAse-, DNSse- und Protease freies Wasser (5 Prime, Hamburg)

Enzyme:

Dream TaqTM DNS Polymerase (Fermentas, St.-Leon-Rot)

Express qPCR SuperMix Universal (Invitrogen, Karlsruhe)

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Tiere, Material und Methoden

32

Antibiotika und Antimykotika:

Amphotericin B (250 µg/ml; Biochrom, Berlin)

Gentamicin (10 mg/ml; Biochrom, Berlin)

Streptomycin/Penicillin (10 mg Streptomycin, 10.000 IE Penicillin/ml; Biochrom, Berlin)

3.2.5.2 Medium für die Probenlagerung

Für die Herstellung von einem Liter Medium, in dem die Tupferproben bei -20°C lagerten, wurde

zunächst Kohlewasser angesetzt. Hierzu wurden 5 l Aqua bidest mit 40 g Aktivkohle versetzt, 6

Stunden mit einem Magnetrührer gerührt und dann stehengelassen bis sich die Kohle abgesetzt

hatte. Anschließend wurde die Lösung filtriert, autoklaviert und 800 ml des Kohlewassers in einen

Glaskolben gegeben. Dann wurden 100 ml 10x konzentrierte Hanks-Salts Lösung, 5 g Bovines

Serum Albumin, 210 mg NaHCO3, 10 ml Streptomycin/Penicillin, 5 ml Gentamicin und 10 ml

Amphotericin B hinzugegeben und im Wasser mit Hilfe eines Magnetrührers gelöst. Abschließend

wurde der pH-Wert mit einer pH-Elektrode gemessen. Dieser sollte zwischen 7,5 und 7,2 liegen

und lag bei 7,3. Die Gebrauchslösung wurde mit einem Spritzenfilter sterilfiltriert und auf 2 ml Re-

aktionsgefäße aufgeteilt.

3.2.5.3 Mastermix für die Rt-PCR nach CUNHA et al. (2009)

Reaktionsvolumen für einen PCR-Ansatz (20 µl):

3,2 µl Wasser

10 µl Express qPCR SuperMix Universal

200 nM dpol771-Forward Primer (Operon, Köln; Tabelle 4)

200 nM dpol831-Reverse Primer (Operon, Köln; Tabelle 4)

80 nM OvHV-2 Sonde (Operon, Köln; Tabelle 4)

80 nM CpHC-2 Sonde (Operon, Köln; Tabelle 4)

8 nM AlHV-1 Sonde (Operon, Köln; Tabelle 4)

80 nM MCFV-WTD Sonde (Operon, Köln; Tabelle 4)

100 ng Template-DNS

3.2.5.4 Mastermix für die cPCR nach ROVNAK et al. (1998)

Reaktionsvolumen für einen PCR-Ansatz (50 µl):

36,5 µl Wasser

1,25 U Dream TaqTM DNS Polymerase

5µl 10x Dream TaqTM Puffer inkl. 20mM MgCl2

400 µM dATP (Roche, Mannheim)

400 µM dGTP (Roche, Mannheim)

400 µM dTTP (Roche, Mannheim)

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Tiere, Material und Methoden

33

400 µM dCTP (Roche, Mannheim)

Primer für den ersten Amplifikationsschritt (A):

2 µM DFA Upstream-Primer (Operon, Köln; Tabelle 4)

2 µM ILK Upstream-Primer (Operon, Köln; Tabelle 4)

2 µM KG1 Downstream-Primer (Operon, Köln; Tabelle 4)

Primer für den zweiten Amplifikationsschritt (B):

2 µM TGV Upstream-Primer (Operon, Köln; Tabelle 4)

2 µM IYG Downstream-Primer (Operon, Köln; Tabelle 4)

100 ng Template-DNS wurden für den ersten Amplifikationsschritt (A) eingesetzt, 4 µl PCR-

Produkt aus dem ersten Amplifikationsschritt wurden für den zweiten Amplifikationsschritt (B) ver-

wendet.

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Tiere, Material und Methoden

34

3.2.6 Primer und Sonden

Die Tabelle 4 zeigt die Primer- und Sondensequenzen der Rt-PCR und der cPCR.

Tabelle 4: Primer- und Sondensequenzen für die Rt-PCR und cPCR

Rt-PCR (CUNHA et al. 2009)

Primer 5’- 3’ Sequenz Reporterfarbstoff (bindet am

5’Ende der Sonde)

/ Quencher- Farbstoff (bindet am

3’ Ende der Sonde)

dpol771-Forward

Primer

CACACCCAACTGGAGTATGAC

dpol831-Reverse

Primer

ATGTTGTAGTGGGGCCAGTC

Sonden

OvHV-2 Sonde ATGTGCGCTTCGACCCTC FAM an 5’, BHQ1 an 3’

AlHV-1 Sonde TCGGTGGGTGACATTCAATA Cy5 an 5’, BHQ2 an 3’

CpHV-2 Sonde AGTTCCATTCTGAGCGGGT HEX an 5’, BHQ1 an 3’

MCFV-WTD Sonde ACTTTAACCCCAACCGTCT Texas Red an 5’, BHQ2 an 3’

cPCR (ROVNAK et al. 1998)

Primer 5’- 3’ Sequenz

DFA GAYTTYGCNAGYYTNTAYCC

ILK TCCTGGACAAGCAGCARNYSGCNMTNAA

TGV TGTAACTCGGTGTAYGGNTTYACNGGNGT

IYG CACAGAGTCCGTRTCNCCRTADAT

KG1 GTCTTGCTCACCAGNTCNACNCCYTT

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Tiere, Material und Methoden

35

Die Abbildungen 5 bis 8 zeigen die Nukleotidpositionen der Primer- und Sondenbindungsstellen.

Der DNS-Strang des Genoms von OvHV-2 und AlHV-1 sowie Teile des DNS-Strangs von CpHV-2

und MCFV-WTD sind als Linie dargestellt. Die Zahlen am linken und am rechten Ende der Linie

zeigen die Anzahl der Basenpaare insgesamt. Die Primer der cPCR sind blau und die Primer und

Sonden der Rt-PCR rot dargestellt und mit den Abkürzungen entsprechend Tabelle 4 bezeichnet.

Die Pfeile nach rechts bedeuten, dass es sich um eine Vorwärtsprimer handelt, die Pfeile nach

links stellen Rückwärtsprimer dar. Die senkrechten Linien grenzen die Bindungsstellen ein. Die

Zahlen oberhalb der Linie geben die Länge der Primer und Sonden sowie die Abstände dazwi-

schen in Basenpaaren an. Die Zahlen unterhalb der Linie zeigen die absoluten Nukleotidpositionen

der Bindungsstellen an.

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Tie

re, M

ate

rial u

nd

Me

thod

en

36

partielles DNS-Polymerase Gen AF327831

OvHV-2

dpol771F Sonde dpol831R DFA ILK TGV IYG KG1 10 18 18 8 19 300 566 19 243 27 8 25 183 21 188 25

1 135135

21634- 21662- 21688- 22573- 22835- 22870- 23078- 23287-

21644 21680 21707 22592 22862 22895 23099 23312

22007 23304

Abbildung 5: OvHV-2 (Accessionnumber GenBank: AY 839756, 135135 bp ) und partielles DNS-Polymerasegen (Accessionnumber GenBank: AF327831, 1297bp) mit Angabe der Nukleotidpositionen (bezogen auf das Gesamtgenom) der Primer- und Sondenbindungsstellen; rot: Rt-PCR, blau: cPCR

partielles DNS-Polymerase Gen AF031809

AlHV-1

dpol771F Sonde dpol831R DFA ILK TGV IYG KG1 11 4 19 17 19 866 19 243 27 8 28 2 173 22 188 25

1 130608

20295- 20310- 20346- 21231- 21493- 21528- 21732- 21942-

20306 20329 20365 21250 21520 21556 21754 21967

21558 21731

Abbildung 6: AlHV-1 (Accessionnumber GenBank: AF005370, 130608 bp) und partielles DNS-Polymerasegen (Accessionnumber GenBank: AF031809, 173 bp) mit Angabe der Nukleotidpositionen (bezogen auf das Gesamtgenom) der Primer- und Sondenbindungsstellen; rot: Rt-PCR, blau: cPCR

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Tie

re, M

ate

rial u

nd

Me

thod

en

37

partielles DNS-Polymerase Gen AF275941

CpHV-2

dpol771F Sonde dpol831R DFA ILK TGV IYG KG1 20 20 18 2 19 866 19 243 21 14 28 2 177 1 24 186 26

1

1993- 2033- 2053- 2938- 3200- 3235- 3442- Länge nicht bekannt 2013 2051 2072 2957 3221 3263 3466

3265 3441 3623

Abbildung 7: CpHV-2 mit teilweise bekannter Sequenz (Accessionnumber GenBank: AF283477, 3623 bp) und partielles DNS-Polymerasegen (Accessionnumber GenBank: AF275941, 177 bp) mit Angabe der Nukleotidpositionen (bezogen auf die bekannte Sequenz) der Primer- und Sondenbindungsstellen; rot: Rt-PCR, blau:

cPCR

partielles DNS-Polymerase Gen AF387516

MCFV-WTD

dpol771F Sonde dpol831R TGV IYG KG1 180 22 188

1 Länge unbekannt

180-202

1 361

Abbildung 8: MCFV-WTD und partielles DNS-Polymerasegen (Accessionnumber GenBank: AF387516, 361 bp) mit Angabe der Nukleotidpositionen (bezogen auf den bekannten Abschnitt des DNS-Polymerasegens) bekannter Primerbindungsstellen der cPCR; rot: Rt-PCR, blau: cPCR

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Tiere, Material und Methoden

38

3.2.7 Molekulargewichtsmarker λHaeIII

Für die Größenbestimmung der in der cPCR amplifizierten DNS-Fragmente wurde die DNS des

Phagen λdV1 (Prof. Dr. Dr. G. Hobom, Gießen) mit dem Enzym Hae III verdaut. Dabei entstehen

Fragmente mit den Längen (in bp): 1713, 1310, 890, 535, 460, 362, 352, 272, 223, 213, 212, 178,

142, 132,83, 40 (Abbildung 9).

1713 bp 1310 bp 890 bp 535 bp 460 bp

362/352 bp

272 bp 223 bp 178 bp

Abbildung 9: Molekulargewichtsmarker λHaeIII

3.2.8 Positivkontrollen

3.2.8.1 OvHV-2

Um die cPCR und die Rt-PCR zu testen und zu vergleichen, wurden sechs verschiedene OvHV-2

Isolate von klinischen Fällen (benannt A-F, siehe Ergebnisse) verwendet, die zuvor vom Landes-

untersuchungsamt Sachsen als OvHV-2- positiv mittels scPCR (BAXTER et al. 1993) diagnosti-

ziert worden waren und freundlicherweise zur Verfügung gestellt wurden. Diese PCR wurde wie-

derholt, das Produkt aufgereinigt und im Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung der

Universität Leipzig sequenziert. Die erhaltenen DNS-Sequenzen wurden mit bereits bekannten

Sequenzen aus der NCBI GenBank mit Hilfe der BLAST Software verglichen. Anschließend wur-

den Verdünnungsreihen in 2er Stufen (unverdünnt, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80) dieser Proben herge-

stellt. Die Verdünnungsreihen dienten dazu, sowohl die cPCR (ROVNAK et al. 1998) als auch die

Rt-PCR (CUNHA et al. 2009) zu testen und die Sensitivität der beiden PCRs zu vergleichen. Die

PCR-Produkte der cPCR wurden ebenfalls aufgereinigt und sequenziert. Diejenige Positivkontrolle,

die im Vergleich zu den anderen Kontrollen als erste einen deutlichen Anstieg in der Fluoreszenz

(Rt-PCR) bzw. eine deutlich sichtbare Bande auf dem Agarosegel (cPCR) zeigte, wurde anschlie-

ßend aliquotiert und für die Probenuntersuchung eingesetzt.

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Tiere, Material und Methoden

39

3.2.8.2 AlHV-1

Zur Auswahl einer zweiten Positivkontrolle wurden vier verschiedene Positivkontrollen für AlHV-1

(Stamm C500) (benannt F-J) und deren Verdünnungsstufen (unverdünnt, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80)

analog der Positivkontrollen für OvHV-2 in der cPCR und in der Rt-PCR getestet. Die Positivkon-

trollen für AlHV-1 wurden aus AlHV-1-infizierten B-Lymphozyten (F), aus Zellkultur (G), aus infizier-

ten Mediastinallymphknoten eines Versuchskaninchens (H) und Zellen aus dem Buffy Coat eines

infizierten Rindes (J) gewonnen 1 . Wie bei den Positivkontrollen für OvHV-2 wurde diejenige

Positivkontrolle, die im Vergleich zu den anderen Kontrollen als erste einen deutlichen Anstieg in

der Fluoreszenz (Rt-PCR) bzw. eine deutlich sichtbare Bande auf dem Agarosegel (cPCR) zeigte,

anschließend aliquotiert und für die Probenuntersuchung eingesetzt.

1 Freundlicherweise zu Verfügung gestellt von Dawn Grant, Virology Division, Moredun Research Institute, Groß-Britannien

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Tiere, Material und Methoden

40

3.3 Methoden

3.3.1 Probenentnahme

Von den in Tabelle 3 aufgeführten Tieren wurden insgesamt 686 Proben genommen. Die folgende

Tabelle 5 zeigt die Aufteilung der Proben.

Tabelle 5: Probenanzahl und Aufteilung

Tupferproben Blutproben

Augentupfer 228 19 Nasentupfer 228 Analtupfer 211

gesamt 667 19

Diese Proben stammen sowohl von Tieren, die routinemäßig untersucht wurden, etwa zur Neona-

tenkontrolle, als auch von Tieren, die aus anderen Gründen, etwa wegen Behandlungen oder Imp-

fungen, gefangen wurden. Dazu wurden jeweils separat von Augen-, Nasen-, und Analschleimhaut

mit sterilem Abstrichbesteck Tupferproben genommen, bei 17 Tieren nur von Augen- und Nasen-

schleimhaut. Von 10 Tieren wurden mehrfach Proben genommen. Eine zusätzliche Blutprobenent-

nahme erfolgte bei 19 Tieren.

Die Tupfer wurden zur Probenentnahme mindestens 3 Sekunden auf der Schleimhaut belassen

bis sie vollgesogen waren. Anschließend wurden jeweils 2 ml steriles Medium zu den Tupfern hin-

zu gegeben.

Die Proben wurden bis zum Transport bei -20°C gelagert, gut isoliert mit Kühlakkus transportiert

und bei Ankunft im Labor bis zur Untersuchung bei -20°C aufbewahrt.

Die Entnahme der Blutproben erfolgte mit sterilen Spritzen und EDTA-Röhrchen. Diese Proben

wurden bis zur Untersuchung bei 7°C gelagert.

3.3.2 DNS-Isolierung

Zur Untersuchung wurden die Proben aufgetaut und gevortext. Dann wurde mit Hilfe einer Glaspi-

pette und einer Pipettierhilfe 1 ml des Mediums bzw. 1 ml Blut mit den darin enthaltenen Zellen in

ein 1,5 ml Reaktionsgefäß übergeführt und die DNS mit einem DNS-Isolierkit nach Gebrauchsan-

leitung des Herstellers isoliert. Nach der Herstellung des entsprechenden Mastermixes wurde die

virale DNS in den Proben durch eine Rt-PCR für OvHV-2, AlHV-1, CpHV-2 und MCFV-WTD

(CUNHA et al. 2009) amplifiziert.

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Tiere, Material und Methoden

41

3.3.3 Spektrophotometrie zur Bestimmung des DNS-Gehalts

Nach CUNHA et al. (2009) sollten 100 ng DNS für die PCR eingesetzt werden. Um den DNS-

Gehalt der Isolate zu bestimmen, wurde ein Spektrophotometer eingesetzt, mit dem bei 100 Pro-

ben der DNS-Gehalt gemessen wurde. Der mittlere DNS-Gehalt wurde berechnet und lag bei 20

ng DNS pro µl Isolat. Demnach wurden pro Reaktion 5 µl Isolat eingesetzt. War eine Probe in der

Rt-PCR positiv, bei der der DNS-Gehalt zuvor nicht bestimmt worden war, wurde bei dieser und

allen weiteren Proben dieses positiven Tieres zusätzlich der DNS-Gehalt der Probenisolate be-

stimmt. Isolate, in denen ein Vielfaches von 100 ng DNS pro µl vorhanden war, wurden verdünnt

und nochmals in der Rt-PCR untersucht, um falsch negative Ergebnisse durch eine Überladung

der PCR mit zu viel DNS zu vermeiden.

3.3.4 Rt-PCR Protokoll nach CUNHA et al. (2009)

Für die Rt-PCR wurden ein Vorwärts- und ein Rückwärtsprimer ( 3.2.6) sowie vier Sonden für die

vier nachzuweisenden Viren – OvHV-2, AlHV-1, CpHV-2 und MCFV-WTD- verwendet. Die Sonden

waren mit vier unterschiedlichen Farbstoffen markiert ( 3.2.6). Befand sich eines der gefragten Vi-

ren in der Probe, band die entsprechende Sonde zwischen den beiden Primern. Während die Po-

lymerase die DNS-Sequenz zwischen den Primern amplifizierte, verdrängte sie die Sonde, wobei

der fluoreszierende Farbstoff frei wurde und gemessen werden konnte. Da die Farbstoffe an den

Sonden alle eine unterschiedliche Wellenlänge besaßen, ließ sich anhand der gemessenen Wel-

lenlänge auf den Farbstoff und damit auf die spezifische Sonde und das vorhandende Virus rück-

schließen.

Die Rt-PCR wurde mit einem MxPro 3000 Rt-PCR Gerät und der dazugehörigen MxPro Soft-

ware mit folgendem Protokoll durchgeführt:

Die PCR begann mit einer Temperatur von 50°C für 2 min. Die erste Denaturierung der DNS er-

folgte bei 95°C für 2 min. Anschließend folgten 40 Zyklen mit je einem Denaturierungsschritt bei

95°C für 15 sec, gefolgt von einem Reaktionsschritt bei 60°C für 45 sec, währenddessen die Pri-

mer mit der Template-DNS hybridisierten und die Polymerase die zu vervielfältigende DNS amplifi-

zierte.

Nach jedem der 40 Zyklen wurde die frei werdende Fluoreszenz gemessen, mit der des vorhe-

rigen Zyklus’ verglichen, die Differenz der beiden Werte in ein Koordinatensystem eingetragen und

als Graph dargestellt. Proben, bei denen die Fluoreszenz vor dem 40. Zyklus anstieg und deren

Graph als Sättigungskurve verlief, wurden als positiv gewertet (CUNHA et al. 2009).

Bei jeder PCR wurden stets die gleichen zwei Positivkontrollen für OvHV-2 (B) und für AlHV-1

(J) in den Verdünnungsstufen 1:10 und 1:40 bzw. 1:10 und 1:80 verwendet. Außerdem wurde stets

mindestens eine Negativkontrolle (Wasser) mitgeführt.

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Tiere, Material und Methoden

42

3.3.5 cPCR Protokoll nach Rovnak et al. (1998)

Bei Rt-PCR positiven Proben wurde zunächst der DNS-Gehalt bestimmt. Anschließend wurden

diese mit einer cPCR für Herpesviren (ROVNAK et al. 1998) untersucht, für die ebenfalls zunächst

ein Mastermix hergestellt wurde.

Anschließend wurde die cPCR mit folgendem Protokoll in einem PTC-200 Thermocycler Gerät

durchgeführt:

Die Denaturierung der DNS erfolgte bei 94°C für 3 min. Die Primer hybridisierten an die

Template-DNS bei 60°C für 2 min. Die Elongation der zu vervielfältigenden DNS erfolgte bei 72°C

für 1 min. Nach 40 Zyklen mit einem Denaturierungsschritt bei 94°C für 30 sec, einem Annea-

lingschritt bei 46°C für 1 min und einem Elongationsschritt bei 72°C für 1 min folgte eine Inkubation

der Reaktion von 7 min bei 72°C, um noch nicht beendete Amplifikationen zu beenden. Anschlie-

ßend wurden die PCR-Produkte bei 4°C gekühlt. Bei der cPCR wurde stets die gleiche, unver-

dünnte OvHV-2- Positivkontrolle sowie mindestens eine Negativkontrolle (Wasser) mit untersucht.

3.3.6 Agarosegel-Elektrophorese

Jeweils 5 µl der PCR-Produkte wurden für die Elekrophorese mit DNS-Ladepuffer versetzt und auf

ein 2%iges Agarosegel aufgetragen. Die Agarose wurde dafür zuvor in TAE (Tris-Acetat-EDTA-

Puffer) durch Erwärmung im Mikrowellengerät gelöst und in die vorbereiteten Gelschlitten gegos-

sen.

Die Elektrophorese wurde in TAE bei 130V durchgeführt, bis sich das Bromphenolblau des La-

depuffers in der Mitte des Gels befand. Dabei wurden die PCR-Produkte der Größe nach aufge-

trennt, wobei sich kleinere PCR-Produkte weiter als große von der Anode auf die Kathode zube-

wegten, da die großen PCR-Produkte durch die Gelporen zurückgehalten werden.

Anschließend wurde das Gel im Ethidiumbromidbad gefärbt, die DNS im Transilluminator mit-

tels UV-Licht sichtbar gemacht und fotografiert. Zur Analyse der Gelelektrophoresebilder diente die

Software AlphaImager 1220.

Im Fall der cPCR lag die zu erwartende Produktgröße einer positiven Probe bei 230-270 bp.

Proben mit Amplifikaten dieser Größe wurden als positiv gewertet.

3.3.7 Aufreinigung der PCR Produkte und Sequenzierung

Die PCR-Produkte dieser positiven Proben wurden mit einem Aufreinigungskit nach Anleitung des

Herstellers bearbeitet und im Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung der Universität

Leipzig sequenziert. Die erhaltenen DNS-Sequenzen wurden mit bereits bekannten Sequenzen

aus der NCBI GenBank mit Hilfe der BLAST Software verglichen.

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Ergebnisse

43

4 Ergebnisse

4.1 Vorversuche

4.1.1 Positivkontrollen

Um die Vorgehensweise zur Untersuchung der Proben zu etablieren, wurden zunächst die Proben

A bis J in 2er Schritten bis 1:80 verdünnt und deren Gesamt-DNS-Gehalt gemessen. Anschließend

wurden alle Verdünnungen sowohl in der cPCR als auch in der Rt-PCR eingesetzt. Die Ergebnisse

sind in der folgenden (Tabelle 6) dargestellt. In der linken Spalte sind die verschiedenen Proben

eingetragen. Unverdünnt, 1:10, 1:20, usw. stehen für die einzelnen Verdünnungsstufen. Pos

bedeutet, dass die entsprechende Probe in der angegebenen Verdünnung und der angegebenen

Methode positiv, neg, dass diese Probe negativ war. Die letzte Spalte gibt Auskunft darüber, bis zu

welcher Verdünnungsstufe die cPCR bzw. die Rt-PCR positive Proben als positiv erkennt. Durch

den Vergleich der Agarosegelbilder mit den Graphen der Rt-PCR entstand folgendes Bild (Tabelle

6).

Tabelle 6: Vergleich Sensitivität cPCR und Rt-PCR der Proben A bis J in den Verdünnungsstufen unverdünnt, 1:10, 1:20, 1:40, 1:80

unverdünnt 1:10 1:20 1:40 1:80

PCR cPCR Rt-

PCR

cPCR Rt-

PCR

cPCR Rt-

PCR

cPCR Rt-

PCR

cPCR Rt-

PCR

Sensitivität

Probe A pos pos pos pos pos neg pos pos neg pos inkonstant

Probe B pos pos pos pos neg pos neg pos neg neg Rt-PCR

>cPCR

Probe C pos pos neg pos neg pos neg pos neg pos Rt-PCR inkon-

stant>cPCR

Probe D / pos pos pos pos pos / / / / Rt-PCR

=cPCR

Probe E pos pos pos pos neg pos neg neg neg neg Rt-PCR

>cPCR

Probe F / / neg pos neg pos neg pos neg / Rt-PCR

>cPCR

Probe G / / pos pos neg pos neg pos neg pos Rt-PCR

>cPCR

Probe H pos / neg pos neg pos neg pos neg pos Rt-PCR

>cPCR

Probe J / / / pos neg pos neg pos neg pos Rt-PCR

>cPCR

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Ergebnisse

44

Bei den Proben B, C, E, F, G, H und J erwies sich die Rt-PCR als sensitiver gegenüber der cPCR.

Bei der Probe D war die Sensitivität in der Rt-PCR und der cPCR gleich. Die Proben A und C er-

gaben inkonstante Bilder.

Aufgrund der besseren Sensitivität der Rt-PCR bestätigte sich die geplante Vorgehensweise,

zuerst die Rt-PCR auf alle Proben anzuwenden, Rt-positive Proben mit der cPCR nach zu unter-

suchen und anschließend die Produkte sequenzieren zu lassen.

Als Positivkontrollen für die Probenuntersuchungen eigneten sich die Proben B, D, E, F, G, H

und J. Da von den Proben B und J am meisten Isolat zur Verfügung stand, wurden sie in der Rt-

PCR als Positivkontrollen eingesetzt, um für alle Versuche in der Rt-PCR die gleichen Kontrollen

verwenden zu können. In der cPCR wurde anstatt der Probe J die Probe G verwendet, da die Pro-

be J für die cPCR nicht geeignet war.

Die folgenden Abbildungen zeigen die Graphen der Rt -PCR der Positivkontrollen B (Abbildung

10) und J (Abbildung 12) und ihrer Verdünnungsstufen (B1: blau, B2: rot, B3: grün, B4: grau; J1:

grau, J2: grün, J3: rot, J4: blau). Auf der x-Achse sind die Anzahl der Zyklen aufgetragen, auf der

y-Achse die Differenz der Fluoreszenz im Vergleich zum vorhergehenden Zyklus. Die horizontale

Linie stellt den von der MxPro Software bestimmten Grenzwert dar, der bei positiven Proben vor

dem 40. Zyklus überschritten sein sollte (Cycle of threshold, Ct) (CUNHA et al. 2009).

Die zugehörigen Standardkurven finden sich jeweils in der Abbildung darunter (Abbildungen 11

und 13) und wurden mit der MxPro Software berechnet. Auf der x-Achse ist die Verdünnungsstufe

aufgetragen, auf der y-Achse der zugehörige Ct-Wert.

Da die Positivkontrollen von Reservoirwirten stammen und die Anzahl an DNS-Molekülen in

diesen Proben zuvor nicht bestimmt worden war, diente diese Untersuchung ausschließlich dem

Vergleich der Sensitivitäten der einzelnen PCR-Protokolle untereinander.

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Ergebnisse

45

Abbildung 10: Positivkontrollen B1 (blau), B2 (rot), B3 (grün), B4 (grau) in der Rt-PCR; x-Achse: Anzahl der durchlaufenen Amplifikationszyklen; y-Achse: Differenz der frei gewordenen Fluoreszenz

B4 B3 B2 B1

Abbildung 11: Standardkurve Positivkontrollen B1, B2, B3, B4 in der Rt-PCR als logarhytmische Funktion; x-Achse: Verdünnungsstufe ; y-Achse: Cycle of threshold

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Ergebnisse

46

Abbildung 12: Positivkontrollen J1 (grau), J2 (grün), J3 (rot), J4 (blau) in der Rt-PCR; x-Achse: Anzahl der durch- laufenen Amplifikationszyklen; y-Achse: Differenz der frei gewordenen Fluoreszenz

J4 J3 J2 J1

Abbildung 13: Standardkurve Positivkontrollen J1, J2, J3, J4 in der Rt-PCR als logarhytmische Funktion; x-Achse: Verdünnungsstufe ; y-Achse: Cycle of threshold

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Ergebnisse

47

Die folgenden Gelbilder (Abbildung 14) zeigen die Ergebnisse der cPCR mit den Positivkontrollen

B und J und ihren Verdünnungsstufen 0 bis 4 (vgl. Tabelle 6). M ist der Molekulargewichtsmarker,

die Pfeile kennzeichnen die relevanten Banden 223 und 272, zwischen denen die PCR-Produkte

liegen. Die positiven Banden, um die es sich in der jeweiligen Abbildung handelt, sind mit einem

Rahmen markiert.

272 bp

223 bp

M B0 B1

272 bp

223 bp

M B2 B3 B4

272 bp

223 bp

M G1

272 bp

223 bp

M J2 J3 J4

Abbildung 14: Gelelektrophoresebilder der Positivkontrollen B0-B4, G1 und J 2-4 cPCR

M: Molekulargewichtsmarker; B0: Positivkontrolle B unvervünnt; B1: Positivkontrolle B 1:10 Verdünnung; B2: Positiv-kontrolle B 1:20 Verdünnung; B3: Positivkontrolle B 1:40 Verdünnung; B4: Positivkontrolle B 1:80 Verdünnung; G1:

Positivkontrolle G 1:10 Verdünnung; J2: Positivkontrolle J 1:20 Verdünnung; J3: Positivkontrolle J 1:40 Verdünnung; J4: Positivkontrolle J 1:80 Verdünnung

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Ergebnisse

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4.2 Ergebnisse der Probenuntersuchungen

4.2.1 Ergebnisse der Rt-PCR 649 Tupferproben und eine Blutprobe von 214 Tieren wurden zunächst in der Rt-PCR untersucht.

Tabelle 7 gibt eine Übersicht über die positiven Proben. Die positiven Tiere sind aufgeführt und die

dazugehörigen Proben mit dem Vermerk, welche positiv und welche negativ in der Rt-PCR waren.

Außerdem ist aufgeführt, um welches Virus es sich laut Rt-PCR bei der jeweiligen Probe handelt.

Tabelle 7: Liste der positiven Proben in der Rt-PCR mit Angabe der Tiere, der dazugehörigen Proben und dem Ergebnis der Rt-PCR

Tiere und Probennummern Augen-

tupfer

Nasen-

tupfer

Anal-

tupfer

Virus

0,1 Burenziege 242 neg pos neg MCFV-WTD

0,1 Kamerunschaf 265 pos pos neg OvHV-2

0,3 Kamerunschafe 264, 266, 267 neg pos neg OvHV-2

0,1 Kamerunschaf 268 neg neg pos OvHV-2

0,1 Markhor 129 pos pos neg CpHV-2

0,3 Markhore 126,132,136 neg pos neg CpHV-2

0,2 Pfauenziegen 22,29 neg pos neg CpHV-2

0,3 Pfauenziegen 17, 23,26 neg pos neg MCFV-WTD

0,1 Sikahirsch 127 pos pos pos CpHV-2

0,1 Skudde 270 neg pos pos OvHV-2

0,1 Skudde 272 neg pos neg OvHV-2

2,1 Weiße Deutsche Edelziegen 243, 245, 248 neg pos neg CpHV-2

0,1 Zwergziege 261 neg pos neg OvHV-2

Die folgenden Abbildungen 15 bis 19 zeigen die Ergebnisse der Rt-PCR und der cPCR. Jeder po-

sitiven Probe ist eine Kurve (Rt-PCR) bzw. eine Gelspur (cPCR) zugeordnet, die jeweils mit der

Probennummer gekennzeichnet ist. Die Abkürzungen A, N und R stehen für Augen-, Nasen- und

Rektaltupfer.

Auf der x-Achse der Graphen der Rt-PCR sind die Anzahl der Zyklen aufgetragen, auf der y-

Achse die Differenz der Fluoreszenz im Vergleich zum vorhergehenden Zyklus. Die horizontale Li-

nie stellt den von der MxPro Software bestimmten Grenzwert dar, der bei positiven Proben vor

dem 40. Zyklus überschritten sein sollte (CUNHA et al. 2009).

Auf den Gelbildern sind die positiven Banden, um die es sich in der jeweiligen Abbildung han-

delt, mit einem Rahmen markiert. M ist der Molekulargewichtsmarker, die Pfeile kennzeichnen die

relevanten Banden 223 und 272, zwischen denen die positiven PCR-Produkte liegen.

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Ergebnisse

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26N (blau), 17N (grün), 23N (rot), 22N (grau); rote Linie: Ct 26N, 17N, 23N; grüne Linie: Ct 22N

272 bp

223 bp

272 bp

223 bp

M 17N 23N 26N M

29N

Abbildung 15: Rt-PCR und cPCR; jeder Probe ist eine Kurve (Rt-PCR) bzw. eine Gelspur (cPCR) zugeordnet, die jeweils mit der Probennummer gekennzeichnet ist (17N, 22N, 23N, 26N, 29N); N = Nasentupfer; x-Achse= Anzahl der Zyklen; y-Achse= Differenz der Fluoreszenz im Vergleich zum vorhergehenden Zyklus; horizontale Linie= Grenzwert, der bei positiven Proben vor dem 40. Zyklus überschritten sein sollte (CUNHA et al. 2009); M= Moleku-largewichtsmarker; Pfeile kennzeichnen die relevanten Banden 223 und 272, zwischen denen die positiven PCR-Produkte liegen

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Ergebnisse

50

129N (grau), 127A (grün), 126N (gelb), 127R (blau), 127N (rot), 129A (hellblau)

272 bp

223 bp

M 129N

Abbildung 16: Rt-PCR und cPCR; jeder Probe ist eine Kurve (Rt-PCR) bzw. eine Gelspur (cPCR) zugeordnet, die jeweils mit der Probennummer gekennzeichnet ist (126N, 127A, 127N, 127R, 129A, 129N); A= Augentupfer; N = Nasentupfer; R= Rektaltupfer; x-Achse= Anzahl der Zyklen; y-Achse= Differenz der Fluoreszenz im Vergleich zum vorhergehenden Zyklus; horizontale Linie= Grenzwert, der bei positiven Proben vor dem 40. Zyklus über-schritten sein sollte (CUNHA et al. 2009); M= Molekulargewichtsmarker; Pfeile kennzeichnen die relevanten Ban-den 223 und 272, zwischen denen die positiven PCR-Produkte liegen.

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Ergebnisse

51

136N (blau), 132N (rot)

272 bp

223 bp

M 132N

242N

Abbildung 17: Rt-PCR und cPCR; jeder Probe ist eine Kurve (Rt-PCR) bzw. eine Gelspur (cPCR) zugeordnet, die

jeweils mit der Probennummer gekennzeichnet ist (132N, 136N, 242N); N = Nasentupfer; x-Achse= Anzahl der Zyklen; y-Achse= Differenz der Fluoreszenz im Vergleich zum vorhergehenden Zyklus; horizontale Linie= Grenzwert, der bei positiven Proben vor dem 40. Zyklus überschritten sein sollte (CUNHA et al. 2009); M= Mole-kulargewichtsmarker; Pfeile kennzeichnen die relevanten Banden 223 und 272, zwischen denen die positiven PCR-Produkte liegen.

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Ergebnisse

52

243N (grün), 245N (rot), 248N (blau)

265N (grün), 265A (grau), 264A (rot), 261N (blau)

Abbildung 18: Rt-PCR und cPCR; jeder Probe ist eine Kurve (Rt-PCR) bzw. eine Gelspur (cPCR) zugeordnet, die jeweils mit der Probennummer gekennzeichnet ist (243N, 245N, 248N, 261N, 264A, 265A, 265N; A= Augentupfer; N = Nasentupfer; x-Achse= Anzahl der Zyklen; y-Achse= Differenz der Fluoreszenz im Vergleich zum vorherge-henden Zyklus; horizontale Linie= Grenzwert, der bei positiven Proben vor dem 40. Zyklus überschritten sein sollte (CUNHA et al. 2009); M= Molekulargewichtsmarker; Pfeile kennzeichnen die relevanten Banden 223 und 272, zwischen denen die positiven PCR-Produkte liegen.

M 243N

M 265N

272 bp

223 bp

272 bp

223 bp

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Ergebnisse

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267N (grün), 270N (rot), 266N (gelb), 270R (blau), 272N (grau), 268R (hellblau)

272 bp

223 bp

M 266N 267N

272 bp

223 bp

M 270R 272N

Abbildung 19: Rt-PCR und cPCR; jeder Probe ist eine Kurve (Rt-PCR) bzw. eine Gelspur (cPCR) zugeordnet, die jeweils mit der Probennummer gekennzeichnet ist (266N, 267N, 268R, 270N, 270R, 272N); N = Nasentupfer; R= Rektaltupfer; x-Achse= Anzahl der Zyklen; y-Achse= Differenz der Fluoreszenz im Vergleich zum vorherge-henden Zyklus; horizontale Linie= Grenzwert, der bei positiven Proben vor dem 40. Zyklus überschritten sein sollte (CUNHA et al. 2009); M= Molekulargewichtsmarker; Pfeile kennzeichnen die relevanten Banden 223 und 272, zwischen denen die positiven PCR-Produkte liegen.

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Ergebnisse

54

4.2.2 Ergebnisse der cPCR

Von den Rt-PCR positiven Proben wurde eine cPCR nach ROVNAK et al. (1998) durchgeführt. Die

Gelbilder der Ergebnisse sind in die obigen Abbildungen 15 bis 19 eingearbeitet. Wie zu erwarten,

waren nicht alle Rt-PCR positiven Proben auch in der cPCR positiv. Tabelle 8 gibt eine Übersicht

über die positiven Proben in der Rt-PCR und der cPCR.

Tabelle 8: Tiere und Probennummer der positiven Proben in der Rt-PCR und cPCR

Tierart und Probennummer Rt-PCR

positiv

cPCR

positiv

0,1 Burenziege 242N MCFV-WTD nein

0,3 Kamerunschafe 264A, 265A, 268R OvHV-2 nein

0,3 Markhore 126N, 129A, 136N CpHV-2 nein

0,1 Pfauenziege 22N CpHV-2 nein

0,1 Sikahirsch 127N,R CpHV-2 nein

0,1 Skudde 270N OvHV-2 nein

0,1 Zwergziege 261N OvHV-2 nein

0,3 Kamerunschafe 265N, 266N, 267N OvHV-2 ja

0,2 Markhore 129N, 132N CpHV-2 ja

0,3 Pfauenziegen 17N, 23N, 26N MCFV-WTD ja

0,1 Pfauenziege 29N CpHV-2 ja

0,1 Sikahirsch 127A CpHV-2 ja

0,2 Skudden 270R, 272N OvHV-2 ja

2,1 Weiße Deutsche Edelziege 243N, 245N, 248N CpHV-2 ja

4.2.3 Messung des Gesamt-DNS-Gehalts bei positiven Proben

Von den positiven Proben wurde der Gesamt-DNS-Gehalt mittels Spektrophotometrie ermittelt. Die

Werte lagen alle etwa im selben Bereich (20 ng/µl). So konnte ausgeschlossen werden, dass die

PCR mit DNS überladen oder die DNS-Isolierung aus den Proben nicht erfolgreich war. Aufgrund

des inhomogenen Aufbaus und Gewichts der einzelnen DNS Moleküle in den Proben, war es nicht

möglich, ausgehend vom Gesamt-DNS-Gehalt der Probe, die Anzahl der einzelnen DNS Moleküle

zu ermitteln.

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Ergebnisse

55

4.2.4 Ergebnisse der Sequenzierung

Die cPCR-Produkte der Proben 17N, 26N, 243N, 265N, 266N, 267N, 270R und 272N wurden auf-

gereinigt und vom Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung der Universität Leipzig mit

dem Primer TGV, der in der cPCR verwendet wurde, sequenziert. Die erhaltenen DNS-Sequenzen

wurden mit bereits bekannten Sequenzen aus der NCBI-Datenbank GenBank und dem Ergebnis

der Rt-PCR verglichen. Dieser Vergleich ergab, dass die Rt-PCR Ergebnisse mit denen der Se-

quenzierung übereinstimmen.

In Tabelle 9 sind die Rt-Ergebnisse und die Sequenzierungsergebnisse der einzelnen Proben auf-

geführt.

Tabelle 9: Vergleich der Ergebnisse der Rt-PCR und der Sequenzierung von positiven Proben aus der Rt-PCR und cPCR

Probe Rt-PCR Sequenzierung

0,1 Pfauenziege 17 N MCFV-WTD MCFV-WTD

0,1 Pfauenziege 26N MCFV-WTD MCFV-WTD

1,0 Weiße Deutsche Edelziege 243N CpHV-2 CpHV-2

0,1 Kamerunschaf 265N OvHV-2 OvHV-2

0,1 Kamerunschaf 266N OvHV-2 OvHV-2

0,1 Kamerunschaf 267N OvHV-2 OvHV-2

0,1 Skudde 270R OvHV-2 OvHV-2

0,1 Skudde 272N OvHV-2 OvHV-2

Die folgenden Abbildungen 20 bis 27 zeigen den Verg leich zwischen den Sequenzen der positiven

Proben und den veröffentlichten Virussequenzen in der NCBI-Datenbank GenBank. Die obere Zei-

le ist die Sequenz des jeweiligen Virus und die untere Zeile die der zu vergleichenden Probe. C, G,

A und T sind die einzelnen Nukleotidbausteine. Übereinstimmungen zwischen Virus und Probe

sind mit einem senkrechten Strich markiert und in Prozent unter der Abbildung angegeben.

MCFV-WTD CATGCTGCCCTGCCT-TTGAGAGCAG-AACTGTGACTCTACGAGGCAGAACCATGCTGGA

||||||||||||||| ||| ||||| |||||||||||||| ||||||||||||||||||

17N CATGCTGCCCTGCCTCATGATAGCAGAAACTGTGACTCTACAAGGCAGAACCATGCTGGA

MCFV-WTD AAAGACCAAGCAGTTTGTGGAAAACGTAAACATTCAGTACCTGCAGCAAATATGCCCAAC

|||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||

17N AAAGACCAAGCAGTTTGTGGAAAACGTAGACATTCAGTACCTGCAGCAAATATGCCCAAC

MCFV-WTD CCAGATTATAAAGAGTCAATCGCCCCACACTAACCCGAGATTCACAGTTATGTACGGGGA

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||| |||||

17N CCAGATTATAAAGAGTCAATCGCCCCACACTAACCCGAGATTCACAGTTGTGTATGGGGA

MCFV-WTD CACGGACTCT

||| || |||

17N CACAGATTCT

Abbildung 20: Probe 17N verglichen mit GenBanknummer AF387516 MCFV-WTD, DNS-Polymerasegen; Überein-stimmung 94%

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Ergebnisse

56

MCFV-WTD TCGGGACATGCTGCCCTGTCT-ATGAGAGCAG-AACTGTGACTCTAC-AGGCAGAACCAT

||||| |||||||||||| || |||| ||||| |||||||||||||| ||||||||||||

26N TCGGG-CATGCTGCCCTGCCTCATGATAGCAGAAACTGTGACTCTACAAGGCAGAACCAT

MCFV-WTD GCTGGAAAAGACCAAGCAGTTTGTGGAAAACGTAGACATTCAGTACCTGCAGCAAATATG

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

26N GCTGGAAAAGACCAAGCAGTTTGTGGAAAACGTAGACATTCAGTACCTGCAGCAAATATG

MCFV-WTD CCCAACCCAGATTATAAAGAGTCAATCGCCCCACACTAACCCGAGATTCACAGTTATGTA

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||

26N CCCAACCCAGATTATAAAGAGTCAATCGCCCCACACTAACCCGAGATTCACAGTTGTGTA

MCFV-WTD CGGCGACACGGACTCT

|| ||||| || |||

26N TGGGGACACAGATTCT

Abbildung 21: Probe 26N verglichen mit GenBanknummer AF387516 MCFV-WTD, DNS-Polymerasegen; Überein-stimmung 94%

CpHV-2 GCCAAGACCCCTCTATTACGGGCCTGCCGGAGAACCCAAGCCCGAGGCTCACCGTGATAT

|||| |||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||| | |

243N GCCAGGACCCCTCTATTACGGGCCTGCCGCAGAACCCAAGCCCGAGGCTCACCGTGGTCT

CpHV-2 ACGGCGACACGGACTC

|||| ||||| |||||

243N ACGGAGACACCGACTC

Abbildung 22: Probe 243 N verglichen mit GenBanknummer AF283477 CpHV-2 DNS-Polymerasegen;

Übereinstimmung 92%

OvHV-2 CCTGTCTGATGAGAGCCGAGACCGTGACTCTCCAGGGCCGAACCATGTTGGAGAAGACAA

|||| || |||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

265N CCTGCCTCATGATAGCCGAGACCGTGACTCTCCAGGGCCGAACCATGTTGGAGAAGACAA

OvHV-2 AACAGTTTGTGGAAAATCTGGACGTCCAGAGCCTACAGCAGATATGTCCAACCCAGACTC

|||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

265N AACAGTATGTGGAAAATCTGGACGTCCAGAGCCTACAGCAGATATGTCCAACCCAGACTC

OvHV-2 TAAAAATTCACGCGCAGCACCCGACCCCGAGATTCACAGTGATGTACGGCGACACGGACT

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || || ||||||||||

265N TAAAAATTCACGCGCAGCACCCGACCCCGAGATTCACAGTGATCTATGGAGACACGGACT

OvHV-2 CTGTG

|||||

265N CTGTG

Abbildung 23: Probe 265N verglichen mit GenBanknummer EU309723 OvHV-2 DNS-Polymerasegen;

Übereinstimmung 96%

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Ergebnisse

57

OvHV-2 TGCCTGATGAGAGCCGAGACCGTGACTCT-TGGGGCCGAACCATGTTGGAGAAGACAAAA

||||| |||| |||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||

266N TGCCTCATGATAGCCGAGACCGTGACTCTCCAGGGCCGAACCATGTTGGAGAAGACAAAA

OvHV-2 CAGTTTGTGGAAAATCTGGACGTCCAGAGCCTACAGCAGATATGTCCAACCCAGACTCTA

|||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

266N CAGTATGTGGAAAATCTGGACGTCCAGAGCCTACAGCAGATATGTCCAACCCAGACTCTA

OvHV-2 AAAATTCACGCGCAGCACCCGACCCCGAGATTCACAGTGATGTACGGCGACACGGACTCT

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| || || ||||||||||||

266N AAAATTCACGCGCAGCACCCGACCCCGAGATTCACAGTGATCTATGGAGACACGGACTCT

OvHV-2 GTG

|||

266N GTG

Abbildung 24: Probe 266N verglichen mit GenBanknummer EU309723 OvHV-2 DNS-Polymerasegen;

Übereinstimmung 95%

OvHV-2 AGCGTCCGGCATGCTGCCCTGCCTGATGATAGCCGAGACCGTGACTCTCCAGGGCCGAAC

||| |||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||

267N AGCCTCCGGCATGCTGCCCTGCCTCATGATAGCCGAGACCGTGACTCTCCAGGGCCGAAC

OvHV-2 CATGTTGGAGAAGACAAAACAGTTTGTGGAAAATCTGGACGTCCAGAGCCTACAGCAGAT

||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||

267N CATGTTGGAGAAGACAAAACAGTATGTGGAAAATCTGGACGTCCAGAGCCTACAGCAGAT

OvHV-2 ATGTCCAACCCAGACTCTAAAAATTCACGCGCAGCACCCGACCCCGAGATTCACAGTGAT

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

267N ATGTCCAACCCAGACTCTAAAAATTCACGCGCAGCACCCGACCCCGAGATTCACAGTGAT

OvHV-2 GTACGGGGACACGGACTCTGTGAATCTC

|| || ||||||||||||||||| |||

267N CTATGGAGACACGGACTCTGTGAAACTC

Abbildung 25: Probe 267N verglichen mit GenBanknummer EU309723 OvHV-2 DNS-Polymerasegen;

Übereinstimmung 96%

OvHV-2 AGCCTACCGCATATATGTCCTACCCAGACTCTAAAAATTCACGCGCAGCACCCGACCCCG

||||||| ||| |||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

270R AGCCTACAGCAGATATGTCCAACCCAGACTCTAAAAATTCACGCGCAGCACCCGACCCCG

OvHV-2 AGATTCACAGTGATGTACGGCGACACGGACTCTGTG

|||||||||||||| || || |||||||||||||||

270R AGATTCACAGTGATCTATGGAGACACGGACTCTGTG

Abbildung 26: Probe 270R verglichen mit GenBanknummer EU309723 OvHV-2 DNS-Polymerasegen;

Übereinstimmung 93%

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Ergebnisse

58

OvHV-2 TCCGGCATGTTGCTCTGCCTGATGAGAGCCGAGACCGTGACTCTCCGGGGCCGAACCATG

||||||||| ||| |||||| |||| |||||||||||||||||||| |||||||||||||

272N TCCGGCATGCTGCCCTGCCTCATGATAGCCGAGACCGTGACTCTCCAGGGCCGAACCATG

OvHV-2 TTGGAGAAGACAAAACAGTTTGTGGAAAATCTGGACGTCCAGAGCCTACAGCAGATATGT

||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

272N TTGGAGAAGACAAAACAGTATGTGGAAAATCTGGACGTCCAGAGCCTACAGCAGATATGT

OvHV-2 CCAACCCAGACTCTAAAAATTCACGCGCAGCACCCGACCCCGAGATTCACAGTGATGTAC

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||

272N CCAACCCAGACTCTAAAAATTCACGCGCAGCACCCGACCCCGAGATTCACAGTGATCTAT

OvHV-2 GGCGACACGGACTCTGTGA

|| ||||||||||||||||

272N GGAGACACGGACTCTGTGA

Abbildung 27: Probe 272N verglichen mit GenBanknummer EU309723 OvHV-2 DNS-Polymerasegen;

Übereinstimmung 95%

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Ergebnisse

59

In Tabelle 10 sind die Ergebnisse der positiven Proben in der Rt-PCR, der cPCR und der Sequen-

zierung zusammengefasst. Sie enthält außerdem Angaben zu Tierart, Alter und Geschlecht der

positiven Tiere.

Tabelle 10: Übersicht über die Ergebnisse aus Rt-PCR, cPCR und Sequenzierung unter Angabe der Proben-nummer, Tierart, Alter (a=Jahre, d=Tage, mo=Monate) und Geschlecht (0,1=weiblich, 1,0=männlich) der positiven Tiere

Proben-

nummer

Tierart Alter Rt-PCR

positiv

cPCR

positiv

Sequenzierung

22N Pfauenziege 10a CpHV-2 nein -

126N 0,1 Markhor 5,5a CpHV-2 nein -

127N 0,1 Sikahirsch über 12 mo CpHV-2 nein -

127R 0,1 Sikahirsch über 12 mo CpHV-2 nein -

129A 0,1 Markhor 11mo CpHV-2 nein -

136N 0,1 Markhor 6,5a CpHV-2 nein -

242N 0,1 Burenziege über 12 mo MCFV-WTD nein -

261N 0,1 Zwergziege über 12 mo OvHV-2 nein -

264A 0,1 Kamerunschaf über 12 mo OvHV-2 nein -

265A 0,1 Kamerunschaf über 12 mo OvHV-2 nein -

268R 0,1 Kamerunschaf über 12 mo OvHV-2 nein -

270N 0,1 Skudde über 12 mo OvHV-2 nein -

23N 0,1 Pfauenziege 4a MCFV-WTD ja -

29N Pfauenziege 2,5a CpHV-2 ja -

129N 0,1 Markhor 11mo CpHV-2 ja -

127A 0,1 Sikahirsch über 12 mo CpHV-2 ja -

132N 0,1 Markhor 4a CpHV-2 ja -

245N 0,1 Weiße Deut-

sche Edelziege

über 12 mo CpHV-2 ja -

248N 1,0 Weiße Deut-

sche Edelziege

über 12 mo MCFV-WTD ja -

17N Pfauenziege 4a MCFV-WTD ja MCFV-WTD

26N Pfauenziege 3a MCFV-WTD ja MCFC-WTD

243N 1,0 Weiße Deut-

sche Edelziege

über 12 mo CpHV-2 ja CpHV-2

265N 0,1 Kamerunschaf über 12 mo OvHV-2 ja OvHV-2

266N 0,1 Kamerunschaf über 12 mo OvHV-2 ja OvHV-2

267N 0,1 Kamerunschaf über 12 mo OvHV-2 ja OvHV-2

270R 0,1 Skudde über 12 mo OvHV-2 ja OvHV-2

272N 0,1 Skudde über 12 mo OvHV-2 ja OvHV-2

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Ergebnisse

60

4.2.5 Zusätzliche Untersuchungen und Ergebnisse

Aus einem Zoo wurden freundlicherweise die Ergebnisse von 17 Blutuntersuchungen auf OvHV-2

mittels snPCR nach BAXTER et al. (1993) bei fünf Skudden, fünf Zwergziegen und sieben

Kamerunschafen zur Verfügung gestellt, von denen auch Tupferproben untersucht wurden.

Zusätzlich untersuchte die LUA Sachsen mit der gleichen snPCR von sechs Tieren Augen-,

Nasen- und Analtupfer sowie eine Blutprobe von einem weiteren Tier auf OvHV-2.1 Die Ergebnisse

dieser Untersuchungen sind in Tabelle 11 zusammengefasst.

Tabelle 11: Ergebnisse zusätzlicher Untersuchungen

Tiere und Proben-nummern

Augen-tupfer

Nasen-

tupfer

Anal-

tupfer

Blut

0,1 Anoa 6 neg neg neg /

0,1 Giraffe 4 neg neg neg /

0,7 Kamerunschafe 257, 263-268

/ / / pos

1,0 Säbelantilope 225

/ / / pos

1,3 Säbelantilopen 2, 1, 3, 5

neg neg neg /

0,3 Skudden

270, 272, 273

/ / / pos

0,2 Skudden

269, 271

/ / / neg

0,3 Zwergziegen

260, 261, 262

/ / / pos

0,2 Zwergziegen

258, 259

/ / / neg

1 An dieser Stelle möchte ich ganz herzlich den Mitarbeitern dieses Zoos und Herrn Dr. Schwarz für die Unterstützung danken.

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Ergebnisse

61

4.2.6 Anzahl der Tiere

Die folgende Übersicht (Abbildung 28) zeigt die Anzahl der BKF-Virus positiven und negativen Tie-

re insgesamt.

87%

13%Anzahl negativerTiere: 190

Anzahl positiverTiere: 28

Abbildung 28: Gesamtübersicht über Anzahl und Prozentsatz positiver und negativer Tiere

4.2.7 Unterteilung der Proben

Abbildungen 29 und 30 beinhalten die Anzahl und Auf teilung der negativen und positiven Proben.

94% 6%

Anzahl negativerProben: 645

Anzahl positiverProben: 41

Abbildung 29: Gesamtübersicht über Anzahl und Prozentsatz positiver und negativer Proben

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Ergebnisse

62

20

4

3

14

Blut positiv

Augentupfer positiv

Nasentupfer positiv

Analtupfer positiv

Abbildung 30: Aufteilung positiver Proben

Abbildung 31 zeigt, wie viele Tiere entweder positive Blut- oder Tupferproben und wie viele Tiere in

beiden Proben positiv reagiert haben.

6

8

14

nur Blut positiv

Blut und Tupfer positiv

nur Tupfer positiv

Abbildung 31: Positive Proben

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Ergebnisse

63

4.2.8 Altersverteilung der beprobten Tiere

Bei Betrachtung der Ergebnisse hinsichtlich des Alters der beprobten Tiere fiel auf, dass haupt-

sächlich adulte Tiere positive Ergebnisse lieferten, wie die folgende Grafik (Abbildung 32) zeigt.

unter 12 Monate negative; 22

unter 12 Monate positive; 1

über 12 Monate negative; 52

über 12 Monate positive; 26

0-7 Tage positive; 1

0-7 Tage negative 126

Abbildung 32: Alterverteilung der beprobten Tiere

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Ergebnisse

64

Tabelle 12 verzeichnet Art, Anzahl und Alter aller beprobten Tiere sowie Art, Anzahl und Alter der

positiven Tiere. Links ist die Tierart aufgeführt, in der Mitte die Gesamtzahl der beprobten Tiere

einer Tierart und in rot die Anzahl der davon positiven Tiere. In Klammern steht geschrieben, wel-

ches Virus in welcher Probe bei den positiven Tieren nachgewiesen wurde. Die rechte Spalte gibt

Auskunft über das Alter der positiven Tiere.

Tabelle 12: Art, Anzahl und Alter aller beprobten Tiere sowie Art, Anzahl und Alter der positiven Tiere

Tierart Anzahl/ davon positive Tiere Alter der positiven Tiere

Alpensteinbock Capra ibex

5/0

Anoa Bubalus depressicornis

1/0

Axishirsch Axis axis

2/0

Bongo Tragelaphus eurycerus

1/0

Burenziege Capra aegagrus f. hircus

10/1 (Tupfer MCFV-WTD)

über 12 Monate

Chinesischer Muntjak Muntjacus reevesi

2/0

Coburger Fuchsschaf Ovis orientalis f. aries

2/0

Dahomey Rind Bos primigenius f. taurus

1/0

Dallschaf Ovis dalli

5/0

Dik Dik

Madoqua sp.

1/0

Dybowskihirsch Cervus nippon hortulorum

5/0

Elch Alces alces

1/0

Elen Taurotragus oryx

2/0

Giraffe Giraffa cameloparadalis rot-schildi

6/0

Girgentanaziege Capra aegagrus f. hircus

4/0

Goral Naemorhedus goral

1/0

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Ergebnisse

65

Tierart Anzahl/ davon positive Tiere Alter der positiven Tiere

Großer Kudu Tragelaphus strepsiceros

2/0

Guanako Lama guanicoe

2/0

Heidschnucke Ovis orientalis f. aries

6/0

Hirschziegenantilope Antilope cervicapra

3/0

Impala Aepyceros melampus

8/0

Kamerunschaf Ovis orientalis f. aries

24/7 (7 Blutproben + 6 Tupfer OvHV-2)

über 12 Monate

Kleinkantschil Tragulus javanicus

1/0

Kleiner Kudu Tragelaphus imberbis

1/0

Leierhirsch Cervus eldii

1/0

Mähnenspringer Ammotragus lervia

1/0

Mergellandschaf Ovis orientalis f. aries

2/0

Moschusochse Ovibos moschatus

2/0

Nyala Tragelaphus sp.

3/0

Oryx Oryx leucoryx

1/0

Ovamboziege Capra aegagrus f. hircus

2/0

Pfauenziege Capra aegagrus f. hircus

6/5 (2 Tupfer CpHV-2 + 3 Tupfer MCVF-WTD)

über 12 Monate;

2,5; 3; 4 und 10,5 Jahre

Reh Capreolus capreolus

3/0

Rentier Rangifer tarandus

5/0

Rotbüffel Syncerus caffer nanus

1/0

Rotkopfschaf Ovis orientalis f. aries

5/0

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Ergebnisse

66

Tierart Anzahl/ davon positive Tiere Alter der positiven Tiere

Säbelantilope Oryx dammah

13/1 (Blut OvHV-2)

1 Tag

Schraubenziege Capra falconeri

8/4

(5 Tupfer CpHV-2)

11 Monate

4; 5,5 und 6,5 Jahre

Sikahirsch Cervus nippon

1/1

(3 Tupfer CpHV-2)

über 12 Monate

Sitatunga Tragelaphus sitatunga

1/0

Skudde Ovis orientalis f. aries

18/3 (3 Blutproben + 3 Tupfer OvHV-2)

über 12 Monate

Spießbock Oryx gazella

2/0

Springbock Andidorcas marsupialis

4/0

Tahr

Hemitragus sp.

3/0

Takin Budorcas taxicolor

1/0

Texel-Walliser Schaf Ovis orientalis f. aries

2/0

Ungarisches Steppenrind Bos primigenius f. taurus

1/0

Waldren Rangifer tarandus fennicus

4/0

Wapiti Cervus canadensis

1/0

Wasserbock Kobus ellipsiprymnus

1/0

Watussirind Bos primigenius f.taurus

3/0

Weißbartgnu Connochaetes taurinus

1/0

Weiße Deutsche Edelziege Capra aegagrus f. hircus

8/3 (2 Tupfer CpHV-2 + 1 Tupfer MCFV-WTD)

über 12 Monate

Wisent Bison bonasus

3/0

Yak Bos mutus f. grunniens

5/0

Zwergziege Capra aegagrus f. hircus

12/3 (3 Blutproben + 1 Tupfer OvHV-2)

über 12 Monate

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Ergebnisse

67

4.3 Zusammenfassung der Ergebnisse

Insgesamt wurden 649 Tupferproben und eine Blutprobe von 214 Tieren aus 44 verschiedenen

Tierarten in der Rt-PCR (CUNHA et al. 2009) auf das Vorhandensein von OvHV-2, AlHV-1, CpHV-

2 sowie MCFV-WTD untersucht. Positive Proben wurden anschließend in der cPCR (ROVNAK et

al. 1998) nachuntersucht. Einige der Proben, die positiv in der cPCR waren, wurden im Interdis-

ziplinären Zentrum für Klinische Forschung der Universität Leipzig sequenziert.

Ergebnisse von vier weiteren Tieren sowie von zwei bereits untersuchten Tieren, die zu unter-

schiedlichen Zeitpunkten beprobt wurden aus Zoo A, deren Augen-, Nasen- und Analtupferproben

sowie eine Blutprobe auf OvHV-2 mittels snPCR (BAXTER et al. 1993) untersucht wurden, stam-

men aus der LUA Sachsen. Zusätzliche Ergebnisse von 18 Blutproben dieser 218 Tiere wurden

von einem Zoo zur Verfügung gestellt.

Bei 28 (12,84 %) dieser 218 Tiere wurden BKF-Viren in Tupferproben mittels Rt-PCR nachge-

wiesen. Die positiven Ergebnisse der Rt-PCR wurden durch die cPCR mit anschließender Se-

quenzierung der PCR–Produkte bestätigt. Die 28 positiven Tiere gehören vier verschiedenen Tier-

arten an: Es handelt sich ausschließlich um adulte Haus- und Wildschafe, Haus- und Wildziegen,

Säbelantilopen und einen Sikahirsch. Bei keinem Tier war es unmittelbar nach der Geburt oder

wenige Tage später zu einer Ausscheidung von BKF-Viren gekommen. Die Geschlechterverteilung

war unauffällig.

Bei der Mehrzahl der positiven Tiere konnte Virus ausschließlich im Nasentupfer, bei einigen

dieser Tiere zusätzlich in der Blutprobe nachgewiesen werden.

4.3.1 Nachweis von AlHV-1

Bei keinem der untersuchten Tiere wurde AlHV-1 nachgewiesen.

4.3.2 Nachweis von OvHV-2

Bei sieben Kamerunschafen (3,2 % der untersuchten Tiere), drei Skudden (1,38 % der untersuch-

ten Tiere), drei Zwergziegen (1,38 % der untersuchten Tiere) und einer Säbelantilope (0,46 % der

untersuchten Tiere) konnte OvHV-2 aus Blutproben isoliert werden. Bei einer dieser Zwergziegen

und sieben dieser Schafe (fünf Kamerunschafe und zwei Skudden) wurde OvHV-2 auch in Tupfer-

proben nachgewiesen. Das Virus konnte bei sechs Tieren aus dem Nasentupfer, bei zwei Tieren

zusätzlich aus dem Augen- bzw. Analtupfer und bei zwei Tieren ausschließlich aus dem Augen-

bzw. Analtupfer isoliert werden.

4.3.3 Nachweis von CpHV-2

Vier Hausziegen (zwei Pfauenziegen und zwei Weiße Deutsche Edelziegen = 1,38 % der unter-

suchten Tiere) und vier Schraubenziegen (Markhore) (1,38 % der untersuchten Tiere) schieden

das CpHV-2 über die Nasenschleimhaut aus. Bei einem Markhor wurde zusätzlich im Augentupfer

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Ergebnisse

68

CpHV-2 gefunden. Bei einem Sikahirsch (0,46 % der untersuchten Tiere) wurde CpHV-2 in allen

Tupferproben nachgewiesen.

4.3.4 Nachweis von MCFV-WTD

Bei fünf Ziegen (2,3 % der untersuchten Tiere) wurde MCFV-WTD in der Nasenschleimhaut nach-

gewiesen. Hierbei handelt es sich um drei Pfauenziegen, eine Weiße Deutsche Edelziege und eine

Burenziege.

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Diskussion

69

5 Diskussion

5.1 Methodik der Probenuntersuchung

Die Entnahme der Tupferproben erfolgte nach einer Methode, mit der schon LI et al. (2004) erfolg-

reich BKF-Viren von Schleimhäuten gewinnen konnten. Dass diese Methode gut geeignet ist, wur-

de durch die erfolgreiche Isolierung von BKF-Viren aus den für diese Studie entnommenen Tup-

ferproben bestätigt.

Die Isolierung der viralen DNS erfolgte mittels eines kommerziellen DNS-Isolierkits. Speziell für

BKF-Viren konnten LI et al. (2004) während einer Studie zur Ausscheidung von OvHV-2 bereits

nachweisen, dass sich diese Methode sehr gut zur Isolierung dieser Viren eignet.

Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass aufgrund eines zu niedrigen Virusgehaltes

in der Tupferprobe während der Isolierung nicht genügend virale DNS aus dem Tupfer gewonnen

werden konnte, um ein positives PCR-Ergebnis zu erhalten. Diesem Problem wurde aber durch die

hochsensitive Rt-PCR von CUNHA et al. (2009) begegnet. Somit war die Gefahr falsch negativer

Ergebnisse durch zu wenig Template-DNS in der Probe ausreichend minimiert.

Wie die Ergebnisse der Vorversuche mit Positivkontrollen für AlHV-1 und OvHV-2 zeigten, er-

wies sich die Rt-PCR von CUNHA et al. (2009) als sensitiver gegenüber der cPCR von VAN

DEVANTER et al. (1996). Während die Positivkontrollen nur unverdünnt und in einer Verdünnung

von 1:10 positiv in der cPCR waren, konnte die Rt-PCR noch bis zu einer Verdünnung von 1:40

bzw. 1:80 derselben Proben virale DNS nachweisen.

Diese hervorragende Sensitivität haben auch CUHNA et al. (2009) bei der Rt-PCR festgestellt.

Im Vergleich zur cPCR von VAN DEVANTER et al. (1996), die für ein positives Ergebnis mindes-

tens 100 Viruskopien pro PCR-Reaktion in der Probe benötigt, erbrachte die Rt-PCR von CUNHA

et al. (2009) bereits ab einer Anzahl von 50 Viruskopien ein positives Resultat. Für die Untersu-

chung der Proben ist dies von entscheidender Bedeutung, da durch die Anwendung der Rt-PCR

auch Tiere detektiert werden, die nur geringe Virusmengen ausscheiden und von der cPCR mögli-

cherweise als negativ erfasst würden. Um die Rt-PCR zu kontrollieren, ist allerdings die cPCR her-

vorragend geeignet, da die PCR-Produkte der cPCR ausreichend groß sind, um sequenziert zu

werden und so das Ergebnis der Rt-PCR bestätigen können.

Mit der Rt-PCR von CUNHA et al. (2009) lassen sich die vier relevantesten BKF-Viren nachwei-

sen: AlHV-1, OvHV-2, Cp-HV-2 und MCFV-WTD. Dadurch erhält man bereits eine breite Übersicht

über das Vorkommen dieser Viren in der Zootierpopulation. Durch den Aufbau der Sonden und die

Kombination mit den Primern ist diese Rt-PCR außerdem äußerst spezifisch, was falsch positive

Ergebnisse minimiert. Dies konnte durch die cPCR mit anschließender Sequenzierung einiger

PCR-Produkte gezeigt werden.

Da die PCR einen Teil des hochkonservierten DNS-Polymerase-Gens bei BKF-Viren nachweist,

ist sie außerdem flexibel genug, um etwaige BKF-Viren zu detektieren, die durch Mutation in ande-

ren, labileren Bereichen der DNS nicht mehr hundertprozentig mit den Originalviren übereinstim-

men.

Die Möglichkeit, alle Proben zunächst mit der cPCR nach VAN DEVANTER et al. (1996) zu un-

tersuchen, wurde ebenfalls betrachtet, aber verworfen. Zwar wäre diese Methode – mit anschlie-

ßender Sequenzierung – geeignet gewesen, nicht nur vier, sondern auch weitere, möglicherweise

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Diskussion

70

noch unbekannte BKF-Viren zu detektieren. Allerdings ist durch die geringere Sensitivität der

cPCR gegenüber der Rt-PCR die Gefahr gegeben, viele falsch negative Ergebnisse zu erhalten

und so auch Ausscheider der vier wichtigsten BKF-Viren zu übersehen.

Durch die niedrige Annealingtemperatur und die Beschaffenheit der degenerierten Primer ist die

cPCR außerdem im Vergleich zur Rt-PCR nach CUNHA et al. (2009) relativ unspezifisch, so dass

leichter als bei der Rt-PCR falsch positive Ergebnisse entstehen können.

Bei der Etablierung der Rt-PCR verwendeten CUNHA et al. (2009) ausschließlich Probenmate-

rial von Tieren mit BKF-Symptomatik. Sie wiesen explizit darauf hin, dass die Untersuchung von

gesunden Tieren noch getestet werden muss. Die hier vorliegende Studie ergab, dass sich die Rt-

PCR sehr gut dafür eignet, BKF-Viren in Tupferproben von klinisch gesunden Tieren nachzuwei-

sen. Um weitere BKF-Viren über die vier hier untersuchten hinaus zu detektieren, könnte diese Rt-

PCR in einer weiteren Studie um spezifische Sonden für andere BKF-Viren erweitert werden.

5.2 Ergebnisse der Probenuntersuchung

Es ist festzuhalten, dass die große Mehrzahl der getesteten Wiederkäuer keines der vier unter-

suchten BKF-Viren ausschied. Somit ist der Verdacht geschmälert, dass auch Antilopen und ande-

re Wildwiederkäuer die gefährlichen BKF-Viren AlHV-1, OvHV-2, CpHV-2 und MCFV-WTD – die

von Gnus, Schafen und Ziegen ausgeschieden werden – häufig und über längere Zeiträume aus-

scheiden. Die Verbreitung dieser vier BKF-Viren scheint hauptsächlich von den bisher bekannten

Reservoirwirten auszugehen (siehe Tabellen 1 und 2) . Dennoch sind Aspekte zu beachten, die

möglicherweise zu falsch negativen Ergebnissen geführt haben könnten:

Da selbst die Rt-PCR von CUNHA et al. (2009) erst ab einem Virusgehalt von 50 Viruskopien in

100 ng Proben-DNS positiv reagiert, kann es bei einem Virusgehalt von weniger als 50 Virusko-

pien zu falsch negativen Ergebnissen kommen. Dies kann vorkommen, wenn zu wenig virale DNS

in der Tupferprobe enthalten ist, um von einer sensitiven PCR detektiert zu werden. Doch in die-

sem Fall ist zu bedenken, dass ein Wirt, der derart wenig Virus ausscheidet, wahrscheinlich für die

meisten Fehlwirte ungefährlich ist, da ein gewisser Infektionsdruck gegeben sein muss, um BKF

herbeizuführen (SYRJÄLA et al. 2006; CRAWFORD et al. 2002; LI et al. 2006a, 1999b; KALUNDA

at al. 1981b; KLEIBOEKER et al. 2002).

Allerdings ist auch zu bemerken, dass sich ein BKF-negatives Tier möglicherweise in einer

Ausscheidungsphase befindet, in der wenig oder gar kein Virus ausgeschieden wird und somit für

andere Tierarten doch eine Gefahr darstellt, falls es zu einem anderen Zeitpunkt mehr Virus aus-

scheidet. Solche Ausscheidungsphasen wurden bereits bei Schafen mit OvHV-2 nachgewiesen

und sind vermutlich auch bei anderen Reservoirwirten von BKF-Viren zu erwarten (LI et al. 2004).

Um dieses Problem in der vorliegenden Studie zu umgehen, erschien es sinnvoll, Tiere möglichst

mehrfach zu beproben oder aber Tiere verschiedener Altersgruppen zu untersuchen. Da die Mehr-

fachbeprobung bei Zootieren logistisch sehr schwier ig ist, wurden für diese Studie Tiere unter-

schiedlichen Alters untersucht. Denn um ein Tier beproben zu können, muss es zuvor narkotisiert

werden oder so jung sein – wenige Tage nach der Geburt – dass es ohne Narkose behandelt wer-

den kann. Das Risiko einer Narkose aber lediglich für die Entnahme von Tupferproben einzugehen,

ist aus Gründen des Tierschutzes nicht verantwortbar.

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Diskussion

71

Bei der Betrachtung der positiven Ergebnisse fällt zunächst auf, dass überwiegend in Tupferpro-

ben der Nasenschleimhaut BKF-Viren nachgewiesen werden konnten. Diese Ergebnisse decken

sich mit Untersuchungen von MUSHI et al. (1980a, b) und LI et al. (2004, 2005b), die zeigten, dass

BKF-Viren vornehmlich über die Nasenschleimhaut ausgeschieden werden. Zusätzlich wurde aber

auch virale DNS in Augen- und Analtupfern der hier beprobten Tiere nachgewiesen. Dies bestätigt,

dass auch diese Übertragungswege eine – wenn auch untergeordnete Rolle – spielen, wie auch

MUSHI et al. (1980a, b) und HÜSSY et al. (2002) zeigten. Weiterhin ist zu beachten, dass es sich

beim Nachweis von viraler DNS auf der Schleimhaut nicht unbedingt um infektiöses Virus handeln

muss. Es kann sich auch um Viruspartikel handeln, die nicht infektiös sind und somit anderen Tie-

ren nicht schaden können. Außerdem kann es bei der Entnahme von Tupferproben zu Blutungen

kommen, wobei eventuell latent infizierte Lymphozyten in die Probe gelangen können und zu ei-

nem positiven Ergebnis führen. Dabei handelt es sich dann aber nicht um ein Tier, dass sich in

einer Ausscheidungsphase befindet, sondern um einen latenten Träger. Um genauer zwischen

Ausscheider und latenten Trägern zu differenzieren, wäre die erneute Entnahme von Blut- und

Tupferproben zu unterschiedlichen Zeitpunkten erforderlich.

Die Frage, welches BKF-Virus bei welcher Tierart nachgewiesen werden kann, ist insofern rele-

vant, als dass bereits für das OvHV-2 gezeigt wurde, dass Ziegen dieses Virus zumindest latent

beherbergen, wenn nicht sogar ausscheiden können, obwohl der eigentliche Reservoirwirt für

OvHV-2 das Schaf ist (LI et al. 2001a). Ähnliche Fälle bei Rindern und Sitatungas wurden von

BAXTER et al. (1993), O’Toole et al. (1997) bzw. FLACH et al. (2002) veröffentlicht. Beim AlHV-1

konnte dies bisher nicht belegt werden. Diese Frage ist für die Zootierhaltung aber relevant, da das

AlHV-1 hier aufgrund seiner Pathogenität sehr gefürchtet ist. Da sich die Herpesviren parallel zu

ihren Reservoirwirten entwickelt haben (LI et al. 2005a), wurde befürchtet, dass das AlHV-1 even-

tuell nicht nur von Gnus, sondern auch von anderen Antilopen latent beherbergt und ausgeschie-

den werden kann.

Auffällig ist, dass – mit Ausnahme eines Sikahirsches1 – lediglich Hausschafe und - ziegen un-

terschiedlicher Rassen BKF-Viren ausschieden und das AlHV-1 gar nicht ausgeschieden wurde.

Dies deutet darauf hin, dass die BKF-Fälle bei Fehlwirten, deren Reservoirwirt nicht ermittelt wer-

den konnte, wahrscheinlich auf einen der bereits bekannten Reservoirwirte (siehe Tabellen 1 und 2)

zurückzuführen sind. Denn viele zoologische Gärten halten Hausschafe und Hausziegen in Strei-

chelzoos. Selbst wenn empfängliche Tierarten desselben Zoos nicht im angrenzenden Gehege zu

den Reservoirwirten gehalten werden, kann es sein, dass diese Reservoirwirte für die Infektion der

Fehlwirte verantwortlich waren. Denn LI et al. (2008) konnten beispielsweise für das OvHV-2 zei-

gen, dass es auch über Distanzen von fünf Kilometern aerogen übertragbar ist. Somit kann sogar

eine Schafherde außerhalb des Zoos für die BKF Erkrankungen im Zoo verantwortlich sein. Durch

die sehr variable Inkubationszeit und die saisonale Ausscheidung (LI et al. 2006a) könnte die

Krankheit sogar von Reservoirwirten ausgelöst werden, die sich zum Zeitpunkt der Erkrankung des

Fehlwirtes gar nicht mehr im betreffenden Zoo befinden. Außerdem spielt möglicherweise die me-

chanische Übertragung durch Zoopersonal eine größere Rolle als bisher angenommen.

1 Wie es zu der Ausscheidung von CpHV-2 bei dem Sikahirsch kam ist unklar. Vermutlich war er an BKF erkrankt und zur Diagnostik beprobt worden. Dass er die Viren auch ausschied, ist nicht ungewöhnlich, denn Fehlwirte können ebenfalls BKF-Viren ausscheiden (ALBINI et al. 2003). Weitere Infektionen in der gleichen Herde Fehlwirte unterbleiben aber anscheinend immer (KLEIBOEKER et al. 2002, KALUNDA et al. 1981a, b).

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Diskussion

72

Dass das AlHV-1 bei keinem der hier untersuchten Tiere nachgewiesen wurde, lässt vorsichtig

vermuten, dass die gefürchtete Ausscheidung von AlHV-1 durch andere Antilopen nicht Auslöser

für die BKF-Fälle waren, deren Reservoirwirt nicht zu ermitteln war. Um aber sicher ausschließen

zu können, dass andere Tierarten das AlHV-1 weder latent beherbergen noch ausscheiden kön-

nen, sind weitere Blut- und Tupferuntersuchungen notwendig. Hierbei ist zu beachten, dass für

diese kontrollierten Studien an Antilopen eine große Anzahl an Tieren in Narkose untersucht wer-

den muss, was aus Tierschutzgründen nicht vertretbar ist.

Die Ausscheidung von OvHV-2 bei Kamerunschafen, Skudden und Zwergziegen deutet darauf

hin, dass auch bei den aufgetretenen BKF-Fällen durch OvHV-2 keine Antilopen an der Verbrei-

tung beteiligt waren. Der Vergleich der Ergebnisse der Untersuchung von Blut und Tupfern dersel-

ben Hausschafe und -ziegen ergab, dass nicht alle Tiere, bei denen OvHV-2 im Blut nachweisbar

war, auch OvHV-2 ausschieden. Dies könnte daran liegen, dass diese Tiere möglicherweise latent

mit OvHV-2 infiziert waren, sich aber momentan nicht in einer Ausscheidungsphase befanden.

Die Schafe stellen demzufolge im Moment keine Gefahr für empfängliche Arten dar. Die OvHV-

2-Infektion kann aber jederzeit vom latenten ins lytische Stadium übergehen, wobei OvHV-2 aus-

geschieden wird. Für den Schafbestand insgesamt bedeutet dies, dass das OvHV-2 in der Herde

kursiert. Daraus sollten Konsequenzen, wie die Etablierung einer virusfreien Schafherde in diesem

Zoo, gezogen werden.

Der Nachweis von OvHV-2 im Blut von Säbelantilopen ist genauer zu betrachten. Bei keiner der

hier untersuchten Säbelantilopen war die Ausscheidung von OvHV-2 nachweisbar. Dass dennoch

OvHV-2 bei gesunden Säbelantilopen im Blut nachweisbar war, ist bemerkenswert. Auch in dieser

Herde von Säbelantilopen gab es keinen Fall von BKF, und die besagten infizierten Antilopen zeig-

ten keine BKF-Symptomatik. Da Säbelantilopen Fehlwirte für das OvHV-2 darstellen, OvHV-2 nicht

in nachweisbaren Mengen ausgeschieden wurde und keine weiteren Tiere der Herde erkrankten,

verhält sich das Virus bei diesen Tieren möglicherweise ähnlich wie bei Ziegen: Säbelantilopen

können es zwar latent tragen, scheiden aber womöglich keine oder für eine Infektion zu geringe

Virusmengen oder aber instabile Viruspartikel aus, so dass keine weiteren Herdenmitglieder infi-

ziert werden. Um dies zu belegen, müssen weitere Untersuchungen zur Menge und Stabilität des

ausgeschiedenen Virus bei Säbelantilopen folgen.

Dass das CpHV-2 von Ziegen ausgeschieden wurde, war zu erwarten, da Ziegen der natürliche

Reservoirwirt dieses Virus sind (CHMIELEWICZ et al. 2001). Wichtig für den Zoo oder Tierpark,

der diese Ziegen hält, ist allerdings zu wissen, dass das CpHV-2 im Bestand verbreitet ist und so-

mit benachbarte empfängliche Tierarten gefährdet.

Die Ergebnisse zur Ausscheidung vom MCFV-WTD sind hervorzuheben. Bisher war unklar,

welche Tierart dieses Virus, das bei Weißwedelhirschen BKF auslöste, latent beherbergt und ver-

breitet (LI et al. 2000). Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass möglicherweise ver-

schiedene Ziegenrassen ein Reservoir für das MCFV-WTD darstellen. Denn trotz der Vielzahl der

hier untersuchten Tierarten, die als Reservoirwirte theoretisch in Frage kämen, war dieses Virus

lediglich bei Ziegen nachweisbar. Dennoch ist zu erwähnen, dass zur Erhärtung dieses Verdachts

weitere Untersuchungen zur Ausscheidung von BKF-Viren bei Ziegen durchgeführt werden müs-

sen. Von Ziegen ist bekannt, dass sie auch OvHV-2 latent beherbergen können, dessen regulärer

Reservoirwirt das Schaf ist. Bei Ziegen konnte allerdings bisher keine Ausscheidung von OvHV-2

nachgewiesen werden (LI et al. 2005b). Möglicherweise verhält es sich mit dem MCFV-WTD ähn-

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Diskussion

73

lich und der „richtige“ Reservoirwirt gehört einer anderen Tierart an. Ziegen könnten dann das

MCFV-WTD wie das OvHV-2 latent beherbergen, ohne zu erkranken.

Dass bei keinem der unmittelbar nach der Geburt sowie einige Tage danach untersuchten Tiere

eine Ausscheidung von BKF-Viren nachweisbar war, mag vielerlei Gründe haben. Zum einen ist

die Ausscheidung der untersuchten Viren sehr unterschiedlich. Zum Beispiel wird das AlHV-1 von

Gnukälbern schon in den ersten Lebenstagen bis zum vierten Lebensmonat (MUSHI et al. 1980a,

b; RWEYEMAMU et al. 1974), das OvHV-2 von Schafen hauptsächlich im Alter von sechs bis

neun Monaten ausgeschieden (LI et al. 2004). Über die Ausscheidungsparameter von CpHV-2 und

MCFV-WTD ist noch wenig bekannt.

Im Fall von OvHV-2 waren die Tiere möglicherweise zu jung, um Virus auszuscheiden. Um

trotzdem OvHV-2-Ausscheider identifizieren zu können, wurden in der vorliegenden Studie Tiere

unterschiedlicher Altersklassen untersucht.

Für den Nachweis von AlHV-1 war der Zeitpunkt der Probenentnahme nach der Geburt günstig

(PLOWRIGHT 1965b). Da dies aber nur für Gnus belegt ist, muss bedacht werden, dass andere

Tierarten möglicherweise auch zu einem anderen Zeitpunkt AlHV-1 ausscheiden könnten. In die-

ser Studie wurden neben neugeborenen Tieren auch äl tere Tiere beprobt. Dennoch wurde das

AlHV-1 nicht nachgewiesen. Dies kann ein Hinweis darauf sein, dass das AlHV-1 nicht – wie be-

fürchtet – sehr weit in der Zootierpopulation verbreitet ist oder gar von anderen Zoowiederkäuern

wie beispielsweise Antilopen anderer Arten ausgesch ieden wird. Um aber sicher auszuschließen,

dass AlHV-1 nicht doch latent von anderen Antilopen beherbergt wird, müssten zusätzlich zu den

Tupferproben weitere Blutuntersuchungen durchgeführt werden. Denn Tupferproben erlauben nur

eine Aussage darüber, ob die Tiere im Moment der Probenentnahme Virus ausscheiden oder nicht;

nicht aber darüber, ob sie das Virus latent beherbergen.

Da über die Ausscheidungsparameter von CpHV-2 und MCFV-WTD noch wenig bekannt ist,

kann über den idealen Zeitpunkt der Probenentnahme wenig gesagt werden. Man kann sich – wie

hier geschehen – zur Probenentnahme lediglich nach den bisher bekannten Ausscheidungszeit-

punkten vom AlHV-1 und OvHV-2 richten und Tiere unterschiedlichen Alters untersuchen.

Neugeborene Wiederkäuer dieser Studie scheinen nich t maßgeblich an der Verbreitung von

BKF-Viren beteiligt gewesen zu sein. Im Hinblick auf die Vergesellschaftung verschiedener Tierar-

ten in zoologischen Gärten ist diese Erkenntnis wichtig, da andernfalls neugeborene Wiederkäuer

von der Herde getrennt werden müssten, bis die Virusausscheidung beendet ist. Dennoch ist zu

bedenken, dass die Aussage über das Verhalten der BKF-Viren bei Neonaten aufgrund der gerin-

gen Tiergesamtzahl unter Vorbehalt zu betrachten ist. Bei nur einem unter 12 Monate alten Tier

wurde die Ausscheidung von BKF-Viren nachgewiesen. Die Mehrzahl der positiven Tiere war über

12 Monate alt. Dies widerspricht scheinbar den Untersuchungen von LI et al. (2004) und MUSHI et

al. (1980a, b), die hauptsächlich bei Jungtieren eine Virusausscheidung feststellten. Andererseits

ist aber bekannt, dass auch ältere Tiere Virus ausscheiden, allerdings meistens nur, wenn sie

schon erkrankt oder gestresst sind (PLOWRIGHT 1986; LI et al. 2004).

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Diskussion

74

5.3 Schlussbetrachtung

Verglichen mit der Anzahl der Tiere, die in dieser Studie keine BKF-Viren ausschieden, ist die An-

zahl an Ausscheidertieren gering. Markhore, Pfauenziegen, Edelziegen und Burenziegen schieden

BKF-Viren aus, die nachweislich pathogen sind. Dies deutet darauf hin, dass sich die BKF-Fälle in

zoologischen Gärten möglicherweise hauptsächlich durch die Anwesenheit bisher bekannter Re-

servoirwirte erklären lassen. Bei den anderen untersuchten Tieren, deren Tupferproben negativ

waren, ist es dennoch schwierig, zu einer endgültigen Aussage bezüglich des Infektionsrisikos

durch diese Tierarten zu kommen. Durch die – negativen – Tupferproben kann nicht ausgeschlos-

sen werden, dass die untersuchten Tierarten nicht doch latent BKF-Viren beherbergen. Um der

Frage der Latenz nachzugehen und um dann einschätzen zu können, ob die latent infizierten Tiere

auch Ausscheider sind, müssten weitere Blutuntersuchungen parallel zu Untersuchungen von wei-

teren, zu unterschiedlichen Zeitpunkten entnommenen Tupferproben an narkotisierten Tieren er-

folgen.

Aufgrund des häufigeren Auftretens von BKF-Viren bei den bisher bekannten Reiservoirwirten,

sollte das Augenmerk zunächst vor allem auf diese Tierarten gelegt werden, wenn es um die Iden-

tifikation der Ausscheider von BKF-Viren in einem zoologischen Garten oder Tierpark geht. Hier

sollten vor allem das diagnostische Vorgehen bei BKF-Verdacht überprüft sowie die Distanzen

zwischen den Gehegen von Reservoir- und Fehlwirten kontrolliert werden.

Die Vergesellschaftung verschiedener Arten ist möglich, wobei aber immer ein gewisses Risiko

einkalkuliert werden muss, da bisher allgemein zu wenig über das Ausscheidungsverhalten von

BKF-Viren bei Reservoir- und Fehlwirten bekannt ist.

Bekannte Reservoir- und Fehlwirte voneinander zu trennen, sollte selbstverständlich sein. Au-

ßerdem ist zu beachten, dass beim OvHV-2 gezeigt wurde, dass es auch über Entfernungen von

bis zu fünf Kilometern übertragen werden kann. Diese Distanz zwischen Gehegen von Reservoir-

und Fehlwirt in zoologischen Gärten einzuhalten erscheint sehr schwierig, wenn nicht sogar un-

möglich. So muss eventuell sogar in Betracht gezogen werden, in Zoos gänzlich auf die Haltung

von Reservoirwirten zu verzichten. Um dies zu umgehen kann erwogen werden, virusfreie Bestän-

de durch Handaufzucht zu etablieren (LI et al. 1999a; LI et al. 2005b) und eine strikte Quarantäne

für mögliche Reservoirwirte bei Zugängen, Umstallungen und Vergesellschaftungen einzuhalten,

während der die Tiere gegebenenfalls mehrfach beprobt werden sollten.

Zur Feststellung, ob es sich um ein Tier handelt, das momentan BKF-Viren ausscheidet, ist die

Entnahme von Tupferproben geeignet. Zusammen mit den Tupferproben sollten Blutproben auf

BKF-Viren untersucht werden, um latente Träger zu erkennen. Allerdings ist hier wieder darauf

hinzuweisen, dass nicht alle Tiere, bei denen BKF-Viren im Blut nachgewiesen wurden, auch Virus

ausschieden. Tiere – Fehlwirte –, die lediglich BKF-Viren in der Blutprobe aufweisen, aber gar kein

infektiöses Virus ausscheiden können, dürfen aber durch eine positive Blutprobe nicht vorschnell

als Reservoirwirt angesehen werden. Möglicherweise ließe sich durch die Verabreichung von Glu-

kokortikoiden während der Quarantäne die Ausscheidung von BKF-Viren herbeiführen und so ein

Reservoirwirt identifizieren (HEUSCHELE et al. 1985). Aufgrund der Nebenwirkungen von Gluko-

kortikoiden muss diese Möglichkeit aber kritisch betrachtet werden. Durch den Stress, den die Tie-

re in Quarantäne erfahren, wird die Virusausscheidung möglicherweise ohnehin ausreichend sti-

muliert, um virale DNS in Tupferproben nachweisen zu können.

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Diskussion

75

Außerdem ist zu beachten, dass auch bei der hier vorliegenden Studie BKF-Viren in Analtupfern

nachgewiesen wurden und somit auch die Gefahr der Ansteckung durch den Kot infizierter Tiere

nicht ausgeschlossen werden kann.

Bei Auftreten von BKF sollte das erkrankte Tier auf alle der vier hier untersuchten Viren getestet

werden. Sind diese Tests negativ, sollte erwogen werden, das Tier mit der cPCR nachzuuntersu-

chen und das PCR-Produkt zu sequenzieren. Denn möglicherweise handelte es sich tatsächlich

um BKF, das aber durch ein Virus ausgelöst wird, für das es noch keine spezifische PCR gibt. In

diesem Fall könnte durch die Sequenzierung eines ausreichend großen PCR-Produktes das Virus

genauer bestimmt werden und Ausschluß über den Reservoirwirt geben, von dem die Erkrankung

ausging.

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Zusammenfassung

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6 Zusammenfassung

Talena Matzat

Beitrag zum Bösartigen Katarrhalfieber bei Wiederkäuern in zoologischen Gärten

Institut für Virologie, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig und Zoologischer Garten

Leipzig

Eingereicht im April 2011

79 Seiten, 32 Abbildungen, 12 Tabellen, 178 Literaturangaben, Anhang

Schlüsselworte: Bösartiges Katarrhalfieber, Herpesviren, AlHV-1, OvHV-2, CpHV-2, MCFV-WTD

Bösartiges Katarrhalfieber ist eine unheilbare Virusinfektion bei Paarhufern, die wiederholt in zoo-

logischen Gärten auftrat, ohne dass die erkrankten Fehlwirte Kontakt zu Reservoirwirten hatten.

Die BKF-auslösenden Gammaherpesviren sind eng miteinander verwandt und werden von ver-

schiedenen klinisch gesunden Reservoirwirten latent beherbergt und ausgeschieden.

Einige dieser Reservoirwirte sind seit längerem bekannt, andere wurden erst kürzlich identifi-

ziert und es wird vermutet, dass es noch weitere unerkannte Reservoirwirte für BKF-Viren gibt.

Hervorzuheben ist, dass die Viren normalerweise eng an ihre Reservoirwirte gebunden sind. Es

traten in letzter Zeit jedoch immer wieder Fälle auf, in denen auch Fehlwirte zwar infiziert waren,

aber nicht erkrankten oder das Virus sogar ausschieden.

Der Zusammenhang zwischen dem Verhalten der BKF-Viren bei Fehl- und Reservoirwirten und

den ungeklärten BKF-Fällen in zoologischen Gärten wurde in der hier vorliegenden Studie näher

untersucht. Es sollte herausgefunden werden, ob Wildwiederkäuer, die bisher nicht als Reservoir-

wirte für BKF-Viren galten, diese Viren ausscheiden und so möglicherweise für die oben erwähn-

ten BKF-Fälle verantwortlich waren.

Es wurden Proben auf die vier verschiedenen BKF-Viren getestet, die am häufigsten zu BKF

führen, in zoologischen Gärten von hoher Relevanz und nachweislich sehr pathogen sind: Alce-

laphines Herpesvirus 1, Ovines Herpesvirus 2, Caprines Herpesvirus 2 und Malignant catarrhal

fever virus – White-tailed deer.

Wie die Untersuchungsergebnisse zeigen, ist die Verbreitung der hier untersuchten BKF-Viren

sehr unterschiedlich. AlHV-1 wurde bei keiner Tierart in den Tupferproben nachgewiesen. Den-

noch darf nicht außer acht gelassen werden, dass Tiere, die momentan AlHV-1 nicht ausscheiden

trotzdem latente Träger sein können und möglicherweise zu einem späteren Zeitpunkt Virus aus-

scheiden. Im Gegensatz dazu wurden das OvHV-2, das CpHV-2 und das MCFV-WTD bei mehre-

ren Tieren festgestellt. Der Nachweis dieser Viren ausschließlich bei Hauswiederkäuern lässt ver-

muten, dass diese Viren nicht massiv von Wildwiederkäuern ausgeschieden werden. Dennoch ist

es möglich, das die Wildwiederkäuer in dieser Studie latent infiziert waren und nur zu dem Zeit-

punkt der Tupferprobenentnahme kein Virus ausschieden. Um latente Infektionen auszuschließen

sind weitere Blutuntersuchungen nötig.

Die Übertragung der BKF-Viren auf Tiere, die keinen direkten Kontakt zu Reservoirwirten im

Zoo hatten, kann auf aerogenem Wege erfolgt sein, da BKF-Viren auch über weite Distanzen hin-

weg und passiv übertragen werden können. Auch können Schafe oder Ziegen außerhalb der Zoos

oder längst aus dem Bestand entfernte Reservoirwirte die Viren übertragen haben.

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Zusammenfassung

77

Der Nachweis von MCFV-WTD bei Ziegen war unerwartet. Bisher war unbekannt, welche Tierart

diesem Virus als Reservoirwirt dient. Der Nachweis dieses Virus in der Nasenschleimhaut von Zie-

gen zeigt, dass diese Tiere das Virus ausscheiden und somit der Reservoirwirt dieses Virus sein

könnten. Diesen Sachverhalt gilt es ebenfalls weiter zu untersuchen.

Letztendlich sollte in zoologischen Gärten und Wildparks weiterhin darauf geachtet werden, be-

kannte Reservoirwirte streng getrennt und weit entfernt von empfänglichen Tierarten zu halten und

sie auf keinen Fall zu vergesellschaften. Die Einhaltung strenger Hygienevorschriften und der Ein-

satz unterschiedlicher Pfleger für Reservoir- und Fehlwirte ist unverzichtbar.

Um die Anzahl von Reservoirwirten zu minimieren, besteht außerdem die Möglichkeit Schafe

und Ziegen durch Handaufzucht virusfrei aufzuziehen oder ganz auf die Haltung von Reservoirwir-

ten zu verzichten. Bei Neuzugängen oder Vergesellschaftungen von Wiederkäuern aller Art ist eine

strikte Quarantäne und individuelle Beprobung der T iere durchzuführen um festzustellen, ob diese

Tiere BKF-Viren ausscheiden oder latent beherbergen. Außerdem können so möglicherweise bis-

her unerkannte Reservoirwirte identifiziert werden.

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Summary

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7 Summary Talena Matzat

Contribution to malignant catarrhal fever in ruminants in zoological gardens

Institute of Virology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig and Zoological Garden

Leipzig

Submitted in April 2011

79 pages, 32 figures, 12 tables, 178 references, appendix

Keywords: malignant catarrhal fever, herpesvirus, AlHV-1, OvHV-2, CpHV-2, MCFV-WTD

Malignant catarrhal fever (MCF) is an incurable infectious disease in even-toed ungulates, which

occurred repeatedly in zoological gardens in Europe without any contact between known hosts and

animals with clinical MCF. The causative agents are closely related viruses of the family gamma-

herpesviridae, which are latently carried and shed by different clinically healthy ruminant species.

Some of the hosts for MCF viruses have been known for many years, while others have been

identified only recently. Yet, there are probably still more host species to be discovered. It has to

be pointed out that generally MCF viruses are strictly associated with their hosts. However, it has

been reported that known susceptible species were infected with MCF viruses without showing any

signs of MCF, some of which even excreted the virus.

This present study investigates the relationship between the behaviour of MCF viruses in hosts

and susceptible species and the nebulous cases of MCF in zoological gardens. The goal was to

determine whether wild ruminants, which are normally not known as hosts for MCF, shed these

viruses and are possibly responsible for MCF cases mentioned above.

For this study, samples of different ruminant species were taken and examined for the four MCF

viruses that cause MCF most frequently, that are of high relevance in zoological gardens and

known to be very pathogenic: Alcelaphine Herpesvirus 1, Ovine Herpesvirus 2, Caprine Herpes-

virus 2 and Malignant catarrhal fever virus – White-tailed deer.

The investigations show that the distribution of these MCF viruses differs. AlHV-1 was not

detected in any of the swab samples of the examined ruminant species. But we have to keep in

mind that an animal which does not shed AlHV-1 momentarily can still be latently infected and may

endanger other animals by shedding the virus at some other point of time. In contrast, OvHV-2,

CpHV-2 and MCFV-WTD were detected in certain species. The detection of these viruses only in

domestic ruminants supposes that these viruses are not shed predominantly by wild ruminants.

Still, it might be possible that the examined species were latently infected and did not shed virus

only at the time the swab samples were taken. In order to rule out latent infections, it is necessary

to take more blood samples.

The remaining question is, how the animals with clinical MCF where infected without any

contact with known host species. One explanation may be that sheep and goats in the same zoo –

or even from beyond the borders of the zoo – transmitted the virus via aerosols. It might even be

possible that hosts which had left the zoo long before were responsible for but not associated with

the recent cases of MCF due to the long incubation period.

The detection of MCFV-WTD in goats in this study was unexpected. Until today the exact host

for this virus has not been identified. The detection of this virus on the nasal mucous membrane in

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Summary

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goats shows that these animals are capable of shedding MCFV-WTD and therefore might be this

virus’ hosts. However, this needs further investigations.

In conclusion, it is very important to keep hosts and susceptible species in different enclosures

and as far away as possible from each other. It should be self-evident not to keep hosts and sus-

ceptible species together in a mixed species enclosure. Strict hygienic measures should be taken

when caring for the animals and different keepers for hosts and susceptible species are a man-

datory.

Further measures for preventing MCF in zoological gardens such as the establishment of virus

free populations of goats and sheep through hand rearing or even the abandonment of host

species in zoological gardens should be taken into account.

When introducing or mixing new ruminant species in a zoo a strict quarantine should be realized

during which an individual testing for MCF viruses should take place in order to detect the

shedding of or latent infection with MCF viruses.

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Page 104: Beitrag zum Bösartigen Katarrhalfieber bei Wiederkäuern in ... · nPCR Nested PCR . V . Nr. Nummer ORF Open reading frame OvHV-2 Ovines Herpesvirus 2 PCR Polymerase chain reaction

Tabelle 1: BKF-Viren mit Angabe des Reservoirwirtes. der Pathogenität für andere Tierarten, den Autoren, die den DNS-Nachweis erbrachten bzw. das Genom sequenzierten, sowie der genetischen Homologie im ORF 9 (DNS-Polymerase-Gen) zwischen den einzelnen Viren in Prozent.

Bezeichnung Reservoirwirt Pathogen, Quelle: vgl. Tabelle 2

DNS-Nachweis bzw. Homologie-vergleich zwischen den Viren

Homologie zum AlHV-1 im ORF 9

Homologie zu anderen BKF-Viren im ORF 9

AlHV-1 Streifengnu, Weißschwanzgnu

ja MURPHY et al. 1994 ; ENNSER

et al. 1997

100% s.u.

MCFV-Oryx Oryx nicht bekannt LI et al. 2003a; LI et al. 2005a 85,10% 100% HiHV-1

SpHV-2 Springbock nicht bekannt PAGAMJAV et al. 2005 60% 62% CpHV-2

AlHV-2 Kuhantilope, Topi nicht bekannt REID u. ROWE 1973 80% 70,2% OvHV-2

AlHV-2 ähnlich wahrscheinlich Jackson Kuhantilope

ja KLIEFORTH et al. 2002 80% 94% AlHV-2

60% OvHV-2

67% MCFV-WTD

OvHV-2 Schaf ja BAXTER et al. 1993;

BRIDGEN u. REID 1991; HART et al. 2007;

72,1% 83,2% MCFV-WTD (KLEIBOEKER et al. 2002)

OvHV-2 ähnlich (HiHV-2)

Säbelantilope ja FLACH et al. 2002 k.A. k.A.

CpHV-2 Ziege ja CHMIELEWICZ et al. 2001 77% 84% OvHV-2

MCFV-Ibex Nubischer Steinbock ja LI et al. 2003a 68% 89,3% CpHV-2

MCFV-WTD unbekannt ja LI et al. 2000; KLEIBOEKER et al. 2002 71% 82% OvHV-2

MCFV-Muskox Moschusochse nicht bekannt LI et al. 2003a 68% 82,5% MCFV-WTD

79,2% OvHV-2

HiHV-1 Pferdeantilope ja LI et al. 2005a, SCHOCK u. REID 1996 89% 100% MCFV-Oryx

MCFV-Aoudad Mähnenspringer nicht bekannt LI et al. 2005a 68% 67% CpHV-2

An

ha

ng

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Anhang

94

Tabelle 2: Tierarten, die Reservoirwirte für BKF-Viren sind bzw. die Antikörper gegen BKF-Viren ohne Symptomatik aufwiesen; Tierarten, bei denen BKF symptomatisch auftrat

Tierart Latein Familie Reservoirwirt von

BKF-Symptomatik durch

BKF-Symptomatik experimentell durch

Quelle

Addaxantilope Addax nasomaculatus Bovidae AlHV-1 SEIDEL 1995

Alpensteinbock Capra ibex ibex Bovidae MCFV-Ibex LI et al. 2003a

Anoa Bubalus depressicornis Bovidae GammaHV FLACH et al. 2002

Arabische Oryxantilope Oryx leucoryx Bovidae AlHV-1 SEIDEL 1995

Atlashirsch Cervus elaphus Cervidae AlHV-2 ähnlich von Jackson Kuhantilope

KLIEFORTH et al. 2002

Axishirsch Axis axis Cervidae OvHV-2, AlHV-1 LI et al. 1999b

Banteng Bos javanicus javanicus

Bovidae OvHV-2 HÄNICHEN et al. 1998; HEUSCHELE 1988

Barasinghahirsch Cervus duvauceli Cervidae OvHV-2 FLACH et al. 2002

Beisaantilope Oryx beisa Bovidae AlHV-1 SEIDEL 1995

Bongo Tragelaphus eurycerus Bovidae MCFV-Ibex OKESON et al. 2007

Buschbock Tragelaphus scriptus Bovidae AlHV-1 SEIDEL 1995

Damhirsch Dama dama Cervidae OvHV-2 HEGEL 1995

Dickhornschaf Ovis canadensis Bovidae Antikörper gegen BKF-Viren

SEIDEL 1995

Dünengazelle Gazella leptoceros Bovidae AlHV-1 SEIDEL 1995

Elch Alces alces Cervidae OvHV-2 HEGEL 1995

Elenantilope Taurotragus oryx Bovidae AlHV-1 SEIDEL 1995

Gabelbock Antilocapra americana Antilocapridae AlHV-1 SEIDEL 1995

Gaur Bos gaurus gaurus Bovidae OvHV-2 HÄNICHEN et al. 1998; HEUSCHELE 1988

Giraffengazelle Litocranius walleri Bovidae AlHV-1 METEYER et al. 1989

Großer Kudu Tragelaphus strepsiceros

Bovidae GammaHV AlHV-1 FLACH et al. 2002; SEIDEL 1995

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Anhang

Tierart Latein Familie Reservoirwirt

von BKF-Symptomatik durch

BKF-Symptomatik experimentell durch

Quelle

Hamster Cricetidae Wühler AlHV-1 KALUNDA et al. 1981b

Hausschaf Ovis aries Bovidae OvHV-2 / OvHV-2, hohe Dosis BAXTER et al. 1993; LI et al. 2005c

Hausziege Capra hircus Bovidae CpHV-2, OvHV-2 OvHV-2 LI et al. 2004; LI et al. 2001a; CHMIELEWICZ et al. 2001; JACOBSEN et al. 2007

Hirschziegenantilope Antilope cervicapra Bovidae AlHV-1 FLACH et al. 2002; SEIDEL 1995

Impala Aepyceros melampus Bovidae GammaHV PAGAMJAV et al. 2005

Jackson Kuhantilope (höchstwahrscheinlich)

Alcelaphus buselaphus jacksoni

Bovidae AlHV-2 ähnlich KLIEFORTH et al. 2002

Kaninchen Leporidae Hasen AlHV-1, OvHV-2, HiHV-2, HiHV-1

KALUNDA et al. 1981b; FLACH et al. 2002; SCHOCK u. REID 1996

Kuhantilope Alcelaphus buselaphus Bovidae AlHV-2 REID u. ROWE 1973

Leierantilope Damaliscucs lunatus Bovidae AlVH-1 SEIDEL 1995

Mähnenspringer Ammotragus lervia Bovidae MCFV-Aoudad OvHV-2 LI et al. 2005; YERUHAM et al. 2004

Meerschweinchen Caviomorpha Meer-schweinchen

AlHV-1 KALUNDA et al.1981b

Milu Elaphurus davidianus Cervidae OvHV-2 REID et al. 1987; FLACH et al. 2002, ORR et al. 1987

Moorantilope Kobus megaceros Bovidae GammaHV AlHV-1 FLACH et al. 2002; SEIDEL 1995

Moschusochse Ovibos moschatus Bovidae MCFV-Muskox LI et al. 2003a

Mufflon Ovis musimon Bovidae OvHV-2 LI et al. 1999b

Nilgauantilope Bosephalus tragocamelus

Bovidae AlHV-1 CERCNY et al. 1978

Nilgiri Tahr Hemitragus hylocrius Bovidae OvHV-2 NIELSEN et al. 1988

Nubischer Steinbock Capra nubiana Bovidae LI et al. 2003a

Pferdeantilope Hippotragus equinus Bovidae HiHV-1 OvHV-2, AlHV-1 REID u. BRIDGEN 1991;GULLAND et al. 1989

Rappenantilope Hippotragus niger Bovidae AlHV-1 SEIDEL 1995

Reh Capreolus capreolus Cervidae OvHV-2 HÄNICHEN u. MANNL 1984

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Anhang

Tierart Latein Familie Reservoirwirt

von BKF-Symptomatik durch

BKF-Symptomatik experimentell durch

Quelle

Rentier Rangifer tarandus Cervidae OvHV-2 KIUPEL et al. 2004; LI et al. 1999; ALTMANN et al. 1973

Riedbock Redunca arundinum Bovidae AlHV-1 SEIDEL 1995

Rind Bos taurus Bovidae OvHV-2 nach Genesung

AlHV-1,OvHV-2 O`TOOLE 1997; TAUS et al. 2005

Rotducker Cephalophus rufilatus Bovidae AlHV-1 METEYER et al. 1989

Rothirsch Cervus elaphus Cervidae OvHV-2 HÄNICHEN et al. 1998;

Rotschildgiraffe Giraffa camelopardis rothschildi

Giraffidae AlHV-1, OvHV-2 MENSINK et al. 1997; POL et al. 1993

Säbelantilope Oryx dammah Bovidae GammaHV-

evtl. HiHV-2

FLACH et al. 2002

Schraubenziege Capra falconeri Bovidae Antikörper gegen BKF-Viren

SEIDEL 1995

Schwarzwedelhirsch Odocoileus hemionus Cervidae OvHV-2 LI et al. 1999b

Schwein Suidae OvHV-2 ALBINI et al. 2003; LØKEN et al.1998

Schweinshirsch Axis porcinus Cervidae GammaHV FLACH et al. 2002

Sikahirsch Cervus nippon Cervidae AlHV-1, CpHV-2 CRAWFORD et al. 2002; KEEL et al. 2003

Sitatunga Tragelaphus spekei Bovidae GammaHV, OvHV-2-ähnlich

OvHV-2,AlHV-1 ASHTON 1982; FLACH et al. 2002

Springbock Andidorcas marsupialis Bovidae SpHV-2 PAGAMJAV et al. 2005

Steppenbison Bison bison Bovidae GammaHV OvHV-2 FLACH et al. 2002; LI et al. 2006a

Streifengnu Connochaetes taurinus Bovidae AlHV-1 PLOWRIGHT et al. 1960

Südafrikanische Spießbock/Oryx

Oryx gazella Bovidae MCFV-Oryx FLACH et al. 2002; LI et al. 2003

Topi Damaliscus korrigum Bovidae AlHV-2 MUSHI et al. 1981a

Wasserbock Kobus ellipsiprymnus Bovidae GammaHV FLACH et al. 2002

Wasserbüffel Bubalus bubalis Bovidae OvHV-2 WIYONO et al. 1994

Wasserreh Hydropotes inermis Cervidae AlVH-1 METEYER et al. 1989

96

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Anhang

Tierart Latein Familie Reservoirwirt von

BKF-Symptomatik durch

BKF-Symptomatik experimentell durch

Quelle

Weißschwanzgnu Connochaetes gnou Bovidae AlHV-1, AlHV-2 BARNARD et al. 1994

Weißwedelhirsch Odocoileus virginianus Cervidae OvHV-2, AlHV-1, CpHV-2

AlHV-1 LI et al. 1999b; LI et al. 2003; WHITENACK et al. 1981

Wisent Bison bonasus Bovidae OvHV-2 MENSINK et al. 1997

Yak Bos grunniens Bovidae GammaHV FLACH et al. 2002

Zwergmuntjak Muntjacus reevesi Cervidae OvHV-2 LI et al. 1999b

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Page 109: Beitrag zum Bösartigen Katarrhalfieber bei Wiederkäuern in ... · nPCR Nested PCR . V . Nr. Nummer ORF Open reading frame OvHV-2 Ovines Herpesvirus 2 PCR Polymerase chain reaction

Danksagung

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10 Danksagung

Ich bedanke mich bei allen, die mich bei der Erstellung dieser Arbeit unterstützt haben.

Prof. Dr. Klaus Eulenberger danke ich ganz besonders für die Überlassung des Themas und die

stetige, freundliche Unterstützung.

Sehr zu Dank verpflichtet bin ich außerdem Herrn Prof. Dr. Hermann Müller, der es mir ermöglichte,

meine Arbeit am Institut für Virologie anzufertigen. Außerdem bedanke ich mich bei allen

Mitarbeitern des Instituts für Virologie der Veterinärmedizinischen Fakultät Leipzig, besonders bei

Anja und Dirk, sowie bei Herrn Dr. Schwarz, die mir mit Rat und Tat zu Seite standen.

Den Mitarbeitern der beteiligten Zoologischen Gärten und Tierparks in Leipzig, Magdeburg,

Dresden, Hannover, Delbrück - Schöning, Nürnberg, München, Basel, Hilvarenbeek und Kerkrade

danke ich herzlich für die hervorragende Unterstützung bei der Beschaffung des Probenmaterials.

Und vor allem danke ich meinen Eltern, Großeltern und Freunden, die mir unter die Arme griffen,

wenn es hakte und sich mit mir freuten, wenn es voran ging.