Europ. 07. Cancer Voh 3, pp. 457-466. Pergamon Press 1968; Printed in Great Britain ,

Charakterisierung menschlicher Tumoren durch autoradiographische Untersuchungen von Biopsiematerial*

W. OEHLERT Pathologisches Institut der Universitiit, Freiburg i. Brsg"

DIE YON zahlreichen Arbeitsgruppen mit unter- schiedlicher Methodik durchgeffihrten auto- radiographischen Stoffwechseluntersuchungen an menschlichen Geweben und Zellen dienen der Beantwortung verschiedener Fragen. So wurden die Versuchsergebnisse z.T. zur diag- nostischen Bewertung des Biopsiematerials [1] z.T. auch ffir die Stellung der Prognose herangezogen. Einige Autoren errechneten unter Verwendung der erhaltenen autoradio- graphischen Untersuchungsergebnisse nach Applikation von sH-Thymidin die Wachstums- geschwindigkeit der entsprechenden Tumoren [2--4], andere berficksichtigen sie bei der Wahl des Cytostatikums [5, 6]. Im Folgenden soll ein l~berblick fiber die z.T. praktizierte Methodik derartiger autoradiographischer Stoffwechseluntersuchungen und fiber einige der bisher erreichten Ergebnisse gegeben werden. Hierbei sollen in erster Linie Unter- suchungen der DNS-Neubildung unter Ver- wendung von "H-Thymidin berticksichtigt werden.

Untersuchungstechnik Die gfinstigsten Versuchsbedingungen sind

dann gegeben, wenn der Einbau radioaktiv markierter Nucleins~mre- und Proteinvorl~iufer in vivo und der autoradiographische Nachweis

*Presented at the Second International Symposium on the Biological Characteristization of Human Tumors, Rome, April 24-26, 1967.

anschliessend an Biopsiematerial oder an Zell- ausstrichen erfolgt [7]. Dieses Vorgehen erfordert jedoch die Injektion verh~iltnismftssig grosser Aktivit~itsmengen, sodass diese Methode wegen der damit verbundenen Strahlenbelas- tung des Gesamtorganismus nur in Ausnahme- f~llen und nicht routinem~issig oder gar mehrmals nacheinander durchftihrbar ist. Nur mit dieser Methode der in vivo-Inkorporation jedoch ist die exakte Bestimmung der DNS- Synthese-Zeit und anderer Generations- phasen m6glich.

Um die Strahlengef~ihrdung des Gesamt- organismus m6glichst gering zu halten, wurde die intraarterielle Applikation radioaktiv mar- kierter Nucleins~urevorl~iufer vorgeschlagen [8]. Dabei erfolgt eine fiberwiegende Mar- kierung des Operationsgebietes, bzw. des zu entfernenden Tumors, der dann nach operativer Entfernung autoradiographisch untersucht werden kann. Bei Wahl geeigneter Versuchszeiten zwischen intraarterieller In- jektion und mehrmaliger Gewebsentnahme vor der endgfiltigen operativen Entfernung des Tumors gelingt auch mit dieser Methode eine Bestimmung yon Generationszeiten.

Eine ebenfalls verMtltnism~issig streng begrenzte lokale Markierung von Lymphknoten erreicht man dutch Injektion von tritiiertem Thymidin (50 gC) in die periphere Lymph- bahn [9]. Nach Excision der entsprechenden Lymphknotengruppen und deren autoradio- graphischer Untersuchung erhfdt man

457

458 W. Oehlert

® @

Introven~s Intraarteriel[ Intracavit~r Intralymphatisch Inkubation in vitro

Abb. 1. Die verschiedenen Applikationsm6"glichkeiten radioaktiv markierter Wuklein. siiurevorliiufer zur autoradiographischen Untersuchung menschlicher Tumoren und die

damit verbundene Strahlengefi~dung des Gesamtorganismus.

Aussagen fiber die Proliferationsaktivit~t und das Markierungsmuster bei Erkrankungen des lymphatischen Gewebes, vor allen Dingen bei Tumoren in diesen Geweben.

Ebenfalls ohne eine gr6ssere Strahlenbelas- tung des Gesamtorganismus k6nnen Einbauver- suche mit Radioaktivit~it in K6rperh6hlen- Ergiissen durchgeffihrt werden [10]. Bei dieser Methode kommt man mit relativ kleinen Aktivi- t~itsdosen (bis zu 500 pC) aus und erreicht innerhalb des Ergusses eine verh~iltnism~issig grosse Aktivit~itskonzentration.

Jegliche Belastung des Gesamtorganismus wird vermieden, wenn man die Einbauver- suche in vitro an bioptisch entnommenen Geweben oder durch Punktion gewonnenen Zellen durchffihrt. Bei der Interpretation der mit dieser Methode erhaltenen Ergebnisse setzt man voraus, dass die Inkorporations- verh~dtnisse des Tumorgewebes in vitro den in vivo exisfierenden Bedingungen gleichzusetzen sind. Wie eine Reihe yon Kontrollversuchen gezeigt hat [11, 12], sind diese Voraussetzungen bei kurzen Inkubationszeiten in neutralem Medium weitgehend erffillt. Der Nachteil der Inkubationsmethode liegt in der sehr geringen Eindringtiefe des Mediums, welches zwar durch Inkubation bei erh6htem Sauerstoffdruck verbessert werden kann [13], aber dennoch die Untersuchung nur sehr kleiner Gewebspartikel gestattet. Da die Stoff- wechselverh~iltnisse und der histologische Gewebsaufbau vor allem in gr6sseren Tumora- realen sehr unterschiedlich sein k6nnen, werden die bei der Inkubation kleiner Gewebspartikel erhaltenen Ergebnisse immer nur beschr~inkte Aussagen fiber umschriebene Tumorareale zulassen. Zus~itzlich sei darauf hingewiesen, dass mittels der Inkubationsmethode eine Bestimmung von Generationsphasen nicht m6glich ist.

Technik der in vitro-Inkubation Unmittelbar nach Gewebsentnahme erfolgt

die 30 rain. Inkubation bei 37 ° in Ringer- 16sung oder anderen N~thrmedien, durch welche ein Sauerstoffstrom geblasen wird. Durch Wahl von Inkubationsgefftssen, in denen ein hoher Sauerstoffdruck w~hrend der Inkuba- tion erzeugt wird [13] k6nnen die Ergebnisse erheblich verbessert werden. Der Inkubations- 16sung werden die entsprechenden radioaktiv markierten Stoffwechselvorl~ufer zugesetzt und zwar in folgender Konzentration: "H-Thymidin (spezifische AktivitRt 3C/mMol)

2-4 gC/ml "H-Cytidin (spezifische Aktivit~t, 1,9 C/mMol)

4,6 pC/ml "H-Leucin-DL (spezifische Aktivit~tt 2,4 C/m

Mol) 10 gC/ml. Nach 30-min Inkubation werden die Gewebs-

stficke ffir 24 Stunden in 4%igem neutralem Formalin fixiert, anschliessend in Paraffin eingebettet und in fiblicher Weise in 5 p-dicke Schnitte zerlegt. Von diesen Gewebsschnitten werden unter Verwendung photographischer Emulsionen (Ilford K2, Ilford G 5, Kodak AR i 0-Stripping-Film) Autoradiogramme angeferfigt, die nach entsprechenden Belich- tungszeiten photographisch entwickelt, fixiert und dann gef~rbt werden. Diese Technik wurde in vielfaeher Weise modifiziert, z.B. durch Ver~nderung der Inkubationszeiten, durch entsprechende vorhergehende Prepara- tion der entnommenen Gewebsproben oder durch unterschiedliche Anfertigung der Auto- radiogramme; sie ist jedoch im Prinzip bei allen Untersuchern die gleiche.

Ergebnisse autoradiographischer Untersuchungen zum Proliferationsmuster und der Proliferationsgrb'sse prdcancerb'ser menschlicher Gewebsvergnderungen

Im Tierexperiment konnte am Beispiel des

Abb. 2.

Abb. 3.

Autoradiogramm des normaIen Portioepithels, 30 min nach inkubation mit 3-H- Thymidin.

Autoradiogramm des abnormen Portioepithels, 30 min nach Inkubation mit -H- Thymidin.

Abb. 4. Autoradiogramm des atypischen Portioepithels, 30 min nach Inkubalion mit all- Thymidin.

Abb. 5. Autoradiogramm des nicht verhornenden Pflaslerzellkarzinoms der Portio, 30 rain. nach Inkubation mit 3 H- Thymidin. ( Alle Bilder aus : Fettig und Sievers [15]).

Abb. 6, 7, 8. Autoradiogramme des normalen (6) metaplastischen (7) carcinomat6s (8) veriinderten menschlichen Bronchialepithels, 30 min. nach Inkubation mit 3-H- Thymidin.

Gharakterisierung mensehlicher Tumoren durch autoradiographische Untersuchungen yon Biopsiematerial 459

Tabelle 1. Autoradiographisch bestimmte Generationszeit der intermitotischen Zellen der Miiusehaut wiihrend der Krebsentstehung dutch Methylcholanthren-

Applikation [14]

Gewebe aH-Markierungsindex L~inge der S-Phase Generat. Zeit

Strat. basale unbeh. Epithel 2-4% 6-7 Std. 150 Std.

Hyperplasie 14,2% 8 Std. 56 Std.

Carcinom 30,0% 8 Std. 32 Std.

Plattenepithelcarcinoms der M~usehaut nach lokaler Applikation von Methylcholantren nachgewiesen werden, dass dem fiber mehrere Wochen sich hin erstreckenden Cancerisie- rungsprozess zum voll ausgebildeten Carcinom eine steigende Proliferationsgeschwindigkeit und eine Ver~inderung des Proliferations- musters im mehrschichtigen Plattenepithel parallel gehen. Die in Tabelle 1 aufgeffihrten Werte zeigen, dass vom normalen mehr- schichtigen Plattenepithel fiber die Hyperplasie bis zum Carcinom eine erhebliche Zunahme der Proliferationsaktivit~t mit der dazuge- h6rigen Abnahme der Generationszeit erfolgt [14.].

Ganz ~hnliche Ergebnisse wurden bei auto- radiographischen Untersuchungen am mehr- schichtigen Portioepithel durch Inkubation yon Gewebsstticken mit 3H-Thymidin erhalten. [15] Bei den in Tabelle la aufgeffihrten Werten wurde die Generationszeit unter Zugrundelegung einer DNS-Synthesezeit yon 6 Stunden errechnet. Die Ergebnisse lassen erkennen, dass auch im menschlichen Portio- epithel w~hrend der pr~cancer6sen Epithelve- r~nderungen eine erhebliche Steigerung der

Proliferationsrate besteht. Innerhalb der ver- schiedenen Entdifferenzierungsstufen vom ab- normen zum atypischen Portiopithel bestehen keine signifikanten Unterschiede; mit der Ent- wicklung zum Careinom erfolgt jedoch eine erneute Steigerung der Proliferationsrate mit einer entsprechenden Verkiirzung der Gene- rationszeit.

Zus~tzlich zu diesen durch quantitative Auswertung yon Autoradiogrammen er- haltenen Aussagen, die selbstverst~ndlich nur als relative Ann~iherungswerte verstanden werden k6nnen, wurde durch die Inkubations- technik eine )knderung im Proliferations- muster des Portioepithels aufgefunden, welche in Parallele zu den entsprechenden Ver/in- derungen bei der experimentellen Caneerisie- rung zu setzen ist.

In Abb. [2-5] ist deutlich erkennbar, dass bei der Caneerisierung des menschlichen Portioepithels immer mehr Zellschichten in die DNS-Synthese und damit in die Indiffe- renzzone einbezogen werden. Im voll aus- gebildeten Carcinom schliesslich existiert eine eigentliche Indifferenzzone nicht mehr. Alle Zellen sind zur DNS-Synthese bef~ihigt.

Tabelle 1 a. dVach in vitro-Incorporation von 81t- Thymidin bestimmte Markie- rungsindices und gescMitzte Generationszeiten des Portioepithels (menschl.) des

atypischen Epithels und des Portiocarcinoms [15]

G e w e b e 8H-Markiertmgsindex L~inge der S-Phase (%)

Generat. Zeit

Portioepithel normal

abnorm.

unruhig

atypisch

Carcinom

6,2

12,0

15,0

15,7

23,0

ffiraUe Gewebe angenommene Zeit

=6 Std.

96 Std.

50 Std.

40 Std.

38 Std.

26 Std.

46O IV. Oehlert

Tabelle 2. 3H-Markierungsindices und geschdtzte Generationszeiten menschlicher Tumoren nach autoradiographischen Untersuchungen (in vitro-Inkubation)

G e w e b e Markierungsindex Generat. Zeit Literatur (%)

Adeno-Ca. Colon Metastase 22,0 27 Std. Magen-Ca. 9,0 66 Std. Adeno-Ca. Colon Metastase 8,0 75 Std. Leber-Ca. 2,5 10 Tage Glioblast. multif. 0,6 1 Monat Cystadenom Ovar 0,36 1,5 Monat Ovarial-Ca. 0,34 1,5 Monat Mamma- Ca. 0,14 3,0 Monat Leiomyom 0,07 5,5 Monat

[2a]

Kleinzell. Bronchus-Ca. 10,2 60,0 Std. Kieferh6hlen-Ca. 15,0 39,6 Std. Pflasterzell-Ca. Zunge 7,0 85,8 Std.

[3]

Pflast erzell- Carcinome der Portio uteri 18,3 32,8 Std. Pflasterzell-Carcinome der Portio uteri 20,8 28,8 Std. Pflasterzell-Carcinome der Portio uteri 25,8 23,2 Std. Pflasterzell-Carcinome der Portio uteri 26,6 22,6 Std. Adeno-Ca. Corp. uteri 9,6 62,5 Std.

12,3 48,8 Std. 14,8 40,9 Std.

Schleimhaut-Sa. Uterus 12,3 48,8 Std.

[15]

Coecum-Ca. 20,2 28,0 Std. Sigma-Ca. 26,5 22,0 Std. Rectum-Ca. 15,4 35,0 Std. Ca. Rectum/Sigma 4,5 112,0 Std. Sigma-Ca. 10,9 48,0 Std.

[183

Aszites Zellen nach in vivo-Applikation von 3H-Thymidin Mamma-Ca. 12,5 Ovarial-Ca. 4,5 Oesophagus-Ca. 3,2 Magen-Ca. 3,0 Lymphoma malign. Hodgkin 1,8 Kystoma pseudomue. Ovar. 0,05

3,4 Tage 6,5 Tage 9,0 Tage

10,0 Tage 16,0 Tage 16,0 Monate

[10a]

)khnliche Untersuchungen wie am Portio- epithel wurden [16] am Biopsiematerial des Bronchialepithels vorgenommen. Auch hier liess sich nachweisen, dass mit zunehmender Entdifferenzierung des Epithels eine Steigerung der Proliferationsaktivitfit erfolgt, welche im Carcinom ihren H6hepunkt erreicht. In den Abb. [6-8] erkennt man, dass im metaplastisch ver~inderten Bronchialepithel, wie im Portio- epithel, die Indifferenzzone auf alle Zellschich- ten ausgedehnt wird, wobei die gewebsspezi- fische Differenzierung verloren geht und die Proliferationsaktivit ~it zunimmt.

Von besonderem Interesse sind Versuchs-

ergebnisse yon Trepel und Mitarb. [17] welche durch in vitro-Inkubation mit 3H- Thymidin und sH-Cytidin die DNS-Synthese und den RNS-Umsatz in verschiedenen Zell- arten des Lymphknotens bei Lymphknoten- hyperplasien, Morbus Hodgkin, grossfolliku- l~irem Lymphoblastom und Leukosen bestimmt haben. Dabei ergaben sich ftir Lymphknoten- hyperplasien, grossfollikul~ires Lymphoblastom und Morbus Hodgkin sehr ~ihnliche Ein- bauspektren, insofern, als bei allen drei Erkrankungen die lymphatischen Retikulum- zellen den gr6ssten Markierungsindex auf- wiesen. )khnliche Markierungsspektren zeigten

Charakterisierung menschlicher Tumoren durch autoradiographische Untersuchungen yon Biopsiematerial 461

reifzellige und unreifzellige Lymphadenosen, w~ihrend die akute Myelose und das Retiku- lumzellsarkom v611ig andere Markierungs- verh~thnisse aufwiesen. Die Gr6sse des Markie- rungsindex ffir die einzelnen Zellarten bei den verschiedenen Erkrankungen lagen sehr nahe beieinander und /ihnlich wie ffir die Leukosen kann auch ffir die Lymphknotenerkrankungen festgestellt werden, dass die Proliferations- aktivit~tt reaktiver Ver~inderungen eher gr6sser ist, als diejenige b6sartiger Tumoren wie: Morbus Hodgkin, grossfollikul/tres Lympho- blastom oder Lymphadenose.

Bestimmung der Wachstumsgeschwindigkeit b6sartiger Tumoren durch in vitro-Untersuchungen der DNS- Synthese

Bei guter Durchmarkierung der untersuchten Gewebe und durch Auswertung genfigend grosser Zellzahlen kann der sH-Markierungs- index der entsprechenden untersuchten Tumo- ren ermittelt werden. Er gibt die Anzahl markierter Zellkerne pro Gesamtzellzahl an. Unter der Annahme, dass jeder DNS-Synthese eine Mitose folgt, ist der 3H-Markierungsindex ein direktes Mass ffir die Proliferationsaktivit~it eines Gewebes. F fir das entsprechende Gewebe ffir das die Lange der DNS-Synthesezeit bekannt ist, kann die mittlere Lebensdauer der entsprechenden Zellpopnlation errechnet werden. Wir hatten bereits darauf hinge- wiesen, dass die Bestimmung der DNS- Synthesezeit mittels der Inkubation fiber- lebenden Gewebes praktisch unm6glich ist. In vivo-Untersuchungen an menschlichen Geweben hatten ergeben, dass mit DNS- Synthesezeiten yon 6 bis fiber 12 Stunden zu rechnen ist. Legt man derartige Werte der Berechnung yon Generationszeiten unter Verwendung der durch in vitro-Inkubation

erhaltenen Markierungsindices zugrunde, so hat man zu berficksichtigen, dass diese Werte mit einer erheblichen Fehlerbreite belastet sind. Es besteht die Moglichkeit, dass die Lange der DNS-Synthesezeit bei den verschie- densten Tumoren des Menschen ganz erheb- liche Unterschiede aufweisen kann, sodass ffir eine exakte Bestimmung der Generationszeit die DNS-Synthesezeit ffir den entsprechenden Tumor jeweils bestimmt werden miisste.

Bei den bisher vorliegenden Untersuchung- sergebnissen wurde yon der Mehrzahl der Untersucher ihren Berechnungen eine DNS- Synthesezeit yon 6 Stunden zugrundegelegt, welche, wie wir heute, wissen mit Sicherheit zu kurz bemessen ist. Immerhin wurden auf diese Weise zun~ichst einmal Werte ffir die verschiedenartigsten menschlichen Tumoren erhalten, die unter Berficksichtigung der genannten Voraussetzungen miteinander ver- gleichbar sind. Die bei ann~ihernd gleichen Inkubationszeiten erhaltenen Ergebnisse fiir eine ganze Reihe yon menschlichen Tumoren sind in Tabelle 2 zusammengefasst.

Das Verhiiltnis zwischen Markierungs- und Mitose- Index in menschlichen Tumoren

Wir wissen aus allen bisher vorliegenden autoradiographischen Untersuchungen in vivo, dass entsprechend der unterschiedlichen L~tnge der DNS-Synthese-Zeit und der Mitosezeit auch die Markierungs- und Mitoseindices unterschiedlich sind. Da bei der Mehrzahl der untersuchten proliferierenden Gewebe die DNS-Synthesezeit um ein Vielfaches langer als die Mitosezeit ist, liegen im allgemeinen die Werte der ~H-Markierungsindices in schnell proliferierenden Geweben etwa um den Faktor lo h6her als die entsprechenden Mitose- indices. [19] Das Verh/iltnis zwischen

Tabelle 3. 3H-Markierungsindex und Mitoseindex in menschlichen Tumoren nach 120 rain. Inkubation mit 3H-Thymidin [20]

Gewebe ZH-Markierungsindex Mitoseindex (%) (%)

Scirrh6ses Ca. Mamma PflasterzeU-Ca. Portio Pflasterze11-Ca. Porfio Neurogenes Sarkom Brustwand Leiomyosarkom Magenwand Pflasterzell-Ca. Larynx Pflasterzell-Ca. Pharynx Normales Zungenepithel Pflasterzell-Ca. Zunge Adeno-Ca. Uterus (bestrahlt) Adeno-Ca. Uterus (unbestrahh) Thymon

0,74 0 5,64 0,14 3,86 0,04 1,06 0,02 0,88 0,02 6,30 0,12

19,72 0,32 4,90 0,02 7,32 0,02 0,20 0 7,24 0,14 1,36 0,12

462 W. Oehlert

Markierungs- und Mitoseindex gibt demnach im allgemeinen das Verh~iltnis zwischen L~inge der Mitosezeit und L~inge der DNS-Synthese- zeit an. Die Verh~iltnisse verschieben sich in dem Augenblick, da nicht jeder DNS-Synthese eine Mitose folgt. Wie die Ergebnisse yon Coons, Norman und Nahum [20] in Tabelle 3 zeigen, bestehen in inkubierten Tumor- geweben Unterschiede zwischen ~H-Mar- kierungsindex und Mitoseindex, die so gross sind, dass sie unm6glich durch das unter- schiedliche Verh~iltnis zwischen DNS-Synthese- zeit und Mitosezeit bedingt sein k6nnen. Die Untersucher inkubierten frisch entnommene Gewebsbr6ckel zwei Stunden lang bei 37 ° in einem N~ihrmedium unter einer 95 %igen Sauerstoffatmosphftre. Die quantitative Aus- wertung erfolgte ansehliessend an Zellausstri- then der trypsinierten und zerriebenen Gewebe. Die dabei erhaltenen riesigen Unterschiede zwischen Markierungs- und Mitoseindex sind u.E. dadurch bedingt, dass zwar alle diejenigen Zellelemente, welche sich zum Zeitpunkt der Gewebsentnahme in ihrer DNS-Synthesephase befanden, diese zu Ende ffihrten und dabei markiert und gez~ihlt wurden. Demgegenfiber dfirften die zum gleichen Zeitpunkt beginnen- den oder in Gang befindlichen Mitosen w~ihrend der Inkubation abgelaufen und des- halb bei der Untersuchung nicht mehr nach- weisbar sein. Da neue Mitosen nach den bisher vorliegenden Erfahrungen wfthrend der Inkubationszeit nicht mehr einsetzen, muss die Mitosezahl inkubierten Materials geringer als unter in vivo-Verh~ltnissen sein.

So konnte z.B. Rajewski [12] bei Inkubations- versuchen mit tierischen Tumoren nachweisen, dass im Excisionsmaterial zwar die bereits begonnene DNS-Synthese weiter ablauft und dabei ein Einbau yon 3H-Thymidin stattfindet, ein ~bertritt neuer Zellen aus der G 1-Phase in die DNS-Synthesephase und aus der G 2 in

die Mitosephase nicht mehr erfolgt. Die nach Inkubation ermittelten Mitoseindices sind deshalb im Gegensatz zu den Markierungs- indices nicht den Verh~iltnissen in vivo gleich- zusetzen. Zu Vergleichen zwischen Markie- rungs- und Mitoseindex mfissen demnach Mitosez~ihlungen herangezogen werden, die an frisch entnommenen, nicht aber an inkubiertem Gewebsmaterial durchgefiihrt werden.

Zur Bestimmung von Wachstumgeschwindigkeiten menschlicher Tumoren durch Inkubationsversuche

Versucht man aus Ergebnissen, welche im Inkubationsversuch erhalten werden, die Wachstumsgeschwindigkeit entsprechender menschlicher Tumoren zu bestimmen, so hat man eine ganze Reihe von Faktoren zu berficksichtigen, welche im Einzelfall mehr oder weniger gut zu definieren sind.

Bei der Gewebsentnahme aus einem Tumora- real und der Untersuchung eines sehr kleinen Gewebszylinders erh~ilt man nur Angaben fiber die Verh~ltnisse in dem untersuchten im Verhaltnis zur Gesamttumorgr6sse winzigen Gewebsbezirk. Die Wachstumsintensit~it kann in den verschiedenen Gewebsarealen eines Tumors ausserordentlich unterschiedlich sein. Vor allem muss berficksichtigt werden, dass erfahrungsgem~iss periphere Tumorareale besser durchblutet und deshalb wachstums- intensiver sind, als zentral gelegene Gewebs- partien. Lieb und Lisco [18] versuchten in ihren Untersuchungen die unterschiedliche Wachstumsintensit~it in Tumorzentrum und Peripherie zu berficksichtigen. Durch die getrennte Auswertung zahlreicher kleiner inkubierter Gewebsbr6ckel verschiedener Tumoren erhielten sie Mittelwerte ffir Tumorzentrum und Tumorperipherie, welche in Tabelle 4 aufgeffihrt sind. Wie die Ergeb- nisse zeigen, k6nnen die Unterschiede bei

TabeUe 4. ~H-Markierungsindex in zentralen und peripheren Tumor- abschnitten nach 30 min. Inkubation mit 3H-Thymidin [18]

Tumor ~H-Markierungsindex in %

Zentrum Peripherie

Coecum-Ca. 21,0; 21,6 18,5; 16,3 24,2; 16,5 23,1

Sigma-Ca. 11,9; 16,5 24,4; 38,0 31,5; 21,8 25,5; 42,5

Rectum-Ca. 4,8; I0,0 31,5 Rectum/Sigma-Ca. 3,1 ; 3,4

7,1

Sigma-Ca. 8,7

Gharakterisierung menschlicher Tumoren durch autoradiographische Untersuchungen von Biopsiematerial 463

verschiedenen Tumoren gering, wie im Falle des Coecum-Carcinoms ode r aber sehr erheblich sein, wie beim Rektumcarcinom. Grund- s~tzlich werden die Unterschiede in der Pro- liferationsaktivit~it yon der Gr6sse der Tumor- knoten oder Tumorareale, bzw. yon dem Ausmass ihrer Gef~ssversorgung abh~ingig sein.

Als weitere Faktoren bei der Errechnung yon Waehstumsgeschwindigkeiten menschlicher Tumoren aus den Ergebnissen von Inkubations- versuchen haben wir zu beriicksichtigen, dass wit mit dieser Methode nur die Proliferations- gr6sse und unter Umstiinden die mittlere Lebensdauer der Tumorzellpopulation erfassen. Diese Proliferationsgr6sse muss jedoch nicht unbedingt Aussagen fiber die Wachstums- geschwindigkeit des entsprechenden Tumors erlauben, da hierffir die Zahl zugrunde- gehender Zellen mit ausschlaggebend sein dtirfte. Die Teilungsgeschwindigkeit eines Tumors ist nur dann direkt der Wachstums- geschwindigkeit, d.h. der Volumenzunahme gleichzusetzen, wenn jede der beiden aus einer ZeUteilung entstehenden Tochterzellen nach entsprechender Generationszeit zwei weitere zur Teilung befiihigte Enkelzellen bildet. Dieser Teilungs- und Wachstumsmechanismus diirftejedoch nur in den frtihesten Stadien des Embryonalwachstums, bzw. in den ersten Zellteilungen nach Implantation sehr wachs- tumssinsentiver Implantationstumoren, z.B. des Yoshida-Hepatoms AH 130 realisiert sein.

Bei Uberschreitung einer bestimmten, richer- lich noch im mikroskopischen Bereich liegenden Tumorgrosse setzen jedoch Differenzierungs- prozesse ein und kommt es zu einem Zellverlust durch Zelltod und Zellabschilferung, welche das Tumorwachstum ganz entscheidend be- einflussen dtirften.

Zus ~itzlich mtissen Polyploidisierungs- prozesse berticksichtigt werden, welche eben- falls trotz vorher ablaufender DNS-Neu- bildung die Entstehung weiterer teilungs- FAhiger Zellen verhindern.

Diese ~berlegungen ffihren zu der Tatsache, dass durch Bestimmung des Markierungsindex nach Inkubation mit 3H-Thymidin nur ein re- latives Mass ffir die Proliferationsaktivit~it der Tumorzellen in einem bestimmten Teil eines Tumors und zu einer bestimmten Zeit erhalten werden kann. Eine Charakterisierung mensch- licher Tumoren, geschweige denn eine exakte Bestimmung der Wachstumsgeschwindigkeit eines Tumors allein mittels der Bestimmung von Markierungs- oder Mitoseindex ist un- m6glich. In jedem Einzelfalle muss neben diesen mit neuer Methodik erhaltenen Werten das histologische und cytologische Bild des entsprechenden Tumors berficksichtigt werden, wenn eine m6glichst allgemein giiltige Charak- terisierung der verschiedenen Tumortypen erreicht werden soll.

RESUM]F, (A) De petits fragments de tissu, prdlevds par biopsie, sont incubds dans des solutions contenant de la thymidine 3H, soit immMiatement aprks le prdl~vement, soit apr~s con- gdlation et section en coupes de quelques millim~tres d'gpaisseur. Apr~s des temps variables d'incubation, les dchantillons sont dtudids par autoradiographie. Dans certaines conditions, le pourcentage de noyaux marquds fournit des indications sur la vitesse de prolifdration des cellules dans les diffdrentes tumeurs. La mgthode du marquage ~ la thymidine est prgfdrable

la mesure de l'index mitotique, parce que le nombre des cellules marqudes est dlevd, et parce que le comptage des cellules marqudes est techniquement plus aisd que la ddtermination de l'index mitotique. Dans les tumeurs croissant tr~s rapidement, le temps mitotique est si court que les mitoses en cours au moment de la biopsie peuvent ddj~ gtre achevdes au moment de la fixation, et elles ne peuvent, par consdquent, pas ~tre mises en gvidence dans les prgparations histologiques.

(B) Si certaines conditions mdthodologiques sont remplies, les rgsultats de l'dtude de tumeurs humaines par cette mgthode ont un intgr~t, non seulement pour le pathologiste, mais aussi pour l'investigation clinique.

(1) Pathog~nie. l'dtude de la proliflration cellulaire a conduit ~ des rdsultats intdressants dans le cancer du poumon, le cancer du col utdrin et la maladie de Hodgkin.

(2) Diagnostic. la technique de marquage in vitro est utilisde, en clinique, pour l'dtude de biopsies et de frottis, dans des cas oft les techniques de colorations conventionnelles donnent des rdsultats douteux.

(3) Traitement. cette mgthode peut, par exemple, donner des indications pour le choix du traitement dans le carcinome de la vessie. A la fa~on des antibiogrammes en bactgriologie, l'effet des agents chimiothdrapiques sur les cellules d'une tumeur donnge peut

464 W. Oehlert

~tre ~tudid in vitro, et le traitement peut gtre choisi en fonction du r~sultat. De la mgme fafon, les r&ultats du traitement peuvent gtre suivis par des gtudes rgpdtFes sur du matgriel biopsique.

SUMMARY (A) Small tissue samples obtained by biopsy are incubated in 3H-thymidine containing solutions, either immediately after biopsy or after temporary freezing and cutting into several mm thick sections. After variable incubation periods and subsequent fixation and histological processing, the samples are investigated by autoradiography. Under certain conditions, the proportion of labelled cell nuclei yields information on the rate of cell proliferation in the respective tumours. The method of thymidine labelling is preferable to the counting of cells in mitosis because a larger part of the proliferating cell population is measured and because' l r demonstration of labelled cells is easier and more dependable than the determination of mitotic indices. In extremely fast growing tumours, as for instance the small cell bronchial carcinoma, the mitotic time is so short that the mitosis which are in process during biopsy will be terminated by the time of fixation and can therefore not be demonstrated by histological techniques.

(B) Certain methodological conditions are fulfilled, the results obtained from incubation experiments with human tumour material are important not only for the pathologist, but also for clinical evaluation:

(1) Pathogenesis. the determination of the proliferative patterns and the rates of cell proliferation has led to results which are of importance for our understanding of the development of bronchial carcinomata, carcinomata of the portio uteri, and Hodgkin's disease.

(2) Cancer diagnosis, the in vitro labelling technique is already clin#ally used for the evaluation of biopsies and especially cell smears, in cases where the conventional staining techniques yield no clear results.

(3) Cancer therapy, the results thus far obtained are, for example, used for the choice of the optimal therapeutic method in the case of bladder carcinomata. In analogy to resistance tests in bacteriology, the effect of certain cytostatic drugs on the cells of a certain tumour can be determined in vitro and therapy adjusted according to the result. In a similar way, therapeutic results can be controlled by periodical incubation tests of biopsy material. The different aspects mentioned in this summary will be discussed in detail using examples from this and other laboratories.

ZUSAMMENFASSUNG Zun&hst werden die verschiedenen M6glichkeiten zur Durchfiihrung autoradiographischer Untersuchungen an menschlichen Geweben unter Beriicksichtigung der dabei auftretenden Strahlengefi~hrdung des Gesamtorganismns besprochen.

Einige der bisher erhaltenen Versuchsergebnisse werden auf ihre Bedeutung fiir Tumorentstehung und Erfassung des Tumorwachstums gepr~ft. Weiter wird darauf hingewiesen, dass mit der Bestimmung yon Mitose- und Markierungsindices noch keine Aussagen iiber die Geschwindigkeit des Tumorwachstums verbunden sind, da mit diesen Methoden die Bestimmung der Anzahl absterbender Tumorzellen nicht m~glich ist.

Abschliessend wird darauf hengewiesen, dass die Anwendung neuer Methoden zwar neue Gesichtspunkte und Vergleichswerte liefert, dass eine Charakterisierung des einzelnen Tumors nur mO'glich ist, wenn auch das Ergebnis der konventionellen histologischen und cytologischen Untersuchung entsprechend mitverwertet wird.

Charakterisierung menschlicher Tumoren durch autoradiographische Untersuchungen von Biopsiematerial 465

LITER&TUR

1. R. LESCH, W. SCHIESSLE und W. OEHLERT, Autoradiographische Unter- suchungen zur DNS-Synthese an menschlichem Excisionsmaterial aus dem Bronchialbaum. Beitr. path. Anat. 129, 295 (1963/64).

2. BASERGA, R., G. C. HENEOAR, W. E. KISIELESKY und H. Llsco, Uptake of Tritiated Thymidine by Human Tumors in vivo. Lab. Invest. 119 360 (1965).

2a. R. BASERGA und W. E. KISIELESKY, Recent observations on cell proliferation and metabolism by radiography with tritiated compounds. Atompraxis 8, 386 (1962).

3. W. OEHLERT, P. DORMER and R. LESCH. Autoradiographische Untersuchungen fiber die DNS-Synthese im fiberlebenden Tumorgewebe des Menschen. Beitr. path. Anat. 128, 468 (1963).

4. H . A . JOHNSON and V. P. BOND, A Method of labeling tissues with tritiated thymidine in vitro and its use in comparing rates of cell proliferation in duct epithelium, fibroadenoma and carcinoma of the human breast. Cancer 14, 639 (1961).

5. W. H. WOL~ERO and R. R. BROWN, Afltoradiographic studies of in vitro incorporation of uridine and thymidine by human tumor tissue. Cancer Res. 22, 1113 (1962).

6. R . J . VEENEMA, B. 17INGERHUT and A. S. GIRGIS: A possible guide to therapy of bladder tumors. 07. Urol. (Baltimore) 90, 736 (1962).

7. H . A . JOHNSON, J. R. RUBINI, E. P. CRONKITE and V. P. BOND, Labeling of human tumor cells in vivo by tritiated thymidine. Lab. Invest. 9, 460 (1960).

8. P. KISSEL, A. DUPREZ, M. BESSOT, J. SCHMITT and A. DOLLANDER, Autoradio- graphy in vivo of human cancers. Nature (Lond.) 210, 274 (1966).

9. P. DORMER, pers. Mitteilung (1967).

10. B. CHON~, Intrakavitiire Radiogoldapplikation im Spiegelbild der Zyto- diagnostik und Autoradiographie. Nucl.-Med., (Stuttgart) 111, 285 (1963).

10a. B. CHON~ Klinisch-experimentelle Untersuchungsergebnisse zum Tumor- stoffwechsel in situ. Mitt GBK 4, 189 (1966).

11. M.F. RAJEWSKY, In vitro studies of cell proliferation in tumours III. Character- istics of a standardised in vitro system for the measurement of 3H-thymidine incorporation into tissue explants. Europ. 07. Cancer 1, 281 (1965).

12. M. F. RAJEWSJY, Zellproliferation in normalen und malignen Geweben: sH-Thymidin-Einbau in vitro unter Standardbedingungen. Biophysik 3, 65 (1966).

13. G.G. STEEL andJ. P. M. BENSTED, In vitro studies of cell proliferation in tumours I. Critical appraisal of methods and theoretical considerations. Europ. 07. Cancer 1, 275 (1965).

14. P. D6RMER, W. H. TULINIUS and W. OEHLERT, Untersuchungen fiber die Generationszeit, DNS-Synthesezeit und Mitosedauer von Zellen der hyper- plastischen Epidermis und des Plattenepithelcarcinoms der Maus nach Methyl- cholanthrenpinselung. Z. Krebsforsch. 66, 11 (1964).

15. O. FETTIO und R. SILVERS, 8H-Index und mittlere Generationszeit des mensch- lichen Portiocarcinoms und seiner Vorstufen. Beitr. path. Anat. 133, 83 (1966).

16. W. SCHIESSLE, U. ERNST und W. OEHLERT, Autoradiographische Untersuchungen zur RNS- und DNS-Synthese an bioptisch entnommenem menschlichem Gewebe bei chronischer Bronchitis und Bronchialkarzinom. Radionuklide in der klinischen und experimentellen Onkologie. Schattauer, Stuttgart (1965).

17. F. TREPEL, J. RASTETTER, H. THEML and G. STOCKHUSEN, Nukleins~ure- synthese und Zytostaticawirkung in pathologischen Lymphknotenzellen. Mecl. Klin. 61, 618 (1966).

18. L . M . LIEB and H. LlSCO, In vitro uptake of tritiated thymidine by carcinoma of the human colon. Cancer Res. 269 733 (1966).

466 W. Oehlert

19. B. SGHULTZE and W. OEHLERT, Autoradiographic investigation of incorporation of 8H-Thymidine into cells of different tissues of the rat and the mouse. Science 131~ 737 (1960).

20. H. COONS, A. NORMAN and A. M. NAHUM, in vitro measurements of human tumor growth. Can~er 19, 1200 (1966).