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Die 3 Phasen der PCR
1. Denaturierung
DNA-Doppelstrang wird in Einzelstränge aufgeschmolzen
Für 30 sec auf 95°C erhitzen
Genomische oder komplexe DNA wird vorab für 5-10 min denaturiert
Denaturierung
Die 3 Phasen der PCR
2. Annealing
Anlagerung der Primer an die Template DNA
für 15-30 sec auf 50-60°C abkühlen
Annealing Temperatur (TA) kann anhand der Primer-Schmelztemperatur (TM) abgeschätzt werden
Annealing
Die 3 Phasen der PCR
3. Extension
Polymerase-vermittelte DNA-Synthese ausgehend vom Primer 3‘-Ende (5‘→3‘-Synthese)
Extension
Zyklus 1 Zyklus 2 Zyklus 3 Zyklus 4
Denaturierung Annealing Extension
N = N0 * 2n
N = Zahl der amplifizierten Moleküle
N0 = Zahl der Startmoleküle
n = Zahl der Zyklen
PCR-Reaktion
⇒ Die Menge an Produkt verdoppelt sich mit jedem Zyklus
Zyklus n
2 Kopien 4 Kopien 8 Kopien 16 Kopien 2n Kopien
Kinetik der PCR-Reaktion
Idealfall
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
1 5 9 13 17 21 25 29 33 37
Zyklus
Log
Kop
ienz
ahl
Sättigung
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
1 5 9 13 17 21 25 29 33 37
Zyklus
Log
Kop
ienz
ahl
Gründe für den Sättigungseffekt: Produkte reannealen (Kompetition mit Primern) Anhäufung von inhibierenden Nebenprodukten Polymerase, Primer und dNTPs werden limitierend
Idealer Verlauf Verlauf mit Sättigung
⇒ PCR Reaktionen verlaufen nie optimal, es kommt zu Sättigungseffekten
Zyklus
Log
(Kop
ienz
ahl)
Frühe Phase
Plateau Phase
Log Phase
Kinetik der PCR-Reaktion
Realer Verlauf einer Produktassimilationskurve einer PCR-Reaktion
Frühe Phase- Signal unterhalb des Detektionslimits- Keine optimale Amplifikation, Reaktion muss sich erst „einschwingen“
Log Phase- Amplifikation läuft optimal (exponentielle Vervielfältigung)
Plateau Phase- Amplifikation läuft suboptimal wegen limitierender Reagenzien und
inhibierender Reaktionsprodukte
Das Problem der Quantifizierung
Endpunktanalyse im Agarosegel Schwierig, da nur in einem engen Zyklusfenster möglich nicht quantitativ⇒ Quantifizierung nur über real-time PCR möglich
Zyklus
Log
(Kop
ienz
ahl)
a b c1 2 3
a
b
c
d
d
Auftrennung im Agarosegel
Quantitative Real-Time PCR
Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren (Prinzip der PCR)
Zusätzlich Möglichkeit der Quantifizierung über Fluoreszenz
Erzeugung fluoreszierender PCR-Produkte
Zunehmende Menge an PCR-Produkten →steigende Fluoreszenz
Möglichkeiten:
Interkalierende Farbstoffe
Sequenzspezifische Sonden
Die Zunahme der Fluoreszenzemission wird während der Reaktion überwacht undals Indikator für Produktakkumulation verwendet. In jedem PCR-Zyklus (inEchtzeit).
SYBR Green
Fluoreszenz nach Einlagern in doppelsträngige DNA:
Zunahme Target-DNA korreliert mit Zunahme der Fluoreszenz
Keine Sequenzspezifität
Zwischen verschieden PCR Produkten kann nicht unterschieden werden
Keine Multiplex-Messungen möglich
Schmelzkurvenanalyse nötig
Interkalierende Farbstoffe
Schmelzkurvenanalyse
Fragmentlängen und somit Spezifität bestimmbar
Temperatur langsam kontinuierlich erhöht: Aufschmelzen der DNA
Bei fragment-spezifischer Schmelztemperatur denaturiert Doppelstrang in Einzelstrang
SYBR Green wird freigesetzt →Fluoreszenzabnahme
Unterscheidung da PCR-Produkt DNA hat höheren Schmelzpunkt als unspezifisch entstehende Primerdimer
Sonde: (z.B. Taqman)
Sequenzspezifisch
Fluoreszenz-Farbstoff (Reporter):
FAM, VIC, ROX usw.
Quencher: „dämpft“ Reporter-Fluoreszenz
TAMRA, Black-Hole-Quencher (BHQ)
Polymerase:
5‘-3‘-Exonuclease-Aktivität
Abbau Sonde bei Synthese des Stranges vom 5‘-Ende ausgehend
Quencher und Reporter entfernen sich räumlich → Fluoreszenz steigt an
Messung am Ende der Elongation jedes Zyklus
Sequenzspezifische Sonden
SYBR Green
Assays die nicht der Spezifität von Sonden-basierten Assays bedürfen
Singleplex Reaktionen
Generelles Screenen von Transkripten
Wenn das PCR System voll optimiert ist (keine Primer-Dimere, keine unspezifischen Amplicons)
Genspezifische Sonden
Allelische Diskrimierung
Multiplex Reaktionen
Amplifikation gering exprimierter Transkripte
Detektion seltener Pathogene
Methylierungsspezifische PCR
Einsatzgebiete der Detektionsmethoden
Patentiertes Optisches System
PCR Block
Linsenarray
Lichtquelle
Multiplexer
Messkopf
CPM Detektor
8 Optische Fasern
LED blau
LED weiss
LED rot
Motor 2
8 OptischeFasern
8 Kollimatoren
Konkaver Spiegel
Motor 1
Spindel
Farbmodul
Modulträger rotiert: 6 Umdrehungen/sek.
Shuttle mit 8 optischen Fasern liest 96 Wells spaltenweise aus
Dauer des Scanvorgangs ist unabhängig von der Zahl der gemessenen Farben
Patent Nr. DE 2006 036 171 B4
Rotierender Modulträger
Funktionsweise des Multiplexers
Enden der 8 optischen Fasern
LED Fluoreszenzlicht zur Anregung
Farbmodulgrün
Farbmodulgelb
Farbmodulrot
Farbmodulblau
6 Umdrehungen/sek
8 Kollimatoren
Emissionsfilter (Interferenz)Emissionsfilter (Glas)
Anregungsfilter
Kollimatorlinse
Probe
Detektor
Ferrule mit optischer Faser
Linse
Strahlteiler
Lichtquelle
Optischer Weg
Filter
Anregung durch drei langlebige, hoch-intensive LEDs (blau, weiss, rot)
Farbmodule mit Anregungs- und Emissionsfiltern
Aufrüstung mit bis zu 4 (qTOWER) bzw. 6 (TOptical) Farbmodulen nach Wahl
Kein passiver Referenzfarbstoff notwendig
Filter Anregung Emission Bsp. Farbstoffe
TOptical Filter Modul 1 470nm 520nm FAM, SYBR Green, Alexa488
TOptical Filter Modul 2 515nm 545nm JOE, VIC, HEX, Yakima Yellow
TOptical Filter Modul 3 535nm 580nm TAMRA, DFO, Alexa 546, NED
TOptical Filter Modul 4 565nm 605nm ROX, TexasRed, Cy3.5
TOptical Filter Modul 5 630nm 670nm Cy5, Alexa 633, Quasar 670
TOptical Filter Modul 6 660nm 705nm LightCycler Red 705, Alexa 680
TOptical FRET Modul 1 470nm 580nm FAM/TAMRA
TOptical FRET Modul 2 470nm 670nm FAM/Cy5
TOptical FRET Modul 3 470nm 705nm FAM/Cy5.5
TOptical FRET Modul 4 515nm 670nm JOE/Cy5
Fluoreszenzanregung
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
400 450 500 550 600 650 700
nm
FAM JOE/HEX/VIC 6-ROX TET TAMRA Cy5 Cy5.5 LED blau LED weiss LED rot
LED
Em
issi
on/A
bsor
ptio
n
LED Anregung qTOWER / TOptical vs. Absorption Farbstoffe
Drei LEDs zur bestmöglichen Anregung üblich verwendeter Fluoreszenzfarbstoffe
Block
96 well Silberblock
Heizrate 6°C/sek, Kühlrate 4,5°C/sek
Geeignet für Standard PCR Tubes, 8er Streifen, Mikrotiterplatten
Korrosionsschutz durch Gold-Anodisierung
Temperaturgradient (optional)
qTOWER TOptical
96 well low profile rapid (LPR) Silberblock
Heizrate 12°C/sek, Kühlrate 8°C/sek
Geeignet für kleinste Probenvolumina
Korrosionsschutz durch Gold-Anodisierung
Sample Protection System (SPS)
Software
Einfaches und übersichtliches Erstellen von Experimenten
Inkl. Auswertungsmodulen für:
a) Absolute Quantifizierung
b) Relative Quantifizierung
c) ∆∆Ct-Quantifizierung
d) Allelische Diskrimierung
e) Schmelzkurvenanalytik
MIQE-konforme Probendokumentation
Benutzerverwaltung inkl. Adminstratorfunktion
Zahlreiche Exporttools (Excel, REST, qBASE, Biogazelle)
Zusammenfassung
modulares Blocksystem
Gradientenfunktion (optional)
Multiplexing bis zu 6 Farben
Offene Plattform für Kits und Plastikmaterialien aller Art
rapidPCR - real time
Kleinste Probenvolumina
Multiplexing bis zu 4 Farben
Geringe Leistungsaufnahme
Geringer Platzdebarf
Patentiertes optisches Shuttlesystem mit Hochleistungs-Optikfasern
Optimale Anregung durch 3 verschiedenfarbige, langlebige LEDs
Anregung und Detektion aller gewöhnlich verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe
Einzigartige Flexibität durch kundenspezifische Konfektionierung mit Farbmodulen
Kein passiver Referenzfarbstoff notwendig
qTOWER TOptical
Trends in der real-time PCR
Multiplex real-time PCR
Kleine Reaktionsvolumina
Rapid/Fast real-time PCR
Offene Plattformen für alle Kits und Plastikwaren
Flexibilität in der Konfiguration der Geräte
Barcode-Reading
LIMS-basierte Probendokumentation
MIQE-konforme Erfassung von Versuchsabläufen
Real time PCR
Hauptanwendungsgebiete
Quantifizierung der Genexpression Qualitätskontrolle und Assayvalidierung Detektion und Quantifizierung von Pathogenen Messung von DNA-Schäden (z.B. Microsatelliten-Instabilitität, Strahlenschäden) Bestimmungen mitochondrialer DNA Genotyptisierungen über allelische Diskriminierung Bestimmung von Copy Number Variations (CNV) Pharmakogenetik
Beispiele für neuere Techniken
DNA-Methylierungsstudien
miRNA Messungen
Assymetrische lineare Amplifikation zur Bestimmung von low-level Transkripten (LATE-PCR)
Neue real-time PCR Techniken
DNA-Methylierungsstudien
Eukaryoten: - Regulation der Genexpression
Prokaryoten: - Schutz vor Fremd-DNA
- Fehlerkorrektur bei der DNA-Neusynthese
Methode
Nachweis der Methylierungsstellen nach Bisulfidkonversion der DNA
Verwendung von spezifischen Sonden, die an unkonvertierte oder konvertierte DNA-Abschnitte binden
MSP (methylation-specific real-time PCR)
CGCGTCG ATC CGCGTCG ATC
CH3 CH3 CH3
UGUGTUG ATU CGCGTCG ATU
CH3 CH3 CH3
UGUGTUG ATU CGCGTCG ATU
CH3 CH3 CH3
BisulfidkonvertierungNaHSO3
Sonde 1Sonde 2
ACACAAC
GCGCAGC
Sonde 1
Sonde 2 ACACAAC
GCGCAGCSonde 2
Sonde 1
Nicht-methylierte DNA Methylierte DNA
Nur Sonde 1bindet
Nur Sonde 2bindet
Real-time PCR
Neue real-time PCR Techniken
LATE-PCR
LATE-PCR wurde spezielle für die Amplifikation von low-copy Targets entwickelt (Gewinn von 1-2 Ct-Werten)
Kombination aus exponentieller Amplikation und linearer Amplifikation
Verwendung von zwei Primern, wobei Primer 1 im deutlichen Überschuss zu Primer 2 eingesetzt wird
Während der ersten Zyklen exponentielle Vermehrung des Produkts
Nach Aufbrauchen von Primer 2 nur noch lineare Amplifikation
Originalpublikation: Sanchez et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA, 101(7):1933-1938.
LATE-PCR(Linear After The Exponential PCR)
Denaturierung
Extension
Annealing
Frühe Phase der Amplifikation
Exponentielle symmetrische Amplifikation
Amplifikation in Sättigung
Sondenbindung bei hohen
Temperaturen
Exponentielle symmetrische Amplifikation
Lineare assymetrische Amplifikation
Lineare assymetrische Amplifikation
Sondenbindung auch bei
niedrigen Temp an Einzelstränge
erleichtert
Exponentielle Amplifikation für ca. 40 Zyklen
Lineare Amplifikation für ca. 50 ZyklenExponentielle
Amplifikation für ca. 20 Zyklen
konventionelle real-time PCR
LATE-PCR
Neue real-time PCR Techniken
miRNA Profiling
miRNAs spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression bei Eukaryoten (Abbau von mRNA - Organogenese, Tumore)
miRNAs sind kleine, non-coding RNAs, die durch die RNA-Polymerase II synthetisiert werden
Sie unterliegen einer Reifung: pri-miRNA -> pre-miRNA -> miRNA
miRNAs haben keinen PolyA-Tail
5‘ 3‘ 5‘ 3‘ 5‘ 3‘
pri-miRNA pre-miRNA
Drosha
Zellkern
5‘3‘
RISC
Dicer
5‘3‘
RISC
Cytosol
AAAA5‘ 3‘mRNA
Neue real-time PCR Techniken
miRNA Profiling
miRNA spezifischer
Primer
5‘ 3‘miRNA
Polyadenylierung(A)n
cDNA-Erststrangsynthese
Oligo(dT)-Primer mit Tag
(A)n(T)n
Zweitstrangsynthese(T)n
(A)n
(T)n
Amplifikation
Detektion über SYBR Green
5‘3‘
miRNA
Stem-LoopRT-Primer
Bindung eines loop-RT Primers
cDNA Erststrangsynthese
Zweitstrangsynthese
Amplifikation
miRNA spezifischer
Primer
miRNA spezifische
Sonde
Stem-Loop basierte cDNA-Syntheseund sondenbasierter Nachweis
Oligo(dT) basierte cDNA-Syntheseund SYBR Green Nachweis
Neue real-time PCR Techniken
High resolution melting - HRM
Hochauflösende Schmelzkurve mit kleinen Temperaturinkrementen
Verwendung von quantitativ interkalierenden 3rd Generation Farbstoffen wie SYTO9, LCGreen oder Eva Green™
Hohe Temperaturuniformität des Thermocycler-Blocks erforderlich
Detektion von einzelnen Nukleotidaustauschen
Fluo
resz
enz
Temperatur55°C 95°C
agtactggactaggttactcttagccta agtactggactaggctactcttagccta
Normale DNA Mutierte DNA
HRM™ und LCGreen sind Warenzeichen von Idaho Technologies, SYTO®9 Invitrogen Corporation, Eva Green™ Biotium Inc
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit !
Wir wünschen Ihnen allen
einen interessanten und
abwechslungsreichen
Tag !
Technische Spezifikationen
TOptical qTOWER
Blockformat 96 well standard, Silber 96 well rapid, Silber
Blockwechsel Ja Nein
Gradient Optional Nein
Max. Heizrate 6,0°C/sek 12,0°C/sek
Max Kühlrate 4,5°C/sek 8,0°C/sek
Blockhomogenität +/- 0,15°C bei 55°C
+/- 0,25°C bei 72°C
+/- 0,50°C bei 95°C
+/- 0,2°C
Kontrollgenauigkeit +/- 0,1°C +/-0,2°C
Probenvolumen 5µl bis 80µl 5µl bis 20µl
LED blau, warmweiss, rot blau, warmweiss, rot
Anregung 8 Hochleistungs-Optikfasern in Shuttle
8 Hochleistungs-Optikfasern in Shuttle
Max. Filteranzahl 6 4
Scandauer 96 well 6 sek 4 sek
Software qPCRSoft qPCRSoft
Algorithmen Absolute Quantifizierung
Relative Quantifizierung
∆∆Ct-Quantifizierung
Allelische Diskrimierung
Schmelzkurvenanalytik
Absolute Quantifizierung
Relative Quantifizierung
∆∆Ct-Quantifizierung
Allelische Diskrimierung
Schmelzkurvenanalytik