Biochemisches Praktikum II

Versuch 1C

Bestimmung der Bindungsaffinität (KD-Wert) und der Bindungskinetik

eines Peptids zu TAP

Christoph Baldauf

BC

-II P

rakt

ikum

WS

06/

07

Ver

such

1C

TAP1

N

ER Lumen

Zytosol

TAP2

N

C C

Peptidbindungs-region

1 2 3 4 5 6 6 5 4 3 2 1

core-DomäneN-Domäne

Membrantopologie des Peptidtransporters TAP

ATPATP

BC

-II P

rakt

ikum

WS

06/

07

Ver

such

1C

Peptid-Spezifität und SelektivitätB

C-II

Pra

ktik

um W

S 0

6/07

Ver

such

1C

KNR R

WY

FLRY

position 1 2 3 4 5 6 7 8 9DE

P DEG

DENS

sele

ctiv

ity

favo

red

disf

avor

ed

Selektivität1. höchste Spezifität für

Peptide von 8-12 AS

2. essentiell sind die ersten

drei N-terminalen und C-terminale AS (Anker-AS)

3. sehr flexible Peptid-Bindungstasche;

Bindung von verzweigten Peptiden

und Peptiden mit großen Fluorophoren möglich

RRYCKSTEL (C4F-Peptid)

BindungsaffinitätB

C-II

Pra

ktik

um W

S 0

6/07

Ver

such

1C

• Die Affinität ist ein Maß für die Bindungsstärke zwischen Bindungspartnern bei Protein-Ligand Wechselwirkungen

• Je höher die Affinität desto größer die Affinitätskonstante KA (M-1)

• Gängigerweise wird jedoch das reziproke Maß gebraucht, die Dissoziationskonstante KD (M)

• Je höher die Affinität eines Proteins zu seinem Liganden, desto niedriger die Dissoziationskonstante (KD) des Komplexes

Assoziationskonstante

Dissoziationskonstante

Bestimmung der Bindungsaffinität eines Peptidszu TAP

0 100 200 300 4000

5

10

15

C4F-Peptid (nM)

nM g

ebun

dene

s Pe

ptid

BC

-II P

rakt

ikum

WS

06/

07

Ver

such

1C

fitten mittels‘one-site binding curve (hyperbole)‘

Y=Bmax*X/(KD+X)

Kd

Bmax

BC

-II P

rakt

ikum

WS

06/

07

Ver

such

1C

Pipettierschema

-> Kompetitorpeptid:

400facher Überschuss (mind. 1µl)

-> TAP in Mikrosomen

eingestellt auf 5 mg/ml; davon 7 µl

-> Endvolumen:

50 µl

X X X X

X X X