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GEORG SCHENDZIELORZ, STEPHAN BINDER, JAN MARIENHAGEN

INSTITUT FÜR BIO- UND GEOWISSENSCHAFTEN, IBG-1: SYSTEMISCHE

MIKROBIOLOGIE, FORSCHUNGSZENTRUM JÜLICH GMBH

Microbial strain development for the biotechnological production of smallmolecules is time-consuming and laborious. This can be attributed to thefact that increased product formation usually does not confer a pheno-type, which would allow interfacing with high-throughput screening technologies. Recently, advances were made in the construction ofbiosensors for detecting small molecules at the single cell level and firstexamples for their application in combination with FACS demonstrate thepotential of such biosensors for microbial strain development.

10.1007/s12268-014-0429-y© Springer-Verlag 2014

ó Viele Güter unseres täglichen Lebens, wiez. B. Kunststoffe, Pharmazeutika, Feinchemi-kalien oder Lebensmittelzusatzstoffe, werdenheute energieintensiv auf Basis von Erdöldurch chemische Synthesen produziert. Ange-sichts immer knapper werdender Erdölres-sourcen und einer rasant wachsenden Welt-bevölkerung müssen neue Wege gefundenwerden, diese Produkte herzustellen. Der Ein-satz von Mikroorganismen in der industriel-len Biotechnologie bietet schon heute in vie-len Fällen eine Alternative zur chemischenSynthese und erlaubt die umweltschonendeProduktion wichtiger chemischer Grundbau-

steine auf Basis nachwachsender Rohstoffe.So werden beispielsweise mit Corynebacte-rium glutamicum, als einem der bedeutend-sten Mikroorganismen der industriellen Bio-technologie, jährlich etwa 2,6 Millionen Ton-nen Glutamat und 2,1 Millionen Tonnen Lysinproduziert [1].

Schlüssel für die mikrobielle Produktionsind leistungsfähige Stämme, deren effizien-te Umsetzung der Substrate zum biotechno-logischen Produkt maßgeblich die Rentabi-lität eines biotechnologischen Prozessesbeeinflusst. Bei der sehr langwierigen Ent-wicklung solcher effizienten Hochleistungs-stämme müssen geeignete Produzenten oftaus sehr großen Bibliotheken genetisch unter-schiedlicher Varianten isoliert werden. Diedazu verwendeten konventionellen Verfah-ren für ein produktorientiertes Screeningerfordern eine individuelle Kultivierung ein-zelner Stammvarianten und die Quantifizie-rung des gewünschten Produktes, meistmittels chromatographischer Methoden.Selbst modernste automatisierte Systeme kön-nen auf diese Weise lediglich wenige Hundert verschiedene Stämme pro Tag analysieren(Abb. 1, [2]). Bereits kleine Stammbibliothe-ken von lediglich 100.000 Varianten lassensich folglich nur mit großem zeitlichen undfinanziellen Aufwand nach dem besten Pro-

duzenten durchsuchen. Um diese Limitierungzu überwinden, sind neue Verfahren not-wendig, welche die Hochdurchsatzanalysemikrobieller Produktionsstämme möglichstohne Kultivierung und aufwendige Analytikerlauben.

Den derzeit höchstmöglichen Durchsatz vonbis zu 50.000 Zellen pro Sekunde ermög-lichen durchflusszytometrische Methodenwie z. B. das fluorescence activated cell sor-ting (FACS). Dabei wird eine Zellsuspension ineinem feinen Flüssigkeitsstrahl fokussiertund durch Tröpfchenbildung zunächst eineVereinzelung der Zellen erreicht. Anhand vonLichtstreuung und Fluoreszenz nach Anre-gung durch Laserlicht werden die Tropfen mitden Einzelzellen sortiert. Wichtige Voraus-setzung für den Einsatz von FACS in derStammentwicklung ist allerdings, dass dieintrazelluläre Produktkonzentration an einoptisches Signal gekoppelt werden kann, dasdann wiederum zur Selektion der produktivenZellen dient. Da biotechnologisch interessanteProdukte aber in der Regel farblos und nicht-fluoreszierend sind, wurde FACS bislang nurselten für die Stammentwicklung eingesetzt.

Konstruktion von BiosensorenErst in Verbindung mit Biosensoren, die dieintrazelluläre Konzentration biotechnologischrelevanter Substanzen in ein Fluoreszenz-signal umwandeln, könnte sich FACS als leis-tungsstarke Standardmethode für die schnel-le Stammentwicklung etablieren. Hierfür gibtes nun erste Beispiele [3]. Die eingesetztenBiosensoren basieren auf Transkriptions -regulatoren, die im Zellmetabolismus dazudienen, physiologische Prozesse in Gegen-wart bestimmter Metaboliten durch Modula-tion der Genaktivität an wechselnde Umwelt-bedingungen anzupassen. Diese Kontrolle derGenexpression ist ein universelles Prinzip,und eine Vielzahl regulatorischer Proteineoder kleiner RNAs, die diese Aufgabe über-nehmen, ist bekannt. Setzt man die Produk-tion eines Autofluoreszenzproteins unter dieKontrolle eines solchen Transkriptionsregu-lators, wird die intrazelluläre Detektion eines

Metabolic Engineering im Hochdurchsatz

Biosensoren für die mikrobielle Stamm -entwicklung im Hochdurchsatzformat

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˚ Abb. 1: Vergleich des maximalen Proben-durchsatzes unterschiedlicher Screening-Technologien in der mikrobiellen Stamment-wicklung.

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spezifischen Metaboliten durch Messung derFluoreszenz möglich.

Diesem Prinzip folgend wurde beispiels-weise der Biosensor pSenLys auf Basis desTranskriptionsregulators LysG für die basi-schen Aminosäuren Lysin, Arginin und His-tidin für C. glutamicum konstruiert (Abb. 2A).LysG aktiviert in Gegenwart erhöhter intra-zellulärer Konzentration von einer der dreiAminosäuren die Expression des Aminosäu-reexporters LysE. Durch eine transkriptio-nelle Fusion des lysE-Promotors mit demGen für das Autofluoreszenzprotein eYFP(enhanced yellow fluorescent protein), wird dieintrazelluläre Konzentration der basischenAminosäuren in ein optisches Signal umge-wandelt (Abb. 2B). Interessanterweise han-delt es sich bei der Fluoreszenzantwort nichtum eine einfache Ja/Nein-Antwort, da Kon-trollexperimente mit unterschiedlich gutenLysin produzenten zeigten, dass mit steigen-den intrazellulären Lysinkonzentrationenauch die Fluoreszenzintensität der Zellenzunimmt (Abb. 2C).

Nach einem ähnlichen Prinzip wurden wei-tere Biosensoren konstruiert, welche dieAkkumulation von Serin, O-Acetylserin,Methionin, Leucin, Isoleucin und Valin inC. glutamicum oder Arginin in Escherichia colidetektierbar machen [4, 5]. Darüber hinauswurde ein Biosensor entwickelt, der die intra-zelluläre Detektion des Kofaktors NADP+ aufEinzelzellebene erlaubt [6].

Biosensorbasiertes Screeningmittels FACSDas enorme Potenzial solcher Sensoren fürdie Stammentwicklung konnte durch dasScreening ungerichtet mutagenisierter C. glu-tamicum-Wildtypzellen auf Varianten mitgesteigerter Lysinbildung demonstriert wer-den (Abb. 3, [4]). Dazu wurden Zellen desWildtyps, die den Sensor pSenLys enthiel-ten und kein Übermaß an Lysin bilden,zunächst chemisch mutagenisiert und die dar-aus resultierende Bibliothek anschließendmittels FACS nach Zellen mit erhöhter Fluoreszenz durchsucht. In nur 30 Minutenkonnten 18 Millionen Zellen analysiert, und286 Zellen mit der höchsten Fluoreszenz aus-sortiert werden. Ein Rescreening mit chro-matographischer Analyse des Kulturüber-stands bestätigte die Lysin-Akkumulation dermeisten Varianten von teilweise über 30 Milli-molar. Durch eine Genomsequenzierung aus-gewählter Stämme konnten Mutationen inGenen identifiziert werden, deren positiverEffekt auf die Lysinproduktion bisher noch

unbekannt war. Ein Beispiel dafür ist dieMutation G81E im murE-Gen, das für einEnzym der Zellwandvorstufensynthesecodiert. Die Rekonstruktion dieser Mutationin etablierten Lysin-Produktionsstämmen vonC. glutamicum führte jeweils zu erheblichenSteigerungen des Lysin-Titers (Abb. 4, [4]).

Biosensoren und FACS können auchgenutzt werden, um Enzymbibliotheken invivo zu screenen [7]. Schlüsselenzyme derLysin-, Arginin- und Histidinsynthese inC. glutamicum werden durch hohe intrazel-luläre Konzentrationen der jeweiligen Ami-nosäure in ihrer Aktivität inhibiert (Feedback-Hemmung). Um diese unerwünschte Regula-

tion der Enzymaktivität in Stämmen für diebiotechnologische Aminosäureproduktion auf-zuheben, wurden die Gene für diese Enzymezunächst mutagenisiert und in C. glutamicum-Zellen mit dem Sensor pSenLys eingebracht.Mittels FACS wurden innerhalb wenigerMinuten mehrere Millionen Zellen dieserBibliotheken analysiert und stark fluoreszie-rende Zellen aussortiert. Nach Kultivierungund Analyse dieser Zellen bezüglich ihrer Pro-duktbildung wurden die erfolgreichen Gen-varianten sequenziert und zahlreiche bisherunbekannte Mutationen identifiziert, beidenen die Feedback-Inhibierung wie ge -wünscht aufgehoben war. Im Vergleich zum

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˚ Abb. 2: Funktionsweise von Biosensoren. A, Design und Prinzip des Lysin-Biosensors pSenLys.B, fluoreszenzmikroskopische Bilder von Sensorzellen des Corynebacterium glutamicum-Wildtyps(oben) und eines C. glutamicum-Lysinproduzenten (unten). C, Korrelation zwischen spezifischerFluoreszenz und intrazellulärer Lysinkonzentration bei unterschiedlichen Lysin-produzierendenC. glutamicum-Stämmen. D, FACS-Analyse von Sensorzellen des C. glutamicum-Wildtyps (oben)und eines C. glutamicum-Lysinproduzenten (unten).

A B C D

˚ Abb. 3: Arbeitsablauf beim FACS-Hochdurchsatz-Screening mikrobieller Produktionsstämmemit Biosensoren. Im ersten Schritt wird eine Bibliothek genetisch verschiedener Zellen generiert,die alle zusätzlich noch ein Plasmid mit einem Biosensor für den Zielmetaboliten tragen. Wenn die(zufällig) eingebrachten Mutationen in einigen wenigen Zellen zu einer erhöhten Bildung des Ziel-metaboliten führen, wird die erhöhte Metabolitkonzentration durch den spezifischen Biosensorregistriert und die jeweiligen Zellen zeigen Fluoreszenz. Die Bibliothek wird im zweiten Schrittmittels FACS bezüglich der Fluoreszenz auf Einzelzellebene analysiert, und die stark fluoreszieren-den Zellen werden aussortiert. Pro Stunde können bis zu 108 Zellen mittels FACS untersucht wer-den. Anschließend werden die aussortierten Zellen einzeln kultiviert und ihre Produktbildung ein-gehend analysiert. Die produktiven Stammvarianten werden dann sequenziert, um die zugrundeliegenden Mutationen zu identifizieren.

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Ausgangsstamm führten diese Enzymvarian-ten zu einer bis zu 80-fach erhöhten Amino-säurekonzentration im Kulturüberstand [7].

Darüber hinaus kann das biosensorbasier-te Hochdurchsatz-Screening mittels FACS inVerbindung mit molekularen Methoden zurgenetischen Manipulation bakterieller Geno-me auch für eine in vivo-Sättigungsmutage-nese einzelner Aminosäuren in essenziellen,Genom-codierten Proteinen eingesetzt wer-

den [8]. So wurde z. B. das Glycin an Position81 des essenziellen Gens murE im Genomgegen alle anderen 19 Aminosäuren durchrecombineering mit Oligonukleotiden ausge-tauscht. Durch ein sich anschließendes FACS-Screening dieser Bibliothek mit dem Biosen-sor pSenLys konnten zwölf neue murE-Vari-anten identifiziert werden, die zu einer erhöh-ten Lysinproduktion mit C. glutamicum führ-ten.

AusblickMikroorganismen besitzen eine enorme Viel-zahl von Transkriptionsregulatoren für bio-technologisch interessante Metaboliten, aufderen Basis Biosensoren konstruiert werdenkönnen. Darüber hinaus bieten die Metho-den des Protein Engineering die Möglichkeit,Biosensoren für ganz neue Zielmoleküle, wiez. B. Feinchemikalien oder Polymervorstufenzu entwickeln, für die es keine natürlichenTranskriptionsregulatoren gibt. Vonseitender biotechnologischen Industrie besteht gro-ßes Interesse an der Biosensor-Technologie,deren Weiterentwicklung zur Marktreife undKommerzialisierung von der Helmholtz-Gemeinschaft im Rahmen des Förderinstru-ments „Helmholtz Enterprise“ unterstütztwird.

DanksagungWir bedanken uns für die finanzielle Un -terstützung durch das BMBF-Projekt „Cory-nebacterium: improving flexibility and fit -ness for industrial production (FlexFit)“ unddurch die Helmholtz-Initiative „Synthetische Biologie“. ó

Literatur[1] Eggeling L, Bott M (Hrsg) (2005) Handbook ofCorynebacterium glutamicum. CRC-Press, Boca Raton[2] Dietrich JA, McKee AE, Keasling JD (2010) High-through-put metabolic engineering: advances in small-molecule scree-ning and selection. Annu Rev Biochem 79:563–590[3] Marcus S, Julia F, Lothar E et al. (2014) Looking for thepick of the bunch: high-throughput screening of producingmicroorganisms with biosensors. Curr Opin Biotechnol 26:148–154[4] Binder S, Schendzielorz G, Stäbler S et al. (2012) A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterialmetabolite producers at the single-cell level. Genome Biol 13:R40[5] Mustafi N, Grünberger A, Kohlheyer D et al. (2012) Thedevelopment and application of a single-cell biosensor for thedetection of l-methionine and branched-chain amino acids.Metab Eng 14:449–457[6] Siedler S, Schendzielorz G, Binder S et al. (2014) SoxR asa single-cell biosensor for NADPH-consuming enzymes inEscherichia coli. ACS Synth Biol 3:41–47[7] Schendzielorz G, Dippong M, Grünberger A et al. (2014)Taking control over control: use of product sensing in singlecells to remove flux control at key enzymes in biosynthesispathways. ACS Synth Biol 3:21–29[8] Binder S, Siedler S, Marienhagen J et al. (2013)Recombineering in Corynebacterium glutamicum combinedwith optical nanosensors: a general strategy for fast producerstrain generation. Nucleic Acids Res 41:6360–6369

Georg Schendzielorz, Stephan Binder undJan Marienhagen (v. l. n. r.)

Korrespondenzadresse:Dr. Jan MarienhagenForschungszentrum Jülich GmbHInstitut für Bio- und GeowissenschaftenIBG1: BiotechnologieD-52425 JülichTel.: 02461-61-2843Fax: 02461-61-2710j.marienhagen@fz-juelich.de

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˚ Abb. 4: Vergleich der extrazellulärenLysin-Akkumulation von fünf unterschied-lichen Corynebacterium glutamicum-Stäm-men vor (WT) und nach Einbau der mittelsbiosensorbasiertem FACS-Screening identi-fizierten Mutation murE (G81E).