Charakterisierung der differentiellen Regulation des ... · In the green alga C. reinhardtii, acclimation to oxygen deprivation is accompanied by extensive changes in gene expression

Charakterisierung der differentiellen

Regulation des Hydrogenase-Gens aus

Chlamydomonas reinhardtii

Dissertation zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie und Biotechnologie

an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften

der Ruhr-Universität Bochum

angefertigt im

Lehrstuhl Biochemie der Pflanzen

Arbeitsgruppe Photobiotechnologie

vorgelegt von

Miriam Pape

aus

Menden

Bochum

Oktober, 2011

Characterization of the differential regulation

of the hydrogenase gene in

Chlamydomonas reinhardtii

Dissertation to obtain the degree

Doctor Rerum Naturalium (Dr. rer. nat.)

at the Faculty of Biology and Biotechnology

Ruhr-University Bochum

International Graduate School of Biosciences

Ruhr University Bochum

Department of Biochemistry of Plants

Photobiotechnology

submitted by

Miriam Pape

from

Menden

Bochum

October, 2011

Referent: Prof. Dr. Thomas Happe, Lehrstuhl Biochemie der Pflanzen

AG Photobiotechnologie

Korreferentin: Prof. Dr. Nicole Frankenberg-Dinkel, Lehrstuhl Biologie der

Mikroorganismen, AG Physiologie der Mikroorgansimen

Tag der Abgabe: 17. Oktober 2011

Diese Arbeit wurde durch das Projekt „Solar-H2“ der Europäischen Union

gefördert.

Inhaltsverzeichnis

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ...................................................................................................... 1

VERZEICHNIS WICHTIGER GENE ................................................................................................ 4

ZUSAMMENFASSUNG .............................................................................................................. 5

SUMMARY .............................................................................................................................. 6

1 EINLEITUNG .......................................................................................................................... 7

1.1 ANAEROBIOSE IN PFLANZLICHEN ORGANISMEN .................................................................................. 7

1.2 PUTATIVE BOTENSTOFFE DER ANAEROBEN ADAPTATION IN PFLANZEN ................................................. 11

1.3 TRANSKRIPTION IN EUKARYOTEN ................................................................................................... 14

1.4 BEISPIELE SAUERSTOFFABHÄNGIGER TRANSKRIPTIONSFAKTOREN ........................................................ 16

1.5 ZIELSETZUNG DER ARBEIT ............................................................................................................. 19

2. MATERIAL UND METHODEN ............................................................................................... 20

2.1 ORGANISMEN UND WACHSTUMSBEDINGUNGEN .............................................................................. 20

2.1.1 Chlamydomonas reinhardtii ........................................................................................... 20

2.1.2 Escherichia coli................................................................................................................ 21

2.2 PLASMIDE.................................................................................................................................. 22

2.3 OLIGONUKLEOTIDE ..................................................................................................................... 22

2.4 MOLEKULARGENETISCHE METHODEN ............................................................................................ 24

2.4.1 Kerntransformation von C. reinhardtii............................................................................ 24

2.4.2 Transformation und Plasmidisolierung aus E. coli .......................................................... 24

2.4.3 Restriktion und Ligation von DNA ................................................................................... 25

2.4.4.Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten ........................................... 25

2.4.5 PCR .................................................................................................................................. 25

2.4.6 Isolierung genomischer DNA aus Grünalgen .................................................................. 26

2.4.7 Southern Blot-Analyse .................................................................................................... 26

2.4.8 Isolierung von Gesamt- und mRNA aus Grünalgen ........................................................ 27

2.4.9 RT-PCR ............................................................................................................................ 27

2.4.10 Northern Blot-Analyse .................................................................................................. 27

2.4.11 Synthese von cDNA ....................................................................................................... 28

2.4.12 Real-Time quantitative PCR .......................................................................................... 28

2.5 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN .............................................................................................. 29

2.5.1 Gewinnung von Proteinrohextrakten aus C. reinhardtii ................................................. 29

2.5.2 Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western Blot-Analyse ........................................ 29

2.6 ANALYSE VON PROTEINSEQUENZEN ............................................................................................... 30

2.7 PHYSIOLOGISCHE METHODEN ....................................................................................................... 30

2.7.1 Ermittlung von Photosynthese- und Respirationsraten .................................................. 30

2.7.2 Ethanol und Formiat Enzym-Test .................................................................................... 31

2.7.3 Arylsulfatase-Screening .................................................................................................. 31

2.7.4 Anaerobe Induktion ........................................................................................................ 32

2.7.5 Messung der in vitro-Hydrogenaseaktivität ................................................................... 33

2.7.6 Kupfermangel Induktion ................................................................................................. 33

2.7.7 Luziferaseaktivitätsmessungen....................................................................................... 33

3 ERGEBNISSE ........................................................................................................................ 35

3.1 IDENTIFIZIERUNG VON REGULATIVEN FAKTOREN DES HYD1-PROMOTORS ............................................ 35

3.2 CHARAKTERISIERUNG DER C. REINHARDTII-TRANSFORMANTE 41-6 MIT EINGESCHRÄNKTER HYD1-

PROMOTORAKTIVITÄT ....................................................................................................................... 37

3.2.1 Die genetische Charakterisierung der Transformante 41-6 zeigt einen Defekt im CRR1-

Gen........................................................................................................................................... 37

3.2.2 Physiologische Charakterisierung der CRR1-defizienten C. reinhardtii Mutante 41-6 ... 43

3.3 ANALYSE DES HYDROGENASE-PROMOTORS UNTER KUPFERMANGEL .................................................... 50

3.4 EINFLUSS VON HG(II) AUF SCHLÜSSELGENE DER ANAEROBIOSE- ANTWORT IN C. REINHARDTII................. 54

3.5 EINFLUSS VON KALIUMCYANID AUF ANAEROB INDUZIERTE SCHLÜSSELGENE .......................................... 59

4 DISKUSSION ........................................................................................................................ 63

4.1 STICKSTOFFMONOXID - PUTATIVER BOTENSTOFF DER ANAEROBEN SIGNALTRANSDUKTION? .................... 64

4.2 EINFLUSS DES TRANSKRIPTIONSFAKTORS CRR1 AUF DIE HYD1-EXPRESSION ........................................ 67

5. LITERATURVERZEICHNIS ..................................................................................................... 82

6 ANHANG ............................................................................................................................. 94

6.1 SEQUENZIERUNGSERGEBNIS ......................................................................................................... 94

6.2 CHEMIKALIEN, ENZYME, KITS, GERÄTE ........................................................................................... 94

LEBENSLAUF .......................................................................................................................... 97

Abkürzungsverzeichnis

1


A ACK Acetat-Kinase ADH Alkoholdehydrogenase ADHE Acetaldehyd/Alkoholdehydrogenase ADP Adenosindiphosphat AHA-Motiv AHA-(„aromatic, hydrophobic, acidic“)-Motiv ATP Adenosintriphosphat B BAC bakterielles artifizielles Chromosom bp Basenpaare BSA „bovine serum albumin“ C cDNA komplementäre DNA Chl Chlorophyll CoA Coenzym A COX Cytochrom-Oxidase CRR1 Copper Response Regulator 1 CYC6 Cytochrom c6 Cyt c Cytochrom c Cyt-b/c1 Cytochrom-b/c1 Cyt-b6/f Cytochrom-b6/f D D1 D1 Untereinheit von PSII DETA-NO Diethylentriamin NO-Addukt DIG Digoxigenin DMDC Dimethyldicarbonat DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure E EDTA Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat EMSA „electromobility shift assay“ ENEA2 modifiziertes TAP-Medium ohne Kupfer F Fdx Ferredoxin FDX5 Ferredoxin 5 FNR Fumarat-Nitrat-Regulator


2

H Hb

Hämoglobin

HRP Meerrettichperoxidase HYD1 [FeFe]-hydrogenase A1 aus C. reinhardtii HYD2 [FeFe]-hydrogenase A2 aus C. reinhardtii HYDEF radikales SAM-Protein aus C. reinhardtii HYDG radikales SAM-Protein, GTPase aus C. reinhardtii J JGI „Joint Genome Institut“ K KCN Kaliumcyanid kDa Kilodalton L LDH Laktat-Dehydrogenase L-NAME NG-Nitro-L-Arginin-Methylester M M1 Motiv 1 (AAGCTCGC) M2 Motiv 2 (CGCAGGCAC) mRNA boten-RNA NAD Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid NADH-DH NADH-Dehydrogenase NADP Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat NDA2 NAD(P)H-Plastochinon-Oxidoreduktase der Klasse II NO Stickstoffmonoxid NO2

- Nitrit NO3

- Nitrat NOS NO-Synthase NR Nitrat-Reduktase O OD optische Dichte P PAT Phosphotransacetylase PBS „phosphate buffered saline“ PC Plastocyanin PCR Polymerase-Kettenreaktion PDC Pyruvat-Decarboxylase PEG Polyethylenglycol PetF photosynthetisches Ferredoxin PFL1 Pyruvat-Formiat-Lyase PFR1 Pyruvat-Ferredoxin-Oxidoreduktase


3

PQ Plastochinon PRE „plastid response element“ PSI / II Photosystem I / II PVDF Polyvinylidenfluorid Q qPCR Real-Time quantitative PCR R RES reaktive elektrophile Spezies RLU relative Luziferase Einheiten RNA Ribonuekleinsäure RNS reaktive Stickstoffspezies ROS reaktive Sauerstoffspezies rRNA ribosomale-RNA RT-PCR reverse Transkriptase-PCR S SBP SQUAMOSA-Promotor-Bindeprotein SDS Natrium-Dodecylsulfat SSC „saline sodium citrate“ T TAE Tris-Acetat-EDTA TAP Tris-Acetat-Phosphat TBP TATA-Bindeprotein TETA Triethylentetramin TMAO Trimethylaminoxid tRNA transfer-RNA U UCLA Universität von Kalifornien, Los Angeles UDP Uridindiphosphat UQ Ubichinon UQH2 Ubisemichinon X X-SO4 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-sulfat

Verzeichnis wichtiger Gene

4

Verzeichnis wichtiger Gene

APHVII Hygromycin-Resistenz-Gen

APHVIII Paromomycin-Resistenz-Gen

ARS2 Arylsulfatase 2

au5.g1421_t1 Protein mit putativer Hämerythrin-Domäne

CBLP “Receptor of activated protein kinase C1”

CPX1 Coproporphyrinogen-III-Oxidase

CRD1 Mg-Protoporphyrinogen-IX-Monomethylester-Oxidative-Zyklase

CRLUC Renilla reniformis Luziferase, codon usage optimiert für C. reinhardtii

CRR1 „copper response regulator 1“

CYC6 Cytochrom c6

CYG12 putative Guanylatcyclase

CYG56 Häm/NO-bindende Guanylatcyclase

FDX5 Ferredoxin 5

HYD1 Hydrogenase A1

HYD2 Hydrogenase A2

HYDEF radikales SAM-Protein

HYDG radikales SAM-Protein, GTPase

NIA1/NIT1 Nitrat-Reduktase

NIT2 Transkriptionsfaktor der Regulation des Stickstoffmetabolismus

PFL1 Pyruvat-Formiat-Lyase

PFR1 Pyruvat-Ferredoxin-Oxidoreduktase

RPL10A ribosomales Protein L10a

Zusammenfassung

5

Zusammenfassung

Unter Sauerstoffmangel passt die einzellige Grünalge Chlamydomonas reinhardtii

ihren Zellstoffwechsel durch die differentielle Expression zahlreicher Gene an

diese Umweltbedingung an. Daran beteiligte Signaltransduktionswege oder

Transkriptionsfaktoren sind bislang kaum bekannt, mit Ausnahme des „copper

response regulator“ CRR1. CRR1 ist ein SBP-Domänen-Protein und reguliert die

differentielle Genexpression durch Bindung an GTAC-Motive unter Kupfer- und

Sauerstoffmangel in C. reinhardtii.

In dieser Arbeit wurden Wirkstoffe eingesetzt, die Einfluss auf putative durch

Anaerobiose aktivierte Signalkaskaden ausüben, um so die Beteiligung

postulierter Botenstoffe zu untersuchen. Stickstoffmonoxid (NO) wird als ein

möglicher Botenstoff unter Anaerobiose in pflanzlichen Zellen diskutiert. Als ein

Entstehungsort von NO wird die Cytochrom-Oxidase (COX) der mitochondrialen

Elektronentransportkette beschrieben. Der Einsatz des COX-Hemmstoffs

Kaliumcyanid zeigte einen Einfluss auf die Induktion der Transkription einiger

anaerob induzierter und CRR1-regulierter Gene und lieferte Hinweise auf eine

Funktion von NO im Rahmen der Antwort auf Anaerobiose in C. reinhardtii.

Zusätzlich bewirkte der Einsatz von Quecksilberionen, welche die Induktion

CRR1-regulierter Gene inhibieren, unter Sauerstoffmangel eine reduzierte

Transkription einiger Schlüsselgene des Wasserstoffmetabolismus.

Hauptziel dieser Arbeit war die gezielte Identifizierung von Mutanten, die Defekte

in der HYD1-Expression aufwiesen. Die Charakterisierung einer Mutante mit

verringerter HYD1-Promotoraktivität zeigte die Regulation des HYD1-Gens in

Abhängigkeit des Transkriptionsfaktors CRR1. Der Promotorbereich des HYD1-

Gens weist zwei GTAC-Motive auf und durch Reportergenstudien wurde der

Einfluss dieser Motive auf die HYD1-Promotoraktivität nachgewiesen.

Interessanterweise scheint die Regulation der HYD1-Expression unter Kupfer- und

Sauerstoffmangel auf unterschiedliche Weise zu erfolgen. So zeigen die

Ergebnisse dieser Arbeit, dass die kupfermangelinduzierte HYD1-Transkription

ausschließlich durch die GTAC-Motive kontrolliert wird und unter Anaerobiose ein

weiterer unbekannter Faktor neben CRR1 an der Regulation beteiligt sein muss.

Summary

6

Summary

In the green alga C. reinhardtii, acclimation to oxygen deprivation is accompanied

by extensive changes in gene expression. To date, knowledge about signaling

pathways leading to this anaerobic adaptation is limited. The induction of

expression of several target genes as a response to copper and oxygen depletion

is controlled by the SBP-domain protein CRR1 (copper response regulator), which

binds to a specific DNA sequence containing a GTAC core.

To examine the role of putative messengers of the anaerobic response, postulated

signaling pathways were manipulated by reagents. Nitric oxide (NO) has been

described as a possible messenger generated by mitochondrial cytochrome

oxidase (COX) upon oxygen deprivation. The COX inhibitor potassium cyanide

affected transcript levels of anaerobically induced and known CRR1 target genes,

which provided first hints of NO playing a signaling role during anaerobiosis.

Furthermore, blocking the CRR1-regulated gene expression by mercuric ions

during oxygen depletion resulted in decreased transcript amounts of key genes of

hydrogen metabolism.

The primary objective of this work was the identification of mutants impaired in the

regulation of HYD1 expression. Characterization of a mutant with defective HYD1

promoter activity showed a deletion of the CRR1 locus and participation of CRR1

in regulation of HYD1 expression. The promoter region of the HYD1 gene contains

two GTAC motifs which were analyzed in reporter gene studies and shown to be

required for HYD1 promoter activity. Interestingly, HYD1 expression seems to be

regulated during oxygen and copper depletion in a different manner. During

copper depletion, HYD1 promoter activity appears to be exclusively under the

control of GTAC sites, whereas this study suggests a second factor to be required

during oxygen depletion.

Einleitung

7

1 Einleitung

1.1 Anaerobiose in pflanzlichen Organismen

Molekularer Sauerstoff (O2) spielt als terminaler Elektronenakzeptor der

mitochondrialen Atmungskette bei der Energiegewinnung der Zelle eine wichtige

Rolle für den Zellstoffwechsel. Darüber hinaus wird Sauerstoff für eine Vielzahl

wichtiger Biosynthesewege, wie beispielsweise die Häm-, Sterol- und

Fettsäuresynthese, benötigt (Goldfine, 1965; Raymond und Segre, 2006).

Sauerstoffmangel bei Pflanzen kann in der Natur als Folge von

Überschwemmungen, Bodenverdichtungen, einer schlechten Entwässerung und

mikrobieller Aktivität im Boden auftreten (Drew, 1997; Geigenberger, 2003). Die

Überlebensdauer unter diesen Bedingungen hängt nicht nur von der Pflanzenzelle

und dem Gewebetyp, sondern auch von Entwicklungsstatus, Genotyp sowie

abiotischen Faktoren ab (Fukao und Bailey-Serres, 2004). Während einige

Pflanzen, wie etwas Reis (Oryza sativa) Überschwemmungen über eine lange Zeit

tolerieren (Sauter, 2000), können andere Pflanzen, zu denen Arabidopsis thaliana

oder Mais (Zea mays) gehören, nur eine kurze Zeit unter diesen Bedingungen

überleben (Drew, 1997; Drew et al., 2000; Hunt et al., 2002).

Bei einer sinkenden Konzentration an Sauerstoff kommt es daher zu zahlreichen

Anpassungsreaktionen, bei denen die Aufrechterhaltung des Energie-Status im

Vordergrund steht. Da das ATP/ADP-Verhältnis bei einer sinkenden Menge an

verfügbaren Sauerstoff abnimmt (Geigenberger et al., 2000; Gibon et al., 2002;

van Dongen et al., 2003), werden beispielsweise ATP-verbrauchende

Stoffwechselwege, wie die Saccharose-, Aminosäure-, Protein- und

Lipidbiosynthese, inhibiert (Geigenberger et al., 2000). Eine weitere Strategie stellt

die Umstellung von energieverbrauchenden zu energiesparenden

Biosynthesewegen dar, wie das Beispiel des Saccharose-Abbaus zeigt:

Saccharose wird unter Aerobiose durch die Enzyme Invertase und Hexokinase

umgesetzt, wobei zwei Moleküle ATP benötigt werden (Geigenberger et al., 1998).

Unter Sauerstoffmangel verbraucht diese Reaktion lediglich ein Molekül

Einleitung

8

Pyrophosphat, da sie von den alternativ gebildeten Enzymen Saccharose-

Synthase (SuSy) und UDP-Glukose-Pyrophosphorylase katalysiert wird

(Geigenberger et al., 1998).

Auch die einzellige Grünalge Chlamydomonas reinhardtii stellt unter anaeroben

Bedingungen ihren Metabolismus um und passt sich so dieser Umweltbedingung

an. In Folge dessen kommt es zur Ausbildung eines für Pflanzen untypischen

anaeroben Stoffwechsels ähnlich der bakteriellen Gärung (Atteia et al., 2006; Mus

et al., 2007; Hemschemeier und Happe, 2011). Dabei werden die fermentativen

Endprodukte Formiat, Acetat und Ethanol im Verhältnis 2:1:1 gebildet und die

Gase Wasserstoff (H2) und Kohlendioxid (CO2) freigesetzt (Gfeller und Gibbs,

1984; Philipps et al., 2011). Auch geringe Mengen an Glycerol und D-Laktat

konnten als fermentative Stoffwechselprodukte nachgewiesen werden (Kreuzberg,

1984). Das vermutlich aus dem Stärkeabbau stammende Pyruvat kann in C.

reinhardtii offenbar von mehreren Enzymsystemen verstoffwechselt werden (Abb.

1-1): Die Aktivität des Enzyms Pyruvat-Formiat-Lyase (PFL1) wurde in C.

reinhardtii bereits gezeigt (Atteia et al., 2006; Hemschemeier et al., 2008; Philipps

et al., 2011). PFL1 katalysiert den Abbau von Pyruvat zu Formiat und Acetyl-CoA.

Acetyl-CoA kann weiterhin zu Ethanol und Acetat umgesetzt werden. Das Enzym

Pyruvat-Ferredoxin-Oxidoreduktase (PFR1) konnte auf genetischer und

Proteinebene in C. reinhardtii nachgewiesen werden (Mus et al., 2007; Terashima

et al., 2010) und bildet aus Pyruvat Acetyl-CoA und CO2. Dabei kommt es zur

Reduktion eines Ferredoxins oder Flavodoxins (Blaschkowski et al., 1982;

Ragsdale, 2003). Es wird vermutet, dass ein durch die PFR1 reduziertes

Ferredoxin Elektronen an die Hydrogenase (HYD1) weitergibt und so an der

Wasserstoffbildung im Dunkeln beteiligt ist (Grossman et al., 2011; Philipps et al.,

2011). Neben den beschriebenen Reaktionen wird eine Verstoffwechslung von

Pyruvat durch eine Pyruvat-Decarboxylase zu Acetaldehyd und CO2

(Hemschemeier et al., 2008) und durch eine Laktat-Dehydrogenase zu Laktat

diskutiert (Stern, 2009).

Einleitung

9

Abb. 1-1: Schematische Darstellung des fermentative n Stoffwechsels in C. reinhardtii. Das

aus dem Stärkeabbau stammende Pyruvat kann von den dargestellten Enzymen zu den

Endprodukten Laktat, Ethanol, Acetat, Formiat und CO2 verstoffwechselt werden. LDH: Laktat-

Dehydrogenase; PFL: Pyruvat-Formiat-Lyase; PFR: Pyruvat-Ferredoxin-Oxidoreduktase; ADHE:

Acetaldehyd/Alkoholdehydrogenase; ADH: Alkoholdehydrogenase; PAT: Phosphotransacetylase;

ACK : Acetat-Kinase; Fdx : Ferredoxin, CoA : Coenzym A.

Neben der Entstehung von H2 während der Fermentation im Dunkeln kann es in

C. reinhardtii auch bei Belichtung zur Wasserstoffproduktion kommen (Abb. 1-2).

Dabei werden Elektronen vom Photosystem II (PSII), resultierend aus der

Wasseroxidation, über die Reduktion von Plastochinon (PQ) und den Cytochrom-

b6/f-Komplex (Cyt-b6/f) über Plastocyanin (PC) auf Photosystem I (PSI)

übertragen, was dann zur Reduktion eines Ferredoxins (PetF) (Winkler et al.,

2009) führt. Das Ferredoxin dient dann als physiologischer Elektronendonor der

Hydrogenase (Roessler und Lien, 1984; Happe und Naber, 1993). Ein weiterer

lichtabhängiger, PSII-unabhängiger Weg nutzt Elektronen aus dem Abbau

organischer Substrate, vermutlich vorwiegend Stärke, welche durch eine

NAD(P)H-Plastochinon-Oxidoreduktase der Klasse II (NDA2) (Jans et al., 2008;

Desplats et al., 2009) direkt auf Plastochinon übertragen werden. Der folgende

Elektronentransport über Cyt-b6/f, Plastocyanin, PSI und Ferredoxin zur

Hydrogenase resultiert ebenfalls in der Produktion von Wasserstoff (Godde und

Trebst, 1980; Maione und Gibbs, 1986; Cournac et al., 2000; Mus et al., 2005).

Einleitung

10

Abb. 1-2: Schematische Abbildung der lichtabhängige n Wasserstoffproduktion in

C. reinhardtii. Die PSII-abhängige Wasserstoffproduktion nutzt Elektronen der photosynthetischen

Wasseroxidation, die über ein Ferredoxin auf die Hydrogenase (HYD1) übertragen werden. Die

NAD(P)H-Plastochinon-Oxidoreduktase (NDA2) kann Elektronen aus dem Stärkeabbau direkt

(PSII-unabhängig) auf den Plastochinon-Pool übertragen. Cyt-b6/f: Cytochrom-b6/f-Komplex, FDX:

Ferredoxin, PC: Plastocyanin, PQ: Plastochinon, PSI und PSII: Photosystem I und II.

Unter Laborbedingungen kann der Wasserstoffmetabolismus von C. reinhardtii auf

unterschiedliche Weise induziert werden. Bei einer Anaerobisierung durch den

Entzug des Nährstoffs Schwefel kommt es zu einer Umstellung des Stoffwechsels

als Antwort auf den Nährstoffmangel. Die photosynthetische Aktivität der Zellen

nimmt innerhalb kurzer Zeit rapide ab (Wykoff et al., 1998). Ursache dafür ist eine

starke Schädigung des D1-Kernproteins des Photosystems II besonders bei

hohen Lichtintensitäten (Ohad et al., 1984). Aufgrund des fehlenden Schwefels

kann eine Neusynthese der benötigten Menge an D1-Protein nicht erfolgen, was

eine verminderte Aktivität des PSII zur Folge hat. Desweiteren kommt es zur

Ausbildung Plastochinon-nicht-reduzierender PSII-Komplexe, zu State I / State II

Übergängen und einer Steigerung des Elektronenflusses über das Photosystem I

(Wykoff et al., 1998). In einer gasdicht verschlossenen Kultur resultieren diese

Anpassungen der photosynthetischen Reaktionen bei gleich bleibender

Respirationsrate in einer Netto-Sauerstoffabnahme und somit Anaerobisierung der

belichteten Kultur (Melis et al., 2000).

Eine weitere Möglichkeit bietet die so genannte anaerobe Induktion. Bei diesem

artifiziellen Prozess wird durch Begasung mit einem inerten Gas, beispielsweise

Stickstoff oder Argon, der Sauerstoff aus aufkonzentrierten und abgedunkelten

Einleitung

11

Kulturen ausgetrieben (Happe und Naber, 1993; Happe und Kaminski, 2002).

Alternativ dazu können C. reinhardtii-Kulturen durch Abdunklung und gasdichten

Verschluss anaerob induziert werden. Durch die zelleigene Atmung wird der in der

Kultur vorhandene Sauerstoff verbraucht und es kommt schrittweise zunächst zu

mikroaeroben und letztendlich zu anaeroben Bedingungen.

Schlüsselenzym der Wasserstoffproduktion ist eine monomere [FeFe]-

Hydrogenase mit einer Größe von 48 kDa, die sich durch ihre hohe

Sauerstoffsensitivität auszeichnet (Stripp und Happe, 2009). C. reinhardtii besitzt

zwei Isoformen der Hydrogenase, HYD1 und HYD2, von denen jedoch

vorwiegend HYD1 aktiv zu sein scheint (Godman et al., 2010). Für die Maturation

des aktiven Zentrums der Hydrogenase, des H-Klusters, sind zwei Radikal-

S-Adenosylmethionin-(SAM)-Proteine, HYDEF und HYDG, erforderlich (Posewitz

et al., 2004; Mulder et al., 2010).

Die Regulation der Expression des HYD1-Gens ist nur in Ansätzen bekannt. In

aeroben Zellen kann kein HYD1-Protein nachgewiesen werden, was auf eine

de novo Synthese unter Anaerobiose schließen lässt (Happe et al., 1994). Bereits

nach wenigen Minuten unter anaeroben Bedingungen kommt es zu einer Induktion

der HYD1-, HYD2-, HYDEF- und HYDG-Transkription (Happe und Kaminski,

2002; Posewitz et al., 2004; Mus et al., 2007), weswegen eine Regulation dieser

Gene auf Transkriptebene vermutet wird. Analysen der Promotoraktivität

unterschiedlich langer Fragmente des HYD1-Promotors zeigten, dass die Region

von -128 bis -21 ausgehend vom Transkriptionsstartpunkt ausreichend für die

Aktivität ist (Stirnberg und Happe, 2004). Regulative Faktoren der HYD1-

Transkription sind jedoch noch nicht bekannt.

1.2 Putative Botenstoffe der anaeroben Adaptation i n Pflanzen

Während man in Bakterien schon viele Sauerstoffsensoren und Komponenten von

Signaltransduktionskaskaden kennt (Bunn und Poyton, 1996; Bauer et al., 1999),

sind die genauen Regulationsmechanismen der Anpassungsreaktionen auf

Einleitung

12

Sauerstoffmangel in Pflanzen noch unbekannt. Es wird vermutet, dass die

Konzentration des verfügbaren Sauerstoffs von den Zellen direkt, durch die

Bindung von Sauerstoff an Proteine oder Liganden, oder indirekt wahrgenommen

werden kann (Bailey-Serres und Chang, 2005). Als indirekte Mechanismen

kommen Störungen der zellulären Homöostase, wie Änderungen des Energie-

oder Redox-Status, in Frage (Mariya et al., 1999). Als Botenstoffe der durch

Anaerobiose oder Hypoxie ausgelösten Signaltransduktion in Pflanzen werden

unter anderem reaktive Sauerstoffspezies und reaktive Stickstoffspezies diskutiert

(Geigenberger, 2003; Fukao und Bailey-Serres, 2004) und die mitochondriale

Atmungskette wird als ein Entstehungsort dieser Moleküle beschrieben

(Igamberdiev und Hill, 2009; Igamberdiev et al., 2010).

Die Entstehung von Stickstoffmonoxid (NO) während der Respiration soll im

Folgenden genauer beschrieben werden. Bei der Atmung werden

Reduktionsäquivalente aus dem Citratzyklus zum Aufbau eines

Protonengradienten, der für die ATP-Gewinnung durch die ATP-Synthase benötigt

wird, genutzt. Unter aeroben Bedingungen wird NADH von einer NADH-

Dehydrogenase (Komplex I) oxidiert und die Elektronen über Ubichinon, den

Cytochrom-b/c1-Komplex (Komplex III), Cytochrom c und die Cytochrom-Oxidase

(Komplex IV) auf den terminalen Akzeptor Sauerstoff übertragen. Zusätzlich kann

die Succinat-Dehydrogenase (Komplex II) des Citratzyklus direkt Elektronen an

Ubichinon abgeben. Unter Anaerobiose steht Sauerstoff als terminaler

Elektronenakzeptor der Atmungskette nicht mehr zur Verfügung. Allerdings konnte

in Säugetieren, Algen und Pflanzen gezeigt werden, dass die Cytochrom-Oxidase

und eventuell auch der Cytochrom-b/c1-Komplex unter diesen Bedingungen

Elektronen auch auf Nitrit übertragen können (Kozlov et al., 1999; Tischner et al.,

2004; Planchet et al., 2005). Dabei kommt es zur Bildung und Akkumulation von

Stickstoffmonoxid (Dordas et al., 2003; Castello et al., 2006) und zur

Aufrechterhaltung der protonengesteuerten ATP-Synthese (Stoimenova et al.,

2007).

Stickstoffmonoxid kann frei Membranen passieren und so ungehindert ins Cytosol

gelangen. Dort kann NO mit Hilfe eines Hämoglobins zu Nitrat verstoffwechselt

werden. Nitrat wird wiederum von der Nitrat-Reduktase zu Nitrit reduziert

Einleitung

13

(Igamberdiev et al., 2010) (Abb.1-3). Zusätzlich konnte bei den enzymatischen

Reaktionen der Nitrat-Reduktase, die neben Nitrat auch Nitrit als Substrat nutzen

kann, eine Entstehung von NO nachgewiesen werden (Yamasaki et al., 1999;

Yamasaki und Sakihama, 2000).

Abb. 1-3: Schema der NO-Bildung in Mitochondrien un ter Anaerobiose. Bei Sauerstoffmangel

können Elektronen auf Nitrit (NO2-) als terminalen Elektronenakzeptor übertragen werden. Dabei

entstehendes NO kann ins Cytosol diffundieren, wo es durch Hämoglobin (Hb) zu Nitrat (NO3-)

umgesetzt wird. Die Nitrat-Reduktase (NR) kann Nitrat wieder zu Nitrit reduzieren. NO kann sowohl

in der mitchondrialen Matrix als auch im Cytosol regulatorische Funktion ausüben. NADH-DH:

NADH-Dehydrogenase, UQ: Ubichinon, UQH2: Ubisemichinon, Cyt-b/c1: Cytochrom-b/c1-Komplex,

Cyt c: Cytochrom c.

Als putativer Botenstoff kann NO sowohl innerhalb als auch außerhalb des

Mitochondriums wirken. So konnte gezeigt werden, dass NO im Mitochondrium die

Freisetzung von Kalzium-Ionen bewirkt (Subbaiah et al., 1998, Subbaiah und

Sachs, 2003). In Mais steigt beispielsweise die cytosolische Kalziumkonzentration

als Reaktion auf Anaerobiose an und dies kann besonders in den Mitochondrien

und ihrer Peripherie beobachtet werden (Subbaiah et al., 1994; Subbaiah et al.,

1994). Eine Unterdrückung des Anstiegs dieser Kalziumfreisetzung durch den

Inhibitor Rutheniumrot führte in Mais zu einer reduzierten anaeroben

Genexpression des ADH1-Gens (Alkohol-Dehydrogenase) und des Saccharose-

Synthase kodierenden SH1-Gens.

Eine Funktion von NO als sekundärer Botenstoff bei der ammoniumabhängigen

Regulation in C. reinhardtii konnte ebenfalls gezeigt werden. So beeinflusst NO

Einleitung

14

die Regulation der Expression des NIA1-Gens, kodierend für die Nitrat-Reduktase

durch Aktivierung der Häm/NO-bindenden Guanylatcyclase CYG56. CYG56 übt

durch die Produktion von cGMP einen inhibierenden Effekt auf die Transkription

des NIA1-Gens (Nitrat-Reduktase) aus (de Montaigu et al., 2010). Verschiedene

Wirkstoffe, die in der Studie eingesetzt wurden, weisen auf eine Beteiligung von

Kalziumströmen an der Signaltransduktionskaskade und die Bildung von NO

durch eine NO-Synthase (NOS) hin. Homologe Proteinsequenzen zu der in

Säugern beschriebenen NO-Synthase (Bryan et al., 2009) wurden in Pflanzen und

Chlamydomonas jedoch nicht identifiziert. Allerdings wird eine Existenz dieses

Enzyms in C. reinhardtii aufgrund einer inhibierten NO-Synthese durch den NOS-

Hemmstoff L-NAME (NG-Nitro-L-Arginin-Methylester) vermutet und könnte eine

weitere Quelle der NO-Produktion sein (de Montaigu et al., 2010).

1.3 Transkription in Eukaryoten

Die in der DNA eukaryotischer Gene enthaltene Information wird durch drei

unterschiedliche DNA-abhängige RNA-Polymerasen abgelesen. Die RNA-

Polymerase I transkribiert Gene, die für große ribosomale-RNAs (rRNA) kodieren,

während die RNA-Polymerase III für die Transkription kleiner RNAs, z.B. transfer-

RNAs (tRNA) oder kleine ribosomale RNAs (5S rRNA), verantwortlich ist. Die

Transkription proteinkodierender Gene in Eukaryoten erfolgt durch die RNA-

Polymerase II. Durch die Regulation der enzymatischen Funktion der RNA-

Polymerasen kann die RNA-Synthese auf den Ebenen der Transkriptionsinitiation,

-elongation und –termination beeinflusst werden. Im Folgenden soll die Regulation

der RNA-Polymerase II näher beschrieben werden.

Die korrekte Expression eines Gens zum richtigen Zeitpunkt und in der benötigten

Intensität wird durch zahlreiche regulative Faktoren beeinflusst. Ein wesentliches

Merkmal eukaryotischer Promotorregionen ist eine AT-reiche TATA-Box, die sich

etwa 30 Nucleotide stromaufwärts des Transkriptionsstartpunkts befindet. An

diese Sequenz kann als genereller Transkriptionsfaktor das TATA-Bindeprotein

(TBP) binden und die RNA-Polymerase II gezielt positionieren. Nicht alle

Einleitung

15

eukaryotischen Promotorregionen enthalten diese konservierte TATAAA-Sequenz,

jedoch findet auch in diesen Fällen eine Positionierung der RNA-Polymerase II

durch DNA-bindende Proteine statt.

Abb. 1-4: Übersicht über die Transkription proteink odierender Gene in Eukaryoten. Die RNA-

Polymerase II wird durch das TATA-Bindeprotein (TBP) am Transkriptionsstartpunkt positioniert

und benötigt weitere generelle Transkriptionsfaktoren, um die Transkription zu initiieren.

Spezifische Transkriptionsfaktoren binden an proximale und distale regulative DNA-Sequenzen

(cis-Elemente) und beeinflussen direkt oder durch Interaktion mit Mediator-Proteinen den

Transkriptionsapparat. Änderungen der Chromatinstruktur, die durch regulative Faktoren

verursacht werden, beeinflussen die Transkription ebenfalls.

Für die Initiation der Transkription sind zusätzliche generelle

Transkriptionsfaktoren notwendig, die durch Protein-Protein-Interaktionen an die

RNA-Polymerase II assoziieren. Diese generellen Transkriptionsfaktoren werden

durch spezifische Transkriptionsfaktoren und Mediatoren ergänzt, um eine

differentielle Genexpression aufgrund zeitlicher, zelltyp- und organspezifischer

Parameter sowie signalvermittelter Umweltbedingungen zu regulieren. Spezifische

Transkriptionsfaktoren (trans-Faktoren) binden an konservierte DNA-Sequenzen,

die cis-Elemente genannt werden, und wirken verstärkend als „Enhancer“ oder

reprimierend als „Silencer“ auf die Transkription. Oft erfolgt die Regulation durch

spezifische Faktoren mit Hilfe von Mediatoren, die durch Protein-Protein-

Interaktionen einen Einfluss auf den Transkriptionsapparat haben.

Eine weitere Möglichkeit der Transkriptionsregulation auf dieser Ebene stellt die

Modifikation der Chromatinstruktur dar. Acetylierung und Deacetylierung,

Einleitung

16

Methylierung, Ubiquitinylierung und Dephosphorylierung der Histone können diese

Struktur verändern und so die Zugänglichkeit der DNA für den

Transkriptionsapparat beeinflussen. Abbildung 1-4 zeigt einige Elemente der

eukaryotischen Transkriptionsregulation.

1.4 Beispiele sauerstoffabhängiger Transkriptionsfa ktoren

Spezifische Transkriptionsfaktoren, die regulierend auf die Genexpression in

Abhängigkeit der Sauerstoffverfügbarkeit wirken, sind in C. reinhardtii bislang noch

unbekannt. Jedoch konnte beobachtet werden, dass die kupfermangelinduzierten

Gene CYC6 (Cytochrom c6), CPX1 (Coproporphyrinogen-III-Oxidase) und CRD1

(Mg-Protoporphyrinogen-IX-Monomethylester-Oxidative-Zyklase) auch unter

Sauerstoffmangel induziert werden (Quinn et al., 2000; Quinn et al., 2002).

Zusätzlich steigt die Transkriptmenge des FDX5-Gens, das für eine Ferredoxin-

Isoform kodiert, nicht nur unter Anaerobiose, sondern auch unter

Kupfermangelbedingungen stark an (Terauchi et al., 2009; Lambertz et al., 2010).

Die Regulation der genannten Gene erfolgt dabei auf transkriptioneller Ebene

durch den Transkriptionsfaktor CRR1 („copper response regulator 1“) (Kropat et

al., 2005). CRR1 besitzt eine SBP-(„SQUAMOSA-promoter-binding-protein“)-

Domäne durch die eine Bindung an DNA-Sequenzen mit einer GTAC-

Kernsequenz im Promotorbereich regulierter Gene erfolgt (Quinn et al., 2000;

Kropat et al., 2005; Lambertz et al., 2010). Die Aktivierung von CRR1 unter

Kupfermangel wird vermutlich durch Austausch gebundener Cu(II)-Ionen der SBP-

Domäne mit Zn(II)-Ionen reguliert (Sommer et al., 2010). Der Mechanismus der

Aktivierung unter Sauerstoffmangel wird bisher nur vermutet und erfolgt

möglicherweise in Abhängigkeit einer cysteinreichen Region am C-Terminus des

CRR1-Proteins (Sommer et al., 2010).

Die Möglichkeiten der Aktivierung von Transkriptionsfaktoren durch verschiedene

Modifikationen an Thiolgruppen konnte bereits an einigen Proteinen aus

verschiedenen Organismen beschrieben werden. Oft werden dabei Thiolgruppen

Einleitung

17

von Cysteinresten durch reaktive Sauerstoff Spezies (ROS), reaktive elektrophile

Spezies (RES) oder reaktive Stickstoff Spezies (RNS) durch Disulfid-

Brückenbildung, S-Thiolierung, S-Nitrosylierung oder S-Alkylierung verändert

(Antelmann und Helmann, 2011). Ein gut untersuchtes Beispiel für die Aktivierung

eines Transkriptionsfaktors durch die Ausbildung von Disulfid-Brücken ist das

OxyR-Protein aus Escherichia coli. OxyR besitzt sechs Cysteine, von denen zwei

konserviert und essentiell für die Redox-Regulation sind (Lee et al., 2004). In

Anwesenheit von Wasserstoffperoxid wird eines dieser Cysteine (C199) oxidiert

und bildet zunächst ein Sulfensäure-Intermediat, bevor es mit dem zweiten

Cystein (C208) eine Disulfidbrücke bildet. Das oxidierte OxyR Protein bindet dann

als Tetramer (Choi et al., 2001; Lee et al., 2004) an entsprechende

Promotorregionen und aktiviert die Expression von Genen, deren Produkte eine

antioxidative Funktion besitzen (Abb. 1-5).

Abb. 1-5: Transkriptionsregulation durch OxyR (nach Antelmann und Helmann, 2011). Die

Oxidation der Thiolreste der Cysteine C199 und C208 führt zu einer Bildung von Disulfidbrücken.

Die dadurch verursachten Konformationsänderungen des OxyR-Tetramers erlauben die Bindung

an DNA und Aktivierung der Transkription.

Desweiteren konnte in vitro gezeigt werden, dass neben der Ausbildung von

Disulfidbrücken auch andere Modifikationen des Cystein C199 ausreichend sind,

um die Regulation zu beeinflussen. So resultiert glutathionyliertes C199 in einer

nicht-kooperativen, die Sulfensäure- und S-nitrosylierte-Form von OxyR in einer

kooperativen Bindung an die DNA (Kim et al., 2002). Unterschiedliche

Modifikationen von OxyR durch verschiedene Signale könnten eine Koordination

einer Vielzahl genetischer Antworten ermöglichen, jedoch ist die Relevanz dieser

alternativer Modifikationen in vivo noch nicht nachgewiesen (Mukhopadhyay et al.,

2004).

Einleitung

18

Als weiteres Beispiel eines sauerstoffabhängigen Transkriptionsfaktors soll an

dieser Stelle das FNR (Fumarat-Nitrat-Regulator)-Protein genannt werden. Dieser

globaler Transkriptionsfaktor kontrolliert in E. coli die Regulation von über 120

Genen als Anpassung auf einen Wechsel von Aerobiose zu Anaerobiose (Sawers

et al., 1988). Die Bereitstellung von Energie durch oxidative Phosphorylierung

während der anaeroben Atmung unter Nutzung alternativer Elektronenakzeptoren,

wie TMAO/DMSO, Fumarat und Nitrat, wird durch eine FNR-regulierte

Genexpression gewährleistet: So werden Gene, die Enzyme des Citratzyklus

kodieren, durch FNR aktiviert (Park und Gunsalus, 1995; Chao et al., 1997; Park

et al., 1997) und Gene, die aerobe respiratorische Enzyme, wie die Cytochrom-

Oxidase oder die NADH-Dehydrogenase kodieren, inhibiert (Frey et al., 1989;

Cotter et al., 1990). Anaerobe respiratorische Enzyme hingegen werden durch

eine gesteigerte Genexpression vermehrt gebildet (Stewart, 1982; Jones und

Gunsalus, 1987; Cotter und Gunsalus, 1989).

Abb. 1-6: Regulation durch den Transkriptionsfaktor FNR (nach Bauer et al., 1999). Ist das

[4Fe-4S]-Kluster intakt, bildet das FNR-Protein Dimere und reguliert durch die Bindung an DNA-

Sequenzen die Expression zahlreicher Gene. Unter aeroben Bedingungen zerfällt das [4Fe-4S]-

Kluster innerhalb weniger Minuten zu einem [2Fe-2S]-Kluster und nach einigen Stunden

vollständig. Die dadurch erfolgende Konformationsänderung verhindert die Bindung an DNA.

Für die Bindung von FNR an die Promotorregionen regulierter Gene ist ein

Ferredoxin-ähnliches [4Fe-4S]-Kluster erforderlich (Lazazzera et al., 1996;

Khoroshilova et al., 1997). Ist dieses Kluster intakt, bildet FNR Homodimere und

besitzt eine hochaffine DNA-Bindung. Beim Übergang von anaeroben zu aeroben

Bedingungen wird das [4Fe-4S]-Kluster oxidiert und zerfällt innerhalb weniger

Minuten zu einem [2Fe-2S]-Kluster, FNR-Monomere entstehen und eine DNA-

Bindung ist nicht mehr möglich (Lazazzera et al., 1993; Bates et al., 1995;

Ziegelhoffer und Kiley, 1995; Lazazzera et al., 1996; Melville und Gunsalus, 1996;

Einleitung

19

Popescu et al., 1998). Dieser Zustand ist zunächst reversibel und das [4Fe-4S]-

Kluster kann durch Reduktion wieder gebildet werden (Popescu et al., 1998). Wird

der oxidative Zustand jedoch über einen Zeitraum von Stunden aufrechterhalten,

kommt es zu einem irreversiblen Zerfall des [2Fe-2S]-Klusters (Popescu et al.,

1998) (Abb. 1-6). Auch wenn die primäre Aufgabe von FNR die Wahrnehmung

von Sauerstoff ist, ist dieser Transkriptionsfaktor zusätzlich in der Lage auf

Stickstoffmonoxid zu reagieren (Cruz-Ramos et al., 2002; Crack et al., 2008).

1.5 Zielsetzung der Arbeit

Die regulativen Faktoren, die zur Ausbildung des anaeroben

Wasserstoffmetabolismus in C. reinhardtii führen, sind zurzeit noch nicht bekannt.

Das Ziel dieser Arbeit war daher die Identifizierung regulatorischer Komponenten

der Anpassung an Sauerstoffmangel. Dazu wurden zwei unterschiedliche

Vorgehensweisen verwendet.

Durch eine gezielte Manipulation der postulierten Singaltransduktionswege unter

Hypoxie in Pflanzen sollte eine Beteiligung beschriebener Botenstoffe bei der

Induktion des Wasserstoffmetabolismus in C. reinhardtii untersucht werden. Dazu

wurden Wirkstoffe verwendet, deren Verwendung auf diesem Gebiet bereits in

unterschiedlichen Organismen beschrieben wurde.

Die wasserstoffbildende Hydrogenase ist ein Schlüsselenzym des

Wasserstoffmetabolismus und ihre Bildung wird unter Anaerobiose stark induziert.

Regulative Faktoren, welche die Promoteraktivität des HYD1-Gens beeinflussen,

sollten durch ein spezifisches Reportergen-Screening einer Mutantenbibliothek

identifiziert werden. Durch die Analyse des HYD1-Promotors in

Reportergenstudien sollte die Bedeutung cis-agierender Sequenzen untersucht

werden. Die Entdeckung und Charakterisierung aktivierender oder inhibierender

Faktoren der HYD1-Transkription sollte zu einem besseren Verständnis der

differentiellen Regulation des Hydrogenase-Gens führen.

Material und Methoden

20

2. Material und Methoden

2.1 Organismen und Wachstumsbedingungen

2.1.1 Chlamydomonas reinhardtii

Die Lagerung und Anzucht von C. reinhardtii erfolgte in Tris-Acetat-Phosphat-

Medium (TAP-Medium) auf Agarplatten oder in Flüssigkultur (Harris, 2009). Je

nach Bedarf wurden folgende Zusätze verwendet: Arginin (200 µg ml-1),

Paromomycin (5 µg ml-1), Hygromycin (10 µg ml-1) oder TETA

(Triethylentetramine, 50 µM). Die Anzucht der Flüssigkulturen erfolgte bis zu einer

Zelldichte von 20 µg Chlorophyll pro ml unter kontinuierlichem Schütteln bei einer

Lichtintensität von 80 µmol Photonen m-2 s-1 und einer Temperatur von 20 °C.

Beij’sche Salzlösung:

mM TAP TAP-S TAP-N ENEA2 8,11 MgSO4 MgCl2 · 6 H2O MgSO4 MgSO4 149,5 NH4Cl NH4Cl KCl NH4Cl 6,8 CaCl2 · 2 H2O CaCl2 · 2 H2O CaCl2 · 2 H2O CaCl2 · 2 H2O

Kaliumphosphatpuffer pH 7.2: 0,238 mM KH2PO4, 0,717 mM K2HPO4

Spurenelemente:

µM TAP TAP-S TAP-N ENEA2 ZnSO4 77 - 77 - ZnCl2 - 77 - 3 MnCl2 26 26 26 3 FeSO4 18 - 18 - FeCl2 - 18 - 5 CoCl2 7 7 7 0,1 CuSO4 6 - 6 - CuCl4 - 6 - 0,3 (NH4)6Mo7O24 · 4 H2O 1 1 1 0,1 H3BO4 120 120 120 120 EDTA Na2 Salz 134 134 134 15


21

Um die Chlorophyllkonzentration einer Algensuspension zu bestimmen, wurde 1

ml Kultur abzentrifugiert, das Pellet in 1 ml Aceton resuspendiert und 3 min bei

80 °C inkubiert. Nach einer erneuten Zentrifugation konnte die Extinktion des

Überstandes bei 652 nm bestimmt werden. Die Chlorophyllkonzentration wurde

nach folgender Formel berechnet: Chl a + b = 27,8 · E652 [µg ml-1]

Tab. 2.1: Liste der in dieser Arbeit verwendeten und erstellten Stämme

Stamm Beschreibung Referenz

CC-124 Wildtyp 137c, mt+ Chlamydomas-Kultursammlung, Duke University, Durham, NC, USA

CC-620 mt+ 137c R3 NM Unterklon Chlamydomas-Kultursammlung, Duke University, Durham, NC, USA

CC-621 mt- 137c NO Unterklon Chlamydomas-Kultursammlung, Duke University, Durham, NC, USA

MR9 Mutante CW- 388- pARG7.8

(HYD1Promotor:ARS2) Stirnberg, 2002

KM99-14 C- / Wildtyp CC-124 (APHVIII) Katrin Müllner, persönliche Mitteilung

41-6 Mutante CW- 388- pARG7.8

(HYD1Promotor:ARS2:crr1) diese Arbeit

B25 Mutante CW- 388- pARG7.8

(HYD1Promotor:ARS2:crr1:CRR1) diese Arbeit

#5 CC-3960 transformiert mit pARG7.8

Janette Kropat, UCLA, persönliche Kommunikation

2.1.2 Escherichia coli

Für molekularbiologische Arbeiten wurde der E. coli Stamm DH5α MCR (F’end A1

hsd 17 (rk-mk+) sup E44 thi-1 rec A1 ∆ (laclzyA-argF) u 169 deo R) (Woodcock et

al., 1989) verwendet. Die Anzucht von E. coli erfolgte bei 37 °C auf LB-Agar-

Platten (35 g l-1 LB Agar, Roth/LABTM) oder in LB-Flüssigmedium der Firma Sigma

(25 g l-1). Die Lagerung der Stämme erfolgte bei -80 °C in G lycerolkulturen.


22

2.2 Plasmide

Tab. 2.2: Liste der in dieser Arbeit verwendeten oder erstellten Plasmide

Plasmid Beschreibung Referenz

pSL18 Besitzt die Resistenz gegen Paramomycin (APHVIII)

Depège et al., 2003

pGEM_hydA1_3’UTR pGEM-T Easy mit HYDA1-3’UTR Astrid Weber pGEM_L10a pGEM-T Easy mit RPL10a-3’UTR Gabrielle Philipps

pHyg3 Besitzt die Hygromycin-Resistenz (APHVII)

Berthold et al., 2002

pMP1 pBS SK+ mit Insert aus C. reinhardtii (BAC1E12)

Diese Arbeit

pMP2 pBS SK+ mit Insert aus pMP1 Diese Arbeit

pMP01 pCL20 mit HYD1 Promotor (-29 bis +44)

Diese Arbeit

2.3 Oligonukleotide

Tab. 2.3: Übersicht der in dieser Arbeit verwendeten Oligonukelotide (Sigma-Aldrich)

Primer Sequenz Zielgen Verwendung

AphVIII ACGATGCGTTGCGTGCACTG APHVIII

Sonde

Southern Blot

AphVIII_rev GAGACTGCGATCGAACGGACAC

ARS01 GTCGACGGTACCGGTCGCGCATAGG

CAAGCTC ARS2

Übergang

HYDA1:ARS2

HydA01 GTCGACGGTACCGGTCGCGCATAGG

CAAGCTC

HYD1-

Promotor

hydA1 qRTfor ATCCGCGAGCTGTACGACAC HYD1 RT PCR

hydA1 qRTrev CTGGCGCTCCTCACTTCTTC

HYDA1_2383_F

w GCGATTGACGTTGGTGTAGG

HYD1 qPCR

HYDA1_2535_Rv GTGCTTACAAGCGGCTGATG

HYDEF-2fwd CTGCATGATTGACGCCCAGA HYDEF RT-PCR

HYDEF-2rev AGGCGGCCCAAGAGAAGAAC

hydG qRTfor CCGGTCAATGACGCTGACTT HYDG RT-PCR


23

hydG qRTrev ATCTGGCTCATGCCGCACTT

CPX1-fd CCAGACCTCCAAGCGTGTGT CPX1 RT-PCR

CPX1-rv GCGTTGCGGATCACCTTCTC

CYC6-fw GCGGCTGCCAAGCGCGGTGCGGATG CYC6 RT-PCR

CYC6-rev CTGCTCAAGGGCGGCCTTGTCCAG

FDX5-fd ACCATCCTCACGCACCAG FDX5 RT-PCR

FDX5-rv CCCCTCCGTTGCGTGATAAA

PFL1_4634 CAAGTACGGCAACGACGATG PFL1 RT-PCR

PFL1_4923 ACGTTGGAGGTGATGGTCAG

crr1fsteve TGCGTGTTTGTTGTTTCAGG CRR1 RT-PCR

crr1rsteve GCCAGGTGTGATGGAGAGAC

CYG12-fd CGAAGGCTGCTTGCTTGAGA CYG12 RT-PCR

CYG12-rv GGTGGCATTGCGTGTGGTAA

au5.g1421_t1-fd CTGACGGTGCCGGAGAAGAA au5.g1241

_t1 RT-PCR

au5.g1421_t1-rv CACTGCCTGCACACGCAACT

CBLP-fd GCCACACCGAGTGGGTGTCGTGCG CBLP

RT-PCR

qPCR

CBLP-rv CCTTGCCGCCCGAGGCGCACAGCG

L10a_qRTfor GCTTCGGACTCCGTCATCAA RPL10A qPCR

L10a_qRTrev CCATGCACAGCACCTTCTTC

Paro06 TACCGGCTGTTGGACGAGTTC

APHVIII Inverse PCR

Paro07 GAGTGTTCCGCGGCGTTCC

5’GSP1 CATACGCACCAATCATGTCAAGCCTC

AG

5’GSP2 GTCTGCCTGACAGGAAGTGAACGCAT

GT

Paro3’ CTAAGCTACCGCTTCAGCACTTG APHVIII PCR

Paro5’ GACATGCGTTCACTTCCTGTC APHVIII

HydA8Pro8_XhoI GCCTCGAGCTTGTCGCGTCTACGATA

TTAG HYD1-

Promotor

Klonierung

pMP01

HydA1Cr_M1_AA

GC_ApaI

TGGGGCCCCATAGGCGTACTCGCAA

ATGCTGT


24

2.4 Molekulargenetische Methoden

2.4.1 Kerntransformation von C. reinhardtii

C. reinhardtii Zellen wurden nach der „glass beads“ Methode von Kindle (Kindle,

1990) transformiert. Die Integration der Fremd-DNA erfolgt dabei ungerichtet. Die

Zellen wurden bis zur logarithmischen Wachstumsphase angezogen, in frischem

Medium aufkonzentriert und mit 1,5 bis 2 µg DNA in einem Reagenzglas mit

Glasperlen (G-8772 acid washed, Sigma-Aldrich) für 30 bis 45 Sekunden kräftig

geschüttelt. Die Zellsuspension wurde dann auf TAP-Platten mit 1 % (w/v) Sorbitol

ausgestrichen. Nach einem Tag wurden die Agarplatten auf Filterpapier mit

Paromomycin oder Hygromycin (5 µg ml-1) umgesetzt. Handelte es sich um

zellwandhaltige Stämme, fand vor der Transformation eine Autolysinbehandlung

statt. Dazu wurden die aufkonzentrierten Zellen 55 min unter leichtem Schütteln

mit einer Autolysinlösung inkubiert, nach erfolgreichem Abbau der Zellwand

abzentrifugiert und in frisches TAP Medium überführt. Die Transformation erfolgte

im Anschluss wie beschrieben, wobei zusätzlich 20 %iges PEG-8000 (Sigma-

Aldrich) verwendet wurde.

Für die Produktion von Autolysin wurden die Stämme CC620 und CC621 bis zur

logarithmischen Wachstumsphase in TAP Medium angezogen. Nach einem

Waschschritt mit TAP-N Medium wurden die Zellen im halben Volumen der

Ausgangskultur TAP-N Medium überführt und für 20 Stunden geschüttelt. Beide

Kulturen wurden dann nochmals in TAP-N Medium aufkonzentriert und in einem

Kolben mit großer Oberfläche vereinigt. Die Produktion von Autolysin erfolgte über

Nacht bei einer moderaten Lichtintensität ohne Schütteln. Sezerniertes Autolysin

wurde durch Zentrifugation (4 °C, 4000 rpm, 15 min) geerntet.

2.4.2 Transformation und Plasmidisolierung aus E. coli

Für die Transformation von kompetenten E. coli DH5α Zellen (Sambrook et al.,

1989) wurden 50 bis 250 ng Plasmid-DNA auf 200 µl kompetente Zellen gegeben

und diese anschließend 40 min auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock bei

42 °C für 1 min wurden 500 µl frisches LB-Medium zu den Zellen gegeben und

diese 30 min bei 37 °C inkubiert. Alternativ wurde eine Induktion der Kompetenz


25

erreicht, indem frisch angezogene E. coli DH5α Zellen mit einer OD600 von 0,3 bis

0,4 in steril filtriertem TSS-Medium (2 % (w/v) LB, 10 % (w/v) PEG8000, 5 % (v/v)

DMSO, 50 mM MgCl2) resuspendiert und auf Eis gestellt wurden. Die

nachfolgende Transformation erfolgte wie beschrieben. Die Isolierung von „high-

copy“-Plasmiden aus E. coli erfolgte mit dem Gene JETTM Plasmid Miniprep Kit

(Fermentas) nach den Angaben des Herstellers. Die Isolierung von bakteriellen

artifiziellen Chromosomen (BAC) erfolgte mit dem „Nucleobond AX“ Kit

(Macherey-Nagel).

2.4.3 Restriktion und Ligation von DNA

Die Restriktion von Plasmid- und BAC-DNA erfolgte mit

Restriktionsendonukleasen (Fermentas) nach Herstellerangaben. Für Ligationen

von Vektor und Insert wurde eine T7 Ligase (Fermentas) nach Herstellerangaben

verwendet. Die Klonierung von PCR-Produkten erfolgte mit dem „pGEM-T Easy“

System (Promega). Die Sequenzierung von DNA erfolgte nach dem

Didesoxyribonukleotid-Kettenabbruch-Prinzip (Sanger et al., 1977) an der Fakultät

für Biochemie und Chemie der Ruhr-Universität Bochum.

2.4.4.Gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fra gmenten

Die gelelektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgte je nach

Verwendung in 1 bis 2 %igen (w/v) Tris-Acetat-EDTA (TAE) Agarosegelen

versetzt mit 0,5 µg µl-1 Ethidiumbromid für 30 min bei 90 V. Um bestimmte DNA-

Fragmente aus Agarosegelen zu isolieren, wurde die gewünschte Bande

ausgeschnitten und die DNA mit dem „GFXTM PCR DNA and Gel Band

Purification“ Kit (GE Healthcare) nach Angaben des Herstellers eluiert.

2.4.5 PCR

Die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) (Mullis und

Faloona, 1987) ermöglicht eine exponentielle in vitro Vervielfältigung von DNA-

Fragmenten. Das zu amplifizierende Fragment wurde durch spezifische

Oligonukleotide definiert und mit der DNA-Taq-Polymerase (Biotools) nach

Herstellerangaben amplifiziert.


26

Inverse PCR

Mit Hilfe der Inversen PCR lassen sich unbekannte Bereiche genomischer DNA

amplifizieren, die eine bekannte Sequenz begrenzen. Dazu werden Primer

benötigt, die auf der bekannten Sequenz liegen und die Amplifikation in Richtung

der unbekannten genomischen DNA ermöglichen. Die isolierte genomische DNA

wurde zunächst mit Restriktionsenzymen geschnitten und die entstandenen

Fragmente mit einer T4-DNA-Ligase bei 16 °C über Na cht religiert, wodurch sich

zirkuläre DNA-Fragmente bildeten. Die unbekannte gDNA wurde dann mit Hilfe

einer PCR wie beschrieben amplifiziert.

2.4.6 Isolierung genomischer DNA aus Grünalgen

Die Isolierung genomischer DNA erfolgte nach Newman (Newman et al., 1990).

Zellkulturen von C. reinhardtii wurden dazu in der späten logarithmischen Phase

geerntet, in Lysispuffer (1 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 3 % SDS) aufgeschlossen

und die Nukleinsäuren mehrmals mit Phenol/Chloroform-Isoamylalkohol (24:1)

extrahiert. Um eine bessere Phasentrennung zu ermöglichen wurde vor dem

ersten Extraktionsschritt TE Puffer (10 mM Tris-HCL pH 8.0, 0,1 mM EDTA)

hinzugegeben. Extrahierte RNA wurde durch einen RNase Verdau (Roth) entfernt

und die Fällung der genomischen DNA erfolgte durch Zugabe von Ethanol absolut

bei Raumtemperatur. Die pelletierte gDNA wurde nach einem Waschschritt mit

70 %igem Ethanol in Wasser gelöst und photometrisch quantifiziert (Nanodrop,

Peqlab). Eine qualitative Kontrolle der isolierten DNA erfolgte optisch durch eine

Agarose-Gelelektrophorese.

2.4.7 Southern Blot-Analyse

Die Integrationshäufigkeit von Plasmiden im Genom von C. reinhardtii wurde mit

Hilfe von Southern Blot Analysen ermittelt (Southern, 1975). Die verdaute

genomische DNA wurde gelelektrophoretisch in einem 0,8 %igen Agarose Gel

aufgetrennt und durch einen 20 x SSC Kapillarblot auf eine Membran (Hybond-N,

Amersham) übertragen. Die Herstellung von DNA-Sonden mittels PCR wurde mit

genspezifischen Oligonukleotiden und dem DIG-Labeling Kit (Roche)

durchgeführt. Die im Kit enthaltenen dNTPs sind mit dem Hapten Digoxigenin


27

markiert, das durch einen spezifischen Anti-Digoxigenin-Antikörper (Roche)

nachgewiesen werden kann. Die Hybridisierung der DNA-Sonde an die DNA

erfolgte bei 64 °C im Wasserbad über Nacht. Die mar kierte DNA wurde am

LumiImager (FluorChem 8800, Alpha Innotech) detektiert.

2.4.8 Isolierung von Gesamt- und mRNA aus Grünalgen

Die Gesamt-RNA aus C. reinhardtii wurde durch Phenolextraktion isoliert (Schloss

et al., 1984). Die Fällung der RNA erfolgte entweder mit 8 M LiCl über Nacht auf

Eis oder dem 2,5 fachen Volumen Ethanol absolut über Nacht bei -20 °C. Das mit

70 % Ethanol gewaschene Pellet wurde in DMDC-H2O aufgenommen und

qualitativ in einem Agarose Gel kontrolliert. Die quantitative Bestimmung der

RNA-Menge erfolgte spektrophotometrisch (NanoDrop, Peqlab). In der

RNA-Probe enthaltene genomische DNA wurde in einem DNase-Verdau

(TurboDNase, Ambion) nach Herstellerangaben entfernt. Die Isolierung von

mRNA aus DNase verdauter Gesamt-RNA wurde mit dem „Oligotex mRNA Mini“

Kit (Macherey-Nagel) wie angegeben durchgeführt.

2.4.9 RT-PCR

Die Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR) wurde mit dem „One Step RT-PCR“ Kit

(Qiagen) nach Herstellerangaben durchgeführt. Als Matrize diente isolierte mRNA.

2.4.10 Northern Blot-Analyse

Northern Blot-Analysen wurden standardmäßig mit 20 µg RNA durchgeführt. Die

denaturierten RNA-Proben wurden in einem Formaldehydgel (1,5 %)

gelelektrophoretisch aufgetrennt und mit Hilfe eines alkalischen Kapillarblots auf

eine positiv geladene Nylonmembran übertragen (Li et al., 1987). Die

Vorhybridisierung (30 min) und die Hybridisierung mit spezifischen RNA-Sonden

(über Nacht) erfolgte in „DIG Easy Hyb“ (Roche) im Schüttelwasserbad bei 64 °C.

Im Anschluss wurde die Membran zweimal mit 0,1 x SSC / 0,1 % SDS bei

Hybridisierungstemperatur gewaschen. Nach Absättigung der freien Bindestellen

auf der Membran durch Blockingreagenz (1 % in Maleinsäurepuffer, 30 min bei

Raumtemperatur) wurde für weitere 30 min der anti-DIG Antikörper (Roche)


28

hinzugegeben. Die Membran wurde dann zweimal in Maleinsäurepuffer

gewaschen, in Puffer 3 äquilibriert (0,1 M Tris pH 9.5, 0,1 M NaCl, 0,05 M MgCl2),

mit dem Substrat „CDP-Star“ (Roche) in Puffer 3 beträufelt und 15 min bei 37 °C

inkubiert. Die Detektion erfolgte mit dem LumiImager (FluorChem 8800, Alpha

Innotech).

2.4.11 Synthese von cDNA

Die Synthese von cDNA erfolgte aus DNase verdauter RNA unter Verwendung

von Oligo(dT)18 Nukleotiden (Sigma-Aldrich), peqGOLD dNTP Mix (PeqLab) und

RNasin (Promega) mit der M-MLV Reversen Transkriptase (Invitrogen) nach

Herstellerangaben. Vor der Durchführung nachfolgender Amplifikationen wurde

die cDNA 1:10 verdünnt.

2.4.12 Real-Time quantitative PCR

Mit Hilfe der Real-Time quantitativen PCR (qPCR) können sowohl DNA als auch

Transkriptmengen quantifiziert werden. Hierzu wird die in der Gesamt-RNA

enthaltene mRNA durch eine reverse Transkription in cDNA umgeschrieben.

Durch den Einsatz des Fluoreszenzfarbstoffes SYBR-Green kann die Zunahme

des Amplifikats nach jedem PCR-Zyklus quantifiziert werden und ermöglicht so

eine Aussage über die ursprünglich enthaltene Transkriptmenge (Pfaffl, 2001).

Die Real-Time PCR wurde in dem Real-Time PCR-Gerät „DNA Enginge Opticon

2“ (MJ Research) mit dem peqGOLD Taq DNA Polymerase Kit (Peqlab) nach

Herstellerangaben durchgeführt. Der benutzte SYBR-Green-Mix enthielt SYBR-

Green (10.000x in DMSO, Sigma), Tween 20 (Carl Roth), BSA (10 mg ml-1, Carl

Roth), DMSO (Carl Roth) und Wasser (Merck). Die Auswertung der PCR-Daten

erfolgte mit dem Programm „Opticon Monitor Analysis Software V.2.02.24“ der

Firma MJ Research. Für die Quantifizierung von DNA-Mengen mit Hilfe des C(T)-

Wertes können verschiedene Rechenmodelle herangezogen werden (Pfaffl,

2001). In dieser Arbeit wurde das Verhältnis der Menge einer bestimmten zu

testenden cDNA zur Menge der cDNA eines Referenzgens wie folgt berechnet:

))((

))((

1Pr)(2Pr)((

)1Pr)(2Pr)((

22

22

cDNAKontrollTC

cDNATC

obecDNAKontrollTCobecDNAKontrollTC

obecDNATCobecDNATC

−∆

∆

−−−

−

=


29

Das Amplikon der CBLP cDNA (au5.g5047_t1, JGI v4.0) diente als Referenzgen

für die Berechnungen. Die Effizienz der eingesetzten Oligonukleotide wurde mit

einer cDNA-Verdünnungsreihe überprüft.

2.5 Proteinbiochemische Methoden

2.5.1 Gewinnung von Proteinrohextrakten aus C. reinhardtii

Proteinrohextrakte wurden durch kurzes Abzentrifugieren der gewünschten

Zellmenge (25 µg Chl ml-1) gewonnen. Nach Resuspension des Pellets in 200 µl 5

x Proteinproben Puffer (0,1 M Tris HCL pH 6.8, 10 % SDS, 25 % Glycerin, 12,5 %

β-Mercaptoethanol, 0,05 % Bromphenolblau) wurden die Proben 5 min bei 95 °C

denaturiert und bei 4 °C gelagert.

2.5.2 Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western B lot-Analyse

Die gelelektrophoretische Auftrennung von Proteinen erfolgte unter

denaturierenden Bedingungen in diskontinuierlichen 8 bis 16 %igen Tricin-SDS-

Polyacrylamidgelen (Schagger und von Jagow, 1987; Schagger, 2006) für 3 bis 4

Stunden bei 60 V. Als Standard diente der PageRulerTM Prestained Protein Marker

(Fermentas). Zur Färbung der Gele wurden diese mit 0,1 % Coomassie R250 in

10 x Entfärber (45 % Ethanol, 45 % Essigsäure, 10 % Wasser) für 15 min

geschwenkt und mit 1 x Entfärber mehrere Stunden entfärbt.

Zur Detektion spezifischer Proteine wurden Western Blot-Analysen durchgeführt.

Der Transfer der Proteine auf PVDF (Transferpuffer: 20 % Methanol, 25 mM Tris,

192 mM Glycin) erfolgte in einem Elektro-Blot in einer semi-dry B44 Fast-Blot-

Zelle (Biometra) für 23 min bei 240 mA. Freie Bindestellen auf der Membran

wurden durch Inkubation der Membran für 1 h bei Raumtemperatur in Blocking-

Puffer (1,5 % Magermilchpulver in PBS-Puffer (4 mM KH2PO4, 16 mM Na2HPO4)

mit 0,1 % Tween) abgesättigt. Es folgte eine Inkubation mit dem Erstantikörper bei

4°C über Nacht. Als Zweitantikörper diente ein goat -anti-rabbit-Antikörper (Pierce),

der durch eine gebundene „horse radish peroxidase“ (HRP) nach Umsetzen eines


30

Substrates (Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate, Pierce;

ImmobilonTM, Millipore) die Detektion durch Chemilumineszenz ermöglicht

(FluorChem 8800, Alpha Innotech).

Tab.2.4: Antiseren, die in dieser Arbeit verwendet wurden

Antiseren Beschreibung Verdünnung Referenz

rabbit-anti-HYD1 Polyklonaler, gegen C. reinhardtii

HYD1 gerichteter Antikörper 1:5000

Happe et al.,

1994

rabbit-anti-FDX5 Polyklonaler, gegen C. reinhardtii

FDX5 gerichteter Antikörper 1:1000

Jacobs et al.,

2009

ImmunoPure

goat-anti-rabbit

IgG,

sekundärer Antikörper, an

Peroxidase gekoppelt 1:5000 Pierce

2.6 Analyse von Proteinsequenzen

Die Analyse von Proteinsequenzen wurde mit den Online-Diensten „InterProScan

Sequence Search“ (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/), „Motif Scan“

(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan) (Sigrist et al., 2010), „Scan Prosite

Tool“ (http://prosite.expasy.org/scanprosite/) (Gasteiger et al., 2003) und „NCBI

Blastp“ (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul et al., 1997) durchgeführt.

2.7 Physiologische Methoden

2.7.1 Ermittlung von Photosynthese- und Respiration sraten

Die Ermittlung von Photosynthese- und Respirationsraten erfolgte mit einer

Clarkschen Sauerstoffelektrode (Hansatech®, H. Saur Laborbedarf, Reutlingen,

Deutschland). Der Nullwert der Sauerstoffelektrode wurde durch Zugabe von

Natriumdithionit zu einer Wasserprobe eingestellt. Der Maximalwert wurde mit

Hilfe von sauerstoffgesättigtem Wasser ermittelt. Die Kulturprobe (1 ml) wurde in


31

die Messzelle mit einem Magnetrührer überführt und luftdicht verschlossen.

Photosyntheseraten wurden bei einer Lichtintensität von 80 µE, Respirationsraten

im Dunkeln, gemessen. Die Sauerstoffaufnahme- bzw. Sauerstoffabnahmeraten

wurden aus der Steigung der Schreiberkurve berechnet und auf die

Chlorophyllkonzentration der eingesetzten Zellkultur normiert.

2.7.2 Ethanol und Formiat Enzym-Test

Die Menge an Ethanol und Formiat in C. reinhardtii Kulturen wurde mit einem

Ethanol- oder Ameisensäure(Formiat)-Enzymtest (Boehringer Mannheim/

R-Biopharm, Darmstadt, Deutschland) spektrophotometrisch nach

Herstellerangaben bestimmt.

2.7.3 Arylsulfatase-Screening

Das verwendete Reportergen ARS2 des im Stamm MR9 integrierten chimären

Konstruktes entspricht dem natürlich in C. reinhardtii vorliegendem ARS2 Gen

(Cre16.g671350, Phytozome v7.0). Die zelleigene Arylsulfatase wird unter Mangel

an freiem Sulfat exprimiert (de Hostos et al., 1989), in das umgebende Medium

sezerniert und katalysiert dort die Hydrolyse von organischen Sulfatestern. Daher

kann auch die chromogene Substanz 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-sulfat (X-SO4,

Sigma Aldrich) zum Nachweis von Arylsulfatase-Aktivität verwendet werden. Bei

Umsetzung von X-SO4 durch die Arylsulfatase entsteht 5-Brom-4-chlor-Indoxyl,

das zum tiefblauen Farbstoff Indigo oxidiert wird.

Eine Insertionsmutanten-Bibliothek mit einem Umfang von 10.000

Transformanden wurde durch Kerntransformation des Stammes MR9 mit der

Paromomycin-Resistenzkassette des Plasmids pSL18 angelegt. Vorbereitend für

das Screening wurden die Transformanden auf TAP Agarplatten mit 1 % Sorbitol

und 5 µg ml-1 Paromomycin überführt. Neben den Transformanden wurden der

Stamm MR9 sowie die zwei Stämme KM16-36 und KM99-14 auf jede Platte

gebracht. Der Stamm MR9 besitzt keine Paromomycin-Resistenz und stellte eine

Kontrolle der Selektions-wirkung des Antibiotikums dar. Die Negativkontrolle

KM99-14 (C-) besitzt eine Paromomycin-Resistenz, jedoch nicht das chimäre

HYD1-Promoter/ARS2-Konstrukt. Dadurch konnte sichergestellt werden, dass


32

eine entstandene Blaufärbung der Transformanden nicht auf die zelleigene, unter

Schwefelmangel exprimierte Arylsulfatase zurückzuführen war. Die

Transformanden wurden bei konstanter Belichtung (50 µE) 9 bis 14 Tage

angezogen und für das Screening ins Anaerobzelt überführt. Unter diesen

Bedingungen wird der HYD1-Promoter aktiviert (Happe und Kaminski, 2002), so

dass auch das ARS2-Gen des chimären HYD1-Promoter/ARS2-Konstrukts

exprimiert wird (Stirnberg und Happe, 2004). Nach einer Anaerobisierung über

zwei bis vier Stunden wurden 25 µl einer 3 mM X-SO4 Lösung in Tris-HCl pH 7,5

auf jede Algenkolonie geträufelt. Die Inkubation mit dem Substrat erfolgte über

Nacht. Transformanden, deren Arylsulfatase unter HYD1-Promotor-Kontrolle aktiv

war, zeigten eine deutliche blaue Färbung. Die Transformanden, die keinen

blauen Ring um ihre Kolonie aufwiesen, wurden zunächst in einem zweiten

Screening überprüft und dann physiologisch in Bezug auf ihre

Wasserstoffproduktion sowie molekularbiologisch charakterisiert.

2.7.4 Anaerobe Induktion

Die artifizielle Anaerobisierung von C. reinhardtii Kulturen ermöglicht eine schnelle

Induktion des Wasserstoffmetabolismus (Happe und Kaminski, 2002). Die

Anaerobisierung wurde dabei entweder durch Stickstoffbegasung oder gasdichten

Verschluss der Kulturen erreicht. Für eine anaerobe Induktion durch

Stickstoffbegasung wurden die Zellen bis zu einem Chlorophyllgehalt von etwa 20

µg ml-1 angezogen, aufkonzentriert (zwischen 60 und 80 µg Chl ml-1), in

Falcongefäße überführt und abgedunkelt. Es erfolgte dann eine Begasung mit

Stickstoff über einen Zeitraum von 4 bis 6 Stunden.

Sollten die Zellen durch gasdichten Verschluss anaerobisiert werden, wurden

diese bis zu einem Chlorophyllgehalt von 15 µg ml-1 angezogen, in frisches

Medium überführt und abgedunkelt in Vierkantflaschen auf einen Magnetrührer

gestellt. Der Verschluss der Vierkantflaschen erfolgte mit einem Suba-Stopfen

(Sigma-Aldrich).


33

2.7.5 Messung der in vitro-Hydrogenaseaktivität

Die in vitro-Hydrogenaseaktivität gibt Auskunft über die Gesamtaktivität an

Hydrogenase, ohne dabei eine Aussage über die physiologische

H2-Bildungsaktivität zu treffen. Der in vitro Reaktionsansatz (1 ml 50 mM Kalium-

Phosphat-Puffer pH 6.8, 1 % Triton X-100, 100 mM Natriumdithionit, 10 mM

Methylviologen) wurde in einem Rollrandgefäß mit einem Suba Stopfen (Sigma-

Aldrich) gasdicht verschlossen und 5 min mit Argon entgast. Die Zellen der zu

untersuchenden Kultur wurden mit einer Kunststoffspritze in das Rollrandgefäß

gegeben. Dieses wurde dann zum Zellaufschluss kräftig geschüttelt und nochmals

eine Minute mit Argon entgast. Nach einer Inkubation im Schüttelwasserbad (20

min, 37 °C) konnte die Gasphase des in vitro Reaktionsansatzes im

Gaschromatographen (GC-2010, Shimadzu) analysiert werden. Die gemessene

Menge an Wasserstoff wurde nach Eichung des Chromatographen nach folgender

Formel berechnet.

112

2

/

403 −− ∗∗∗

∗∗=− hChlµgHnmolhmenKulturvolumlChlµg

HnmoleaktivitätHydrogenasvitroin

ba

a: 20 min Inkubation, b: Injektion von 200 µl Gasphase (bei einem Gefäßvolumen von

8 ml)

2.7.6 Kupfermangel Induktion

Kulturen, die unter kupferfreien Bedingungen angezogen werden sollten, wurden

aus einer TAP Vorkultur in ENEA2-Medium mit Zugabe des Kupferchelators TETA

(Triethylentetramin, 50 µM) (Ferrante et al., 2008) überimpft (1. Runde). Aus

dieser kupfermangelinduzierten Vorkultur wurden die Kulturen nochmals in

frisches ENEA2 Medium mit TETA überimpft. Verwendete Glaswaren wurden im

Vorfeld mit HCl und Millipore Wasser gespült (Quinn und Merchant, 1998).

2.7.7 Luziferaseaktivitätsmessungen

Für die Luziferaseaktivitätsmessungen wurden die Zellen zunächst wie

beschrieben unter Kupfermangel bis zu einer Zelldichte von circa 15 µg Chl ml-1

angezogenen. 1,5 ml der Zellkultur wurden dann in einem Ultraschallwasserbad


34

aufgeschlossen (3 x 30 sec) und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Kurz vor

Messung der Luziferaseaktivität wurden die aufgeschlossenen Zellen aufgetaut

und je 200 µl zusammen mit 1 µl Coelenterazin (2 mM) in eine 96 Well Platte

gegeben. Aktives Luziferaseprotein setzt das Coelenterazin zu Coelenteramid um.

Dabei wird Sauerstoff verbraucht und Photonen emittiert. Die emittierten Photonen

wurden in einem Luminometer gemessen (96-microplate luminometer, Berthold

detection systems, verbunden mit dem Programm simplicity2.1), das in der

Abteilung für Molekulare und Medizinische Virologie (AG Grundwald) an der

Ruhr-Universität Bochum freundlicherweise zur Verfügung gestellt wurde. Das

erhaltene Messergebnis wurde in RLU („relative luminescence units“) angegeben.

Von den mit Coelenterazin gemessenen RLU wurde der Leerwert (nur Zellen ohne

Coelenterazin, ca. 15 RLU) abgezogen.

Ergebnisse

35

3 Ergebnisse

Bereits im Jahr 1939 entdeckte Hans Gaffron, dass C. reinhardtii in der Lage ist

molekularen Wasserstoff zu produzieren. Das Schlüsselprotein dieses

Stoffwechsels, die Hydrogenase (HYD1), wurde identifiziert und isoliert (Roessler

und Lien, 1984; Happe und Naber, 1993; Happe et al., 1994) und das

dazugehörige Gen (HYD1) charakterisiert (Happe und Kaminski, 2002). Die

Regulation der HYD1-Genexpression ist jedoch nur in Ansätzen bekannt. In dieser

Arbeit sollten regulative Faktoren der Expression von HYD1 und anaerob

induzierter Schlüsselgene zum einen durch das Screening einer

Insertionsmutantenbibliothek und zum anderen durch Inhibitorstudien identifiziert

werden.

3.1 Identifizierung von regulativen Faktoren des HYD1-Promotors

Innerhalb weniger Minuten unter anaeroben Bedingungen kommt es in

C. reinhardtii zu einer Induktion des HYD1-Transkriptes (Happe und Kaminski,

2002). Die Analyse der Promotoraktivität unterschiedlich langer Fragmente des

HYD1-Promotors zeigte, dass die Region von -128 bis -21 ausgehend vom

Transkriptionsstartpunkt ausreichend für die Aktivität ist (Stirnberg und Happe,

2004). Regulative Faktoren der Promotoraktivität konnten jedoch bislang nicht

identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher mit einem etablierten

Screeningsystem (Pape, Diplomarbeit 2008) gezielt nach Mediatoren der

Hydrogenase-Promotoraktivität gesucht. Dazu wurde eine Insertionsmutanten-

Bibliothek von über 10.000 Transformanten des Stammes MR9 erstellt.

C. reinhardtii MR9 (HYD1pro:ARS2) besitzt ein stabil integriertes

Reportergenkonstrukt bestehend aus einer Region stromaufwärts des

Translationsstartpunktes des HYD1 Gens und einer Arylsulfatase (ARS2) (Abb.

3-1). Ist der HYD1-Promotor aktiv, kann die Arylsulfatase gebildet werden und das

Ergebnisse

36

künstliche Substrat X-SO4 zu einem blauen Indigofarbstoff umsetzen (Stirnberg

und Happe, 2004).

Abb. 3-1: Schematische Darstellung des chimären Rep ortergen-Konstruktes. Der Bereich

stromaufwärts des Translationsstartpunktes (ATG) des HYD1-Gens wurde vor das Arylsulfatase-

Reportergen (ARS2) kloniert und in den Stamm MR9 integriert. TS: Transkriptionsstartpunkt.

Die Transformation des Stammes MR9 mit einer Paromomycin-Resistenzkassette

führt zu ungerichteten Insertionen in der genomischen DNA. Findet die Insertion in

einem Gen statt, dessen Produkt regulierend auf die Aktivität des HYD1-

Promotors wirkt, resultiert dies in einer Änderung der Blaufärbung. Ein aktiver

HYD1-Promotor kann so einfach und schnell optisch erkannt werden (Abb. 3-2).

Abb. 3-2: Schema des hier verwendeten Screenings na ch Transformanten mit veränderter

HYD1-Promotoraktivität. Nach Transformation des Stammes MR9 mit der Paromomycin-

Resistenzkassette wurden die Transformanten auf frischen TAP-Agar Platten unter aeroben oder

anaeroben Bedingungen mit dem Substrat X-SO4 inkubiert. Bei aktivem HYD1 Promotor kann die

gebildete Arylsulfatase das Substrat zu einem blauen Indigofarbstoff umsetzen. Stamm MR9 diente

zur Kontrolle des Antibiotika-Selektionsdruckes. Die Aktivität der zelleigenen Arylsulfatase wurde

mit einer Transformante (C-; KM99-14) überprüft, die eine Paromomycin-Resistenz, jedoch kein

Reportergenkonstrukt enthält.

Ergebnisse

37

Ein durch die Transformation verursachter Defekt in einem negativ regulierenden,

inhibierenden Faktor würde zu einem aktiven HYD1-Promotor auch unter nicht

induzierenden Bedingungen führen. Die Promotoraktivität von 6.000

Transformanten wurde daher unter aeroben Bedingungen untersucht. Dabei

konnte keine Transformante mit aktivem Promotor gefunden werden. Positiv

regulierende, aktivierende Faktoren würden unter anaeroben, also induzierenden

Bedingungen einen Aktivitätsverlust des HYD1-Promotors verursachen. Über

10.000 Transformanten wurden daher unter sauerstofffreien Bedingungen

bezüglich ihrer HYD1-Promotoraktivität getestet. Anaerobe Bedingungen wurden

durch Überführen der Transformanten in ein Anaerob-Zelt erreicht. Neben zwei

bereits untersuchten Transformanten (Pape, Diplomarbeit 2008) konnte eine

weitere Transformante identifiziert werden, die keine Blaufärbung mehr zeigte

(Abb. 3-8). Diese Transformante wurde 41-6 genannt und genetisch sowie

physiologisch charakterisiert.

3.2 Charakterisierung der C. reinhardtii-Transformante 41-6 mit

eingeschränkter HYD1-Promotoraktivität

3.2.1 Die genetische Charakterisierung der Transfor mante 41-6 zeigt einen

Defekt im CRR1-Gen

Die Integration von Fremd-DNA in das Genom von C. reinhardtii erfolgt

ungerichtet und nicht selten werden mehrere Kopien der Fremd-DNA eingebaut.

Um die Integrationshäufigkeit der Paromomycin-Resistenzkassette in der

Transformante 41-6 zu bestimmen, wurde daher eine Southern Blot-Analyse

durchgeführt (Abb. 3-3). Die genomische DNA der Transformante 41-6 zeigte

nach Hybridisierung mit einer spezifischen Sonde gegen die Paromomycin-

Kassette in drei unterschiedlichen Restriktionsansätzen ein Signal. Die

genomische DNA der untransformierten Kontrolle MR9 wies keine Bande auf.

Somit konnte gezeigt werden, dass eine singuläre Integration der Paromomycin-

Kassette in das Genom des Stammes 41-6 stattgefunden hatte.

Ergebnisse

38

Abb. 3-3: Analyse der Integrationshäufigkeit der Pa romomycin-Resistenzkassette . Die

genomische DNA der Stämme MR9 und 41-6 wurde mit den Restriktionsenzymen PstI, PvuII und

NsbI geschnitten und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Die Hybridisierung erfolgte mit einer

spezifischen Sonde gegen die Paromomycin-Kassette. Als Positivkontrolle diente das

Ursprungsplasmid der Resistenzkassette pSL18. M: DNA-Standard.

Da die Southern Blot-Sonde gegen die Paromomycin-Kassette lediglich an einen

Bereich von 300 Basenpaaren bindet und es bei der Transformation mit der

Glasperlenmethode in C. reinhardtii zum Zerbrechen der Fremd-DNA kommen

kann, wurde weiterhin überprüft, ob die gesamte Paromomycin-Kassette integriert

wurde. Die Amplifikation mit den Oligonukleotiden Paro5‘ und Paro3‘ wies das

vollständige APHVIII-Gen inklusive der flankierenden Regionen regulativer

Bereiche des RBCS2-, HSP70- und PSAD-Gens nach (Abb. 3-4).

Abb. 3-4: Bestätigung der vollständigen Integration der Paromomycin-Resistenzkassette

durch PCR. Die schematische Darstellung der Paromomycin-Resistenzkassette (rechts) zeigt die

Bindestellen der Oligonukleotide Paro5‘ und Paro3‘ (Amplifikation Paromomycin-Kassette) und der

für die inverse PCR verwendeten Oligonukleotide. Die Paromomycin-Kassette konnte vollständig

amplifiziert werden und wurde somit intakt in das Genom der Transformante 41-6 integriert.

Genomische-DNA des untransformierten Stamms MR9 zeigte keine Bande (links).

Ergebnisse

39

Die genaue Kenntnis der integrierten Sequenz ermöglichte die Lokalisation der

Paromomycin-Kassette im Genom durch inverse PCR (Abb. 3-5). Zunächst wurde

die genomische DNA des Stammes 41-6 mit dem Restriktionsenzym PstI verdaut

und religiert. Dabei entstanden zirkuläre Fragmente genomischer DNA. Enthielt

eines dieser Fragmente die bekannte Sequenz der Resistenzkassette konnte mit

Hilfe spezifischer Oligonukleotide (5’GSP1 und 5’GSP2, Paro07 und Paro06,

Abb. 3-4) das entsprechende Fragment durch PCR vervielfältigt und sequenziert

werden. Eine geschachtelte („nested“) PCR mit weiter innen liegenden

Oligonukleotiden erhöhte dabei die Spezifität der Reaktion.

Abb. 3-5: Schematische Darstellung der inversen PCR . Die genomische DNA des Stammes 41-

6 wurde mit dem Restriktionsenzym PstI geschnitten und religiert. Zirkuläre Fragmente, welche die

Paromomycin-Kassette (rote Linie) enthalten, können mit den spezifischen Oligonukleotiden

5’GSP1/5’GSP2 und Paro07/Paro06 amplifiziert werden (links). Die anschließende Sequenzierung

der flankierenden Bereiche (schwarze und graue Linie) wurde mit den Oligonukleotiden 5’GSP2

oder Paro06 durchgeführt und ergab eine Integration der Paromomycin-Kassette in den Genen

au5.g9305_t1 und au5.g9306_t1 (rechts).

Da das Genom von C. reinhardtii nahezu vollständig sequenziert ist, konnten die

flankierenden Bereiche der Resistenzkassette mit einer BLAST-Analyse und der

Datenbank JGI v4.0 („Joint Genome Institute“, http://genome.jgi-

psf.org/Chlre4/Chlre4.home.html) identifiziert werden. Die Sequenzierungen

(Anhang und schematische Abbildung 3-5) des durch inverse PCR erhaltenen

Fragmentes ergaben nach Vergleich der Sequenzen mit der Datenbank JGI v4.0

eine Integration der Paromomycin-Kassette im Chromosom 2. Das 5’ Ende der

Kassette ist an der Position 6656644, das 3’ Ende an der Position 6642863

Ergebnisse

40

lokalisiert. Durch die Integration der Fremd-DNA wurden demnach 13,78 kb der

genomischen DNA deletiert. Kodierende Bereiche der Gene au5.g9305_t1 und

au5.g9306_t1 wurden durch die Integration der Paromomycin-Kassette im Stamm

41-6 verkürzt (Abb. 3-6).

Abb. 3-6: Schematische Darstellung der Integration der Paromomycin-Resistenzkassette in

das Genom der Transformante 41-6 verglichen mit dem Ursprungsstamm MR9. Durch

Transformation des Stammes MR9 mit der Paromomycin-Resistenzkassette konnte die

Transformante 41-6 isoliert werden. Die Integration der Resistenz-Kassette (rote Box) fand im

Chromosom 2 von Position 6642863 (3‘-Ende) bis Position 6656644 (5‘-Ende) (rote Markierungen)

statt. 13,78 kb genomischer DNA wurden deletiert und die Gene au5.g9305_t1 und au5.g9306_t1

teilweise deletiert.

Um die Integration der Paromomycin-Kassette zu bestätigen, wurden die

Übergänge von der Resistenz-Kassette zur flankierenden genomischen DNA

amplifiziert (Abb. 3-7). Als Matrize diente ungeschnittene genomische DNA des

Stammes 41-6. Durch genspezifische Oligonukleotide für die Paromomycin-

Kassette und für die Gene au5.g9305_t1 und au5.g9306_t1 konnte nachgewiesen

werden, dass die entsprechenden Gene die Paromomycin-Kassette flankieren.

Um die Spezifität der Reaktion zu erhöhen, wurde ebenfalls eine geschachtelte

PCR durchgeführt. Die Änderungen der Amplifikatgrößen am 3‘-Ende (A und B:

740 bp und 480 bp) sowie am 5‘-Ende (C und D: 330 bp und 220 bp) der

Paromomycin-Kassette entsprechen den Vorhersagen, die aufgrund der

bekannten Sequenzen gemacht werden konnten.

Das Gen au5.g9305_t1 kodiert für ein hypothetisches Protein unbekannter

Funktion. Die Proteinsequenz weist keine bekannten Motive oder Domänen auf

(Stephen F. Altschul, 1997; Sigrist CJ, 2010; Gasteiger E, 2003) (siehe Material

und Methoden). Das Gen au5.g9306_t1 kodiert für den „copper response

Ergebnisse

41

regulator“ (CRR1), einen Transkriptionsfaktor, der die Expression

kupferabhängiger Gene reguliert (Kropat et al., 2005). Das CRR1 Gen besitzt

6410 Basenpaare und kodiert für ein 1249 Aminosäuren großes Polypeptid.

Abb. 3-7: Amplifikation der Übergänge zwischen Paro momycin-Kassette und genomischer

DNA im Stamm 41-6 . Mit genspezifischen Oligonukleotiden (Paare A und B, sowie C und D) der

Paromomycin-Kassette (rote Box) und der Gene au5.g9305_t1 (grau) und au5.g9306_t1 (schwarz)

wurden die Bereiche zwischen Fremd-DNA und flankierender genomischer DNA amplifiziert.

Da bekannt ist, dass CRR1 nicht nur unter Kupfermangel die Genexpression

reguliert, sondern auch unter Sauerstoffmangel (Quinn et al., 2000; Quinn et al.,

2002) eine Rolle zu spielen scheint, wurde der Stamm 41-6 zunächst mit dem

CRR1-Gen komplementiert und auf die Restauration des wildtypischen Phänotyps

hin untersucht. Für die Komplementation wurde das bakterielle artifizielle

Chromosom („bacterial artificial chromosome“, BAC) mit der Nummer 1E12

(PTQ139 auf JGI v4.0) zunächst mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut (Abb.

3-8). Dabei entstand ein 9201 bp großes Fragment, welches das komplette

CRR1-Gen (au5.g9306_t1) sowie einen Bereich intergenischer DNA enthielt. Die

Klonierung dieses Fragmentes in den Vektor pBluescript II SK+ resultierte in dem

Plasmid pMP1. Die in pMP1 enthaltene intergenische Region enthält laut

Vorhersagen älterer Annotationen der JGI Datenbank einen Teil eines für ein

hypothetisches Protein kodierenden Gens (JGI v4.0 Protein ID: 324927).

Sequenzanalysen (siehe Material und Methoden) diesen Bereiches ergaben

jedoch weder „Expressed Sequence Tags“ (ESTs) noch bekannte Proteinmotive

oder Domänen des putativ kodierten Proteins. Um dennoch zu gewährleisten,

dass dieser intergenische Bereich bei der Komplementation keine Rolle spielt,

wurde der Bereich des CRR1-Gens aus pMP1 nochmals in den Vektor pBS SK+

Ergebnisse

42

kloniert. Dazu wurde das Plasmid pMP1 mit den Restriktionsenzymen KpnI und

EcoRI verdaut. So konnte eine Sequenz ausgeschnitten und in den Vektor

pBluescript II SK+ kloniert werden, die lediglich das CRR1-Gen, sowie jeweils

272 bp stromauf- und stromabwärts, enthielt.

Abb. 3-8: Klonierungsstrategie zur Komplementation des Stammes 41-6 mit dem CRR1-Gen.

Ein Bereich des Chromosoms 2 (JGI v4.0) wurde mit EcoRI aus BAC 1E12 ausgeschnitten und in

den Vektor pBS II SK+ kloniert. Dieser Bereich enthält neben dem CRR1-Gen (schwarzer Pfeil)

laut älterer Annotationen einen Teil eines Gens, das für ein hypothetisches Protein kodiert (grauer

Pfeil, Protein ID: 324927). Das dabei entstandene Plasmid pMP1 wurde daher mit KpnI und EcoRI

verdaut und das Insert, welches ausschließlich das CRR1-Gen sowie je 272 bp flankierender

genomischer DNA enthält, ebenfalls in den Vektor pBSII SK+ kloniert. Das daraus resultierende

Plasmid pMP2 wurde linearisiert und mit dem Plasmid pHyg3 in den Stamm 41-6 transformiert.

Das entstandene Plasmid pMP2 wurde linearisiert und zusammen mit dem

Plasmid pHyg3, welches eine Hygromycin-Resistenz vermittelt (Berthold et al.,

2002), in den Stamm 41-6 (HYD1pro:ARS2:crr1) transformiert. Insgesamt konnten

114 Hygromycin-resistente Transformanten selektioniert werden. Diese

Transformanten wurden mit dem Arylsulfatase-Test unter anaeroben Bedingungen

auf die Wiederherstellung der Hydrogenase-Promotoraktivität untersucht.

17 Transformanten zeigten eine deutliche Blaufärbung nach Anaerobisierung und

Ergebnisse

43

Inkubation mit dem Substrat X-SO4 und somit einen aktiven HYD1-Promotor. Die

Komplementante B25 (HYD1pro:ARS2:crr1:CRR1) (Abb. 3-9) wurde für weitere

Untersuchungen gewählt.

Abb. 3-9: Aktivität des Arylsulfatase-Reportergens nach

Transformation mit dem CRR1-Gen. Nach

Anaerobisierung und Inkubation mit dem Substrat X-SO4

zeigte eine deutliche Blaufärbung des Wildtyps MR9

(HYD1pro:ARS2) und der Komplementante B25

(HYD1pro:ARS2:crr1:CRR1), dass der Hydrogenase-

Promotor aktiv war. Die Mutante 41-6 (HYD1pro:ARS2:crr1)

wies keine Blaufärbung und somit einen inaktiven HYD1-

Promotor auf.

Die Transformante 41-6 weist eine singuläre Integra tion der Paromomycin-

Resistenzkassette im Chromosom 2 an den Positionen 6656644 und 6642863

auf. Die Gene au5.g9305_t1 und au5.g9306_t1 ( CRR1) wurden dadurch

verkürzt. Die Komplementation mit dem CRR1-Gen restauriert den

ursprünglichen Phänotyp hinsichtlich der Arylsulfat ase-Reportergenaktivität.

3.2.2 Physiologische Charakterisierung der CRR1-def izienten C. reinhardtii

Mutante 41-6

Die CRR1-defiziente Mutante 41-6 wies einen deutlichen Aktivitätsverlust des

Hydrogenase-Promotors hinsichtlich der Arylsulfatase-Aktivität unter anaeroben

Bedingungen auf. Da sich Änderungen der Photosynthese- und Respirationsraten

auch auf den Wasserstoffmetabolismus auswirken können (Ruhle et al., 2008),

wurden diese in dem Ursprungsstamm MR9 und der Mutante 41-6 in einer

Clarkschen Sauerstoffelektrode ermittelt (Tab. 3-1). Zwischen dem CRR1-

defizienten Stamm 41-6 und der Kontrolle MR9 konnten dabei in drei

unabhängigen Messungen keine Unterschiede festgestellt werden. Die

Photosyntheserate betrug in den beiden Stämmen zwischen 109 und 114 nmol

Ergebnisse

44

O2 h-1 µg Chl-1. Bei Messung der Respirationsrate wurden Werte zwischen 35 und

37 nmol O2 h-1 µg Chl-1 in den Kulturen MR9 und 41-6 ermittelt.

Tab. 3-1: Photosynthese- und Respirationsraten der Stämme MR9 und 41-6. Die Raten von

Sauerstoffzu- und -abnahme wurden in drei unabhängigen Experimenten in einer Clarkschen

Sauerstoffelektrode bei einer Lichtintensität von 80 µE ermittelt.

nmol O 2 * h-1 * µg Chl -1 MR9 41-6

Photosynthese 114,35 ± 3,5 109,05 ± 2,5

Respiration 37,23 ± 3,71 35,56 ± 4,43

Um zu überprüfen, ob der Defekt im CRR1-Gen einen Einfluss auf den

fermentativen Stoffwechsel hat, wurden die Reaktionen zweier Schlüsselenzyme,

der Pyruvat-Formiat-Lyase und der Alkohol-Dehydrogenase, stichprobenartig

untersucht. Unter Anaerobiose katalysieren diese Enzyme Reaktionen zur Bildung

von Ethanol und Formiat und es kommt zu einem Anstieg dieser Produkte. Im

Verlauf einer anaeroben Induktion durch Stickstoffbegasung der Stämme MR9

und 41-6 wurden Proben entnommen und auf ihren Gehalt an Ethanol und Formiat

untersucht (Abb. 3-13). In beiden Kulturen konnte ein deutlicher Anstieg von

Ethanol und Formiat beobachtet werden, wobei jedoch keine deutlichen

Unterschiede zwischen den Kulturen MR9 und 41-6 erkennbar waren.

Abb. 3-10: Ethanol- und Formiatbildung anaerob indu zierter Zellen der Stämme MR9 und

41-6. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden Proben stickstoffbegaster Zellen (zwei

unabhängige Experimente) entnommen und auf ihren Gehalt an Ethanol und Formiat untersucht.

Ergebnisse

45

Die CRR1-defiziente Mutante 41-6 zeigt keine Unters chiede hinsichtlich der

Photosynthese- und Respirationsraten sowie des Ferm entations-

stoffwechsels gemessen an der Ethanol- und Formiatp roduktion.

Um den Einfluss von CRR1 auf die Expression der zelleigenen Hydrogenase zu

untersuchen, wurden die Zellen durch Stickstoffbegasung künstlich anaerob

induziert. Bei dieser Induktionsmethode wird schon nach wenigen Minuten ein

anaerobes Milieu erreicht (Hemschemeier et al., 2009). Da die Lebensfähigkeit der

Zellen jedoch nach einigen Stunden abnimmt, ist diese Art der Induktion nur für

Experimente über einen Zeitraum von wenigen Stunden geeignet. Als Maß für die

Expression des HYD1-Gens kann die in vitro-Hydrogenaseaktivität bestimmt

werden. Diese gibt Auskunft über die Menge an aktiver Hydrogenase in einer

Kultur. Da die Zellen mit einem Detergens aufgeschlossen und künstliche

Elektronendonoren hinzugegeben werden, kann die maximale

Hydrogenaseaktivität unabhängig von der physiologischen Beschaffenheit der

Zellen ermittelt werden.

Abbildung 3-11 zeigt die in vitro-Hydrogenaseaktivitäten der C. reinhardtii-Stämme

MR9 (HYD1pro:ARS2), der Mutante 41-6 (HYD1pro:ARS2:crr1) und der

Komplementante B25 (HYD1pro:ARS2:crr1:CRR1) im Verlauf der anaeroben

Induktionen durch Stickstoffbegasung. Es sind deutliche Unterschiede des CRR1-

defizienten Stammes 41-6 verglichen mit dem Wildtyp MR9 und der

Komplementanten B25 zu erkennen. Während die Stämme MR9 und B25 einen

kontinuierlichen Anstieg der Hydrogenase in vitro-Aktivität bis etwa 150 nmol

H2 h-1 µg Chl-1 zeigten, erreichte die Mutante 41-6 lediglich 50 % der in vitro-

Aktivität. Die maximale in vitro-Hydrogenaseaktivität des Stammes 41-6 betrug

etwa 60 nmol H2 h-1 µg Chl-1.

Ergebnisse

46

Abb. 3-11: Anaerobe Induktion durch Stickstoffbegas ung. In vitro Hydrogenase Aktivitäten der

CRR1 defizienten Mutante 41-6 (weiß), der Komplementante B25 (grau) und des Wildtyps MR9

(schwarz) im Verlauf einer anaeroben Induktion durch Stickstoffbegasung. Dargestellt sind die

gemittelten Aktivitäten dreier unabhängiger Experimente und die daraus resultierenden

Standardabweichungen.

Um den Einfluss von CRR1 auf die Hydrogenase-Expression auch auf der Ebene

der Transkription zu untersuchen, wurden nach drei Stunden anaerober Induktion

Proben zur Isolation der Gesamt-RNA genommen. Eine Northern Blot-Analyse

dieser RNA mit spezifischen Sonden gegen das HYD1-Transkript sowie die

konstitutiv vorhandene mRNA des Referenzgens RPL10A zeigte, dass das HYD1-

Signal nach drei Stunden anaerober Induktion in der Mutante 41-6 deutlich

geringer war als in dem Wildtyp MR9 während das Signal des Referenzgens

konstant blieb. Nach Komplementation mit dem CRR1-Gen konnte die

ursprüngliche HYD1-Transkriptmenge wieder erreicht werden, wie bei der

Komplementanten B25 zu sehen ist (Abb. 3-12)

Ergebnisse

47

Abb. 3-12: Northern Blot-Analyse der HYD1-Transkriptmenge nach drei Stunden anaerober

Induktion . Gesamt-RNA (20 µg) der Stämme MR9, 41-6 und B25 wurde in einem Formaldehydgel

aufgetrennt und mit spezifischen RNA-Sonden gegen HYD1 und das Referenzgen RPL10A

hybridisiert. Diese Analyse wurde dreimal durchgeführt.

Im CRR1-defizienten Stamm 41-6 ist die Expression d es HYD1-Gens unter

anaeroben Bedingungen stark vermindert.

Der „copper response regulator“ CRR1 reguliert die Expression einer Vielzahl

kupferabhängiger Gene. So ist bekannt, dass die Gene CYC6 (kodierend für

Cytochrom c6), CPX1 (Coproporphyrinogen III Oxidase) und CRD1 („copper

response defect protein 1“, aerobe oxidative Cyclase) unter Kupfermangel durch

CRR1 aktiviert werden (Quinn et al., 2002; Kropat et al., 2005; Castruita et al.,

2011). Das hämhaltige Cytochrom c6 übernimmt unter Kupfermangelbedingungen

die Rolle des kupferhaltigen Plastocyanins in der Photosynthesekette. Kann

Cytochrom c6 aufgrund eines Defekts im CRR1-Gen nicht mehr exprimiert werden,

so kommt es zu Wachstumsdefiziten unter Kupfermangelbedingungen (Eriksson

et al., 2004). Da es aufgrund genetischer Variabilität zwischen verschiedenen

wildtypischen Laborstämmen zu unterschiedlichen phänotypischen Ausprägungen

kommen kann (Siaut et al., 2011), wurde das Wachstumsverhalten des CRR1-

defizienten Stammes 41-6 unter Kupfermangel untersucht. Die Zellen wurden mit

1 µg Chlorophyll pro ml angeimpft und ihr Wachstum in TAP-Medium mit Kupfer

sowie TAP-Medium ohne Kupfer (ENEA2) (Ferrante et al., 2008) beobachtet (Abb.

3-13).

Die Zugabe des Kupferchelators TETA (Triethylenetetramin) gewährleistete, dass

noch vorhandene Kupferionen gebunden wurden und somit den Zellen nicht mehr

zur Verfügung standen. In TAP-Medium, das Kupfer enthielt, konnte kein

Unterschied im Wachstum zwischen den Stämmen MR9 und 41-6 beobachtet

Ergebnisse

48

werden. Unter Kupfermangelbedingungen zeigte sich, dass die CRR1-defiziente

Mutante 41-6 verglichen mit dem Wildtyp MR9 nach 72 Stunden langsamer wuchs

und nach 144 Stunden einen deutlich geringeren Chlorophyllgehalt erreichte.

Dieser betrug nach 144 Stunden beim Ursprungsstamm MR9 32,58 µg Chl ml-1

und bei der CRR1-defizienten Mutante 18,82 µg Chl ml-1. Als zusätzliche Kontrolle

der Wachstumsbedingungen wurde eine weitere CRR1-defiziente Mutante,

genannt #5 (CC-3960 transformiert mit ARG7, Janette Kropat, UCLA, persönliche

Kommunikation), untersucht. Auch der Stamm #5 wächst unter Kupfermangel

schlechter als unter Normalbedingungen.

Abb. 3-13: Wachstum unter Kupfermangelbedingungen. Die Stämme MR9 und 41-6, sowie

eine weitere CRR1 defiziente Mutante, benannt als #5, wurden mit 1 µg Chl ml-1 in TAP Medium

mit Kupfer und ohne Kupfer angeimpft. Kupferfreies Medium wurde zusätzlich mit dem

Kupferchelator TETA versetzt. Das Wachstum wurde photographisch sowie durch Bestimmung des

Chlorophyllgehalts der Kulturen festgehalten.

Ergebnisse

49

Kürzlich wurde gezeigt, dass das HYD1-Transkript auch unter Kupfermangel

verstärkt gebildet wird (Castruita et al., 2011). Daher wurde analysiert, ob die hier

isolierte CRR1 Mutante auch unter Kupfermangelbedingungen eine veränderte

Induktion des HYD1-Gens und weiterer Markergene aufweist (Castruita et al.,

2011). Dazu wurden nach 72 Stunden Wachstum unter Normalbedingungen und

nach 144 Stunden Wachstum unter Kupfermangelbedingungen Proben zur

Isolierung von Gesamt-RNA genommen. Aus diesen Proben wurde cDNA

synthetisiert und die HYD1-Transkriptmenge quantitativ durch Real-Time-PCR

bestimmt (Abb. 3-14).

Abb. 3-14: Analyse der HYD1-, HYDEF-, FDX5- und CPX1-Transkriptmenge unter

Kupfermangelbedingungen durch qPCR. Die Stämme MR9 und 41-6 wurden unter Normal- und

Kupfermangelbedingungen angezogen und Proben zur Isolation von Gesamt-RNA genommen. Mit

der daraus synthetisierten cDNA wurde eine quantitative Real-Time-PCR durchgeführt (zwei

unabhängige qPCR-Analysen) und die Transkriptmenge unter Kupfermangelbedingungen im

Verhältnis zur Transkriptmenge unter Normalbedingungen berechnet und auf die CBLP-

Transkriptmenge normiert.

Die Transkriptmenge unter Kupfermangelbedingungen wurde dabei im Verhältnis

zur Menge des Transkriptes unter Normalbedingungen berechnet und auf das

Ergebnisse

50

Referenzgen CBLP normiert (siehe Material und Methoden). Bei Anzucht unter

Kupfermangelbedingungen kam es im Stamm MR9 zu einer 11fach erhöhten

Bildung des HYD1-Transkriptes verglichen mit Zellen, die unter

Normalbedingungen angezogen wurden. Die CRR1-defiziente Mutante 41-6 zeigte

eine verminderte (3,5fach) HYD1-Transkriptmenge verglichen mit dem Stamm

MR9. Auch zwei weitere Gene des anaeroben Metabolismus, HYDEF und FDX5,

sowie ein Gen des Kupfermangelmetabolismus, CPX1, zeigten eine deutliche

Induktion der Transkriptmenge im Stamm MR9, die in der Mutante 41-6 vermindert

war (Abb. 3-14).

Die CRR1-defiziente Mutante 41-6 zeigt unter Kupfer mangelbedingungen

Wachstumsdefizite und eine verminderte Transkriptio n der Gene HYD1,

HYDEF, FDX5 und CPX1.

3.3 Analyse des Hydrogenase-Promotors unter Kupferm angel

Der Transkriptionsfaktor CRR1 aktiviert die Genexpression von Zielgenen, indem

er an ein cis-Element mit der Basenfolge GTAC bindet, wie durch

Promotoranalysen der CYC6- und CPX1-Promotoren gezeigt werden konnte

(Quinn et al., 2000). Dieses GTAC-Motiv konnte durch eine in silico-Analyse auch

an den Positionen -84 und -173 ausgehend vom Transkriptionsstartpunkt im

HYD1-Promotor gefunden werden (Abb. 3-15). Die Fähigkeit einer heterolog

exprimierten SBP-Domäne des CRR1-Proteins aus C. reinhardtii an das proximale

GTAC-Motiv des HYD1-Promotors zu binden konnte in vitro bereits durch einen

„electromobility shift assay“ (EMSA) gezeigt werden (Camilla Lambertz,

Doktorarbeit, 2010). Somit besteht die Möglichkeit, dass der Transkriptionsfaktor

CRR1 die Expression des HYD1-Gens direkt durch eine Bindung im

Promotorbereich beeinflusst. Desweiteren konnten zwei Sequenzabschnitte

identifiziert werden, die ebenfalls im Promotor des HYD2-Gens in C. reinhardtii

sowie im Promotorbereich einer Hydrogenase aus C. moewusii zu finden sind

Ergebnisse

51

(Abb. 3-15). Diese Sequenzabschnitte wurden als Motiv 1 (M1: AAGCTCGC) und

Motiv 2 (M2: CGCAGGCAC) bezeichnet (M. Winkler, persönliche Kommunikation).

Da angenommen wird, dass Gene mit ähnlichem Expressionsmuster gemeinsame

Motive in ihren Promotoren aufweisen (Vilo et al., 2000), besitzen diese

Sequenzabschnitte möglicherweise eine regulative Funktion. Durch

Promotoranalysen mittels Konstrukten, in denen das Luziferase-kodierende

CRLUC-Gen unter die Kontrolle von Bereichen des HYD1-Promotors gebracht

wurde, konnte ein Einfluss der GTAC-Motive im Hydrogenase-Promotor auf die

Expression unter anaeroben Schwefelmangel-Bedingungen bereits gezeigt

werden (Camilla Lambertz, Doktorarbeit, 2010). So führten Mutationen in einem

oder beiden GTAC-Motiven zu einem Aktivitätsverlust des HYD1-Promotors unter

anaeroben Bedingungen. Bei Mutation des Motivs 1 konnte eine leichte Zunahme

der HYD1-Promotoraktivität unter anaeroben Bedingungen gezeigt werden, was

auf ein putativ reprimierendes Element schließen ließ.

Abb. 3-15: Konstrukte unterschiedlicher HYD1-Promotorsequenzen und dem Reportergen

CRLUC. Der HYD1-Promotorbereich ist schematisch dargestellt (oben) und zeigt bekannte

Elemente. Der Translationsstartpunkt (+159) und der Transkriptionsstartpunkt (+1) konnten bereits

identifiziert werden (Happe und Kaminski, 2002). Der für die Aktivität notwendige Kernpromotor ist

als weiße Box dargestellt (-37 bis +44). Die Motive 1 und 2 wurden als M1 (AAGCTCGC) und M2

(CGCAGGCAC) bezeichnet. Die zwei GTAC-Elemente liegen an den Positionen -84 und -173

ausgehend vom Transkriptionsstartpunkt. Die Reportergenkonstrukte, die für die HYD1-

Promotoranalyse unter Kupfermangelbedingungen verwendet wurden, wurden mit den jeweiligen

Elementen skizziert (unten). Graue Boxen stellen das jeweilige Element mit wildtypischer Sequenz

dar, schwarze Boxen eine mutierte Sequenz (GTAC � ATAC; M1: AAGCTCGC � CTCATCGC).

Ergebnisse

52

Um die Bedeutung der bekannten Motive für die Aktivität des Hydrogenase-

Promotors unter Kupfermangelbedingungen zu untersuchen, wurden

Reportergenstudien mit Konstrukten aus verschiedenen HYD1-Promotorbereichen

und dem CRLUC-Reportergen Luziferase durchgeführt. Letzteres stammt

ursprünglich aus der Weichkoralle Renilla reniformis, der Kodongebrauch wurde

allerdings für eine bessere Expression in C. reinhardtii angepasst (Fuhrmann,

2004). Aktives Luziferaseprotein kann das Substrat Coelenterazin zu

Coeleteramid umsetzen. Bei dieser Reaktion werden Photonen emittiert, welche

dann von einem Luminometer detektiert und als „relative luziferase units“ (RLU)

quantifiziert werden können. Aufgrund der Ergebnisse der Reportergenstudien

unter anaeroben Schwefelmangelbedingungen (Camilla Lambertz, Doktorarbeit

2010) wurden unter Kupfermangelbedingungen lediglich die GTAC Motive und das

Motiv 1 untersucht.

Die Induktion der HYD1-Promotoraktivität wurde durch Anzucht der C. reinhardtii-

Stämme mit den dargestellten Konstrukten (Abb. 3-15) in kupferfreiem Medium

erreicht. Als Negativkontrolle diente das promotorlose Reportergen CRLUC des

Konstruktes CL20 (Lambertz et al., 2010). Als Positivkontrolle wurde das

Konstrukt CL33 mit dem Bereich von -1018 bis +159 ausgehend vom HYD1-

Transkriptionsstartpunkt in nativer Sequenz verwendet. Dabei wurde eine

Luziferaseaktivität von durchschnittlich 1041 RLU ermittelt (Abb. 3-16). Durch

Mutation des distalen GTAC-Motivs an Position -173 (Konstrukt BB01) sank die

durchschnittliche Luziferaseaktivität auf 264 RLU; Mutation des proximalen GTAC-

Motivs an Position -84 (Konstrukt CL44) bewirkte einen Abfall auf 79 RLU. Wurden

beide GTAC-Motive in ihrer Sequenz verändert (CL46), entsprach die

Luziferaseaktivität der des promotorlosen Konstrukts CL20 (Abb. 3-16). Eine

Deletion des Promotorbereichs bis zum Anfang des Kernpromotors an Position

-37 (CL40) sowie darüber hinaus bis zur Position -29 (Konstrukt MP01) resultierte

ebenfalls in einem Verlust der Luziferaseaktivität verglichen mit den

Hintergrundwerten des Konstruktes CL20. Eine Änderung in der putativ

reprimierenden Sequenz des Motivs 1 an Position -23 (CL43) konnte die

Luziferaseaktivität nicht wiederherstellen (Abb. 3-16).

Ergebnisse

53

Abb. 3-16: Luziferaseaktivität unterschiedlicher HYD1-Promotorkonstrukte unter

Kupfermangelbedingungen. Die angegebene Anzahl (n) individueller Transformanten von jedem

Promotorkonstrukt wurde gemessen und der Mittelwert (roter Balken) berechnet. Jede untersuchte

Transformante wird durch ein Dreieck repräsentiert. RLU: „relative luminescence units“.

Um sicher zu stellen, dass eine veränderte Promotoraktivität tatsächlich auf die

Sequenzänderungen oder Deletionen im Promotor, und nicht auf unzureichende

Kupfermangelbedingungen zurückzuführen war, wurden stichprobenartig

Proteinproben genommen. Diese wurden in einer Western Blot-Analyse bezüglich

des Proteins CYC6 untersucht. Die detektierten Banden (Abb. 3-17) auf der Höhe

von Cytochrom c6 (15,4 kDa) zeigten, dass den Zellen erfolgreich Kupfer entzogen

wurde. Als Negativkontrolle diente eine Kultur, die unter kupferhaltigen

Bedingungen angezogen wurde und daher kein CYC6 bildete.

Abb. 3-17: Western Blot-Analyse zum Nachweis von CY C6 in kupfermangelinduzierten

Zellen. Stichprobenartig wurden Proteinproben kupfermangelinduzierter Zellen genommen. Eine

äquivalente Menge Protein (entsprechend einer Zellmenge von 2 µg Chlorophyll) wurde bezüglich

des Proteins CYC6 untersucht.

Ergebnisse

54

Der vollständige HYD1-Promotor bewirkt unter Kupfermangelbedingungen

eine Expression des Reportergens CRLUC. Eine Mutation in dem distalen

oder proximalen GTAC-Motiv führt zu einem Abfall, M utationen in beiden

GTAC-Motiven führen zum vollständigen Verlust der P romotoraktivität. Das

Motiv 1 an Position -37 scheint keinen reprimierend en Effekt auf die

Promotoraktivität zu haben.

3.4 Einfluss von Hg(II) auf Schlüsselgene der Anaer obiose-

Antwort in C. reinhardtii

Die Expression von unter Kupfermangel aktivierten Genen kann durch die Zugabe

von Quecksilberchloridionen in Form von HgCl2 in nicht toxischer Konzentration

gehemmt werden (Hill et al., 1991; Quinn et al., 2000). Der genaue

Wirkmechanismus von Quecksilberionen auf die Genexpression ist zurzeit noch

unbekannt. Es wird jedoch diskutiert, dass Hg(II) möglicherweise reversibel im

CRR1-abhängigen Signaltransduktionsweg eingreift (Sommer et al., 2010).

Um den Einfluss von Quecksilberionen aufgrund der Parallelen zwischen Kupfer-

und Sauerstoffmangel auch auf den anaeroben Metabolismus zu untersuchen,

wurden Zellen des C. reinhardtii-Wildtypstamms CC-125 in Vierkantflaschen

gasdicht verschlossen und abgedunkelt. Durch die nicht mehr stattfindende

Photosynthese bei gleich bleibender Respirationsrate kommt es zu einem

Verbrauch des in den Kulturen enthaltenen Sauerstoffs und zu einer langsamen

Anaerobisierung der Zellen. Quecksilberchlorid wurde entweder zu Beginn des

Experimentes (Hg(II) t=0h) oder nach zweistündiger Induktion (Hg(II) t=2h) zu den

Zellen gegeben. Als Kontrolle diente eine unbehandelte Kultur. Als Maß für die

Expression des HYD1-Gens wurde die in vitro-Hydrogenaseaktivität bestimmt

(Abb. 3-18). Die unbehandelten Zellen zeigten bereits nach einer Stunde eine

deutliche in vitro-Aktivität von etwa 25 nmol H2 h-1 µg Chl-1, die auf 230 nmol

Ergebnisse

55

H2 h-1 µg Chl-1 nach vier Stunden anstieg. Wurde den Kulturen zu Beginn der

Induktion Quecksilberionen in Form von HgCl2 hinzugefügt, konnte keine in vitro-

Hydrogenaseaktivität über den Zeitraum des Experiments gemessen werden.

Wurde HgCl2 nach zweistündiger Induktion zu den Zellen gegeben, stieg die

in vitro-Aktivität gleich der unbehandelten Kultur bis zu diesem Zeitpunkt an, nahm

nach der Zugabe jedoch wieder ab (Abb. 3-18).

Abb. 3-18: Einfluss von Hg(II) auf die in vitro Hydrogenase Aktivität anaerob induzierter

C. reinhardtii Zellen. Zellen des Stammes CC-125 wurden durch Abdunklung anaerob induziert

und die in vitro-Hydrogenaseaktivitäten zu den angegebenen Zeitpunkten ermittelt. Die Zugabe von

10 µM HgCl2 erfolgte zu Beginn des Experimentes (Hg(II) t=0h) oder nach zwei Stunden (Hg(II)

t=2h). Als Referenz diente eine unbehandelte Kultur. Dargestellt sind die gemittelten Aktivitäten

dreier unabhängiger Experimente und die daraus resultierenden Standardabweichungen.

Für dieses Experiment ist eine gleichmäßige Respirationsrate in den drei Kulturen

(kein Zusatz, Hg(II) t=0h und Hg(II) t=2h) für das Maß der anaeroben Induktion

entscheidend. Eine unterschiedliche Respiration würde auch ohne HgCl2-Zugabe

zu einer unterschiedlich schnellen Induktion und somit unterschiedlichen in vitro-

Aktivitäten in den Kulturen führen. Um daher einen Einfluss von Quecksilberionen

auf die Atmung der Zellen auszuschließen, wurden die Respirationsraten nach

drei Stunden anaerober Induktion ermittelt (Tab. 3-2). Die Respirationsraten der

Kulturen unterschieden sich nur geringfügig. Die variierende in vitro-Aktivität der

Ergebnisse

56

Kulturen wurde demnach nicht durch eine unterschiedlich schnelle

Anaerobisierung verursacht.

Tab. 3-2: Respirationsraten unter Einfluss von Quec ksilberionen. Die Respirationsraten

wurden nach dreistündiger Inkubation von Kulturen ermittelt, die von Beginn an (t=0h) oder zwei

Stunden nach Inkubationsstart (t=2h) mit HgCl2 behandelt wurden. Die unbehandelte Kultur diente

als Kontrolle.

Ohne Zusatz Hg(II) t=0h Hg(II) t=2h

nmol O 2 * h-1 * µg Chl -1 46,03 40,56 45,43

HgCl2 wurde schon in mehreren Studien in C. reinhardtii eingesetzt (Hill et al.,

1991; Quinn et al., 2000; Quinn et al., 2002) und erwies sich in der angewandten

Konzentration als sublethal. Um die Überlebensfähigkeit der Zellen nach

Inkubation mit HgCl2 in dieser Arbeit ebenfalls zu kontrollieren, wurde ein Aliquot

anaerob induzierter Zellen nach sechstündiger Inkubation mit HgCl2 auf TAP-Agar-

Platten ausgestrichen (Abb. 3-19). Das Wachstumsverhalten der Zellen, die zu

Beginn (Hg(II) t=0h) oder nach zweistündiger Induktion (Hg(II) t=2h) mit HgCl2

versetzt wurden, unterschied sich nicht von den unbehandelten Zellen.

Abb. 3-19: Überlebensfähigkeit von mit HgCl 2 behandelten Zellen. Ein Aliquot anaerob

induzierter Kulturen des Stammes CC-125 wurde nach sechs Stunden auf TAP-Agar-Platten

ausgestrichen und das Zellwachstum nach fünf Tagen dokumentiert. Die Kulturen wurden zu

Beginn des Experiments (Hg(II) t=0h) oder nach zwei Stunden (Hg(II) t=2h) mit HgCl2 (10 µM)

behandelt. Die Positivkontrolle (kein Zusatz) wurde lediglich anaerob induziert.

Um die Expression anaerob induzierter Gene näher zu untersuchen, wurden die

Proteinmengen von HYD1 und FDX5 untersucht (Abb. 3-20). FDX5 wird unter

anaeroben und Kupfermangelbedingungen induziert und ebenfalls durch den

Ergebnisse

57

Transkriptionsfaktor CRR1 reguliert (Lambertz et al., 2010). Zu Beginn der

anaeroben Induktion, sowie nach zwei und vier Stunden wurden von allen

Kulturen Gesamt-Proteinproben entnommen und die Menge an gebildeten HYD1-

und FDX5-Protein in einer Western Blot-Analyse quantifiziert. Bei den Kulturen,

denen kein HgCl2 hinzugefügt wurde, konnte eine deutliche Induktion von HYD1

und FDX5 beobachtet werden. Wurde den Zellen zu Beginn HgCl2 hinzugefügt,

war dies nicht der Fall. Die Kultur, die nach zweistündiger Induktion mit HgCl2

behandelt wurde, unterschied sich hinsichtlich der HYD1- und FDX5-Expression

nicht von der unbehandelten Kontrolle (Abb. 3-20).

Abb. 3-20: Western Blot-Analyse der HYD1- und FDX5- Menge in anaerob induzierten Zellen

unter dem Einfluss von Hg(II). Zu den angebenen Zeitpunkten der Induktion wurden

Proteinproben entnommen. Die äquivalente Menge von 2 µg Chlorophyll wurde auf die darin

enthaltene Menge an HYD1 und FDX5 untersucht.

Zusätzlich zur Proteinbildung wurden die Transkriptmengen wichtiger Gene des

anaeroben Metabolismus und der Anpassung auf Kupfermangel untersucht. Dazu

wurden Proben zur Isolierung von Gesamt-RNA im Verlauf der anaeroben

Induktion genommen, und die daraus synthetisierte cDNA mit Hilfe einer PCR

semi-quantitativ untersucht (Abb. 3-21).

Als Referenzgene wurden die zwei „housekeeping“ Gene CBLP und RPL10A

verwendet, die eine Expression in allen Proben zeigten. Als Schlüsselgene für den

anaeroben Metabolismus wurden die Gene der Hydrogenase (HYD1), der

Maturationsfaktoren HYDEF und HYDG, des Ferredoxins FDX5 und der Pyruvat-

Formiat-Lyase PFL1 untersucht. Die für den Wasserstoffmetabolismus

notwendigen Gene HYD1, HYDEF, HYDG sowie das Ferredoxin FDX5 wurden bei

sofortiger Zugabe von Hg(II)-Ionen nicht mehr transkribiert. Das PFL1-Gen, das

für ein Enzym des Gärungsstoffwechsels in C. reinhardtii kodiert, wurde unter

Hg(II)-Einfluss zwar schwächer transkribiert, jedoch war eine deutliche Expression

unter Anaerobiose nach vier Stunden zu beobachten. Bei der Antwort auf

Ergebnisse

58

Kupfermangelbedingungen wichtige Gene in C. reinhardtii, wie CRR1, CPX1 und

CYC6, zeigten zunächst ein unterschiedliches Transkriptionsmuster verglichen mit

Schlüsselgenen des anaeroben Metabolismus. So war bereits zu Beginn des

Experimentes (0h) Transkript dieser Gene in den Zellen vorhanden. Bei sofortiger

Zugabe von HgCl2 wurden diese Gene nicht mehr transkribiert. Eine Zugabe von

Hg(II)-Ionen nach zweistündiger anaerober Induktion bewirkte keine Änderung des

Transkriptionsmusters verglichen mit der unbehandelten Kontrolle bei allen

untersuchten Genen.

Abb. 3-21: Semi-quantitative Transkriptanalyse anae rob induzierter Zellen unter dem

Einfluss von Hg(II). Zellen des Stammes CC-124 wurden anaerob induziert, und HgCl2 (10 µM) zu

Beginn des Experimentes (t=0h) und nach zwei Stunden (t=2h) hinzugegeben. Entnommene RNA

wurde mit einer RT-PCR auf die Transkriptmenge der rechts aufgelisteten Gene untersucht. Die

Zyklenanzahl der PCR wurde dabei wie folgt auf die Expression des jeweiligen Gens angepasst:

27 Zyklen (CBLP, HYD1, FDX5, PFL1), 29 Zyklen (RPL10A, CPX1, HYDEF, HYDG, CRR1), 37

Zyklen (CYC6).

Quecksilberchloridionen blockieren die Antwort von C. reinhardtii auf

Kupfermangelbedingungen und auf Anaerobiose. Schlüs selgene, wie HYD1,

HYDEF, HYDG und FDX5, werden unter diesen Bedingungen nicht mehr

transkribiert.

Ergebnisse

59

3.5 Einfluss von Kaliumcyanid auf anaerob induziert e

Schlüsselgene

Ein Model der Regulation des anaeroben Metabolismus in Pflanzen beschreibt die

mitochondriale Elektronentransportkette als wesentliche Komponente der

Signaltransduktionswege (Igamberdiev und Hill, 2009). So wird diskutiert, dass bei

niedriger Sauerstoffkonzentration alternativ Nitrit als Elektronenakzeptor des

Cyt-b/c1-Komplexes und der Cytochrom-Oxidase dienen kann, wobei der putative

Botenstoff Stickstoffmonoxid (NO) entsteht (Igamberdiev und Hill, 2009).

Tatsächlich konnte bereits beobachtet werden, dass abgedunkelte C. reinhardtii-

Zellen nach Zugabe von Nitrit NO produzieren und die Bildung von NO durch

Zugabe von Kaliumcyanid (KCN) inhibiert werden kann (Sakihama et al., 2002).

Der Einfluss von KCN auf den anaeroben Metabolismus wurde mit einer

anaeroben Induktion durch Stickstoffbegasung untersucht (Abb. 3-22). Bei dieser

Art der Induktion wird vorhandener Sauerstoff durch die Begasung aus einer

abgedunkelten Zellkultur getrieben. Für alle folgenden Experimente wurde der

Stamm CC-1690 gewählt, da er die Wildtyp-Allele der Gene NIT1 und NIT2

besitzt, und somit in der Lage ist, Nitrat zu verstoffwechseln. Die Anzucht und die

anaerobe Induktion erfolgten in einem modifizierten TAP-Medium, welches als

Stickstoffquelle kein Ammoniumsalz sondern Kaliumnitrat enthielt.

Als Maß für die Induktion des anaeroben Metabolismus diente die Hydrogenase in

vitro-Aktivität. Wurde der Kultur zu Beginn der anaeroben Induktion KCN (5 mM)

hinzugefügt, konnte zu keinem Zeitpunkt eine in vitro-Hydrogenaseaktivität

gemessen werden. Die unbehandelte Kontrollkultur zeigte eine deutlich

ansteigende in vitro-Hydrogenaseaktivität (Abb. 3-22).

Ergebnisse

60

Abb. 3-22: Einfluss von KCN auf die in vitro Hydrogenase Aktivität anaerob induzierter

C. reinhardtii-Zellen. Zellen des Stammes CC-1690 wurden durch Stickstoffbegasung anaerob

induziert und die in vitro-Hydrogenaseaktivitäten zu den angegebenen Zeitpunkten ermittelt. Die

Zugabe von 5 mM KCN erfolgte zu Beginn des Experimentes (grau). Als Referenz diente eine

unbehandelte Kultur (schwarz). Dargestellt sind die gemittelten Aktivitäten dreier unabhängiger

Experimente und die daraus resultierenden Standardabweichungen.

Die Vitalität der Zellen nach der anaeroben Induktion wurde analog zu den

Versuchen mit Quecksilberchlorid durch den Ausstrich eines Aliquots Zellen auf

TAP-Agar-Platten untersucht. Verglichen mit der unbehandelten Kontrolle zeigte

die mit KCN inkubierte Kultur keine Wachstumsdefizite (Daten nicht gezeigt).

Um die Induktion anaerober Schlüsselgene unter dem Einfluss von KCN zu

untersuchen, wurden die Transkriptmengen wichtiger Gene des anaeroben

Metabolismus untersucht. Da auch in dieser Arbeit Gemeinsamkeiten des

anaeroben und des Kupfermangelmetabolismus festgestellt werden konnten,

wurden zusätzlich einige kupfermangelinduzierte Gene untersucht. Des Weiteren

wurde die Transkription der Gene CYG12 und au5.g1241_t1 untersucht. Daten

einer RNA-Sequenzierungsstudie zeigten eine Induktion beider Gene unter

anaeroben Bedingungen (A. Hemschemeier, persönliche Kommunikation). CYG12

kodiert für eine putative Guanylatcyclase und könnte somit eine Funktion in

NO-gesteuerten Signalwegen haben. Das Gen au5.g1241_t1 kodiert für ein

putatives Protein mit Hämerythrin-Bindedomäne und wurde auf Grund seiner

Eigenschaft als mögliches Sauerstoff-bindendes Protein ausgewählt. Proben zur

Isolierung von Gesamt-RNA wurden im Verlauf der anaeroben Induktion

Ergebnisse

61

genommen und die daraus synthetisierte cDNA mit Hilfe einer PCR semi-

quantitativ untersucht (Abb. 3-23).

Abb. 3-23: Semi-quantitative Transkriptanalyse anae rob induzierter Zellen unter dem

Einfluss von KCN. Zellen des Stammes CC-1690 wurden anaerob induziert und KCN (5 mM) zu

Beginn des Experiments hinzugegeben (+). Als Kontrolle diente eine unbehandelte Kultur (-).

Entnommene RNA wurde mit einer RT-PCR auf die Transkriptmenge der rechts aufgelisteten

Gene untersucht. Die Zyklenanzahl der PCR wurde dabei wie folgt auf die Expression des

jeweiligen Gens angepasst: 27 Zyklen (RPL10A, HYD1, FDX5, CYC6, CRD1, CPX1, CYG12,

au5.g1241_t1) und 28 Zyklen (HYD2, HYDEF, HYDG).

Für die Transkriptmengen der Gene HYD1, HYD2, HYDEF und HYDG zeigten

sich nach zwei Stunden anaerober Induktion keine Unterschiede zwischen der

unbehandelten und der mit KCN behandelten Kultur. Nach vier Stunden anaerober

Induktion war die Transkriptmenge dieser Gene in der mit KCN behandelten Kultur

deutlich erniedrigt. Zu beachten war die geringere Gesamttranskriptmenge,

gemessen am RPL10A Transkript, in der unbehandelten Kultur nach vier Stunden.

Hinsichtlich der Gene FDX5, CRD1, CYG12 und au5.g1241_t1 zeigte sich sowohl

nach zwei, als auch nach vier Stunden Induktion eine verringerte Transkriptmenge

in der mit KCN behandelten Probe. Für die Gene CYC6 und CPX1 zeigten sich

ebenfalls erst nach vier Stunden erniedrigte Transkriptmengen in der mit KCN

inkubierten Kultur verglichen mit der unbehandelten Kontrolle.

Ergebnisse

62

Da KCN einen deutlichen Einfluss auf die Induktion der Transkription einiger

ausgewählter Gene ausübte, wurde zusätzlich der Einfluss des NO-Donors DETA-

NO auf die Transkription dieser Gene untersucht. Zellen des Stammes CC-1690

wurden in einem Erlenmeyerkolben bis zu einer Zelldichte von 15 µg Chl ml-1

angezogen. Die Zellen wurden für die Dauer des Experimentes bei einer

Belichtung von 80 µE permanent geschüttelt. Vor der Zugabe von DETA-NO

(0,5 mM) (0h) sowie nach Zugabe von DETA-NO (0,5h; 1h; 2h; 4h) wurden

Proben zur Isolierung von Gesamt-RNA entnommen und die Transkriptmenge der

Gene HYD1, HYD2, HYDEF, HYDG, FDX5, CYC6, CPX1, CRD1, CYG12 und

au5.g1241_t1 in einer semi-quantitativen-PCR untersucht. Dabei konnte keine

Induktion der Transkripte dieser Gene beobachtet werden (Daten nicht gezeigt).

DETA-NO (Diethylentriamin NO-Addukt) führte in Hefezellen zu einer deutlichen

Induktion des anaeroben Gens CYC7 unter aeroben Bedingungen (Castello et al.,

2006). Eine Wirkung dieser Substanz auf den Stoffwechsel von C. reinhardtii

wurde jedoch noch nicht beschrieben.

Die Zugabe von KCN vermindert die Transkription der bekannten CRR1-

regulierten Gene FDX5, CYC6, CPX1 und CRD1 sowie der Gene CYG12 und

au5.g1241_t1 unter Anaerobiose.

Diskussion

63

4 Diskussion

Unter Sauerstoffmangel passt die einzellige Grünalge C. reinhardtii ihren

Zellstoffwechsel durch die differentielle Expression zahlreicher Gene an diese

Umweltbedingung an. Ein Schlüsselgen dabei ist das HYD1-Gen. HYD1 kodiert

für eine [FeFe]-Hydrogenase, die sowohl in dunkel-adaptierten und

stickstoffbegasten Zellen, als auch in belichteten Zellen, denen Schwefel entzogen

wurde, gebildet wird (Melis, 2007; Mus et al., 2007; Philipps et al., 2011). Durch

Promotoranalysen konnte gezeigt werden, dass die Region von -128 bis -21 relativ

zum Transkriptionsstartpunkt des HYD1-Gens ausreichend für die

Promotoraktivität ist (Stirnberg und Happe, 2004). Weitere regulative

Komponenten, wie beispielsweise Transkriptionsfaktoren, konnten bislang noch

nicht beschrieben werden.

Ziel dieser Arbeit war es, regulative Faktoren der HYD1-Expression zu

identifizieren. Dazu wurden zwei Herangehensweisen verfolgt. In einem ersten

Ansatz kamen Wirkstoffe zum Einsatz, von denen bereits bekannt ist, dass sie mit

dem anaeroben Metabolismus verknüpfte Signaltransduktionswege anderer

Organismen beeinflussen. Diese Art von experimentellem Vorgehen sollte der

Charakterisierung postulierter Mechanismen und der Identifikation prinzipieller

Regulationsvorgänge dienen.

Ein weiteres und zentrales Vorgehen dieser Arbeit, welches in der Identifikation

spezifischer Regulationsfaktoren resultieren sollte, war die Methode der „forward“-

Genetik. Dabei wird nach ungerichteter Mutagenese gezielt nach Transformanten

mit einem bestimmten Phänotyp gesucht. Auf diese Weise konnten bereits

erfolgreich regulative Elemente im Stoffwechsel von C. reinhardtii, wie bei der

Antwort auf Schwefelmangel und der Nitratassimilation, gefunden werden

(Gonzalez-Ballester et al., 2005; Gonzalez-Ballester et al., 2008). Aufgrund der

Ergebnisse des Screenings nach regulativen Faktoren der HYD1-Expression

sowie parallel ablaufender Studien dieser Arbeitsgruppe (Lambertz, Doktorarbeit

2010) und aktuellen Publikationen (Castruita et al., 2011) wurden zusätzliche

Analysen des HYD1-Promotors mit Hilfe von Reportergenstudien durchgeführt.

Diskussion

64

4.1 Stickstoffmonoxid - Putativer Botenstoff der an aeroben

Signaltransduktion?

Stickstoffmonoxid ist ein bioaktives Molekül, das zahlreiche biologische Prozesse

in verschiedenen Organismen reguliert (Beligni und Lamattina, 2001). Das

gasartige freie NO-Radikal besitzt eine relativ kurze Halbwertszeit von weniger als

sechs Sekunden (Bethke et al., 2004) und ist aufgrund eines ungepaarten

Elektrons hoch reaktiv. Durch die daraus resultierende schnelle Reaktion von NO

mit reaktiven Sauerstoff Spezies (ROS), verschiedenen Rezeptoren sowie

Transkriptionsfaktoren (Romero-Puertas et al., 2004) stellt dieses Molekül einen

geeigneten biologischen Botenstoff in Signaltransduktionswegen verschiedener

Organismen dar.

Auch in C. reinhardtii konnte bereits eine Funktion von NO als Botenstoff gezeigt

werden: So aktiviert NO eine Häm/NO-bindende Guanylatcyclase (CYG56),

welche dann die ammoniumabhängige Genregulation des NIA1-Gens (Nitrat-

Reduktase) beeinflusst (de Montaigu et al., 2010). Die Funktion dieser Häm/NO-

bindenden Guanylatcyclase an der differentiellen Genregulation der Nitrat-

Assimilation in C. reinhardtii wurde in dieser Studie erfolgreich durch Wirkstoffe

wie NO-Donoren, Phosphodiesterase-Inhibitoren und NO-Synthase-Inhibitoren

nachgewiesen (de Montaigu et al., 2010).

Bei geringen Sauerstoffkonzentrationen wird die mitochondriale Atmungskette als

möglicher Entstehungsort von Stickstoffmonoxid in Pflanzen diskutiert. Unter

dieser Umweltbedingung können Elektronen von der Cytochrom-Oxidase (COX)

und wahrscheinlich dem Cytochrom-b/c1-Komplex auf Nitrit übertragen werden,

wobei NO gebildet wird (Igamberdiev und Hill, 2009). Abgedunkelte C. reinhardtii-

Zellen produzieren nach Zugabe von Nitrit NO und dieser Effekt kann durch den

COX-Hemmstoff Kaliumcyanid inhibiert werden (Sakihama et al., 2002). Vor

diesem Hintergrund sollte eine Beteiligung von NO an der anaerob induzierten

Genexpression in C. reinhardtii durch den Einfluss von KCN untersucht werden.

Dazu wurde der Stamm CC-1690 gewählt, da dieser in der Lage ist, aktive Nitrat-

Reduktase zu bilden und somit auch Nitrat zu Nitrit verstoffwechseln kann. Eine

mit KCN inkubierte, anaerob induzierte Kultur zeigte keine in vitro-

Diskussion

65

Hydrogenaseaktivität mehr, obwohl die Transkripte des HYD1-Gens sowie der

Gene HYD2, HYDEF und HYDG nachgewiesen werden konnten. Da KCN kein

spezifischer Hemmstoff ist, kann keine Aussage darüber gemacht werden, ob dies

lediglich durch eine Hemmung der Aktivität bzw. Bildung des Hydrogenase-

Proteins, oder durch eine unbekannte Reaktion von KCN verursacht wird.

Interessanterweise konnte jedoch ein deutlicher Einfluss von KCN auf die

Expression von FDX5 und der Gene des Kupfermangelmetabolismus, CYC6,

CRD1 und CPX1, beobachtet werden, die bei Zugabe von KCN weniger stark

transkribiert wurden. Ob diese veränderte Transkription tatsächlich durch eine

Hemmung der NO-Bildung oder durch einen unspezifischen Effekt des KCN

verursacht wurde, bleibt unklar. Es ist jedoch auffällig, dass die Transkription

bekannter Zielgene des Transkriptionsfaktors CRR1 offenbar besonders sensitiv

gegenüber KCN-Zugabe ist. Ein Zusammenhang zwischen der Generation von

NO und der Antwort auf Kupferstress, verursacht durch eine erhöhte

Konzentration von Kupfer, konnte in C. reinhardtii bereits gezeigt werden. So

wurde bei der Zugabe steigender Konzentrationen an Kupfer zu den Zellkulturen

ein Anstieg der intrazellulären NO-Konzentration und eine gesteigerte Prolin-

Synthese beobachtet (Zhang et al., 2008). Die Regulation des

Transkriptionsfaktors CRR1 durch NO kann an dieser Stelle nur vermutet werden.

Da CRR1 eine Zink-bindende SBP-Domäne sowie einen cysteinreichen

C-Terminus besitzt (Sommer et al., 2010) und NO die Fähigkeit hat, Metalle in

Proteinen zu oxidieren sowie an Thiole zu binden und so die Eigenschaften von

Proteinen zu modifizieren (Igamberdiev und Hill, 2009; Blokhina und Fagerstedt,

2010), besteht eine Möglichkeit der Modifikation von CRR1 durch NO.

Auch die Transkription der Gene CYG12 und au5.g1241_t1 wurde durch die

Zugabe von KCN herabgesetzt. Das Gen CYG12 war in diesem Zusammenhang

interessant, da die Transkriptmenge in anaeroben Kulturen des C. reinhardtii

Stammes CC-125 ansteigt (A. Hemschemeier, persönliche Mitteilung), und

CYG12 somit möglicherweise eine wichtige Funktion unter Sauerstoffmangel

ausübt. CYG12 kodiert für eine putative Häm/NO-bindende Guanylatcyclase und

könnte somit eine Rolle bei einer NO-abhängigen Signaltransduktion als Reaktion

auf Sauerstoffmangel spielen. Diese Form der löslichen Guanylatcyclasen wird in

der Regel durch NO aktiviert (Koesling et al., 2004) und katalysiert daraufhin die

Diskussion

66

Umwandlung von Guanosintriphosphat (GTP) zu 3’-5’-zyklischem Guanosin-

Monophosphat (cGMP) unter Abspaltung eines Phosphatrestes. C. reinhardtii

besitzt 57 annotierte Gene, die für Guanylatcyclasen kodieren. Von diesen haben

jedoch lediglich die Proteine CYG11, CYG12, CYG15, CYG38, CYG56 und

CYG57 die gleiche Domänenstruktur wie die tierischen Guanylatcyclasen (Nioche

et al., 2004; Merchant et al., 2007). Eine NO-vermittelte Beteiligung von CYG56

bei der ammoniumabhängigen Signaltransduktion in C. reinhardtii konnte vor

kurzem nachgewiesen werden (de Montaigu et al., 2010).

Das Gen au5.g1241_t1 kodiert für ein Protein, das eine putative Hemerythrin-

Domäne besitzt, und wurde aufgrund seiner Bedeutung als möglicher direkter

Sensor von Sauerstoff ausgewählt. Hemerythrin-Proteine besitzen in ihrem aktiven

Zentrum ein [2Fe]-Zentrum, an das Sauerstoff binden kann (Stenkamp, 1994) und

es wird eine putative Funktion dieser Proteine als Sauerstoff-Sensoren diskutiert

(Xiong et al., 2000; Isaza et al., 2006). So hat beispielsweise das Methyl-bindende

chemotaktische Protein DcrH aus Desulfovibiro vulgaris eine hemerythrin-ähnliche

Domäne und besitzt möglicherweise eine anaerotaktische Funktion (Isaza et al.,

2006). In Säugetieren konnte die Hemerythrin-Domäne des Proteins FBXL5 als

regulatorischer Schalter identifiziert werden: Unter Eisen- und Sauerstoffmangel

akkumuliert FBXL5 und beeinflusst durch Degradation des regulatorischen

Proteins IRP2 die Expression von Genen, die für die Aufnahme von Eisen

verantwortlich sind (Salahudeen et al., 2009).

Um einen tatsächlichen Einfluss von Stickstoffmonoxid nachzuweisen, sind

weitere Experimente erforderlich. Denkbar wären zum Beispiel Transkriptanalysen

unter aeroben/anaeroben Bedingungen in Abhängigkeit weiterer Wirkstoffe. Der in

dieser Arbeit verwendete NO-Donor DETA-NO wurde bei seiner Verwendung in

Hefezellen beschrieben und induzierte die Transkription des in der Regel anaerob

exprimierten Gens CYC7 auch unter aeroben Bedingungen (Castello et al., 2006).

Die Transkription anaerober Gene von C. reinhardtii in Gegenwart von Sauerstoff

konnte in dieser Arbeit jedoch nicht durch die Zugabe von DETA-NO gezeigt

werden, was möglicherweise durch Unterschiede beider Organismen bedingt wird.

Eine kürzlich vorgestellte Studie zeigte die erfolgreiche Freisetzung von

Stickstoffmonoxid mit den NO-Donoren SNAP (S-Nitroso-N-Acetylpenicillamin)

Diskussion

67

und DEA-NONOat (Diethylamin NONOat) in C. reinhardtii (de Montaigu et al.,

2010), weshalb diese Substanzen für weitere Analysen besonders

vielversprechend sind. Als NO-Radikalfänger wurde der Einsatz von reduziertem

Hämoglobin in C. reinhardtii (Sakihama et al., 2002) und der Substanz PTIO

(2-Phenyl-4,4,5,5-Tetramethylimidazolin-3-Oxid-1-Oxyl) in Hefezellen (Castello et

al., 2006) dokumentiert. Das Enzym NO-Synthase (NOS) katalysiert die Bildung

von NO aus der Aminosäure Arginin und stellt neben der mitochondrialen

Atmungskette eine weitere Quelle der NO-Synthese dar. Die Existenz einer NO-

Synthase in Pflanzen konnte bis jetzt noch nicht gezeigt werden, jedoch führen

Messungen potenzieller NOS-Aktivität (Cueto et al., 1996; Ninnemann und Maier,

1996; Delledonne et al., 1998) und immunologische Nachweise mit einem

Antikörper gegen eine säugetiertyp-NOS in Pflanzenzellen (Ribeiro et al., 1999) zu

kontroversen Diskussionen auf diesem Gebiet. Studien der ammoniumabhängigen

Genregulation weisen auf eine Existenz von NO in C. reinhardtii hin (de Montaigu

et al., 2010) und der NOS-Inhibitor L-NAME (NG-Nitro-L-Arginin-Methylester) wäre

daher eine weitere geeignete Substanz, um sowohl die Beteiligung von NO als

auch den Ort der Entstehung zu untersuchen.

Die hier diskutierten Ergebnisse weisen darauf hin, dass NO eine Rolle in der

Signaltransduktion unter Sauerstoffmangel in C. reinhardtii spielt. Falls eine

Funktion von NO als Botenstoff durch fortführende Studien bestätigt werden kann,

ist auch der Enstehungsort von NO von großem Interesse, da dieses Wissen zu

einem besseren Verständnis der sauerstoffabhängigen Signaltransduktion in C.

reinhardtii führen würde.

4.2 Einfluss des Transkriptionsfaktors CRR1 auf die HYD1-

Expression

Das in dieser Arbeit verwendete Screening-System diente dazu, regulative

Faktoren der HYD1-Expression zu identifizieren. Das Maß der HYD1 Expression

von Transformanten einer Insertionsmutanten-Bibliothek wurde mit Hilfe des

Reportergens ARS2 unter anaeroben und aeroben Bedingungen untersucht. Unter

Diskussion

68

anaeroben Bedingungen konnte aus über 10.000 Transformanten eine Mutante

(41-6) isoliert werden, die keine Aktivität des Reportergens mehr zeigte. Trotz

nicht mehr detektierbarer Arylsulfataseaktivität im Screening war die Mutante 41-6

noch in der Lage, HYD1 zu bilden, wenn auch in verringertem Maß. Dies zeigt,

dass eine verminderte HYD1 Promotoraktivität ab einer gewissen Schwelle in dem

hier verwendeten System nicht mehr detektiert werden kann. Unter induzierenden

Bedingungen ist dies von Vorteil, da auch Faktoren, die die HYD1 Expression nur

geringfügig beeinflussen, gefunden werden können. Diese unzureichende

Sensitivität kann jedoch unter nicht induzierenden, aeroben Bedingungen von

Nachteil sein. So kann nicht gesagt werden, ob eine schwache HYD1

Promotoraktivität verursacht durch einen defekten Repressor detektiert werden

könnte. Tatsächlich wurde unter aeroben Bedingungen aus 6.000 Transformanten

keine mit einer veränderten HYD1-Expression gefunden. Da das ARS2-Gen nativ

in C. reinhardtii vorhanden ist, kann das häufig beobachtete Problem eines

abweichenden Kodongebrauchs und einer daraus resultierenden schwachen

Proteinexpression bei der Verwendung von heterologen Reportergenen

(Fuhrmann et al., 1999) ausgeschlossen werden.

Ein häufig beobachtetes Ereignis bei der Insertionsmutagenese in C. reinhardtii

sind Deletionen des Genoms von fünf bis 57 kb (Kindle, 1990; Cenkci et al., 2003).

Dies kann zwar zu Schwierigkeiten bei der Identifikation des verantwortlichen

Gens führen, hat jedoch auch den Vorteil, dass eine kleinere Menge an

Transformanten ausreicht, um das gesamte Genom abzudecken (Dent et al.,

2001). Geht man davon aus, dass die untersuchte Anzahl an Transformanten

ausreichend war, ist es daher möglich, dass das Screeningsystem unter aeroben

Bedingungen nicht sensititv genug ist oder die HYD1 Expression nicht durch

reprimierende Faktoren reguliert wird.

Dennoch war auch nach dem anaerob induzierenden Screening mit lediglich einer

identifizierten Mutante die Ausbeute wesentlich geringer als in anderen

beschriebenen Systemen (Gonzalez-Ballester et al., 2005; Ruhle et al., 2008). Ein

generelles Problem bei der ungerichteten Insertionsmutagenese in C. reinhardtii

scheinen so genannte „Hot Spots“ des Genoms zu sein. Als „Hot Spots“ werden

genomische Regionen bezeichnet, in welche eingebrachte Fremd-DNA bevorzugt

integriert. So wurden bei der Analyse des Schwimmverhaltens von

Diskussion

69

Transformanten einer Insertionsmutantenbibliothek 24 Mutanten isoliert, von

denen acht einen Defekt im selben Gen aufwiesen (Wilkerson et al., 1995). Auch

konnten bereits in mehreren Arbeitsgruppen C. reinhardtii Transformanten mit

Defekten in den Genen der Maturationsfaktoren der Hydrogenase, HYDEF und

HYDG, identifiziert werden (Posewitz et al., 2004; T. Happe, persönliche

Mitteilung). Dies könnte im Umkehrschluss auch dazu führen, dass selbst bei einer

ausreichenden Anzahl an untersuchten Transformanten nur wenige mit dem

gewünschten Phänotyp gefunden werden können.

Mit Hilfe des verwendeten Screeningsystems konnte eine Transformante mit

verminderter HYD1 Promotoraktivität isoliert werden, die auch eine reduzierte

HYD1 Transkriptmenge unter anaeroben und Kupfermangelbedingungen zeigte.

Die genetische Charakterisierung und Komplementation dieser Mutante zeigt,

dass der Transkriptionsfaktor CRR1 verantwortlich für den beschriebenen

Phänotyp ist.

CRR1 reguliert die Expression einiger anaerob- und kupfermangelinduzierter

Gene

CRR1 („copper response regulator“) aus C. reinhardtii ist ein SBP-(“SQUAMOSA

promoter binding protein”)-Domänen-Protein und wurde bereits als regulativer

Faktor bei der Anpassung an Kupfermangelbedingungen beschrieben (Kropat et

al., 2005; Castruita et al., 2011). Die erstmalige Beschreibung der SBP-Domäne

fand anhand eines Proteins aus Antirrhinum majus (Großes Löwenmaul) statt, das

an den Promotor des SQUAMOSA-Gens bindet (Klein et al., 1996). Proteine mit

einer SBP-Domäne sind ubiquitär in der Pflanzenwelt vertreten (Guo et al., 2008;

Yang et al., 2008), weshalb sie eine spezifische Rolle in der Pflanzenentwicklung

besitzen könnten (Cardon et al., 1999).

Für den Transkriptionsfaktor CRR1 aus C. reinhardtii konnte gezeigt werden, dass

dieser die Regulation der Gene CYC6, CPX1, CRD1 und FDX5 sowohl unter

Kupfer-, als auch unter Sauerstoffmangel reguliert (Quinn et al., 2000; Quinn et al.,

2002; Lambertz et al., 2010) (Tab. 4-1). Das hämbindende Cytochrom c6 (CYC6)

übernimmt in Abwesenheit von Kupfer die Aufgabe des kupferhaltigen

Plastocyanins in der Elektronentransportkette der Photosynthese (Merchant und

Bogorad, 1986). Die Coproporphyrinogen-III-Oxidase, kodiert durch CPX1, und die

Diskussion

70

Mg-Protoporphyrin-IX-Monomethyl-Ester-Zyklase, kodiert durch CRD1, sind an

der Tetrapyrrol-Biosynthese beteiligt (Timko, 1998). Auch FDX5, welches für das

Ferredoxin FDX5 kodiert, wird unter Sauerstoff- und Kupfermangel induziert

(Jacobs et al., 2009; Terauchi et al., 2009; Lambertz et al., 2010), jedoch konnte

die genaue Funktion dieses Proteins noch nicht beschrieben werden.

Tab. 4-1: Übersicht Kupfer- und Sauerstoffmangel in duzierter Gene. Die aufgeführten Gene

werden sowohl unter Anaerobiose als auch unter Kupfermangel in Abhängigkeit von GTAC-

Motiven reguliert. Der Lokus der Gene wurde mit der Datenbank „Phytozome v7.0“

(http://www.phytozome.net/) ermittelt.

Gen Lokus Protein Stoffwechsel Referenz

CYC6 Cre16.g651050 Cytochrom c6 Photosynthese Quinn et al., 2000

und 2002

CPX1 Cre02.g085450 Coproporphyrinogen III-

Oxidase

Tetrapyrrol-Biosynthese

Quinn et al., 2000 und 2002

CRD1 Cre07.g346050

Mg-Protoporphyrinogen

IX-Monomethylester-Zyklase

Tetrapyrrol-Biosynthese

Quinn et al., 2000 und 2002

FDX5 Cre17.g700950 Ferredoxin ? Lambertz et al.,

2010

HYD1 Cre03.g199800 Hydrogenase H2-

Metabolismus

Lambertz, Doktorarbeit 2010;

diese Arbeit

In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass zweiwertige Quecksilberionen

die CRR1 regulierte Antwort auf Kupfer- und Sauerstoffmangel inhibieren (Hill et

al., 1991; Quinn et al., 2002). Auf welche Weise diese Hemmung stattfindet konnte

bis bislang noch nicht gezeigt werden. Es wird diskutiert, dass Hg(II)

möglicherweise Kupfer an einer putativen Kupfer-bindenden Stelle im CRR1-

Protein substituiert oder an ein kritisches Thiol des Proteins bindet und so zur

Inaktivierung von CRR1 führt (Sommer et al., 2010).

Auch in dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Quecksilberchlorid unter

Anaerobiose die Expression wichtiger anaerob induzierter Gene sowie Gene des

Kupfermangelmetabolismus hemmt. In einer Studie von Quinn und Kollegen

Diskussion

71

konnte kein Einfluss von HgCl2 auf die HYD1 Transkription gezeigt werden (Quinn

et al., 2002). Dies unterscheidet sich von den hier vorgestellten Ergebnissen: Bei

Zugabe von HgCl2 konnte nicht nur eine deutlich verminderte HYD1 Transkription,

sondern auch eine stark verringerte HYD1 Proteinmenge beobachtet werden, was

vermutlich zu dem gezeigten Verlust der in vitro-Hydrogenaseaktivität führte. Eine

mögliche Erklärung dafür könnte der unterschiedliche experimentelle Aufbau sein.

So wurden in dieser Arbeit die Zellen durch gasdichten Verschluss und

Abdunkelung anaerob induziert und nicht bei Belichtung durch Stickstoffbegasung

wie in der von Quinn und Kollegen durchgeführten Studie (Quinn et al., 2002). Ein

wesentlich entscheidender Faktor könnte jedoch auch die höhere Konzentration

an verwendetem Quecksilberchlorid (10 µM gegenüber 1 µM) in dieser Arbeit sein.

Quinn et al. (2002) verwendeten 10 µM HgCl2 zur erfolgreichen Unterdrückung der

CPX1 und CYC6 Transkription, während die Expression des HYD1-Gens in

Anwesenheit von 1 µM untersucht wurde. In Anwesenheit dieser geringen Menge

an Quecksilberchlorid wurde das CPX1 Transkript jedoch noch gebildet, so dass

in der hier vorliegenden Arbeit die höhere Konzentration von 10 µM gewählt wurde

(Quinn et al., 2002).

Die Wirkstoffstudien mit Quecksilberchlorid sowie die physiologische

Charakterisierung der CRR1 defizienten Mutante 41-6 zeigen, dass es

anscheinend eine größere Anzahl an Genen gibt, die sowohl unter Kupfer- als

auch unter Sauerstoffmangel durch CRR1 reguliert werden. Durch qPCR konnte

gezeigt werden, dass unter Kupfermangel auch die anaerob induzierten Gene

HYD1 und HYDEF transkribiert wurden, und dass diese Transkription durch einen

Defekt im CRR1-Gen vermindert war. Quecksilberchlorid beeinflusste nicht nur die

Transkription der kupfermangelinduzierten Gene CYC6 und CPX1, sondern auch

die von FDX5 und der Gene HYDEF, HYDG sowie HYD1. Die Transkription des

CRR1-Gens scheint ebenfalls durch Quecksilberchlorid beeinflusst zu werden,

obwohl bis jetzt angenommen wird, dass CRR1 keiner transkriptionellen

Regulation unterliegt (Kropat et al., 2005). Diese verminderte Transkription von

CRR1 nach Zugabe von HgCl2 eröffnet allerdings auch die Möglichkeit, dass

HgCl2 durch die Menge an gebildetem CRR1 die Expression der gezeigten Gene

beeinflusst.

Diskussion

72

Die Frage, warum eine Gruppe von Genen sowohl unter Kupfer- als auch unter

Sauerstoffmangel aktiviert wird, ist bis heute ungeklärt. Kupfer präzipitiert unter

anaeroben Bedingungen, was die Bioverfügbarkeit dieses Spurenelements stark

vermindert (Osterberg, 1974). Man vermutet, dass erst die Anreicherung der

Atmosphäre mit Sauerstoff zur Bildung von löslichem Cu2+ aus dem vorher

unlöslichen Cu+ und zur Entstehung von Kupfer-bindenden Enzymen führte

(Egami, 1975). Die Entstehung eines Transkriptionsfaktors für beide

Umweltbedingungen könnte demnach evolutionär bedingt sein. Für den

Transkriptionsfaktor CRR1 könnte dies bedeuten, dass er noch wesentlich mehr

Gene reguliert als bisher gezeigt. Neue Studien, die mit Hilfe der „RNA-

Sequencing“-Methode das Transkriptom eines CRR1-defizienten mit dem eines

CRR1-komplementierten Stammes unter Kupfer- oder Sauerstoffmangel

vergleichen, geben erste Hinweise, dass dies tatsächlich der Fall ist (Castruita et

al., 2011; A. Hemschemeier, persönliche Kommunikation).

Die Regulation CRR1-abhängiger Gene erfolgt über GT AC-Motive

Die Regulation CRR1-abhängiger Gene erfolgt auf transkriptioneller Ebene durch

Bindung der SBP-Domäne von CRR1 an DNA-Sequenzen mit einer GTAC-

Kernsequenz im Promotorbereich der entsprechenden Gene (Quinn et al., 2000;

Kropat et al., 2005; Lambertz et al., 2010). Diese Sequenzabfolge wird als GTAC-

Motiv bezeichnet und wurde bisher in den Promotorsequenzen aller bekannten

CRR1-regulierten Gene nachgewiesen . Eine in silico Analyse der Promotorregion

des HYD1 Gens identifizierte zwei GTAC Motive an den Positionen -173 und -84

(Abb. 4-1).

Diskussion

73

Abb. 4-1: GTAC-Motive in den Promotoren Sauerstoff- und Kupfermangel-induzierter Gene.

Graue Boxen repräsentieren ein GTAC-Motiv, dessen Einfluss auf die Genexpression unter

Kupfer- und/oder Sauerstoffmangel durch Promotoranalysen nachgewiesen werden konnte.

Schwarze Boxen zeigen GTAC-Motive, die die Genexpression nicht beeinflussen. Weiße Boxen

stellen GTAC-Elemente dar, die bisher nicht unabhängig von weiteren GTAC-Motiven untersucht

wurden.

Frühere Untersuchungen zeigten außerdem durch einen elektrophoretischen

Mobilitätstest (EMSA), dass die heterolog exprimierte CRR1-SBP-Domäne in vitro

an das proximale GTAC-Motiv bindet (Lambertz, Doktorarbeit 2010).

Reportergenanalysen mit verschiedenen Fragmenten des HYD1 Promotors und

dem Luziferase-kodierenden Reportergen CRLUC unter anaeroben

Schwefelmangelbedingungen (Lambertz, Doktorarbeit 2010) und

Kupfermangelbedingungen (diese Arbeit) zeigten außerdem einen Einfluss der

GTAC-Motive auf die HYD1 Promotoraktivität. Diese sind in Abbildung 4-2

schematisch zusammengefasst.

Die Mutation in einem der beiden Motive führte unter Schwefelmangel zu einer

Abnahme der Luziferaseaktivität. Diese Aktivitätsabnahme war bei Mutation beider

Motive noch stärker ausgeprägt. Ein vollständiger Verlust der Luziferaseaktivität

unter Anaerobiose konnte jedoch erst bei einer Verkürzung bis Position -29

ausgehend vom Transkriptionsstartpunkt festgestellt werden und ist somit

unabhängig von den GTAC-Motiven (Lambertz, Doktorarbeit 2010). In dieser

Arbeit konnte weiterhin bestätigt werden, dass die GTAC-Motive auch unter

Kupfermangelbedingungen die HYD1 Promotoraktivität beeinflussen. Die Mutation

Diskussion

74

in einem GTAC-Element führte in Reportergenanalysen zu einer Abnahme der

Luziferaseaktivität. Wurden beide GTAC-Motive in ihrer Sequenz verändert

resultierte dies in einem vollständigen Verlust der messbaren Aktivität.

Abb. 4-2: Schematische Übersicht der Luziferaseakti vität unter Schwefel- und

Kupfermangelbedingungen in Abhängigkeit der GTAC-Mo tive in den

Reportergenkonstrukten. Dargestellt ist der HYD1 Promotorbereich mit den untersuchten GTAC-

Motiven in nativer (weiße Boxen) und veränderter (schwarze Boxen) Sequenz. Die gemessene

Aktivität des Reporterproteins Luziferase (RLU) ist mit gelben, geschwungenen Pfeilen skizziert.

Unter anaeroben Schwefelmangelbedingungen (links) führt erst eine Deletion der Region

stromaufwärts des Transkriptionsstartpunktes des HYD1-Gens bis Position -29 zu einer nicht mehr

messbaren Luziferaseaktivität. Unter Kupfermangelbedingungen (rechts) zeigt der Promotor bei

Mutation beider GTAC-Motive keine messbare Aktivität mehr.

Da beide GTAC-Motive anscheinend essentiell für die HYD1 Promotoraktivität

unter Kupfermangelbedingungen sind, sollte im Fall einer Regulation durch CRR1

eine CRR1 defiziente Mutante in Abwesenheit von Kupfer nicht mehr in der Lage

sein, HYD1 Transkript zu bilden. Es konnte jedoch in dieser Arbeit anhand der

Transformante 41-6 und in einer Studie von Castruita und Kollegen mit einer

Diskussion

75

weiteren crr1-Mutante (Castruita et al., 2011) gezeigt werden, dass die

HYD1-Expression beider untersuchter Mutanten lediglich verringert ist. Diese

Diskrepanz könnte einerseits durch eine nicht ausreichende Sensitivität des

Luziferase-Assays zu erklären sein. Es wurde bereits gezeigt, dass eine anhand

von Transkriptanalysen nachweisbare, aber im Vergleich zu Schwefelmangel

geringere Promoteraktivität des FDX5-Promoters nicht mittels Luziferase-Aktivität

nachgewiesen werden konnte (Lambertz et al., 2010). Da das Genom von

C. reinhardtii insgesamt mindestens 21 Gene aufweist, die für putative SBP-

Domänen Proteine kodieren (Riano-Pachon et al., 2008), kann jedoch

andererseits auch die Möglichkeit nicht ausgeschlossen werden, dass ein anderes

SBP-Domänen Protein als CRR1 die HYD1 Expressionsregulation beeinflusst.

SBP-Domänen Proteine besitzen die Fähigkeit, generell und speziesübergreifend

in vitro an GTAC-Motive binden zu können (Birkenbihl et al., 2005). So kann zum

einen die SBP-Domäne von CRR1 aus C. reinhardtii an GTAC-Motive von

Promotoren aus Arabidopsis binden und zum anderen ist bekannt, dass der CYC6

Promotor aus C. reinhardtii mit der SBP-Domäne von Proteinen aus

Physcomitrella interagieren kann (Birkenbihl et al., 2005). Die verringerte, aber

nicht abwesende Transkription des HYD1-Gens in crr1-Mutanten könnte also auch

auf die partielle Regulation eines bisher unbekannten SBP-Box-

Transkriptionsfaktors durch CRR1 zurückzuführen sein.

Regulation der HYD1 Expression

Aufgrund der diskutierten Ergebnisse kann ein vorläufiges Modell der

Expressionsregulation des HYD1-Gens erstellt werden (Abb. 4-3). Die

Reportergenanalysen unter anaeroben Schwefelmangelbedingungen haben

gezeigt, dass die HYD1-Expression zwar durch die GTAC-Motive beeinflusst wird,

jedoch nicht vollständig von ihnen abhängig ist. Es ist daher zu vermuten, dass

unter Sauerstoffmangel noch mindestens ein weiterer Faktor die Expression des

HYD1-Gens reguliert. Unter Kupfermangelbedingungen scheint die HYD1-

Expression strikter durch die GTAC-Motive reguliert zu sein, da Mutationen in

beiden Motiven zu einem Verlust der Promotoraktivität führten. Da CRR1

defiziente Mutanten unter Kupfermangel jedoch noch HYD1 Transkript bilden,

Diskussion

76

besteht die Möglichkeit, dass ein weiteres SBP-Domänen-Protein die Expression

durch Bindung an die GTAC-Motive reguliert. In diesem Fall könnte das CRR1

Protein möglicherweise lediglich verstärkend auf die Transkription wirken oder

seinerseits den unbekannten Faktor regulieren. Diese Situation wäre natürlich

auch unter anaeroben Bedingungen denkbar, da die direkte Interaktion von CRR1

mit dem HYD1 Promotor in vivo noch nicht nachgewiesen werden konnte.

Abb. 4-3: Modell der HYD1-Regulation unter Sauerstoff- und Kupfermangel . Die Regulation

des HYD1-Gens wird durch GTAC-Elemente (weiße Boxen) in der Promotorregion beeinflusst.

CRR1 (blau) kann durch Bindung an die GTAC-Motive die Transkription regulieren. Unter

Sauerstoffmangel ist wahrscheinlich ein zusätzlicher unbekannter Faktor (gelb) an der

Transkriptionsregulation beteiligt. Desweiteren könnte auch ein unbekanntes SBP-Domänen-

Protein (orange) in Abhängigkeit von CRR1 die Transkription durch Bindung an die GTAC-Motive

beeinflussen.

CRR1 ist ein Multidomänenprotein und besitzt neben der SBP-Domäne noch ein

N-terminales AHA-(„aromatic, hydrophobic, acidic“)-Motiv, ein Ankyrin-

Wiederholungsmotiv und eine C-terminale Cystein-reiche Region (Sommer et al.,

2010; Kropat et al., 2011). Die charakteristische Funktion eines Ankyrin-

Wiederholungsmotivs besteht in der Vermittlung von Protein-Protein-Interaktionen.

Diskussion

77

Diese Domäne kann auch in einer Vielzahl weiterer SBP-Domänen-Proteinen

gefunden werden (Riese et al., 2007) und ermöglicht in der Theorie eine

Interaktion von CRR1 mit anderen regulativen Faktoren. In einer kürzlich

vorgestellten Studie konnte gezeigt werden, dass nach Komplementation einer

CRR1 defizienten Mutante mit einem CRR1-Konstrukt, das eine Leseraster-

Mutation im Ankyrin-Wiederholungsmotiv besitzt, die kupfermangelinduzierte

Expression des CYC6 Gens wieder hergestellt werden konnte, während die

anaerob induzierte CYC6 Expression stark verringert war (Sommer et al., 2010).

Nach Komplementation mit einem Konstrukt, in dem der cysteinreiche C-Terminus

des CRR1-Gens entfernt wurde, war ebenfalls eine Kupfermangelinduktion des

CYC6-Gens zu beobachten, jedoch keinerlei Transkriptionsantwort auf Hypoxie

(Sommer et al., 2010). Diese zwei Motive von CRR1 könnten daher

möglicherweise an der differentiellen Regulation unter Sauerstoff- und

Kupfermangel beteiligt sein. So könnte eine Interaktion von CRR1 mit einem

weiteren regulativen Protein über das Ankyrin-Wiederholungsmotiv erfolgen. Die

cysteinreiche Region am C-Terminus von CRR1 könnte analoge Funktionen zu

sauerstoffabhängigen Transkriptionsfaktoren, wie z. B. OxyR, aufweisen.

Tatsächlich beschreibt ein kürzlich vorgestelltes Modell eine Aktivierung von

CRR1 unter Kupfermangel durch den Austausch zweiwertiger Kupferionen durch

Zinkionen an der SBP-Domäne und eine daraus resultierende DNA-Bindung an

das GTAC-Motiv. Die Aktivierung unter Sauerstoffmangel kann bis jetzt nur

vermutet werden und könnte möglicherweise durch Modifikationen an den

C-terminalen Cysteinen erfolgen. In Abwesenheit von Sauerstoff könnten diese an

ihren Thiolresten reduziert und die Elektronen auf das zweiwertige Kupfer

übertragen werden. Cu(I)-Ionen besitzen eine geringere Binde-Affinität für die

SBP-Domäne weshalb angenommen wird, dass diese durch Zn(II)-Ionen

ausgetauscht werden. Dies würde analog zu Kupfermangelbedingungen zu einer

Bindung an GTAC-Motive und zur Aktivierung der Genexpression führen (Abb.

4-4) (Sommer et al., 2010).

Diskussion

78

Abb. 4-4: Vorläufiges Modell der Transkriptionsregu lation durch CRR1 (nach Sommer 2010).

In Anwesenheit von Kupfer binden Cu(II)-Ionen an die SBP-Domäne und verhindern eine DNA-

Bindung. Ist kein Kupfer vorhanden, binden Zn(II)-Ionen an die SBP-Domäne und es findet eine

Bindung an GTAC-Motive statt. Unter Anaerobiose werden Thiolreste am cysteinreichen C-

Terminus und gebundenes Cu(II) reduziert. Dadurch enstandenes Cu(I) besitzt eine geringere

Affinität und wird durch Zn(II) ersetzt.

Die vielfältigen und sich in ihren genauen Mechanismen offenbar

unterscheidenden Regulationsmöglichkeiten durch den Transkriptionsfaktor CRR1

wurden auch in einer kürzlich vorgestellten Studie gezeigt (Strenkert et al., 2011).

So modifziert CRR1 die Chromatinstruktur der Promotorregionen seiner Zielgene

in unterschiedlicher Intensität. CRR1 bewirkt eine Öffnung der Chromatin-Struktur

des CYC6 Promotors unter Kupfermangelbedingungen und ermöglicht so erst die

Transkription durch die RNA-Polymerase. Die Promotorregion des CRD1 Gens

hingegen scheint auch unter nicht induzierenden Bedingungen in einer konstitutiv

geöffneten Chromatinstruktur vorzuliegen. Es wird diskutiert, dass CRR1 in

diesem Fall nur zur Verstärkung der Transkription neben einem weiteren bisher

unbekannten Faktor dient (Strenkert et al., 2011). Die Expressionsmuster von

CYC6, CRD1 und CPX1 unter Kupfer bzw. Sauerstoffmangel zeigen ebenfalls

Unterschiede auf. So werden CRD1 und CPX1 unter Sauerstoffmangel viel

schneller und stärker induziert als CYC6. In Abwesenheit von Kupfer wird

hingegen mehr CYC6-Transkript gebildet als von CPX1 (Quinn et al., 2002). Eine

Diskussion

79

differentielle Transkriptionskontrolle mehrerer Gene unter verschiedenen

Umweltbedingungen durch CRR1, verursacht durch unterschiedliche

Mechanismen des Proteins, scheint also durchaus denkbar.

Weitere putative cis-agierende Elemente im HYD1-Promotorbereich

Da die HYD1-Transkription unter Sauerstoffmangel nur teilweise durch die GTAC-

Motive und den Transkriptionsfaktor CRR1 reguliert zu werden scheint, gibt es

möglicherweise andere unbekannte regulative Faktoren. Die Regulation eines

Gens durch mehrere cis-agierende Elemente und unterschiedliche

Umweltbedingungen in C. reinhardtii konnte bereits gezeigt werden. So wird das

H43/FEA1-Gen (“High-CO2-inducible 43 kDa protein/Fe assimilation 1”) sowohl

durch einen erhöhten CO2-Gehalt, als auch durch Eisenmangel über zwei

unterschiedliche Promotorelemente reguliert (Baba et al., 2011). Auch die

Regulation des HSP70A-Gens („heat shock protein“) in C. reinhardtii durch Hitze

und Licht erfolgt durch unterschiedliche cis-Elemente und Signalwege (Kropat et

al., 1995).

Ein Vergleich der Promotorsequenz des HYD1-Gens mit einer Datenbank von cis-

agierenden regulatorischen DNA-Elementen (“PLACE”, „Database of plant cis-

acting regulatory DNA elements“, http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/) (Higo et al.,

1999) ergab eine Vielzahl putativer cis-agierender Sequenzen. Dabei konnte ein

cis-Element gefunden werden, dass genau in der Region liegt, deren Deletion

unter anaeroben Schwefelmangelbedinungen zum Verlust der Promotoraktivität

des HYD1-Gens führt und somit möglicherweise von Relevanz bei der

Transkriptionsregulation ist (Abb. 4-5). Diese Sequenz befindet sich zwischen

Position -33 und -56 ausgehend vom Transkriptionsstartpunkt und ist bekannt als

„plastid response element“ (PRE). Plastid-„Response“-Elemente besitzen die

Sequenz (G/C)CGA(C/T)N(A/G)N15(T/C/A)(A/T/G) und wirken regulativ auf die

Expression des HSP70A Gens in C. reinhardtii in Abhängigkeit von Mg-

Protoporphyrin und Licht (von Gromoff et al., 2006).

Diskussion

80

Abb. 4-5: „Plastid Response Element“ im Hydrogenase Promotor. Dargestellt ist die

Auswirkung der sukzessiven Deletion der HYD1 Promotorregion unter anaeroben

Schwefelmangelbedingungen auf die Expression. Die Sequenz des PRE ist grau dargestellt.

Eine Beteiligung von Licht bei der Induktion der HYD1-Expression in Abhängigkeit

des PRE ist insofern denkbar, als dass bei belichteten anaeroben Bedingungen,

verursacht durch Schwefelmangel, wesentlich mehr HYD1-Transkript gebildet wird

als unter Anaerobiose und Dunkelheit im Rahmen einer artifiziellen anaeroben

Induktion. Auch scheint die HYD1-Transkription in synchronisierten C. reinhardtii

Kulturen tageszeitlichen Schwankungen zu unterliegen, die nicht ausschließlich

mit dem Sauerstoffgehalt des umgebenden Mediums zu erklären sind (Whitney et

al., 2010). Die Lokalisation von HYD1 im Chloroplasten und eine Kopplung an die

photosynthetische Elektronentransportkette lassen außerdem vermuten, dass die

wichtigste physiologische Funktion der Hydrogenase unter Lichteinfluss und

Anaerobiose ausgeübt wird. Um einen tatsächlichen Einfluss der Sequenz des

PRE auf die HYD1 Promotoraktivität nachzuweisen, sind jedoch weitere

Untersuchungen notwendig. So könnte das in dieser Arbeit verwendete System

mit dem CRLUC Reportergen in Kombination mit einer mutierten Sequenz des

Plastid-„Response“-Elements für weitere Analysen verwendet werden.

Die Regulation der HYD1-Expression scheint durch das Zusammenspiel einer

Vielzahl von Faktoren beeinflusst zu werden. Als ein zentraler spezifischer

Diskussion

81

Transkriptionsfaktor wurde das Protein CRR1 identifiziert und auch die Beteiligung

der GTAC-Motive konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden. Es ist zu

vermuten, dass weitere regulatorische Proteine in Interaktion mit CRR1 oder

CRR1-unabhängig die Transkription von HYD1 steuern. Als möglicher Botenstoff

der anaeroben Adaptation kann Sticktoffmonoxid diskutiert werden. Die putative

Bedeutung des PRE im HYD1-Promotor eröffnet darüber hinaus die Möglichkeit

einer Beteiligung weiterer Umwelsignale neben Sauerstoffmangel auf die HYD1-

Transkriptionsregulation.

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Anhang

94

6 Anhang

6.1 Sequenzierungsergebnis

Das Sequenzierungsergebnis der inversen PCR ist mit der Sequenz der

Paromomycin-Kassette (rot), des Genmodels au5.g9305_t1 (grau), der PstI-

Schnittstelle (grün) und des CRR1-Gens (schwarz) dargestellt.

6.2 Chemikalien, Enzyme, Kits, Geräte

Chemikalien

Die eingesetzten Chemikalien wurden in größtmöglicher Reinheit (p.A. Qualität)

von den Firmen Acros, LKB-Pharmacia, Merck, Roche, Roth, Serva und Sigma

bezogen.

Anhang

95

Ausgewählte Enzyme und Substrate

Enzym Hersteller

Coelenterazin Pjk-GmbH

M-MLV Reverste Transkriptase Invitrogen Gibco, Carlsbad, CA, USA

Pfu Ultra Hotstart Stratagene, La Jolla, CA, USA

Restriktionsendonukleasen Fermentas, Burlington, Canada

RNase Inhibitor, RiboLock Fermentas, Burlington, Canada

RNasin Promega, Madison, WI, USA

Super Signal West Dura Extended solution Pierce, Rockfort, IL, USA

Taq-DNA-Polymerase Biotools, Madrid, Spanien

T4-DNA-Ligase Fermentas, Burlington, Canada

Kits

Kit-System Hersteller

DIG DNA Labeling dNTPs Roche Applied Science, Mannheim, Deutschland

DIG RNA-Labeling Kit (SP6/T7) Roche Applied Science, Mannheim, Deutschland

DIG RNA-Labeling dNTPs Roche Applied Science, Mannheim, Deutschland

Gene JetTM Plasmid MiniPrepKit Fermentas, Burlington, Canada

GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit GE Healthcare, Chalfont, UK

Nucleobond AX PC100 Macherey-Nagel, Düren, Deutschland

pGem-T Easy Vektor System Promega, Madison, WI, USA

Geräte

Gerät Modell Hersteller

Anaerobzelt CLc Coy Laboratory, Grass Lake, MI, USA

Chemilumineszenz-Detektor FluorChem8800 Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA

Distille Cyclon Fistrem, Loughborough, UK

Elektrophorese-Apparatur Mini-Protean Biorad, Hercules, CA, USA

Feinwaage AW 320 Shimadzu, Duisburg, Deutschland

Anhang

96

P1200N Mettler, Columbus, OH, USA

Gaschromatograph GC 2010 Shimadzu, Duisburg, Deutschland

Geldokumentationsgerät Gel Max Intas, Göttingen, Deutschland

Heizschüttler TM compact Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Impfbank HF 48 Gelaire Sydney, Australien

Hera Safe Kendro, Langenselbold, Deutschland

Microplate Luminometer Orion Berthold detection systems, Pforzheim, Deutschland

PCR-Gerät Mastercycler Personal Eppendorf, Hamburg, Deutschland

Gene Amp PCR-System 2700

Applied Biosystems, Foster City, CA, USA

Opticon 2 MJ Research, St. Bruno, Quebec, Kanada

pH-Elektrode B210-DH Broadley James Corporation, Bedford, UK

Photometer NanoDrop ND-1000 Peqlab, Erlangen, Deutschland

Smart spec 3000 BioRad, Hercules, CA, USA

Protein-Blotkammer Fastblot B44 Biometra, Göttingen, Deutschland

Thermoschüttler Thermomixer compact Heidolph, Eppendorf, Deutschland

Ultraschallgerät Sonifier 250 Branson, Danbury, CT, USA

Vakuumverdunster Speed Vac Concentrator

Bachofer, Reutlingen, Deutschland

Wasserbad SW-20C Julabo, Seelbach, Deutschland

Wärmeschränke B28 Binder, Tuttlingen, Deutschland

WTB Binder, Tuttlingen, Deutschland

Zentrifugen Mini Spin Eppendorf, Hamburg, Deutschland

5810R Eppendorf, Hamburg, Deutschland

5471R Eppendorf, Hamburg, Deutschland

97

Lebenslauf

Persönliche Daten

Name Miriam Pape

Geburtsdatum 26.11.1981

Geburtsort Menden

Staatsangehörigkeit deutsch

Familienstand ledig

Hochschulstudium

03/2008 bis 12/2011 Promotionsstudium an der Ruhr-Universität Bochum am

LS Biochemie der Pflanzen, AG Photobiotechnologie

mit dem Thema „Charakterisierung der differentiellen

Regulation des Hydrogenase-Gens aus

Chlamydomonas reinhardtii“

10/2002 bis 01/2008 Biologiestudium an der Ruhr-Universität Bochum,

Thema der Diplomarbeit „Physiologische und

molekularbiologische Charakterisierung der

Signaltransduktionswege im anaeroben Stoffwechsel

von Chlamydomonas reinhardtii“ (Gesamtnote: sehr

gut)

Schulausbildung

09/1992 bis 06/2001 Walram-Gymnasium, Menden, Abitur mit den

Schwerpunkten Englisch, Biologie, Deutsch,

Erziehungswissenschaften

09/1988 bis 06/1992 Grundschule Bischof-von-Ketteler-Schule

Freiwilliges Ökologisches Jahr

09/2001 bis 08/2002 Ökologiestation Sangerhausen e.V., Sangerhausen

98

Konferenzbeiträge

Miriam Pape , Anja Hemschemeier, Thomas Happe (2008) A novel screening

system detects regulative factors of the hydA1 promoter in Chlamydomonas

reinhardtii. 17. Photosynthese-Workshop Nord-West 2008, Bochum, Deutschland,

Vortrag

Miriam Pape , Anja Hemschemeier, Thomas Happe (2009) A novel screening

system detects regulative factors of the hydA1 promoter in Chlamydomonas

reinhardtii. VAAM-Jahrestagung, Bochum, Deutschland, Poster

Miriam Pape , Camilla Lambertz, Anja Hemschemeier, Thomas Happe (2009)

Transcriptional regulation of the hydA1 and fdxA promoter in Chlamydomonas

reinhardtii. SOLAR-H2 Workshop, Cambrils, Spanien, Poster

Miriam Pape , Camilla Lambertz, Anja Hemschemeier, Thomas Happe (2009)

Transcriptional regulation of the hydA1 and fdxA promoter in Chlamydomonas

reinhardtii. 18. Photosynthese-Workshop Nord-West 2009, Golm, Deutschland,

Vortrag

Miriam Pape , Anja Hemschemeier, Thomas Happe (2010) Transcriptional

regulation of the hydA1 promoter in Chlamydomonas reinhardtii. SOLAR-H2

Workshop, Berlin, Deutschland, Poster

Eingereichte Publikation

Pape M, Lambertz C, Happe T, Hemschemeier A (2011) Differential expression

of the Chlamydomonas [FeFe]-hydrogenase encoding HYDA1 gene is regulated

by the Copper Response Regulator 1. Plant Phys, submitted

Danke!

Prof. Dr. Thomas Happe danke ich für die Möglichkeit in seiner Arbeitsgruppe

promovieren zu können, für das stetige Interesse an dieser Arbeit und die damit

verbundenen wissenschaftlichen Gespräche und Ratschläge.

Prof. Dr. Nicole Frankenberg-Dinkel danke ich für die freundliche Übernahme des

Korreferats.

Dr. Anja Hemschemeier hat mich mit zahlreichen wissenschaftlichen Ratschlägen und

Ideen, ständiger Diskussionbereitschaft und Aufmunterung nach frustrierenden

Labortagen immer unterstützt. Dafür danke ich ihr sehr.

Dr. Camilla Lambertz danke ich für die tolle Laborplatznachbarschaft, ihre Anteilnahme

bei Problemen mit gewissen Chlamys und ihre Untersützung in allen Lebenslagen.

Ich danke der gesamten AG Happe für die super Arbeitsatmosphäre und

Zusammenarbeit, sowie für die Unterstützung und das Verständnis vor allem zum Ende

meiner Arbeit. Besonders danken möchte ich dem „Büro nebenan“ für die gemeinsamen

Feiern und Freizeitaktivitäten, die netten, spaßigen und manchmal auch tiefgründigen

Gespräche und dafür, dass immer ein Stuhl für mich da war.

Ganz herzlich danke ich Anja und Dana für 18 Semester Freundschaft! Olaf, Debbie und

Ainhara möchte ich für Unterstützung und Aufmunterung, aber auch den Spaß danken,

den wir zusammen hatten. Ich bin froh, dass es euch alle gibt!

Ein großer Dank gilt Nicole. Für das schöne Zusammenleben in Paschistan, gespendeten

Trost und Mut, das gemeinsame Erkunden neuer kulinarischer Genüsse und die vielen

skurrilen Momente, die wir geteilt haben. Du bist mehr als nur Fernseh- und

Familienministerin!

Zuletzt möchte ich mich bei meinen Eltern und meinem Bruder für ihre Verlässlichkeit,

Unterstützung und ihr Mitfiebern bedanken. Ihr seid super!

Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbständig verfasst und bei keiner anderen

Fakultät eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel

verwendet habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um

sechs in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare.

Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in

keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.

Bochum, den

(Unterschrift)

Documents

Charakterisierung der differentiellen Regulation des ... · In the green alga C. reinhardtii, acclimation to oxygen deprivation is accompanied by extensive changes in gene expression