Biofilme - industrienahe Testmethoden 09112015 … · ^ Á ] d u ] o ] v ' U D À v í î U , r õ ì í ñ ^ X ' o o v U Á ] X Z ' µ Z ] o µ v P ] v , µ Z o P v

Swissatest Testmaterialien AG, Mövenstrasse 12, CH-9015 St. Gallen, swissatest.ch

Biofilm –Industrienahe TestmethodenCaroline AmbergSwissatest testmaterials ag, St. Gallen, Schweiz

Zürich, 11. November, 2015Kolb Kolloquium

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Inhalt

• Biofilme in Haushaltgeräten• Normen zu Biofilmuntersuchungen• Swissatest Testmethoden

• Biofilm Screening Test (Lab-scale Test)• Erfassung der Biofilmreduktion in der Waschmaschine• Biofilm-Wachstum in der Waschmaschine

• Relevanz und Grenzen der Tests• Zusammenfassung und Fazit

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Swissatest Testmaterialien AG, Mövenstrasse 12, CH-9015 St. Gallen, swissatest.ch 3 November 2015


• Wasser / Feuchtigkeit• Ablauf, Pumpe, Schläuche, Bottich, Trommel, Waschmittelschublade

• Temperaturen zwischen 4°C und 60°C• Niedrigtemperatur-Waschverfahren: 20°C bis 40°C

• Organische / Anorganische Nährstoffe• Schmutzbeladung der Wäsche• Kunststoffe / Gummiteile und Schläuche• Metalle / Legierungen (Drehkreuz)

• Ungenügende Keimreduktion• Waschmittel ohne Bleiche• Kurze Waschzyklen• Geringer Wasserverbrauch

Biofilmbildung in Waschmaschinen muss erwartet werden und lässt sich nicht vollständig verhindern

Biofilmbildung in Waschmaschinen


• Wasser / Feuchtigkeit• Sumpf, Filter, Ablauf, Ionenaustauscher, Pumpe, Schläuche, Gummidichtung,

• Temperaturen zwischen 4°C und 60°C• Höhere Temperaturen zwischen 50 und 75°C (Klarspülen)

• Organische / Anorganische Nährstoffe• Hoher Schmutzgehalt im Sumpf, Ablauf und Filter• Gummi / Schläuche

• Keimreduktion • Trends zu tieferen Temperaturen• Kürzere Spülzyklen• Wasserverbrauch

Wegen der feuchten Umgebung und der hohen Schmutzladung muss auch im Geschirrspüler mit Biofilmbildung gerechnet werden

Biofilmwachstum im Geschirrspüler

November 20155


Ist Biofilmbildung in Haushaltsgeräten ein Problem?

Ja, weil…• Geruchsproblem• Biokorrosion / Biofouling• Potentielles Gesundheitsrisiko:

• Infektionen• Unsichtbare Verbreitung von Antibiotika-Resistenzen


Geruchsbildung in Haushaltgeräten

Oktober 2015 7

• Biofilmbildung ist die Geruchsquelle• Dimethyl disulphide, 3-methyl-1-butanol, Isovaleriansäure und Isobutyric acid werden am häufigsten detektiert• Involvierte Mikroorganismen:

• Pseudomonas Stämme (P. aeruginosa, P. fluorescens, P. oleovorans, P. pseudoalcaligenes)• Staphylococcus Stämme (S. epidermidis, S. haemolyticus)• Micrococcus Stämme, • Shewanella putrefaciens• Brevundimonas sp.• Sphingobacterium sp.• Microbacterium sp.

Geruchsstoffe aus Waschmaschinen tragen zum Schlechtgeruch von Textilien bei Beanstandungen durch Kunden Im Geschirrspüler scheint das Geruchsthema weniger prominent

Source: Stapleton K et al. (2013). The potential impact of washing machines on laundry malodour generation. Letters in Applied Microbiology 56, 299-306.


Pathogene Keime in der Waschmaschine

Oktober 2015 8

Häufig nachgewiesene Mikroorganismen:• Pseudomonas aeruginosa• Staphylococcus sp. (S. epidermidis, S. haemolyticus)• Micrococcus sp.• Shewanella putrefaciens• Brevundimonas sp.• Sphingobacterium sp.• Microbacterium sp.• Fungi: Rhodotorula, Candida, Fusarium etc.

Resultate repräsentieren nicht zwingend die Realität im Biofilm! ca. 30% der isolierten Keime sind potentiell pathogen (Risikogruppe 2) Keimtransfer von Gerät auf Wäsche oder Geschirr Infektionsrisiko, stille Verbreitung von Antibiotika ResistenzenPseudomonas aeruginosa

Sources: Stapleton K et al. (2013). The potential impact of washing machines on laundry malodour generation. Letters in Applied Microbiology 56, 299-306.Gattlen J et al. (2010). Biofilms isolated from washing machines from three continents and their tolerance to a standard detergent. Biofouling, 26(8), 873-882.IFH report (2011).The infection risks associated with clothing and household linens in home and everyday life settings, and the role of laundry


Pathogene Keime im Geschirrspüler

October 2015 9

• Keine Studien über das Keimspektrum im Geschirrspüler vorhanden• Hitzeresistente Bakterien, Sporenbildner und Pilze• Isolierte Pilze (ca. 60% der beprobten Geschirrspüler enthalten Pilze):

• Aspergillus sp. • Candida sp.• Fusarium sp.• Penicillium sp.• Rhodotorula sp.• Black Yeast Exophiala (in 50% der Proben mit Pilzen)

Exophiala sp. (thermo-, pH- und salz tolerant Systemische Infektionen / Lungen Infektionsrisiko ist unklar Haushaltgeräte können Nischen für spezialisierte Mikroorganismen darstellen

Exophiala dermatitidisSources: Zalar et al. (2011). Dishwasher – A man-made ecological niche acoommodating human opportunistic fungal pathogens.Fungal Biology 115, 997-1007.Babic et al. (2015). Candida and Fusarium species known as opportunistic human pathogens from customer-accessible parts of reisdential washing machines. Fungal Biology 119, 95-113.Gostincar, Grube, Gunde-Cimerman (2015). Evolution of Fungal Pathogens in Domestic Environments? Fungal Biology 115, 1108-1018.


Inhalt• Biofilme in Haushaltgeräten• Normen zu Biofilmuntersuchungen• Swissatest Testmethoden



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Biofilm Probenahme und AnalytikProbenahme:Tupfer, Materialplättchen Direkte Untersuchungsmöglichkeiten: e.g. Microskopie, FTIR-Spectrometrie

Analytik:• Zellzahlen• Art der Species• Verteilung der Species im Biofilm• Biofilmstruktur• Biofilmmenge (Biomasse)• EPS-Menge• Viabilität• Vorkommen spezifischer Keime

Methode hängt vom Ziel der Untersuchung ab Einzelne Parameter alleine sind oft ungenügend und sagen wenig aus Ein natürlicher Biofilm ist eine hoch-komplexe Struktur. Die Wahl der richtigen Analysemethode und die Interpretation der Ergebnisse muss vorher gut durchdacht werden und zum Untersuchungsziel passen

November 201511


Biofilm StandardsASTM E2562_12: Standard Test Method for Quantification of Pseudomonasaeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC BiofilmReactorKultur und Probenahme eines standardisierten P. aeruginosa biofilm für verschiedensteAnwendungen. Massnahme zur Biofilm Entfernung kann im Reaktor oder nach Entnahme derBiofilm-Plättchen durchgeführt werden.Hohe Scherkräfte, stark haftender BiofilmBestimmung der Keimzahlen

ASTM_E2871_13: Standard Test Method for Evaluating Disinfectant Efficacy AgainstPseudomonas aeruginosa Biofilm Grown in CDC Biofilm Reactor Using Single TubeMethodKultur eines P. aeruginosa Biofilms nach dem Standard E2562_12. Desinfektionsmittelprüfung in50 ml RöhrchenBestimmung der Keimzahlen

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Biofilm StandardsASTM E2647_13: Standard Test Method for Quantification ofPseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow BiofilmReactor with Low Shear and Continuous Flow Kultur und Probenahme eines standardisierten P. aeruginosa Biofilms fürverschiedene Anwendungen. Massnahmen zur Biofilm-Entfernung können imReaktor oder extern nach Entnahme der Biofilm-Plättchen durchgeführtwerden Umgebung mit geringen Scherkräften, Biofilm haftet lose Bestimmung der Keimzahlen

ASTM E 2196_12: Standard Test Method for Quantification ofPseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with Medium Shear andContinuous Flow Using Rotating Disk Reactor Kultur und Probenahme eines standardisierten P. aeruginosa Biofilms fürunterschiedliche Anwendungen. Massnahmen zur Biofilmentfernung könnenim Reaktor oder extern nach Entnahme der Biofilm-Plättchen durchgeführtwerden Mittlere Scherkräfte, Biofilm haftet ‘mittel’ Bestimmung der Keimzahlen

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Biofilm StandardsASTM E2799_12: Standard Test Method for Testing Disinfectant Efficacy against Pseudomonas aeruginosaBiofilm using the MBEC Assay Desinfektionsmittelprüfung mit P. aeruginosa biofilm Nur Screening test Bestimmung der Keimzahl (quantitativ) oder der Optischen Dichte (qualitativ)

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Biofilm Screening test Lab scale Methode zur Erfassung der Biofilmentfernung oder Biofilmabnahme:• Wachstum eines jungen Biofilm (24 h)• Chemische Behandlung oder simulierter Wasch- / Reinigungsprozess• Erfassung der Biofilmmenge mit dem Kristallviolett-Assay (O’Toole, 2011) alternativ Keimzahlbestimmungen

Anwendungen: • Beschichtungen von Oberflächen• Gerätereinigungsmittel• Desinfektionsmittel• Bestimmen der wirksamsten Konzentrationen• Bestimmen der wirksamsten Waschbedingungen• Synergistische oder antagonistische EffekteVerschiedene Prüfvarianten stehen zur Verfügung


Biofilm Screening Test Pseudomonas aeruginosa

Microbial growth in the solution OD595

Simulated washing machine cleaning test

24 h incubation at 30°C in growth medium

4 h Incubation at 30°C in medium

Microbial growth in the solution OD595

Crystal violet assay

E. coliStaphylococcusaureus

Mixed biofilm

Quantification of growth in the suspension

Quantification of biofilm amount

Rinsing to remove planctonic cells

1) Growth of a young biofilm

2) Simulated washing test(s)

3) Biofilm quantification

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Prüfansätze / Wasserkontrolle Negativkontrolle (ohne Biofilm)

WM Reiniger A WM Reiniger BWM Reiniger C

Wasser-kontrolleChlor-bleiche (50g/L)

Aktive Inhaltsstoffe:A: Citric acid, Limonene, B: citric acidC: organische Säuren, BitrexChlorbleiche zum Vergleich

Prüfung von verschiedenen Waschmaschinen-Reinigern

Prüfbedingungen:-Hauptwaschen: 60°C 30 min bei 100U/min-2 Spülgänge à 10 min, RT


Prüfung von Waschmaschinen-Reinigern

-0,5000,0000,5001,0001,5002,0002,5003,0003,5004,000

mixed biofilm, WM cleaner A water control mixed biofilm, WM cleaner B chlorine (50g/L) mixed biofilm, WM cleaner CBiofilm

forma

tion CV

-assay a

t 550 n

mEin simulierte Waschversuch (Biofilm-Quantifizierung mit dem Kristallviolett-assay)

Single washing test:• Good efficiency to lower biofilm amount• No total removal of biofilm • Chlorine was more effective• No difference between the Cleaners

-0,5000,0000,5001,0001,5002,0002,5003,0003,5004,000

mixed biofilm, WM cleaner A water control mixed biofilm, WM cleaner B chlorine (50g/L) mixed biofilm, WM cleaner C

Biofilm

forma

tion CV

-assay a

t 550 n

m Biofilm prevention:• Good efficiency to lower biofilm amount• No total removal of biofilm (Chemistry and/or temperature are not sufficient)• Chlorine was more effective• Cleaner B was more effective in the long-term approach

‘Langzeit-Wirkung’ (Biofilm-Quantifizierung mit dem Kristallviolett-Assay)


Prüfung von Waschmitteln / Maschinenreinigern

Prüfansätze / Wasserkontrolle Negativkontrolle (ohne Biofilm)

Wasser-kontrolle IEC-A* WM Reiniger AFlüssig-Waschmittel WM-reiniger 1

Aktive Inhaltsstoffe:1: ?A: Citric acid, D-LimoneneB: citric acidIEC-A*: Bleichkomplex TAED - Perborat

WM Reiniger B Prüfbedingungen:-Hauptwaschen: 60°C 30 min bei 100U/min-2 Spülgänge à 10 min, RT


Prüfung von Waschmittel-Reinigern /

21

503000126000

977

6500014900

154

1

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100

1000

10000

100000

1000000

H2O control liquid color detergent IEC-A* washing machinecleaner 1 washing machinecleaner A washing machinecleaner B

arith m

ean of

microb

ial coun

ts per 5

ul

detergent / washing machine cleaner

Microbial counts (Biofilm) in lab scale test Ein simulierter Waschversuch (Keimzahlbestimmung)

Bessere Differenzierung zwischen den Produkten mit der Keimzahlbestimmung Reiniger B entfernt am meisten Biofilm (Inaktivierung von Keimen) und ist sogar effizienter als IEC-A*


Biofilm Entfernung in der Waschmaschine

Biofilm Entfernung in der Waschmaschine:• Biofilm mit drei Bakterienspecies (E. coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa) auf Polypropylen-Plättchen• Bestimmung der Biofilm-Entfernung durch Erfassung der Keimzahlen auf den Plättchen vor / nach der Wäsche

Anwendungen:• Erfassung der Biofilm Entfernung in einem einzelnen Waschprozess• Vergleichende Prüfung (Prozess ohne WM / Flüssigwaschmittel)• Synergistischer Effekt der Mechanik, Wasser, Chemie und Temperatur

Biofilmentfernung in einem Gerätereinigungszyklus Wirksamkeit von Waschmitteln / Bleiche / Additive Übertragung von Biofilmkeimen auf die gewaschene Wäsche


Biofilm Entfernung in der WaschmaschinePseudomonas aeruginosa

Koch-/Buntwäsche60°C, kurzNo detergent, liquid detergent, IEC-A*, verschiedene Waschmaschinen-Reiniger

24 h incubation at 30°C in growth medium

Suspension wird weiter analysiert

E. coliStaphylococcusaureusMicrobial counts of mixed biofilms before washing cycle

Microbial counts of mixed biofilms on carrier after washing cycle

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Biofilm wird vom Plättchen abgelöst (Ultraschall, Vortex)


Port 1: Bottich, mittlere Höhe

Port 2: Bottich, unten beim Sumpf

Port 3: Bottich hinten oben

Biofilm Ports zum Einsetzen der Biofilme in die Waschmaschine


Biofilmentfernung in der Waschmaschine (60°C)

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Unterschiede zwischen den Produkten sind in der Waschmaschine kleiner als im lab-scale test (tiefe Keimzahlen und grössere Standardabweichungen) Bleiche haltiges Pulverwaschmittel ist bei 60°C bereits sehr effektiv gegenüber Biofilm Gewisse Gerätereiniger sind weniger effektiv gegenüber Biofilm als IEC-A* (im lab-scale test und in der Waschmaschine)

1945,33

86,92

9,92 9,0018,50

9,00

1,0

10,0

100,0

1000,0

10000,0

H2O control liquid color detergent IEC-A* washing machinecleaner 1 washing machinecleaner A washing machinecleaner B

arithm

. mean

micro

bial cou

nts KBE

/coupo

n

detergent / Washing machine cleaner

Microbial counts (biofilm) in washing machine


Transferrate von Biofilmkeimen auf die WäscheTransfer rates from washing machine biofilm bacteria to Cotton

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kleine Transferraten (ca. 200 Keime / Textilträger) ohne Waschmittel Unterschiede zwischen Baumwolle und Polyester Unterschiede zwischen den Keimen


Biofilm Wachstum TestBiofilm Wachstum Test:• Testdauer > 12 Wochen• 2 Waschzyklen pro Woche• Zugabe von Prüfkeimen / Erdsuspension / ohne Zugabe von Keimen• ‘Schlechte’ Consumer-Gewohnheiten werden simuliert: Schmutzbeladung, Niedrigtemperaturwaschverfahren, etc.

Anwendungen:• Regelmässige Anwendung eines Produktes oder Gerätereinigungszyklus wird simuliert im Vergleich zu einem Geräte ohne Anwendung des Produktes / Reinigungszyklus• Nach dem Versuch werden Waschmaschinen auseinander-genommen und der Biofilm an verschiedenen Probenahme-stellen charakterisiert

• Visuell: sauber / Ablagerungen• Biofilm Menge: Protein-, Polysaccharide Menge, Keimzahlen und Keimspektrum


1 1

2

6

11

15

3

4

5a5b

6

7a7b

1012a/b

Probenahmeorte


ProbenahmeorteWaschmaschine A

Waschmaschine B

Waschbedingungen:- 30°C Koch / Buntwäsche- 400 U/min- Flüssigwaschmittel mit tiefer Dosierung- 50% Beladung (Baumwolle)- Schmutzbeladung: 10 g/kg Kapazität- Maschine bleibt nach dem Waschprozess 24 h geschlossen


Sampling Locations

Waschmaschine A

Waschmaschine B


PROBENAHMEORTE BESCHREIBUNG BIOFILM-BILDUNG WM 1

BIOFILM-BILDUNG WM 2

BIOFILM-BILDUNG WM 3

1 Trommel aussen 6 8 92 Trommel aussen, Rückseite, unter Drehkreuz 6 14 83 Bottich, unten bei Ablauf 6 8 144 Bottich, unten, bei Heizung 7 12 135A Bottich, Rückwand 9 10 116 Drehkreuz 7 13 87A Türdichtung, unten 10 9 107B Türdichtung, seitlich auf Höhe der Wasserlinie 6 68A Waschmittelschublade, Hauptwaschgangfach 5 7 48B Einspülkasten 5 5 48C Einschubkasten, Ablauf Weichspüler 79 Wasserabfluss-rohr 5 9 810 Faltenbalg (Einschubkasten – Trommel) 7 6 1011 Trommel, Aussenseite vorne 5 8 712A Faltenbalg bei Ablauf 10 11 1412B Faltenbalg Kugelventil 713 Bottich Schweissnaht 1213 Schlauch Pumpe zur Türdichtung 614 Entlüftung Trommel / Schaumsensor 7 3 515 Steg 7 9 916 Flusensieb 5 10 1217 Wasserzulaufschlauch 6 6 818 Wasser aus dem Flusensieb 7 10 1019 Türglas 6 11 920 Pumpe 7 8 7

MITTELWERT PRO PROBENAHMEORT 6.7 9 8.7

Qualitative Beurteilung pro Probeort beinhaltet:- Gesamtkeimzahl- Schimmelpilze- Pseudomonas aeruginosa- Proteinmenge- Polysaccharid-menge- visuelle Beurteilung

Interessant: Obwohl Wasserqualität, Schmutzbeladung und Waschbedingungen ähnlich waren, haben sichunterschiedliche Keimspektren in den Waschmaschinen etabliert (Materialien, Geräteprüfung)


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Relevanz und Grenzen der TestsRelevanz / Vorteile GrenzenBiofilm Screening test ist flexible nutzbar: • Testkeime (single strains oder mixed-species biofilm)• Einzelne oder mehrere Waschzyklen können simuliert werden• Wiederaufwachsen von Biofilm nach einer Reinigung / Waschzyklus kann simuliert werden• Pseudomonas aeruginosa ist ein Problemkeim in wasserführenden Systemen und deshalb nicht nur für Haushaltgeräte relevant• Viele verschiedene Bedingungen können parallel geprüft werden

Modell-systemAnalytik begrenzt die UntersuchungJe nach Anwendung kommen sehr spezifische Keime zur AnwendungMechanik kann nicht richtig simuliert werden

Biofilm Entfernung in der Waschmaschine:• In situ test• Alle Einflussfaktoren werden berücksichtigt• Entspricht fast der realen Situation

Weniger gut reproduzierbarSehr spezifische UntersuchungVergleichende PrüfungBiofilm-Anzucht beeinflusst ResultatAnalytik begrenzt ResultatBiofilm Wachstumstest:• Gerätebeurteilung und vergleich• Materialbeurteilung• Worst-case szenario wird simuliert

KonstruktionsunterschiedeDatenmenge Beurteilung ist eine HerausforderungAnalytik begrenzt Resultat


Zusammenfassung und Fazit• Biofilme in Haushaltgeräte stellen hauptsächlich ein Geruchsproblem dar. Das Gesundheitsrisiko ist noch unklar. • Verschiedene Biofilmnormen bestehen, die hauptsächlich die Produktion von reproduzierbaren Biofilmen beschreiben. Pseudomonas aeruginosa als einziger Biofilmkeim.• Eine Norm (ASTM E2799_12: ) beschreibt eine Testmethode für die Prüfung von Desinfektionsmittel gegenüber Pseudomonas aeruginosaBiofilmen• Verschiedene Testmethoden für Biofilm-Untersuchungen wurden von Swissatest entwickelt. • Biofilm Screening test für Auswahl und Optimierung von aktiven Inhaltsstoffen und Formulierungen, sowie systematische Untersuchungen• Biofilm Entfernung in der Waschmaschine für die Beurteilung von Produkten und / oder Gerätereinigungszyklen• Biofilm Wachstum Test für die Beurteilung von Geräten und Materialien


Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit

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