Block: „Molekulare Zellbiologie von Immunzellen“ SS 2008

Referent: Marcell Louis

Ergebnispräsentation:

„Klonierung von Cytohesin-Mutanten“

Klonierung von Cytohesin-Mutanten:

E157K R281K V. a. zur Strukturaufklärungvon Proteinen

Einführung von Punktmutation in Cyh-1

PCR-Mutagense:

1. Schritt:

2. Schritt:

E157K 471bp 723bp

R281K 843bp 351bp

1,194 kb

(Splicing by Overlap-Extension)

Gelbilder der PCR-Mutagenese und SOEing-PCR:

E157K

351bp

R281K

843bp

723bp

471bp

Mutagenese:

SOEing:

E157K R281K

1194bp 1194bp

Daraufhin: Reinigung (CHCl3/Phenol) + Fällung

Marker

Marker

831947

564 1375

947

Verdau:

Restriktionsenzyme:MluI A/CGCGTNotI GC/GGCCGC

Cyh-1 (mutiert)

MluI NotI Kontrolle des Verdaus

Marker Verdaukontrollen

~ 1,2 kb

4,7 kb

Nach Verdau: Dephosphorylierung der 5‘-Enden verringert Religationswahrscheinlichkeit

Verdau-Kontrolle des Plamids:

Marker

Verdau-Kontrollen der Vektoren

Low-Melting-Gel erleichtert Isolierung der DNAIsolierung durch Exzision unter UV-Licht

4,2-4,9kb

Unverdauter Vektor

Vektor (verdaut)

4,7 kb

Ligation/Transformation/‘Minipräp‘:

Isolierte Insert- und Verktorstränge:

HitzeschockT4-DNA-Ligase

Ampicillin

Minipräparation

Testverdau der ‚Minipräp‘:

Verdau

~ 1,2 kb

4,7 kb

4,7 kb

~ 1,2 kb

Marker Ansätze/ Klone

Klone erfolgreich

4268

4973 DB

941

1375

Testverau/‚Minipräp‘:

Erfolgreiche Klone werden in größerem Maßstab angezüchtet

Aus der sog. Maxipräparation reinigt man die Plamide auf (CsCl-Gradient)

Zum Schluss: DNA-Konzentrationsbestimmung im Fotometer:

(Ergebnis leider sehr niedrig, also kein Paradebeispiel)

Ende:

Vielen Dank!

Außerdem bedanke ich mich bei ‚Wikipedia‘, aus der ich meine (umgeänderten) Abbildungen benutze.