Biochemie - core.ac.uk · Biochemie Cre-Rekombinase-exprimierende Mäuse zur örtlichen Mutagenese in der Niere. Entwicklung und Analyse eines Tiermodells zur Untersuchung der

Biochemie

Cre-Rekombinase-exprimierende Mäuse zur örtlichen Mutagenese in der Niere.

Entwicklung und Analyse eines Tiermodells zur Untersuchung der

Autosomal Dominanten Polycystischen Nierenerkrankung (ADPKD) beim Menschen

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades

der Naturwissenschaften im Fachbereich Chemie und Pharmazie

der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster

vorgelegt von

Lambrini Tontsidou

aus Wuppertal

- 2008 -

Dekan: Univ.-Prof. Dr. F. Ekkehardt Hahn

Erster Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Hans-Joachim Galla

Zweiter Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Jürgen Horst

Tag der mündlichen Prüfung: 28.05.2008

Tag der Promotion: 28.05.2008

„Das Ziel weicht ständig vor uns zurück. Genugtuung liegt im Einsatz, nicht im Erreichen.

Ganzer Einsatz ist ganzer Erfolg“.

Mahatma Gandhi (1869-1948)

Für meinen Sohn

Teile dieser Arbeit wurden publiziert:

• Tontsidou L, Bilbilis K, Pennekamp P, Skryabin B , Galla H-J, Horst J , Dworniczak B

(2002), Specific expression of Cre recombinase in kidney tubular cells of mice, 52nd

Annual Meeting of the American Society of Human Genetics“ in Baltimore Maryland

USA 10/2002, Program Nr: 891 from 2002 ASHG Annual Meeting

(http://www.ashg.org/genetics/ashg/ashgmenu.htm)

Specific expression of Cre recombinase in kidney tubular cells of mice Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is one of the most common

monogenic diseases in humans with an incidence of 1:600. The cardinal finding is the

formation of fluid filled cysts in both kidneys - predominantly in the proximal tubules -

frequently resulting in end stage renal failure. In the vast majority of cases, the disease is

caused by mutations in PKD1 and/or PKD2. However, despite extensive research only little

is known concerning the pathogenesis of ADPKD. Cystogenesis in ADPKD kidneys in

humans is a focal process: patients inherit one germline mutation and acquire somatic

mutations affecting the normal allele in a subset of cells (second hit). In the last couple of

years conventional knockout mouse models for Pkd1 and Pkd2 have been generated. All of

them are prenatal lethal making it impossible to analyze the pathogenesis of ADPKD after

birth/over a longer period in adult mice. These limitations caused by embryonic lethality can

be circumvented by conditional mutagenesis in which the loss of gene function is placed

under temporal and/or spatial control. In order to establish this system we have generated a

transgenic mouse line expressing the Cre-recombinase under the control of a truncated

mouse type II GGT promoter. We expected that this promoter allows the spatial excision of

loxP flanked genes in proximal tubular cells. The recombinase activity was demonstrated by

crossing these mice with Cre- reporter lines (Z/AP and ROSA26). Both lines carry a marker

gene whose expression requires excision of loxP flanked stop sequences. Using alkaline

phosphatase histochemistry in Z/AP mice as well as b-Galactosidase histochemistry in

ROSA26 mice we observed a strong and specific expression of Cre-recombinase in proximal

tubular renal cells. This Cre transgenic mouse line, which induces efficient Cre-mediated

excision of DNA in proximal tubules, should provide a useful genetic resource to elucidate

the role of loxP manipulated genetic targets in cyst formation of ADPKD.

• Lambrini Tontsidou, Konstantinos Bilbilis, Petra Pennekamp, Boris Skryabin, Hans-

Joachim Galla, Jürgen Horst, Bernd Dworniczak, GGT-Cre mice for tissue-specific

gene ablation in proximal kidney tubules, Proceedings (poster or lecture-abstract) of

the annual fall meeting, German Society for Biochemistry and Molecular Biology

(GBM), Münster (Westfalen), Germany, September 19-22, 2004 (www.gbm-

online.de).

GGT-Cre mice for tissue-specific gene ablation in proximal kidney tubules Autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD) is one of the most common

monogenic diseases in humans with an incidence of 1:1000. The main characteristic of the

disease is the formation of fluid filled cysts in both kidneys (originating from the proximal

tubules), frequently resulting in end stage renal failure. In the vast majority of cases the

disease is caused by a mutation in the PKD1 or PKD2 gene. In the last couple of years

numerous conventional Pkd1 and Pkd2 knockout mouse models have been generated. All of

them are prenatal lethal, thus making it impossible to analyze the pathogenesis of ADPKD

after birth. These limitations can be circumvented by conditional mutagenesis in which the

loss of gene function is placed under temporal and/or spatial control. In order to establish this

system we generated a transgenic mouse line expressing the Cre-recombinase under the

control of a truncated mouse type II GGT promoter. We expected that this promoter allows

the spatial excision of loxP flanked genes in proximal tubular cells.

The recombinase activity was demonstrated by crossing these mice with Cre-reporter lines

(Z/AP and ROSA26). Both lines carry a marker gene whose expression requires excision of

loxP flanked stop sequences. Using alkaline phosphatase histochemistry in Z/AP mice as

well as Beta-Galactosidase histochemistry in ROSA26 mice we observed a strong and

specific expression of Cre-recombinase in proximal tubular renal cells.

This GGT-Cre transgenic mouse line, which induces efficient Cre-mediated excision of DNA

in proximal tubules, should provide a useful genetic resource to elucidate the role of loxP

manipulated genetic targets in cyst formation of ADPKD.

INHALTSVERZEICHNIS I

I Inhaltsverzeichnis

II Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................ V 1 Einleitung ................................................................................................................1 1.1 Autosomal Dominante Polyzystische Nierenerkrankung ...............................................1

1.1.1 Genetik der ADPKD ...............................................................................................1

1.1.2 Genprodukte von PKD1/PKD2...............................................................................2

1.1.2.1 Expression von Polycystin 1 und 2.................................................................2

1.1.3 Zystenentwicklung .................................................................................................3

1.2 Herstellung transgener Tiermodelle...............................................................................4

1.2.1 Tiermodelle der ADPKD.........................................................................................5

1.2.1.1 Pkd1 ...............................................................................................................5

1.2.1.2 Pkd2 ...............................................................................................................6

1.3 Cre/loxP-Rekombinationsmechanismus........................................................................6

1.3.1 Gewebespezifische Cre-Expression ......................................................................9

1.3.2 Zeitlich regulierbare Cre-exprimierende Tiermodelle ...........................................12

1.3.2.1 Tet-Repressor/Aktivator-System ..................................................................12

1.3.2.2 Interferon-Rezeptor-Rekonstitution ..............................................................14

1.3.2.3 Murines Östrogen-induzierbares System .....................................................14

1.3.2.4 Humanes Östrogen-induzierbares System ..................................................14

1.4 Ziele.............................................................................................................................16

2 Material und Methoden.........................................................................................17 2.1 Datenbanken ...............................................................................................................17

2.2 Molekularbiologische Methoden ..................................................................................18

2.2.1 Kultivierung von Escherichia coli (E. coli) ............................................................18

2.2.2 Anlegen einer Gefrierkultur ..................................................................................18

2.2.3 Plasmid-Isolierung aus E. coli ..............................................................................18

2.2.3.1 Plasmid-Minipräparation aus E. coli .............................................................18

2.2.3.2 Qiaprep-Plasmid-Mini-/Maxi-Präparation aus E. coli....................................19

2.2.4 DNA-Isolierung aus Gewebe................................................................................19

2.2.5 Reinigung isolierter DNA......................................................................................19

2.2.5.1 Phenol/Chloroform-Extraktion ......................................................................19

2.2.5.2 Aussalzung...................................................................................................20

2.2.5.3 Isopropanol-Fällung......................................................................................20

2.2.5.4 Ethanol-Fällung ............................................................................................20

2.2.5.5 Dialyse..........................................................................................................20

2.2.6 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren...................................................20

INHALTSVERZEICHNIS II

2.2.7 Gelelektrophorese von Nukleinsäuren.................................................................21

2.2.8 Extraktion und Rückgewinnung von DNA aus Agarosegelen ..............................22

2.2.9 Modifikation und Klonierung von Nukleinsäuren..................................................22

2.2.9.1 Restriktion ....................................................................................................22

2.2.9.2 Dephosphorylierung der 5´-Enden ...............................................................22

2.2.9.3 Auffüllen von 5´-Überhängen mit Klenow-Polymerase.................................23

2.2.9.4 Ligation.........................................................................................................23

2.2.9.5 Klonierung von PCR-Produkten ...................................................................24

2.2.9.6 Klonierung von Restriktionsfragmenten........................................................24

2.2.10 Transformation von E. coli .................................................................................24

2.2.11 Polymerasekettenreaktion (PCR).......................................................................24

2.2.12 DNA-Sequenzierung ..........................................................................................25

2.2.12.1 Proben-Aufreinigung ..................................................................................26

2.2.12.2 Vorbereitungen der PCR-Reaktionsansätze ..............................................26

2.2.12.3 Vorbereitung der Sequenzierungsansätze für den ABI PRISM® 310 ........27

2.2.12.4 Vorbereitung der Sequenzierungsansätze für den ABI PRISM® 3700 ......27

2.2.13 Hybridisierungstechnik.......................................................................................27

2.2.13.1 Southern-Transfer ......................................................................................27

2.2.13.2 Radioaktive DNA-Markierung.....................................................................28

2.2.13.3 Radioaktive Hybridisierung.........................................................................28

2.3 Etablierung der Mauslinien ..........................................................................................29

2.3.1 Mikroinjektion .......................................................................................................29

2.3.2 Genotypisierung der Mauslinien...........................................................................30

2.3.3 Dokumentierung der Mauslinien ..........................................................................30

2.3.4 Kreuzungen mit Reportermäusen ........................................................................31

2.3.4.1 Kreuzungen mit der Z/AP-Reportermauslinie...............................................32

2.3.4.2 Kreuzungen mit der ROSA26-Reportermauslinie.........................................33

2.4 Histologische Techniken..............................................................................................34

2.4.1 Vorbereitung der Gefrierschnitte ..........................................................................34

2.4.1.1 Entnahme des Gewebes ..............................................................................34

2.4.1.2 Entnahme der Embryonen ...........................................................................34

2.4.1.3 Anfertigungen der Gefrierschnitte ................................................................34

2.4.2 Enzymhistochemische Färbungen.......................................................................34

2.4.2.1 Detektion der β-Galaktosidase .....................................................................34

2.4.2.2 Detektion der alkalischen Phosphatase .......................................................35

2.4.3 Histologische Übersichtsfärbung..........................................................................35

2.4.4 Immunfluoreszenz-Untersuchungen ....................................................................36

INHALTSVERZEICHNIS III

2.4.4.1 Lektin-Markierung.........................................................................................36

2.4.4.2 Anti-Cre-Rekombinase-Markierung..............................................................36

2.4.5 Auswertung der histochemischen Präparate .......................................................37

2.5 Sicherheitsbestimmungen ...........................................................................................39

2.6 Verwendete Materialien ...............................................................................................39

2.6.1 Plasmide ..............................................................................................................39

2.6.2 Sonde...................................................................................................................39

2.6.3 Oligonukleotide ....................................................................................................40

2.6.4 Organismen .........................................................................................................40

2.6.5 Antikörper.............................................................................................................41

2.6.6 Puffer ...................................................................................................................42

2.7 Geräte..........................................................................................................................46

2.8 Bezugsfirmen...............................................................................................................47

3 Ergebnisse ............................................................................................................48 3.1 Promotor-Recherche ...................................................................................................48

3.2 Klonierung der Zielvektoren.........................................................................................51

3.2.1 Klonierung des Vektors pGGT-CRE ....................................................................51

3.2.1.1 Klonierung des Vektors pGGT-PFU-1 - Genomische PCR -........................52

3.2.1.2 Umklonierung des Vektors pGGT-PFU-1 .....................................................55

3.2.1.3 Isolierung des GGT-CRE-Transgens aus dem Zielvektor ............................56

3.2.2 Klonierung des Vektors pGGT-RTTA...................................................................58

3.2.2.1 Amplifikation des GGT-Promotors................................................................59

3.2.2.2 Isolierung des GGT-RTTA-Transgens aus dem Zielvektor ..........................61

3.2.3 Klonierung des Vektors pBI-CRE-lacZ.................................................................63

3.2.3.1 Einführung einer HindIII-Schnitttstelle in pBI-3 an Position nt 5188.............64

3.2.3.2 Klonierung des Vektors pBI-3-H3.................................................................64

3.2.3.3 Isolierung des Transgens BI-CRE-lacZ aus dem Zielvektor.........................65

3.3 Generierung transgener Tiere .....................................................................................69

3.4 Identifizierung möglicher transgener Mauslinien .........................................................70

3.4.1 PCR-Genotypisierung ..........................................................................................70

3.4.2 Southern-Analysen ..............................................................................................72

3.5 Generierung stabiler Linien..........................................................................................74

3.6 Das Expressionsprofil des murinen GGT-Promotors...................................................75

3.6.1 Untersuchungen der Cre-Expression mittels Z/AP-Reportermäuse ....................75

3.6.1.1 Verpaarung der GGT-CRE-Mäuse mit Z/AP-Reportermäuse ......................75

3.6.1.2 Charakterisierung der doppeltransgenen GGT-CRE+/Z/AP+-Mäuse............77

3.6.1.3 Cre-Expression in adulten GGT-CRE-Mäusen.............................................77

INHALTSVERZEICHNIS IV

3.6.2 Untersuchungen der Cre-Expression mittels ROSA26-Reportermäuse ..............79

3.6.2.1 Verpaarung der GGT-CRE-Mäuse mit ROSA26-Reportermäuse ................79

3.6.2.2 Charakterisierung der GGT-CRE+/ROSA26+-Mauslinien .............................79

3.6.2.3 Cre-Rekombinase-Expression zum Zeitpunkt E14,5....................................81



3.6.2.6 Cre-Rekombinase-Expression bei neugeborenen Mäusen..........................86

3.6.2.7 Cre-Rekombinase-Expression bei adulten GGT-CRE-Mäusen ...................89

3.6.3 Expression des GGT-CRE-Transgens in der adulten Niere ................................91

4 Diskussion ............................................................................................................93 4.1 Nierenspezifische Cre-exprimierende Mausmodelle ...................................................94

4.2 Generierung der transgenen GGT-CRE-Maus............................................................95

4.2.1 Relevanz des proximalen Tubulus für die Zystenbildung.....................................95

4.2.2 Relevanz der Promotorgröße...............................................................................98

4.3 Muriner 346-bp-GGT-Minimalpromotor ......................................................................99

4.3.1 GGT-pII-346/β-Galaktosidase-Maus ..................................................................100

4.4 Klonierung des GGT-CRE-Transgens ......................................................................100

4.5 Das Expressionsprofil des murinen GGT-Promotors ................................................100

4.5.1 Cre/loxP-Rekombination in GGT-CRE+/Z/AP+-Mäuse .......................................100

4.5.2 Früheste Cre/loxP-Rekombination in GGT-CRE+/ROSA26+-Mäuse..................101

4.5.3 Cre/loxP-Rekombination in neonatalen/adulten GGT-CRE+/ROSA26+-Mäusen102

4.6 Expression des GGT-Transgens in der Niere............................................................103

4.7 Ausblick: Zeitlich induzierbare nierenspezifische Cre-Mäuse....................................104

4.7.1 Generierung der Konstrukte GGT-RTTA und BI-CRE-lacZ ...............................104

5 Zusammenfassung.............................................................................................107 6 Literatur ...............................................................................................................108 7 Anhang ................................................................................................................121 7.1 Restriktionsendonukleasen .......................................................................................121

7.2 Plasmidkarten ...........................................................................................................122

7.3 DNA-Sequenzen .......................................................................................................127

7.3.1 Sequenzname: pGGT-CRE ...............................................................................127

7.3.2 DNA-Sequenz der Sonde S1 .............................................................................130

Danksagung......................................................................................................................131

Lebenslauf.........................................................................................................................132

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS V

II Abkürzungsverzeichnis A Adenin

Abb. Abbildung

AmpR Ampicillin-Resistenz

Aqua dest. (lat.: Aqua destillata) destilliertes Wasser

AS Aminosäuren

bp Basenpaar

BSA (engl.: bovine serum albumin) Rinderserumalbumin

C Cytosin

CAG (engl.: chicken β-actin gene) Hühnchen-β-Actin-Gen

CAT Chloramphenicol-Acetyltransferase

cDNA komplementäre DNA

CMV Cytomegalievirus

Cre (engl.: cyclization recombination) Cre-Rekombinase

CreERT Tamoxifen-aktivierbare Cre-Rekombinase mit ERT-LBD

CreERT2 Tamoxifen-aktivierbare Cre-Rekombinase mit ERT2-LBD

Cy3 Indocarbocyanin

ddNTP 2’,3’-Didesoxynukleosid-5’-triphosphat

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

DNase Desoxyribonuklease

dNTP 2’-Desoxynukleosid-5’-triphosphat

ds doppelsträngig

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamin-N,N,N´,N´-Tetraessigsäure-Dinatriumsalz

E. coli Escherichia coli

et al. (lat.: et allii) und andere

EtBr Ethidiumbromid

EtOH Ethanol

ER Östrogenrezeptor

ES-Zellen embryonale Stammzellen

F (engl.: forward) vorwärts

FITC Fluorescein-Isothiocyanat

G Guanin

g Erdbeschleunigung (9,81 m s-2)

gefloxt loxP-flankiert

HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N-2-ethansulfonsäure

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS VI

HSV Herpes-Simplex-Virus

IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid

IRES (engl.: Internal Ribosomal Entry Site) interne ribosomale Eintrittsstelle

kb Kilobase

kDa Kilodalton

lacZ β-Galaktosidasegen

LB Luria-Bertani

LBD Ligandenbindungsdomäne

loxP (engl.: locus of crossing over of P1) DNA-Substrat von Cre

MCS (engl.: multiple cloning site) Multiple Klonierungsstelle

mRNA messenger RNA

neo Neomycinresistenz-Gen

nt Nukleotide

OD optische Dichte

ORF (engl.: open reading frame) offener Leserahmen

pA Polyadenylierungssignal

PBS (engl.: phosphate buffered saline) Phosphat-gepufferte Salzlösung

PCR (engl.: polymerase chain reaction) Polymerasekettenreaktion

PGK Phosphoglycerat Kinase

pT-Zellen proximale Tubuluszellen

R (engl.: reverse) rückwärts

RNA Ribonukleinsäure

rpm (engl.: rotations per minute) Umdrehungen pro Minute

RNase Ribonuklease

RT Raumtemperatur

SDS Natriumdodecylsulfat

SV40 simian virus 40

T Thymin

TBE Tris/Borat-EDTA

Tris Tris[hydroxymethyl]-aminomethan

U (engl.: unit) Einheit

ü. N. über Nacht

V Volt

Wt Wildtyp

X-Gal 5-Brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-Galactosid

Allgemein gebräuchliche Maßeinheiten und umgangssprachliche Abkürzungen sind nicht

angegeben. Die Restriktionsendonukleasen werden in der üblichen Schreibweise aufgeführt.

EINLEITUNG 1

1 Einleitung

1.1 Autosomal Dominante Polyzystische Nierenerkrankung Die Autosomal Dominante Polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD) ist eine der häufigsten

erblichen monogenen Erkrankungen. Weltweit liegt die Inzidenz zwischen 1:500 bis 1:1000

(Gabow & Grantham, 1997). Ein Charakteristikum ist die progressive Entwicklung und

Vergrößerung flüssigkeitsgefüllter renaler Zysten, was bei nahezu der Hälfte aller ADPKD-

Patienten zum vollständigen Nierenversagen führt (Torra et al., 2000). Dabei entstammen

die Nierenzysten aus renalen Tubulusstrukturen. Es handelt sich hierbei um die proximalen

Tubuli den distalen Tubuli und dem Sammelrohr (Nadasdy et al., 1995). Obwohl

Nierenfunktionsstörungen klinisch im Vordergrund stehen, handelt es sich bei der ADPKD

um eine systemische Erkrankung (Bogdanova et al., 2002). Die auffälligste

Begleiterscheinung ist der arterielle Bluthochdruck, der bereits lange vor dem

Nierenversagen auftritt (Torres, 1999). Bei der häufigsten extrarenalen Manifestation handelt

es sich um die Zystenbildung in den epithelialen Organen (Perrone, 1997). Bis zum heutigen

Zeitpunkt existiert keine effiziente Therapie zur Behandlung von ADPKD-Patienten.

1.1.1 Genetik der ADPKD ADPKD kann durch Mutationen in zwei - inzwischen im Detail charakterisierten - Genen

verursacht werden: PKD1 und PKD2 (Kimberling et al., 1988, Peters & Sandkuijl, 1992). Die

Existenz eines dritten verantwortlichen Gens PKD3 ist von De Almeida (1995) postuliert

worden, wobei seine Genomlokalisation bislang noch nicht bestimmt werden konnte. PKD1-

Mutationen sind verantwortlich für 85% der Erkrankungen und etwa 14% können auf Defekte

im PKD2-Gen zurückgeführt werden. Für die übrigen ADPKD-Fälle sind Mutationen in bisher

nicht identifizierten PKD-Genen verantwortlich.

PKD1 ist auf dem Chromosom 16p13.3 lokalisiert. Dabei handelt sich um eines der größeren

humanen Gene, bestehend aus 46 Exons und verteilt auf über 53 kb der genomischen DNA

(The International Polycystic Kidney Disease Consortium, 1994, Hughes et al., 1995). Das

Gen PKD1 kodiert für ein 14,1 kb mRNA-Transkript, welches in das so genannte Polycystin

translatiert wird. Das zweite ADPKD-Gen -PKD2- wurde 1996, aufgrund seiner partiellen

Sequenzhomologie zum PKD1-Gen, nach entsprechenden Datenbankrecherchen

identifiziert. PKD2 ist auf dem Chromosom 4q21–23 lokalisiert und kodiert für ein 5,3 kb

großes mRNA-Transkript. Es ist in 15 Exons aufgeteilt und weist eine ca. 25%ige Homologie

zum PKD1 Gen auf. Obwohl ADPKD einem autosomal dominanten Erbgang folgt wirkt sich

auf zellulärer Ebene ein rezessiver Mutationsmechanismus aus (Torra et al., 1999; Qian &

Watnick, 1999). ADPKD setzt eine Keimbahnmutation in einem Allel voraus, jedoch wird die

Zystenbildung durch eine zweite somatische Mutation im anderen Allel initiiert. Solch ein

EINLEITUNG 2

Mutationsmechanismus wurde häufig in Tumorsuppressorgenen nachgewiesen und bereits

1971 als die so genannte "two hit hypothesis" von Knudson am Beispiel von Retinoblastoma

postuliert (Knudson, 1971).

1.1.2 Genprodukte von PKD1/PKD2 Die Genprodukte von PKD1 und PKD2 gehören zu den so genannten Polycystinen. Sie

spielen eine entscheidende Rolle in einer Vielzahl von biologischen Prozessen, wie z.B. der

Fertilisation und der mechanischen Reizübermittlung (Igarashi & Somlo, 2002; Nauli et al.,

2003). PKD1 kodiert für Polycystin 1, einem großen transmembranen Glykoprotein mit

verschiedenen extrazellulären Motiven (The American PKD1 Consortium, 1995; Hughes et

al., 1995; The International Polycystic Kidney Disease Consortium, 1995). Das Genprodukt

von PKD2 - Polycystin 2 - ist ein Kalziumkanal-bildendes Protein, das vorwiegend im

endoplasmatischen Retikulum, aber auch in der Zellmembran lokalisiert ist (Mochizuki et al.,

1996; Koulen et al. 2002). Durch „patch clamp“ -Analysen konnte gezeigt werden, dass

Polycystin 2 einen nicht-selektiven Kationenkanal mit einer Leitungsfähigkeit für Ca2+-Ionen

bildet (Hanaoka et al., 2000; Gonzalez-Perrett et al., 2001; 2002; Vassilev et al., 2001;

Koulen et al., 2002; Igarashi & Somlo, 2002).

Es wird allgemein akzeptiert, dass Polycystin 1 mit Polycystin 2 interagieren kann. In vitro-

Experimente zeigten Wechselwirkungen zwischen den carboxyterminalen Domänen auf.

Darüber hinaus konnte ein nativer Polycystinkomplex in transgene, nicht transgene und

humane renale Tubulusstrukturen nachgewiesen werden (Qian et al., 1997; Tsiokas et al.,

1997; Newby et al., 2002). Ferner aktiviert und stabilisiert Polycystin 1 den Kalziumkanal (Xu

et al., 2003). Da Mutationen von Polycystin 1 bzw. Polycystin 2 zur Ausbildung von

Nierenzysten führen, wird vermutet, dass dieser Proteinkomplex einen Mechanosensor

bildet, welcher die Geometrie der Tubuli in der Niere reguliert. Es ist jedoch gegenwärtig

unklar, welche zellulären Programme durch die flussbedingte Zilienbewegung reguliert

werden (Nauli et al., 2003).

1.1.2.1 Expression von Polycystin 1 und 2 Durch in situ-Hybridisierungen und immunhistochemische Methoden wurde die Expression

der ADPKD-Proteine analysiert. Aufgrund der Schwierigkeit, adäquate Antikörper gegen die

Polycystine zu gewinnen, sowie der Verwendung unterschiedlicher Gewebepräparationen

führten diese Analysen zu widersprüchlichen Ergebnissen. Sowohl Polycystin 1 als auch

Polycystin 2 weisen ein überraschend komplexes Expressionsmuster auf. Zu den Geweben

mit der höchsten Expressionsrate gehören Nieren, Pankreas, Leber, Lunge, Darm, Gehirn,

reproduktive Organe und Thymus (Griffin et al., 1996, 1997a, 1997b; Peters et al., 1996,

1999; Ward et al., 1996; Weston et al., 1997; Geng et al., 1996; 1997; van Adelsberg, 1999a;

EINLEITUNG 3

1999b; Obermüller et al., 1999; Ong et al., 1999a, 1999b, 1999c; Guillaume & Trudel, 2000;

Foggensteiner et al., 2000; Wilson, 2001). Expressionsorte sind vor allem Epithel- und

Endothelzellen und aufzweigende Strukturen wie Nierentubuli, Gallengänge und

Pankreasgänge (Ibraghimov-Beskrovnaya et al., 1997).

1.1.3 Zystenentwicklung Verschiedene zelluläre Prozesse können zur Entwicklung von Nierenzysten führen. Zu

nennen sind: Zellproliferation, Apoptose, Veränderungen der Zellpolarität/Sekretion und

Anomalien der extrazellulären Matrix (Lanoix et al., 1996).

Eine hohe Zellteilungsrate konnte im frühen Stadium der Zystenentwicklung nachgewiesen

werden (Ebihara et al., 1988; Montesano et al., 1991; Trudel et al., 1991; Wilson, 1991,

Wilson et al., 1992, Wilson, 1997). Durch Induktion mit endogenen Wachstumsfaktoren wie

z.B. dem epidermalen Wachstumsfaktor EGF (Ogborn & Sareen, 1996), zeigte sich bei

Tiermodellen zunächst eine Nierenausdehnung mit anschließender progressiver

Zystenentwicklung. Ferner entwickelt das ADPKD-Epithelium eine erhöhte Sensitivität

gegenüber dem EGF, dem Glukokortikoid Hydrocortison und dem Peptidhormon Insulin

(Nauta et al., 1995). Histologisch betrachtet geht die Zystenbildung einher mit einer

Abflachung des tubulären Epithels, einer Verdickung der Basalmembran und einer

Veränderung der epithelialen Polarität. Ergänzend verlieren die Epithelzellen ihre

charakteristischen Eigenschaften wie z.B. den Bürstensaum der proximalen Tubuli und die

basolateralen Einfaltungen. Ferner liegen in humanen ADPKD Epithelien die Proteine Na/K-

ATPase, Fodrin, Ankyrin und EGF-Rezeptoren unregelmäßig lokalisiert vor (Du & Wilson

1995; Brill et al., 1996).

Um nun die Frage aufzugreifen, wie die Zysten entstehen, muss zunächst auf die Genetik

verwiesen werden. Genetisch spricht viel dafür, dass beide Allele von PKD1 und PKD2

inaktiviert sein müssen, damit sich Zysten bilden (Pei, 2001). In Analogie zu den

Tumorsuppressorgenen wird zur Zeit davon ausgegangen, dass das in der Keimbahn

gesunde Allel im Laufe des Lebens eine Mutation erleidet, die betroffenen Zellen erhalten

möglicherweise einen Wachstumsvorteil und die Zystenbildung beginnt, weil ihr

entsprechendes “Stoppsignal” ausgefallen ist. In diesem Zusammenhang sei erwähnt, dass

die renalen Tubulusstrukturen aus einem bindegewebigen Vorläufergewebe differenzieren.

Das bedeutet das Lumen der Tubuli entwickelt sich erst im Laufe der Zeit. Zu einem genau

definierten Zeitpunkt muss die Lumenbildung allerdings zu einem Ende kommen, denn die

Nierentubuli sind sehr ausgedehnt. Wenn das Stoppsignal folglich nicht mehr existiert, wird

mehr Lumen gebildet und es entstehen Zysten (Gallagher et al., 2000). Über die Natur des

Sensors gibt es bestimmte Vorstellungen. Möglicherweise kommt primären Zilien, eine

maßgebliche chemo- und/oder mechanosensorische Rolle zu. Die dafür sprechenden

EINLEITUNG 4

Befunde sind der Nachweis verschiedener Zystenproteine in primären Zilien (Yoder et al.,

2002) und der Verlust ihrer mechanosensorischen Eigenschaften bei Ausfall von Polycystin 1

und 2 (Nauli et al., 2003).

Abschließend stellt sich die Frage, wo die Zystebildung initiiert wird. Bei Betrachtung von

transgenen Tiermodellen mit einer polycystischen Nierenerkrankung oder der humanen

ADPKD zeigte sich, dass sowohl im renalen Sammeltubulus als auch in den distalen und

hauptsächlich in den proximalen Tubulussegmenten sich Zysten ausbilden (Witzgall, 1999).

1.2 Herstellung transgener Tiermodelle Zur Erforschung menschlicher Erkrankungen wird häufig ein Tiermodell herangezogen,

wobei sich Mäuse bei genetisch bedingten Erkrankungen bewährt haben. Um eine definierte

Veränderung im Genom zu erreichen gibt es verschiedene methodische Ansätze:

1. Mikroinjektion von DNA-Konstrukten in befruchtete Eizellen

2. Genetische Veränderung von embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) und

Erzeugung chimärer Transgene

3. Intramuskuläre DNA-Injektion

4. Klonierung von Tieren aus genetisch veränderten Zellen

5. Gentransfer mittels retroviraler Vektoren

Bei der ersten Methode mittels Mikroinjektion erfolgt die Einführung gentechnisch

veränderter DNA in den Pronukleus kurz vor der Karyogamie (Pronukleusinjektion), wobei

sich das Transgen zufällig in das murine Genom integrieren kann (Meisler, 1992; Hogan et

al., 1994; Simoni, 1994; Wight & Wagner, 1994). Darüber hinaus sind zu dieser Methode

noch folgende Eigenschaften erwähnenswert: Es liegt eine stabile Integration des DNA-

Konstrukts in das Genom vor, es können häufig viele Kopien (ca. 10-100) tandemartig

vorliegen und die transgenen Tiere besitzen genetisch einheitliche Zellen. Mittels

Pronukleusinjektion generierte transgene Tiere werden z.B. für folgende Studien

angewendet:

• Expressions- und Promotorstudien durch Einsatz von Reportergenen

• Über- oder Fehlexpressionsstudien durch Einsatz genfremder Promotoren

• Korrektur eines vorhandenen Gendefektes durch Einbau eines Wildtyp-Gens

Hingegen wird bei der zweiten Methode die genetisch modifizierte DNA gezielt durch

homologe Rekombination in murine embryonale Stammzellen (ES-Zellen) integriert

(Capecchi, 1989; Shastry, 1994, 1995, 1998; Nomura, 1997; Müller, 1999). Es resultiert eine

EINLEITUNG 5

vollständige oder partielle Defizienz eines Gens und dessen Genprodukts. Mitunter wird

diese Methodik auch als konventionelle Gen-„knockout“-Technologie bezeichnet. Bei der

Methode der intramuskulären Injektion ist die Durchführung zwar relativ einfach, das

Transgen wird aber nicht an die Nachkommen weitergegeben, wobei die Klonierung von

Tieren aus differenzierten Zellen prinzipiell die gleichen Möglichkeiten zum Gentransfer wie

die Verwendung von ES-Zellen bietet.

1.2.1 Tiermodelle der ADPKD Um die ADPKD in vivo besser analysieren zu können und neuere Therapieansätze zu

entwickeln, wurden mehrere konventionelle Gen-„knockout“-Tiermodelle generiert. Tabelle

1.1 gibt einen Überblick über die generierten transgenen Mäuse.

Tabelle 1.1: ADPKD-Mausmodelle

Name verändertes Gen Literatur

Pkd1del34/del34 Pkd1 (Exon 34) Lu et al.,1997

Pkd1L/L Pkd1 (Exon 43-45) Kim et al., 2000

Pkd1S-lacZ/S-lacZ Pkd1 (Exon 17-21) [IRES-lacZ]

Boulter et al., 2001

Pkd1β-gal/β-gal Pkd1 (Exon 2-3) ["gene trap", lacZ]

Piontek, 5th Int. Workshop on PKD (11.05.-12.05.2000)

Pkd2-/- Pkd2 (Exon 1) Wu et al., 1998 Wu et al., 2000

Pkd2-/-lacZ+/+ Pkd2 (Exon 1) [lacZ] Pennekamp, 2000

1.2.1.1 Pkd1 1997 ist die erste Pkd1-„knockout- Maus konstruiert worden (Lu et al., 1997). Eine Deletion

im Exon 34 konnte durch homologe Rekombination in murine ES-Zellen verursacht werden.

In dieser Arbeit zeigte sich zunächst bei Pkd1-heterozygoten Tieren kein erkennbarer

Phänotyp. Aufgrund einer massiven Entwicklung von Nierenzysten, Pankreaszysten und

einer pulmonären Hypoplasie verstarben jedoch homozygote Pkd1-Mäuse perinatal. Die

renale Zystenentwicklung beginnt am embryonalen Tag 15,5 (E 15,5) in den proximalen

Tubulusstrukturen. 1999 berichtete die Arbeitsgruppe Lu et al., dass auch heterozygote

Pkd1-Mäuse im Alter von 9-14 Monaten Nierenzysten ausbilden. Es zeigte sich, dass

homozygot mutante Embryonen darüber hinaus Ödeme, Gefäßstörungen sowie Brüche in

den Blutgefäßen entwickelten. Die Autoren erklärten diese Beobachtung mit der Beteiligung

von Polycystin 1 an endothelialen Zell-Zell-Verbindungen und infolgedessen an der Integrität

von Blutgefäßen (Kim et al., 2000).

EINLEITUNG 6

1.2.1.2 Pkd2 1998 ist eine Pkd2-„knockout“-Maus mit einem unstabilen Pkd2-Allel beschrieben worden

(Wu et al., 1998). Das Allel durchläuft eine somatische Inaktivierung durch intragenische

homologe Rekombination und produziert dadurch ein reales Nullallel. Sowohl heterozygote

als auch homozygote Mausmutanten entwickeln polycystische Nieren mit Leberschäden. In

einer späteren Arbeit wurde ergänzend über Herzdefekte bei homozygoten Pkd2-

Mausmutanten berichtet (Wu et al., 2000).

Bei der Pkd2-„knockout“-Mauslinie Pkd2-/-lacZ+/+ ist einzigartig, dass das Reportergen lacZ zum

einen unter der Promotorkontrolle des Pkd2-Gens steht und zum anderen Pkd2 zusätzlich

inaktiviert (Pennekamp, 2000). Mit diesem Tiermodell war es möglich, sowohl die Expression

von Pkd2 während der Entwicklung als auch den Phänotyp der ADPKD2 in der Maus zu

analysieren. Zusätzlich zu der progressiven Zystenbildung in beiden Nieren und im Pankreas

was auch die anderen ADPKD-Mausmodelle aufzeigten sind hier zum ersten Mal skelettale

Defekte, Lebernekrosen und eine Fehllage der Organe, verursacht durch eine fehlerhafte

Determinierung der embryonalen Links-Rechts-Achse, beobachtet worden (Pennekamp et

al., 2002).

1.3 Cre/loxP-Rekombinationsmechanismus Die Erforschung von genetischen Erkrankungen wurde durch die Inaktivierung von

spezifischen Genen (Gen-„knockout“-Technologie) durch homologe Rekombination in der

Maus revolutioniert (Thomas & Capecchi, 1987). Allerdings verfügen die bisher vorgestellten

konventionellen ADPKD-Tiermodelle über erhebliche Nachteile, da eine permanente

genetische Modifikation in der Keimbahn der Maus erzeugt wurde. Das konventionelle

Ausschalten eines Gens führt in allen Zellen des Tieres während der gesamten prä- und

postnatalen Entwicklung zum Verlust der Genfunktion. Alle Pkd1- und -2 homozygot

mutanten Mäuse versterben aufgrund erheblicher Defekte bereits vor der Geburt. Folgerichtig werden durch die embryonale Letalität und den komplex pleiotropen Phänotyp

postnatale Untersuchungen am Tier, besonders präventive und therapeutische

Langzeitstudien, unmöglich gemacht. Insbesondere kann die zeit- und zelltypspezifische

Funktion eines Gens an konventionellen Nullmutanten nicht analysiert werden. Ferner eignet

sich die Technik des konventionellen Ausschaltens eines Gens auch nicht zur Erzeugung

komplexer chromosomaler Veränderungen, wie großer Deletionen, Duplikationen,

Inversionen und Translokationen. Es kann auch nicht ausgeschlossen werden, dass die

beobachteten Phänotypen nicht nur ein Ergebnis gezielter Mutationen sind, sondern auch

aus ihren unterschiedlichen genetischen Hintergrund resultieren. Darüber hinaus üben

diverse Gene in verschiedenen Zelltypen während der Ontogenese aber auch postnatal

einen Einfluss aus, wie es in der ADPKD in den extrarenalen Manifestationen zu beobachten

EINLEITUNG 7

ist. Um diesen pleiotropen Phänotyp zu umgehen und einen präziseren Einblick in die

Zystenentstehung zu gewinnen, wird ein konditionales Mausmodell benötigt (Nagy, 2000).

Dieses Modell würde ermöglichen gezielt zeit- und/oder gewebespezifisch Gene

auszuschalten. Dafür bietet sich in idealer Weise das Cre/loxP-Rekombinationssystem an.

Bei diesem System wurden klassische Methoden zur Modifikation von Genen mit

Rekombinationssystemen kombiniert, wobei Rekombinasen einen Austausch zwischen zwei

kurzen DNA Erkennungssequenzen katalysieren. Der Bakteriophage P1 aus Escherichia coli

(E. coli) kodiert für dieses ortspezifische Rekombinationssystem, dass sich aus zwei

Komponenten zusammensetzt: eine loxP-(locus of recombination)-DNA-Sequenz an der das

Rekombinationsereignis erfolgt und ein Cre-Rekombinase-Protein, welches die

Rekombination ausführt (Sternberg & Hamilton, 1981; Sternberg et al., 1981). Die Cre-

Rekombinase ist ein einzelnes exogenes Polypeptid und ein Mitglied der Integrase-Familie.

Es handelt sich um ein 38,5 kDa großes Protein (343 AS), welches in der Lage ist, zwischen

34 bp großen loxP-DNA-Sequenzen anzubinden und sowohl in vivo als auch in vitro zu

rekombinieren (Sternberg & Hamilton, 1981; Abremski & Hoess, 1984). Die natürliche

katalytische Funktion des Cre-Proteins als endogenes Produkt des Bakteriophagen P1 ist

das Verpacken von DNA zwischen zwei loxP-Stellen (Sternberg & Hamilton, 1981; Sternberg

et al., 1981). Jede loxP-Stelle weist zwei invertierte 13 bp große gegenläufig angeordnete,

flankierende Sequenzen, die als Bindestellen für jeweils ein Cre-Monomer fungieren und

durch eine 8 bp große Region getrennt ist (Hoess et al., 1982). Abbildung 1.1.A stellt die

loxP-Sequenz dar. Unter Bildung eines Cre-Protein Tetramers entsteht der

Rekombinationskomplex. Das Cre-Protein enthält DNA-bindende amino- und

carboxyterminale Domänen, wobei nur der Carboxyterminus die Rekombination zwischen

den loxP-Sequenzen vermittelt (Wierzbicki et al., 1987; Hoess et al., 1990; Guo et al., 1997).

Innerhalb der 8 bp langen, zentralen Region führt der nukleophile Angriff eines in der C-

terminalen, katalytischen Domäne befindlichen Tyrosins zu Einzelstrangbrüchen (Hoess &

Abremski, 1985). Das Rekombinationsprodukt entsteht durch den koordinierten Austausch

der Stränge unter Bildung eines Rekombinationsintermediates mit einer Holliday-Struktur

(Holliday, 1964). Nach Studien von Mack et al. (1992) konnte ermittelt werden, dass jeweils

ein Cre-Rekombinase Molekül an eine loxP-Motivwiederholung bindet. Abhängig von der

Orientierung der loxP-Sequenzen zueinander und dem Integrationsort kann eine Inversion,

Excision/Integration oder Translokation von DNA erzeugt werden (Abbildung 1.1). Die

zentrale Region ist asymmetrisch, welche dadurch eine Richtung erhält. Bei gleicher

Orientierung der loxP-Sequenzen führt die Rekombination zur Excision des

eingeschlossenen Fragmentes (Abbildung 1.1C), bei entgegen gesetzter Orientierung zur

Inversion (Abbildung 1.1B). Intermolekulare Rekombinationsereignisse können zu

Integrationen oder Translokationen führen (Abbildung 1.1D).

EINLEITUNG 8

5´ ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT 3´ 3´ TATTGAAGCATATTACATACGATATGCTTCAATA 5´ Abbildung 1.1: Das Cre/loxP-Rekombinationssystem. (A) Das Cre-Enzym katalysiert die Rekombination zwischen zwei 34 bp-langen loxP-Erkennungssequenzen (Darstellung als Dreieck). Die loxP Sequenz besteht aus zwei 13 bp-Palindromen (waagerechte schwarze Pfeile), die eine asymmetrische 8 bp-Kernregion (schwarz umrandet) flankieren. Die Phosphodiesterbindungen, welche das Cre-Enzym spaltet, sind durch senkrechte rote Pfeile gekennzeichnet; rot markierte Nukleotide entsprechen der 6 bp-langen crossing-over Region. (B) Die Rekombination zweier entgegengesetzt orientierter loxP-Sequenzen im selben DNA-Molekül (intramolekulare Rekombination) führt zur Inversion der intragenischen Region. (C) Die Rekombination zweier gleichgerichteter loxP-Sequenzen im gleichen DNA-Segment führt zur Excision des flankierten Abschnittes. Wenn die loxP Sequenzen auf unterschiedlichen DNA Molekülen liegen (intermolekulare Rekombination), kann eine Integration (C) oder Translokation (D) der DNA ausgeführt werden. Die Länge der Reaktionspfeile gibt die relative Effizienz jeder Reaktion an. (Modifiziert nach Metzger & Feil, 1999).

Integration Excision Inversion Translokation

(B) (C) (D)

(A)

EINLEITUNG 9

1.3.1 Gewebespezifische Cre-Expression Das Cre/loxP-Rekombinationssystem hat sich in Säugerzellen als sehr effizient erwiesen und

wird verwendet, um gezielt genetische Veränderungen in ES- und in Somazellen der Maus

zu induzieren (Sauer, 1994). Es bietet ein großes Spektrum an Variationen, wie das Genom

modifiziert werden kann, wobei es in vivo am häufigsten zur Inaktivierung von Genen durch

Cre-vermittelte Excision loxP-flankierter („gefloxter“) DNA-Abschnitte eingesetzt wird (Nagy,

2000). Eine gewebespezifische Modifikation des Genoms ist in vielen Fällen informativer als

bei der konventionellen Gen-„knockout“-Maus, wo zu jedem Zeitpunkt der Entwicklung und in

jeder Zelle der Genverlust vorliegt. Dabei basiert die konditionale somatische Mutagenese in

der Maus auf der gewebespezifischen oder induzierbaren Expression von Cre über

geeignete Promotoren. Unter der Kontrolle des Promotors ergibt sich somit die Möglichkeit

einer sehr selektiven Cre-Expression und infolgedessen einer gewebespezifischen

Gendeletion. In der Abbildung 1.2 wird das Wirkprinzip der konditionalen Mutagenese

dargestellt.

Abbildung 1.2 Konditionale Mutagenese in der Maus. Durch Expression der Cre-Rekombinase wird das „gefloxte“ Zielgen herausgeschnitten. Rote Dreiecke stellen loxP-Sequenzen dar.

Bei der Erzeugung konditionaler Mausmutanten wird zunächst mittels pronukleärer Injektion

bei einer Mauslinie ein DNA-Konstrukt injiziert, welches die Cre-Rekombinase unter der

Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors stellt (Abbildung 1.3 A). Die loxP-

Erkennungssequenzen werden bei einer weiteren Mauslinie durch homologe Rekombination

gezielt in das Genom integriert. Dabei werden die loxP-Sequenzen in der Weise eingeführt,

dass sie ein bestimmtes Zielgen flankieren. Daraus resultieren so genannte „gefloxte“

Mäuse, welche sich phänotypisch vom Wildtyp nicht unterscheiden lassen (Abbildung 1.3 B).

Die „gefloxten“ Mäuse werden mit Cre-exprimierenden Mäusen verkreuzt, um eine Excision

Cre-Rekombinase

CRE

Zielgen

Promotor Cre-Rekombinase

CRE

Zielgen

Promotor

EINLEITUNG 10

der loxP-flankierten DNA-Sequenz zu bewirken (Abbildung 1.3 C). In den Zellen, wo der

gewebespezifische Promotor aktiv ist, kann nach Expression der Cre-Rekombinase eine

Rekombination zwischen den eingefügten loxP-Sequenzen bewirkt werden, was letztendlich

zu einem Herausschneiden des „gefloxten“ DNA-Segments führt (Abbildung 1.3 D) (Sauer,

1998; Metzger & Feil, 1999; Nagy, 2000; Metzger & Chambon, 2001). Alle anderen Zellen

verbleiben in ihrem ursprünglichen Genotyp (Abbildung 1.3 E).

.P Cre . .ZG .

.P Cre .

ZG

X

ZGCre

spezifische Zellen alle andere Zellen

(a) (b)

(c)

(d) (f)

..P Cre . .ZG ..ZG .

.P Cre .

ZG .P Cre .

ZG

X

ZGZGCreCre

spezifische Zellen alle andere Zellen

(a) (b)

(c)

(d) (f)

Abbildung 1.3: Gewebespezifische Geninaktivierung. (A) Cre-exprimierende Mauslinie; (B) „gefloxte“ Maus. Nach Kreuzung von (A) und (B) resultiert eine konditionale Mauslinie (C). In den speziellen Zellen mit katalytisch aktiver Cre-Rekombinase wird das „gefloxte“ Zielgen (ZG) herausgeschnitten (D). Bei alle anderen Zellen ohne Aktivität des gewebespezifischen Promotors, bleibt die Cre-Expression aus und infolgedessen ZG unverändert.

Mit Hilfe gewebespezifischer konditionaler Mäuse kann auch unterschieden werden, ob sich

der beobachtete Phänotyp aus der primären Funktion des Gens ergibt, oder ob die

Gendeletion sekundär auch andere Gewebe beeinflusst. Transgene Mauslinien mit

gewebespezifischer Cre-Expression haben bereits mehrfach zur Aufklärung biologischer

Fragestellungen beigetragen; wie z.B. bei Insulin-Rezeptoren in murine Skelettmuskelzellen

oder bei Zytokin-Rezeptoren in Herzmuskelzellen (Brüning et al., 1998; Chen et al., 1998;

Hirota et al., 1999; Kulkarni et al., 1999). Die Gewebespezifität hängt stark von dem

verwendeten Promotor ab. In der Regel werden endogene verkürzte Promotoren

(Minimalpromotoren) eingesetzt, deren Aktivitätsmuster hinreichend charakterisiert ist. Für

eine Untersuchung der Zystenentwicklung bei der ADPKD mit Hilfe des konditionalen

Mausmodels richtet sich das Augenmerk auf die Niere. Aus diesem Grunde wäre hier ein

(A)

(C)

(D) spezifische Zellen (E) alle anderen Zellen

(B)

EINLEITUNG 11

Promotor von Interesse, der zellspezifisch in der Niere und präferenziell im Nephron aktiv ist,

wo die Zystenbildung initiiert wird. Eine Auswahl nierenspezifischer Cre-Mäuse wurde in der

Tabelle 1.2 zur Übersicht aufgelistet. Alle zurzeit erhältlichen Cre-exprimierenden

Mausmodelle können der Internetseite http://www.mshri.on.ca/nagy/ des Nagy Labs (Samuel

Lunenfeld Research Institute, Toronto, Ontario, Kanada) entnommen werden.

Tabelle 1.2: Nierenspezifische Cre-Mausmodelle

Name Promotor Expression Literatur

THP-CreTag Tamm-Horsfall-Protein Niere außer Macula densa, distale Tubuli; Testis

Stricklett et al., 2003

βMCM86 pCAGGS merCremer induzierbar mit 4-Hydroxytamoxifen (Zhang et al., 1996; Verrou et al., 1999)

Podozyten Bugeon et al., 2003

K18IresCreERT2 Keratin 18 CreERT2 induzierbar mit 4-Hydroxytamoxifen (Indra et al.,1999)

Leber, Niere, Gebärmutter Endometrium

Wen et al., 2003

Mx1Cre Mx1 Interferon induzierbar (Kühn et al., 1995)

Nierenkortex, Nierentubuli, Glomeruli, Endothelium, Mesangium, Podozyten

Schneider et al., 2003

P2.5P-Cre human NPHS2 Podozyten Moeller et al., 2003

apoECre humanes Apolipoprotein E Nierenkortex, Nierentubuli Leheste, 2003

rtTA(LAP)-1 LAP Tetrazyklin induzierbar (Gossen & Bujard., 1992)

Leber-, Nierenzellen, Neuronen, T-Lymphozyten

Schönig et al., 2002

Ksp1.3/Cre Ksp-Cadherin Adult: Sammelrohr, aufsteigenden Schenkel der Henleschen Schleife Embryo: Ureterknospe, renale Tubuli

Shao et al., 2002a; 2002b

Neph-Cre Nphs1 (Nephrin)

Podozyten Eremina et al., 2002

AxIL-1pr/Cre Interleukin-1β Glomeruli Yokoo et al., 2001

EINLEITUNG 12

1.3.2 Zeitlich regulierbare Cre-exprimierende Tiermodelle Eine enge zeitliche Kontrolle der Genexpression kann jedoch grundsätzlich nicht alleine über

den Promotor erzielt werden, da verkürzte Minimalpromotoren häufig konstitutiv aktiv sind.

Diese zeitliche Kontrolle wird über eine exogene Beeinflussung der Cre-Expression erreicht.

Die besten Erfahrungen wurden hierbei mit der hormonellen Induktion gemacht. Für eine

zeitlich induzierbare Expression der Cre-Rekombinase in transgenen Tieren sind bislang

mehrere Regulationsmodelle veröffentlich worden. Im folgenden Abschnitt werden die

induzierbaren Systeme vorgestellt.

1.3.2.1 Tet-Repressor/Aktivator-System Als Pioniere entwickelten Gossen und Bujard 1992 ein Kontrollsystem, welches die

Expression individueller Gene durch exogene Zugabe von Tetrazyklin-Analoga reguliert

(Gossen & Bujard, 1992). Dieses System zur induzierbaren Genexpression basiert auf zwei

regulatorischen Elementen: dem Transkriptionsaktivator tTA und einem Operator. Der

Transkriptionsaktivator tTA ist ein Fusionsprotein bestehend aus dem Tet-Repressor vom

tn10 des Bakteriums E. coli und der Aktivierungsdomäne vom viralen Protein VP16 des

Herpes simplex Virus (HSV). Beim Operator handelt es sich um einen humanen

Cytomegalovirus (CMV) Promotor kombiniert mit multiplen tet-Operatorsequenzen (tetO)

(Gossen & Bujard, 1992; 1993; Kuhn et al., 1995; Gossen et al., 1995; Kistner et al., 1996).

Der Transkriptionsaktivator tTA kann nur in seiner aktiven Form an den Operator anbinden

und die Transkription initiieren. Diese aktive Form wird tTA nur in Abwesenheit von

Tetrazyklin beibehalten. Durch die Zugabe von Tetrazyklin kommt es zu einer

Konformationsänderung vom tTA und wird dadurch inaktiviert. Infolgedessen kann der

inaktive tTA nicht an den Operator anbinden und die Transkription unterbleibt.

Der reverse Transaktivator rtTA ist mit dem tTA identisch mit Ausnahme von vier

Aminosäure-Substitutionen im tTA-Lokus, die den reversen Phänotyp vermitteln (Gossen et

al., 1995; Lindeberg & Ebendal, 1999). Hierbei wird rtTA im Gegensatz zu tTA, der als

Repressor fungiert, erst durch eine Tetrazyklin-Zugabe (bzw. seines Analogons Doxycyclin

(Dox)) aktiviert und kann am Operator anbinden. Erst nach Anbindung des aktiven rtTA

erfolgt die Transkription. Zum besseren Verständnis ist die induzierbare Genexpression mit

rtTA in Abbildung 1.4 bildlich dargestellt. Eine konditionale Expression wird ermöglicht, wenn

die Cre-Rekombinase unter der Kontrolle vom Tetrazyklin-Regulationssystem gestellt wird.

Eine herausragende Arbeit wurde 2000 von Yamamoto et al., (2000) veröffentlicht. Die

Arbeitsgruppe etablierte mittels des tTA-Regulationssystem und des Cre-lox/P-

Rekombinationsmechanismus ein konditionales transgenes Mausmodell um die

neurodegenerative Erkrankung Huntington Disease (HD) zeitlich zu regulieren. HD ist

charakterisiert durch progressive und putativ irreversible neuropathologische Symptome

EINLEITUNG 13

durch Einlagerung von Proteinaggregaten, so genannten Huntingtinen, in Neuronen. Die

entwickelten HD-Mausmodelle exprimieren ein mutiertes Hungtingtin-Fragment, wodurch

sich der charakteristische HD-Phänotyp einstellt. Durch Zugabe von Tetrazyklin konnte tTA

inaktiviert werden, somit ist die Huntingtin Expression inhibiert. Bemerkenswerterweise

stellten sich eine Regeneration der Neuronen und ein Rückgang der HD-Symptomatik ein.

Somit zeigte sich, dass diese Erkrankung, was lange Zeit als nicht möglich erachtet wurde,

reversibel ist. Diesbezüglich sind weitere zeitlich induzierbare Tiermodelle entwickelt worden

(Hennighausen et al., 1995; Utomo at al., 1999; Lindeberg & Ebendal, 1999; Saam &

Gordon, 1999; Schönig et al., 2002; Radomska et al., 2002).

Abbildung 1.4: Induzierbare Genexpression vermittelt durch rtTA. Nach Zugabe von Doxycyclin (Dox) wird rtTA aktiviert und bindet an die tet-Operatorsequenzen (tetO). Die Transkription des gewählten Transgens wird somit aktiviert. Abbildung modifiziert nach Gossen et al., 1995.

-Dox +Dox

rtTA

x (A)n

tetO

inaktives rtTA

x (A)n

tetO

aktives rtTA

rtTA

Promoter (A)n

-Dox +Dox

rtTA

x (A)nx (A)n

tetO

inaktives rtTA

x (A)nx (A)n

tetO

aktives rtTA

rtTA

Promoter (A)n(A)n

EINLEITUNG 14

1.3.2.2 Interferon-Rezeptor-Rekonstitution Kühn etablierte 1995 eine Mx1-Cre-Maus, bei welcher die Cre-Rekombinase unter der

Kontrolle des Interferons induzierbaren Mx1-Promotors steht (Kühn et al., 1995). Die

Interferon induzierbare Mx1-Cre-Maus ist von mehreren Arbeitsgruppen verwendet worden

(Schneider et al., 2003; Radtke et al., 1999; Tomita et al., 2000; Horcher et al., 2001;

Ioannidis et al., 2001; Yang et al., 2001; Akiyama et al., 2002; Han et al., 2002; Raffai et al.,

2002; Lieu et al., 2003).

1.3.2.3 Murines Östrogen-induzierbares System Ein weiteres System zur Regulation der Cre-Rekombinase ist 1996 von Zhang et al. (1996)

entwickelt und 1999 von Verrou et al. weitergehend modifiziert worden. Es wurden

Expressionsvektoren konstruiert für ein Fusionsprotein, welches aus der Cre-Rekombinase

und einer mutierten Hormonbindungsdomäne des murinen Östrogenrezeptors besteht. Die

Bindungsdomäne wurde sowohl am C- als auch am N-Terminus der Cre-Rekombinase

kloniert. An der Hormonbindungsdomäne kann noch das synthetische Anti-Östrogen

Tamoxifen anbinden, aber nicht mehr das endogen vorkommende 17-β-Östradiol. Durch 4-

Hydroxytamoxifen wird folglich die chimäre Cre-Rekombinase merCremer (mer: murine

oestrogen receptor) aktiviert. Dieses Modell wurde von Bugeon et al. (2003) angewendet um

eine zeitlich induzierbare Cre-Expression in Podozyten zu erzielen. 2003 fand diese Methode

auch zur konditionalen Cre-Expression in Herzmuskelzellen Verwendung (Petrich et al.,

2003).

1.3.2.4 Humanes Östrogen-induzierbares System Ein weiteres System für die zeitlich und örtlich regulierte Cre-Expression stellt das

gemeinsam von Metzger et al. (1995) entwickelte Cre-ERT-System dar. Die Fusion der

Ligandenbindungsdomänen (LBD: ligand-binding domain) aus steroid Hormonrezeptoren

(ER: estrogen receptor) mit einer Vielzahl von heterologen Proteinen zeigten eine liganden-

abhängige Aktivitätskontrolle. Es wurde eine ligandeninduzierbare Cre-Rekombinase durch

Fusionierung des Cre-Strukturgens mit der Ligandenbindungsdomäne des humanen

Östrogen-Rezeptors (hER) generiert. Das entstandene chimäre Protein Cre-ER führte zu

einer östradiolabhängigen Cre/loxP-Rekombination. Sowohl das endogene 17β-Östradiol als

auch das synthetische Anti-Östrogen 4-Hydroxytamoxifen aktiviert das Fusionsprotein Cre-

ER (Metzger et al., 1995). Die Spezifität dieses Rezeptors wurde nachfolgend durch

Mutagenese so variiert, dass das Fusionsprotein nicht mehr durch das endogene Östrogen,

sondern nur noch durch Tamoxifen aktiviert werden kann. Durch die mutierte

Ligandenbindungsdomäne resultierte das Protein Cre-ERT (Feil et al., 1996, 1997). Auf

molekularer Ebene ist Tamoxifen für die Translokation des cytoplasmatisch lokalisierten Cre-

EINLEITUNG 15

ERT in Richtung Nukleus verantwortlich (Brocard et al., 1997). Erst im Nukleus kann das Cre

als DNA-Bindeprotein enzymatisch aktiv werden. Eine Tamoxifen-induzierbare retinoid-X-

Rezeptoren-Expression wurde in Keratinozyten (Li et al., 2000) und in Adipozyten

(Fettzellen) ausgeführt (Imai et al., 2001). 2003 erfolgte eine spezifische Cre-ERT2 -

Expression in myelinbildenden Schwann-Zellen (Leone et al., 2003).

EINLEITUNG 16

1.4 Ziele Die Herstellung transgener Tiermodelle zur Funktionsanalyse neuer Gene oder

Genvarianten und die Gen-„knockout/knockin“-Technologie, durch die Gene oder Gen-

Abschnitte inaktiviert, addiert oder modifiziert werden können, haben sich mittlerweile zu

einer vielfach genutzten Technik entwickelt. Diese komplexen experimentellen Ansätze sind

insbesondere dann von Bedeutung, wenn die Keimbahnmutationen letal oder die

Auswirkungen einer Mutation nur in bestimmten Geweben oder Organen von Wichtigkeit

sind. Diese Limitierungen zeigten sich bei den ADPKD-„knockout“-Mäusen. Konventionell

generierte Mausmutanten zeigen nur den ersten relevanten Expressionszeitpunkt auf. In

anderen Fällen wird ein komplexer pleiotroper Phänotyp verursacht, der mit dem

menschlichen ADPKD-Phänotyp nicht vergleichbar ist. Die konditionale Mutagenese in der

Maus ist ein neuer Ansatz zur gewebespezifischen, funktionellen Analyse von Genen. Ein

Meilenstein zur Generierung konditionaler Mausmutanten ist das mittlerweile vielfach

eingesetzte Cre/loxP-Rekombinationssystem. Ziel dieser Arbeit war es eine transgene

Mauslinie zu entwickeln, bei welcher nephronspezifisch die Cre-Rekombinase exprimiert

wird. Diese Maus wäre in Zukunft nicht nur für die Analyse der ADPKD, sondern auch für

Funktionsstudien vieler weiterer nierenspezifischer Gene von großer Bedeutung.

MATERIAL UND METHODEN

17

2 Material und Methoden

Alle in den folgenden Kapiteln verwendeten Materialien und Geräte sind in Kapitel 2.6-2.7

aufgeführt. Die Bezugsfirmen und deren Adressen sind in Kapitel 2.8 aufgelistet.

2.1 Datenbanken Zwecks Identifizierung geeigneter Oligonukleotide zur PCR und zur Sequenzierung wurden

folgende Programme verwendet:

• OLIGO 4.0, Primer Analysis Software, National BioSciences

• http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi (Whitehead Institute

Center for Genome Research, Cambridge, MA, USA)

Für die Standard-Sequenzanalyse (Transkription, Translation, Restriktion, Editierung der

Sequenzinformationen) sind folgende Programme verwendet worden:

• DNASISTM Version 6.0, Pharmacia Biotech (Freiburg)

• http://genius.embnet.dkfz-heidelberg.de/menu/w2h/w2hdkfz/index.shtml,DKFZ

Heidelberg, HUSAR

Zur Sequenzauswertung des ABI PRISM® 310 und des ABI PRISM® 3700 wurde folgendes

Programm verwendet:

• Chromas, Version 1.43 (32-bit) Conor Mc Carthy School of Biomolecular and

Biomedical Science Faculty of Science Griffith University Brisbane, Queensland

Australien

Zur Darstellung von Plasmidkarten wurde folgendes Programm verwendet:

• pDRAW32 1.0 Revision 1.1.61, Kjeld Olesen Acaclone software,

http://www.acaclone.com

Datenbankrecherchen erfolgten über folgende Internetseite:

• http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/ National Center for Biotechnology Information

U.S National Library of Medicine 8600 Rochville Pike, Bethesda, MD 20894, USA

Zur Dokumentierung der in dieser Arbeit verwendeten Mauslinien ist folgendes Programm

verwendet worden:

• Microsoft® Access 2002, Microsoft Corporation 1992-2001

http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi

http://genius.embnet.dkfz-heidelberg.de/menu/w2h/w2hdkfz/index.shtml

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/


18

2.2 Molekularbiologische Methoden

2.2.1 Kultivierung von Escherichia coli (E. coli) Die Anzucht der E. coli-Bakterien erfolgte in LB-Medium bei 37°C. Flüssigkulturen wurden

mit 200 rpm geschüttelt. Um plasmidtragende Zellen zu selektionieren, wurde Ampicillin in

einer Endkonzentration von 100 µg/ml zugegeben. Die Herstellung der Nährmedien erfolgte

nach Sambrook et al. (1989). Für Festmedien wurde 1% - 2,5% (w/v) Agar-Agar zugesetzt.

2.2.2 Anlegen einer Gefrierkultur Unter Selektionsdruck wurde zunächst eine Einzelkolonie in Flüssigmedium über Nacht

angezogen. 700 µl von der Flüssigkultur sind anschließend in ein Kryoröhrchen, in dem

150 µl Glyzerin (87%) vorgelegt waren, überführt worden. Die Gefrierkultur wurde bei -70°C

gelagert und vor Gebrauch im Schüttelwasserbad aufgetaut.

2.2.3 Plasmid-Isolierung aus E. coli In Abhängigkeit von der gewünschten Qualität und Quantität der Plasmid-DNA wurden drei

unterschiedliche Isolierungsmethoden durchgeführt. Für geringe DNA-Mengen ohne hohen

Reinheitsgrad, erfolgte die konventionelle Plasmid-Isolation aus E. coli (2.2.3.1). Um einen

höheren Reinheitsgrad und/oder größere DNA-Mengen zu erzielen, ist ein Kit für Plasmid-

Mini-/Maxi-Präparation (2.2.3.2) der Firma Qiagen (Hilden) verwendet worden. Alle

Methoden der Plasmid-Isolation beruhen auf der alkalischen Denaturierung mit

anschließender DNA-Neutralisierung (Birnboim & Doly, 1979).

2.2.3.1 Plasmid-Mini-Präparation aus E. coli

Nach Animpfung einer E. coli-Einzelkolonie erfolgte die Anzucht unter entsprechendem

Selektionsdruck über Nacht (37°C) in 7 ml LB-Medium. Nach Zentrifugation von 1,5 ml der

Flüssigkultur (15000 g, 3 min) wurden die Zellen in 50 µl TE-Puffer resuspendiert. Durch

Zugabe von 300 µl des alkalischen Lysispuffers (TENS-Puffer 1) fanden die Zell-Lyse und

die DNA-Denaturierung statt. Die Plasmid-DNA renaturierte durch die anschließende Zugabe

von 150 µl Neutralisierungspuffer (TENS-Puffer 2). Nach Durchmischen der Lösung wurden

die chromosomale DNA, die Proteine, sowie die Zelltrümmer abzentrifugiert (15000 g,

15 min). Um die DNA zu präzipitieren, wurde der Überstand in einen Volumen Isopropanol

(-20°C) überführt. Nach erneuter Zentrifugation (15000 g, 30 min, 4°C) wurde das Pellet mit

70% Ethanol (-20°C) gewaschen. Der Ansatz ist abschließend zentrifugiert (s. o.) und das

entstandene Pellet in 20 µl TE-Puffer gelöst und mit 1 µl RNase (1 U/µg) vermengt worden.


19

2.2.3.2 QIAprep-Plasmid-Mini-/Maxi-Präparation aus E. coli

Durch die QIAprep-Plasmid-Mini-/Maxi-Präparation (Qiagen, Hilden) wurde Plasmid-DNA

mittels einer Anionenaustauschersäule aus E. coli Bakterien-Flüssigkultur gewonnen. Die

Präparationen bakterieller Plasmid-DNA erfolgten mit dem QIAprep-Mini-/Maxi-Kit (Qiagen,

Hilden) gemäß dem mitgelieferten Protokoll aus 50 ml- bzw. 500 ml-Kulturen.

2.2.4 DNA-Isolierung aus Gewebe Genomische DNA aus Gewebe wurde in dieser Arbeit mittels zwei unterschiedlichen

Methoden gewonnen:

• Phenol-Chloroform-Extraktion (2.2.5.1)

• Aussalzung (2.2.5.2)

Beide Methoden beruhen auf den Zellaufschluss durch SDS und Proteinase K. Bei der

anschließender Beseitigung der Proteine unterscheiden sie sich durch die Zugabe von

entweder einer Phenol/Chloroform- oder einer gesättigten NaCl-Lösung. Das Gewebe wurde

zunächst mit einem Skalpell zerkleinert und in 0,5-5 ml Lysispuffer überführt

(Mäuseschwänze: 750 µl, andere Gewebe: 5 ml). Nach Zugabe von 50 µl Proteinase K

(10 mg/ml) / ml Lysispuffer wurde die Lösung über Nacht in einem auf 55°C temperiertes

Schüttelwasserbad inkubiert. Die DNA wurde am folgenden Tag mittels Phenol/Chloroform-

Lösung extrahiert (2.2.5.1) oder ausgesalzen (2.2.5.2). Abschließend erfolgte die DNA-

Fällung mit Isopropanol (2.2.5.3) oder mit Ethanol (2.2.5.4).

2.2.5 Reinigung isolierter DNA 2.2.5.1 Phenol/Chloroform-Extraktion Zur Abtrennung von Nukleinsäuren aus proteinhaltigen Lösungen wurden

Phenol/Chloroform-Extraktionen durchgeführt. Die wässrige Lösung ist mit einem Volumen

TE- gesättigtem Phenol versetzt und gut gemischt worden. Dabei bleiben die Nukleinsäuren

aufgrund ihrer hydrophilen Gruppen in der oberen wässrigen Phase gelöst, während sich die

Proteine zwischen beiden Phasen, in der so genannten Interphase, anordnen. Nach

anschließender 5-minütiger Zentrifugation bei 13.000 rpm (RT) wurde die obere wässrige

Phase in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Nach Zugabe von einem Volumen

Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) auf die wässrigen Phase wurde das Gefäß geschüttelt und

erneut zentrifugiert (13000 rpm, RT, 5´), so dass die vorhandenen Phenolreste extrahiert

wurden. Anschließend ist die obere DNA-haltige wässrige Phase vorsichtig abgenommen

und in ein neues Reaktionsgefäß überführt worden. Mit 800 µl Isopropanol (2.2.5.3) oder

Ethanol erfolgte abschließend die DNA-Fällung (2.2.5.4).


20

2.2.5.2 Aussalzung Bei der Methode der Aussalzung wurden 550 µl DNA-Lösung mit 154 µl 6 M NaCl vermengt

und 15 Sekunden gemischt. Es folgte eine Zentrifugation für 5 Minuten bei 13.000 rpm (RT).

Der DNA-haltige Überstand ist vorsichtig abgenommen und mit 600 µl Isopropanol gefällt

worden (2.2.5.3).

2.2.5.3 Isopropanol-Fällung Nach Zugabe von 0,7 fachen Volumens Isopropanol (4°C) zu der DNA-haltigen Lösung

wurde das Reaktionsgefäß leicht geschwenkt und anschließend abzentrifugiert (15000 g,

30 min, 4°C) worden. Die Reinigung des Pellets erfolgte durch Zugabe von 70% Ethanol und

einer erneuten Zentrifugation (15000 g, 5 min, 4°C). Das entstandene Pellet wurde

abschließend luftgetrocknet und in einer gewünschten Menge Aqua dest. oder TE-Puffer

gelöst (über Nacht, RT).

2.2.5.4 Ethanol-Fällung 1/10 Volumen Na-Acetat (3M, pH 5,2) und das 2,5-fache Volumen Ethanol abs. (-20°C)

wurden in die DNA-Lösung überführt. Das Reaktionsgefäß wurde leicht geschwenkt und

nach Zentrifugation (13000 rpm, 30 min, 4°C) konnte der Überstand abgegossen und das

entstandene Präzipitat mit 70%igem Ethanol (4°C) gewaschen werden. Abschließend wurde

das DNA-Pellet an der Luft getrocknet und in einer gewünschten Menge Aqua dest. oder TE-

Puffer aufgenommen (über Nacht, RT).

2.2.5.5 Dialyse Niedermolekulare Verunreinigungen wie z.B. Zucker oder Salze können enzymatische

Reaktionen inhibieren. Um sie zu entfernen, wurde bis zu 50 µl DNA-Lösung auf ein

Mikrofilterblättchen (Millipore, Schwalbach) mit einem Porendurchmesser von 0,025 µm

übertragen. Das Filterblatt lag 15 min auf der Oberfläche einer mit Aqua dest. gefüllter

Petrischale. Die semipermeable Membran des Mikrofilterblättchens ist für Nukleinsäuren

undurchlässig, wodurch die niedermolekularen Verbindungen aus der Probe entlang des

osmotischen Gradienten in die umgebende Flüssigkeit diffundieren.

2.2.6 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren Die Bestimmung der Reinheit und die Quantifizierung von Nukleinsäuren erfolgte durch

Messung der optischen Dichte (OD) mit dem Photometer ”Genequant” (Pharmacia, Freiburg)

bei 360 nm, 280 nm und 260 nm.


21

2.2.7 Gelelektrophorese von Nukleinsäuren Die Nukleinsäuren wandern beim Anlegen eines elektrischen Feldes aufgrund der negativen

Ladung ihres Zucker-Phosphat-Rückrats in Richtung Anode. Als Folge des

Molekularsiebeffektes der Gelmatrix vollzieht sich eine Auftrennung der Makromoleküle nach

ihrer Größe (Aaij & Borst, 1972). Tabelle 2.1 stellt den Auftrennungsbereich linearer DNA-

Moleküle in Gelen bei unterschiedlichen Agarosekonzentrationen dar.

Tabelle 2.1: Effizienter Trennbereich linearer DNA-Moleküle in Gelen unterschiedlicher Agarosekonzentration (Maniatis et al., 1989). Agarosekonzentration [%] 0,3 0,6 0,7 0,9 1,2 1,5 2,0

Auftrennungsbereich [kb] 60-5 20-1 10-0,8 7-0,5 6-0,4 4-0,2 3-0,2

Die Agarose wurde in Elektrophoresepuffer (1x-TBE-Puffer/Größenbestimmung; 1×-TEP-

Puffer/DNA-Transfer-Gele) suspendiert, und mit Ethidiumbromid versetzt. Nach Erstarren

des Agarosegels wurde mit Elektrophoresepuffer überschichtet. Anschließend sind die

Proben mit 1/10 Volumen Gelladepuffer versetzt und in die Probetaschen pipettiert worden.

Als Längenstandard dienten 500 ng der 100 bp-Leiter (Invitrogen, Karlsruhe) und/oder 500

ng des Markers GeneRuler™ 1 kb DNA Leiter (Fermentas, St. Leon-Rot; Abbildung 2.1). Die

Gelelektrophorese erfolgte je nach Agarosekonzentration, Größe des Gels und

Zusammensetzung der Fragmente bei einer Feldstärke von 0,5 bis 5 V/cm in einem Zeitraum

von 1-12 Stunden. Abschließend konnte die DNA unter UV-Licht betrachtet werden.

Abbildung 2.1: DNA-Längenstandards (A): 100 bp-DNA-Leiter (Invitrogen, Karlsruhe); (B): GeneRuler™ 1 kb DNA-Leiter (Fermentas, St. Leon-Rot).

(A)

-500

-600

-300

-100

-200

-400

-1.500

-2.072

bp bp (B)


22

2.2.8 Extraktion und Rückgewinnung von DNA aus Agarosegelen Mit Hilfe des “QIAquick Gel Extraction Kit” (Qiagen, Hilden) erfolgte die Extraktion von DNA-

Fragmenten (<10 kb) aus Agarosegelen, entsprechend dem mitgelieferten Protokoll. Die

Gelmatrix wird durch Natriumperchlorat zersetzt und die DNA adsorbiert an die

Säulenmatrix. Nach Reinigung durch mehrere Waschschritte kann die DNA aus den

Säulchen mit wahlweise 30 µl TE-Puffer (65°C) oder Aqua dest. eluiert werden.

2.2.9 Modifikation und Klonierung von Nukleinsäuren Die Klonierung von Nukleinsäuren ist definiert als Einbau von DNA-Fragmenten in Vektoren

mit anschließender Transformation in E. coli-Bakterien. Ziel dieser Transformation ist die in

vivo Vermehrung der exogenen Nukleinsäuren. Dabei setzt jede Klonierungsstrategie eine

Modifikation der DNA voraus. Alle einklonierten DNA-Fragmente wurden nach

abgeschlossener Klonierung zur Kontrolle sequenziert und anschließend mit der

Ausgangssequenz verglichen. Somit konnte gewährleistet werden, dass nur einklonierte

DNA-Fragmente ohne Sequenzveränderungen verwendet worden sind.

2.2.9.1 Restriktion Die Restriktion von DNA erfolgte durch Restriktionsendonukleasen der Klasse II, welche dem

Anhang zu entnehmen sind. Es wurden Enzyme der Firmen Roche (Mannheim), Invitrogen

(Karlsruhe) oder New England Biolabs (Frankfurt/Main) bezogen und unter Verwendung der

mitgelieferten Puffersysteme nach Angaben des Herstellers eingesetzt. Bei Mehrfach-

Restriktionen mit Enzymen, die unterschiedliche Puffer benötigten, wurde der Puffer gewählt,

bei dem die geringsten Aktivitätsverluste zu erwarten war. Falls erforderlich, erfolgte nach

der Restriktion eine Hitzeinaktivierung. Die Restriktionsreaktionen wurden abschließend über

eine Gelelektrophorese (2.2.7) kontrolliert und analysiert.

2.2.9.2 Dephosphorylierung der 5´-Enden Um bei Klonierungen eine Vektor-Religation zu vermeiden, können die 5´-Enden der DNA-

Vektoren mit Hilfe der alkalischen Phosphatase dephosphoryliert werden. Hierfür wurde die

SAP-alkalische-Phosphatase der Firma Roche (Mannheim) eingesetzt. Nach Restriktion

(2.2.9.1) mit anschließender Hitzeinaktivierung der Restriktionsendonukleasen erfolgte die

Zugabe folgender Lösungen: pro 50 ng Vektor-DNA: 0,9 µl SAP-Puffer (10x) und 1 U

alkalischer Phosphatase. Bei überstehenden DNA-Enden schloss sich eine

Inkubationsphase von 10 min bei 37°C an und bei glatten DNA-Enden 60 min bei 37°C.

Nach der Dephosphorylierungsphase folgte die Hitzeinaktivierung der alkalischen

Phosphatase bei 65°C für 15 min, in der sie irreversibel denaturiert. Die dephosphorylierte

DNA konnte dann für weitere Ligationen eingesetzt werden. Alternativ kann CIP („calf


23

intestinal phosphatase“, Roche, Mannheim) verwendet werden. Tabelle 2.2 veranschaulicht

ein CIP-Pipettierschema:

Tabelle 2.2: CIP-Pipepettierschema

Agentien Konzentration Vol. (µl)

Restringierte Vektor-DNA x ng/µl 20,0

10×CIP-Puffer 2,5

H2O 1,5

Alkalische Phosphatase 1U/μl 1

2.2.9.3 Auffüllen von 5´-Überhängen mit Klenow-Polymerase Aus 5´-überhängenden Restriktionsschnittstellen können durch Einsatz der Klenow-

Polymerase, ein Fragment der DNA-Polymerase I aus E. coli, welche keine 5´-3´-

Exonuklease-Aktivität besitzt, glatte Enden erzeugt werden. Dazu wird die DNA in

Anwesenheit von dNTPs mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aus E. coli

inkubiert. Tabelle 2.3 stellt das Pipettierschema dar. Die Inkubation erfolgte 2 h bei 15°C mit

anschließender Hitzeinaktivierung bei 75°C (15 min).

Tabelle 2.3: Klenow-Pipettierschema

Agentien Konzentration Vol. (µl)

Restriktionsfragment x ng/µl 15,0

10x HindIII-Puffer 2,5

dNTPs 0,5 mM 5,0

Klenow-Polymerase 1 U/µl 2,5

2.2.9.4 Ligation Die Ligation von DNA-Fragmenten erfolgte mit Hilfe der T4-DNA-Ligase aus E. coli. Dieses

Enzym katalysiert die Ausbildung von Phosphordiesterbindungen zwischen benachbarten 3´-

Hydroxy- und 5´-Phosphatgruppen doppelsträngiger DNA-Moleküle. Für die Ligations-

reaktionen wurde ein molares Verhältnis von 1:3 bis 1:5 Vektor zur Insert-DNA eingesetzt.

Zur DNA Lösung kam das entsprechende Volumen vom 10x T4-Ligationspuffer hinzu. Der

Ansatz inkubierte 3 min bei 50°C und kühlte anschließend auf Eis ab um mögliche

Sekundärstrukturen der DNA zu zerstören. Abschließend wurde 1U/µg T4-Ligase zugesetzt

und bei 14°C ca. 6-12 Stunden im Wasserbad inkubiert.


24

2.2.9.5 Klonierung von PCR-Produkten Um PCR-Produkte zu klonieren, sind in der vorliegenden Arbeit zwei Techniken angewandt

worden. Erstens die Topoisomerase-Methode (Shuman, 1994) mit Hilfe des TOPOTM TA

Cloning Version E-Kits (Invitrogen, Karlsruhe) und zweitens konventionell mittels Einführung

von Restriktionsschnittstellen in die Leitsequenzen (Primer). Die Taq-Polymerase hat eine

terminale Transferase-Aktivität, durch die einzelne Desoxyadenosine (A) an den 3´-Enden

der resultierenden PCR-Produkte kovalent angebunden werden. Ein im Kit mitgelieferter

linearisierter Vektor (TOPOTM -Klonierungsvektor) verfügt über einzelne überhängende 3´-

Desoxythymidine (T). Das Enzym Topoisomerase I katalysiert die Ligation des TOPOTM -

Klonierungsvektors mit den PCR-Amplifikaten. Gemäß den Angaben des Herstellers wurde

die Klonierung durchgeführt. Mit der konventionellen Methode sind Oligonukleotide durch

Restriktionsschnittstellen generiert worden (Anhang). Abschließend wurden die

Ligationsansätze in E. coli-Zellen transformiert (2.2.10).

2.2.9.6 Klonierung von Restriktionsfragmenten Um DNA-Fragmente zu klonieren, wurde die DNA zunächst restringiert (2.2.9.1) und nach

gelelektrophoretischer Auftrennung (2.2.7) aus dem Agarosegel extrahiert (2.2.8). Zwecks

Vermeidung einer Religation des Vektors bei Verwendung eines Restriktionsenzyms erfolgte

vor der Ligation eine Dephosphorylierung mit der alkalischen Phosphatase (2.2.9.2). Bei der

Klonierung von DNA mit unterschiedlichen Restriktionsfragmenten wurden mittels der

Klenow-Polymerase (2.2.9.3) glatte Enden produziert und anschließend ligiert (2.2.9.4). Zur

Vervielfältigung der klonierten Fragmente, sind die Ligationsansätze abschließend in E. coli-

Zellen transformiert worden (2.2.10).

2.2.10 Transformation von E. coli Als Transformation wird die Veränderung des Genotyps einer Zelle durch die exogene

Aufnahme von DNA-Molekülen bezeichnet (Singer & Berg, 1992). Um DNA aufnehmen zu

können, müssen die Zellen chemisch vorbehandelt werden. Zur Transformation wurden

E. coli-Top10-Zellen (Invitrogen, Karlsruhe) gemäß den Angaben des Herstellers verwendet.

2.2.11 Polymerasekettenreaktion (PCR) Bei der PCR-Methode handelt es sich um ein effizientes Verfahren zur in vitro-Vermehrung

von DNA (Mullis, 1990). Einzelne DNA-Fragmente liegen nach 20 bis 40 Vermehrungszyklen

in milliardenfacher Kopie vor. Folgende Reaktionskomponenten sind für die PCR-

Durchführung erforderlich: doppelsträngige Matrizen-DNA; Oligonukleotide (PCR-Primer),

welche zur Matrizen-DNA komplementär sind; freie Desoxynukleotide (dNTPs); Mg2+-Ionen

und thermostabile DNA-Polymerasen. In dieser Arbeit wurden die Taq-Polymerase aus dem


25

thermophilen Eubacterium Thermus aquaticus (Chien et al., 1976; Invitrogen, Karlsruhe) und

die Pfu-Polymerase (Lundberg et al., 1991; Stratagene, LaJolla, USA) aus dem

hyperthermophilen Archaebakterium Pyrococcus furiosus verwendet. Tabelle 2.4 stellt das

PCR-Pipettierschema dar. Die PCR-Programmparameter sind der Tabelle 2.5 zu

entnehmen. Bei einem hohen GC-Gehalt der Matrizen-DNA und zur Vermeidung von Primer-

Dimerisierungen wurde den Reaktionsansätzen Betain (0,5 M) und DMSO (5-10%)

zugesetzt.

Tabelle 2.4: PCR-Pipettierschema

Agentien Konzentration Volumen (µl)

DNA 100 ng/μl 2,0

PCR-Puffer 10x 5,0

dNTPs 5 mM 2,0

5´-Oligonukleotid 10 pmol/μl 1,0

3´-Oligonukleotid 10 pmol/μl 1,0

DNA-Polymerase 5 U/μl 0,3

ddH2O 38,7 (ad 50 μl)

Tabelle 2.5: Programmparameter für die PCR-Reaktion; Schritte 2-4 25-35x wiederholen

Schritt T in (°C) T (min)

1. Initiale Denaturierung 95 4,5

2. Denaturierung 94 0,45

3. Hybridisierung 50-65 1-1,5

4. Elongation 72 0,5-4

5. finale Elongation 72 7

6. Abschluss 15

2.2.12 DNA-Sequenzierung Der zyklischen Sequenzierung („cycle sequencing”) liegt die Didesoxy-Kettenabbruch-

Methode (Sanger et al., 1977) zugrunde, welche der PCR-Methode sehr ähnlich ist. DNA-

Fragmente werden in vitro in einer zyklischen, enzymatischen Reaktion erzeugt. Die DNA-

Sequenzierung erfordert als Matrize einzelsträngige DNA, sowie einen

Oligodesoxynukleotid-Primer, der zu einem kleinen Teil des Einzelstranges komplementär

ist. Weitere Reaktionskomponenten sind Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs), DNA-

Polymerase und Reaktionspuffer. Anders als bei der PCR sind hier außer dNTPs auch

Didesoxynukleotide (ddNTPs) vorhanden, nach deren Einbau die Strangsynthese


26

abgebrochen wird. Dabei wird die Reaktion durch das Fehlen der 3´-Hydroxylgruppe des

Didesoxynukleotids abgebrochen. Da zu jedem Zeitpunkt der Strangsynthese der Zufall

entscheidet, ob ein dNTP oder das modifizierte Nukleotid ddNTP eingebaut wird, entstehen

insgesamt DNA-Fragmente jeder Länge, die jeweils mit der Primersequenz beginnen und mit

einem ddNTP enden. Zur Sequenzierung wurde das ABI PRISM BigDyeTM, Terminator Cycle

Sequencing Kit (Applied Biosystems, Darmstadt) gemäß den Angaben des Herstellers

verwendet. Die gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffe der eingesetzten ddNTPs wurden auf den

ABI PRISM® 310 oder ABI PRISM® 3700 DNA Analyzer (Applied Biosystems, Darmstadt)

nach Anregung mit Laserlicht detektiert. Es erfolgte die Sequenzierung des kodogenen

Stranges und des Gegenstranges.

2.2.12.1 Proben-Aufreinigung Die PCR-Produkte wurden mittels eines kommerziellen Pre-Sequencing-Kits (USB

Corporation, Cleveland Ohio, USA) aufgereinigt. Nach Beendigung der PCR verbleiben

unverbrauchte dNTPs und Primer im PCR-Reaktionsgemisch, welche sich störend auf die

nachfolgende Sequenzierung auswirken würden. Die im Kit vorliegenden hydrolytischen

Enzyme alkalische Garnellen-Phosphatase und Exonuklease I entfernen unerwünschte

dNTPs und Primer. Dabei beseitigt die Exonuklease I die übrigen einzelsträngigen Primer

und überflüssige einzelsträngige DNA, und die alkalische Garnellen-Phosphatase die

verbliebenen dNTPs. Beide Enzyme lassen sich bei 80°C inaktivieren. Folgender Ansatz

wurde vorbereitet:

3 µl PCR-Produkt

0,6 µl Exonuklease I

0,6 µl Alkalische Phosphatase

Es folgte eine Inkubation von 15 min bei 37°C mit abschließender Hitzeinaktivierung (15 min;

80°C). Die Vektor-DNA kann nach einer Plasmid-Präparation (2.2.3) ohne weitere

Reinigungsschritte sofort eingesetzt werden. Optional konnten mittels Dialyse (2.2.5.5)

niedermolekulare Verunreinigungen entfernt werden.

2.2.12.2 Vorbereitungen der PCR-Reaktionsansätze Pro Reaktion wurden zwei Ansätze gemäß den Angaben des Herstellers (Applied

Biosystems, Darmstadt) vorbereitet. Jeder Ansatz enthält die Matrizen-DNA, den Strang-

bzw. Gegenstrang-Sequenzierungs-Primer, das Reaktionsgemisch (ABI PRISM BigDye

Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, Darmstadt) und Aqua dest. Der

Reaktionsansatz sollte zum einen auf Eis stehen, um Aktivitätsverluste der DNA-Polymerase


27

vorzubeugen und zum anderen, wegen der Lichtempfindlichkeit des ddNTP-Chromophors,

Licht vermieden werden. Anschließend erfolgte die Sequenzreaktion (2.2.12) im T3-

Thermocycler (Biometra, Göttingen). Tabelle 2.6 stellt die Programmparameter der

Sequenzreaktion dar.

Tabelle 2.6: Programmparameter für die Sequenzreaktion; Schritte 2-4 25x wiederholen

Schritt T (°C) t

1. Denaturierung 96 2 min

2. Denaturierung 94 10 sec

3. Hybridisierung 50 5 sec

4. Elongation 60 2 min

2.2.12.3 Vorbereitung der Sequenzierungsansätze für den ABI PRISM® 310 Der Reaktionsansatz (10 µl) wurde nach der Sequenzreaktion in 90 µl Aqua dest. überführt

und nach Zugabe von 3M NaAc (pH 5,2) und 275 µl abs. Ethanol für 5 min bei RT inkubiert.

Nach einer Zentrifugation (10 min; 13000 rpm) wurde der Überstand mittels einer

Wasserstrahlpumpe abgezogen. Das Pellet wurde zunächst in 30 µl HPLC-Wasser gelöst

dann in Spezial-Behälter für den ABI PRISM® 310 überführt und abschließend mit Gummi-

Septen verschlossen.

2.2.12.4 Vorbereitung der Sequenzierungsansätze für den ABI PRISM® 3700 Der ABI PRISM® 3700 DNA Analysator ist ein vollautomatisiertes Multikapillar-

Elektrophorese-Gerät, das die parallele Sequenzanalyse von 96 Proben in einigen Stunden

ermöglicht. Um die Sequenzreaktionen einzusetzen, wurden sie zunächst mittels einer

Sephadex-Multiscreen Filterplatte (Multiscreen: Millipore Billerica, USA; SephadexTM G-50

Fine: Amersham Biosciences, Braunschweig) aufgereinigt und mittels Zentrifugation in „96-

well optical Reaktionsplatten“ (Applied Biosystems, Darmstadt) überführt.

2.2.13 Hybridisierungstechnik 2.2.13.1 Southern-Transfer Um den Southern-Transfer (Southern, 1975) durchzuführen wurden die zu identifizierenden

DNA-Fragmente nach Restriktion (2.2.9.1) in einem Agarosegel neben einem

Längenstandard (2.2.7) gelelektrophoretisch aufgetrennt (2.2.7). Anschließend wurde das

Agarosegel mit einem Lineal als Orientierungshilfe photographiert, um später die

radioaktiven Signale distinkter DNA-Banden zuordnen zu können. Um den Transfer großer

Fragmente (>10 kb) zu erleichtern, erfolgte eine Depurinierung in 0,25 M HCl für 5 min. Das

Agarosegel inkubierte dann in die Denaturierungslösung für 30 min. Nachdem das Gel kurz


28

mit Aqua dest. gewaschen wurde, folgte eine weitere 30-minütige Inkubationsphase in der

Neutralisierungslösung. Abschließend äquilibrierte das Gel in dem SSC-Puffer (2x).

Für den Transfervorgang wurde das äquilibrierte Gel luftblasenfrei auf einen Stapel

Whatmann 3MM Filterpapier gelegt, welches sich in einer Schale mit SSC-Puffer (20x)

befand. Um den Kapillarstrom vom Gel auf die Nylonmembran zu sichern, sind die Gelränder

mit Folie abgedeckt worden. Anschließend wurde eine - passend zum Gel geschnittene -

positiv geladene Nylon-Membran (Roche, Mannheim) auf das Gel gelegt. Um den

essentiellen Kapillarsog zu erhöhen, sind auf der Nylon-Membran drei Lagen mit SSC-

Puffer (2x) angefeuchtetes 3MM-Papier, mehrere Lagen Zellstoff und ein Gewicht von ca.

1 kg gestellt worden. Der DNA-Transfer erfolgte über Nacht.

Nachfolgend wurde die Nylonmembran mit SSC-Puffer (2x) gewaschen, an der Luft

getrocknet und für 2 Stunden bei 80°C erhitzt. Aufgrund der hohen Bindungskapazität der

positiv geladenen Nylon Membran (Roche, Mannheim), wurde alternativ ein modifiziertes

alkalisches Verfahren für den Southern-Transfer verwendet (Chomczynski & Qasha, 1984;

Reed & Mann, 1985). Hierbei erfolgte der Transfer von Agarosegelen nach der

Depurinierung in 0,4 M NaOH. Zur Bindung der DNA an die Membran war eine UV-

Vernetzung für 3 min im Transilluminator erforderlich. Bei alkalisch behandelten Membranen

musste die Lagerung bei 4°C erfolgen.

2.2.13.2 Radioaktive DNA-Markierung Als Hybridisierungssonden wurden entweder PCR- oder genomische DNA-Fragmente

verwendet. Dabei erfolgte die Markierung der Sonden enzymatisch durch Einbau des

radioaktiven Isotops α-P32-dCTP mit dem “High Prime Kit” (Boehringer Ingelheim, Ingelheim

am Rhein). Hierzu wurden 50 bis 100 ng Sonde in 11 µl H2O für 10 min im Wasserbad

gekocht, 5 min auf Eis abgekühlt und mit 5 µl α-P32-dCTP und 4 µl Reaktionsmix gemischt.

Es folgte eine Inkubationsphase von 1 h bei 37°C. Abschließend wurde die radioaktiv

markierte DNA-Sonde über QIAquick-Säulchen (Qiagen, Hilden) nach Angaben des

Herstellers aufgereinigt.

2.2.13.3 Radioaktive Hybridisierung Die Southern-Transfer-Membranen (2.2.13.1) wurden zuerst mit SSC-Puffer (2x) benetzt und

anschließend für 1 h in Prähybridisierungspuffer (1ml/cm2) bei 68°C vorinkubiert. Zur

Hybridisierung wurde zunächst der Hybridisierungspuffer (1ml/cm2) mit 50-100 ng der frisch

denaturierten 32P-markierten DNA-Sonde gemischt und auf die Membran gegeben (Der

Prähybridisierungspuffer wurde entfernt). Die Inkubation erfolgte in einem

Hybridisierungsofen (Biometra, Göttingen) bei 68°C über Nacht. Nach Beendigung der

Hybridisierungsphase wurde der Hybridisierungspuffer abgegossen und die Filter zweimal je


29

15 min bei RT und anschließend dreimal je 15 min bei 68°C mit der Waschlösung 1

gewaschen. Die Membranen wurden anschließend in Folien eingeschweißt. Unter

Verwendung eines BioMAX-MR-Röntgenfilms (Kodak, Stuttgart) erfolgte die

Autoradiographie für 2-24 h (-70°C). Alternativ wurde als Hybridisierungslösung

ExpressHypTM (Clontech, Heidelberg) verwendet und nach Angaben des Herstellers

eingesetzt.

2.3 Etablierung der Mauslinien Die Mäuse wurden von der Firma Charles River (Sulzfeld) und der Firma Harlan (Horst,

Niederlande) bezogen und in der zentralen tierexperimentellen Einrichtung (ZTE) der

medizinischen Fakultät des Universitätsklinikums Münster in Standardkäfigen zu

Vierergruppen mit Wasser ad libitum und Standarddiät (Altromin 1324, Altromin, Lage)

gehalten. Sie waren einem 12 Stunden Tag-Nacht-Rhythmus (07.00 - 19.00 Uhr) und einer

Temperatur von 22 ± 2°C ausgesetzt. Alle Versuche sind gemäß dem deutschen

Tierschutzgesetz durchgeführt und mit der Nummer G10/98 genehmigt worden.

2.3.1 Mikroinjektion

Transgene Mäuse wurden mittels der Mikroinjektions-Methode nach Hogan et al. (1994)

erzeugt. Um zunächst eine ausreichende Menge an Plasmid-DNA zu erhalten, die für die

Mikroinjektion in Oocyten vorgesehen war, erfolgte eine Plasmid-Präparation (2.2.3.2). Die

FVB/N-Oocyten sind von FVB/N-Männchen befruchtet worden. Anschließend wurden in den

fertilisierten Oocyten mittels einer feinen Kanüle die Konstrukte eingeführt. Dabei kann eine

zufällige Integration des Transgens ins murine Genom erfolgen. Die Oocyten wurden

nachfolgend in pseudoschwangere CD1-Weibchen überführt. Durch die vorherige

Verpaarung der Weibchen mit vasektomierten Männchen wird die Ovulation durch den

mechanischen Reiz ausgelöst, worauf die Weibchen zur Aufnahme anderer fertilisierter

Oocyten wie auch zum Austragen der Embryonen bereit sind. Die Injektion der in dieser

Arbeit klonierten DNA-Konstrukte in fertilisierte FVB/N-Oocyten und die anschließende

Implantation der Oocyten in scheinschwangere CD1-Mäuse wurde freundlicherweise von

Herrn Dr. Dr. Boris Skryabin (Institut für Experimentelle Pathologie; ZMBE Münster)

durchgeführt.


30

2.3.2 Genotypisierung der Mauslinien Um zu überprüfen, ob die injizierten DNA-Konstrukte ins Genom der Embryonen erfolgreich

integriert und auch an deren Nachkommen weitergegeben wurden, erfolgte die

Genotypisierung über PCR- (2.2.11) und Southern-Transfer-Analysen (2.2.13.1). Es wurden

ebenfalls auch diejenigen Mäuse genotypisiert, die aus Kreuzungen zwischen transgenen

und Reportermauslinien resultierten. Der Genotyp wurde durch spezifische PCR-Formate mit

den zugehörigen Primern festgestellt, welche der Tabelle 2.7 zu entnehmen sind. Southern-

Transfer Analysen erfolgten bei der transgenen Mauslinie GGT-CRE mit der Sonde S1

(Abbildung 2.6).

Tabelle 2.7: Primer zur Genotypisierung transgener Mäuse

Transgene Mauslinie Primer Sequenz 5´- 3´

GGT-CRE Cre-3-F Cre-3-R

GGT TCG TTC ACT CAT GGA AAA GCA TGA TCT CCG GTA TTG AAA

5470-GGT-IN-F 5523-Cre-R2

GTG ACG TCA GCG TTG ACC ATC CTC C CGA TGA GTT GCT TCA AAA ATC CCT TCC

RTTA-GGT-CRE 5525-RTTA-F1 5528-RTTA-R2

CGG CGC TCT GGA ATT ACT CAA TGG CGC ACT TTA GCT GTT TCT CCA GGC CAC

ROSA26 5588-rosa26-F 5589-rosa26-R1 5590-rosa26-R2

AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT GCG AAG AGT TTG TCC TCA ACC GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG

Z/AP 5573-lacZ-F 5574-lacZ-R

CTG CGT TGG AGT GAC GGC AGT TAT C GTA GTG TGA CGC GAT CGG CAT AAC C

2.3.3 Dokumentierung der Mauslinien Um alle Mäuse zu registrieren, wurden erst die Männchen und dann die Weibchen eines

Wurfs durchnummeriert und ihre Identitätsnummer, Stamm/Hybridstamm, Geburtsdatum,

Geschlecht, Fellfarbe, Nummer der Eltern, Generation, Geschwisterzugehörigkeit und

genetische Sicherheitsstufe sowohl im Zuchtbuch als auch auf der Käfigkarte dokumentiert.

Alle erfassten Daten sind in Microsoft-Access Datenbanken gespeichert und katalogisiert

worden. Zur eindeutigen Identifizierung der Tiere wurden Ohrmarkierungen angebracht.


31

2.3.4 Kreuzungen mit Reportermäusen Um die Cre-Rekombinase-Aktivität der Cre-exprimierenden Mauslinien in vivo

enzymhistochemisch zu analysieren wurden Reportermäuse eingesetzt. Die in dieser Arbeit

generierte transgene GGT-CRE-Mauslinie, wurde sowohl mit den Reportermäusen Z/AP

(Lobe et al., 1999) als auch mit ROSA26 (Soriano, 1999) gekreuzt. Abbildung 2.2 stellt

schematisch das Paarungsschema vor.

Abbildung 2.2: Paarungsschema zur Etablierung und Analyse von doppeltransgenen GGT-CRE+/ZAP+- und GGT-CRE+/ROSA26+-Mäusen. (A) Kreuzungen der GGT-CRE-Mauslinie mit den Reportermäusen Z/AP; ROSA26. Nur in den Zellen mit GGT-Promotoraktivität wird die Cre-Rekombinase exprimiert. (B) GGT-CRE/Z/AP-Zellen ohne Cre-Expression werden durch das hPLAP-Substrat nicht angefärbt. Dafür wird lacZ detektiert. Bei den GGT-CRE/ROSA26-Zellen ohne Cre-Expression liegt keine lacZ-Expression vor. (C) Bei den GGT-CRE/Z/AP-Zellen mit Cre-Expression ist das Reportergen hPLAP enzymhistochemisch nachweisbar. Die β-Galaktosidase ist nicht detektierbar. GGT-CRE/ROSA26-Zellen weisen bei einer Cre-Expression auch einen lacZ-Expression auf. Nur Zellen mit Cre-Expression entwickeln ein blaues Präzipitat nach einer X-Gal-Färbung.

CAGG hplap GGT CRE polyA

GGT-CRE

r26r Neo 4xpA lacZ

(B) Zellen ohne Cre-Expression

lacZ hplap

X

(C) Zellen mit Cre-Expression

X

lacZ

hplap r26r lacZ

r26r Neo 4xpA lacZ

Z/AP ROSA26

CAGG

CAGG

(A) Kreuzungsschema mit GGT-CRE-Mäusen und den Reportermäusen Z/AP und ROSA26

CAGG hplap GGT CRE polyA

GGT-CRE

r26r Neo 4xpA lacZr26r Neo 4xpA lacZ

(B) Zellen ohne Cre-Expression

lacZ hplap

X

(C) Zellen mit Cre-Expression

X

lacZ

hplap r26r lacZ

r26r Neo 4xpA lacZ

Z/AP ROSA26

CAGG

CAGG

(A) Kreuzungsschema mit GGT-CRE-Mäusen und den Reportermäusen Z/AP und ROSA26


32

2.3.4.1 Kreuzungen mit der Z/AP-Reportermauslinie Die Z/AP-Reportermaus Tg(ACTB-Bgeo/ALPP)1Lbe (Lobe et al., 1999) exprimiert konstitutiv

das Reportergen lacZ unter der Kontrolle des CAGG-Promotors (Niwa et al., 1991). Sowohl

embryonal als auch adult liegt eine ubiquitäre lacZ-Expression vor. Ausnahmen sind

Erythrozyten, Chondrocyten und Adipozyten. Der CAGG-Promotor besteht aus dem CMV-

Enhancer und dem Hühnchen-β-Aktin-Promotor. Dem Promotorbereich schließen sich zwei

Reportergene an: lacZ und humane plazentale alkalische Phosphatase (hPLAP, DePrimo et

al., 1996; Millan, 1986). Die β-Galaktosidaseaktivität wird durch eine βgeo-Kassette vermittelt

(Friedrich & Soriano, 1991). Es handelt sich hierbei um die Fusion einer lacZ-Sequenz mit

einer Neomycinkassette. Das Reportergen lacZ wird von loxP-Stellen flankiert. Stromabwärts

befinden sich drei Kopien des SV40-polyA Signals (Zinyk et al., 1998), sowie das zweite

Reportergen hPLAP (Abbildung 2.3 A). Diese besondere Konstellation hat zur Folge, dass

die β-Galaktosidase ubiquitär exprimiert; dafür kann hPLAP aufgrund der vorgeschaltenen

SV40-polyA Signale nicht translatiert werden. Erst nach Kreuzung der Z/AP-Mauslinie mit

einer Cre-exprimierenden Maus kann die gefloxte lacZ-Kasette durch das Cre-Enzym

entfernt und folgerichtig hPLAP ungehindert transkribiert werden (Abbildung 2.3 B). Somit

wird nur in den Cre-aktiven Zellen die lacZ Expression durch die alkalische Phosphatase

Expression ersetzt. Durch die Detektion der alkalischen Phosphatase (2.4.2.2) konnten bei

den doppeltransgenen GGT-CRE/Z/AP-Mäusen, Rückschlüsse auf den Expressionsort der

Cre-Rekombinase und ihrer katalytische Aktivität gezogen werden.

Abbildung 2.3: Schematische Darstellung und Cre/loxP-Rekombination des Z/AP-Konstrukts. (A) Der Promotor besteht aus dem CMV-Verstärker und dem Huhn-Aktin-Promotor. Die „gefloxte“ (dargestellt durch schwarze Dreiecke) β−geo-Sequenz kodiert für ein Fusionsprotein aus β-Galaktosidase (lacZ) und Neomycin-Phosphotransferase (Friedrich & Soriano, 1991). Nachgeschaltet sind drei Kopien des SV40-polyA Signals (3xpA). Beim zweiten Reportergen handelt es sich um das humane plazentale alkalische Phosphatase Gen (hPLAP). (B) Die Cre-Rekombinase hat den gefloxten DNA-Bereich deletiert, was die Transkription von hPLAP zur Folge hat. Zeichnung modifiziert nach Lobe et al., 1999.

CMV enhancer

pA´ βgeo hPLAP 3xpAloxP loxP

Huhn-βActin Promotor

Zielbereich der Cre-Rekombinase

+ CRE

hPLAP (B)

(A)

pA´


33

2.3.4.2 Kreuzungen mit ROSA26-Reportermäusen Bei der in dieser Arbeit eingesetzten ROSA26-Maus handelt es sich um die lacZ-

Reportermauslinie B6, 129S-Gtrosa26tm1Sor (Friedrich & Soriano, 1991; Zambrowicz, et al.,

1997; Soriano, 1999). Ihr Transgen besteht aus einer Spleiß-Akzeptor-Sequenz (SA) gefolgt

von einer gefloxten Neomycinkassette mit einer vierfachen polyA-Sequenz und dem

Reportergen lacZ am 3´-Ende (Maxwell et al., 1989). Die vierfache polyA-Sequenz führt zu

einem Transkriptiosstillstand der RNA-Polymerase. Demzufolge kann das stromabwärts

gelegene lacZ-Reportergen nicht transkribiert werden. (Soriano, 1999). Zur besseren

Übersicht ist das ROSA26-Konstrukt in Abbildung 2.4 A schematisch wiedergegeben. Erst

durch die enzymatische Aktivität der Cre-Rekombinase wird der gefloxte DNA-Bereich

entfernt. Demzufolge kann die stromabwärts liegende lacZ-Kassette transkribiert und die β-

Galaktosidase exprimiert werden (Abbildung 2.4 B). Dieser Arbeit standen sowohl

heterozygote als auch homozygote ROSA26-Mauslinien zur Verfügung. Nach Verkreuzung

von GGT-CRE-Mäusen mit ROSA26-Reportermäusen erfolgte zunächst eine

Genotypisierung um den transgenen Status zu ermitteln (2.3.2). Eine Charakterisierung der

in vivo Cre-Expression erfolgte mittels einer X-Gal-Färbung (2.4.2.1) von Gefrierschnitten

doppeltransgener GGT-CRE+/ROSA26+-Mäusen. Als Kontrolle dienten GGT-CRE-

/ROSA26+-Mäuse. Nur in diesem Gewebe wo das Cre-Protein exprimiert wurde und

katalytisch aktiv war, konnte die β-Galaktosidase nachgewiesen werden.

Abbildung 2.4: Schematische Darstellung und Cre/loxP-Rekombination des ROSA26-Konstrukts. (A) Der Spleiß-Akzeptor-Sequenz (SA) folgt eine gefloxte Neomycin Kassette mit einer vierfachen polyA-Sequenz (PGK neo 4xpA). Dem schließt sich eine lacZ-Kasette und eine dreifache polyA-Sequenz (bPA) an. (modifiziert nach Soriano, 1999). (B) Nach Anbindung einer enzymatisch aktiven Cre-Rekombinase entfernt Cre die „gefloxte“ PGK neo 4xpA Sequenz. Demzufolge kann lacZ transkribiert werden. Die loxP-Stellen sind als schwarze Pfeile dargestellt.

SA PGK neo 4xpA lacZ bPA

SA lacZ bPA

+ CRE

(B)

(A)


34

2.4 Histologische Techniken

2.4.1 Vorbereitung der Gefrierschnitte 2.4.1.1 Entnahme des Gewebes Den Versuchstieren entnommenes Gewebe wurde in PBS-Puffer pH 7,4 (1mM MgCl2)

gewaschen und anschließend in -20°C flüssiges Isopentan überführt. Durch diese

Gefrierungstechnik wird eine spätere Herstellung von Gefrierschnitten am Mikrotom

ermöglicht. Die Lagerung erfolgte bei -20°C. Bei adulten Tieren wurden folgende Organe

entnommen: Gehirn, Leber, Nieren, Milz, Lunge, Herz, Pankreas, Haut, Muskelgewebe,

Ovar/Testis.

2.4.1.2 Entnahme der Embryonen Um den frühesten Expressionszeitpunkt und den Expressionsprofil der Cre-Rekombinase

festzustellen, wurden transgene murine Embryonen in verschiedenen embryonalen

Entwicklungsstufen angefärbt und analysiert. Dafür wurden Mäuse an einen definierten

Zeitpunkt verpaart. Der Kopulationsplug zeigt den Anfang der Schwangerschaft an und wird

als Tag 0,5 der Embryogenese festgelegt. Die Embryonen wurden nach Entnahme

narkotisiert und in -20°C flüssiges Isopentan überführt. Die Lagerung erfolgte bei -20°C

2.4.1.3 Anfertigungen der Gefrierschnitte Die Präparate sind mit dem Gefriermedium GSV1 (Slee Technik, Mainz) als

Haftungsvermittler auf Objektgläser mit entsprechenden Haftrillen aufgefroren worden.

Anschließend wurde das vorbereitete Gewebe bzw. die Embryonen mit dem Mikrotom-

Kryostat HM 500 OM geschnitten. Die Schnitte (6-15 µm) wurden auf Superfrost-

Objektträger (R. Langenbrinck, Emmendingen) übertragen.

2.4.2 Enzymhistochemische Färbungen 2.4.2.1 Detektion der β-Galaktosidase

Das E. coli lacZ-Gen - ein klassisches Reportergen - kodiert für die β-Galaktosidase

(Beckwith, 1980). Bei der β-Galaktosidase handelt es sich um das bakterielle Äquivalent zur

Lactase. Dieses Enzym spaltet die β-1,4-glykosidische Bindung der Laktose. Das meist

verwendete Substrat zur Detektion der β-Galaktosidase ist ein synthetisches

Substratanalogon, ein Indol-Derivat 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactosid (X-Gal, Holt &

Sadler, 1958). Dabei wird X-Gal in β-Galaktose und ein blaues Chromophor (Indigofarbstoff)

hydrolysiert. Die β-Galaktosidase wurde auf Gefrierschnitten nach Matsusaka et al. (1999)

detektiert. In einer 2%igen Glutaraldehyd-Fixierungslösung wurden die Gefrierschnitte

(2.4.1.3) für 5 min auf Eis inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS-Puffer für je 10 min


35

(1 mM MgCl2) wurden die Gefrierschnitte mit der X-Gal-Färbelösung für maximal 10 Stunden

bei 30°C inkubiert. Abschießend wurde mit PBS-Puffer gewaschen. Die endogene β-

Galaktosidase lässt sich, anders als bei der endogenen alkalischen Phosphatase, wo eine

Hitzeeinwirkung (20 min.) erforderlich ist, durch eine entsprechend alkalischen pH-Wert (8)

und reduzierter Inkubations-Temperatur (30°C) inaktivieren.

2.4.2.2 Detektion der alkalischen Phosphatase Das Gen hPLAP (DePrimo et al., 1996; Millan, 1986) kodiert für ein hitzestabiles Protein,

was die Unterscheidung zu der thermolabilen endogenen murinen Phosphatase ermöglicht.

Die Gefrierschnitte wurden eingangs in 0,2% Glutaraldehyd (in PBS-Puffer pH 7,4 + 1mM

MgCl2) fixiert. Es folgten drei Waschschritte (je 5 min in PBS-Puffer pH 7,4 + 1mM MgCl2)

mit anschließender Hitzeinaktivierung der endogenen alkalischen Phosphatase (20 min;

70°C). Anschließend inkubierten die Präparate 10 min in AP-Puffer. Die Darstellung der

alkalischen Phosphatase (AP) erfolgte mittels einem chromogenen Substrat für alkalische

Phosphatase (BM Purple AP Substrat; Roche, Mannheim). Ein blaues Präzipitat zeigt AP-

Aktivität an.

2.4.3 Histologische Übersichtsfärbung Eine Übersichtsfärbung der Schnitte erfolgte mit Eosin Y. Dabei handelt es sich um einen

schwach sauren Farbstoff der Fluorescein-Gruppe, welcher acidophile Cytoplasmaproteine,

Kollagenfasern und Bindegewebe rot anfärbt. Die Präparate wurden zunächst in einer

0,1%igen Eosin-Lösung für 15 min inkubiert und anschließend mit Aqua dest. für 2 min

gespült. Die Differenzierung erfolgte für 2 min in 80%iges Ethanol, wo sich eine Alkoholreihe

anschloss: 2 min 90% Ethanol, 2 min 100% Ethanol. Abschließend wurden die Schnitte

zweimal je 2 min in Xylol inkubiert und mit Eukitt eingedeckelt.


36

2.4.4 Immunfluoreszenz-Untersuchungen Durch die Möglichkeit Fluorchrome an Antikörper zu koppeln (Coons & Kaplan, 1950), lassen

sich spezifische Antigen-Antikörper Reaktionen in histologischen Schnitten durch die

Fluoreszenzmikroskopie sichtbar machen. Tabelle 2.8 stellt die verwendeten Fluorochrome

mit den entsprechenden Wellenbereichen dar.

Tabelle 2.8: Fluorochrome der Fluoreszenzmikroskopie

Markierung Absorption Emission Wellenbereich

Carbocyanin Cy2TM 489 nm 505 nm grün

FITC (Fluorescein-Isothiocyanat) 492 nm 520 nm grün

TRITC (Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanat) 550 nm 570 nm rot

RRX (Rhodamin RedX, Lissamin Rhodamin B-Derivat)

570 nm 590 nm rot

2.4.4.1 Lektin-Markierung Zur Darstellung der proximalen Tubuli wurden die Nieren-Gefrierschnitte mit spezifischen

Lektinen markiert. Die Gefrierschnitte fixierten 20 min bei RT in 4%iger PFA-Lösung. Es

folgte eine Inkubation (10 h) in PBS-Puffer (pH 7,4 + 1 mM MgCl2). Die Lektine wurden 1:20

in PBS-Puffer (pH 7,4 +1 mM MgCl2) verdünnt und 1 h bei RT im Dunkeln inkubiert.

Abschließend ist mit PBS-Puffer (pH 7,4 + 1 mM MgCl2) gewaschen und mit Moviol

eingedeckelt worden. Die Lagerung der Schnitte erfolgte bei 4°C. Ferner wurde zur

Verifizierung proximaler Tubuli auch 10 µg/ml biotinyliertes Lektin verwendet. In diesem Fall

muss eine sekundäre Markierung mittels Extravidin (Sigma-Aldrich, St. Luis, USA)

hinzukommen. Die beiden Moleküle Avidin und Biotin haben eine sehr hohe Bindungsaffinität

und eignen sich daher besonders gut als histochemisches Nachweissystem. Biotinmarkierte

Lektine lassen sich durch eine Inkubation (1 h) bei RT (dunkel) mit Avidin-Molekülen sichtbar

machen, wenn letztere mit einem Fluoreszenzfarbstoff konjugiert sind. Nach dreimaligem

Waschen in PBS-Puffer (pH 7,4 +1 mM MgCl2) wurde mit Moviol eingedeckelt.

2.4.4.2 Anti-Cre-Rekombinase-Markierung Um die Cre-Rekombinase auf den Gefrierschnitten zu detektieren, wurde mit dem

polyklonalen Anti-Cre-Antikörper (Novagen, Madison, USA) markiert. Es erfolgte zunächst

eine Aceton-Fixierung für 10 min bei -20°C mit anschließender Lufttrocknung (5 min).

Alternativ konnte auch mit Methanol fixiert werden. Die Blockierung wurde für 30 min bei RT

mit PBD-Puffer durchgeführt. Der polyklonale Kaninchen Anti-Cre-Antikörper wurde 1:1000

in PBS-Puffer verdünnt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Anschließend ist 3x für 5 min in

PBS-Puffer pH 7,4 gewaschen worden. Das Abgießen muss sehr vorsichtig erfolgen, um die

Gewebepräparate nicht zu beschädigen. Der sekundäre Antikörper wurde in PBD-Puffer


37

verdünnt (1:100) und für 1 h im Dunkeln auf das Gefrierpräparat aufgetragen. Es folgten 3

Waschschritte mit PBS-Puffer pH 7,4 je 5 min. Abschließend wurden die markierten

Gefrierschnitte mit Moviol eingedeckelt und bei -20°C gelagert.

2.4.5 Auswertung der histochemischen Präparate Für die Auswertung der Präparate wurde ein „ZEISS Axioskop 2 plus“-Mikroskop (Carl Zeiss,

Jena) mit dem Filtersatz 23 (DBP485/20 und DBP 546/12) für kombinierte Visualisierung der

Fluoreszenz-Farbstoffe verwendet. Zum besseren Verständnis der Nierenanatomie wird in

Abbildung 2.5 A ein Sagittalschnitt der Niere dargestellt. Die Niere gliedert sich in drei

Abschnitte auf: Nierenbecken (Pelvis renalis), Nierenmark (Medulla renalis) und Nierenrinde

(Cortex renalis). Von der Nierenrinde reichen kegelförmige Markpyramiden (Pyramides

renales) durch die Nierenmarksubstanz bis hin zum Nierenbecken. Die Nierenrinde liegt

unter der gesamten Oberfläche, dringt aber in den Bertin´schen Säulen (Columnae renales)

zwischen den Markpyramiden (Pyramides renales) bis an die Nierenbucht (Sinus renalis)

vor. Die Nieren bestehen aus etwa einer Million Nephronen. Nephrone sind strukturelle und

funktionelle Einheiten der Niere und bestehen aus dem Nierenkörperchen (Glomerulus) und

den Nierenkanälchen (renale Tubuli), welche im Sammelrohr münden. Die renalen Tubuli

sind dünne Kanälchen mit einem einschichtigen Epithel; hier erfolgt die Rückresorption aber

auch die Sekretion von bestimmten Stoffen. Der epitheliale Tubulusapparat besteht aus

einem gewundenem Teil, dem proximalen Tubulus, einem geraden Abschnitt der in das

Nierenmark absteigt (Pars recta), einer haarnadelförmigen Schleife (Henlesche Schleife),

einem gerade aufsteigendem Abschnitt und einem zweiten gewundenen Teil - dem distalen

Tubulus - der in der Nähe des zugehörigen Nierenkörperchens liegt (Abbildung 2.5 B).


38

(A)

(B)

Abbildung 2.5: Niere/Nephron (A): Schematische Darstellung einer Niere (Sagittalschnitt). (B): Illustrierung eines Nephrons. Die Pfeile zeigen die Richtung des Flüssigkeitsstroms an.

Nierenpyramiden (Pyramides renales)

Nierenbecken (Pelvis renalis)

Harnleiter (Ureter)

Nierenkapsel (Capsula fibrosa)

Nierenrinde (Cortex renalis)

Nierenkelch (Calix renalis)

Nierenpapillen (Papillae renales)

Bertin´schen Säulen (Columnae renales)

Unterer Nierenpol (Extremitas inferior)

Oberer Nierenpol (Extremitas superior)

Nierenmark (Medulla renalis)

pT dT Hs Sr tW Bo Gl zA aA

proximaler Tubulus distaler Tubulus Henlesche Schleife Sammelrohr Tubuluswand Bowmansche Kapsel Glomerulum zuführende Arterie abführende Arterie

pT dT

Hs

Sr

Bo

Gl

zA aA

tW


39

2.5 Sicherheitsbestimmungen Alle gentechnischen Arbeiten wurden gemäß dem Gentechnikgesetz vom 22. März 2004

durchgeführt. Die Anmeldung der Arbeiten erfolgte gemäß § 8 Abs. 1 und § 11 des

Gentechnikgesetzes. Die Arbeiten wurden gemäß der Sicherheitsstufen und

Sicherheitsmaßnahmen (§ 7 Abs. 1 Gentechnikgesetz) durchgeführt.

2.6 Verwendete Materialien Alle benutzten Chemikalien wurden im analytischen Reinheitsgrad von folgenden Firmen

bezogen: Amersham Buchler (Freiburg, D), Biozym (Hess. Oldendorf, D), Fluka AG (Buchs,

CH), Hartmann Analytics (Braunschweig, D), Invitrogen (Karlsruhe), MERCK (Darmstadt, D),

Pharmacia LKB (Freiburg, D), SERVA Feinbiochemica (Heidelberg, D) und Sigma-Aldrich

(St. Louis, USA).

2.6.1 Plasmide Tabelle 2.9: Plasmide. Die zugehörigen Plasmidkarten sind im Anhang dargestellt.

Name Große (kb) Herkunft

pSL300/PgkNeoL 4,9 Dr. Dr. B. Skryabin, ZMBE, Münster

pHD2-Cre1 4,5 Dr. C. Kellendonk, DKFZ, Heidelberg

pGGT-PFU-1 4,5 diese Arbeit

pGGT-CRE 7,2 diese Arbeit

pUHDrtTA2S-M2 4,2 Prof. Dr. W. Paulus, Institut für Neuropathologie, Münster

pGGT-RTTA 3,8 diese Arbeit

pBI-3 7,7 BD Biosciences Clontech, Heidelberg

pBI-3-H3 7,7 diese Arbeit

pBI-CRE-lacZ 9,7 diese Arbeit

2.6.2 Sonde

Abbildung 2.6: Sonde S1. BglII/EcoRI-DNA-Fragment (1129 bp) aus dem Vektor pHD2. Die schwarze Box stellt die NLS-Sequenz dar; der graue Pfeil den zweiten offenen Leserahmen der P1-Cre-Rekombinase. Die DNA-Sequenz ist dem Anhang zu entnehmen.

NLS-Cre-Rekombinase

BglII-1 EcoRI-1129 bp


40

2.6.3 Oligonukleotide Tabelle 2.10: Primer

Primer Sequenz 5´-3´

GGT-SalI-5402-F CGT GCG TCG ACT CTA AGC TAT GGT CTA GTG CCT GGG GC

GGT-BglII-5403-R GCT GCA GAT CTG CAA GAG GTC AGC TAA GGG GTG CC

pBI-3-AR-5494 GGC AAC AAT TAA TAG ACT GGA TGG AGG CG

pBI-3BF-H3-5495 GAC TGC ATT AAT GAA GCT TCC AAC GCG

pBI-3-BR-5496 CGG CAA CAA TTA ATA GAC TGG ATG GAG GCG

5470-GGT-IN-F GTG ACG TCA GCG TTG ACC ATC CTC C

5523-Cre-R2 CGA TGA GTT GCT TCA AAA ATC CCT TCC

Cre-3-F GGT TCG TTC ACT CAT GGA AAA

Cre-3-R GCA TGA TCT CCG GTA TTG AAA

5470-GGT-IN-F 5526-RTTA-R1

GTG ACG TCA GCG TTG ACC ATC CTC C GCG ATG TGA GAG GAG AGC ACA GCG

5525-RTTA-F1 5528-RTTA-R2


5526-RTTA-F2 GCG ATG TGA GAG GAG AGC ACA GCG

5525-RTTA-F1 5528-RTTA-R2


5573-lacZ-F 5574-lacZ-R

CTG CGT TGG AGT GAC GGC AGT TAT C GTA GTG TGA CGC GAT CGG CAT AAC C

2.6.4 Organismen Tabelle 2.11: Mausstämme

Name Genetik Stamm S Herkunft

GGT-CRE 346 bp-großer-muriner Promotor der Gamma-Glutamyl-Transpeptidase Typ II; NLS, Cre-Rekombinase, SV40-polyA

FVB/N S1 Diese Arbeit

Z/APTg(ACTB-Bgeo/ALPP)1Lbe Bestand-Nr.: 003919

Prom. Actb, Aktin, Huhn; PLAP; Bgeo ES R1,

129/CD1 S1 Lobe et al., 1999 Charles River, Sulzfeld

B6,129S-Gtrosa26tm1Sor Bestand-Nr.: 003309

gene trap ROSA 26; Bgeo; lacZ; ES AK7 (129S4/SvJaeSor)

AK7/129 S1 Soriano, 1999 Charles River, Sulzfeld

FVB/NHanHsd Albino, Apoa-1b, Car-2 b, Es-1 b, Es-2 b, Es-3c, Fv-1 b, Gpd-1 b, Gpi-1 b, Hbbd, Idh-1a, Mod-1a, Mup-1a, Pep-3 b, Pgm-1a, Pgm-2a, Trfb

FVB/N Wt Harlan, Horst Niederlande


41

Tabelle 2.12: E. coli-Bakterienstamm

Stamm Genotyp Referenz

TOP10 F-, mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), Δ80 lacZ Δ M15, ΔlacX74, deoR, recA1, araD139, Δ(ara-leu)7697, galU, galK, rpsL, endA1, nupG

Invitrogen, Karlsruhe

2.6.5 Antikörper Tabelle 2.13: Antikörper

Antikörper Markierung Firma

Polyklonaler Anti-Cre-Antikörper

- Novagen, Madison, USA

Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) sekundärer Antikörper

RRX Jackson ImmunoResearch, West Grove, USA

Goat Anti-Rabbit IgH (H+L) sekundärer Antikörper

CyTM2 Jackson ImmunoResearch West Grove, USA

Lektin-PHA-E (Phaseolus vulgaris-Erythroagglutinin)

TRITC Sigma-Aldrich, St. Luis, USA

Lektin-PHA-E (Phaseolus vulgaris-Erythroagglutinin)

Biotin Vector Laboratories, Burlingame, USA

Extravidin FITC Sigma-Aldrich, St. Luis, USA


42

2.6.6 Puffer

Ampicillin Stammlösung 100 mg/ml in Aqua dest. AP-Puffer 10 mM MgCl2 100 mM Tris-HCl pH 9,5 100 mM NaCl 0,01% Natrium-Deoxycholat 0,02% NP-40 In PBS-Puffer

Betain Stammlösung 5 M Betain in Aqua dest. Lagern bei -20°C

Denaturierungslösung, 0,5 M NaOH 1,5 M NaCl

dNTPs 5 mM dATP 100 mM 5 mM dCTP 100 mM 5 mM dGTP 100 mM 5 mM dTTP 100 mM In Aqua dest. Eosin-Lösung 0,1% Aqua dest.

Ethidiumbromid-Lösung

1 µl 1 ml

Ethidiumbromid-Stammlösung Aqua dest

Ethidiumbromid-Stammlösung 5 mg Ethidiumbromid/ml Aqua dest

Gelladepuffer 6 g Saccharose (60% Saccharose (w/v)) 0,3% Bromphenol-Blau 0,3% Xylen-Cyanol ad 10 ml Aqua dest. Glutaraldehyd-Fixierungslösung 2% Glutaraldehyde (50%) 0,01% Natrium-Deoxycholat 0,02% IGAEPAL-CA630 1 mM MgCl2 in PBS-Puffer pH 8.0


43

Hybridisierungspuffer 2-6x SSC (20x) 0,1-0,5% SDS (20%) 200 ng/µl Herings-Sperma-DNA 5x Denhardts (50x) IPTG-Stammlösung 100 mM IPTG in Aqua dest.

LB -Medium (LB: Low salt) 1,0% Trypton 0,5% Hefe-Extrakt

0,5% NaCl pH 7,0 Lysispuffer 10 mM Tris, pH 8 10 mM EDTA 10 mM NaCl 0.6% SDS Mowiol 2,4 g Mowiol 4-88 (Hoechst, Frankfurt/Main) 6 g Glycerol, bei 50°C ca. 1 h lösen 12 ml 200 mM Tris-HCl Bei 50°C ca. 3 h lösen 5 min/2500 rpm zentrifugieren Überstand abnehmen

Neutralisierungslösung 0.5 M Tris Southern-Transfer 1.5 M NaCl pH 7 mit HCl konz. Paraformaldehyd (PFA)-Lösung 4% (w/v) PFA 1x PBS-Puffer 1 mM MgCl2 pH 7,4

PBD-Puffer 1x PBS-Puffer 10% Eselserum pH 7,4 PBS-Puffer (10x) 1,37 M NaCl 0,027M KCl 0,080M Na2PO4 0,020M Na2PO4


44

PCR-Puffer (10x) 500 mM KCl 100 mM Tris 15,0 mM MgCl2 0,1% Gelatine 1,0% Triton X

Prähybridisierungspuffer 2-6x SSC (20x) 0,1-0,5% SDS (20%) 200 ng/µl Herings-Sperma-DNA 5x Denhardts (50x) Aqua dest. SDS-Puffer 20% 20 g Natriumdodecylsulfat (SDS) ad 100 ml Aqua dest.

SOC-Medium 2,0% Trypton 0,5% Hefe-Extrakt 10 mM NaCl 2,5 mM KCl 10 mM MgCl2 x 6H2O 20 mM Glucose

SSC (20x) 3 M NaCl 0,3 M Natriumcitrat pH 7 mit HCl

TBE-Puffer (10x) 1 M Tris-Borat 20 mM EDTA pH 8,3 TEP-Puffer (10x) 218 g Tris 20,07 g NaH2PO4-H2O 18,6 g EDTA

TE-Puffer 10 mM Tris 1 mM EDTA pH 7,6 TENS-Puffer 1 10 ml TE-Puffer (1x) 0,1 M NaOH 0,5% w/v SDS


45

TENS-Puffer 2 3 M Kaliumacetat pH 4,8 Waschlösung 1 2x SSC 0,1% SDS; RT

Waschlösung 2 0,1x SSC 0,5% SDS; 60-68°C

X-Gal-Stammlösung 40 mg/ml X-Gal in DMF lösen lagern bei -20°C X-Gal-Färbelösung 0,01% Natrium-Deoxycholat 0,02% 0,02% IGAEPAL-CA630 1mM MgCl2 2mM K3Fe(CN)6 2mM K4Fe(CN) 6 1mg/ml X-Gal-Stammlösung in PBS-Puffer pH 8.0


46

2.7 Geräte

DNA Thermal Cycler Biometra T3-Thermocycler Biometra Filmentwickler Kodak, RPX-OMat Prozessor Gelelektrophorese-Kammer Pharmacia LKB GNA 100

Pharmacia LKB GNA 200 Gelphotographie Polaroid MP-4 Land Camera Heizblöcke Eppendorf Thermostat 5320

Stuart Test Tube Heater Inkubator, Schüttler Edmund Buhler, Laborgerätebau, Glastechnik,

Umwelttechnik, SM 5 Kamera RICO XR/X 3000D, SLR Kamera Kaltlicht-Leuchte Leica Kühlzentrifugen Sorvall® RC-5B Refrigerated Superspeed Centrifuge

Rotoren: Sorvall SS-34, Sorvall SH-MT Mikroskop Axioskop, Zeiss Mikrotom Mikrotom-Kryostat HM 500 OM, MICROM Netzgeräte Pharmacia GPS 200/400

Pharmacia EPS 3500 pH-Meter Knick, ph-mV-Meter Photometer Genequant, Pharmacia Schüttler New Brunswick Scientific, Edison, N.J., U.S.A.

Biodancer Stereolupe Leica MZ 12 Sterilbank Heraeus Herasafe Tischzentrifugen

Heraeus Sepatech Biofuge A Heraeus Sepatech Biofuge 13 Heraeus Labofuge I;

UV-Lampe BACHOFER 302 nm; Vilbert Lourenat Waagen Sartorius Type 1801

Sartorius L2200S Zentrifugen BECKMAN CS-15R Centrifuge, Rotoren: F2402,

F0630, S1480


47

2.8 Bezugsfirmen

Altromin Lage, Deutschland Amersham Biosciences Braunschweig, Deutschland Applied Biosystems Darmstadt, Deutschland BD Biosciences Clontech Heidelberg, Deutschland Bio-Rad Laboratories München, Deutschland Biometra Göttingen, Deutschland Biozym Diagnostik Hessisch Oldendorf, Deutschland Boehringer Ingelheim Ingelheim am Rhein, Deutschland Carl Zeiss Jena, Deutschland Charles River Sulzfeld, Deutschland Chroma Köngen, Deutschland Dianova Hamburg, Deutschland Epicentre Technologies Madison, USA Eppendorf Hamburg, Deutschland Fermentas St. Leon-Rot, Deutschland Fluka Chemie Buchs Schweiz Greiner Solingen, Deutschland Heraeus Düsseldorf, Deutschland Hoechst Frankfurt am Main, Deutschland Interactiva Ulm, Deutschland Invitrogen Karlsruhe, Deutschland Jackson ImmunoResearch West Grove, USA Kodak Stuttgart, Deutschland Nalgene-Nunc Wiesbaden, Deutschland New England Biolabs Frankfurt am Main, Deutschland Merck Darmstadt, Deutschland Microm International Walldorf, Deutschland MWG Biotech Ebersberg, Deutschland Novagen Madison, USA Pharmacia Amersham Freiburg, Deutschland Promega GmbH Mannheim, Deutschland Qiagen Hilden, Deutschland Research Genetics, Inc. Huntsville, AL, USA Roche Diagnostics Mannheim, Deutschland Roche Applied Science Mannheim, Deutschland R.Langenbrinck Emmendingen, Deutschland Schleicher& Schuell Dassel, Deutschland SERVA Electrophoresis Heidelberg, Deutschland SIGMA-ALDRICH St. Louis, USA Slee Technik GmbH Mainz, Deutschland Stratagene La Jolla CA, USA USB Corporation Cleveland Ohio,USA Vector Laboratories Burlinghame, USA Whatman Biometra Göttingen, Deutschland

ERGEBNISSE

48

3 Ergebnisse

3.1 Promotor-Recherche Um den geeigneten Promotor für die Generierung einer gewebespezifisch Cre-Rekombinase

exprimierenden Maus zu finden, erfolgte eine intensive Literatur-Recherche. Dabei richtete

sich das Augenmerk auf Promotoren mit einer spezifischen Aktivität in der Niere,

insbesondere in den renalen Tubuluszellen. Das Expressionsprofil des idealen Promotors

sollte - außer in murinen Zelllinien - auch in transgenen Tieren mittels stromabwärts

klonierter Reportergene getestet sein. Unter den Reportergenen waren sowohl lacZ aus E.

coli als auch GFP aus der Qualle Aequorea victoria (Prasher, 1995) beschrieben. Darüber

hinaus konnte außer einem Reportergen auch c-DNA unter der Kontrolle des zu

untersuchenden Promotors vorhanden sein. Anschließende Untersuchungen sollten mittels

Nothern-blots, in situ Hybridisierungen oder immunhistochemischen Untersuchungen durch

geeignete Antikörper erfolgt sein. Im Rahmen dieser Recherche ist eine entsprechende

Auswahl von geeigneten Promotoren in Tabelle 3.1 aufgelistet worden. Dieser Liste können

die zugehörigen Gene der Promotoren und die Literaturquellen entnommen werden. Ferner

wird die Promotor-Länge und das stromabwärts klonierte Reportergen bzw. die c-DNA,

sowie das Expressionsprofil des Transgens aufgeführt. Nach genauer Abwägung von Größe,

Spezifität und Voruntersuchungen der ausgewählten Promotoren ist die Entscheidung auf

den 346 bp-großen-Minimalpromotor der murinen Gamma-Glutamyl-Transpeptidase Typ II

(GGT-Promotor) gefallen. Wichtige Kriterien sind seine geringe Größe und die eingehenden

Promotoranalysen in transgenen lacZ-exprimierenden Mäusen (Sepulveda et al., 1997). Eine

detaillierte Erläuterung dieser Entscheidung wird im Diskussionsteil aufgeführt.

ERGEBNISSE

49

Tabelle 3.1: Gewebespezifische Promotoren mit Schwerpunkt Nierenexpression. Expression von Reportergenen bzw. c-DNA in transgenen Tieren.

Promotor Länge Expression von/in Literatur

h REN 149 bp hREN/renale juxtaglomeruläre Zellen Hobart et al., 1984; Sinn et al., 1999a; 1999b; Fuchs et al., 2002

m Ksp-Cadherin 324 bp GFP/tubuläre Epithelzellen adulter Nieren; renale Tubuli, dicker aufsteigender Schenkel der Henleschen-Schleife

Whyte et al., 1999; Shao et al., 2002a; 2002b

m GGT 346 bp lacZ/pT-Zellen Rajagopalan et al., 1993; Sepulveda et al.,1997

m Tie-2 1,2 kb lacZ/Gefäßendothelzellen Sato et al., 1993; Korhonen et al,1995; Schlaeger et al., 1995; 1997

m Nphs1 1,25 kb lacZ/renale Podozyten Moeller et al., 2000; 2002

h PAI-1 1,27 kb lacZ/pT-Zellen Basile et al., 1997; Emert et al., 1998; Kruithof & Cousin,1988; Strandberg et al., 1988

m BMP7 end. 1,28 kb

lacZ/ embryonal: Ureterknospe; Mesenchym adult: Sammelrohr, distale Tubuli, dicker aufsteigender Ast der Henleschen-Schleife, Podozyten

Godin et al., 1998; Gould et al., 2002 ; Simon et al., 2002;

h KAP 1,5 kb humanes Angiotensinogen (HAGT)/ Epithelzellen proximaler Tubuli

Niu et al., 1991; Ding et al., 1997; Hardy et al., 2001

m DARPP-32 2,1 kb lacZ/ dicker aufsteigender Schenkel der Henleschen-Schleife

Blau et al., 1995

h NPHS2 2,5 kb lacZ/renale Podozyten Moeller et al., 2002

hun BGT1 2,4 kb CAT/renale Medulla Kaneko et al., 1997

r THP 3,0 kb GFP/dicker aufsteigender Schenkel der Henleschen-Schleife

Yu et al., 1994; Zhu et al., 2002

ERGEBNISSE

50


m Ksp-Cadherin 3,3 kb lacZ/tubuläre Epithelzellen adulter Nieren, renale Tubuli, dicker aufsteigender Schenkel der Henleschen-Schleife ab E14,5

Igarashi et al., 1999; Whyte et al., 1999

m LAMB1 3,9 kb lacZ/embryonale Nieren, adulte Tubuli im Nierenmark/-rinde, Ovarien, Testis

Okano et al., 1992; Sharif et al., 2001

r Uromodulin 3,9 kb lacZ/tubuläre Epithelzellen der Henleschen-Schleife

Kim et al., 2003

m Nphs1 5,4 kb 8,3 kb

lacZ/viszerale Epithelzellen des Glomerulus (Podozyten), Gehirn, Pankreas

Moeller et al.,2000; Putaala et al., 2001

m Epo 6,5 kb lacZ/pT-Zellen, Leber McDonald et al., 1986; Loya et al., 1994; Haidar et al., 1997

h Alpha 1AT 7,0 kb humanes Alpha 1AT/Leber, Niere, Makrophagen

Long et al., 1984; Ruther et al., 1987 ; Sifers et al., 1987

m TESK1 9,0 kb lacZ/testikuläre Keimzellen, pT-Zellen Herzmuskelzellen, Nervenzellen

Toshima et al., 1998; 2001

m AQP2 9,5 kb GFP/renale Tubuli, Sammelrohr, Testes, Samenleiter

Nelson et al., 1997; Zharkikh et al., 2002

m Angiopoietin-2 end. n.b.

lacZ/embryonale Niere, renale Medulla, Glomeruli

Yuan et al., 2000

REN = Renin; Ksp-Cadherin = nierenspezifisches Cadherin; GGT = Gamma-Glutamyl-Transpeptidase Typ II; Tie-2 = Rezeptor-Tyrosinkinase 2; Nphs1 = Nephrin; PAI-1 = Plasminogen Aktivator Inhibitor I; BMP7 = Knochen-Morphogenetisches Protein; KAP = Nieren Androgen-reguliertes-Protein; DARPP-32 = Dopamin- und Adenosin 3',5'- cAMP-regulierter Inhibitor der Protein phosphatase-1; NPHS2 = Podocin; BGT1 = Betain-Transporter; THP = Tamm-Horsfall Protein; LAMB1 = Laminin B1; Epo = Erythropoietin; Alpha 1AT = Alpha 1-Antitrypsin; TESK1 = testikuläre Proteinkinase1; AQP2 = Aquaporin-2; pT-Zellen = proximale Tubuluszellen; end. = endogen; h = human; m = murin; r = Rinder; hun = Hund

ERGEBNISSE

51

3.2 Klonierung der Zielvektoren In dieser Arbeit wurden die Zielvektoren pGGT-CRE, pGGT-RTTA und pBI-CRE-lacZ

kloniert. Zum besseren Verständnis werden in den folgenden Abschnitten 3.2.1 bis 3.2.3 die

jeweiligen Klonierungsschritte anschaulich dargestellt.

3.2.1 Klonierung des Vektors pGGT-CRE Zur Erstellung des Zielvektors pGGT-CRE wurden folgende funktionelle Elemente benötigt:

1. 346 bp-Minimalpromotor Typ II der murinen Gamma-Glutamyl-Transpeptidase (GGT)

(Sepulveda et al., 1997)

2. Kernlokalisationssignal (NLS, Kalderon et al., 1984) vom SV40 large T Antigen

3. kodierender Bereich der P1-Cre-Rekombinase (Sternberg et al., 1986)

4. SV40-polyA Region (Fiers et al., 1978)

5. Ampicillin-Resistenz (ampR)

Beim Zielvektor pGGT-CRE steht der kodierende Bereich der P1-Cre-Rekombinase unter

der Kontrolle des gewebespezifischen GGT-Miniminalpromotors. Wobei die vorgeschaltene

NLS-Sequenz zur Translokation der Cre-Rekombinase in den Nukleus dienen soll. Im 3´-

Bereich wurde die SV40-polyA Region einkloniert, um einen Transkriptionsstillstand der

RNA-Polymerase sicherzustellen. Im folgenden Verlauf werden die einzelnen

Klonierungsschritte für den Zielvektor pGGT-CRE bis zur Isolierung des Transgens GGT-

CRE dargestellt. In der Tabelle 3.2 sind alle verwendeten Plasmide bzw. genomischen DNA-

Fragmente für die in vitro-Konstruktion des Vektors pGGT-CRE mit den zugehörigen

funktionellen Kassetten aufgelistet.

Tabelle 3.2: Verwendete Plasmide bzw. genomische DNA-Fragmente zur Klonierung des Zielvektors pGGT-CRE. Plasmid/DNA-Bezeichnung funktionelle Kassette

amplifizierte murine genomische DNA GGT-Promotor

pHD2-Cre1 NLS

Cre-Rekombinase

SV40-polyA

pSL300/PgkNeoL ampR

ERGEBNISSE

52

3.2.1.1 Klonierung des Vektors pGGT-PFU-1 - Genomische PCR - Ein 424 bp großes DNA-Fragment mit anteilig 346 bp des GGT-Promotors Typ II (Abbildung

3.1) wurde aus der genomischen murinen DNA amplifiziert. Die PCR-Reaktion fand unter

Verwendung der Oligonukleotide 5402/5403 (unterstrichen) und der pfu-DNA-Polymerase

(Stratagene) statt.

SalI -346

1 GTCGACTCTA AGCTATGGTC TAGTGCCTGG GGCTACCCCT ACTTTATTGC 51 CTCAGGAACA TTTTTGAGGA CATCATGTCT GTCTCTAAAT TCACAGAGGG 101 ACTTAGCAGG GGCTGTCTGG AAGGGTTCAC CGGTGGCCTC TGCCCCTTAG 151 AGGGAACCAA ATCTGGAAAG TGGGGGAGCC CCTTTCCCAG GCTCTTAGTA 201 CCTCCCTCCT CCCCCGCCCA GAGCCCTCCT GGGGCTGCAT GAACTTTAGT 251 CACCTGGTCA CAAGCCTGAC GCTGCGCCTC CTTGCGGCTG TGACGTCAGC 301 GTTGACCATC CTCCCAGCCT ATCTGAACCT CTTACAGAGG ACTCCCTACC +1 351 TCACACCCCA CTCAGAAGCC TTCAGATGCC CTTCTGGGAT GCTGGGCACC BglII 401 CCTTAGCTGA CCTCTTGCAG ATCT

Abbildung 3.1: 424 bp-DNA-Sequenz mit dem GGT-Minimalpromotor. Die Sequenz stellt die 346-bp-Promotorregion des murinen GGT Typ II dar (eingerahmt). Die Restriktionsschnittstellen sind grau hervorgehoben und die Primersequenzen (5402/5403) sind unterstrichen. +1 zeigt den Transkriptionsstartpunkt an (Sepulveda et al., 1994). Die vorliegende genomische Sequenz von 412 bp (gelb hervorgehoben) ist kongruent mit der Genbank Accession Nr.: NT_039496.4 nt 1354210 -1354621 (NCBI) von Mus musculus Chromosom 10.

Mit den Oligonukleotiden GGT-SalI-5402-F und GGT-BglII-5403-R (Tabelle 3.3) wurde am

5´-Ende des Amplifikats eine SalI-Schnittstelle und am 3´-Ende eine BglII-Schnittstelle

eingeführt.

Tabelle 3.3: Oligonukleotide mit eingeführten Restriktionsschnittstellen. Die Primer 5402/5403 wurden in der genomischen PCR zur Amplifikation des murinen GGT-Promotors eingesetzt. Die Restriktionsenzyms-Erkennungssequenzen sind grau unterlegt (R: reverse; F: forward).

Primer-Name Oligonukleotid-Sequenz 5´- 3´

GGT-SalI-5402-F 5´- CGT GCG TCG ACT CTA AGC TAT GGT CTA GTG CCT GGG GC - 3´

GGT-BglII- 5403-R 5´- GCT GCA GAT CTG CAA GAG GTC AGC TAA GGG GTG CC -3´

ERGEBNISSE

53

Das SalI/BglII restringierte PCR-Produkt ist anschließend in den gleich verdauten Vektor

pHD2-Cre1 einkloniert worden. Beide Restriktionsprodukte sind gelelektrophoretisch

aufgetragen und können der Abbildung 3.2 entnommen werden. Durch diese Klonierung

wurde die NLS-Cre-Rekombinase des Vektors pHD2-Cre1 unter der Kontrolle des murinen

GGT-Promotors gestellt. Dabei ist der endogene Promotor HSV-TK entfernt worden. Dieser

Austausch der Promotoren ist schematisch in der Abbildung 3.3 wiedergegeben. Der neu

entstandene Vektor wurde als pGGT-PFU-1 bezeichnet.

M1 1 2 3 4 5 M2

Abbildung 3.2: Gelelektrophoretische Auftrennung von pHD2-Cre1 (pC) und dem GGT-Promotor. 1: pC/SalI: 4,5 kb; 2: pC/SalI/BglII: 4 kb + 411 bp; 3-5: Genomische PCR mit den Oligonukleotiden GGT-SalI-5402 und GGT-BglII-5403-R. 424 bp-PCR-Produkt mit den GGT-Promotor-Typ II. M1: GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder (Fermentas); M2: 100 bp-DNA-Ladder (Invitrogen)

pHD2-Cre1/SalI/BglII (4 kb)

GGT-Promotor-Typ II(424 bp)

ERGEBNISSE

54

Abbildung 3.3: Schematische Darstellung der Klonierung des Vektors pGGT-PFU-1. Der Vektor pHD2-Cre1 wurde mit SalI/BglII restringiert und das entstandene ca. 4 kb große DNA-Fragment mit dem 418 bp-SalI/BglII-PCR-Produkt (GGT-Promotor Typ II) ligiert. Die roten Pfeile stellen die Primer 5402/5403 dar und der Transkriptionsstartpunkt ist mit einem schwarzen Pfeil verdeutlicht. pA: SV40-polyA. Zur Verdeutlichung werden nur die Inserts mit den funktionellen Kassetten (SalI/NotI-Fragmente) der Vektoren pHD2-Cre1 und pGGT-PFU-1 dargestellt.

Entfernen der HSV-TK (411 bp)

pA

pA

SalI BglII

GGT X SalI/BglII Ligation mit PCR-Produkt

pGGT-PFU-1

pHD2-Cre1

ERGEBNISSE

55

3.2.1.2 Umklonierung des Vektors pGGT-PFU-1 Das 2,4 kb große DNA-Fragment aus pGGT-PFU-1 mit den funktionellen Einheiten GGT,

NLS, Cre und SV40-polyA wurde unter Verwendung der Restriktionsschnittstellen SalI/KpnI

in der MCS des Vektors pSL300/PgkNeoL umkloniert (Abbildung 3.4).

Abbildung 3.4: Schematische Darstellung der Klonierung des Zielvektors pGGT-CRE. Umklonierung des isolierten 2406 bp-SalI/KpnI -Fragments aus pGGT-PFU-1 in pSL300/PgkNeoL unter Verwendung der SalI/KpnI-Schnittstellen der MCS. Der generierte Zielvektor pGGT-CRE ist in Abbildung 3.6 dargestellt.

X SalI/KpnI Ligation

pGGT-PFU-1 4,5 kb

ERGEBNISSE

56

3.2.1.3 Isolierung des GGT-CRE-Transgens aus dem Zielvektor Für die nachfolgende Mikroinjektion wurde aus dem Zielvektor pGGT-CRE, unter

Verwendung der SalI/KpnI-Schnittstellen, das 2,4 kb-große Transgen GGT-CRE isoliert. Zur

Charakterisierung des Zielvektors wurde pGGT-CRE vollständig sequenziert und die DNA-

Sequenz kann dem Anhang entnommen werden. Des Weiteren sind Restriktionskontrollen

durchgeführt worden (Abbildung 3.5). Die Abbildung 3.6 stellt anschaulich die Isolierung des

GGT-CRE dar.

M1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M2

Abbildung 3.5 (A): Restriktionskontrolle des Konstruktes pGGT-CRE (pG). 1: pG/SalI/KpnI 2430 bp + 4744 bp; 2: pG/SalI 7174 bp; 3: pG/KpnI 7174 bp; 4: pG/EcoRV 1460 bp + 5714 bp; 5: pG/HincII 300 bp + 1964 bp + 4910 bp; 6: pG/HpaI 7174 bp; 7: pG/EcoNI 7174 bp; 8: pG/SspI 3597 bp + 551 bp + 153 bp + 1942 bp + 800 bp + 131 bp; 9: pG/CvnI 7174 bp; 10: pGGT-PFU-1/CvnI 4,7 kb; 11: pSL300/pGKNeoL/CvnI 4901 bp; 12: pGGT-CRE unverdaut; M1: GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder (Fermentas); M2: 100 bp-DNA-Ladder (Invitrogen).

A

Transgen GGT-CRE (2,4 kb)

ERGEBNISSE

57

X SalI/KpnI Mikroinjektion

Abbildung 3.6: Isolierung des 2,4 kb-SalI/KpnI-Transgens GGT-CRE aus dem Zielvektor pGGT-CRE. NLS-CRE steht unter der Kontrolle des murinen GGT-Minimalpromotors (346 bp). Der Transkriptionsstartpunkt ist mit einem Pfeil verdeutlicht. Stromabwärts liegt die SV40polyA-Region (pA) vor. Das 2,4 kb große Transgen GGT-CRE ist im Rahmen dieser Arbeit zu Verifizierung des Amplifikats und der angeschlossenen Klonierungen komplett sequenziert worden und ist dem Anhang zu entnehmen.

pA

2,4 kb

pGGT-CRE 7174 bp

GGT-CRE-Transgen 2,4 kb

ERGEBNISSE

58

3.2.2 Klonierung des Vektors pGGT-RTTA Für eine zeitliche und gewebespezifische kontrollierte Genexpression beim tTA-System

(Gossen et al., 1995) sind wie eingangs schon erwähnt zwei genetische Elemente

erforderlich: Ein Doxycyclin-abhängiger Transkriptionsaktivator (rtTA), welcher unter

Kontrolle des gewebespezifischen Promotors steht und ein Tet Operator (tetO). Aus diesem

Grund sind in dieser Arbeit zwei weitere Vektoren konstruiert worden: pGGT-RTTA und pBI-

CRE-lacZ. Durch die Kombination beider genetischer Elemente wird eine, durch Doxycyclin

beeinflussbare, konstitutive Expression der Cre-Rekombinase ermöglicht.

Für die Konstruktion des Vektors pGGT-RTTA sind folgende funktionelle Einheiten

verwendet worden:

1. 346 bp-GGT-Minimalpromotor

2. kodierende Region des Transkriptionsaktivators rtTA2S-M2

3. SV40-polyA Region

4. Ampicillin-Resistenz (ampR)

Der Vektor pGGT-RTTA enthält als funktionelle Einheit die kodierende Region des

Transkriptionsaktivators rtTA2S-M2. Es handelt sich hierbei um einer modifizierten Version

vom rtTA mit höherer Stabilität in eukaryotischen Zellen, größerer Sensitivität gegenüber

Doxycyclin und reduzierter Hintergrundaktivität bei dessen Abwesenheit (Urlinger et al.,

2000). Der modifizierte Transkriptionsaktivator rtTA2S-M2 wurde unter die Kontrolle des

GGT-Minimalpromotors gestellt. Im 3´- Bereich schließt das Transgen mit einer SV40- polyA

Region ab. Tabelle 3.4 listet die benötigten Plasmide bzw. DNA-Fragmente und deren

funktionellen Einheiten zur Erstellung des Vektors pGGT-RTTA auf.

Tabelle 3.4: Verwendete Plasmide und genomische DNA-Fragmente zur Klonierung des Zielvektors pGGT-CRE

Plasmid/DNA-Bezeichnung funktionelle Kassette

amplifizierte murine genomische DNA GGT-Promotor

pUHDrtTA2S-M2 rtTA2S-M2

SV40-polyA

ampR

ERGEBNISSE

59

3.2.2.1 Amplifikation des GGT-Promotors Aus muriner genomischer DNA wurde ein 424 bp-großes-PCR-Produkt mit anteilig 346 bp

des GGT-Promotors Typ II amplifiziert und gelelektrophoretisch aufgetragen (Abbildung

3.8 B). Die eingesetzten Primer GGT-XhoI-5442-F und GGT-EcoRI-5443-R werden in der

Tabelle 3.5 dargestellt. Daraus ergeben sich die Restriktionsschnittstellen XhoI/EcoRI,

welche den GGT Promotor Typ II flankieren.

Tabelle 3.5: Oligonukleotide GGT-XhoI-5442-F und GGT-EcoRI-5443-R mit internen Restriktionsschnittstellen zur Amplifikation des murinen GGT-Promotors. Die Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen sind grau hervorgehoben; (R: reverse; F: forward).


GGT-XhoI-5442-F 5´- CGT GCC TCG AGT CTA AGC TAT GGT CTA GTG CCT GGG GC - 3´

GGT-EcoRI-5443-R 5´- GCT GCG AAT TCG CAA GAG GTC AGC TAA GGG GTG CC -3´

Nach Isolation aus dem Agarosegel wurde das PCR-Produkt unter Verwendung der neu

generierten Restriktionsschnittstellen XhoI/EcoRI geschnitten. Anschließend erfolgte eine

Ligation mit dem gleich restringierten pUHDrtTA2S-M2-Fragment (3433 bp). Aus dieser

Klonierung resultierte der Zielvektors pGGT-RTTA (Abbildung 3.7), wo der endogene

Promotor hCMV durch den GGT-Promotor Typ II ausgetauscht wurde. Somit stand die Cre-

Rekombinase beim Zielvektor pGGT-RTTA unter der Kontrolle vom Doxycyclin-abhängigen

Transkriptionsaktivator rtTA2S-M2.

ERGEBNISSE

60

X XhoI/EcoRI Ligation

Abbildung 3.7: Klonierung des GGT-Promotors in pUHDrtTA2S-M2. Nach Restriktion des Vektors unter Verwendung der Schnittstellen XhoI/EcoRI wird phCMV verworfen und mit dem XhoI/EcoRI-PCR-Produkt (418 bp) ligiert. Es resultiert nach Transformation des Ligationsansatzes der Zielvektor pGGT-RTTA (3851 bp).

Entfernen des phCMV

XhoI EcoRI

GGT

pGGT-RTTA 3851 bp

pUHDrtTA2S-M2 4198 bp

ERGEBNISSE

61

Vor der Ligation wurde der Vektor pUHDrtTA2S-M2 mittels Restriktionsverdau (siehe

Abbildung 3.8 A) und Resequenzierung kontrolliert.

M1 1 2 3 4 5 6 M2

Abbildung 3.8: (A): Restriktionskontrolle des Vektors pUHDrtTA2S-M2 (pUH). 1: pUH/XhoI/HindIII 2,21 kb + 1,98 kb; 2: pUH/XhoI/EcoRI 3,43 kb + 0,76 kb; 3: pUH/EcoRI/HindIII 2,97 kb + 1,22 kb; 4: pUH/SmaI/EcoRI 3,44 kb + 0,74 kb; (B): Murine genomische PCR. Es wurden die Oligonukleotide GGT-XhoI-5442-F und GGT-EcoRI-5443-R eingesetzt. Daraus resultiert ein 424 bp-PCR-Produkt mit den GGT-Promotor-Typ II (Spur 5). 6: Wasserkontrolle mit den Primern GGT-XhoI-5442-F und GGT-EcoRI-5443-R. M1: GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder (Fermentas); M2: 100 bp-DNA-Ladder (Invitrogen)

3.2.2.2 Isolierung des GGT-RTTA-Transgens aus dem Zielvektor Unter Verwendung der Restriktionsendonukleasen XhoI und HindIII konnte das 1646 bp

große Transgen GGT-RTTA aus dem Vektorrückrat des pGGT-RTTA isoliert werden

(Abbildung 3.9). In der Abbildung 3.10 ist die Isolierung des Transgens schematisch

dargestellt.

M1 1 M2

Abbildung 3.9: Restriktionskontrolle des GGT-RTTA (GT). 1: GT/XhoI/HindIII 2,2 kb + 1,6 kb; M1: GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder (Fermentas); M2: 100 bp-DNA-Ladder (Invitrogen)

Transgen

GGT-RTTA (1,6 kb)

A B

ERGEBNISSE

62

Abbildung 3.10: Isolierung des 1,6 kb XhoI/HindIII-Transgens aus dem Zielvektor pGGT-RTTA. Die kodierende Sequenz für den Transkriptionsaktivator rtTA2S-M2 steht unter der Kontrolle des murinen GGT-Minimalpromotors. Der Transkriptionsstartpunkt ist mit einem Pfeil verdeutlicht. Stromabwärts liegt die SV40-polyA-Region (pA) vor. Das 1,6 kb große Transgen GGT-RTTA ist im Rahmen dieser Arbeit zu Verifizierung des Amplifikats und der angeschlossenen Klonierungen komplett sequenziert worden.

pA

X XhoI/HindIII Mikroinjektion

1,6 kb

pGGT-RTTA 3851 bp

GGT-RTTA-Transgen 1,6 kb

ERGEBNISSE

63

3.2.3 Klonierung des Vektors pBI-CRE-lacZ Zur Klonierung des Vektors pBI-CRE-lacZ wurden folgende funktionelle Einheiten verwendet:

1. bidirektioneller Promotor Pbi-1 (Baron et al., 1995)

2. sieben tet-Operatorsequenzen (tetO)

3. NLS-lacZ

4. NLS-P1-Cre-Rekombinase

5. SV40-polyA

6. Kaninchen β-Globin-Intron/polyA (Lanford et al., 1988)

7. ampR

Nach entsprechender Modifizierung des kommerziellen Vektors pBI-3 (BD Biosciences

Clontech, Heidelberg) wurde die kodierende Region der Cre-Rekombinase mit einer

vorgeschaltenen NLS-Sequenz einkloniert. Der Vektor pBI-3 weist als wichtiges funktionelles

Element den bidirektionellen Promotor Pbi-1 auf (Baron et al., 1995). Diese Konstellation

ermöglicht die gleichzeitige äquimolare Expression eines Reportergens (z.B. lacZ) und eines

zweiten Gens, hier in dieser Arbeit die Cre-Rekombinase. Die bidirektionelle Aktivierung des

Reportergens und der Cre-Rekombinase erlaubt sehr einfach die Kontrolle der

vorgenommenen Transfektion. Dadurch ist es möglich, dass z.B. In einem transgenen Tier

neben der leicht nachweisbaren β-Galaktosidase auch die Cre-Rekombinase exprimiert wird.

Die eigentliche Induzierbarkeit der Genexpression resultiert aber aus den vorliegenden tet

Operator-Sequenzen (tetO). Erst durch die Anbindung eines Doxycyclin-aktiviertes rtTA-

Proteins erfolgt die gleichzeitige Transkription beider klonierten Gene. Die

Klonierungsstrategie des Vektors pBI-CRE-lacZ und die anschließende Transgen-Isolierung

(BI-CRE-lacZ) werden in den folgenden Abschnitten (3.2.3.1-3.2.3.3) erörtert. In der Tabelle

3.6 sind die Plasmide für die in vitro-Konstruktion des Zielvektors pBI-CRE-lacZ aufgelistet

worden.

Tabelle 3.6: Verwendete Plasmide zur Klonierung des Zielvektors pBI-CRE-lacZ

Plasmid-Bezeichnung funktionelle Kassette

pBI-3 Pbi-1 tetO NLS-lacZ

β-Globin-polyA ampR

pHD2-Cre1 NLS-Cre-Rekombinase

SV40-polyA

ERGEBNISSE

64

3.2.3.1 Einführung einer HindIII-Schnitttstelle in pBI-3 an Position nt 5188 Die Generierung einer singulären HindIII-Restriktionsschnittstelle im Vektor pBI-3 (Clontech)

an Position nt 5188 war erforderlich, um das Transgen am 3´-Ende des b-Globin-polyA-

Bereichs isolieren zu können. Mittels PCR und der Primer 5494 und 5495 (Tabelle 3.7)

wurde eine HindIII-Schnittstelle eingeführt. Als DNA-Matrize diente der Ausgangsvektor pBI-

3, wobei ein 1235 bp AseI-Fragment amplifiziert wurde.

Tabelle 3.7: Oligonukleotide zur Einführung einer HindIII-Schnittstelle in pBI-3 an Position nt 5188. Die HindIII-Erkennungssequenz ist eingerahmt. Grau hervorgehoben sind die endogenen AseI-Restriktionsschnittstellen (R: reverse; F: forward).


pBI-3-AR-5494 5´- GGC AAC AAT TAA TAG ACT GGA TGG AGG CG-3´

pBI-3BF-H3-5495 5´- GAC TGC ATT AAT GAA GCT TCC AAC GCG-3´

Die Einführung der zusätzlichen HindIII-Erkennungssequenz im AseI-Fragment des Vektors

pBI-3, erfolgte durch den Primer pBI-3BF-H3-5495 (Tabelle 3.7). Dieses Fragment wurde

anschließend in korrekter Orientierung mit dem AseI-pBI-3-Fragment (6,4 kb) kloniert

(Abbildung 3.13). Daraus resultierte der so benannte Vektor pBI-3-H3 (7,7 kb). Das

Klonierungsergebnis wurde mittels Restriktionskontrolle (Abbildung 3.11) und

Resequenzierung verifiziert.

M 1 2 3 4

Abbildung 3.11: Restriktionskontrolle von pBI-3-H3 (pBI-H). 1: pBI-H /HindIII/PstI 5,2 kb + 2,5 kb 2: pBI-H /HindIII/PstI 5,2 kb + 2,5 kb 3: pBI-H/HindIII linearisiert 4: pBI-H/HindIII linearisiert. M: GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder (Fermentas)

3.2.3.2 Klonierung des Vektors pBI-3-H3 Um das NLS-Cre-Rekombinase-Gen mit der SV40-polyA-Region unter der Kontrolle des

tetO abhängigen Minimalpromotors vom Pbi-1 zu setzen, wurde über die endogenen

Schnittstellen PstI und NotI aus pHD2-Cre-1 geschnitten und im Vektor pBI-3-H3 über

7,7 kb-pBI-3-H3

ERGEBNISSE

65

PstI/NotI kloniert. Aus dieser Klonierungsstrategie entstand der Zielvektor pBI-CRE-lacZ

(9,6 kb). Abbildung 3.14 stellt die Klonierung schematisch dar.

3.2.3.3 Isolierung des Transgens BI-CRE-lacZ aus dem Zielvektor Die Entfernung des Vektorrückrats zur Erlangung des 7,16 kb große Transgens BI-CRE-lacZ

erfolgte unter Verwendung der endogenen NotI- und der neu generierten HindIII-

Schnittstelle. In Abbildung 3.12 ist die gelelektrophoretische Auftrennung des Transgens und

des Vektorrückrats dargestellt und die Isolierung in Abbildung 3.15 schematisch

wiedergegeben. Das Transgen BI-CRE-lacZ ist im Rahmen dieser Arbeit komplett

resequenziert worden.

M 1

Abbildung 3.12: Restriktionsverdau des Vektors pBI-CRE-lacZ. 1: pBI-CRE-lacZ/NotI/HindIII 7,16 kb (Transgen BI-CRE-lacZ) + 2,5 kb (Vektorrückrat) M: GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder (Fermentas)

7,16 kb BI-CRE-lacZ

2,5 kb Vektorrückrat

ERGEBNISSE

66

X AseI Ligation des 1235 bp AseI-Fragment mit neu generierter HindIII-Schnittstelle Entfernung des endogenen AseI-Fragments

Abbildung 3.13: Klonierung einer HindIII-Schnittstelle in pBI-3 bei Position nt 5188. Restriktion von pBI-3 mit AseI; Entfernen des AseI-Fragments (1235 bp); Ligation mit 1235 bp großen AseI-PCR-Produkt (neu eingeführte HindIII-Schnittstelle mittels Primer 5495). Nach Transformation des Ligationsansatzes entsteht der Vektor pBI-3-H3 mit neu generierter HindIII-Schnittstelle an Position nt 5188.

Entfernen des AseI-Fragments (1235 bp)

pBI-3-H3 7,7 kb

ERGEBNISSE

67

X PstI/NotI Ligation

Abbildung 3.14: Klonierung der NLS-Cre-polyA-Kassette in pBI-3-H3. Das NLS-Cre-Rekombinase-Gen mit der stromabwärts liegenden SV40-polyA-Region wurde unter der Kontrolle des tetO abhängigen Minimalpromotors vom Pbi-1 gestellt. Diese Klonierung erfolgte über Restriktion mittels der endogenen Schnittstellen PstI und NotI aus pHD2-Cre-1 in den Vektor PstI/NotI/pBI-3-H3.

pA

pBI-3-H3 7,7 kb

PstI/NotI/pHD2-Cre1 2312 bp

ERGEBNISSE

68

Abbildung 3.15: Isolierung des Transgens BI-CRE-lacZ aus dem Zielvektor. Die Entfernung des Vektorrückrats aus pBI-CRE-lacZ erfolgte unter Verwendung der endogenen NotI- und der neu generierten HindIII-Schnittstelle. Es resultiert das 7,16 kb große Transgen BI-CRE-lacZ.

X NotI/HindIII

BI-CRE-lacZ Transgen 7,16 kb

pBI-CRE-lacZ 9,7 kb

ERGEBNISSE

69

3.3 Generierung transgener Tiere Nach der Injektion des Transgens GGT-CRE in fertilisierte FVB/N-Oocyten (2.3.1) wurden

drei Männchen und zwei Weibchen geboren und nach der Injektion des Transgens GGT-

RTTA zwei Männchen und drei Weibchen. In den Tabellen 3.8 und 3.9 sind diese

Ergebnisse dargestellt.

Tabelle 3.8: Nachkommen aus der Pronukleusinjektion des Transgens GGT-CRE

Injektion des Name Geschlecht Geburtsdatum

GGT-CRE G1 m 14.11.2000 GGT-CRE G2 m 14.11.2000 GGT-CRE G3 m 14.11.2000 GGT-CRE G4 f 14.11.2000 GGT-CRE G5 f 14.11.2000

Tabelle 3.9: Nachkommen aus der Pronukleusinjektion des Transgens GGT-RTTA

Injektion des Name Geschlecht Geburtsdatum

GGT-RTTA T1 m 02.12.2000

GGT-RTTA T2 m 02.12.2000

GGT-RTTA T3 f 02.12.2000

GGT-RTTA T4 f 02.12.2000

GGT-RTTA T5 f 02.12.2000

ERGEBNISSE

70

3.4 Identifizierung möglicher transgener Mauslinien

3.4.1 PCR-Genotypisierung Zum Nachweis der Trangene GGT-CRE und GGT-RTTA im murinen Genom (2.3.2) wurden

spezifische PCR-Formate entwickelt. In Abbildung 3.16 ist die Lage der Primer (Tabelle 2.7)

auf den Transgenen GGT-CRE und GGT-RTTA schematisch wiedergegeben.

Abbildung 3.16: Position der Genotypisierungs-Primer. (A) GGT-CRE; (B) GGT-RTTA. Die Lage der Primer wurde farbig hervorgehoben und dessen Orientierung mit einem kleinen schwarzen Pfeil angedeutet. Das Amplifikat ist als schwarzer Balken mit seiner zugehörigen Größe dargestellt.

994 bp

500 bp

pA

420 bp

578 bp

pA

GGT-CRE-Transgen 2412 bp

GGT-RTTA-Transgen 1646 bp

(A)

(B)

ERGEBNISSE

71

Nach der PCR (2.2.11) zur Genotypisierung potentieller GGT-CRE-transgener Tiere wurden

die resultierenden Amplifikate gelektrophoretisch aufgetrennt (2.2.7). Die Ergebnisse können

der Abbildung 3.17 entnommen werden. Als Kontrolle zur Spezifität der verwendeten PCR-

Primer wurde auch genomische DNA aus nicht transgenen FVB/N Mäusen amplifiziert (WT).

Die Zielvektoren pGGT-CRE bzw. pGGT-RTTA dienten als Positivkontrollen. Eine distinkte

PCR-Bande in Höhe von 994 bp ist nur beim Weibchen G5 zu erkennen. Bei den

Geschwistern G1, G2, G3 und G4 konnte kein Transgen nachgewiesen werden. Wie

erwartet liegt nach Amplifikation der genomischen DNA vom Wildtyp (WT) keine Bande vor.

Anders bei der vektoriellen DNA, wo eine sehr starke Bande zu erkennen ist. Das Transgen

GGT-RTTA konnte bei den Nachkommen T1-T5 trotz mehrmaliger PCR-Ansätze nicht

nachgewiesen werden.

Genomische PCR; Primer 5470-GGT-IN-F/5523-Cre-R2

M1 G1 G2 G3 G4 G5 Wt V M2

Abbildung 3.17: Genomische PCR unter Verwendung der Primer 5470-GGT-IN-F/5523-Cre-R2. G1-G5: Genomische DNA aus G1-G5; Wt: Genomische DNA aus FVB/N-Mäusen; V: pGGT-CRE; M1: GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder (Fermentas); M2: 100 bp-DNA-Ladder (Invitrogen); Der Pfeil zeigt auf das ca. 0,9 kb große PCR-Produkt.

ca. 0.9 kb

ERGEBNISSE

72

3.4.2 Southern-Analysen

Um die PCR-Resultate der Genotypisierung von GGT-CRE zu verifizieren erfolgte ein

genomischer Southern-Blot mit der Sonde S1 (2.6.2). Dabei handelt es sich um ein 1,1 kb

großes BglII/EcoRI-Fragment isoliert aus dem Zielvektor pGGT-CRE (Abbildung 3.18).

Innerhalb dieses Fragmentes liegt der gesamte kodierende Bereich der Cre-Rekombinase.

Nach radioaktiver Markierung mit dem Isotop 32P wurde die Sonde S1 für die Hybridisierung

der mit dem Restriktionsenzym HincII verdauten genomischen DNA eingesetzt. Die genaue

Position der Sonde S1 im Transgen GGT-CRE zeigt die Abbildung 3.19 auf.

M 1

Abbildung 3.18: Restriktion des Vektors pGGT-CRE (pGC) zur Isolation der Sonde S1. 1: pGC/BglII/EcoRI: 3117 bp + 2486 bp + 1129 bp (S1) + 442 bp M: GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder (Fermentas)

Abbildung 3.19: Schematische Darstellung der Sonden-Position (S1) im GGT-CRE.

1129 bp Sonde S1

Sonde S1 (1129 bp)

1964 bp-HincII-Fragment

GGT-CRE-Transgen 2,4 kb

ERGEBNISSE

73

Für den Southern-Transfer wurde außer HincII-restringierter genomische DNA aus G1 bis

G5 auch HincII-restringierte DNA einer FVB/N-Maus (WT) zur Kontrolle aufgetragen. Nach

der Hybridisierung mit der S1-Sonde ist ein Hybridisierungssignal bei G5 auf der Höhe von

ca.1,9 kb deutlich zu erkennen. Dies bestätigt somit das PCR-Resultat für die G5-Maus. Das

Radiogramm ist in Abbildung 3.20 dargestellt.

Genomische Southern-Analyse; Sonde S1 WT G1 G2 G3 G4 G5

Abbildung 3.20: Southern-Analyse unter Verwendung der Sonde S1. WT: HincII-restringierte genomische DNA aus FVB/N-Mäusen G1-G5: HincII-restringierte genomische DNA aus G1-G5. Das Hybridisierungssignal wird mit einem Pfeil markiert.

ca. 1,9 kb

ERGEBNISSE

74

3.5 Generierung stabiler Linien Das Weibchen G5 wurde sowohl mit FVB/N Männchen als auch mit den Reportermäusen

ROSA26- bzw. Z/AP-Mäusen (2.3.4) verpaart. Für die Genotypisierung der F1-Generation

wurden sowohl PCR- als auch genomische Southern-Analysen durchgeführt. In der

Abbildung 3.21 sind die Ergebnisse der Genotypisierung für folgende Nachkommen

dargestellt: G16, G17, G22, G25, G26, G27 und GR13. Bei den Mäusen G16-G27 handelt es

sich um Nachkommen aus Kreuzungen mit FVB/N-Mäusen. GR13 resultierte aus der

Verpaarung von G5 mit einer ROSA26-Reportermaus. Es konnte sowohl durch PCR- als

auch durch Southern-Blot-Analysen das Transgen GGT-CRE bei den Nachkommen

nachgewiesen werden. Somit zeigte sich, dass das Weibchen G5 sein Transgen GGT-CRE

an die Nachkommen weitergeben kann. Abbildung 3.21 stellt parallel zum PCR-Resultat das

Hybridisierungsergebnis dar.

G5 G16 G17 G25 G27 M

G5 GR13 G17 G22 G26

Abbildung 3.21: Ergebnisse der genomischen PCR und der Southern-Analysen A: Genomische PCR unter Verwendung der Primer Cre-3-F/Cre-3-R. Der Pfeil zeigt auf das 0,5 kb große PCR-Produkt B: Southern-Transfer-Analyse der GGT-CRE-Mäuse zur Verifizierung der PCR Resultate. Der Nachweis erfolgte nach Restriktion der DNA mit HincII und Hybridisierung mit der Sonde S1. Das Hybridisierungssignal wird mit einem Pfeil markiert. M: GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder (Fermentas)

ca. 0,5 kb

ca. 1,9 kb

(A) Genomische PCR; Primer Cre-3-F/Cre-3-R

(B) Genomische Southern-Analyse; Sonde S1

ERGEBNISSE

75

3.6 Das Expressionsprofil des murinen GGT-Promotors Die transgene Maus G5 trägt das DNA-Konstrukt GGT-CRE (Abbildung 3.6), welches eine

346 bp-große Region des murinen GGT-Promotors (Sepulveda et al., 1997) enthält.

Stromabwärts liegt unter dessen Kontrolle der kodierende Bereich der P1-Cre-Rekombinase

mit vorgeschaltenen Kern-Lokalisations-Signal (NLS). Dieses Signal führt zur Translokation

des Cre-Proteins vom Cytoplasma in den Nukleus. Es ist insofern von signifikanter

Bedeutung, da es sich bei der Cre-Rekombinase um ein DNA-Bindeprotein handelt. Die

gewebespezifische Expression als auch die enzymatische Rekombinationsaktivität des Cre-

Proteins wurde experimentell nachgewiesen. Zu diesem Zweck erfolgte die

Charakterisierung der Cre-vermittelten Rekombination in Reportermauslinien. Das zeitliche

und örtliche Expressionsmuster der Cre-Rekombinase, sowie ihre katalytische Aktivität

wurde sowohl mittels Z/AP- (Lobe et al., 1999) als auch mittels ROSA26 -Reportermäusen

(Soriano, 1999) aufgezeigt. Zur besseren Übersicht ist das Paarungsschema der Etablierung

und der Analyse doppeltransgener GGT-CRE+/ZAP+- und GGT-CRE+/ROSA26+-Mäuse

sehr anschaulich in der Abbildung 2.2 dargestellt.

3.6.1 Untersuchungen der Cre-Expression mittels Z/AP-Reportermäuse Im folgenden Abschnitt werden die Ergebnisse der Cre-Rekombinase-Expression bei adulten

GGT-CRE-Mäusen durch Verpaarung mit der Z/AP-Reportermauslinie vorgestellt.

3.6.1.1 Verpaarung der GGT-CRE-Mäuse mit Z/AP-Reportermäuse Die Untersuchung des Expressionsprofils der Cre-Rekombinase, wie auch ihre katalytischen

Aktivität in vivo erfolgte zunächst mit der Z/AP-Reportermaus. Diese Z/AP-Mauslinie (Lobe et

al., 1999) exprimiert lacZ konstitutiv und annähernd ubiquitär unter Kontrolle des CAGG

Promotors (Niwa et al.; 1991). Dabei liegt die Expression sowohl embryonal als auch adult

weit verbreitet vor. Das lacZ-Reportergen wird von loxP-Erkennungssequenzen flankiert und

kann somit durch die katalytische Aktivität der Cre-Rekombinase deletiert werden. Ferner

liegen im 3´-Bereich drei polyA-Signale vor (Zinyk et al., 1998), damit eine unbeabsichtigte

Transkription des weiter stromabwärts gelegenen Gens der humanen plazentalen

alkalischen Phosphatase (hPLAP; DePrimo et al., 1996; Millan, 1986) unterbleibt. Eine von

der Cre-Rekombinase erfolgreich vermittelte Rekombination kann somit histochemisch

nachgewiesen werden. Unrekombinierte Zellen und Gewebe sind lacZ-positiv.

Rekombinierte Bereiche sind hingegen β-Galactosidase-negativ. Sie exprimieren hPLAP,

welches ebenfalls durch histochemische Methoden detektiert werden kann. Zum Nachweis

der Cre-Rekombinase-Expression sind GGT-CRE- mit Z/AP-Reportermäusen verpaart

worden. In der Abbildung 3.22 wird zum besseren Verständnis der Cre/loxP-

ERGEBNISSE

76

Rekombinationsmechanismus dargestellt, vermittelt durch das Z/AP- und das GGT-CRE-

Transgen.

Cre

GGT NLS Cre-Rekombinase polyA-SV40

lacZ pA hPLAPCAGG CAGG hPLAP

Cre



Cre



Abbildung 3.22: Cre/loxP-Rekombinationsmechanismus des Z/AP-Allels vermittelt vom GGT-CRE. (A) Beim Konstrukt GGT-CRE wird die Cre-Rekombinase-Expression durch den murinen GGT-Minimalpromotor vermittelt. (B) Nach Anlagerung des Cre-Proteins an die loxP-Erkennungssequenzen (rote Dreiecke) wird die lacZ-Kassette deletiert. Die Transkription des stromabwärts liegenden hPLAP-Gens wird dadurch ermöglicht. Bei Abwesenheit von Cre kann hPLAP nicht transkribiert werden.

(A) GGT-CRE

(B) Z/AP

ERGEBNISSE

77

3.6.1.2 Charakterisierung der doppeltransgenen GGT-CRE+/Z/AP+-Mäuse Nach Verpaarung von heterozygoten Z/AP- mit heterozygoten GGT-CRE-Mäusen wurde

zunächst der Genotyp bestimmt. Die Genotypisierung für das Z/AP-Allel erfolgte mittels einer

spezifischen lacZ-PCR unter Verwendung der Primer 5573-lacZ-F/5574-lacZ-R (Tabelle 2.7).

Dabei wurde ein PCR-Produkt der Größe 310 bp amplifiziert. Das Transgen GGT-CRE

wurde - wie bereits im Abschnitt 3.4.1 beschrieben - sowohl durch PCR unter Verwendung

der Primer Cre-3-F/Cre-3-R bzw. 5470-GGT-IN-F/5523-Cre-R2, als auch mittels Southern-

Blot-Analysen (Sonde S1) nachgewiesen. Nach der Genotypisierung sind doppeltransgene

GGT-CRE+/Z/AP+-Mäuse und zur Kontrolle GGT-CRE-/Z/AP+-Mäuse experimentell

charakterisiert worden. Um das Expressionsprofil des GGT-Promotors und die katalytische

Aktivität des Cre-Enzyms bei adulten GGT-CRE+/Z/AP+-Mauslinien zu analysieren, wurden

zunächst Gefrierschnitte von GGT-CRE+/Z/AP+ - und als Kontrolle von GGT-CRE-/Z/AP+-

Mäusen erstellt. Zum Nachweis des hitzestabilen hPLAP-Proteins erfolgten

enzymhistochemische Färbungen, durch Zugabe eines chromogenen Substrats der

alkalischen Phosphatase (AP; 2.4.2.2).

3.6.1.3 Cre-Expression in adulten GGT-CRE-Mäusen Die hPLAP-Detektion bei den Doppeltransgenen ist nur in den Zellen möglich, in denen eine

Cre/loxP-Rekombination stattgefunden hat. Bei einer vorliegenden hPLAP-Expression

kommt es nach Zugabe des chromogenen AP-Substrates zu einer Blaufärbung. Das Z/AP-

Allel vermittelt im unrekombinierten Fall keine ungewünschte Expression der hitzestabilen

hPLAP, weshalb eine Blaufärbung unterbleibt. Nach Zugabe des AP-Substrates konnte,

außer bei den Nieren, bei keinem weiteren entnommenen Organ (Gehirn, Leber, Milz,

Lunge, Herz, Pankreas, Haut, Muskelgewebe, Ovar/Testis) eine Blaufärbung festgestellt

werden (Abbildungen nicht gezeigt). Abbildung 3.23 zeigt die AP-Färbung von

Gefrierschnitten einer Niere, welche aus einem 6 Wochen alten GGT-CRE+/Z/AP+-Weibchen

stammen. Bei der mikroskopischen Darstellung des Gefrierschnittes (Abbildung 3.23 A: 2,5x)

ist eine Blaufärbung an der äußeren Nierenregion deutlich zu erkennen. Die AP-Färbung

erstreckt sich von der Nierenrinde bis hin zum Außenstreifen der Nierenmarkregion. In

diesem Abschnitt, vor allem im Rindengewebe der Niere liegt das Hauptstück des

proximalen Tubulus als proximales Konvolut (Pars convoluta) vor. Bei 40-facher

Vergrößerung des Nieren-Kortex sind die blau gefärbten proximalen Tubuluszellen

lichtmikroskopisch zu erkennen (Abbildung 3.23 B: 40x). Die Abbildungen 3.2.3 D und E

stellen Gefrierpräparate aus GGT-CRE-/Z/AP+ Kontrollnieren dar. Beim Fehlen der Cre-

Rekombinase Aktivität kann keine alkalische Phosphatase Färbung beobachtet werden.

ERGEBNISSE

78

Abbildung 3.23: hPLAP-Expression in adulten GGT-CRE/Z/AP-Mäusen. (A) Nach AP-Färbung von Nieren-Gefrierschnitten (2,5x) einer adulten GGT-CRE+/Z/AP+-Maus (6 Wochen) zeigt sich eine intensive bläuliche Färbung im Bereich des renalen Kortex bis zur äußeren Medulla. (B) 40-fache Vergrößerung des Nieren-Gefrierschnittes nach AP-Färbung einer adulten GGT-CRE+/Z/AP+-Maus (6 Wochen) zur besseren Darstellung der blaugefärbten proximalen Tubuluszellen (pT). (C) AP-Färbungen von Nieren-Gefrierschnitten (2,5x) aus einer GGT-CRE-/Z/AP+-Maus. Im gesamten Nierenbereich liegt keine Blau-Färbung vor. (D) 40-fache Vergrößerung der GGT-CRE-/Z/AP+ Kontrollniere (6 Wochen) nach AP-Färbung.

Niere GGT-CRE+/Z/AP+ (2,5x) Niere GGT-CRE+/Z/AP+ (40x)

pT

A B

D

Kontrollniere GGT-CRE-/Z/AP+ (1,25x) Kontrollniere GGT-CRE-/Z/AP+ (40x)

DC D

ERGEBNISSE

79

3.6.2 Untersuchungen der Cre-Expression mittels ROSA26-Reportermäuse Im folgenden Abschnitt werden die Ergebnisse der Cre-Rekombinase-Expression vorgestellt,

nach Verpaarung der GGT-CRE-Mäuse mit der ROSA26-Reportermauslinie. Folgende

Stadien werden erläutert: E12,5; E14,5; E15,5; E17,5; neugeboren und adult.

3.6.2.1 Verpaarung der GGT-CRE-Mäuse mit ROSA26-Reportermäuse ROSA26-Reportermäuse wurden mit den in dieser Arbeit generierten transgenen GGT-CRE-

Mäusen verpaart (2.3.4.2). Beim Reporterstamm ROSA26 (Soriano, 1999) liegt eine gefloxte

Neomycinkassette mit einer vierfachen polyA-Sequenz und das stromabwärts gelegene

Reportergen lacZ vor. Erst durch die Anbindung des Cre-Proteins an die loxP-

Erkennungssequenzen kann diese Terminationskassette entfernt und folgerichtig eine lacZ-

Expression initiiert werden. Demzufolge liegt bei diesen ROSA26-Reportermäusen eine lacZ-

Expression nur in den Zellen vor, in denen die Cre-Rekombinase katalytisch aktiv ist. Bei

Abwesenheit des Cre-Enzyms unterbleibt die Transkription des lacZ-Gens, wodurch nach

enzymhistochemischen Färbereaktionen eine Unterscheidung zwischen Cre-exprimierenden

und nicht-exprimierenden Zellen ermöglicht wird. Mittels dieser Unterscheidung kann das

Expressionsprofil des murinen GGT-Minimalpromotors durch Kreuzung der GGT-CRE- mit

ROSA26-Mauslinien charakterisiert werden.

3.6.2.2 Charakterisierung der GGT-CRE+/ROSA26+-Mauslinien Homozygote und heterozygote ROSA26-Mäuse können, anders als bei den Z/AP-

Reportermäusen, durch PCR-Analysen unterschieden werden. Bei der PCR-Genotypisierung

des ROSA26-Allels wurde für die Amplifikation des mutanten Allels die Primer 5588/5589

(250 bp Amplifikat) und für das Wildtyp-Allel das Oligonukleotidpaar 5588 und 5590 (500 bp

Amplifikat) verwendet (Tabelle 2.7).

Zur Generierung doppeltransgener GGT-CRE+/ROSA26+-Mäuse sind demzufolge

homozygote ROSA26+- mit heterozygoten GGT-CRE+/--Mäusen verpaart worden. Ziel dieser

Analysen war es das Expressionsprofil des GGT-Promotors und die Rekombinationsfähigkeit

der stromabwärts gelegenen Cre-Rekombinase, sowohl in den embryonalen als auch in den

adulten murinen Stadien zu analysieren. Bei den GGT-CRE+/ROSA26+-Tieren kann die

Aktivität der Cre-Rekombinase durch das Vorliegen des lacZ-Reportergens

enzymhistochemisch visualisiert werden. In den speziellen Zellen, wo das Cre-Enzym

exprimiert wird, findet eine enzymatische Rekombination an den loxP-Stellen statt und die

gefloxte Terminationskassette wird folglich deletiert. Es erfolgt die Transkription des

stromabwärts gelegenen lacZ-Gens. Falls die Rekombination durch die Abwesenheit des

Cre-Enzyms unterbleibt behindert die Terminationskassette das Ablesen des Reportergens

ERGEBNISSE

80

und folglich die Erzeugung des Genproduktes. Dieser katalytische Mechanismus beim

ROSA26-Konstrukt vermittelt durch die Cre-Rekombinase des GGT-CRE-Transgens ist in

Abbildung 3.24 dargestellt. Die Charakterisierung der Cre-Rekombinase-Expression erfolgte

mittels X-Gal-Färbung von Gefrierschnitten.

Rosa26Rosa26

Cre


SA PGK neo 4xpA lacZ pA SA lacZ pARosa26Rosa26

Cre



Cre



Cre


SA PGK neo 4xpA lacZ pA SA lacZ pA

Abbildung 3.24: Cre/loxP-Rekombinationsmechanismus des ROSA26-Allels vermittelt vom GGT-CRE. (A) Nach Aktivierung des Cre-Gens durch den GGT-Promotor wird das Cre-Enzym exprimiert. (B) Die Cre-Rekombinase katalysiert die Rekombination zwischen zwei loxP-Erkennungsstellen, wodurch die intragenische DNA-Sequenz - Neomycinkassette mit einer vierfachen polyA-Sequenz - deletiert wird. Erst durch die Entfernung dieser gefloxten Terminationskassette wird die Transkription des stromabwärts klonierten Reportergens lacZ, welches für das Enzym β-Galaktosidase kodiert, ermöglicht. Die Rekombinationsfähigkeit der vorliegenden Cre-Rekombinase lässt sich durch die Anwesenheit der β-Galaktosidase nachweisen.

(A) GGT-CRE

(B) ROSA26

ERGEBNISSE

81

3.6.2.3 Cre-Rekombinase-Expression zum Zeitpunkt E14,5 Aus der lacZ-Expression im murinen Gewebe lässt sich die Rekombinationsfähigkeit der

Cre-Rekombinase ableiten. Der früheste untersuchte Zeitpunkt der lacZ-Expression durch X-

Gal-Färbungen in doppeltransgenen GGT-CRE+/ROSA26+-Embryonen ist E12,5. Bis zum

embryonalen Stadium E14,5 konnte keine lacZ-Expression nachgewiesen werden, was als

Indiz für die Abwesenheit der Cre-Rekombinase gilt. Folglich ist der GGT-Minimalpromotor in

dieser Embryonalphase noch nicht aktiviert. Abbildung 3.25 A stellt einen parasagittalen

Gefrierschnitt eines doppeltransgenen Embryos zum Zeitpunkt E14,5 nach der X-Gal-

Färbung dar. In keinem der Gewebe stellt sich eine Blaufärbung ein. In der Abbildung 3.25 B

ist zur detaillierten Verdeutlichung der Metanephros des Embryos vergrößert abgebildet.

GGT-CRE+/ROSA26+-Mausembryo GGT-CRE+/ROSA26+-Metanephros

Abbildung 3.25: LacZ-Expression in doppeltransgenen GGT-CRE+/ROSA26+-Mausembryonen (E14,5). A Parasagittaler Gefrierschnitt (1,25x) durch einen GGT-CRE+/ROSA26+-Embryo (E14,5) nach einer X-Gal-Färbung. In diesem murinen Entwicklungsstadium ist keine lacZ-Expression zu beobachten. B Zur Verdeutlichung eine 40-fache Vergrößerung der Embryonen-Niere (Metanephros) bei E14,5. he = Herz; hi = Gehirn; le = Leber; lu = Lunge; ma = Magen; me = Metanephros; wi = Wirbelsäule

A B

Le

me

hi

ma

wi

lu he

me

ERGEBNISSE

82

3.6.2.4 Cre-Rekombinase-Expression zum Zeitpunkt E15,5 Nach der X-Gal-Färbung von Gefrierschnitten eines GGT-CRE+/ROSA26+-Mausembryos

konnte erstmalig zum Zeitpunkt E15,5 eine leichte Blaufärbung in der embryonalen Niere

(Metanephros) und dem Darm beobachtet werden. Im Darm liegende Bakterien weisen

endogene β-Galaktosidasen auf, welche das X-Gal mit hydrolisieren. Kein weiteres

embryonales Gewebe weist eine lacZ-Expression auf. In der Abbildung 3.26 sind

Gefrierschnitte sowohl aus Cre-/ROSA26+-Kontrollembryonen (Abbildung A-D), als auch aus

doppeltransgenen GGT-CRE+/ROSA26+-Mausembryonen (Abbildung E-F) in

unterschiedlichen mikroskopischen Vergrößerungen dokumentiert worden. Bei den

Kontrollembryonen lässt sich eine Blaufärbung nach der X-Gal-Färbung nur im Darm

visualisieren. Kein weiteres Gewebe konnte angefärbt werden. In den Abbildungen 3.26 B, C

und D sind Gefrierschnitte embryonaler Nieren ohne nachweisbare lacZ-Expression zu

sehen. Zur besseren mikroskopischen Visualisierung ist in Abbildung 3.26 D eine

Kontrollniere vergrößert (10x) dargestellt. Verglichen mit den Kontrollembryonen weisen

doppeltransgene GGT-CRE+/ROSA26+-Embryonen vereinzelte leichte Blaufärbungen in der

äußeren renalen Medulla-Region auf (Abbildungen 3.26 E-F). Schwarze Pfeile zeigen auf die

β-Galaktosidase-exprimierenden blau gefärbten renale Regionen. Dieses Ergebnis steht für

eine anfängliche gewebespezifische Cre/loxP-Rekombination eines enzymatisch aktiven

Cre-Rekombinase-Proteins. Ab dem embryonalen Zeitpunkt E15,5 wird nach diesen

vorliegenden Ergebnissen der gewebespezifische Minimalpromotor des Transgens GGT-

CRE aktiviert. Folgerichtig setzt die Transkription der stromabwärts klonierten Cre-

Rekombinase setzt ein. Durch das Vorliegen des ROSA26-Allels kann die früheste

katalytische Cre-Rekombinase Aktivität zum Zeitpunkt E15,5 in der embryonalen Niere

erfasst werden.

ERGEBNISSE

83

Abbildung 3.26: LacZ-Expression in doppeltransgenen GGT-CRE+/ROSA26+-Embryonen (E15,5) und in GGT-CRE-/ROSA26+-Kontrollembryonen (E15,5). (A) Parasagittaler Gefrierschnitt nach der X-Gal-Färbung eines Kontrollembryos GGT-CRE-/ROSA26+ zum embryonalen Zeitpunkt E15,5. Außer im angeschnittenen Darmbereich (int) ist keine lacZ-Expression zu beobachten. Die Blaufärbung des Darms resultiert aus dem Vorhandensein von Bakterien mit endogener β-Galaktosidase. (B-C) Mikroskopische Aufnahmen (1,25x) der embryonalen Nierenregion (me) aus Kontrollembryonen (E15,5) mit unterschiedlichen Schnittebenen. (D) 10-fache Vergrößerung einer embryonalen Niere (me) aus einem Kontrollembryo (E15,5). Auch bei dieser Vergrößerung ist keine Blaufärbung bei den Kontrollnieren zu erkennen. (E-F) Die aus der Cre/loxP-Rekombination vermittelte β-Galaktosidase des GGT-CRE+/ROSA26+-Embryos kann in der äußeren renalen Medulla-Region mittels X-Gal-Färbung detektiert und mikroskopisch als Blaufärbung dargestellt werden (E: 2,5x; F: 5x). Schwarze Pfeile deuten auf die angefärbte blaue Region. int = Darm; le = Leber; me = Metanephros. Die cytoplasmatische Hintergrundfärbung wurde mit 0,1% Eosin durchgeführt.

A B

C D

E F

me

le

int

int int

int

int

me

int

int

me me

me

int

me

ERGEBNISSE

84

3.6.2.5 Cre-Rekombinase-Expression zum Zeitpunkt E17,5 Im embryonalen Zeitpunkt E17,5 zeigt sich bei den doppeltransgenen GGT-CRE+/ROSA26+-

Mäusen nach der X-Gal-Färbung eine vergleichsweise stärkere lacZ-Expression als zum

embryonalen Zeitpunkt E15,5. Auch während der Embryonalphase E17,5 ist bei den

Doppeltransgenen eine charakteristische Blau-Färbung in der äußeren Medulla der

Nierenregion und im Darmbereich zu erkennen. Dies bestätigt das Vorhandensein eines

katalytisch aktiven Cre-Enzyms im Metanephros, welches unter transkriptioneller Kontrolle

des murinen GGT-Minimalpromotors steht. Bei den GGT-CRE-/ROSA26+- Kontrollmäusen ist

die β-Galaktosidase außer in der angeschnittenen Darmregion nicht nachzuweisen. Diese

Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die Cre-Rekombinase bei den GGT-CRE-Mäusen

zum embryonalen Zeitpunkt E17,5 an katalytischer Aktivität gewonnen hat. In der Abbildung

3.27 werden mikroskopische Aufnahmen von X-Gal-gefärbten Gefrierschnitten aus

Kontrollembryonen GGT-CRE-/ROSA26+ (Abbildung A-C) und doppeltransgenen GGT-

CRE+/ROSA26+ (Abbildung D-H) im embryonalen Zeitpunkt E17,5 dargestellt.

ERGEBNISSE

85

Abbildung 3.27: LacZ-Expression in doppeltransgenen GGT-CRE+/ROSA26+-Embryonen und in GGT-CRE-/ROSA26+-Kontrollembryonen zum embryonalen Zeitpunkt E17,5. (A) Nach einer X-Gal-Färbung zur Detektion der β-Galaktosidase ist beim Gefrierschnitt (1,25x) eines GGT-CRE-

/ROSA26+-Kontrollembryos nur im angeschnittenen Darmbereich (int) eine Blau-Färbung zu erkennen. (B-C) Sagittalschnitte von Kontrollembryonen bei einer mikroskopischen Vergrößerung von 2,5x. (D-H) LacZ-Expression nach X-Gal-Färbung in doppeltransgenen GGT-CRE+/ROSA26+-Mausembryonen; Lichtmikroskopische Aufnahmen zur Verdeutlichung der Lokalisation der Cre-Rekombinase-Aktivität (D-E: 1,25x; F: 2,5x; G-H: 5x). Bei der 5-fachen Vergrößerung der doppeltransgenen embryonalen Niere (Metanephros) lässt sich die lacZ-Expression histologisch in der äußeren Medulla Region lokalisieren. Schwarze Pfeile zeigen auf die angefärbte blaue Region. int = Darm; me = Metanephros. Die cytoplasmatische Hintergrundfärbung erfolgte mittels Zugabe von 0,1% Eosin.

E

A B C

D F

G H

int

int

int

me me

me

me me

me

ERGEBNISSE

86

3.6.2.6 Cre-Rekombinase-Expression bei neugeborenen Mäusen Bei den neugeborenen doppeltransgenen GGT-CRE+/ROSA26+-Mäusen zeichnet sich nach

X-Gal-Färbungen von Gesamt-Gefrierschnitten (Abbildung 3.28 D-F; H) eine signifikant

intensivere lacZ-Expression in der Niere ab, als zum embryonalen Entwicklungsstadium

E17,5. Ferner konnte erst zu diesem Entwicklungsstadium durch Lektin-markierte

Gefrierpräparate eine präzisere Aussage zur Lokalisation der Cre-Rekombinase-Expression

getroffen werden (Abbildung 3.29).

Um den lacZ-Expressionsort genau einzuordnen, welcher mit den Expressionsort der Cre-

Rekombinase bei doppeltransgenen GGT-CRE+/ROSA26+-Mäusen kongruent ist, wurden

Gefrierschnitte mit Lektin PHAE-TRITC aus Phaseolus vulgaris immunhistochemisch

markiert. Das Lektin PHAE-TRITC bindet spezifisch an Oberflächenproteine der proximalen

Tubuli (rot) und ermöglicht dadurch eine Differenzierung aller renalen Tubulusstrukturen.

Aufgrund der Tatsache, dass X-Gal-gefärbte Präparate mit Glutaraldehyd fixiert wurden,

konnten keine nachfolgenden immunhistochemischen Markierungen auf dem gleichen

Gefrierschnitt durchgeführt werden. Bei diesem Fixierungsmittel liegt bei

fluoreszenzmikroskopischer Untersuchung eine starke Eigen-Emission vor, was eine

Darstellung des Chromophors TRITC vom Lektin undurchführbar machte. Die Fixierung für

Präparate, die immunhistochemisch markiert wurden, erfolgte mittels Aceton. Aus diesem

Grund wurden parallele Gefrierpräparate zur Verdeutlichung der Expressionsorte verwendet.

Es zeigt sich sehr deutlich, dass es sich bei den blau gefärbten Segmenten, die aus der Cre-

vermittelten lacZ-Expression resultieren, um proximale Tubulusstrukturen handelt. Abbildung

3.29 stellt zwei parallele Nieren-Gefrierschnitte einer neonatalen GGT-CRE+/ROSA26+-Maus

dar: (A) immunfluorimetrische Aufnahme nach der Lektin-Markierung und (B) parallel dazu

nach der X-Gal-Färbung.

ERGEBNISSE

87

Abbildung 3.28: LacZ-Expression in neugeborenen GGT-CRE+/ROSA26+-Mäusen und in GGT-CRE-/ROSA26+-Kontrollmäusen. (A-C) Nieren-Gefrierschnitt einer neugeborenen X-Gal-gefärbten GGT-CRE-/ROSA26+- Kontrollmaus. Analog zu den embryonalen Entwicklungsstadien liegt außer im angeschnittenen Darmbereich (int) keine lacZ-Expression vor (A-B: 1,25x; C: 2,5x). Die Blaufärbung der interstinalen Geweberegion resultiert aus den dort vorliegenden Bakterien mit endogener β-Galaktosidase. (D-F) Bei den neugeborenen doppeltransgenen GGT-CRE+/ROSA26+-Mäusen wird eine starke lacZ-Expression im Bereich des renalen Kortex bis hin zur äußeren Medulla-Region nachgewiesen (D-E: 1,25x; F: 2,5x). (G) Als Vergleich die 5-fache Vergrößerung einer Kontrollniere (GGT-CRE-/ROSA26+). Hier liegt keine Blaufärbung vor. (H) 5-fache Vergrößerung der äußeren Nierenregion einer doppeltransgenen neonatalen GGT-CRE+/ROSA26+-Maus zur besseren Darstellung der lacZ-Expression innerhalb der Niere. Schwarze Pfeile zeigen auf proximale Tubuli. int = Darm; ni = Niere; pT = proximale Tubuli. Die cytoplasmatische Hintergrundfärbung wurde mit 0,1% Eosin erzeugt.

A B C

D E F

G H

int int

int

int

int

ni ni

ni

ni ni

ni

int

pT

ERGEBNISSE

88

PHA-E-Lektin-Markierung X-Gal-Färbung

GGT-CRE+/ROSA26+-Niere (1,25x)

Abbildung 3.29: Expression der Cre-Rekombinase in neonatalen GGT-CRE+/ROSA26+-Mäusen. Vergleichende Nieren-Darstellung mit korrespondierenden Gefrierschnitten. (A) Spezifische immunhistochemische Lektin-Markierung (PHA-E-TRITC) für proximale Tubuli (rot). (B) Paralleler X-Gal-gefärbter Nieren-Gefrierschnitt einer doppeltransgenen neugeborenen GGT-CRE+/ROSA26+-Maus. Eine Kolokalisation des Lektin PHA-E mit der lacZ-Expression (blau) ist aus dem Vergleich beider Aufnahmen deutlich zu erkennen. Es handelt sich bei den blaugefärbten Nierenzellen um proximale Tubuluszellen (pT). Das verwendete Lektin PHAE aus Phaseolus vulgaris ist TRITC-markiert.

A B

pT pT

ERGEBNISSE

89

3.6.2.7 Cre-Rekombinase-Expression bei adulten GGT-CRE-Mäusen Aus adulten doppeltransgenen GGT-CRE+/ROSA26+-Mäusen, sowie aus GGT-CRE-

/ROSA26+-Kontrollmäusen erfolgte eine Organentnahme (siehe Abschnitt 2.4.1.1) um

weiterführende histochemische Untersuchungen durchzuführen. Ziel war es eine genaue

Aussage zu treffen, ob die Cre-Rekombinase-Expression auch im adulten

Entwicklungsstadium der Maus zellspezifisch vorliegt. Nach erfolgter Detektion der β-

Galaktosidase mittels X-Gal-Färbung konnte außer in den Nieren und dem Darmtrakt keine

weitere Blaufärbung beobachtet werden. Um experimentell nachzuweisen, ob die Expression

der Cre-Rekombinase in adulten Nieren aus 4-Wochen alten GGT-CRE+/ROSA26+-Mäusen

in den proximalen Tubulusstrukturen beschränkt ist, folgten immunhistochemische

Markierungen. Dabei wurden Nieren-Gefrierschnitte von CRE+/ROSA26+-Mäusen (4

Wochen) und CRE-/ROSA26+-Kontrollmäusen (4 Wochen) mit TRITC-gekoppeltem PHA-E-

Lektin angefärbt. Korrespondierende Gefrierschnitte wurden zum Nachweis der β-

Galaktosidase-Expression mit X-Gal angefärbt. In Abbildung 3.30 A wird der histochemische

Nachweis der lacZ-Expression einer CRE+/ROSA26+-Niere neben einer GGT-CRE-

/ROSA26+-Kontrollniere (Abbildung 3.30 B) präsentiert. Bestimmte histologische Areale des

doppeltransgenen Nierenpräparates wurden eingegrenzt (K1-K3). Diese Regionen werden

neben den Lektin-PHA-E TRITC-markierten korrespondierenden Gefrierschnitten in

Abbildung 3.31 vergrößert vergleichend dargestellt. Es zeigt sich eine Kolokalisation der

Lektin-markierten (rot) mit den blaugefärbten Nierenregionen. Dies lässt zum einem den

Schluss zu, dass eine Cre-Rekombinase-Expression zellspezifisch in den proximalen

Tubuluszellen vorliegt und zum anderen dass bis zum adulten Stadium die katalytische

Aktivität des Cre-Proteins beibehalten wird.

Abbildung 3.30: LacZ-Expression in adulten Nieren aus doppeltransgenen GGT-CRE+/ROSA26+-Mäusen und GGT-CRE-/ROSA26+-Kontrollmäusen (4 Wochen). (A) Sagittaler Gefrierschnitt nach der X-Gal-Färbung einer doppeltransgenen 4-Wochen alten GGT-CRE+/ROSA+-Maus (1,25x). Die lacZ-Expression dehnt sich kranzformig von der äußeren renalen Medulla bis hin zum Nierenkortex aus. (B) Lichtmikroskopische Aufnahme (2,5x) einer adulten Kontrollniere (GGT-CRE-/ROSA+). Eine Blaufärbung liegt hier nicht vor. Durch Zugabe von 0,1% Eosin wurde das Cytoplasma rot angefärbt.

A B K1

K2

K3

ERGEBNISSE

90

Abbildung 3.31: Expression der Cre-Rekombinase in doppeltransgenen GGT-CRE+/ROSA26+-Mäusen. Links ist die spezifische immunhistochemische Lektin-PHA-E-Markierung der proximalen Tubuli (rot) dargestellt. Rechts liegen korrespondierende X-Gal-gefärbte Nieren-Gefrierschnitte (blau) vor, welche die β-Galaktosidase nachweisen. Eine Kolokalisation der Lektin-PHA-E-Markierung (rot) und der lacZ-Expression (blau) konnte festgestellt werden. (Hintergrundfärbung mit 0,1% Eosin).

Niere GGT-CRE+

Medulla/Papillen-Sektionen (K1)

Pelvis/Medulla-Sektionen (K2)

Medulla/Papillen-Sektionen (K3)

Lektin PHA-E TRITC X-Gal

ERGEBNISSE

91

3.6.3 Expression des GGT-CRE-Transgens in der adulten Niere Nieren aus adulten GGT-CRE+-Transgenen (4-84 Wochen) wurden entnommen, um nach

Anfertigung von Gefrierschnitten das Expressionsprofil der Cre-Rekombinase durch

Markierung mit einem spezifischen primären Cre-Antikörper (Novagen) zu untersuchen. Die

Abbildungen 3.32 A-C zeigen eine immunfluormetrische Darstellung der äußeren renalen

Medulla von einer adulten transgenen GGT-CRE+-Maus auf. Bei dieser

immunhistochemischen Markierung ist der primäre polyklonale Antikörper (Novagen) gegen

die Cre-Rekombinase, sowie ein sekundärer Antikörper verwendet worden, der mit dem

roten Fluorophor Rhodamin (Jackson ImmunoResearch) gekoppelt ist. Das Fluorophor

Rhodamin lässt sich mittels der Fluoreszenzmikroskopie im roten Wellenbereich gut

visualisieren. Eine deutliche rote Markierung ist in den Nuklei renaler Tubuli aus transgenen

Mäusen zu erkennen, was mit der Präsenz eines Kernlokalisationssignals (NLS) im

Transgen GGT-CRE übereinstimmt (Abbildung 3.32 A-C). Das Kernlokalisationssignal ist

von großer Bedeutung, weil das Enzym Cre-Rekombinase als DNA-Bindeprotein nur im Kern

katalytisch aktiv sein kann. Nieren-Gefrierschnitte aus nicht transgenen Tieren (FVB/N)

zeigen nach gleicher immunhistochemischer Analyse keine rote Markierung auf, was für die

Spezifität des verwendeten Cre-Antikörpers spricht (Abbildung 3.34 D). Außer den

Rhodamin-markierten sekundären Antikörper wurde auch ein Cy2-gekoppelter Antikörper

(Jackson ImmunoResearch) zur Darstellung der Cre-Rekombinase auf Gefrierschnitten

transgener GGT-CRE+ und nicht transgener Mäuse eingesetzt. In diesem Fall lassen sich die

Kerne grün darstellen (Abbildung 3.32 E-G). Als Kontrolle wurden Nieren-Gefrierschnitte

nicht transgener Tiere unter gleichen immunhistochemischen Konditionen markiert. Bei

Nieren-Gefrierschnitten nicht transgener FVB/N-Kontrollmäuse, ist keine signifikante grüne

Markierung zu erkennen (Abbildung 3.32 H). Des Weiteren sind Gefrierschnitte folgender

Organe auf das Vorliegen der Cre-Rekombinase mittels dem primären Cre-Antikörper und

dem sekundären Rhodamin-gekoppelten Antikörper immunhistochemisch analysiert worden:

Gehirn, Leber, Milz, Lunge, Herz, Pankreas, Haut, Muskelgewebe und Ovar/Testis

(Abbildung nicht gezeigt). Bei keinen der genannten Organe konnte die Cre-Rekombinase

unter Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie detektiert werden. Um eine histologische

Identifizierung der Cre-Rekombinase-exprimierenden Zellen zu erzielen, wurden Nieren-

Gefrierschnitte transgener und nicht transgener Tiere doppelt markiert. Für die

immunhistochemische Doppellmarkierung wurde zum einem der Cre-Antikörper mit dem

sekundären Rhodamin-markierten Antikörper eingesetzt und zum anderen ein FITC-

gekoppeltes biotinyliertes Lektin PHA-E, welches unverändert spezifisch an

Oberflächenproteine proximaler Tubuluszellen anbindet und im grünen Wellenbereich

emittiert. In den Abbildungen 3.32 I-K sind fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen dieser

immunhistochemischen Doppelmarkierung dargestellt. Bei den Nieren-Gefrierschnitten

ERGEBNISSE

92

transgener Tiere zeigt sich eine charakteristische Rotfärbung der Nuklei innerhalb grüner

Lektin-markierter proximaler Tubulusstrukturen. Es konnte keine Rotfärbung und somit keine

Cre-Rekombinase-Expression in den Glomeruli, den distalen Tubuli, der Henleschen

Schleife und den Blutgefäßen beobachtet werden. Zusammenfassend kann festgestellt

werden, dass die Cre-Rekombinase bei adulten GGT-CRE+-Mäusen spezifisch in den Nuklei

der renalen proximalen Tubuluszellen exprimiert wird.

Abbildung 3.32: Expression des Cre-Proteins in proximale Tubuli adulter GGT-CRE+-Mäuse. (A-C) GGT-CRE+-Nieren-Gefrierschnitte wurden mit einem primären polyklonalen Cre-Antikörper (Novagen) und einem Rhodamin-RRX-gekoppelten Esel-anti-Kaninchen (Jackson ImmunoResearch) sekundären Antikörper markiert (rot). Die Aufnahmen zeigen die renale Region der äußeren Medulla mit rot gefärbten Nuklei in den Tubulussegmenten. (D) Nieren aus nicht transgenen FVB/N-Mäusen zeigen unter identischen immunhistochemischen Bedingungen keine spezifische Färbung. (E-G) GGT-CRE+-Nieren-Gefrierschnitte sind mit dem primären polyklonalen Cre-Antikörper und einem sekundären CyTM2 gekoppelten Ziegen-anti-Kaninchen (Jackson ImmunoResearch) Antikörper markiert worden (grün). Es liegen grüne Nuklei innerhalb renaler Tubuli vor. (H) Bei nicht transgenen FVB/N-Mäusen und unter gleichen Bedingungen wie bei E-G konnte keine spezifische Grünfärbung der Nuklei beobachtet werden. (I-J) Eine Doppelmarkierung eines Nierenschnittes von einem GGT-CRE+-Maus mit FITC-gekoppeltem biotynyliertem Lektin (grün) zeigt die Cre-Expression in den Nuklei proximaler Tubuluszellen auf. Dieses Lektin bindet spezifisch nur an die Oberflächenproteine proximaler Tubuli. Der Cre-Antikörper ist gemeinsam mit dem Rhodamin-markierten sekundären Antikörper immunhistochemisch eingesetzt worden. Es konnte eine kernlokalisierte Cre-Rekombinase in den mit Lektin (grün) gefärbten proximalen Tubulusstrukturen beobachtet werden. (K) Hier wurde ein Gefrierschnitt eines nicht transgenen Tieres unter Verwendung der gleichen Antikörper und Lektine wie auch in I-J. Nur die proximalen Tubuli sind grün markiert. Die Cre-Rekombinase ist nicht detektierbar.

A D C B

E F G H

I J K

F G H

DISKUSSION

93

4 Diskussion

Charakteristisch für die ADPKD ist die langsam fortschreitende Bildung und Vergrößerung

von Zysten in beiden Nieren, welche aus Keimbahnmutationen in einem Allel des PKD1 oder

des PKD2 Gens resultieren (Torra et al., 1999; Qian & Watnick, 1999) und im weiteren

Verlauf des Lebens sich nach der Zweitreffer-Theorie (Knudson, 1971) eine zweite

somatische Mutation im anderen Allel ereignet. Durch eine kontinuierliche Proliferation der

klonalen Zellen, welche aus unterschiedlichen Nephronsegmenten entstammen, kommt es

dann zur Zystenbildung.

Sowohl spontan entstandene genetische Modelle für die polycystische Nierenerkrankung,

wie cpk (Preminger et al., 1982; Davisson et al., 1991; Simon et al., 1994; Hou et al., 2002),

orpk (Yoder et al., 1995; 1996; 2000b; Murcia et al., 2000; Taulman et al., 2001) und inv

(Mochizuki et al., 1998) als auch die konventionell entwickelten Pkd1- (Lu et al., 1997; Kim et

al., 2000; Boulter et al., 2001; Lu et al., 2001) und Pkd2-defizienten Mausmutanten (Wu et

al., 1998; Pennekamp et al., 2002) wiesen u. a. Nierenzysten auf. Diese Tiermodelle lieferten

wichtige Daten über die Pathogenese der Zystenentstehung, welche unabhängig vom

betroffenen Gen, auf einen gemeinsamen Mechanismus der renalen Zystogenese schließen

lassen. Ferner konnte gezeigt werden, dass Polycystine eine Schlüsselrolle bei der renalen-,

kardiovaskulären-, pankreatischen- und der Knochenentwicklung spielen. Polycystin 2 ist

zudem essentiell für die Links-Rechts-Polarität (Pennekamp et al., 2002). Bei allen bislang

generierten ADPKD-Tiermodellen sind die endogenen Pkd-Gene in allen Organen und

während der gesamten Lebenszeit des Organismus ausgeschaltet. Daraus ergeben sich

erhebliche Nachteile wie die embryonale Letalität im homozygoten Zustand und ein

komplexer pleiotroper Phänotyp. Beides macht eine Untersuchung im adulten Tier, also

präventive und therapeutische Langzeitstudien, undurchführbar. Um diese Limitierungen zu

umgehen, ist vor allem eine örtliche somatische (konditionale) Geninaktivierung notwendig.

Hierdurch wäre es möglich, im adulten Tier die Genfunktion nur in einem bestimmtem

Gewebe, Organ oder Zelltyp auszuschalten. Mit einer konditionalen Mausmutante könnte die

Zystenentwicklung gezielt im Ursprungsgewebe untersucht werden.

Für eine konditionale Genaktivierung wurde in den letzten Jahren das so genannte Cre/loxP-

Rekombinationssystem entwickelt und fortlaufend modifiziert (Lakso et al., 1992; Gu et al.,

1993; Sauer 1998). Zur Realisierung einer konditionalen Mausmutante sind eine „gefloxte“

Maus und eine gewebespezifisch Cre-Rekombinase-exprimierende Maus erforderlich. Beim

gefloxten Mausmodell werden essentielle Bereiche eines ausgewählten Zielgens mit

Erkennungssequenzen (loxP-Stellen) flankiert, die die Transkription nicht beeinflussen. Die

Cre-Rekombinase bindet spezifisch an die loxP-Sequenzen und katalysiert eine somatische

Rekombination zwischen den loxP-Motiven (Sternberg & Hamilton 1981). Nach der

DISKUSSION

94

Verpaarung wird der ansonsten phänotypisch unauffälligen gefloxten Maus in den Cre-

Rekombinase exprimierenden Zellen der gefloxte DNA-Bereich herausgeschnitten. Ziel

dieser Arbeit war es eine transgene Maus zu generieren, welche nierenspezifisch die Cre-

Rekombinase exprimiert, wobei die geeignete Auswahl des Promotors mit der erforderlichen

Gewebespezifität von großer Bedeutung war. Dabei sollte die Promotoraktivität spezifisch in

den renalen Tubuli vorliegen, da Nierenzysten in diesem Gewebe initiiert werden.

4.1 Nierenspezifische Cre-exprimierende Mausmodelle In der Tabelle 4.1 sind transgene Mauslinien mit nierenspezifischer Expression der Cre-

Rekombinase aufgelistet, die in der Literatur schon beschrieben sind.

Tabelle 4.1: Nierenspezifische Cre-exprimierende Mäuse. h: human; m: murin

Transgen Promotor Expression Literatur

AQP2-CreTag h Aquaporin-2 Renales Sammelrohr, Epithelzellen der Testes

Nelson et al., 1998

Neph-Cre m Nephrin Podozyten Eremina et al., 2002

Ksp1.3/Cre m Ksp-Cadherin Embryos: abzweigende Ureterknospe, renale Tubuli, Wolffscher/ Müllerscher Gang Adult: renale Tubuli, Sammelrohr, Pars ascendens

Shao et al., 2002a; 2002b

THP-CreTag m Tamm-Horsfall-Protein

Niere außer Macula densa, distale Tubuli; leichte Expression Testis, Gehirn

Stricklett et al., 2003

P2.5P-Cre h NPHS2 Podozyten Moeller et al., 2003

Die AQP2-CreTag-Maus exprimiert die Cre-Rekombinase, welche unter der Kontrolle des

humanen 13 kb Aquaporin-2 Promotors steht, im renalen Sammelrohr und den Epithelzellen

der Testes (Nelson et al., 1998). Hier ist zu erwähnen, dass die embryonale Expression

unbekannt ist. 4125 bp des murinen Nephrin-Promotors wurden bei der Neph-Cre Maus der

Cre-Rekombinase vorgeschaltet, was zu einer spezifischen Expression in den renalen

Podozyten führt (Eremina et al., 2002). Die Ksp1.3/Cre Maus wurde sowohl embryonal als

auch adult auf ihre Cre-Rekombinase-Expression hin untersucht (Shao et al., 2002a; 2002b).

Bei diesem Transgen steht das Cre-Gen unter der Kontrolle des murinen Ksp-Cadherin

Promotors (1329 bp). Hierbei liegt das Cre-Protein embryonal in den sich entwickelnden

renalen Tubuli, der abzweigenden Ureterknospe und den Gonodukten (Wolffscher/

Müllerscher Gang) vor. Im adulten Stadium ist eine Expression immunhistochemisch im

renalen Sammelrohr, dem dicken aufsteigenden Ast (Pars ascendens) der Henleschen

Schleife und der renalen Tubuli -vorwiegend distaler Tubulus- zu erkennen. Stricklett et al.

DISKUSSION

95

(2003) entwickelten eine transgene THP-CreTag Maus, wobei der murine 3,7 kb-große-THP-

Promotor dem Cre-Gen vorgeschaltet wurde. In diesem Fall konnte bei adulten Tieren eine

Cre-Expression hauptsächlich im dicken aufsteigenden Ast der Henleschen Schleife

beobachtet werden. Des Weiteren konnte CreTag-mRNA in den Testes und im Gehirn

detektiert werden. Spezifisch in den Podozyten und nur postnatal wird die Cre-Rekombinase

bei der transgenen P2.5P-Cre Maus mit dem humanen 2,5 kb-NPHS2-Promotor exprimiert

(Moeller et al., 2003). Außer der Neph-Cre-Maus, die spezifisch in den Podozyten Cre

exprimiert, weisen alle genannten putativ nierenspezifischen Mäuse in unterschiedlichen

Nierenregionen eine Cre-Expression auf. Zum Teil liegt sogar eine extrarenale Expression

vor. Bei keiner der bislang generierten Cre-exprimierenden Mäuse war ausschließlich in den

renalen Tubulussegmenten eine spezifische Cre-Expression vorliegend.

Die in dieser Arbeit entwickelte transgene GGT-CRE-Maus wäre demnach die Erste, die

sowohl embryonal als auch adult spezifisch in den proximalen Tubuluszellen der Niere eine

katalytisch aktive Cre-Rekombinase exprimiert.

4.2 Generierung der transgenen GGT-CRE-Maus Bei der Generierung der GGT-CRE-Maus war zunächst die Auswahl eines geeigneten

gewebespezifischen Promotors von hoher Relevanz, was eine intensive Literaturrecherche

erforderte. Im Ergebnissteil (Tabelle 3.1) sind alle potentiellen nierenspezifischen

Promotoren der Größe nach tabellarisch aufgeführt. Letztendlich fiel die Entscheidung auf

den murinen Minimalpromotor Gamma-Glutamyl-Transpeptidase Typ II (GGT).

Ausschlaggebend für die Auswahl des GGT-Promotors bei der Generierung der Cre-

exprimierenden transgenen Maus waren folgende zwei Hauptkriterien, welche in den

Abschnitten 4.2.1-4.2.2 diskutiert werden:

• Ort der Promotoraktivität • Promotorlänge

4.2.1 Relevanz des proximalen Tubulus für die Zystenbildung Der proximale Tubulus der Niere wird bei der Zystenentstehung im Vergleich zum distalen

Tubulus und dem Sammelrohr unterschiedlich beeinträchtigt und wird im folgenden Absatz

erörtert.

DISKUSSION

96

Die cpk/cpk Maus war das erste beschriebene Maus-Modell mit der Symptomatik der

polycystischen Nierenerkrankung. Es stellte sich ein autosomal rezessives Krankheitsbild

ein. Die Zystenbildung wird bei der cpk/cpk Maus im proximalen Tubulus initiiert und betrifft

im späteren Verlauf auch das Sammelrohr (Nidess et al., 1984; Avner et al., 1987). Ein

analoges Muster dieser pathologischen Nierenveränderung konnte gleichfalls bei der

homozygoten Pkd1-defizienten-Maus (Lu et al., 1997) und auch bei zwei weiteren ARPKD-

Mausmodellen beobachtet werden: der bpk/bpk Maus (Nauta et al., 1995) und der orpk/orpk

Maus (Moyer et al., 1994). Nierenanalysen bei der transgenen Han:SPRD cy/+ Ratte - ein

ADPKD Tiermodell - zeigten ebenfalls auf, dass die Nierenzysten dem proximalen Tubulus

entstammen (Cowley et al., 1993; Schäfer et al., 1994; Obermüller et al., 1997). Dieses

Muster der pathologischen Nierenveränderung konnte auch beim ADPKD-Mausmodell

Pkd2-/-lacZ+/+ beobachtet werden (Pennekamp, 2000). Es lag eine Zystenbildung in den

Grenzbereichen von Cortex und Medulla in den Glomeruli und proximalen Abschnitte der

Tubuli vor. Im Gegensatz dazu entstammen die renalen Zysten bei der Pkd2-Knockout-Maus

Pkd2-/- von Wu et al. (1998), beim pcy/pcy Mausmodell (Takahashi et al., 1991) und dem

chi/chi Rattenmodell (Inage et al., 1991) überwiegend aus den distalen Tubulusstrukturen

und dem Sammelrohr. Ein Grund für diese widersprüchlichen Ergebnisse kann die

verwendete Untersuchungsmethodik sein. Wenn ausschließlich Licht- und

Elektronenmikroskopische Methoden durchgeführt wurden, um den Ursprung der Zysten

nachzuweisen, ist eine Differenzierung zwischen den einzelnen Tubuli und dem Sammelrohr

erheblich erschwert. Die charakteristischen histologischen Unterscheidungsmerkmale, wie

z.B. der Bürstensaum beim proximalen Tubulus gehen im Laufe der Zystenentwicklung

verloren. Ferner unterbleibt bei zystisch veränderten Nephronsegmenten die Expression

deren spezifischer Marker, so dass ein spezieller Markernachweis nicht mehr zur Verfügung

steht. Folglich führt dessen Anwendung nicht zu einer sicheren Charakterisierung einzelner

Nephronabschnitte (Obermüller et al., 1997). Manche transgene Tiermodelle der ADPKD

ähneln der humanen Form der polycystischen Nierenerkrankung so sehr, dass die

Vermutung nahe liegt, dass die Zysten bei der humanen Krankheitsform ebenfalls aus den

proximalen Tubuli und dem Sammelrohr entstammen (Bachinsky et al., 1995; Devuyst et al.,

1996). Nach einer Erhebung aller in diesem Abschnitt genannten Ergebnisse wird dem

proximalen Tubulus bei der Zystenbildung eine besondere Bedeutung zugesprochen. Bei

dieser Nephroneinheit liegt eine erhöhte Affinität zur Zystenbildung vor. Diese Anfälligkeit ist

möglicherweise darin begründet, dass die vorliegenden Mutationen bei den ADPKD-

Tiermodellen Strukturen betreffen, wie z.B. Zell-Zell-Kontakte, Zell-Matrix-Kontakte, welche

für eine reguläre Funktion der proximalen Tubuli wichtiger sind als für die übrigen

Nephronsegmente. Die mutierten Proteine würden zwar nicht das eigentliche

Differenzierungsprogramm der proximalen Tubuli behindern, könnten aber eventuell ein

DISKUSSION

97

essentielles Stoppsignal verhindern, so dass fortdauernd Zystenzellen proliferieren und sich

pathologisch Lumen ausbilden.

Aufgrund der erhöhten Anfälligkeit des proximalen Tubulus zur Zystenbildung bietet sich

dieser Expressionsort für die Cre-Rekombinase in idealer Weise an. In der Literatur sind fünf

Promotoren beschrieben worden, die nach in vivo-Untersuchungen, eine Aktivität

vorwiegend in renalen proximalen Tubuli aufwiesen (Tabelle 4.2).

Tabelle 4.2: Auflistung gewebespezifischer Promotoren mit Hauptaktivität in pT-Zellen. Expression von Reportergenen bzw. c-DNA in transgenen Tieren.


m GGT 346 bp lacZ/pT-Zellen Rajagopalan et al., 1993; Sepulveda et al.,1997

h PAI-1 1,27 kb lacZ/pT-Zellen Kruithof & Cousin, 1988; Strandberg et al., 1988; Emert et al., 1998

h KAP 1,5 kb HAGT/pT-Epithelzellen Niu et al., 1991 Ding et al., 1997; Hardy et al., 2001

m Epo 6,5 kb lacZ/pT-Zellen, Leber McDonald et al., 1986; Loya et al., 1994; Haidar et al., 1997

m TESK1

9,0 kb lacZ/testikuläre Keimzellen, pT-Zellen, Herzmuskelzellen, Nervenzellen

Toshima et al., 1998; 2001

GGT = Gamma-Glutamyl-Transpeptidase Typ II; PAI-1 = Plasminogen Aktivator Inhibitor I; KAP = Nieren Androgen-reguliertes-Protein; Epo = Erythropoietin; TESK1 = testikuläre Proteinkinase1; humanes Angiotensinogen; HAGT = humanes Angiotensinogen; pT-Zellen = proximale Tubuluszellen; h = human; m = murin

9,0 kb des murinen testikulären Proteinkinase-1-Promotors (Toshima et al., 1998) wurden

dem Reportergen lacZ vorgeschaltet um dessen Expressionsprofil zu analysieren.

Tatsächlich konnte in den renalen proximalen Tubuluszellen der adulten TESK1/lacZ-Maus

die β-Galaktosidase nachgewiesen werden (Toshima et al., 2001). Ferner lag extrarenal in

den testikulären Keimzellen, den Herzmuskelzellen und den Nervenzellen ebenfalls eine

erhöhte lacZ-Expression vor. Da keine nierenspezifische Promotoraktivität vorlag, wurde der

murine TESK1-Promotor ausgeschlossen.

Analog zu den Ergebnissen des murinen TESK1 Promotors zeigte sich beim murinen

Erythropoietin-Promotor (McDonald et al., 1986) außer im proximalen Tubulus auch eine

extrarenale Aktivität in der Leber (Loya et al., 1994; Haidar et al., 1997).

DISKUSSION

98

Der KAP-, PAI-1- und GGT-Promotor kamen in die engere Auswahl. Grund dafür waren die

in vivo Expressionsuntersuchungen, welche eine Promotoraktivität primär im proximalen

Tubulus nachwiesen (Ding et al., 1997; Emert et al., 1998; Sepulveda et al., 1997). Bei der

so genannten KAP-HAGT-Maus (Ding et al., 1997) wurden 1,5 kb vom Promotor des

humanen Nieren Androgen-regulierten Proteins mit der kodierenden Region des humanen

Angiotensinogen (hAGT) Gens fusioniert. Durch in situ Hybridisierungen, unter Verwendung

von anti-sense-Proben aus hAGT-mRNA, konnte eine sehr spezifische KAP-hAGT-

Expression in den Epithelzellen des proximalen Tubulus detektiert werden (Ding et al.,

1997). Es lag adult keine extrarenale Expression vor. Sowohl der PAI-1-Promotor als auch

der GGT-Minimalpromotor wurden stromaufwärts vom lacZ kloniert, um dessen

Expressionsprofil in transgenen Tieren aufzuzeigen. Bei beiden transgenen Tieren zeigte

sich eine äußerst spezifische β-Galaktosidase-Expression ausschließlich im proximalen

Tubulus der Niere.

4.2.2 Relevanz der Promotorgröße Hinsichtlich ihres örtlichen Aktivitätsprofils unterscheiden sich der KAP-, PAI-1- und GGT-

Promotor kaum voneinander. Promotoraktivitäten wurden mittels histochemischer

Expressionsuntersuchungen ausschließlich in den renalen proximalen Tubuluszellen

nachgewiesen. Ein wichtiger Unterschied ist jedoch die Promotorlänge. Beim KAP-Promotor

sind es 1,5 kb, beim PAI-1-Promotor 1,27 kb, wohingegen beim GGT-Promotor nur 346 bp

für eine Gewebespezifität ausreichen.

Eine geeignete und flexible Klonierungsstrategie zum Einbringen eines Promotors vor ein

Strukturgen ist mittels der PCR-Technologie zu realisieren. Der Promotorbereich wird mit

den entsprechenden homologen Oligonukleotidsequenzen aus genomischer DNA heraus

amplifiziert. Am 5´- und 3´-Ende der Primersequenz werden Restriktionsschnittstellen

eingefügt, um eine weiterführende Klonierung in einen Vektor mit analogen Schnittstellen zu

ermöglichen. Bei dieser Klonierungsmethodik sind kürzere Promotorbereiche von Vorteil. Je

größer die zu amplifizierende DNA-Sequenz ist, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit eines

Synthesefehlers. Aus diesem Grund fiel letztendlich die Wahl auf den 346 bp großen GGT-

Promotors. Zur Amplifikation der murinen genomischen 346 bp-DNA-Sequenz wurde die pfu-

DNA-Polymerase eingesetzt, die aufgrund einer 3´-5´- Exonuklease-Aktivität im Vergleich zu

anderen thermostabilen DNA-Polymerasen die niedrigste Fehlerrate besitzt (Cline et al.,

1996; Shafikhani, 2002).

DISKUSSION

99

4.3 Muriner 346-bp-GGT-Minimalpromotor Bei der Gamma-Glutamyl-Transpeptidase - eine membrangebundene Ektopeptidase -

handelt es sich um ein Schlüsselenzym im Glutathion-Metabolismus (Vina, 1990; Meister,

1995; Lieberman et al., 1995; Meister & Larsson, 1995; Shi et al., 1995). Das Protein wird in

unterschiedliche epitheliale Zellen exprimiert (Whitfield, 2001; Hanigan & Frierson, 1996) mit

der höchsten Expressionsrate präferenziell in der Niere, Dünndarm, Pankreas, fetaler Leber

und weiteren Organen mit sekretorischen und absorptiven Eigenschaften (Vina, 1990;

Lieberman et al., 1995). 1993 konnte erstmals die Struktur von unterschiedlichen GGT-

mRNAs in murinen Nieren charakterisiert werden (Rajagopalan et al., 1993). Mittlerweile

wurde auch die kodierende Region des murinen GGT-Gens entschlüsselt (Shi et al., 1995).

Es ist auf dem Chromosom 10 lokalisiert (LocusID: 14598, NCBI), umfasst 12589 bp (NT

039496, NCBI) und wird in 12 Exons unterteilt. GGT wird von sieben unterschiedlichen

Promotoren in sieben mRNAs transkribiert, welche zwar den gleichen offenen Leserahmen

einnehmen, sich aber in der 5´-nicht translatierten Region unterscheiden (Rajagopalan et al.,

1993; Sepulveda et al., 1994; Carter et al., 1994; Habib et al., 1995; Lieberman, 1995; Shi et

al., 1996; Chikhi et al., 1999). Die sieben Promotoren mit den zugehörigen mRNAs werden

als Typ I - Typ VII bezeichnet. Obwohl GGT dank der unterschiedlichen Promotoren in einer

relativ ubiquitären Weise exprimiert wird, ergibt sich dennoch eine Gewebespezifität durch

die mRNAs (Lieberman et al., 1995; Chikhi et al., 1999). Zellbiologische

Transfektionsexperimente mit dem CAT-Gen, welches als Nachweis für die

Promotoraktivierung fungiert zeigten auf, dass der GGT-Promotor-Typ II den murinen

proximalen Tubuluszellen eine signifikant höhere CAT-Aktivität verleiht als den Fibroblasten.

Für eine zellspezifische Expression eines Reportergens in murine Zellen reichen die cis-

aktiven Elemente des GGT-Promotors Typ II aus (Sepulveda et al., 1994). Zusätzlich zu den

Expressionsstudien wurden Promotoruntersuchungen durchgeführt, um die exakte

Lokalisation der betreffenden gewebespezifischen DNA-Elemente nachzuweisen. Durch

Mutagenese ergaben sich unterschiedliche 5´-Deletionen, welche durch weiterführende

Transfektionsexperimente in murinen proximalen Tubuluszellen (MPT-Zellen) analysiert

wurden. Es zeigte sich, dass die 346 bp-großen Promotorelemente des murinen GGT-

Promotor-Typ II die höchste Aktivität aufwiesen (Sepulveda et al., 1997). Um einen Einblick

zu gewinnen, ob der murine GGT-Promotor-Typ II ausreichend cis-aktive Elemente für eine

eingeschränkte in vivo-Expression besitzt, folgte die Generierung eines transgenes

Tiermodells (Sepulveda et al., 1997).

DISKUSSION

100

4.3.1 GGT-pII-346/β-Galaktosidase-Maus Nach Ermittlung der geeigneten Promotorlänge wurde ein Transgen mit stromabwärts

geschalteter lacZ-Kassette unter Kontrolle des 346 bp-großen Minimalpromotors GGT

gesetzt (Sepulveda et al., 1997). Das Konstrukt pII-346/β-Galaktosidase wurde zunächst in

MPT-Zellen transfiziert, um die β-Galaktosidase Aktivität zu testen. Nach Generierung der

GGT-pII-346/β-Galaktosidase-Maus sind verschiedene Organe (Niere, Nebenniere, Leber,

Dünndarm, Milz, Lunge, Herz, Gehirn und Uterus) zur Detektion der β-Galaktosidase

histochemisch analysiert worden. Nur die Nieren-Sektionen und hier nur die proximalen

Tubulusstrukturen ließen sich blau anfärben, was auf eine spezifische Promotoraktivität

hinwies.

4.4 Klonierung des GGT-CRE-Transgens Um eine zellspezifische Expression der Cre-Rekombinase im proximalen Tubulus zu

erreichen, wurde in dieser Arbeit das Strukturgen der Cre-Rekombinase (ORF2; Sternberg et

al., 1981) unter die Kontrolle des oben beschriebenen 346 bp großen GGT-Promotors

gestellt. Stromabwärts des ATG-Startkodons des Cre-Gens sind im Leseraster 21 bp des

Kernlokalisationssignals (NLS; Kalderon et al., 1984) vom SV40 large T Antigen inseriert

worden. NLS führt zur Translokation der Cre-Rekombinase in den Nukleus. Das DNA-

Bindeprotein Cre-Rekombinase muss im Kern vorliegen, um die gewünschte Rekombination

zu katalysieren. Stromabwärts wurde abschließend eine SV40-polyA-Region einkloniert. Das

so entstandene Transgen GGT-CRE wurde zur Erzeugung transgener Tiere in den

Pronukleus fertilisierter FVB/N-Oocyten injiziert und anschließend in scheinschwangere

CD1-Mäuse nach Hogan et al., (1994) implantiert. Aus der Implantierung resultierte eine

transgene weibliche Maus (G5). Mittels Southern-Transfer-Analysen und PCR-

Genotypisierungen konnte nachgewiesen werden, dass das Transgen GGT-CRE auch bei

den Nachkommen vorlag.

4.5. Das Expressionsprofil des murinen GGT-Promotors Zuerst konnte gezeigt werden, dass die Cre-Rekombinase des GGT-CRE-Konstruktes

katalytisch aktiv war. Dafür wurden GGT-CRE-Mäuse sowohl mit Z/AP-Reportermäusen

(Lobe et al., 1999) als auch mit ROSA26-Reportermäusen (Soriano, 1999) verpaart.

4.5.1 Cre/loxP-Rekombination in GGT-CRE+/Z/AP+-Mäuse Mittels enzymhistochemischer Detektionsmethoden für die hitzestabile humane plazentale

alkalischen Phosphatase (hPLAP) des Z/AP-Allels konnte bei den doppeltransgenen GGT-

CRE+/Z/AP+-Mäusen ein Rekombinationsereignis der Cre-Rekombinase nachgewiesen

DISKUSSION

101

werden. In unrekombinierten Zellen verhindert eine vorgeschaltene gefloxte βgeo-Kassette

(Friedrich & Soriano, 1991) die Transkription des hPLAP-Gens. Eine hPLAP-Expression

stellt sich nur ein, wenn eine katalytisch aktive Cre-Rekombinase exprimiert und dadurch die

gefloxte Terminationseinheit deletiert wird. Infolgedessen kann hPLAP mittels dessen

Substratzugabe detektiert werden. Nieren-Gefrierschnitte von adulten GGT-CRE+/Z/AP+-

Mäusen wiesen eine intensive bläuliche Färbung der hPLAP im Bereich des renalen Kortex

bis zur äußeren Medulla auf. Es handelte sich nach einer lichtmikroskopischen

Charakterisierung um proximale Tubulusstrukturen. GGT-CRE-/Z/AP+ Kontroll-Tiere wiesen

unter gleichen histochemischen Bedingungen keine hPLAP-Expression auf.

Schlussfolgernd lässt sich durch diese Experimente eine katalytische in vivo-Aktivität der

Cre-Rekombinase in adulten transgenen GGT-CRE-Mäusen nachweisen.

4.5.2 Früheste Cre/loxP-Rekombination in GGT-CRE+/ROSA26+-Mäusen ROSA26-Reportermäuse können eine Cre/loxP-Rekombination mittels einer β-

Galaktosidase-Expression aufzeigen. Auf dem ROSA26-Allel liegt als Terminationseinheit

eine gefloxte Neomycinkassette mit einer vierfachen polyA-Sequenz vor, wodurch der

Transkriptionsstillstand der RNA Polymerase gewährleistet wird. Das stromabwärts gelegene

Reportergen lacZ kann folglich nicht translatiert werden. Erst durch die Anbindung des Cre-

Enzyms an die loxP-Erkennungssequenzen erfolgt die Entfernung der Terminationskassette

und demzufolge die Initiierung der lacZ-Transkription. In dieser Arbeit wurden sowohl

embryonale als auch adulte GGT-CRE+/ROSA26+-Mäuse überprüft. Als Kontrolle dienten

GGT-CRE-/ROSA26+-Mäuse. Zur embryonalen Untersuchung der Cre/loxP-Rekombination

wurden Gefrierschnitte ganzer Embryonen eingesetzt. Der erste Analysezeitpunkt war E12,5.

Erst zum embryonalen Zeitpunkt E15,5 bei doppeltransgenen GGT-CRE+/ROSA26+-

Embryonen konnte eine leichte lacZ-Expression in der embryonalen Niere (Metanephros)

und dem Darm beobachtet werden. In der Kontrollgruppe lag nur im Darmbereich eine lacZ-

Expression vor. Im Darm lebende Bakterien enthalten die endogene β-Galaktosidase, die

das vorgelegte X-Gal mitverwertet. Aus diesem Grunde wurde eine Blaufärbung auch bei

Kontroll-Mäusen interstinal beobachtet. Bei früheren embryonalen Stadien konnte durch

lichtmikroskopische Betrachtungen keine Blaufärbung im gesamten Embryo erfasst werden.

In der Literatur finden sich zum Vergleich Informationen über den ersten

Expressionszeitpunkt der murinen GGT. 1988 wurde an murinen Zellen quantitativ durch

Fluorimetrie-Messverfahren die spezifische Aktivität der Transpeptidase mit parallelen

immunhistochemischen GGT-Nachweismethoden (Curto et al., 1988) festgestellt. Beim

Embryonalstadium E13 wurde in der fetalen murinen Niere 1 mU/mg Protein gemessen.

Zwischen den Gestationstagen 13-21 ergab sich eine 50-fach höhere spezifische

Transpeptidase-Aktivität. Am 13. Tag der Gestation wurde GGT immunhistochemisch an der

DISKUSSION

102

apikalen Oberfläche der sich entwickelnden murinen renalen Vesikel und dem proximalen

Segment der S-förmigen Tubuli dargestellt. Am 15. Tag der Gestation findet sich GGT

vorwiegend an der apikalen Oberfläche der sich entwickelten proximalen Segmente. Der 17.

Gestationstag geht einher mit der Nierenorganisation in diskreten Zonen. Hier findet sich ein

ziemlich hoher Aktivitätsanstieg des Enzyms, was mit einem starken immunhistochemischen

Signal am proximalen Tubulus der inneren Kortex korrelierte. Im Vergleich dazu konnte

humane GGT mittels immunhistochemischer Analysen in menschlichen proximalen

Tubuluszellen eines 12 Wochen alten Fötus lokalisiert werden (Hanigan & Frierson, 1996).

Die Diskrepanz des in doppeltransgenen GGT-CRE+/ROSA26+-Mäusen festgestellten ersten

lacZ-Expressionszeitpunkts bei E15,5 und der in der Literatur beschriebenen ersten

Expression des GGT-Proteins kann zum einem an der verkürzten Promotorregion des

Transgens liegen. Zum anderen könnte eine Cre/loxP-Rekombination erst durch einen

gewissen Dosis-Effekt gewährleistet werden. Wie bei Curto et al., (1988) beschrieben erhöht

sich die Transpeptidase Aktivität um das 50-fache zwischen den Embryonaltagen 13-21, was

auf eine stetig ansteigende Aktivität des Promotors hinweist.

4.5.3 Cre/loxP-Rekombination in neonatalen und adulten GGT-CRE+/ROSA26+- Mäusen Bei den neugeborenen GGT-CRE+/ROSA26+-Mäusen wurde eine genaue Charakterisierung

der lacZ-exprimierenden Nierenzellen mittels einer Lektin-Markierung, welche spezifisch für

proximale Tubuluszellen ist, durchgeführt. Eine Kolokalisation des Lektins PHA-E aus

Phaseolus vulgaris und der lacZ-Expression ist bei den Gefrierschnitten von ganzen

doppeltransgenen Neugeborenen Tieren deutlich zu erkennen. Es handelte sich beim

blaugefärbten Gewebe um proximale Tubuluszellen. Ganzkörperschnitte von neugeborenen

GGT-CRE+/ROSA26+- und GGT-CRE-/ROSA26+-Mäusen wurden für weiterführende X-Gal-

Färbungen und Lektin-Markierungen eingesetzt. Eine lacZ-Expression konnte bei neonatalen

Mäusen ausschließlich im renalen proximalen Tubulus beobachtet werden. Diese

Ergebnisse demonstrieren, dass eine gewebespezifische Cre/loxP-Rekombination auch an

diesem Entwicklungszeitpunkt durch den GGT-Minimalpromotor vermittelt wird. Wichtig

hierbei ist auch die Tatsache, dass Ganzkörperschnitte von Neugeborenen histochemisch

analysiert wurden. Somit wurden praktisch alle Geweberegionen berücksichtigt. Das Fehlen

einer lacZ-Expression im extrarenalen Bereich ergibt die Schlussfolgerung, dass die Cre-

Rekombinase zumindest bei der neugeborenen transgenen GGT-CRE+-Maus nur im

proximalen Tubulus katalytisch aktiv ist. Analog zu den GGT-CRE+/Z/AP+-Mäusen konnte

auch bei den adulten GGT-CRE+/ROSA26+-Mäusen eine spezifische Anfärbung der

proximalen Tubuluszellen beobachtet werden. Mit dem Unterschied, dass bei den adulten

GGT-CRE+/ROSA26+-Mäusen die lacZ-Expression außer durch lichtmikroskopischer

DISKUSSION

103

Beobachtung auch durch nephronspezifische Lektine die Lokalisation der Cre-Rekombinase

genauer untersucht werden konnte. Zusammenfassend kann postuliert werden, dass bei der

transgenen GGT-CRE-Maus die katalytische Aktivität der Cre-Rekombinase im proximalen

Tubulus ab den Embryonalstadium E15,5 bis hin zum adulten Stadium durchgängig vorliegt.

4.6 Expression des GGT-CRE-Transgens in der Niere Die genaue Lokalisation des Cre-Proteins innerhalb der Zelle bei der GGT-CRE-Maus

konnte durch die Verwendung von Cre-Rekombinase-Antikörpern dargestellt werden.

Ausschließlich in den Zellkernen renaler proximaler Tubuli wurde die Cre-Rekombinase auf

Nieren-Gefrierschnitten GGT-CRE+-Mäusen immunhistochemisch detektiert. Eine genaue

Charakterisierung des Nephronsegments erfolgte mit Hilfe eines biotinylierten Lektins,

welches spezifisch an Oberflächenproteine proximaler Tubuluszellen bindet. Für die

immunhistochemische Doppelmarkierung wurde zum einem der Cre-Antikörper mit dem

sekundären Rhodamin-markierten Antikörper und zum anderen ein FITC-gekoppeltes

biotinyliertes Lektin eingesetzt. Nieren-Gefrierschnitte proximaler Tubuluszellen mit

immunhistochemischer Doppelmarkierung zeigten ein eindeutiges Resultat. Die Cre-

Rekombinase liegt im Zellkern des proximalen Tubulus vor. Eine Kernlokalisation war zu

erwarten, da das angebundene Kernlokalisationssignal die Translokation der Cre-mRNA in

den Nukleus aktiv vermittelt.

Das Muster der Cre-Expression ist vergleichbar mit den Ergebnissen der Arbeitsgruppe

Sepulveda et al., (1997). Ihre Resultate ergaben sich durch Einbringen des bakteriellen

Reportergens lacZ unter die transkriptionelle Kontrolle des verkürzten Minimalpromotors.

Dabei konnte die β-Galaktosidase durch X-Gal Färbungen ausschließlich im proximalen

Tubulus detektiert werden. Unklar blieb bei deren Untersuchungen, ob extrarenale lacZ-

Expression vorlag. Durch Markierung von GGT-CRE-Gefrierschnitten des Gehirns, Leber,

Milz, Lunge, Herz, Pankreas, Haut, Muskelgewebe und des Ovars/Testis mit dem primären

polyklonalen Antikörper gegen die Cre-Rekombinase und dem sekundärer Rhodamin-

gekoppelten Antikörper konnte bei diesem Gewebe keine Cre-Rekombinase detektiert

werden.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die in dieser Arbeit entwickelte transgene

GGT-CRE-Maus die Erste beschriebene ist, die sowohl embryonal als auch adult spezifisch

in den proximalen Tubuluszellen der Niere eine katalytisch aktive Cre-Rekombinase

exprimiert. Dieses Ergebnis konnte sowohl durch den Einsatz von zwei unterschiedlichen

Reportermäusen als auch durch Cre-Antikörper eindeutig gezeigt werden.

DISKUSSION

104

Die GGT-CRE-Maus repräsentiert ein neues experimentelles Reagenz für

gewebespezifische Knockouts in der Niere, und genauer im proximalen Tubulus. Da die Cre-

Rekombinase unter der Kontrolle des GGT-Promotors steht und ihre Expression sich auf den

proximalen Tubulus beschränkt, wird sich die Geninaktivierung nach Verpaarung mit

gefloxten Mäusen nur in diesem Gewebe ereignen. Zudem wird das Transgen der GGT-

CRE-Maus nicht vor dem embryonalen Zeitpunkt E15,5 exprimiert. Genau diese Eigenschaft

lässt sich zur Untersuchung von Genen mit essentiellen Funktionen bei der

Embryonalentwicklung aneignen, die sonst durch konventionelle Inaktivierung zur

embryonalen Letalität führen. Sie kann letztendlich einen großen Beitrag zur Erforschung der

Zystenentwicklung bei der ADPKD beitragen, welche unter anderem in den proximalen

Tubulussegmenten initiiert werden.

4.7 Ausblick: Zeitlich induzierbare nierenspezifische Cre-Mäuse

4.7.1 Generierung der Konstrukte GGT-RTTA und BI-CRE-lacZ Um sowohl eine örtliche als auch eine zeitlich definierte Expression der Cre-Rekombinase zu

ermöglichen wurden in dieser Arbeit zwei weitere Konstrukte zur Generierung transgener

Tiere entwickelt: GGT-RTTA und BI-CRE-lacZ. Für eine zeitliche Kontrolle der Cre-

Rekombinase wurde das binäre Transkriptions-Kontrollsystem von Gossen und Bujard

(1992) verwendet, welches die Expression individueller Gene durch exogene Zugabe von

Doxycyclin reguliert. Bei diesem regulatorischen System sind zwei regulatorische Elemente

erforderlich: Der Transkriptionsaktivator tTA und der Operator. Methodisch werden diese

genetischen Elemente in zwei unterschiedlichen Mauslinien pronuklear injiziert, um erst

durch späteres Verkreuzen in Wechselwirkung zu treten. Beim Transgen GGT-RTTA wurde

der reverse Doxycyclin-abhängige Transkriptionsaktivator (rtTA) unter Kontrolle des

Minimalpromotors GGT gesetzt. Der Transkriptionsaktivator rtTA könnte gewebespezifisch

durch den GGT-Promotor exprimiert und zeitlich durch exogene Doxycyclin-Zugabe reguliert

werden. Erst durch die Zugabe des Doxycyclins wäre rtTA aktiviert und könnte an spezielle

Operatoren (tetO) anbinden, welche auf dem zweiten Konstrukt BI-CRE-lacZ vorliegen. Das

Konstrukt BI-CRE-lacZ weist außer den tetO-Sequenzen auch den bidirektionellen Promotor

Pbi-1 auf (Baron et al., 1995). Diese Konstellation erlaubt die gleichzeitige äquimolare

Expression zweier Gene. Der aktivierte Transkriptionsaktivator rtTA aus dem Konstrukt GGT-

RTTA würde spezifisch an den tetO-Sequenzen anbinden und infolgedessen die

Transkription der zwei divergent geschalteten Zielgene Cre und lacZ induzieren. Abbildung

4.1 zeigt schematisch das Zusammenwirken der Transgene pGGT-RTTA mit pBI-CRE-lacZ

auf.

DISKUSSION

105

Abbildung 4.1: Gewebespezifische und zeitlich definierte Expression der Cre-Rekombinase mittels rtTA. (A) Der reverse Tetrazyklin-kontrollierbare Transaktivator rtTA (Gossen & Bujard, 1992; Baron et al., 1995) liegt im Vektor pGGT-RTTA unter der Kontrolle des gewebespezifischen GGT-Minimalpromotors vor. rtTA ist ein Fusionsprotein zwischen dem Tet Repressor und der Aktivierungsdomäne des VP16 Proteins vom Herpes Simplex-Virus (Gossen et al., 1995). Doxycyclin (Dox) agiert nach exogener Zugabe als Effektor und lässt rtTA an tetO binden. (B) Der Vektor pBI-CRE-lacZ weist den bidirektionalen Promotor Pbi-1 auf, dessen sieben tet Operator-Sequenzen (tetO) von zwei divergenten Minimalpromotoren flankiert sind (Baron et al., 1995). Unter der Kontrolle der Minimalpromotoren stehen bidirektional die Reportergene Cre-Rekombinase und lacZ. Erst nach Anbindung des Transaktivators rtTA an die tetO-Sequenzen wird die Transkription der Cre-Rekombinase und der β-Galaktosidase aktiviert. Beide Genprodukte werden äquimolar exprimiert.

Das Transgen GGT-RTTA wurde in den Pronukleus fertilisierter FVB/N-Oocyten injiziert und

anschließend in scheinschwangere CD1-Mäuse implantiert. Trotz mehrmaliger

Genotypisierungsansätze bei den resultierenden Mäusen konnte das Transgen GGT-RTTA

jedoch nicht nachgewiesen werden. Die zufällige Integration eines Transgens in die

genomische DNA des Pronukleus ist ein sehr seltenes Ereignis und bedarf mehrerer

Injektionsansätze in fertilisierte murine Oocyten um positive Resultate zu erzielen. Ein

signifikanter Ausblick auf weitere Studien ist die Generierung der GGT-RTTA- und BI-CRE-

lacZ- transgenen Mäuse. Durch die vorliegenden Ergebnisse aus der transgenen GGT-CRE-

Maus zeigt sich, dass der verkürzte murine Promotor GGT eine gewebespezifische Cre-

Expression in den proximalen Tubuluszellen vermittelt. Beim Konstrukt GGT-RTTA ist eine

gewebespezifische Expression des rtTA Proteins, durch den vorgeschaltenen GGT-Promotor

im proximalen Tubulus zu erwarten. Die Verwirklichung der zeitlichen Komponente, vermittelt

durch die exogene Doxycyclin-Zugabe und den Operator-Sequenzen des BI-CRE-lacZ-

Transgens, bedarf weiterer Analysen. In der Literatur ist dieses Transkriptions-

(A) GGT-RTTA

GGT

Cre-Rekombinase NLS

+ Dox

BiTetO

mP mP

rtTA

NLS lacZ

aktives rtTA

GGTGGT

Cre-Rekombinase NLSNLS

+ Dox

BiTetO

mP mP

rtTArtTA

NLS lacZ

aktives rtTA

(B) BI-CRE-lacZ

DISKUSSION

106

Kontrollsystem von Gossen und Bujard (1992) schon erfolgreich zum Einsatz gekommen

und der Tabelle 4.3 zu entnehmen (Hennighausen et al., 1995; Utomo at al., 1999;

Lindeberg & Ebendal, 1999; Saam & Gordon, 1999; Schönig et al., 2002; Radomska et al.,

2002). Schönig et al., entwickelte 2002 ein effizientes rtTA/Cre/loxP-Regulationssystem. Es

zeigte sich durch Kreuzungen der generierten βMCM86-Mäusen mit ROSA26-

Reportermäusen, dass durch die exogene Zugabe von Tetrazyklinen eine effiziente

Cre/loxP-Rekombination außer in Nierenzellen auch in Hepatozyten, Neuronen und in T-

Lymphozyten stattfindet.

Tabelle 4.3: Zeitlich regulierbare Cre-exprimierende transgene Mäuse in der Niere.

Transgen Promotor Expression Literatur

βMCM86 pCAGGS merCremer induzierbar mit 4-Hydroxytamoxifen (Zhang et al., 1996; Verrou et al., 1999)

Podozyten Bugeon et al., 2003

K18IresCreERT2 Keratin 18 CreERT2 induzierbar mit 4-Hydroxytamoxifen (Indra et al.,1999)

Leber, Niere, Gebärmutter

Wen et al., 2003

Mx1Cre Mx1 Interferon induzierbar (Kühn et al., 1995)

Nierenkortex/-tubuli, Glomeruli, Endothelium, Mesangium, Podozyten

Schneider et al., 2003

rtTA(LAP)-1 LAP Tetrazyklin induzierbar (Gossen & Bujard., 1992)

Hepatozyten, Nierenzellen, Neuronen und T-Lymphozyten

Schönig et al., 2002

Die Bedeutung einer zeitlich und örtlich gerichteten Expression der Cre-Rekombinase im

proximalen Tubulus ergibt sich aus der Tatsache, dass es sich bei der Zystenentstehung

beim ADPKD um einen fokalen zweistufigen Prozess handelt. ADPKD setzt eine

Keimbahnmutation in einem Allel voraus, jedoch wird die Zystenbildung durch eine zweite

somatische Mutation zu einem späteren Lebenszeitpunkt im anderen Allel renaler tubulärer

Zellen initiiert. Eine Anregung zur Zystenbildung kann durch eine gerichtete Inaktivierung des

Polycystin1 oder 2 in den proximalen Tubulussegmenten ermöglicht werden und somit zur

Verwirklichung der Entwicklung therapeutischer Ansätze zur Beeinflussung von ADPKD,

verholfen werden.

ZUSAMMENFASSUNG

107

5. Zusammenfassung Die Zystogenese bei Nieren von ADPKD-Patienten ist ein fokaler Prozess: Obwohl diese

Erkrankung einem autosomal dominanten Erbgang folgt, wirkt sich auf zellulärer Ebene ein

rezessiver Mutationsmechanismus aus. Es liegt zunächst eine Keimbahnmutation vor und

erst im Laufe des Lebens ereignen sich somatische Mutationen im normalen Allel (second

hit). In den letzten Jahren sind mehrere konventionelle Mausmutanten für die Gene Pkd1

und Pkd2 generiert worden. Durch die pränatale Letalität ergaben sich Limitierungen bei der

Analyse der ADPKD-Pathogenese. Ferner kann auch trotz Vorliegen lebensfähiger

Nullmutanten die spezifische Funktion des Gens in einem bestimmten Gewebe nicht

untersucht werden, da das Zielgen in diesen Mäusen in jeder Körperzelle, bereits von Beginn

der Embryonalentwicklung an, inaktiviert ist. Diese Limitierungen der permanenten

Gendeletion können durch die Methode der konditionalen somatischen Mutagenese unter

Einsatz des Cre/loxP-Rekombinationssystems umgangen werden. Mittels transgener

Mauslinien, die die Cre-Rekombinase gewebespezifisch exprimieren, können loxP-flankierte

(„gefloxte“) Zielgene selektiv nur in einem bestimmten Zelltyp aus dem Chromosom

herausgeschnitten und damit inaktiviert werden. Somit kann mittels konditionaler

Mutagenese die embryonale Letalität umgangen werden. Ziel dieser Arbeit war es transgene

Mäuse zu entwickeln, die gewebespezifisch im proximalen Tubulus der Niere die Cre-

Rekombinase exprimieren. Es wurde die GGT-CRE-Mauslinie generiert, welche die Cre-

Rekombinase unter der Kontrolle des murinen Minimalpromotors Gamma-Glutamyl-

Transpeptidase Typ II stellt. Dieser Promotor erlaubt eine nierenspezifische Expression des

Cre-Proteins in den proximalen Tubuluszellen. Die erzeugte GGT-CRE-Mauslinie wurde mit

Cre-Reportermäusen (ROSA26 und Z/AP) verkreuzt und auf ihre Expressions- und

Rekombinationseigenschaften hin untersucht. Beide Reporterlinien tragen ein Markergen,

welches erst nach einer Cre-vermittelten Excision gefloxter Terminationseinheiten exprimiert

werden kann. Unter Verwendung von histochemischen Methoden für die alkalische

Phosphatase bei der Z/AP-Mauslinie und für die β-Galaktosidase bei der ROSA26-Mauslinie

konnte sehr deutlich die Expression einer katalytisch aktiven Cre-Rekombinase in den

proximalen Tubuluszellen der Niere doppeltransgener Tiere beobachtet werden. Ferner

konnte die genaue zelluläre Lokalisation der Cre-Rekombinase, welche sich im Zellkern der

proximalen Tubuluszellen befand, durch immunhistochemischer Markierung mittels Cre-

Antikörpern und gewebespezifischen Lektinen demonstriert werden. Die GGT-CRE-

Mauslinie kann durch die Einführung genomischer Veränderungen (Cre/loxP-Rekombination)

spezifisch in den proximalen Tubuluszellen der Niere einen wichtigen Beitrag bei der

Erklärung der Mechanismen für die Zystenformierung leisten. Ferner erlaubt diese transgene

Mauslinie durch ihre embryonale gewebespezifische Cre-Expression eine Untersuchung

diverser Gene welche speziell in der Nierenentwicklung involviert sind.

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ANHANG

121

7 Anhang

7.1 Restriktionsendonukleasen

Restriktionsenzym Erkennungsstelle

BamH1 G!GATCC

BglII A!GATCT

Eco47III AGC!GCT

EcoRI G!AATTC

EcoRV GAT!ATC

HincII GTY!RAC

HindIII A!AGCTT

HpaI GTT!AAC

KpnI GGTAC!C

NcoI C!CATGG

NheI G!CTAGC

NotI GC!GGCCGC

PstI CTGCA!G

PvuII CAG!CTG

SalI G!TCGAC

SphI GCATG!C

XbaI T!CTAGA

XhoI C!TCGAG

ANHANG

122

7.2 Plasmidkarten

pSL300/PgkNeoL (B. Skryabin, ZMBE, Münster); Resistenz: Ampicillin, Kanamycin/Geneticin (G418); Wirt: E. coli; eukaryotische Zellen

pHD2-Cre1 (C. Kellendonk, German Cancer Research Center, Heidelberg, Kellendonk et al., 1996); NLS-Cre-Rekombinase (pMC-Cre: Gu et al., 1993); (NLS : Kalderon et al., 1984; Cre: Sternberg et al., 1986) ; HSV-TK, SV40-polyA; Resistenz: Ampicillin; Wirt: E. coli

pHD2-Cre1 4,5 kb

pSL300/pgkNeoL 4892 bp

ANHANG

123

pGGT-PFU-1 (L. Tontsidou, diese Arbeit); 424 bp-SalI/BglII-Fragment mit murinen genomischen GGT Promotor Typ II in PHD2-Cre-1; Resistenz: Ampicillin; Wirt: E. coli

pGGT-CRE (L. Tontsidou, diese Arbeit); 2411 bp-SalI/KpnI-Fragment (GGT-NLS-Cre-SV40-polyA) aus pGGT-PFU-1 in pSL300/PgkNeoL Resistenz: Ampicillin, Kanamycin/Geneticin (G418); Wirt: E. coli

pGGT-PFU-1 4,5 kb

pGGT-CRE 7174 bp

ANHANG

124

pUHDrtTA2S-M2; pUHr T62-1 (Prof. Dr. W. Paulus, Institut für Neuropathologie, Münster); phCMV, rtTA2S-M2 (Knott et al., 2002; Koponen et al., 2003), SV40-polyA; Resistenz: Ampicillin; Wirt: E. coli

pGGT-RTTA (L. Tontsidou, diese Arbeit); 424 bp-XhoI/EcoRI-Fragment mit murinen genomischen GGT Promotor Typ II in pUHDrtTA2S-M2 (3433 bp); Resistenz: Ampicillin; Wirt: E. coli

pGGT-RTTA 3851 bp

pUHDrtTA2S-M2 4198 bp

ANHANG

125

Plasmid: pBI-3 (U. Baron, R. Sprengel, ZMBH, Heidelberg; Baron et al., 1995; Clontech); Schwarze Boxen symbolisieren die tet-Operatorsequenzen (tetO); Resistenz: Ampicillin; Wirt: E. coli

pBI-3-H3 (L. Tontsidou, diese Arbeit); Mit Primer 5495/5494 eine HindIII-Schnittstelle an Position nt 5188 in pBI-3 hinzugefügt; Schwarze Boxen symbolisieren die tet-Operatorsequenzen (tetO); Resistenz: Ampicillin; Wirt: E. coli

pBI-3 7727 bp

pBI-3-H3 7727 bp

ANHANG

126

pBI-CRE-lacZ (L. Tontsidou, diese Arbeit); ein PstI/NotI-Fragment aus PHD2-Cre kloniert in pBI-3-H3; Schwarze Boxen symbolisieren die tet-Operatorsequenzen (tetO); Resistenz: Ampicillin; Wirt: E. coli.

pBI-CRE-lacZ 9696 bp

ANHANG

127

7.3 DNA-Sequenzen 7.3.1 Sequenzname: pGGT-CRE Länge: 7174 bp Vektorrückgrat : nt 1-2286 GGT Promotor II: nt 2287-2704 ATG: nt 2734-2736 NLS: nt 2737-2757 Cre-ORF2: nt 2758-3786 SV40-polyA: nt 3834-4682 Vektorrückgrat: nt 4683-7174 1 CAGGTGGCAC TTTTCGGGGA AATGTGCGCG GAACCCCTAT TTGTTTATTT 51 TTCTAAATAC ATTCAAATAT GTATCCGCTC ATGAGACAAT AACCCTGATA 101 AATGCTTCAA TAATATTGAA AAAGGAAGAG TATGAGTATT CAACATTTCC 151 GTGTCGCCCT TATTCCCTTT TTTGCGGCAT TTTGCCTTCC TGTTTTTGCT 201 CACCCAGAAA CGCTGGTGAA AGTAAAAGAT GCTGAAGATC AGTTGGGTGC 251 ACGAGTGGGT TACATCGAAC TGGATCTCAA CAGCGGTAAG ATCCTTGAGA 301 GTTTTCGCCC CGAAGAACGT TTTCCAATGA TGAGCACTTT TAAAGTTCTG 351 CTATGTGGCG CGGTATTATC CCGTATTGAC GCCGGGCAAG AGCAACTCGG 401 TCGCCGCATA CACTATTCTC AGAATGACTT GGTTGAGTAC TCACCAGTCA 451 CAGAAAAGCA TCTTACGGAT GGCATGACAG TAAGAGAATT ATGCAGTGCT 501 GCCATAACCA TGAGTGATAA CACTGCGGCC AACTTACTTC TGACAACGAT 551 CGGAGGACCG AAGGAGCTAA CCGCTTTTTT GCACAACATG GGGGATCATG 601 TAACTCGCCT TGATCGTTGG GAACCGGAGC TGAATGAAGC CATACCAAAC 651 GACGAGCGTG ACACCACGAT GCCTGTAGCA ATGGCAACAA CGTTGCGCAA 701 ACTATTAACT GGCGAACTAC TTACTCTAGC TTCCCGGCAA CAATTAATAG 751 ACTGGATGGA GGCGGATAAA GTTGCAGGAC CACTTCTGCG CTCGGCCCTT 801 CCGGCTGGCT GGTTTATTGC TGATAAATCT GGAGCCGGTG AGCGTGGGTC 851 TCGCGGTATC ATTGCAGCAC TGGGGCCAGA TGGTAAGCCC TCCCGTATCG 901 TAGTTATCTA CACGACGGGG AGTCAGGCAA CTATGGATGA ACGAAATAGA 951 CAGATCGCTG AGATAGGTGC CTCACTGATT AAGCATTGGT AACTGTCAGA 1001 CCAAGTTTAC TCATATATAC TTTAGATTGA TTTAAAACTT CATTTTTAAT 1051 TTAAAAGGAT CTAGGTGAAG ATCCTTTTTG ATAATCTCAT GACCAAAATC 1101 CCTTAACGTG AGTTTTCGTT CCACTGAGCG TCAGACCCCG TAGAAAAGAT 1151 CAAAGGATCT TCTTGAGATC CTTTTTTTCT GCGCGTAATC TGCTGCTTGC 1201 AAACAAAAAA ACCACCGCTA CCAGCGGTGG TTTGTTTGCC GGATCAAGAG 1251 CTACCAACTC TTTTTCCGAA GGTAACTGGC TTCAGCAGAG CGCAGATACC 1301 AAATACTGTT CTTCTAGTGT AGCCGTAGTT AGGCCACCAC TTCAAGAACT 1351 CTGTAGCACC GCCTACATAC CTCGCTCTGC TAATCCTGTT ACCAGTGGCT 1401 GCTGCCAGTG GCGATAAGTC GTGTCTTACC GGGTTGGACT CAAGACGATA 1451 GTTACCGGAT AAGGCGCAGC GGTCGGGCTG AACGGGGGGT TCGTGCACAC 1501 AGCCCAGCTT GGAGCGAACG ACCTACACCG AACTGAGATA CCTACAGCGT 1551 GAGCATTGAG AAAGCGCCAC GCTTCCCGAA GGGAGAAAGG CGGACAGGTA 1601 TCCGGTAAGC GGCAGGGTCG GAACAGGAGA GCGCACGAGG GAGCTTCCAG 1651 GGGGAAACGC CTGGTATCTT TATAGTCCTG TCGGGTTTCG CCACCTCTGA 1701 CTTGAGCGTC GATTTTTGTG ATGCTCGTCA GGGGGGCGGA GCCTATGGAA 1751 AAACGCCAGC AACGCGGCCT TTTTACGGTT CCTGGCCTTT TGCTGGCCTT 1801 TTGCTCACAT GTTCTTTCCT GCGTTATCCC CTGATTCTGT GGATAACCGT 1851 ATTACCGCCT TTGAGTGAGC TGATACCGCT CGCCGCAGCC GAACGACCGA 1901 GCGCAGCGAG TCAGTGAGCG AGGAAGCGGA AGAGCGCCCA ATACGCAAAC 1951 CGCCTCTCCC CGCGCGTTGG CCGATTCATT AATGCAGCTG GCACGACAGG 2001 TTTCCCGACT GGAAAGCGGG CAGTGAGCGC AACGCAATTA ATGTGAGTTA 2051 GCTCACTCAT TAGGCACCCC AGGCTTTACA CTTTATGCTT CCGGCTCGTA 2101 TGTTGTGTGG AATTGTGAGC GGATAACAAT TTCACACAGG AAACAGCTAT

ANHANG

128

2151 GACCATGATT ACGCCAAGCT CGAAATTAAC CCTCACTAAA GGGAACAAAA 2201 GCTGGTACGA GGACAGGCTG GAGCCATGGC TGGTGACCAC GTCGTGGAAT 2251 GCCTTCGAAT TCAGCACCTG CACATGGGAC GTCGACTCTA AGCTATGGTC 2301 TAGTGCCTGG GGCTACCCCT ACTTTATTGC CTCAGGAACA TTTTTGAGGA 2351 CATCATGTCT GTCTCTAAAT TCACAGAGGG ACTTAGCAGG GGCTGTCTGG 2401 AAGGGTTCAC CGGTGGCCTC TGCCCCTTAG AGGGAACCAA ATCTGGAAAG 2451 TGGGGGAGCC CCTTTCCCAG GCTCTTAGTA CCTCCCTCCT CCCCCGCCCA 2501 GAGCCCTCCT GGGGCTGCAT GAACTTTAGT CACCTGGTCA CAAGCCTGAC 2551 GCTGCGCCTC CTTGCGGCTG TGACGTCAGC GTTGACCATC CTCCCAGCCT 2601 ATCTGAACCT CTTACAGAGG ACTCCCTACC TCACACCCCA CTCAGAAGCC 2651 TTCAGATGCC CTTCTGGGAT GCTGGGCACC CCTTAGCTGA CCTCTTGCAG 2701 ATCTAAGCTT CCCAATTCCT GCAGCCCTCG ACCATGCCCA AGAAGAAGAG 2751 GAAGGTGTCC AATTTACTGA CCGTACACCA AAATTTGCCT GCATTACCGG 2801 TCGATGCAAC GAGTGATGAG GTTCGCAAGA ACCTGATGGA CATGTTCAGG 2851 GATCGCCAGG CGTTTTCTGA GCATACCTGG AAAATGCTTC TGTCCGTTTG 2901 CCGGTCGTGG GCGGCATGGT GCAAGTTGAA TAACCGGAAA TGGTTTCCCG 2951 CAGAACCTGA AGATGTTCGC GATTATCTTC TATATCTTCA GGCGCGCGGT 3001 CTGGCAGTAA AAACTATCCA GCAACATTTG GGCCAGCTAA ACATGCTTCA 3051 TCGTCGGTCC GGGCTGCCAC GACCAAGTGA CAGCAATGCT GTTTCACTGG 3101 TTATGCGGCG GATCCGAAAA GAAAACGTTG ATGCCGGTGA ACGTGCAAAA 3151 CAGGCTCTAG CGTTCGAACG CACTGATTTC GACCAGGTTC GTTCACTCAT 3201 GGAAAATAGC GATCGCTGCC AGGATATACG TAATCTGGCA TTTCTGGGGA 3251 TTGCTTATAA CACCCTGTTA CGTATAGCCG AAATTGCCAG GATCAGGGTT 3301 AAAGATATCT CACGTACTGA CGGTGGGAGA ATGTTAATCC ATATTGGCAG 3351 AACGAAAACG CTGGTTAGCA CCGCAGGTGT AGAGAAGGCA CTTAGCCTGG 3401 GGGTAACTAA ACTGGTCGAG CGATGGATTT CCGTCTCTGG TGTAGCTGAT 3451 GATCCGAATA ACTACCTGTT TTGCCGGGTC AGAAAAAATG GTGTTGCCGC 3501 GCCATCTGCC ACCAGCCAGC TATCAACTCG CGCCCTGGAA GGGATTTTTG 3551 AAGCAACTCA TCGATTGATT TACGGCGCTA AGGATGACTC TGGTCAGAGA 3601 TACCTGGCCT GGTCTGGACA CAGTGCCCGT GTCGGAGCCG CGCGAGATAT 3651 GGCCCGCGCT GGAGTTTCAA TACCGGAGAT CATGCAAGCT GGTGGCTGGA 3701 CCAATGTAAA TATTGTCATG AACTATATCC GTAACCTGGA TAGTGAAACA 3751 GGGGCAATGG TGCGCCTGCT GGAAGATGGC GATTAGCCAT TAACGCGTGG 3801 GGGATCCACT AGTTCTAGGG GCTCGAGGAA TTCTCTTTGT GAAGGAACCT 3851 TACTTCTGTG GTGTGACATA ATTGGACAAA CTACCTACAG AGATTTAAAG 3901 CTCTAAGGTA AATATAAAAT TTTTAAGTGT ATAATGTGTT AAACTACTGA 3951 TTCTAATTGT TTGTGTATTT TAGATTCCAA CCTATGGAAC TGATGAATGG 4001 GAGCAGTGGT GGAATGCCTT TAATGAGGAA AACCTGTTTT GCTCAGAAGA 4051 AATGCCATCT AGTGATGATG AGGCTACTGC TGACTCTCAA CATTCTACTC 4101 CTCCAAAAAA GAAGAGAAAG GTAGAAGACC CCAAGGACTT TCCTTCAGAA 4151 TTGCTAAGTT TTTTGAGTCA TGCTGTGTTT AGTAATAGAA CTCTTGCTTG 4201 CTTTGCTATT TACACCACAA AGGAAAAAGC TGCACTGCTA TACAAGAAAA 4251 TTATGGAAAA ATATTCTGTA ACCTTTATAA GTAGGCATAA CAGTTATAAT 4301 CATAACATAC TGTTTTTTCT TACTCCACAC AGGCATAGAG TGTCTGCTAT 4351 TAATAACTAT GCTCAAAAAT TGTGTACCTT TAGCTTTTTA ATTTGTAAAG 4401 GGGTTAATAA GGAATATTTG ATGTATAGTG CCTTGACTAG AGATCATAAT 4451 CAGCCATACC ACATTTGTAG AGGTTTTACT TGCTTTAAAA AACCTCCCAC 4501 ACCTCCCCCT GAACCTGAAA CATAAAATGA ATGCAATTGT TGTTGTTAAC 4551 TTGTTTATTG CAGCTTATAA TGGTTACAAA TAAAGCAATA GCATCACAAA 4601 TTTCACAAAT AAAGCATTTT TTTCACTGCA TTCTAGTTGT GGTTTGTCCA 4651 AACTCATCAA TGTATCTTAT CATGTCTGCA TCGATGGGTA CCGGTTGTTG 4701 ATCTATAGAT CATGAGTGGA GGAATGAGCT GGCCCTTAAT TTGGTTTTGC 4751 TTGTTTAAAT TATGATATCC AACTATGAAA CATTATCATA AAGCAATAGT 4801 AAAGAGCCTT CAGTAAAGAG CAGGCATTTA TCTAATCCCA CCCCACCCCC 4851 ACCCCCGTAG CTCCAATCCT TCCATTCAAA ATGTAGGTAC TCTGTTCTCA 4901 CCCTTCTTAA CAAAGTATGA CAGTAAAAAA CTTCCATTTT AGTGGACATC 4951 TTTATTGTTT AATAGATCAT CAATTTCTGC AGACTTACAG GATCCCCTCA

ANHANG

129

5001 GAAGAACTCG TCAAGAAGGC GATAGAAGGC GATGCGCTGC GAATCGGGAG 5051 CGGCGATACC GTAAAGCACG AGGAAGCGGT CAGCCCATTC GCCGCCAAGC 5101 TCTTCAGCAA TATCACGGGT AGCCAACGCT ATGTAATGAT AGCGGTCCGC 5151 CACACCCAGC CGGCCACAGT CGATGAATCC AGAAAAGCGG CCATTTTCCA 5201 CCATGATATT CGGCAAGCAG GCATCGCCAT GGGTCACGAC GAGATCCTCG 5251 CCGTCGGGCA TGCGCGCCTT GAGCCTGGCG AACAGTTCGG CTGGCGCGAG 5301 CCCCTGATGC TCTTCGTCCA GATCATCCTG ATCGACAAGA CCGGCTTCCA 5351 TCCGAGTACG TGCTCGCTCG ATGCGATGTT TCGCTTGGTG GTCGAATGGG 5401 CAGGTAGCCG GATCAAGCGT ATGCAGCCGC CGCATTGCAT CAGCCATGAT 5451 GGATACTTTC TCGGCAGGAG CAAGGTGAGA TGACAGGAGA TCCTGCCCCG 5501 GCACTTCGCC CAATAGCAGC CAGTCCCTTC CCGCTTCAGT GACAACGTCG 5551 AGCACAGCTG CGCAAGGAAC GCCCGTCGTG GCCAGCCACG ATAGCCGCGC 5601 TGCCTCGTCC TGCAGTTCAT TCAGGGCACC GGACAGGTCG GTCTTGACAA 5651 AAAGAACCGG GCGCCCCTGC GCTGACAGCC GGAACACGGC GGCATCAGAG 5701 CAGCCGATTG TCTGTTGTGC CCAGTCATAG CCGAATAGCC TCTCCACCCA 5751 AGCGGCCGGA GAACCTGCGT GCAATCCATC TTGTTCAATG GCCGATCCCA 5801 TATTGGCTGC AGGTCGAAAG GCCCGGAGAT GAGGAAGAGG AGAACAGCGC 5851 GGCAGACGTG CGCTTTTGAA GCGTGCAGAA TGCCGGGCTC CGGAGGACCT 5901 TCGCGCCCGC CCCGCCCCTG AGCCCGCCCC TGAGCCCGCC CCCGGACCCA 5951 CCCCTTCCCA GCCTCTGAGC CCAGAAAGCG AAGGAGCAAA GCTGCTATTG 6001 GCCGCTGCCC CAAAGGCCTA CCCGCTTCCA TTGCTCAGCG GTGCTGTCCA 6051 TCTGCACGAG ACTAGTGAGA CGTGCTACTT CCATTTGTCA CGTCCTGCAC 6101 GACGCGAGCT GCGGGGCGGG GGGGAACTTC CTGACTAGGG GAGGAGTAGA 6151 AGGTGGCGCG AAGGGGCCAC CAAAGAACGG AGCCGGTTGG CGCTACCGGT 6201 GGATGTGGAA TGTGTGCGAG GCCAGAGGCC ACTTGTGTAG CGCCAAGTGC 6251 CAGCGGGGCT GCTAAAGCGC ATGCTCCAGA CTGCCTTGGG AAAAGCGCCT 6301 CCCCTACCCG GTAGAATTCC AGTCTAGAAC GTTAGCCGGC TACGTATACT 6351 CCGGAATATT AATAGGCCTA GGATGCATAT GGCGGCCGCC TGCAGCTGGC 6401 GCCATCGATA CGCGTACGTC GCGACCGCGG ACATGTACAG AGCTCGAGAA 6451 GTACTAGTGG CCACGTGGGC CGTGCACCTT AAGCTTGCCT AATCGGACGA 6501 AAAAATGACC ATGATTACGC CAAGCTCCAA TTCGCCCTAT AGTGAGTCGT 6551 ATTACAATTC ACTGGCCGTC GTTTTACAAC GTCGTGACTG GGAAAACCCT 6601 GGCGTTACCC AACTTAATCG CCTTGCAGCA CATCCCCCTT TCGCCAGCTG 6651 GCGTAATAGC GAAGAGGCCC GCACCGATCG CCCTTCCCAA CAGTTGCGCA 6701 GCCTGAATGG CGAATGGGAC GCGCCCTGTA GCGGCGCATT AAGCGCGGCG 6751 GGTGTGGTGG TTACGCGCAG CGTGACCGCT ACACTTGCCA GCGCCCTAGC 6801 GCCCGCTCCT TTCGCTTTCT TCCCTTCCTT TCTCGCCACG TTCGCCGGCT 6851 TTCCCCGTCA AGCTCTAAAT CGGGGGCTCC CTTTAGGGTT CCGATTTAGT 6901 GCTTTACGGC ACCTCGACCC CAAAAAACTT GATTAGGGTG ATGGTTCACG 6951 TAGTGGGCCA TCGCCCTGAT AGACGGTTTT TCGCCCTTTG ACGTTGGAGT 7001 CCACGTTCTT TAATAGTGGA CTCTTGTTCC AAACTGGAAC AACACTCAAC 7051 CCTATCTCGG TCTATTCTTT TGATTTATAA GGGATTTTGC CGATTTCGGC 7101 CTATTGGTTA AAAAATGAGC TGATTTAACA AAAATTTAAC GCGAATTTTA 7151 ACAAAATATT AACGTTTACA ATTT

ANHANG

130

7.3.2 DNA-Sequenz der Sonde S1

1 AGATCTAAGC TTCCCAATTC CTGCAGCCCT CGACCATGCC CAAGAAGAAG 51 AGGAAGGTGT CCAATTTACT GACCGTACAC CAAAATTTGC CTGCATTACC 101 GGTCGATGCA ACGAGTGATG AGGTTCGCAA GAACCTGATG GACATGTTCA 151 GGGATCGCCA GGCGTTTTCT GAGCATACCT GGAAAATGCT TCTGTCCGTT 201 TGCCGGTCGT GGGCGGCATG GTGCAAGTTG AATAACCGGA AATGGTTTCC 251 CGCAGAACCT GAAGATGTTC GCGATTATCT TCTATATCTT CAGGCGCGCG 301 GTCTGGCAGT AAAAACTATC CAGCAACATT TGGGCCAGCT AAACATGCTT 351 CATCGTCGGT CCGGGCTGCC ACGACCAAGT GACAGCAATG CTGTTTCACT 401 GGTTATGCGG CGGATCCGAA AAGAAAACGT TGATGCCGGT GAACGTGCAA 451 AACAGGCTCT AGCGTTCGAA CGCACTGATT TCGACCAGGT TCGTTCACTC 501 ATGGAAAATA GCGATCGCTG CCAGGATATA CGTAATCTGG CATTTCTGGG 551 GATTGCTTAT AACACCCTGT TACGTATAGC CGAAATTGCC AGGATCAGGG 601 TTAAAGATAT CTCACGTACT GACGGTGGGA GAATGTTAAT CCATATTGGC 651 AGAACGAAAA CGCTGGTTAG CACCGCAGGT GTAGAGAAGG CACTTAGCCT 701 GGGGGTAACT AAACTGGTCG AGCGATGGAT TTCCGTCTCT GGTGTAGCTG 751 ATGATCCGAA TAACTACCTG TTTTGCCGGG TCAGAAAAAA TGGTGTTGCC 801 GCGCCATCTG CCACCAGCCA GCTATCAACT CGCGCCCTGG AAGGGATTTT 851 TGAAGCAACT CATCGATTGA TTTACGGCGC TAAGGATGAC TCTGGTCAGA 901 GATACCTGGC CTGGTCTGGA CACAGTGCCC GTGTCGGAGC CGCGCGAGAT 951 ATGGCCCGCG CTGGAGTTTC AATACCGGAG ATCATGCAAG CTGGTGGCTG 1001 GACCAATGTA AATATTGTCA TGAACTATAT CCGTAACCTG GATAGTGAAA 1051 CAGGGGCAAT GGTGCGCCTG CTGGAAGATG GCGATTAGCC ATTAACGCGT 1101 GGGGGATCCA CTAGTTCTAG GGGCTCGAGG AATTC

DANKSAGUNG

131

Danksagung

Bei Herrn Univ.-Prof. Dr. Hans-Joachim Galla möchte ich mich an dieser Stelle ganz herzlich

für die Betreuung meiner Promotionsarbeit bedanken.

Herrn Univ.-Prof. Dr. Jürgen Horst danke ich ganz herzlich für die Möglichkeit, im Institut für

Humangenetik meine Promotionsarbeit anfertigen zu dürfen. Seine stetige hilfreiche

Unterstützung und seine Diskussionsbereitschaft trugen sehr zum Erfolg dieser Arbeit bei.

Frau Univ.-Prof. Dr. Angelika Barnekow danke ich ganz herzlich für ihre Bereitschaft als

Prüferin tätig zu werden.

Bei Herrn Dr. Dr. Boris Skryabin möchte ich mich sehr herzlich für die Mikroinjektionen zur

Generierung transgener Tiere bedanken.

Ein großes Dankeschön gilt allen alten und neuen Mitarbeitern des Instituts für

Humangenetik, die durch ihre Zusammenarbeit zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen

haben.

Allen, die mich im Laufe der Zeit, in der diese Arbeit entstanden ist, begleitet haben, möchte

ich meinen Dank aussprechen.

Meiner Famille, die immer für mich da war, gebührt mein ganz besonderer Dank. Vor allem

danke ich meinem Mann, der mir stets hilfreich zur Seite stand und mich immerwährend

motiviert und begeistert hat. Schließlich möchte ich mich ganz besonders liebevoll bei

meinem Sohn Alex bedanken, dessen erstes Lebensjahr von der Fertigstellung dieser Arbeit

beeinflusst war und dem diese Arbeit gewidmet ist.

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