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Biologische Grundlagen

©Silke Trißl, April 2005

25.04.2005: Silke Trißl, Proseminar 'Klassische Algorithmen in der Bioinformatik' 2

Überblick – Biologie

n Organismenn Aufbau von Zellen

– Prokaryoten und Eukaryotenn Genom und DNAn Transkription

– DNA → RNA → Proteinn Proteinen Regulatorische und metabolische Netzwerken Human Genome Project

n 2. Teil: Überblick – Techniken


Orgainsmen

Ursprünglicher Organismus

Protozoa(Einzeller) Tiere

Algen

EukaryotenProkaryoten

gram pos.Bakterien

Cyano-bakterien

Archaea

halophilMethano-bakterien

PflanzenPilze


Beispiele

n Escherichia coli– Bakterium (Prokaryot)– lebt im Darmtrakt von

Tieren und Menschen– Modellorganismus der

Biologie

n Saccharomyces cereviciae– Eukaryot– Bäckerhefe– bildet Sporen

1µm5µm


Größen in der Biologie


Aufbau von Zellen

n Prokaryoten– Ringförmiges Genom– kann Plasmide enthalten

n tragen auch Informationen (DNA)

n wichtig für das Klonieren

n Eukaryoten– Genom im Zellkern– besitzt noch weitere

Kompartementen Golgi-Apparat (Transport)n Mitochondrien (Energie)n Lysosom (Verdauung)


Funktion der DNA

n DNA: Träger von Erbinformationen– Codiert für funktionelle Produkte wie Proteine oder RNA

n Genom: Gesamtheit der DNA in einer Zelle– Sprich: alle Gene in einer Zelle

n Millionenfach kopiert– Ohne wesentliche Veränderung– Wird an Tochterzellen weitergegeben


Jahrestag

n 25.04.1953– James Watson, Francis Crick– „Molecular Structure of Nucleic Acids“– Nature, 1 Seite– „This structure has two helical chains

each coiled around the same axis“n Basiert auf Arbeiten von Wilkins &

Franklin n Nobelpreis 1962

– „for their discoveries concerning themolecular structure of nucleic acids and its significance for information transfer in living material“


Struktur der DNA

n DNA – Desoxyribonucleic acidn Doppelsträngig

– Komplementäre Basenn Adenin – Thymin (A – T)n Guanin – Cytosin (G – C)

n Allgemeiner Aufbau– Zuckerphosphat-Gerüst– Basen

n Besitzt Richtung– 5‘ → 3‘ (sprich: drei-Strich)

n Windet sich um sich selbst


DNA

n Grundbausteine– Phosphatgruppe– Zucker (Desoxyribose)– Base

n 5‘-Ende: Phosphatn 3‘-Ende: Desoxyribose

(Hydroxylgruppe)

5‘

3‘


5 Basen

n Purinbasen– Adenin, Guanin

n Pyrimidinbasen– Thymin (Uracil), Cytosin

n Wasserstoffbrücken– halten beide Stränge

zusammen– 2 zwischen A – T – 3 zwischen G – C


DNA Replikation

n Mitose: Zellverdoppelungn Meiose: geschlechtliche Teilung

n Schritte der Replikation– Auftrennen des Doppelstrangs– Anlagerung eines RNA Primers– Synthese des komplementären

Strangs von 5‘ → 3‘n durch DNA Polymerase


Von der DNA zum Protein

n Transkription– Abschreiben– DNA → m(essenger)RNA– DNA ↔ RNA

n Doppel- ↔ einzelsträngign Thymin (T) ↔ Uracil (U)n Desoxyribose ↔ Ribose

n Translation– Übersetzen– mRNA → Protein– RNA ↔ Protein

n 3 Basen → 1 Aminosäuren Σ = 4 ↔ Σ = 20 „Central Dogma in Molecular Biology“


Gen

n Abschnitt auf dem Genom– Vorlage zur Herstellung eines funktionellen Produkts

n Nur RNA oder weiter zum Protein

– Alle direkt daran beteiligten Sequenzenn 5‘ UTR, 3‘ UTR (Untranslatierte Region)

n Aber: Nur der Abschnitt zwischen Start- und Stopcodonwird in mRNA übersetzt

5‘

5‘

3‘

3‘

Enhancer Promotor

Startcodon Stopcodon

Vorlage für Primärtranskript

5‘ UTR 3‘ UTR

TATA

Intron Exon


Transkription

n DNA → primäre mRNA– Durch RNA Polymerase

n Präprozessierung– poly-A-Schwanz am 3‘ Ende– ‚Cap‘-Struktur am 5‘ Ende– Entfernen der Introns und

zusammenfügen der Exonsn alternatives Splicen

– Unterschiedliche Exons können kombiniert werden

– Ergibt Proteine mit unterschiedlicher Funktion

n Transport der mRNA ins Cytoplasma

Nur bei Eukaryoten


Translation

n Übersetzung – Nukleotidsequenz der mRNA– zu Aminosäuresequenz der Proteine

n Je 3 Basen (Codon) codieren für 1 Aminosäure

n Wie viele mögliche Kombinationen?– Triplett → 3 Stellen– 4 mögliche Buchstaben (A, T (U), G, C)– 43 = 64 mögliche Kombinationen– Aber nur 20 Aminosäuren

n Redundanz im genetischen Code


Aminosäuren

n 20 verschiedene Aminosäuren– Hydrophil (wasserliebend)– Hydrophob (wasserabstoßend)– Sauer (geladen, hydrophil)– Basisch (geladen, hydrophil)

n Redundanz im Genetischen Code

n Base Nr. 3: wobble– Kann häufig ausgetauscht

werden ohne Konsequenzen

hydrophil hydrophob sauer basisch


Redundanz im Code

Org1: AUU AGU UGG GAU AAA UUA GCUOrg2: AUA UCU UGG GAC AAG CUG GCCOrg3: AUC UCU UGG GAU AAG CUU GCGOrg4: AUU AGC UGG GAC AAA CUC GCAOrg5: AUC UCC UGG GAU AAG UUG GCU

Protein: Ile Ser Trp Asp Lys Leu Ala


Proteine Grundgerüst

n Synthese erfolgt am Ribosom– tRNA

n Besitzt Anticodonn Hat Aminosäure

n Einzelne Aminosäuren durch Peptidbindung verbunden– kovalente Verbindung

n Abfolge an Aminosäuren= Primärstruktur

mRNA

Ribosom

Anti-codon

Amino-säure

tRNA


Sekundärstruktur von Proteinen

n a-Helix– Wasserstoffbrücken

n ß-Faltblatt– Wasserstoffbrücken


Tertiärstruktur

n Tertiärstruktur: Räumliche Anordnung der Sekundärstrukturelemente

1b71 aus Protein Data Bank


Tertiärstruktur - Kräfte

n Wechselwirkungen zwischen Teilen der Proteinkette

n Disulfidbrücken– kovalente Bindung– sehr stabil E=380 kJ/mol

n Wasserstoffbrücken– sehr häufig E=4 kJ/mol

n Ionenbindung– E=12.5 kJ/mol

n Van-der-Waals– allgemeine Interaktion

zwischen Atomen– E=0,4 kJ/mol

n Hydrophobe Interaktion– Abstoßung vom Wasser


Quartärstruktur

n Anordnung von mehreren Proteinkettenn Beispiel – Hämoglobin

– Besteht aus 4 Ketten– Wichtig für den Sauerstofftransport im Blut


Mutationen in DNA – Auswirkungen

n Stille Mutation – keine Auswirkung auf Protein

n Echte Mutation– Ersetzen von Aminosäuren

n durch Ähnliche– keine Auswirkung auf Struktur– keine Auswirkung auf Funktion

n durch ‚Unähnliche‘– Auswirkung auf Struktur– Verlust / Verbesserung der Funktion


Proteinfunktionen

n Struktur– Zellwand, Membrane, Zellkern, Organellen, …

n Signaltransduktion– Signalerkennung (von Außen), Transduktion, intrazelluläre

Reaktion, …

n Metabolismus– Atmung, Energieproduktion, Nährstoffumwandlung, Abbau von

chem. Substanzen, …

n Housekeeping– Proteinsynthese und -abbau, DNA Verdopplung, Zellzyklus, ...

n Transport– mRNA vom Zellkern zum Ribosom, Proteine vom Ribosome zur

Zellwand, …


Regulatorische Netzwerke

n Einflüsse regulieren die Transkription von Genen– Äußere (Chemische Stoffe, Temperaturen, Strahlung)– Innere (Stoffwechselprodukte)

n Gene haben einen unterschiedlich hohenExpressionslevel– Menge an vorhandener

mRNA– Ändert sich über Zeit

und Zellart


Metabolische Netzwerke

n Glykolyse– Umwandlung von Glukose

zu Pyruvat unter Engergiegewinnung

n Start-, Zwischen- und Endprodukte regulieren auch die Transkription


Human Genome Project

n Begonnen 1986– Geplante Fertigstellung 2005 – Ziel: Finden aller Gene des Menschen

n Weltweite Kollaboration– 20 große Institutionen– In Deutschland: seit 1996 etwas 60 Mbp

n Fertiggestellt– Draft im Jahr 2000: (90% draft, 30% finished, 99.99%

accuracy)– Beinahe fertig 2001 (analyzed draft)– Wirklich fertig 2003


Menschliche Genom

n Menschen – Homo sapiens– ~ 3.100.000.000 bp (Basenpaare)

n Entspricht ~ 2 m DNA

– Verteilt auf n 22 Chromosomenn + 2 Geschlechtschromosomenn Länge: 50–250 Mbp

– ~ 25.000 Genen (war mal bei ~100.000)

– ~ 150.000 Proteine– ~ 500.000 Proteinformen


Menschliche Gene

n ~ 25.000 Gene– Niemand weis wirklich wie viele

n Länge zwischen 100bp und 2Mbp (Introns+Exons)n Durschschnittliche Länge der codierenden Region: 1400 bps

– Duchschnittl. Proteinlänge 447 Aminosäurenn Durschnittl. Gen hat 9 Exonsn Nur 3 % des menschlichen Genoms ist kodierend

– Rest: „junk“?– Viele Repeats, Transposons– Regulatorische Elemente– Pseudogene– Chromosomale Struktur: Zentromere und Telomere


Chromosome bei Eukaryoten

n Stark strukturiert während der Metaphase

– Doppelsträngige DNA– ‚Perlschnurform‘ des Chromatin– Chromatinfibrille– Fibrille wird weiter strukturiert– Chromosom


gatcaattatagttgacttcagtcctgcctgattcatctccaaaaatgtagtctgcctgattcatctcccaaaaatgtagctccgcttaaaggagctttcaagttgggggtggtgggccattcagtgttgtcactaacagatgcatcttgtgggggtaaaatgtcccaaagtatcttttcttgcttatgttcataagggcgctggtctggaatgtgccacatctgttctcactctgccatggactcctggaccctctgtgtgtccctttgtatcctggtagcgagtgagtcctcatgatttatcatcctcatgctgggcctctgtatagatga

Genomsequenzierung

n Jedes Chromosom isolierenn Chromosom in kleine Stücke brechenn Jedes Stück DNA sequenzierenn Die einzelnen Stücke zu einem zum Chromosom

zusammenfügen (Assembly)


DNA schneiden

n Restriktionsenzyme– Erkennen Sequenzabschnitte

auf der DNA– Schneiden an der Stelle

n Blunt (gerader Schnitt)n Sticky (überhängende Enden)

n Länge der Erkennungssequenz steuert die DNA Fragmentgröße– 4 Basen → 256 bp Fragmente– 6 Basen → 4,000 bp Fragmente– 8 Basen → 65,000 bp Fragmente


Chromosome zerschneiden

n Chromosom mit einem ‚rare Cutter‘ behandeln– Erkennungssequenz 8 bp

n Enzym- und DNA Konzentration steuern, so dass– Nicht alle Stellen schneiden– In jedem Strang andere Stellen

n DNA Stücke voneinander trennen– jedes einzeln in Zellen klonieren

schneiden

klonieren

Chromosom

DNA Stücke

Hefezellen


Chromosomen zerkleinern

n YAC – Yeast ArtificialChromosome– Enthält < 1.000.000 bp

chromosomale DNA– Je YAC nur einen Abschnitt

n BAC – Bacterial ArtificialChromosome– < 250.000 bp erneut

geschnittene DNA

n Plasmid– < 4.000 bp– Wird in Bakterien eingebracht


Klonieren mit Plasmiden

n DNA geschnitten mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen (REs)

n Ligation in vorbereiteten Vektor– DNA Ligase

n Vektor wird in Bakterienzelle gebracht– Typisch: E. coli

n Vektor = Plasmid– Bekannte Sequenz– Ebenfalls mit REs geschnitten– Trägt Antibiotikaresistenz

BamHI

EcoRI EcoRI

BamHIEcoRI

Antibiotika-resistenz

Vektor(Plasmid)

DNA

schneiden

Fragmente

ligieren


Klonieren – cont. –

n Jedes Bakterium nimmt nur ein Plasmid aufn Ausplattieren der Bakterien

– Auf Nährbodenn Agarn Nährstoffen Antibiotikum

n Inkubieren (wachsen lassen)– E. coli: 37 °C, über Nacht

n Jede einzelne Bakterie wächstzu einer sichtbaren Kolonie (Klon)– Nur Bakterien mit Plasmid können wachsen


Zur Erinnerung

n YACs und BACs so geschnitten, dass überlappende Stücke entstehen

schneiden

YAC1 YAC2 YAC3

YAC4YAC5

YAC6YAC7


Wie viele Klone?

n Theoretischer Wert– Überlappung von Klonen– Hohe Überdeckung notwendig (6 – 10-fach)

30001200075000Homo sapiens3.000 Mbp

1807204500Drosophila180 Mbp

YAC(1000 Kbp)

BAC(250 Kbp)

Cosmid(40 Kbp)


Contig Mapping

n Herstellung von vielen Klonen– Überlappende Klone– Redundanz

n Klone mit gleichen Fragmentenn Klone mit Teilfragmenten

n Finden der ‚wichtigsten Klone‘– Bearbeitung vom möglichst

wenigen Klonen– Aber: weiterhin Überlappung

n Überprüfung auf bekannte Sequenzen– PCR– Hybridisierung

bekannte Sequenzen

Array mit Klonen


PCR: Polymerase chain reaction

n Vervielfältigen von DNA– in vitro (im Reagenzglas)– Ausgehend von einer Vorlage

n PCR benötigt– DNA Template (doppelsträngig)– 2 DNA Primer

n Einzelsträngign Komplementär zu einer bekannten Sequenzn Zwischen 15 und 25 Nukleotide lang

– DNA Polymerase– dNTP‘s (Desoyxnukleotide)

n dATP, dCTP, dGTP, dTTP


PCR – Ablauf

Denaturieren– Auftrennen des Doppelstrangs

Annealen– Anlagern der Primer an komplementäre DNA (~ 55 °C)

Elongation– Verlängern des Strangs durch DNA Polymerase

n Vervielfältigung– 1. Zyklus: 2 Doppelstr.– 2. Zyklus: 4 Doppelstr.– …– 20. Zyklus: 1.000.000

1 2 3

95

72

55

T(°C)

t

1

2

3


Länge von DNA bestimmen

n DNA Negativ geladen– Wandert im elektrischen Feld zum

Pluspol

n Agarose Gel– Hoch vernetzt– Hindert DNA am wandern

n Kurze kommen eher durch als lange DNA Stücke

n DNA wird auf Gel aufgetragen und sichtbar gemacht

n Länge: Vergleich gegen Standard

-

+


Länge von DNA bestimmen

50

200

400

800

1500

n DNA Negativ geladen– Wandert im elektrischen Feld zum

Pluspol

n Agarose Gel– Hoch vernetzt– Hindert DNA am wandern

n Kurze kommen eher durch als lange DNA Stücke

n DNA wird auf Gel aufgetragen und sichtbar gemacht

n Länge: Vergleich gegen Standard


DNA Sequenzierung (nach Sanger)

n Abfolge von Basen in DNA Sequenz lesenn Sequenzierreaktion (basiert auf PCR) mit

– DNA Template (doppelsträngig)– 1 Primer– DNA Polymerase– dNTP‘s– ddNTP‘s (Didesoxynukleotide)

n Brechen Kettenverlängerung abn Sind markiert

– Früher: radioaktiv– Heute: fluoreszent (1 Farbstoff je Base)


DNA Sequenzierung – cont. –

n PCR ergibt DNA Stücke mit unterschiedlicher Länge– Markiert

n Werden über ein Acrylamid-Gel aufgetrennt-

+ Laser


DNA Sequenzierung – cont –

n Markierten Basen werden durch Laser detektiert– Ergibt 4 Tracefiles (Für jede Base eines)

n Tracefiles werden zum Chromatogrammzusammengesetzt– Leseweite ~ 500 bp


Großer Fortschritt

n Früher:– Radioaktiv– Handarbeit

n Heute:– 4 Floureszensfarbstoffe– vollautomatisch


Assembly

n Wir haben jetzt sequenzierte Stücke DNA– ~ 500 bp groß– Überlappend

n Wir wissen, sie kommen aus einem BAC, bzw. einem YAC

n Algorithmisches Problem: Sequence assembly– setze die 500 bp großen Stücke wieder zu einem BAC

bzw. YAC zusammen

n Aber: nicht überall funktioniert diese Strategie– Chromosome walking


Auswirkungen vom HGP

n Datenflut– Datenbanken & Bioinformatik

n Datenbasis für Finden von Genen– Alle Gene finden– Zusammenwirken von Genen erkennen– Erkennen von Genen, die mit Erbkrankheiten in

Verbindung stehen

n Erkenntnis über ähnliche/gleiche Gene in anderen Organismen– Experimente mit Modellorganismen

n Maus, Hefe, E. coli


Finden von Genen

n Aus einem Gen entsteht ein funktionelles Produkt (Protein)– mRNA muß existieren

n mRNA durch reverse Transkription in cDNAumschreiben– poly-T Primer– cDNA klonieren und sequenzieren

AAAAACAP5‘ 3‘

5‘TTTTT3‘


Expressionslevel von Genen

n Microarrays– enthält kurze Abschnitte von bekannten Genen– 30.000 – 100.000 Spots (Proben) pro Array– jeder Spot enthält mehrere Kopien

Array mit DNA Proben


Microarray-Experiment

n mRNA in cDNA umschreiben– von gesunden und kranken Zellen– cDNA dabei markieren (fluoreszent)

n cDNA auf Chip auftragen und hybridisieren– cDNA Stücke an Proben binden

n restliche cDNA abwaschenn Messen der Intensität je Spot

– Vergleichn Gesund – Krank


Ergebnis von Microarray-Experimenten

n Image mit Intensitäten für jede Probe– Rot: Kontrolle– Grün: Sample

n Interpretation der Ergebnisse– Vergleich von

vielen Patienten– Vergleich von

Genen


Fragen?

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