Acta histochern. 65, 228-232 (1979)

Anatomisches Institut(Komm. Direktor: Prof. Dr. sc. med. J. STAUDT)

und Nervenklinik(Direktor: Prof. Dr. sc. med. H. A. F. SCHULZE)

des Bereiches Medizin (Charite) dcr Humboldt-Universita.t zu Berlin

Beitrag zur Transmitterhistochemiedes Cortex cerebelli der Ratte!)

Notes on the transmitter histochemistryof the cortex cerebelli of rat

Von CLAUS PFISTER2) und HERBERT DANNER

Mit einer Abbildung

(Eingegangen am 27. April 1979)

Zusammenfassung

Der Cortex cerebelli der normalen adulten Ratte wurde fluoreszenzhistochemisch mittels derParaformaldehyd-Methode nach FALCK und Hn.r.A:Rl> (1962) zum Nachweis der Catecholaminebzw. einer modifizierten Ninhydrin-Reaktion zum Nachweis der GABA (PFISTER und GORNE1978) untersucht.

Die Purkinje-Zellen wiesen eine wechselnde Intensita.t und Topik des fluoreszierenden GABA·Reaktionsproduktes auf.

Noradrenerge Boutons konnten ha.ufig in punktf6rmiger Reihung urn die Somata der Pur·kinje-Zellen nachgewiesen werden.

Die Somata der GABA-ergen Purkinje-Neurone wfuden demnach unter dem inhibitorischenEinfluJ3 sowohl der Basket-Zellen des Cortex cerebelli wie auch von Locus coeruleus-Neuronenstehen.

Summary

The cortex cerebelli of the normal, adult rat was investigated fluorescence histochemically bymeans of the paraformaldehyde method according to FALCK and 1I:ILw.RJ:' (1962) for visualizationof catecholamines and a modified ninhydrin-reaction for the demonstration of GABA (PFISTERand GORNE 1978), respectively.

The Purkinje neurons were shown to display a considerable variability of the fluorescentGABA reaction product.

Noradrenergic boutons were shown to be arranged mostly in a punctate manner around thesomata of the Purkinje cells. The Purkinje cell pericarya would thus be under the inhibitory in­fluence of cerebellar bascet neurons as well as of Locus coeruleus neurons.

1) Mit dankenswerter Unterstiitzung durch einen Forschungsauftrag des Ministeriums furHoch- und Fachschulwesen der DDR.

2) Herrn Prof. Dr. M. GERSOH mit herzlichen Wiinschen zum 70. Geburtstag.

Beitrag zur Tranemitterhistochemie des Cortex cerebelli 229

Zur Aufklarung von Psychopharmaka-Wirkungen auf neuronale Netze (SZENTA­GOTHAI 1976, ROBERTS 1976), deren Konnektivitat tiber unterschiedliche Transmit­tersubstanzen zu einem funktionellen System realisiert wird, ist die histotopochemi­sche Direktdarstellung der Transmitter von besonderem Wert.

An den Purkinje-Zellen des Cortex cerebelli sind verschiedene Transmitter mitunterschiedlicher Methodik nachgewiesen (OLSON und FUXE 1971, UNGERSTEDT 1971,SOTELO et al. 1972, HOKFELT und LJUNGDAHL 1972, LJUNGDAHL et al. 1973, SIGGINSet al. 1973, 1976, LANDIS und BLOOM 1975, PFISTER und GORNE 1978) und differenteEffekte exogen zugefiihrter Transmitter ermittelt worden (YAMAMOTO 1967, HOKIN1969, SIGGINS et al. 1973).

Wir haben, im Sinne der Erarbeitung eines "normalen Standards", unsere Ergeb.nisse zur Verteilung der GABA (PFISTER und GORNE 1978, GORNE und PFISTER 1979)erneut reproduziert und versucht, Befunde hinsichtlich einer noradrenergen Afferenzan den Purkinjezellen des Cerebellum der Ratte (HOKFELT und FUXE 1969, OLSONund FUXE 1971, PICKEL et al. 1974) zu erheben.

Material und Methode

Es wurden die Cerebelli von insgesamt 10 mannlichen adulten Ratten (Stamm Rehbriicke)fluoreszenzhistochemisch untersucht.

Noradrenalin: Paraformaldehyd-Technik nach FALCK und HILLARP (1962); Vorbehandlungder Tiere mit 300 mg{kg Pargylin i. p.

GABA: modifizierte Technik nach WOLMAN (1971); siehe PFISTER und GORNE (1978).Die fluoreszenzmikroskopische Auswertung erfolgte mit einem Fluoreszenzmikroekop Pluo­

vall!> (Carl Zeiss, Jena) bei Auflichtfluoreezenz unter Verwendung eines Kardioidkondensors;Filterkombination: BG 224, G 249 oder G 248.Mikrophotographie: EiLokta RTL 1000; Filmmaterial: ORWO NP 27.

BefundeNoradrenalin

Durch Vorbehandlung der Tiere mit 300 mg/kg Pargylin, i. p., wird durch Hem­mUIig der Monoaminooxydase ein Riickstau von Noradrenalin in Nervenzellkorpernund Terminationen erreicht. Bei so vorbehandelten Tieren konnten im Stratumganglionare des Cerebellum distinkt fluoreszierende noradrenerge Terminationen anden Purkinje-Zellen dargestellt werden (Abb. la, c). In wenigen Fallen gelang, ab­hangig von der Schnittfiihrung, auch eine Demonstration des praterminalen Axonsiiber eine relativ lange Strecke (Abb. 1d).

y-Aminobuttersaure (GABA)Mit der modifizierten Ninhydrin-Reaktion im octanolischen Milieu konnten unsere

Befunde tiber die Normalverteilung der GABA im Stratum ganglionare reproduziertwerden.

Es sind Purkinje-Zellen mit fluoreszierendem Randsaum von Purkinje-Zellen mitintensiver perikaryeller Fluoreszenz zu unterscheiden. Dariiber hinaus kommen Pur­kinje-Zellen ohne GABA-Fluoreszenz vor (Abb. 1b).16 Acta histochem. Ed. 65

230 c. PFISTER und H. DANNER

Beitrag zur Transmitterhistochemie des Cortex cerebelli

Diskussion

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Der Modus der interneuronalen Verschaltung des Cortex cerebelli konnte in kombiniertenmorphologisch-elektrophysiologischen Untersuchungen weitgehend geklart werden. Demnachgibt es im Cortex cerebelli nur einen exzitatori'3ch wirkenden Neurontyp (Kornerzellen); fiir alleiibrigen Neuronformen einschlieJ31ich der Purkinje-Zellen wurde eine inhibitorisch postsynapti­sche Wirkung postuliert (ECCLES et a!' 1967). In neueren Arbeiten konnte neben weiterfiihrendenNeuronspezifizierungen im Cortex cerebelli (CHAN-PALAY 1972) auch das Afferenzfasersystemnaher bestimmt werden. So wurden, zusatzlich zu den klassischen Moos- und Kletterfasern, auch

inhibitorisch wirkende noradrenerge Fasern aus dem Locus coeruleus (HoKFELT und FUXE 1969,BLOOM et a!' 1971) sowie serotoninerge Fasern aus dem Nucleus raphe dorsalis (BOBILLIER et a1.1976) nachgewiesen.

Fiir die inhibitorisch wirkenden Neurone einschlieJ31ich der Purkinje-Zellen wird GABA alsTransmitter diskutiert (LJUNGDAHL et a1. 1973). Die Purkinje-Zellen fungieren als corticale out­put.Neurone; sie sollen iiber eine terminale GABA-Freisetzung in inhibitorischer Weise auf denDeiters'schen Kern einwirken (OBATA et a!' 1967).

Auf der Basis einer modifizierten Ninhydrin-Reaktion (WOLMAN 1971) konnte auch im phar­makologischen Experiment GABA im Cortex cerebelli direkt dargestellt werden (PFISTER undGORNE 1978, GORNE und PFISTER 1979). Aus vorliegenden Befunden ist eraichtlich, daLl die Pur­kinje·Zellen hinsichtlich Topik und ]ntensitat des fluoreszierenden GABA-Produktes nicht ein­heitlich reagieren: Purkinje-Z311en mit starker perikaryelltr Fluoreszenz und Purkinje·Zellen urn·geben von einem fluoreszierenden Randsaum wechseln mit Purkinje-Zellen ohne GABA -Struktur abo

Die von HOKFELT und FUXE (1969) erstmals nachgewiesene Catecholamin-Afferenz zum Cere­bellum konnten wir in unSHom Material vorwiegend in Form einer punktformigen Reihung vonfluoreszierenden Strukturen um die Somata der Purkinje-Neurone zeigen. Diese Anordnung laLltan axo·somatische Kontakte von noradrenergen Axonen denken, die das Cerebellum iiber den

---.A'edunculus cerebellaris superior erreichen (PICKEL et aJ. 1974).Die Spezifitat des fluoreszenzhistochemisch darstellbaren GABA.Reaktionsproduktes voraus­

gesetzt (PFISTER und GORNE ]978, GORNE und PFISTER 1979, PFISTER und WOLNY 1979) konntenvorliegende Ergebnisse dafiir sprechen, daLl die Perikarya der GABA.ergen Purkinje-Neuronedes Cortex cerebelli sowohl von Terminalen der Basket-Zellen (ECCLES et a1. 1967) wie auch vonnoradrenergen Boutons von Locus-coeruleus-Neuronen, beide mit inhibitorisch postsynaptischemEffekt, kontaktiert werden.

LiteraturBLOOM, F. E., SIGGINS, G. R., HOFFER, B. J., OLIVER, A. P., and WOODWARD, D. J., Mechanisms

of inhibition of cerebellar Purkinje cells in rat and frog. Experientia (Basel) 27, 1109 (1971).BOBILLIER, P., SEGUIN, S., PETITJEAN, T., SAI,VERT, D., TOURET, M., and JOUVET, M., The raphe

nuclei of the cat brain stem: a topographical atlas of their efferent projections as revealed byautoradiography. Brain Res. 113,449-486 (1976).

CHAN-PALAY, V., and PALAY, S. L., High voltage electron microscopy of rapid Golgi prepara­tions. Neurons and their processes in the cerebellar cortex of monkey and rat. Z. Anat. Ent·wick1.gesch. 137, 125-152 (1972).

ECCLES, J. C., ITO, M., and SZENTAGOTHAI, J., The cerebellum as a Neuronal Maschino. Berlin,Heidelberg, New York, Springer Verlag 1967.

Abb. 1. Querschnitte durch das Stratum ganglionare des Cerebellum der Ratte.

a) Reihung punktformiger Noradrenalinfluoreszenz urn die Purkinje-Zellsomata. 840: 1;b) Verschiedene Topik und Intensitat der GAB.A.-Fluoreszenz. 840: 1;c) Noradrenalin-Fluoreszenz im Stratum ganglionare. 360: 1;d) Noradrenerges praterminales Axon fiihrt an die Purkinje·Zelle heran. 840: 1.

16"

232 C. PFISTER und H. DANNER, Boitrag zur Transmittorhistoohomie des Cortex cerebelli

FALOK, B., Observations on the possibilities of the cellular localization of monoamines by afluorescence Method. Acta physiol. scand. 197, 1-25 (1962).

- Hn.LARl', N.·A., THIEME, G., and ToRI', A., Fluorescence of catecholamines and related com­pounds condensed with formaldehyde. J. Histochem. Cytochem. 10, 348-354 (1962).

GORNE, R., und PFISTER, C., Pharmakologische Beeinflussung del' y·Aminobuttersaure-(GABA).Fluoreszenz in Hirnstrukturen del' Ratte. Mit Bemerkungen zum Chemismus del' Nachweis­reaktion. Acta histochem. (1979) im Druck.

HOKIN, M. R., Effect of norepinephrine on 32p incorporation into individual phosphatides inslices from different areas of the guinea pig brain. J. Neurochem. 16,127 -134 (1969).

HOKFELT, T., and FUXE, K., Cerebellar monoamine nerve terminals as new type of afferentfibers to the cortex cerebelli. Exp. Brain Res. 9,63-72 (1969).and LJUNGDAHL, A., Autoradiographic Identification of Cerebral and Cerebellar CorticalNeurons Accumulating Labelled Gamma-Aminobutyric Acid (3H-GABA). Exp. Brain Res 14,354--'362 (1972).

LANDIS, S., and BLOOM, F. E., Ultrastructural identification of noradrenergic boutons in mutantand normal mouse cerebellar cortex. Brain Res 96, 299-305 (1975).

LJUNGDAHL, A., SEIGER, A., HOKFEI,T, T., and OLSON, L., 3H·GABA uptake in growning cere­bellar tissue autoradiography ofintraoculat transplants. Brain Res 61, 379-384 (1973).

OLSON, L., and FUXE, K., On the projections from the locus coeruleus noradrenaline neurons:The cerebellar innervation. Brain Res. 28, 165-171 (1971).

PFISTER, C., und GORNE, R., Zur Spezifitat des fluoreszenzhistochemischen Nachweises del' y.Aminobuttersaure (GABA). Acta histochem. 63, 80-88 (1978).

- und WOLNY, H.-J., GABA-Fluoreszenz bei del' Ninhydrinreaktion im octanolischen Milieu.Spektrofluorometrische Untersuchungen. Acta histochem. (1979) im Druck.

PIOKEL, V.M., SEGAL, M., and BLOOM, F. E., Axonal Proliferation Following Lesions of CerebellarPeduncles. A Combined Fluorescence Microscopic and Radioautographic Study. J. CompoNeurol. 155,43-60 (1974).

ROBERTS, E., Disinhibition as an Organizing Principle in the Nervous Systems - the Role of theGABA-System. Application to neurologic and Psychiatric Disorders. In: GABA in NervousSystem Function; E. ROBERTS, T. N. CHASE, D. B. TOWER (eds.). Raven Press, New York,pp. 515-539 (1976).

SIGGINS, G. R., BATTENBERG, E. F., HOFFER, B. J., and BLOOM, F. E., Noradrenergic Stimulationof Cyclic Adenosine Monophosphate in Rat Purkinje Neurons: An ImmunocytochemicalStudy. Science 179, 585-588 (1973).HENRIKSEN, S. J., and LANDIS, S. C., Electrophysiology of Purkinje neurons in the weavermouse: iontophoresis of neurotransmitters and cyclic nucleotides, and stimulation of the nu­cleus locus coeruleus. Brain Res. 114,53-69 (1976).

SOTELO, C., PRIVAT, A., and DRAIN, M. J., Localization of 3H-GABA in tissue culture of ratcerebellum using electron microscopy autoradiography. Brain Res 45, 302-308 (1972).

SZENTAGOTHAI, J., Introductory remarks. In: Neuron Concept Today. Symp. Tihany 1976 (SZEN­TAGOTHAI, J., J. HAMORI, and E. S. VIZI, eds.) Budapest, Akademiai Kie.do 1976.

UNGERSTEDT, U., Stereotoxic mapping of the monoamine pathways in the rat brain. Acta physiol.scand., Suppl. 367,1-48 (1971).

YAMAMOTO, C., Pharmacologic studies of norepinephrine, acetylcholine and related compoundson neurons in Deiters' nucleus a.nd cerebellum. J. Pharmacol. Exp. Ther. 156, 39-47 (1967).

WOLMAN, M., A fluorescent histochemical procedure for Gamma-Aminobutyric-Acid. Histochemie28,118-130 (1971).

Anschrift del' Verfasser: Dr. reI'. nat. CLAUS PFISTER und Dr. med. HERBERT DANNER, Ana­tomisches Institut des Bereiches Medizin (ChariM) del' Humboldt-Universitat zu Berlin, DDR . 104Berlin, Philippstral3e 12.