292 H. ScI~6N und H. LEIPOLD : Bestimmung der fl-Glucuronidase-Aktivitat im menschlichen Serum Klinische Wochenschrift

mechanismus annehmen m6ehten. Durch Stop-flow- Analysen konnten wir dieses Transpor tsys tem eben- falls wie die der Aminos£uren in den proximalen Tubulus Iokalisieren.

Die Diskrepanz zwisehen unseren Ergebnissen und den frfiher fiber die Kreatinrfiekresorption erhobenen Befunden (I~T~S 1934, 1944, T ~ x und P S T ~ S 1943, ZIEI%LEt¢, ~OLK, MAGLADEI~Y und LILIENTHAL 1949) mSehten wir auf methodische Untersehiede zurfickffihren. Die Clearanee-Untersuchungen wurden zum Tell nicht bei kons tan ten Plasmaspiegeln durch- geffihrt, sondern nach einmaliger orater oder intra- peritonealer Kreat ingabe. Zum anderen weisen die verwendeten Bes t immungsmethoden (Kreatinbestim- mung aus der Differenz des Kreat ingehal tes vor tmd nach saurer t tydrolyse) einem spezifisehen enzy- matischen Verfahren gegenfiber erhebliehe Ungenauig- keiten auf.

Zusammen/assung. 1. Die tubul£re Rfickresorption yon Krea t in wurde an narkotisierten (Pernocton) Hunden bei stufenweise erhShter K~eatinplasmakon- zentrat ion untersucht . Die Krea t inkonzent ra t ionen in Urin und Plasma wurden mit einem enzymat ischen Verfahren best immt.

2. Bei Steigerung des Kreatin-PlasmaspiegeIs bis auf das 50fache des Normalwertes konnte ein tubul£res Transpor tmaximura ffir Krea t in bei e twa 30/~Mol/min je 100 ml Glomerulusfil trat nachgewiesen werden. Dieses wird bei einem auf das 15fache erh6htem Plasma- spiegel erreicht.

3. Eine kompet i t ive Beeinflussung der Kreat in/ rfickresorption durch die Aminosiiuren Glycin und L-Glutaminsaure wurde nicht nachgewiesen.

4. Durch Stop-flow-Analysen wurde die Kreat in- rfiekresorption in den proximalen Tubulus lokalisiert.

Literatur. B~IS~CE~Z, G., H. J. BOLTZE, TK. B?d~E~, t~. CZOK, K. H. GA~BADE u. E. MEYE~-A~ND~: Diphospho- fructose-Aldolase, Phosphoglyceraldehyd - Dehydrogenase, Milehs~ure-Dehydrogenase, Glycerophospha.t -Dehydrogenase und Pyrovatkinase aus Kaninchenmuskulatnr in einem Arbeits- gang. Z. ~aturforsch. 8, 555 (1953). - - BEY]~R, K. H., L. D. WRtGY~T, H. t~. SKEO¢S, H. F. RVSSO and G. A. S~A~En: ]~enal clearance of essential amino acids: their competition for reab- sorption by the renal tubnlus. Amer. J. Physiol. 151, 202 (1947). GAYE~, J., u. W. GE~OK: Die Lokalisierung der L-Amino- s~uren-Riiekresorption in der Niere dutch Stopflow-Ana!ysen. Klin. Wsehr. 39, 1054 (1961). - - Gm~En~i~, tt., u. It. H~ITE: Statistische Urteilsbildung. Berlin- GSttingen- Heidelberg: Springer 1951. - - G~oK, W., and J. GAY~n: The tubular reabsorption of amino acids in the kidney of the dog. I. Inter- nat. Kongr. Nephrologie, Evians les Bains 1960. Exeerpta reed. (Amst.), Ser., 29, 41 (1960); - - Die tubulgre l~iick- resorption der L-Aminos~uren in der Niere des Hundes. Transportmaxima und competitive Hemmung. Xlin. Wschr. 89, 540 (1961). --- GoLn]a~, W., and H. C~IaS~S: Hypertension and hypertensive disease. New York: Commonwealth Fund 1944. - - MArviN, 1%. L., L. P. Sv~niws and W. S. W~LDE: Physiologist 1, 58 (t957). Zit. nach MALV~, W~DE and SU~L~- vAzq 1958. - - MAnWN, R. L., W. S. W~LDE and L. P. SVLn~- VAS: Localization of nephron transport by stop flow analysis. Amer. J. Physiol. 194, 135 ( 1 9 5 8 ) . - P~TTS, R .F . : The clearance of ereatine in dog and man. Amer. J. Physiol. 109, 532 (1.934) ; - - The clearance of creatine in the phlorizinized dog. Amer. J. Physiol. 109, 542 (1934); - - A renal reabsorptive mechanism in the dog common to glycin and creatine. Amer. J. Physiol. 140, 156 (1944); - - A comparison of the ~enal reabsorptive processes for several amino acids. Amer. J. Physiol. 140, 535 (1944). - - RoE, J. H., I. H. Ess~nrie and N. P. GOLDS~E~Iq: A photometric method for the determina- tion of inulin in plasma and urine. J. biol. Chem. 178, 839 (1949). - - TA~qz]~R,M.L., and C. GILVA~G: Creatine and creathxkinase measurement. J. biol. Chem. 234, 3201 (1959). - - T I ~ i s Y , N. A., and J. P. P~:EgS: The mode of excretion of creatine and creatine metabolism in the thyroid disease. J. elin. Invest. 22, 595 (1943). - - ZIE~L~R, K. L., B. P. FOLK, J. W. I~fA~ADJ~Y and J. L. L~L~EX~gA~: On creatinuria in man. The roles of the renal tubule and of muscle mass. Bull. John Hop. Hosp. 85, 370 (1949).

B e s t i m m u n g de r ~ - G l u c u r o n i d a s e - A k t i v i t i i t i m m e n s e h l i e h e n S e r u m

Von HARALD SCtt6N und I~]~I%I]~EI%T LEIPOLD

Aus der h~edizinischen %~niversitS.tsklinik Erlangen (Direktor: t)rof. Dr. N. ttENNING)

Bestimmung der fl.Glucuronidase-Aktivitgt im menschliehen Serum

Das Vorkommen der fi-Glueuronidase in tierischem Gewebe wurde erstmals yon dem Japaner S ~ A 1915 nachgewiesen 4. 1948 ver6ffentlichte FISH~A~ ~2 eine Methode zur Bes t immung der GLUC* in mensch- lichem Gewebe und Serum naeh dem Prinzip : Phenol- phthaleinglucuronJd _GLVO, ~ o ~ Phenolphthalein -5 Glucurons~ure. Die Menge des ents tandenen Phenolphthaleins, als MaB ffir die Akt iv i ta t des Fer- mentes, k a n n dann colorimetriseh bes t immt werden.

Ein Nachtei l der Originalmethode yon F ISH,As ist die lange Inkubat ionszei t , die aber notwendig ist, usa meBbare Ext ink t ionen zuerhal~en. Auch zeigte sich beim Colorimetrieren der phenolphthaMnhal t igen LSsung ein deutlicher Extinktionsabfal l , d . h . das rote Dinatr iumsalz geht bei diesem pg -W e r t bereits in das farblose Trinatr iumsalz fiber. Wir versuchten diese M£ngel zu beheben. Die yon uns modifizierte Methode wird im folgenden kurz dargelegt.

Zeitlicher Verlau/ der enzymatischen Hydrolyse. Aueh bei unseren Untersuchungen erwies sich eine

* GLUC = fi-Glucumnidase.

Inkuba t ions tempera tu r yon 380 bei einem p m W e r t yon 4,5 als optimal. Wit inkubier ten jeweils eine Misehung yon 2,5 cm s Aeetatpuffer p g 4,5, 0,3 em 3 0,01 m PhGl** L6sung und 0,1 cm 3 glucuronidasereiches Misehserum I-Iepatitiskranker. I n stundenweisen Ab- st£nden wurden zwei lg6hrchen der Versuchsreihe mi t je 2,5 cm 3 Glycinpuffer (fiber die Zusammen- setzung des Puffers s.w.u.) versetzt, die LSsung filtriert und bei 546 m/z colorimetriert. Wie die Abb. 1 zeigt verl~uft die l%eaktion w£hrend der ersten 5 Std linear. Sodann erfolgt ein leichtes Absinken, aber aueh nach 80 Std war noeh keine wesentliehe Verminderung der Reaktionsgesehwindigkeit erkennbar.

Substratkonzentration im Inkubationsgemisch. U m das optimale Verh~Itnis der fermenthal t igen L6sung (Serum) zum Substra t zu linden, inkubier ten wir in je 2,5 cm 3 Acetatpuffer , bei kons tan ter Substrat- konzentra t ion (0,3 em ~ 0,01 m PhG1-LSsung), Serum- mengen yon 0,05--0,4 cm ~ (Abb. 2). I n weiteren Versuehen ver£nderten wit bei kons tan te r Serum- menge die Subs t ra tkonzent ra t ion (Abb. 3). Colori- metr ier t wurde bei beiden Versuchsreihen immer gegen

** PhG1 = Phenolphthaleingheuronid.

Jg. 40, ]left 6 H. SCHON und H. LEIPeLD : Bestimmung der fl-Glueuronidase-Aktivit/~t ina. mensehlichen Serum 293 15. M~rz 1962

das n/~mliehe Gemiseh, dem das PhG1 erst naeh der Inkubat ion zugesetzt wurde. Die Abb. 2 und 3 zeigen die Ergebnisse dieser Untersuchungen. Demnach sind bei einer Serummenge yon 0,I cm a und > 0,5 cm ~ 0,01 m PhG1-LSsung die relativ hSchsten Extink- tionen zu erwarten. Bei dieser Substratkonzentration f~llt w~.hrend tier Inkubat ion ein Serumeiweig-Sub- stratgemiseh aus, so dab nur mi t 0,3 em a 0,01 m SubstrattSsm~g gearbeitet werden kann.

Vermeidung des Extin~tionsab/alles in der alkalischen L6sung

Beim colorimetrischen Nachweis des entstandenen Phenolphthaleins muB der pi~-Wert der LSsung zwischen 9,6 und 10 liegen. Den 2,9 cm a hakubierter L6sung (2,5 cm s Acetatpuffer pH 4,5, 0,1 cm a Serum, 0,3 cm a PhG1-LSsung) ffigen wir 2,5 cm a eines alkali- sehen Puffers zu (100 em ~ Glyeinpuffer PI~ 11,8 und 3,0 cm ~ 5 n NaOH). Wie unsere Untersuchungen zeigten ist die Extinktion des Phenolph~haleins bei Verwendung dieses Gemisehes am gr6Bten und aueh fiber mehr als 30 rain konstant.

Die oben ange/iihrten Versuche /iihrten uns zu /otgender Methode: Man pipett iert in drei gShrehen je 2,5 em ~ Aeeta~puffer p~ 4,5, sowie 0,1 em ~ des zu untersuehenden Serums.

Zwei dieser R.Shrehen werden mi t 0,3 em a 0,01 m PhGI-LSsung verse~zt. (Das PhG1 wird in Aeetat- puffer p~ ~,5 gelSst,) Das dritte RShrchen dient der Leerwertsbestimmung.

Die RShrehen werden mi t Parafi lm* versehlossen und 4 Std im Wasserbad bei 380 inkubierg.

Naeh der Inkubat ion gibt man zu jedem R6hrehen 2,5 em s der oben angegebenen alkalisehen LSsung, zum KontrollrShrehen noeh zus/~zlich 0 ,3em a PhG1- L6sung.

Naeh dem Filtrieren (Sehleicher & Sehfill 512:/e tP) werden die phenolphthaMnhalt igen LSsungen gegen das KontrollrShrchen eolorimetriert (546 m/~, 2 em- Cuvette) und der Mittelwert der Extinkt ion errechnet.

Einheit. Als Einheit w~hlten wir internationale Einheiten (IE). 1 I E = }eMol Substratumsatz/Std je 1000 ml Serum. Zur Umreehnung in Fishman-Ein- heiten mug mi~ dem Faktor 31,83 multipliziert werden.

Bereehnung. Die freigesetzte Phenolphthalein- menge in Gamma wird dureh eine Eiehkurve ermittelt.. Die Umrechnm~g in I E erfolgt naeh der Gleiehung: x I E --- (Phenolphthalein in y) • 10000

318,3.4 (,uMol Phenol-

phthaIein/Std/1000 ml Serum).

Inal~tivierung des Fermentes. Nach einer Erw/~r- mung des Serums auf 80 o fiber 10 min konnte keine Aktivit~t mehr festgestellt werden. Die Aktivit~ts- abnahme der GLUC bei Aufbewahrung des Serums im Eisschrank bei d- 40 betrggt nach 4 Tagen 4 - -6%, nach 9Tagen etwa 15%. Wurde das Serum bei Zimmergemperatur aufbewahrt, so mug mi~ einer Aktivitfi tsabnahme yon 10---12% nach 4 Tagen, und mit Aktivit~tsverlusten yon 25--330 % nach 9 Tagen gereehnet werden.

Normalwerte. Zur Festlegung des physiologisehen Streubereiehes wurden kli:niseh gesunde Personen (Blutspender der Klinik) untersueht. Die Unter-

• Thermoplastische Kunsts~off-Folie, B. Braun, 5Ielsungen

suehung erfolgte am Tage der Blutabnahme und nur in Ausnahmef/~llen muBte das Serum, jedoeh nieht 1/~nger als 36 Std, im Eissehrank aufbewahrt werden. Die Ergebnisse sind aus der Tgbelle 1 zu ersehen. Ein Gesehlechtsunterschied im Sinne einer niederen Aktivit/~t bei Frauen war unverkennbar. Die Werte liegen wesentlich hSber als sie yon FIstt~A~- und g . Do~I~La_w~ ~** angegeben wurden, da bei unserer

! I - -

0,5

0 5 lo 15 2o Sfd 25 Zeil

Abb. 1. Zeit l ieher Verlauf der enzymat i schen Hydro lyse

o,5 I -----7 - -

o,7 I

~7 o,2 o,3 ~g crn z o,5 Serurnkonzen/ral/on

Abb. 2. Abh~tngigkei~ der ents~ehenden ~2henolphShMeinmenge yon der Serumkonzen~ration des Inkubationsgemisches (0,05--0,50 cm a Serum in 2,0- -2 ,55 em ~ Acet~tpuffer l?~ 4,5) bei k o n s t a n t e r S u b s t r ~ k o n z e n t r a t i o n

(0,8 cm ~ 0,01 m PhGl-LSsung) und Inkuba t ionsze i t

0,25

0,20

~o/o /

J

J

o o / o,2 o,s o,q cm 3 ~ 5 Substra/konzen/za/ibn

Abb. 3. Abh~ngigke i t der ents tehenden Phenolph~hale inmenge ~on t ier Subs t ra tkonzen t ra t ion des Inkuba t i ensgemisches bei k o n s t a n t e r Serum- konzen t ra t ion (0,1 em ~ Serum in 2 ,3--2 ,75 era S Ace~atpuffer) und kon-

stanter Inkubationszeit

TabeIIe 1. Arithmetische Mittelwerte urtd Standardabweichung der GLUC bei klinisch g~sunden, miinnliehen und weiblichen

Personen ( Btutspender)

Gesehlecht Zahl Ar i thmeMseher der F~tlle N i t t e lw e r t

9 25 27,9 :J: 7,1 26 37,6 4-9,2

Meghode die Inkubat ion bei optimaler Substratsgt- tigung und die eolorimetrisehe Ablesung bei einem pg-Wert gtinstigster Phenolphthaleinextinktion er- folgt.

** W/~hrend unserer Untersuehungen ersehien ein Beitrag yon I~. Dom~MANX zum gleichen Thema 1. Die Ergebnisse dieser Arbeit stimmen im groBen und ganzen mit den unsrigen iiberein.

294 V ~ A v. B~AND : fdber den Einflul~ yon CO~ auf den Einbau yon C~-Acetat Kiinische Wochenschrift

Diagnose

Tabelle 2.

Akute Hepati t is (erste 3 Wochen) {

Abklingende Hepat i t is . . .{

Chronische Hepat i t i s . . .{

Lebercirrhose . . {

VersehluBikterus . {

Bereich der GLUC.Aktivitditen bei Patienten mit verschiedeneu Lebererkrankungen

Gesamt- I zahl

ZahI der F~lle

im ira ~a~ho- qormal- logisc!~en bereich Bereich

0 17 2 10

6 6 3 0

2 3 3 2

4 3 1 1

1 1 0 1

17 12

~ 12 3

]

H6chs$- weft

126 IE 156 IE

58 IE 48 IE

75 I E 83 I E

84 I E 87 IE

52 IE 65 IE

Tabelle 3. GLUC-Aktivitgten bei verschiedenen Erkrankungen

Lymphogranulomatose . . . ~ 17 IE Trichlorathylen-Intoxikat ion . c? 32 IE Pilzvergiftung . . . . . . . ~ 22 IE Pankreatopathie . . . . . . . c~ 68 IE~ ~ 41 IE Chronische Obstipation . . . ~ 55 I E Choteeystopathie . . . . . . ~ 64 I E Cholecystitis . . . . . . . . ~ 18 IE Apoplektiseher Insul t . . . . . ~ 39 I E Pyeloeystitis . . . . . . . . ~ 48 I E Adipositas . . . . . . . . . ~ 38 IE Carcinom . . . . . . . . . . ~ 73 IE, 38 IE ; ~ 5 2 I E , 7 2 I E Herzinfarkt . . . . . . . . . c~ 4 Fi~lle 27--60 IE

Diagnostischer Wert der GLUC-Aktivitditsbestlm- mungen. Untersuchungen an 60 Patienten mit ver- schiedenen Lebererkrankungen (Tabelle2) ergaben, dag geringffigige ~berschreitungen' des 2g-Bereiehes bis zu 90 IE bei der chronischen Hepatitis, der Leber- cirrhose und beim VerschluBikterus m6glich sind. Aktivitgten fiber 9 0 I E beobachteten wir nur in Fi~llen akuter Hepatitis innerhalb der ers~en 3 Wochen

nach Einsetzen der Prodromi. Eine ErhShung der GLUC beim Versehlu~ikterus kann nicht mit Sicher- heir ausgeschlossen werden, da wir nur wenige Pa- tienten mit dieser Erkrankung untersuchen konnten. Aus Tabelle 3 sind die GLUC-Aktivitaten bei ver- sehiedenen anderen Erkrankungen zu ersehen. Aktivi- taten fiber 90 IE sind demnaeh beweisend ffir eine akute Hepatitis. Niedere GLUC-Aktivit£ten schliel~en jedoch eine akute Hepatitis nicht aus. Zu /~hnlichen Ergebnissen waren aueh E . P . PI~nDA U. Mitarb. ~ gekommen.

Zusammen/assung. Ausgehend yon einer yon FISH~X angegebenen Methode entwiekelten wir ein Verfahren zur Bestimmung der GLUC-Aktivit/~t im mensehliehen Serum, das bei optimaler Substrat- konzentration eine Messung in kfirzerer Zeit erlaubt.

Der physiologisehe Streubereich wurde dutch Untersuchung yon 51 klinisch gesunden Personen ermittel~ ( +o 13,7--42,1 IE, ~ 19,2--56,0 IE).

Untersuchungen an Kranken ergaben, dal~ mit einer ErhShung der Serumak~ivit/it bei Pa~ienten mit akuter Hepatitis zu reehnen ist. Da die GLUC im Gegensatz zu den Fermenten des energieliefernden Stoffwechsels GBT, GOT und SDH nut sehr langsam inaktiviert wird, ist die Aktivit£tsbestimmung der GLUC besonders in den F~llen yon Vorteil, bei denen eine tgngere Aufbewahrung (Transport) des Serums unvermeidlich ist.

Llteratur. ~ Dom~MA~, R. : Zur klinischen Best immung und Xinet ik der fl-Glukuronidase. Dtsch. Arch. kiln. Ned. 206~ 322--333 (1960). - - ~ Frs]z~A~r, W. t t . : B. S]~RI~]SR and R. BRUNETTI: Application of an improved glucuronidase assay method to the s tudy of human blood fl-glueuronidase. J . biol. Chem. 173, 4 4 9 - 4 5 6 (1948). - - ~ P~N~DA, E . P . , J . A. GOLDBAEG, A. M. RUTES:BUBA?~ and B.M. BA~-KS: The significance of serum fl-gtucuronidase act ivi ty in pat ients with liver disease. Gastroenterol. 86~ 202--213 (t959). - - a SERA, Y. : Zur Kenntnis der gepaarten Glukuronsaure. ~[II. Mit- teilung. Uber die Spaltung der Orcin-Phloroglueinglukuron- saure dutch 0rgansafte. Itoppe-Seylers Z. physiol. Chem. 92, 261--275 (1914).

0her den Einflu]l von C0~ auf den Einbau yon C~-Aeetat in die Fraktion hiiherer Fetts~uren Von

V ~ A v. B~A~D Aus der Xedizinischen Poliklinik der Universitii¢ l~Itinchen (Direktor: Prof. Dr. W. S]~ITZ)

Im Verlaufe unserer Versuche fiber Fetts~ure- synthese mit Hilfe eines 15slichen Enzymsystems aus Taubenleber haben wit die HShe der Atmung be- st immt 1. Gem/iS der Warburgschen Versuchsanord- hung wurde ein mit NaOH getr/~nkter Filterstreifen in den zen~ralen Zylinder des Warburg-Gef~l~es zur Ab- sorption der entstehenden CO s eingeleg~. Bei diesen Versuehen wurde beobachtet, da$ die H6he der Fett- s£uresynthese aus C~4-Acetat dieser Ans£~ze deu~lich herabgese~zt ist gegenfiber Parallelversuehen, die ohne die M6glicl~eit der CO2-Absorption, aber ebenfalIs in aerobem Milieu inkubiert waren. Sehon S. Gv~I~¢ hat 19524 beobachtet, da$ ein bicarbonathaltiges Milieu no~wendig ist ffir die Bildung yon hSheren Fetts/~uren aus Acetat, ohne eine weRere Erkl/~rung abgeben zu kSnnen. Wit haben jetzt systematiseh die Abhi~ngig- keit der Fetts/~uresynthese aus C~4-Aeetat mit Hilfe dieses fe~tsi~uresynthetisierenden Enzymsystems aus T a u b e n l e b e r y o n d e r G e g e n w a r t -con B i c a r b o n a t - i o n e n u n t e r s u c h $ . D ie se B e f u n d e h a b e n i h r e B e d e u - t u n g b e k o m m e n d u t c h d ie A r b e i t e n y o n S. J . WAKIL ~

fiber die aufgefundene notwendige Bildung yon Malo- nyl-CoA aus Acetyl-CoA, bevor letzteres in die Fett- s~uren eingebaut werden ka, nn. - - Weiterhin wurde die Wirkung yon Mn ÷+ auf die HShe der Fettsi~ure- synthese in C02-Atmosph/ire untersueht. - - Bei allan Versuchsans/~tzen wurden der ATP-Gehalt und der Gehalt an Glueose-6-phosphat zu verschiedenen Zeiten bestimmt nnd in Beziehung zur HShe der jeweiligen Fetts~uresynthese und der sie beeinflussenden Fak- toren gebracht.

Methodik Das fetts~uresynthetisierende Enzymsystem wird nach

friiheren Angaben aus Taubenleher pr~pariertl,~, ~. 30g Leher werden mi t 40 ml Puffer (Phosphat-Bicarbonat-Puffer *, pl~-Wert 7,4) homogenisiert nnd durch Zentrifugierung frak- tioniert. Man erh£1t ungef~hr 30 ml EnzymlSsung. Unte r Zusatz bes t immter Cofaktoren wird das Enzymsystem mit t~a-l-CIa-Aeeta~ im Warburg-Gef~$ bei 380 C inkubier t ; der normaIe Versuchsansatz ha t folgende Zusammensetzung: 0,1 mt ~IgClz 0,006 m Endkonzen t ra t ion ; 0,1 ml Iqa-Citrat

* 81,8 ml m/15 NasHPO 4 ' 2 H20 + 18,2 ml m/15KH~PO 4 -~- 0,07 m KHCO a.