11

LC V

L)hi

e I (

HP

Vaso

ld

atog

raph

10/1

1 R

.

HPLCHPLCHPLCHPLCChromatographie IChromatographie I

Chr

oma

WS

201 HPLC HPLC VorlesungVorlesungHPLC HPLC VorlesungVorlesung

22

R. R. VasoldVasold

A l tikA l tik Abt ilAbt il

LC V

L) Analytik Analytik -- Abteilung Abteilung

Institut für Organische ChemieInstitut für Organische Chemie

hie

I (H

P

Vaso

ld

Institut für Organische ChemieInstitut für Organische Chemie

Prof. B. KönigProf. B. König

atog

raph

10/1

1 R

. gg

Chr

oma

WS

201

33

KapitelKapitel I:I: EinführungEinführungKapitelKapitel I: I: EinführungEinführung

KapitelKapitel II:II: GrundprinzipienGrundprinzipienKapitel Kapitel II: II: GrundprinzipienGrundprinzipien

K i lK i l IIIIII D h hi hD h hi h

LC V

L) Kapitel Kapitel III: III: Der chromatographische Der chromatographische ProzeßProzeß

hie

I (H

P

Vaso

ld

Kapitel Kapitel IV: IV: Das ChromatogrammDas Chromatogramm

atog

raph

10/1

1 R

.

Kapitel V: Literatur

Chr

oma

WS

201 ap te te atu

44

LC V

L)hi

e I (

HP

Vaso

ld

atog

raph

10/1

1 R

.

Kapitel I: EinführungKapitel I: Einführung

Chr

oma

WS

201 Kapitel I: EinführungKapitel I: Einführung

55I EinführungI EinführungI 1I 1 Was heißtWas heißt HPLCHPLC ??

HHHHI.1I.1 Was heißt Was heißt HPLCHPLC ??

HH ighighHH ighighPP PPPP erformanceerformance--PPressureressureLL

LC V

L) LL iquidiquidCC

hie

I (H

P

Vaso

ld CC hromatographyhromatography

atog

raph

10/1

1 R

.

( = Hochleistungs/Druck( = Hochleistungs/Druck

Chr

oma

WS

201 ( g( g

--FlüssigFlüssig--ChromatographieChromatographie))

66I EinführungI EinführungI 2I 2 Was bedeutetWas bedeutet HPLCHPLC ??I.2I.2 Was bedeutet Was bedeutet HPLCHPLC ??

Unterschied zwischen Unterschied zwischen moderner HPLCmoderner HPLC undundkl i hkl i h Sä lSä l Ch t hiCh t hi ??klassischer klassischer SäulenSäulen--ChromatographieChromatographie ??

LC V

L) wesentlich wesentlich höhere Auflösunghöhere Auflösung bei Trennungbei Trennung(Trennung von bis zu 100 Komponenten/Lauf u. mehr)(Trennung von bis zu 100 Komponenten/Lauf u. mehr)

hie

I (H

P

Vaso

ld

Drastische Drastische Verkürzung der AnalysendauerVerkürzung der Analysendauer(h (h →→ Bereich von Minuten) Bereich von Minuten)

atog

raph

10/1

1 R

.

Erhebliche Verbesserung der Erhebliche Verbesserung der EmpfindlichkeitEmpfindlichkeit(ca. 10(ca. 10--9 9 g [ng] bis 10g [ng] bis 10--1212 g [pg]) g [pg])

Chr

oma

WS

201 (( g [ g]g [ g] g [pg])g [pg])

77I EinführungI EinführungI 3I 3 Wann wirdWann wird HPLCHPLC angewendet ?angewendet ?I.3I.3 Wann wird Wann wird HPLCHPLC angewendet ?angewendet ?

Notwendige Notwendige VoraussetzungVoraussetzung ist die ist die LöslichkeitLöslichkeitder zu analysierenden Substanz in einem der zu analysierenden Substanz in einem yygeeignetem Solvens geeignetem Solvens

DieDie HPLCHPLC wird eingesetzt wenn:wird eingesetzt wenn:

LC V

L)

Die Die HPLCHPLC wird eingesetzt, wenn:wird eingesetzt, wenn:

Substanzen Substanzen schwer flüchtigschwer flüchtig oder oder nicht flüchtignicht flüchtig

hie

I (H

P

Vaso

ld

Substanzen mit rel. Substanzen mit rel. hohem Molekulargewichthohem Molekulargewichtli (MWli (MW 500)500)

sind (sonst alternativ Einsatz von GC)sind (sonst alternativ Einsatz von GC)

atog

raph

10/1

1 R

. vorliegen (MW vorliegen (MW > 500)> 500)es sich um es sich um thermisch instabilethermisch instabile(leicht zersetzliche) Substanzen handelt(leicht zersetzliche) Substanzen handelt

Chr

oma

WS

201 (leicht zersetzliche) Substanzen handelt.(leicht zersetzliche) Substanzen handelt.

88I EinführungI EinführungI 4I 4 Wo wirdWo wird HPLCHPLC eingesetzt ?eingesetzt ?I.4I.4 Wo wird Wo wird HPLC HPLC eingesetzt ?eingesetzt ?

Zur Zur ReinheitsReinheits-- und Produktkontrolleund Produktkontrolle chem. Substanzenchem. Substanzen

Zur Zur AnalyseAnalyse von von ArzneistoffenArzneistoffen

LC V

L)

ZZ B tiB ti S h d t ffS h d t ff (U lt l tik)(U lt l tik)

Zur Zur BestimmungBestimmung von von WirkstoffenWirkstoffen in in biolog. Matricesbiolog. Matrices

hie

I (H

P

Vaso

ld Zur Zur BestimmungBestimmung von von SchadstoffenSchadstoffen (Umweltanalytik)(Umweltanalytik)

Zur Zur TrennungTrennung und und ReinigungReinigung von von BiopolymerenBiopolymeren

atog

raph

10/1

1 R

. (Enzymen, Nukleinsäuren, Peptiden ...)(Enzymen, Nukleinsäuren, Peptiden ...)

StandardmethodeStandardmethode in fast allen in fast allen chem. Laboratorienchem. Laboratorien

Chr

oma

WS

201

99I EinführungI EinführungI 5I 5 Wie wird dieWie wird die HPLCHPLC durchgeführt ?durchgeführt ?I.5I.5 Wie wird die Wie wird die HPLC HPLC durchgeführt ?durchgeführt ?

Injektor

P

22 33

LC V

L)

Säule

Pumpe

44

hie

I (H

P

Vaso

ld

Mobile Computergesteuerte1155

atog

raph

10/1

1 R

.

Detektor

MobilePhasen Auswertesoftware11

Chr

oma

WS

201

Abb. 1:Abb. 1: Schematische Darstellung einer HPLCSchematische Darstellung einer HPLC--AnlageAnlage

1010I EinführungI EinführungI 5I 5 Wie wird dieWie wird die HPLCHPLC durchgeführt ?durchgeführt ?I.5I.5 Wie wird die Wie wird die HPLC HPLC durchgeführt ?durchgeführt ?

LC V

L)hi

e I (

HP

Vaso

ld

atog

raph

10/1

1 R

.

Abb 2:Abb 2: Moderner HPLCModerner HPLC--ArbeitsplatzArbeitsplatz

Chr

oma

WS

201 Abb. 2:Abb. 2: Moderner HPLCModerner HPLC--ArbeitsplatzArbeitsplatz

1111

LC V

L)hi

e I (

HP

Vaso

ld

atog

raph

10/1

1 R

.

Kapitel II: GrundprinzipienKapitel II: Grundprinzipien

Chr

oma

WS

201 Kapitel II: GrundprinzipienKapitel II: Grundprinzipien

1212

II 1II 1 Grundbegriff:Grundbegriff: ChromatographieChromatographieII GrundprinzipienII GrundprinzipienII.1II.1 Grundbegriff: Grundbegriff: ChromatographieChromatographie

Historie: M Tswett (1906)Historie: M. Tswett (1906)Der Begriff „Chromatographie“ wurde 1906 bei der Beobachtung geprägt, als sich ein Extrakt aus grünen Blättern auf einer mit

l t Z k füllt Sä l i hi d fä btgepulvertem Zucker gefüllten Säule in verschieden gefärbte Einzelfarbstoffe ( Chlorophyll, Carotin etc. ) auftrennen ließ.

LC V

L) Chroma = Farbe / Graphein = schreiben

D fi itiD fi iti Ch t hiCh t hi

hie

I (H

P

Vaso

ld Definition: Definition: ChromatographieChromatographieMit dem Ausdruck Mit dem Ausdruck „Chromatographie“„Chromatographie“ bezeichnet man einen bezeichnet man einen TrennprozessTrennprozess bei welchem das Probengemisch zwischen zweibei welchem das Probengemisch zwischen zwei

atog

raph

10/1

1 R

. TrennprozessTrennprozess, bei welchem das Probengemisch zwischen zwei, bei welchem das Probengemisch zwischen zweinicht miteinander mischbarennicht miteinander mischbaren Phasen im sog. chromatographiPhasen im sog. chromatographi--schen Bett (Trennsäule oder Ebene) verteilt wird. Eine schen Bett (Trennsäule oder Ebene) verteilt wird. Eine HilfsphaseHilfsphase(stationäre Phase)(stationäre Phase) ruht dabei während die andereruht dabei während die andere HilfsphaseHilfsphase

Chr

oma

WS

201 (stationäre Phase)(stationäre Phase) ruht dabei, während die andere ruht dabei, während die andere HilfsphaseHilfsphase

(mobile Phase)(mobile Phase) an ihr vorbei strömt. an ihr vorbei strömt. Michail Semjonowitsch Tswett (Zwet)Michail Semjonowitsch Tswett (Zwet)

1872 1872 -- 19191919

1313

II 2 Grundbegriff:II 2 Grundbegriff: HilfsphasenHilfsphasenII GrundprinzipienII GrundprinzipienII.2 Grundbegriff: II.2 Grundbegriff: HilfsphasenHilfsphasenStationäre Phase:Stationäre Phase:

MeistMeist ist in der Chromatographie die stationäre Phase ist in der Chromatographie die stationäre Phase festfest(Chromatographiebett).(Chromatographiebett).SeltenSelten ist die stationäre Phase ist die stationäre Phase flüssigflüssig(dann aber als unbeweglicher „stationärer“ , flüssiger Film auf (dann aber als unbeweglicher „stationärer“ , flüssiger Film auf der Oberfläche eines Feststoffes aufgebrachtder Oberfläche eines Feststoffes aufgebracht

LC V

L)

ggz.B. als adsorbierter Wasserfilm auf Cellulose), oder als z.B. als adsorbierter Wasserfilm auf Cellulose), oder als unbewegliche flüssige, sog. quasistationäre Phase im Inneren unbewegliche flüssige, sog. quasistationäre Phase im Inneren von porösen Kugeln (Gelpermeationschromatographie)von porösen Kugeln (Gelpermeationschromatographie)

hie

I (H

P

Vaso

ld

von porösen Kugeln (Gelpermeationschromatographie).von porösen Kugeln (Gelpermeationschromatographie).

Mobile Phase:Mobile Phase:Die mobile Phase kann sein:Die mobile Phase kann sein:

atog

raph

10/1

1 R

. Die mobile Phase kann sein:Die mobile Phase kann sein:gasförmiggasförmigflüssigflüssig LC/HPLCLC/HPLCLiquidchromatographieLiquidchromatographie

GaschromatographieGaschromatographie GCGC

Chr

oma

WS

201 flüssigflüssig LC/HPLCLC/HPLCLiquidchromatographieLiquidchromatographie

1414

II 3 Grundbegriff:II 3 Grundbegriff: VerteilungskoeffizientVerteilungskoeffizient KKII GrundprinzipienII GrundprinzipienII.3 Grundbegriff: II.3 Grundbegriff: Verteilungskoeffizient Verteilungskoeffizient KK

beschreibt die unterschiedliche Verteilung der Substanzenbeschreibt die unterschiedliche Verteilung der Substanzen zwischen stationärerstationärer Phase und mobilermobiler Phase:

KK ccss(X)(X)

cc (X)(X)(1)(1)

LC V

L)

ccmm(X)(X)

hie

I (H

P

Vaso

ld

ccss(X)(X) = = StoffmengenkonzenztrationStoffmengenkonzenztration der der

= Verteilungskoeffizient= VerteilungskoeffizientKK

atog

raph

10/1

1 R

. ss( )( )Substanz X in der stationären PhaseSubstanz X in der stationären Phase

ccmm(X)(X) = = StoffmengenkonzentrationStoffmengenkonzentration der der

Chr

oma

WS

201 Substanz X in der mobilen PhaseSubstanz X in der mobilen Phase

1515

II 4 Grundbegriff:II 4 Grundbegriff: KapazitätsfaktorKapazitätsfaktor kkII GrundprinzipienII GrundprinzipienII.4 Grundbegriff: II.4 Grundbegriff: Kapazitätsfaktor Kapazitätsfaktor kk

beschreibt die unterschiedliche Verteilung der Substanzenbeschreibt die unterschiedliche Verteilung der Substanzen zwischen stationärerstationärer Phase und mobilermobiler Phase :

kknnnn

ss(X)(X)

(X)(X)(2)(2)

LC V

L)

nnmm (X)(X)

k

hie

I (H

P

Vaso

ld

= = StoffmengeStoffmenge der Substanz X in der der Substanz X in der

= Kapazitäts= Kapazitäts-- oder Retentionsfaktoroder Retentionsfaktorknnss (X)(X)

atog

raph

10/1

1 R

. ggstationären Phasestationären Phase

== StoffmengeStoffmenge der Substanz X in der mobilender Substanz X in der mobilen

ss ( )( )

nnmm(X)(X)

Chr

oma

WS

201 StoffmengeStoffmenge der Substanz X in der mobilen der Substanz X in der mobilen

PhasePhasemm

1616

II 4 1 Zusammenhang zwischenII 4 1 Zusammenhang zwischen kk undund KKII GrundprinzipienII GrundprinzipienII.4.1 Zusammenhang zwischen II.4.1 Zusammenhang zwischen kk und und KK

da da n = c n = c · · V V

KapazitätsfaktorKapazitätsfaktor VerteilungskoeffizientVerteilungskoeffizient

KKVV

ststkknn

ss(X)(X) cc VVss stst(X)(X)(3)

LC V

L)

KKVVmobmob

kknnmm(X)(X) cc VVmm mobmob(X)(X) (3)

hie

I (H

P

Vaso

ld VVstst = Volumen der stationären Phase i. d. SäuleVolumen der stationären Phase i. d. SäuleVVmobmob = Volumen der mobilen Phase i. d. Säule= Volumen der mobilen Phase i. d. Säule

atog

raph

10/1

1 R

. mobmob

Die Die unterschiedliche Wechselwirkungunterschiedliche Wechselwirkung von Substanzen in zwei von Substanzen in zwei nicht miteinander mischbaren Phasen ergibt eine Vielzahl nicht miteinander mischbaren Phasen ergibt eine Vielzahl

Chr

oma

WS

201 gg

unterschiedlicher Chromatographieartenunterschiedlicher Chromatographiearten::

1717

II 5 Chromatographiearten (Auswahl)II 5 Chromatographiearten (Auswahl)II GrundprinzipienII GrundprinzipienII.5 Chromatographiearten (Auswahl)II.5 Chromatographiearten (Auswahl)

Trennung durch AdsorptionTrennung durch Adsorption Stationäre Stationäre

Ad i Ch hi

Trennung durch AdsorptionTrennung durch AdsorptionPhasePhase

Adsorptions-Chromatographieflüssig / fest

(NP/RP-HPLC) mobile mobile PhasePhase

LC V

L)

PhasePhase

hie

I (H

P

Vaso

ld Trennung durch LöslichkeitTrennung durch Löslichkeit

StationäreStationäre

atog

raph

10/1

1 R

.

Verteilungs-Chromatographieflüssig / flüssig

Stationäre Stationäre PhasePhase

Chr

oma

WS

201

1818

II 5 Chromatographiearten (Auswahl)II 5 Chromatographiearten (Auswahl)II GrundprinzipienII GrundprinzipienII.5 Chromatographiearten (Auswahl)II.5 Chromatographiearten (Auswahl)

T d h L dT d h L d Stationäre Stationäre Trennung durch LadungTrennung durch Ladung(vereinfacht)(vereinfacht)

PhasePhase

Ionenaustausch-Chromatographie

LC V

L)hi

e I (

HP

Vaso

ld Trennung durch LadungTrennung durch Ladung(realistisch)(realistisch)

Stationäre Stationäre PhasePhase

atog

raph

10/1

1 R

.

Ionenaustausch-Chromatographie

Chr

oma

WS

201

1919

II 5 Chromatographiearten (Auswahl)II 5 Chromatographiearten (Auswahl)II GrundprinzipienII GrundprinzipienII.5 Chromatographiearten (Auswahl)II.5 Chromatographiearten (Auswahl)

Trennung durch Größe/GestaltTrennung durch Größe/Gestalt Stationäre Stationäre Trennung durch Größe/GestaltTrennung durch Größe/GestaltPhasePhase

Ausschluß-ChromatographieSEC, GPC

LC V

L)hi

e I (

HP

Vaso

ld Trennung durch AffinitätTrennung durch Affinität Stationäre Stationäre PhasePhase

atog

raph

10/1

1 R

.

Affinitäts-Chromatographiez.B. Antigen/Antikörper

Chr

oma

WS

201

2020

II 6 Strategie der TrennungII 6 Strategie der Trennung (HPLC)II GrundprinzipienII GrundprinzipienII.6 Strategie der TrennungII.6 Strategie der Trennung (HPLC)

LC V

L)hi

e I (

HP

Vaso

ld

atog

raph

10/1

1 R

.

Abb. 3:Schema zur Auswahl

Chr

oma

WS

201 Schema zur Auswahl

der passenden Chromatographieart

2121

II 7 Die Säulenauswahl (HPLC)II 7 Die Säulenauswahl (HPLC)II GrundprinzipienII GrundprinzipienII.7 Die Säulenauswahl (HPLC)II.7 Die Säulenauswahl (HPLC)

LC V

L)hi

e I (

HP

Vaso

ld

atog

raph

10/1

1 R

.

Chr

oma

WS

201 Abb. 4:Abb. 4: Beispiel verschiedener Beispiel verschiedener

HPLCHPLC--SäulenSäulen

2222

LC V

L)hi

e I (

HP

Vaso

ld

Kapitel III:Kapitel III:

atog

raph

10/1

1 R

. Kapitel III:Kapitel III:Der chromatographische Der chromatographische

Chr

oma

WS

201 ProzeßProzeß

2323

III 1 Der TrennvorgangIII 1 Der TrennvorgangIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.1 Der TrennvorgangIII.1 Der Trennvorgang

1 i1 i1 min1 min

A5 min5 min

LC V

L)

A

B10 min10 min

hie

I (H

P

Vaso

ld B15 min15 min

atog

raph

10/1

1 R

.

C20 min20 min

Chr

oma

WS

201

Abb. 5: Zeitlicher Verlauf einer chromatographischen Trennung

2424

III 2 DefinitionenIII 2 DefinitionenIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.2 DefinitionenIII.2 Definitionen

Definition: Definition: ChromatogrammChromatogrammMit dem Ausdruck Mit dem Ausdruck „Chromatogramm“„Chromatogramm“ bezeichnet man die bezeichnet man die graphische Auftragung der graphische Auftragung der GrößenwerteGrößenwerte einer Größe (z.B. der einer Größe (z.B. der Absorption) die am Ende der stationären Phase also z B amAbsorption) die am Ende der stationären Phase also z B amAbsorption), die am Ende der stationären Phase, also z.B. am Absorption), die am Ende der stationären Phase, also z.B. am Säulenausgang, in der mobilen Phase gemessen werden, gegen Säulenausgang, in der mobilen Phase gemessen werden, gegen die die ZeitZeit oder das oder das VolumenVolumen der mobilen Phase.der mobilen Phase.

LC V

L)

Definition: Definition: Retentionsvolumen / Retentionsvolumen / --ZeitZeitDD V lV l d bil Ph d di t ti ä Phd bil Ph d di t ti ä Ph

hie

I (H

P

Vaso

ld Das Das VolumenVolumen der mobilen Phase, das die stationäre Phase vom der mobilen Phase, das die stationäre Phase vom Moment der Probenaufgabe bis zum Erscheinen der Substanz Moment der Probenaufgabe bis zum Erscheinen der Substanz XXals Peak im Chromatogramm passiert hat, nennt man das als Peak im Chromatogramm passiert hat, nennt man das

atog

raph

10/1

1 R

.

RetentionsvolumenRetentionsvolumen der Substanz X: der Substanz X: VVRR(X)(X)Die zugehörige Zeit nennt man die Die zugehörige Zeit nennt man die RetentionszeitRetentionszeit: : ttRR(X)(X)..

Chr

oma

WS

201

2525III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 3 Das RetentionsvolumenIII 3 Das Retentionsvolumen (X)(X)VIII.3 Das RetentionsvolumenIII.3 Das Retentionsvolumen (X)(X)RV

(X)(X)ttFFVV (X)(X)(X)(X) RRRR ttFFVV ••== (4)(4)

LC V

L)

Retentionsvolumen [ml] Retentionszeit [min]

hie

I (H

P

Vaso

ld

Retentionsvolumen [ml]

atog

raph

10/1

1 R

. Volumenfließgeschwindigkeit [ml·min-1]

Chr

oma

WS

201

2626III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 4 Die lineare FließgeschwindigkeitIII 4 Die lineare Fließgeschwindigkeit UUIII.4 Die lineare FließgeschwindigkeitIII.4 Die lineare Fließgeschwindigkeit UUmm

(5)(5)uuFFAA

FFAA

FF

rrmm

22AA AA rr ff 22

li Fli ß h i di k it d bil Phli Fli ß h i di k it d bil Ph

LC V

L) uumm :: lineare Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase lineare Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase [cm·s[cm·s--11]]

FF V l fli ß h i di k it [ lV l fli ß h i di k it [ l 11]]

hie

I (H

P

Vaso

ld FF :: Volumenfließgeschwindigkeit [ml·sVolumenfließgeschwindigkeit [ml·s--11]]Af : freie Säulenquerschnittsfläche [cm2]

atog

raph

10/1

1 R

. A A :: SäulenquerschnittsflächeSäulenquerschnittsfläche [[cmcm22]]

r r :: Säulenradius [cm]Säulenradius [cm]

Chr

oma

WS

201

:: InterpartikelInterpartikel--Porosität der Säule ( Kieselgel Porosität der Säule ( Kieselgel 0.8)0.8)

2727

III 4 1 DieIII 4 1 Die InterpartikelporositätInterpartikelporosität III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.4.1 Die III.4.1 Die InterpartikelporositätInterpartikelporosität

(6)(6)

VV VV VVc stst 0 (6)(6)

VV VVcc cc

LC V

L)

:: InterpartikelporositätInterpartikelporosität

hie

I (H

P

Vaso

ld VVcc : geometrisches Säulenvolumen [cm: geometrisches Säulenvolumen [cm33]]

VV : Volumen der stationären Phase [cm: Volumen der stationären Phase [cm33]]

atog

raph

10/1

1 R

. VVStSt : Volumen der stationären Phase [cm: Volumen der stationären Phase [cm33] ]

VV00 : : InterpartikelvolumenInterpartikelvolumen der Säule [cmder Säule [cm33]]

Chr

oma

WS

201

2828III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßuuIII 5 ZusammenhangIII 5 Zusammenhang zwischen undund u(X)(X)

DieDie linearelineare WanderungsgeschwindigkeitWanderungsgeschwindigkeit u(X)u(X)

uuIII.5 ZusammenhangIII.5 Zusammenhang zwischen mm undund u(X)(X)

Die Die linearelineare Wanderungsgeschwindigkeit Wanderungsgeschwindigkeit u(X)u(X)der Substanz der Substanz XX muß der muß der linearenlinearenWanderungsWanderungs--(Fließ)(Fließ)--Geschwindigkeit der Geschwindigkeit der gg ( )( ) ggmobilen Phase mobilen Phase uumm direkt proportional seindirekt proportional sein..

d hd h (X)(X) i di d i kl ii kl i d hö h td hö h t

LC V

L) d.h.d.h. u(X)u(X) wirdwird immer kleinerimmer kleiner uumm oder höchstens oder höchstens gleich gleich uumm sein.sein.

hie

I (H

P

Vaso

ld

(7)(7)undunduu uu(X)(X) mm uu uu(X)(X) mm

atog

raph

10/1

1 R

. (7)(7)undunduu uu(X)(X) mm uu uu(X)(X) mm

Chr

oma

WS

201

2929

III 5 1 Der ProportionalitätsfaktorIII 5 1 Der Proportionalitätsfaktor (X)(X)III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.5.1 Der Proportionalitätsfaktor III.5.1 Der Proportionalitätsfaktor mm(X)(X)

Der ProportionalitätsfaktorDer Proportionalitätsfaktor (X)(X) muß alsomuß alsoDer ProportionalitätsfaktorDer Proportionalitätsfaktor mm(X)(X) muß also muß also zwischen zwischen 00 und und 11 liegen.liegen.

(X)(X)== uu uu(X)(X) ·· (8)(8)

LC V

L) mm(X)(X)== uu uu(X)(X) mm·· (8)(8)

hie

I (H

P

Vaso

ld Es kann sich bei Es kann sich bei mm(X)(X) nur um den nur um den StoffmengenanteilStoffmengenanteil der Substanz der Substanz XX in der in der mobilenmobilen

PhPh h d l il j di S b th d l il j di S b t XX dd

atog

raph

10/1

1 R

. PhasePhase handeln, weil ja die Substanz handeln, weil ja die Substanz XX nur dann nur dann überhaupt mit der Geschwindigkeitüberhaupt mit der Geschwindigkeit uumm transportiert transportiert

(d h mitgenommen) werden kann(d h mitgenommen) werden kann

Chr

oma

WS

201 (d.h. mitgenommen) werden kann. (d.h. mitgenommen) werden kann.

Dieser Dieser StoffmengenanteilStoffmengenanteil ist wie folgt definiert:ist wie folgt definiert:

3030III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 6 ZusammenhangIII 6 Zusammenhang (X)(X) undund kk

11 11

III.6 Zusammenhang III.6 Zusammenhang mm(X)(X) und und kk

mm(X)(X) mm(X)(X)nn

ss(X)(X) mm (X)(X)nn nn11

ss(X)(X)nn kk11

11 (9)(9)ss(X)(X) mm (X)(X)nn ss( )( )

mm(X)(X)

nn11

kk 11 ( )( )

LC V

L)

(X)(X)== uu uu(X)(X) mm·· ==11

uu (10)(10)

hie

I (H

P

Vaso

ld mm(X)(X)== uu ( )( ) mm == 11kk ++ uumm (10)(10)

atog

raph

10/1

1 R

.

uu

uukkmm

(X)(X)11 (11)(11)

Chr

oma

WS

201 uu(X)(X) (11)(11)

kk == RetentionsRetentions--/Kapazitätsfaktor/Kapazitätsfaktor

3131

III 6 1 GrenzfälleIII 6 1 GrenzfälleIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.6.1 GrenzfälleIII.6.1 Grenzfälle

uu(X)(X)11

uumm(X)(X)== uu uu(X)(X) mm·· == 11kk ++uumm (10)(10)

Erhält man zwei Grenzfälle:

Da für jeden Stoffmengenanteil gilt: Da für jeden Stoffmengenanteil gilt: mm00 11(X)(X)

LC V

L)

Erhält man zwei Grenzfälle:

mm1.)1.) FürFür (X)(X) = 0= 0 uu (X)(X) = 0= 0

hie

I (H

P

Vaso

ld

112 )2 ) uu(X)(X)

d.h. es befindet sich d.h. es befindet sich keinekeine Substanz Substanz XX in der mobilen Phase in der mobilen Phase -- allesalles ist an ist an die die stationärestationäre Phase gebunden, d.h. Phase gebunden, d.h. keine Wanderungkeine Wanderung der Substanzder Substanz

atog

raph

10/1

1 R

. = 1= 1FürFür mm(X)(X)2.)2.) uuuu (X)(X) = = mmd.h. es befindet sich die d.h. es befindet sich die gesamtegesamte Substanz Substanz XX in der in der mobilenmobilen Phase Phase ––die Substanzdie Substanz XX hat somit keine Wechselwirkung mit der stationärehat somit keine Wechselwirkung mit der stationäre

Chr

oma

WS

201 die Substanz die Substanz XX hat somit keine Wechselwirkung mit der stationäre hat somit keine Wechselwirkung mit der stationäre

Phase, d.h. Phase, d.h. WanderungsgeschwindigkeitWanderungsgeschwindigkeit von von XX gleich der der gleich der der mobilen Phasemobilen Phase..

3232

III 7 Die TotzeitIII 7 Die Totzeit ttIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.7 Die Totzeit III.7 Die Totzeit tt00

Die Zeit zwischen dem Aufbringen der SubstanzDie Zeit zwischen dem Aufbringen der Substanz XX aufaufDie Zeit zwischen dem Aufbringen der Substanz Die Zeit zwischen dem Aufbringen der Substanz XX auf auf die Säule und dem Auftauchen der Substanz die Säule und dem Auftauchen der Substanz XX im im Detektor, die im Detektor, die im 2. Fall2. Fall verstreicht, wenn also verstreicht, wenn also keine keine WechselwirkungWechselwirkung der Substanz der Substanz XX mit der stationären mit der stationären Phase stattfindet, bezeichnet man häufig als sog. Phase stattfindet, bezeichnet man häufig als sog. T t it“T t it“ d Sä ld Sä l tt

LC V

L) „Totzeit“„Totzeit“ der Säule der Säule tt00..

Analog dazu wird das zugehörige Volumen als sog. Analog dazu wird das zugehörige Volumen als sog.

hie

I (H

P

Vaso

ld „Totvolumen“„Totvolumen“ VV00 der Säule bezeichnetder Säule bezeichnet..

tt

atog

raph

10/1

1 R

. Der Gebrauch dieser Bezeichnungen Der Gebrauch dieser Bezeichnungen VV0, 0, tt00 wird von wird von der der IUPACIUPAC jedoch wegen vieler jedoch wegen vieler VerwechslungsmöglichkeitenVerwechslungsmöglichkeiten heuteheute nicht mehrnicht mehr

Chr

oma

WS

201 VerwechslungsmöglichkeitenVerwechslungsmöglichkeiten heute heute nicht mehrnicht mehr

empfohlenempfohlen..

3333

III 8 Die DurchbruchszeitIII 8 Die Durchbruchszeit ttIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.8 Die Durchbruchszeit III.8 Die Durchbruchszeit ttmm

So ist mit dem sog. So ist mit dem sog. „Totvolumen“„Totvolumen“ VV00 oft nicht nur das oft nicht nur das eigentliche Totvolumeneigentliche Totvolumen der der SäuleSäule gemeint gewesen, gemeint gewesen, sondern zudem das sondern zudem das „„Totvolumen“Totvolumen“,, das durch das das durch das apparative Chromatographiesystem verursacht wird (z Bapparative Chromatographiesystem verursacht wird (z Bapparative Chromatographiesystem verursacht wird (z.B. apparative Chromatographiesystem verursacht wird (z.B. durch die Volumina der durch die Volumina der VerbindungskapillarenVerbindungskapillaren, der , der AnschlüsseAnschlüsse, der, der KonnektorenKonnektoren etc.)etc.)

LC V

L)

AnschlüsseAnschlüsse, der , der KonnektorenKonnektoren etc.)etc.)Dies wird alles berücksichtigt in den Ausdrücken:

hie

I (H

P

Vaso

ld DurchbruchsDurchbruchsvolumen bzw. DurchbruchsDurchbruchszeit

atog

raph

10/1

1 R

.

Als Symbole von der IUPAC empfohlen:

Chr

oma

WS

201

Vm und tm

3434

III 8 1 DurchbruchsvolumenIII 8 1 Durchbruchsvolumen VV undund zeitzeit ttIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.8.1 Durchbruchsvolumen III.8.1 Durchbruchsvolumen VVmm und und --zeitzeit ttmm

Definition: Definition: Durchbruchsvolumen / Durchbruchsvolumen / --zeitzeitAls Als DurchbruchsvolumenDurchbruchsvolumen VVmm bzw. bzw. --zeitzeit ttmm wird dasjenige wird dasjenige VolumenVolumen (bzw. die dazu (bzw. die dazu korrespondierende Zeitkorrespondierende Zeit) bezeichnet, ) bezeichnet, das benötigt wird, um einedas benötigt wird, um eine nichtnicht--retardierenderetardierende Substanz von derSubstanz von derdas benötigt wird, um eine das benötigt wird, um eine nichtnicht retardierenderetardierende Substanz von der Substanz von der InjektionsstelleInjektionsstelle bis zur bis zur DetektionsstelleDetektionsstelle zu befördern. Dieses zu befördern. Dieses Volumen umfaßt also genau genommen zusätzlich zum Volumen umfaßt also genau genommen zusätzlich zum Volumen Volumen der mobilen Phase im Säulenbettder mobilen Phase im Säulenbett VV diedie Totvolumina“Totvolumina“ desdes

LC V

L)

der mobilen Phase im Säulenbettder mobilen Phase im Säulenbett VVmobmob die die „„Totvolumina Totvolumina desdesGerätesGerätes z.B. im Einspritzventil, in den Verbindungskapillaren, im z.B. im Einspritzventil, in den Verbindungskapillaren, im Detektor etc..Detektor etc..

hie

I (H

P

Vaso

ld ttmm Ist für alle Sunstanzen Ist für alle Sunstanzen gleichgleichDi A ft t hi dli h S b t k tDi A ft t hi dli h S b t k t

atog

raph

10/1

1 R

. Die Auftrennung unterschiedlicher Substanzen kommt Die Auftrennung unterschiedlicher Substanzen kommt ausschließlich dadurch zustande, daß sich diese auf Grund ihrer ausschließlich dadurch zustande, daß sich diese auf Grund ihrer chemischen Beschaffenheit chemischen Beschaffenheit unterschiedlich langeunterschiedlich lange in der in der

Chr

oma

WS

201 stationären Phasestationären Phase aufhalten und somit zu unterschiedlichen aufhalten und somit zu unterschiedlichen

RetentionszeitenRetentionszeiten eluieren, d.h. getrennt werden eluieren, d.h. getrennt werden

3535

III 8 1 DurchbruchsvolumenIII 8 1 Durchbruchsvolumen VV undund zeitzeit ttIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.8.1 Durchbruchsvolumen III.8.1 Durchbruchsvolumen VVmm und und --zeitzeit ttmm

Da beiDa bei modernen HPLCmodernen HPLC AnlagenAnlagen diesediese eigentlicheneigentlichen

Anmerkung !Anmerkung !

LC V

L)

Da bei Da bei modernen HPLCmodernen HPLC--AnlagenAnlagen diese diese eigentlichen eigentlichen „Totvolumina„Totvolumina des apparativen Systems“des apparativen Systems“ auf ein auf ein

MinimumMinimum reduziert sind (durch minimale reduziert sind (durch minimale

hie

I (H

P

Vaso

ld Kapillardurchmesser, optimierte Gerätegeometrie etc. ), Kapillardurchmesser, optimierte Gerätegeometrie etc. ), können diese Parameter zur können diese Parameter zur Vereinfachung der Vereinfachung der

ProblematikProblematik hier hier vernachlässigtvernachlässigt werden, und es wird im werden, und es wird im

atog

raph

10/1

1 R

.

Folgenden davon ausgegangen, daß Folgenden davon ausgegangen, daß ttmm ausschließlich von ausschließlich von der der SäulenlängeSäulenlänge beeinflußt wird, und sich die beeinflußt wird, und sich die

WanderungsgeschwindigkeitenWanderungsgeschwindigkeiten u(u(x)x) umum uu beibei

Chr

oma

WS

201 WanderungsgeschwindigkeitenWanderungsgeschwindigkeiten u(u(x)x) um um uumm bei bei

konstanter Flußrate auf die konstanter Flußrate auf die SäulenlängeSäulenlänge beziehen. beziehen.

3636III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 8 2 ZusammenhangIII 8 2 Zusammenhang tt tt (X)(X) undund tt

tt tt ttRR (X)(X) SS(X)(X)

III.8.2 Zusammenhang III.8.2 Zusammenhang ttm m , , ttRR(X) (X) und und ttSS

ttRR(X(X11))

ttRR(X(X22))tt tt ttRR (X)(X) SS(X)(X) mm

ttRR(X(X11))

LC V

L)

ttmm

hie

I (H

P

Vaso

ld

atog

raph

10/1

1 R

. Zeit [s]Zeit [s]ttSS(X(X11))ttSS(X(X22))

Chr

oma

WS

201

Abb. 6:Abb. 6: Musterchromatogramm mit Musterchromatogramm mit ttSS(X)(X) als Aufenthaltszeit der als Aufenthaltszeit der Komponente Komponente XX in der stationären Phasein der stationären Phase

3737III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 8 3 Bestimmung vonIII 8 3 Bestimmung von tt undund tt (X)(X)III.8.3 Bestimmung von III.8.3 Bestimmung von ttmm und und ttRR(X)(X)

Wovon sind Wovon sind DurchbruchszeitDurchbruchszeit ttmm und und RetentionszeitRetentionszeit ttRR(X) (X) abhängig ?abhängig ?

von den Abmessungen der Säule von den Abmessungen der Säule ((Länge:Länge: LL))

LC V

L)

gg (( gg ))von den Wanderungsgeschwindigkeiten von den Wanderungsgeschwindigkeiten uumm, , uu(X)(X)

D hb h lD hb h l R t ti lR t ti l

hie

I (H

P

Vaso

ld

LL VVmm LL VVRR(X)(X)

DurchbruchsvolumenDurchbruchsvolumen RetentionsvolumenRetentionsvolumen

atog

raph

10/1

1 R

. LLttmm uumm

FF

VVmm LLuu (x)(x)

ttRR(X)(X)VV

FFRR(X)(X)

Chr

oma

WS

201

(12)(12) (13)(13)

3838

PPauseLC

VL)

hie

I (H

P

Vaso

ld

atog

raph

10/1

1 R

.

Chr

oma

WS

201

3939III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 8 4 ZusammenhangIII 8 4 Zusammenhang tt tt (X)(X) undund kkIII.8.4 Zusammenhang III.8.4 Zusammenhang ttmm , , ttRR(X)(X) undund kk

(14)(14)tt RR (X)(X) VVRR (X)(X) uumm (14)(14)

ttmm VVmm uu(X)(X)

LC V

L)

berücksichtigt man die bekannte Beziehungberücksichtigt man die bekannte Beziehung

hie

I (H

P

Vaso

ld

mm(X)(X)== uu uu(X)(X) mm·· == 1111

kk ++ uumm (10)(10)

atog

raph

10/1

1 R

. 11kk ++

Chr

oma

WS

201

ergibt sich:ergibt sich:

4040III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 8 4 ZusammenhangIII 8 4 Zusammenhang tt tt (X)(X) undund kkIII.8.4 Zusammenhang III.8.4 Zusammenhang ttmm , , ttRR(X)(X) undund kk

tt VVtttt

VVVV

kkRR (X)(X)

mm

RR (X)(X)

mm 11 (15)(15)

tt VVmm mm

LC V

L) VV VV kkRR (X)(X) mm (( ))11 (16)(16)

hie

I (H

P

Vaso

ld

atog

raph

10/1

1 R

.

tt tt kkRR (X)(X) mm (( ))11 (17)(17)

Chr

oma

WS

201

4141III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 9 Berechnung des KapazitätsfaktorsIII 9 Berechnung des Kapazitätsfaktors kkIII.9 Berechnung des Kapazitätsfaktors III.9 Berechnung des Kapazitätsfaktors kk

Auflösen von GleichungAuflösen von Gleichung (17)(17) nachnach kk demdemAuflösen von Gleichung Auflösen von Gleichung (17)(17) nach nach k k dem dem KapazitätsKapazitäts-- oder Retentionsfaktorfaktor:oder Retentionsfaktorfaktor:

kktt tt

tttt

tttt

ttmm SS

RRRR (X)(X) (X)(X)(X)(X)

11 (18)(18)

LC V

L) tt tttt mm mmmm( )( )

hie

I (H

P

Vaso

ld

tt kk tt kkSS mm(X)(X)

atog

raph

10/1

1 R

.

tt kk tt tt kkRR mm mm(X)(X)

11 (19)(19)

Chr

oma

WS

201

4242III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 9 1 B d t d K ität f ktIII 9 1 B d t d K ität f kt kkIII.9.1 Bedeutung des Kapazitätsfaktors III.9.1 Bedeutung des Kapazitätsfaktors kk

kktt

tt RR (X)(X)

11 (20)(20)

D fi itiD fi iti K itätK ität (R t ti )f kt(R t ti )f kt

ttmm

LC V

L) Definition: Definition: KapazitätsKapazitäts--(Retentions)faktor(Retentions)faktor

Um Um „Chromatogramme“„Chromatogramme“ , die z.B. an verschieden, die z.B. an verschieden langenlangen oder oder t hi dli ht hi dli h di kdi k Sä l d b i t hi dli hSä l d b i t hi dli h

hie

I (H

P

Vaso

ld unterschiedlich unterschiedlich dickendicken Säulen oder bei unterschiedlicherSäulen oder bei unterschiedlicherFlußgeschwindigkeitFlußgeschwindigkeit gemessen wurden, vergleichen zu gemessen wurden, vergleichen zu können, bedient man sich einer können, bedient man sich einer dimensionslosen Größedimensionslosen Größe, dem , dem

atog

raph

10/1

1 R

. KapazitätsKapazitäts--(Retentions)faktor (Retentions)faktor kk. . Der Der KapazitätsKapazitäts--(Retentions)faktor (Retentions)faktor kk einer Substanz einer Substanz XX ist eine ist eine auf die auf die Durchbruchszeit „normierte Elutionsgröße“Durchbruchszeit „normierte Elutionsgröße“. .

Chr

oma

WS

201 „ g„ g

4343III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 9 2 BeispieleIII 9 2 BeispieleIII.9.2 BeispieleIII.9.2 Beispiele

tt (X)(X)tt tt kkRR (X)(X) mm (( ))11kk

tttt

RR

mm

(X)(X)11

(20)(20) (17)(17)

LC V

L)

Substanz eluiert unverzögert Substanz eluiert unverzögert ttRR = = ttmm k =0k =0

hie

I (H

P

Vaso

ld

Literaturangabe k = 5Literaturangabe k = 5 zuzu

atog

raph

10/1

1 R

.

mit eigener Säule (gleiches mit eigener Säule (gleiches Material aber andere Material aber andere

erwarten erwarten ttRR = 15 min= 15 min

Chr

oma

WS

201

Dimensionen) z.B. Dimensionen) z.B. ttm m = 2.5 min= 2.5 min

4444III. Der chromatographische ProzeßIII. Der chromatographische ProzeßIII 10 DieIII 10 Die Theorie der BödenTheorie der Böden

Es gibt mehrere Möglichkeiten den

III.10 Die III.10 Die Theorie der BödenTheorie der Böden

Es gibt mehrere Möglichkeiten, den chromatographischen Trennprozess genauer zu beschreiben.

AA BB CC

LC V

L)

Z itZ it

hie

I (H

P

Vaso

ld Zeit Zeit Ziel:Ziel:

Die PositionDie Position jeder einzelnen Komponentejeder einzelnen Komponente imim

atog

raph

10/1

1 R

. Die Position Die Position jeder einzelnen Komponentejeder einzelnen Komponente im im chromatographischen Trennsystem und ihre dortige chromatographischen Trennsystem und ihre dortige KonzentrationsverteilungKonzentrationsverteilung in Abhängigkeit von derin Abhängigkeit von der

Chr

oma

WS

201 KonzentrationsverteilungKonzentrationsverteilung in Abhängigkeit von der in Abhängigkeit von der

ZeitZeit bestimmt zu können.bestimmt zu können.

4545III. Der chromatographische ProzeßIII. Der chromatographische ProzeßIII 10 DieIII 10 Die Theorie der BödenTheorie der Böden

Ein möglicher Ansatz:Ein möglicher Ansatz:

III.10 Die III.10 Die Theorie der BödenTheorie der Böden

Ein möglicher Ansatz:Ein möglicher Ansatz:

Theorie der BödenTheorie der Böden(th ti h T t f d ll)(th ti h T t f d ll)(theoretisches Trennstufenmodell)(theoretisches Trennstufenmodell)

Übertragung der Übertragung der Theorie der fraktionierten Theorie der fraktionierten

LC V

L)

g gg gDestillationDestillation auf die Säulenchromatographieauf die Säulenchromatographie

Übernimmt Begriffe vonÜbernimmt Begriffe von BodenhöheBodenhöhe undund

hie

I (H

P

Vaso

ld

Übernimmt Begriffe von Übernimmt Begriffe von BodenhöheBodenhöhe und und BodenzahlBodenzahl

atog

raph

10/1

1 R

.

Anschaulich, aber natürlich nur Anschaulich, aber natürlich nur näherungsweisenäherungsweise richtig, da richtig, da die Annahme einer die Annahme einer wiederholten Einstellung separaterwiederholten Einstellung separater

GleichgewichteGleichgewichte beim Vorliegen einerbeim Vorliegen einer bewegten mobilenbewegten mobilen

Chr

oma

WS

201 GleichgewichteGleichgewichte beim Vorliegen einer beim Vorliegen einer bewegten mobilenbewegten mobilen

PhasePhase eher unrealistisch isteher unrealistisch ist

4646III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 10 DieIII 10 Die Theorie der BödenTheorie der BödenIII.10 Die III.10 Die Theorie der BödenTheorie der Böden

BodenhöheBodenhöhe

LC V

L)

BodenBoden

BodenhöheBodenhöhe

hie

I (H

P

Vaso

ld

atog

raph

10/1

1 R

.

Chr

oma

WS

201

Abb. 7:Abb. 7: Beispiel eines DestillationsturmsBeispiel eines Destillationsturms

4747

III 10 1III 10 1 TrennstufenhöheTrennstufenhöhe undund TrennstufenzahlTrennstufenzahlIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.10.1 III.10.1 TrennstufenhöheTrennstufenhöhe und und TrennstufenzahlTrennstufenzahl

BodenhöheBodenhöhe == TrennstufenhöheTrennstufenhöhe HHBodenhöheBodenhöhe = = TrennstufenhöheTrennstufenhöhe HHBodenzahlBodenzahl = = TrennstufenzahlTrennstufenzahl NNzz

Definition: Definition: TrennstufenhöheTrennstufenhöheDie Trennstufenhöhe HH (die Höhe eines Theoretischen Bodens),

LC V

L)

( )oder HETPHETP (height equivalent to one theoretical plate)(height equivalent to one theoretical plate) ist die Strecke, auf der sich beim Fließen der mobilen Phase das Gleichgewicht einmal einstellt

hie

I (H

P

Vaso

ld

Gleichgewicht einmal einstellt.

W i dW i d T t f höhT t f höh HH dd

atog

raph

10/1

1 R

. Wovon sind Wovon sind TrennstufenhöheTrennstufenhöhe HH und und TrennstufenzahlTrennstufenzahl NNzz in der in der Chromatographie abhängig ?Chromatographie abhängig ?

Chr

oma

WS

201 Chromatographie abhängig ?Chromatographie abhängig ?

4848

III 10 1 1III 10 1 1 Beeinflussung vonBeeinflussung von HH undund NNIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.10.1.1III.10.1.1 Beeinflussung von Beeinflussung von HH und und NNZZ

TrennstufenhöheTrennstufenhöhe und und TrennstufenzahlTrennstufenzahl werden werden beeinflußt von:beeinflußt von:

LängeLänge der Säuleder Säule

LC V

L)

HHLL

NNLL

hie

I (H

P

Vaso

ld HHNNzz

NNHHzz

atog

raph

10/1

1 R

.

(21)(21) (21a)(21a)

Chr

oma

WS

201

4949III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 10 1 2III 10 1 2 Bedeutung vonBedeutung von HH undund NNIII.10.1.2 III.10.1.2 Bedeutung von Bedeutung von HH und und NNZZ

Bedeutung:Bedeutung:

HH minimalminimal Trennung Trennung optimaloptimal

LC V

L)

ppNNZZ maximalmaximal

hie

I (H

P

Vaso

ld NNZZ charakterisiert somit die charakterisiert somit die LeistungsfähigkeitLeistungsfähigkeit einer einer Trennsäule. Je besser die Säule gepackt wurde (kleine Trennsäule. Je besser die Säule gepackt wurde (kleine

T t f höh ) d j lä i i t d t öß i t diT t f höh ) d j lä i i t d t öß i t di

atog

raph

10/1

1 R

. Trennstufenhöhe), und je länger sie ist, desto größer ist die Trennstufenhöhe), und je länger sie ist, desto größer ist die TrennstufenzahlTrennstufenzahl und somit die und somit die TrennleistungTrennleistung..

Chr

oma

WS

201

5050

III 10 1 3III 10 1 3 Einfluß vonEinfluß von uu aufauf HH undund NNIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.10.1.3III.10.1.3 Einfluß von Einfluß von uumm auf auf HH und und NNZZ

Gegeben sind z.B.:Gegeben sind z.B.:Gegeben sind z.B.:Gegeben sind z.B.:

Dimensionen d. Säule: (Länge, Dicke)Dimensionen d. Säule: (Länge, Dicke)

Füllung d. Säule (Material, Füllung d. Säule (Material, Porenweite Partikelgröße etc.)Porenweite Partikelgröße etc.)

LC V

L) Für den Experimentator einzig Für den Experimentator einzig variierbarvariierbar soll sein: soll sein: FlußFluß, bzw. die Fließgewschwindigkeit , bzw. die Fließgewschwindigkeit uumm der der

hie

I (H

P

Vaso

ld

, g g, g g mmmobilen Phase durch die Säule.mobilen Phase durch die Säule.

JeJe größergrößer der Fluß destoder Fluß desto weniger oftweniger oft kann sich daskann sich das

atog

raph

10/1

1 R

. Je Je größergrößer der Fluß, desto der Fluß, desto weniger oftweniger oft kann sich das kann sich das GleichgewichtGleichgewicht einstellen einstellen --> > Trennung schlechter !!!Trennung schlechter !!!

JeJe niedrigerniedriger der Fluß destoder Fluß desto mehrmehr kommen z Bkommen z B

Chr

oma

WS

201 Je Je niedrigerniedriger der Fluß, desto der Fluß, desto mehrmehr kommen z.B. kommen z.B.

DiffusionsvorgängeDiffusionsvorgänge ins Spiel ins Spiel --> > Trennung schlechter !!!Trennung schlechter !!!

5151

III 10 1 4 DasIII 10 1 4 Das H/uH/u DiagrammDiagrammIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.10.1.4 Das III.10.1.4 Das H/uH/u--DiagrammDiagramm

]]H/uH/u--KurveKurvee H

[µm

]e

H [µ

m]

H/uH/u--KurveKurvefe

nhöh

efe

nhöh

e

5050

LC V

L)

3030 MinimumMinimum

enns

tuf

enns

tuf

hie

I (H

P

Vaso

ld

1010

Tre

Tre

bei LC ca. 0.1bei LC ca. 0.1--0.2 cm/s (GC: 100.2 cm/s (GC: 10--40 cm/s)40 cm/s)

atog

raph

10/1

1 R

.

FließgeschwindigkeitFließgeschwindigkeit u [ cm/s ]u [ cm/s ]1,01,00,50,5 1,51,5

Chr

oma

WS

201

Abb. 8:Abb. 8: H/uH/u--DiagrammDiagramm zur Bestimmung des optimalen Flusseszur Bestimmung des optimalen Flusses

5252

III 11 DieIII 11 Die van Deemtervan Deemter--GleichungGleichungIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.11 Die III.11 Die van Deemtervan Deemter--GleichungGleichungHierbei handelt es sich um eine Hierbei handelt es sich um eine empirischeempirische Gleichung mit Gleichung mit folgenden Größen:folgenden Größen:

BBfolgenden Größen:folgenden Größen:

HH AAuu

CC uumm

mm (22)(22)

LC V

L)hi

e I (

HP

Vaso

ld

atog

raph

10/1

1 R

.

EddyEddy--DiffusionDiffusion(Wirbeldiffusion)(Wirbeldiffusion)

LongitudinalLongitudinal--DiffusionDiffusion

StoffaustauschStoffaustausch--AnteilAnteil

Chr

oma

WS

201 AA--TermTerm BB--TermTerm CC--TermTerm

5353

III 11 DieIII 11 Die van Deemtervan Deemter--GleichungGleichungIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.11 Die III.11 Die van Deemtervan Deemter--GleichungGleichung

EddyEddy DiffusionDiffusionEddyEddy--DiffusionDiffusion(Wirbeldiffusion)(Wirbeldiffusion)

AA--TermTerm

LC V

L)

AA TermTermbeschreibt die beschreibt die BandenverbreiterungBandenverbreiterung, die von , die von derder GeometrieGeometrie derder FestphasenteilchenFestphasenteilchen und vonund von

hie

I (H

P

Vaso

ld

der der GeometrieGeometrie der der FestphasenteilchenFestphasenteilchen und von und von der der PackungPackung dieser Teilchen in der Säule dieser Teilchen in der Säule herrührt.herrührt.

atog

raph

10/1

1 R

. StatistischStatistisch gesehen haben einige gesehen haben einige Probenmoleküle einen relativ Probenmoleküle einen relativ kurzenkurzen Weg, Weg, während andere gezwungen sind einenwährend andere gezwungen sind einen

Chr

oma

WS

201 während andere gezwungen sind, einen während andere gezwungen sind, einen

„Umweg“„Umweg“ zu machen.zu machen.

5454

III 11 DieIII 11 Die van Deemtervan Deemter--GleichungGleichungIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.11 Die III.11 Die van Deemtervan Deemter--GleichungGleichung

LongitudinalLongitudinalLongitudinalLongitudinal--DiffusionDiffusionBB--TermTerm

LC V

L) berücksichtigt:berücksichtigt: Strömungsverteilung !Strömungsverteilung !Laminare StrömungLaminare Strömung (Molekültransport) ist in der(Molekültransport) ist in der

hie

I (H

P

Vaso

ld

Laminare StrömungLaminare Strömung (Molekültransport) ist in der (Molekültransport) ist in der MitteMitte zwischen zwei Partikeln zwischen zwei Partikeln größergrößer als in der als in der NäheNähe der Packungspartikel.der Packungspartikel.

atog

raph

10/1

1 R

.

berücksichtigt:berücksichtigt: Diffusion der Moleküle !Diffusion der Moleküle !beschreibt im beschreibt im H/uH/u--DiagrammDiagramm eine eine HyperbelHyperbel

Chr

oma

WS

201

und ist in der und ist in der LCLC zu zu vernachlässigenvernachlässigen..

5555

III 11 DieIII 11 Die van Deemtervan Deemter--GleichungGleichungIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.11 Die III.11 Die van Deemtervan Deemter--GleichungGleichung

StoffaustauschStoffaustausch--AnteilAnteilCC TT

LC V

L)

berücksichtigt:berücksichtigt: Kinetische Beiträge!Kinetische Beiträge!

CC--TermTerm

hie

I (H

P

Vaso

ld Geschwindigkeit Geschwindigkeit desdes Stoffaustausches Stoffaustausches zwischen stationärer und mobiler Phase.zwischen stationärer und mobiler Phase.

atog

raph

10/1

1 R

.

GeschwindigkeitGeschwindigkeit des des MassentransportesMassentransportes der der Probenmoleküle Probenmoleküle in die Porenin die Poren der stat. Phase der stat. Phase

Chr

oma

WS

201

und und ausaus ihnenihnen herausheraus ..

5656III Der chromatographische ProzeßIII 11 DieIII 11 Die van Deemtervan Deemter--GleichungGleichungDie Die H/uH/u--KurveKurve erhält man nach Addition aller drei Terme dererhält man nach Addition aller drei Terme dervanvan DeemterDeemter GleichungGleichung:

III.11 Die III.11 Die van Deemtervan Deemter--GleichungGleichung

vanvan--DeemterDeemter-- GleichungGleichung:

µm]

µm]

H/uH/u--KurveKurveöh

e H

[µöh

e H

[µ

LC V

L)

BB TermTerm

CC--TermTerm

stuf

enhö

stuf

enhö

5050

hie

I (H

P

Vaso

ld

1010

3030

AA--TermTerm

BB--TermTerm

Tren

nTr

enn

atog

raph

10/1

1 R

.

1,01,00,50,5

1010

Fließgeschwindigkeit u [cm/s]Fließgeschwindigkeit u [cm/s]1,51,5

Chr

oma

WS

201

Abb. 9:Abb. 9: H/uH/u--Diagramm mit den Termen der Diagramm mit den Termen der VanVan--DeemterDeemter--GleichungGleichung

5757

III 12 Facit der vanvan Deemter GleichungDeemter GleichungIII Der chromatographische ProzeßIII.12 Facit der vanvan Deemter GleichungDeemter Gleichung

I d Ch t hi i t b t btI d Ch t hi i t b t bt t Tt TIn der Chromatographie ist man bestrebt, In der Chromatographie ist man bestrebt, gute Trennungengute Trennungenin in relativ kurzen Analysenzeitenrelativ kurzen Analysenzeiten durchzuführen. D.h. man durchzuführen. D.h. man versucht eine versucht eine minimale Trennstufenhöheminimale Trennstufenhöhe bei möglichst bei möglichst flacher flacher H/u KurveH/u Kurve zu erzielen.zu erzielen.

Dies läßt sich erreichen durch:Dies läßt sich erreichen durch:

LC V

L)

Geringe Geringe KorngrößenKorngrößen(Einfluß auf(Einfluß auf AA TermTerm undund CC TermTerm))

hie

I (H

P

Vaso

ld (Einfluß auf (Einfluß auf AA--TermTerm und und CC--TermTerm))

Enge Enge KorngrößenverteilungKorngrößenverteilung bzw. dichte Packung bzw. dichte Packung (Ei fl ß f(Ei fl ß f BB TT ))

atog

raph

10/1

1 R

. (Einfluß auf (Einfluß auf BB--TermTerm))

Geringer Geringer SäulendurchmesserSäulendurchmesser

Chr

oma

WS

201

(Einfluß auf (Einfluß auf AA--TermTerm und und BB--TermTerm))

5858

III 13 Bedeutung in derIII 13 Bedeutung in der PraxisPraxisIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.13 Bedeutung in der III.13 Bedeutung in der PraxisPraxis

B i t ktB i t kt HPLCHPLC Sä lSä l li tli t HH b ib i D ltD ltBei gut gepackten Bei gut gepackten HPLCHPLC--SäulenSäulen liegt liegt HH beim beim Doppelten Doppelten bis bis FünffachenFünffachen des des mittleren Teilchendurchmessers mittleren Teilchendurchmessers ddpp ..

Trennstufenhöhe HPLCTrennstufenhöhe HPLC: 10: 10 25 µm25 µm

LC V

L)

Trennstufenhöhe HPLCTrennstufenhöhe HPLC: 10: 10--25 µm25 µm

Trennstufenzahl HPLCTrennstufenzahl HPLC: 4.000: 4.000--10.00010.000

hie

I (H

P

Vaso

ld

atog

raph

10/1

1 R

.

Trennstufenzahl GCTrennstufenzahl GC: 3.000: 3.000--150.000150.000

Trennstufenhöhe GCTrennstufenhöhe GC: 0.3: 0.3--0.8 mm0.8 mm

Chr

oma

WS

201

5959

LC V

L)hi

e I (

HP

Vaso

ld

atog

raph

10/1

1 R

.

Kapitel IV: Kapitel IV:

Chr

oma

WS

201 Das Chromatogramm Das Chromatogramm

6060IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 1IV 1 QualitativeQualitative AussagenAussagenIV.1 IV.1 QualitativeQualitative AussagenAussagen

z B Zuordnung von Substanzen überz B Zuordnung von Substanzen überz.B. Zuordnung von Substanzen überz.B. Zuordnung von Substanzen überidentische Retentionszeitidentische Retentionszeit ttRR(x)(x)..

Ggf. Injektion von Ggf. Injektion von ReferenzsubstanzenReferenzsubstanzen..

LC V

L)

z.B. Identifizierung von Substanzen überz.B. Identifizierung von Substanzen überUVUV APEXAPEX SpektrenSpektren (Diodenarray)(Diodenarray)

hie

I (H

P

Vaso

ld UVUV--APEXAPEX--SpektrenSpektren (Diodenarray),(Diodenarray),siehe Seminar und Praktikumsiehe Seminar und Praktikum..

atog

raph

10/1

1 R

.

z.B. Identifizierung von Substanzen überz.B. Identifizierung von Substanzen überIsoplot undIsoplot und 33--DD--PlotPlot

Chr

oma

WS

201 Isoplot und Isoplot und 33 DD PlotPlot ..

6161IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 1 1 DerIV 1 1 Der IsoplotIsoplotIV.1.1 Der IV.1.1 Der IsoplotIsoplot

AbsorptionAbsorption0 mAU0 mAU 100 mAU100 mAUe

[nm

]e

[nm

]en

läng

een

läng

e

LC V

L) Wel

lW

ell

hie

I (H

P

Vaso

ld

atog

raph

10/1

1 R

.

Chr

oma

WS

201

Abb. 10:Abb. 10: Isoplot einer chromatographischen TrennungIsoplot einer chromatographischen Trennung Zeit [min]Zeit [min]

6262IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 1 2 DerIV 1 2 Der 3D3D PlotPlotIV.1.2 Der IV.1.2 Der 3D3D--PlotPlot

LC V

L)

n [m

AU

]n

[mA

U]

hie

I (H

P

Vaso

ld

bsor

ptio

nbs

orpt

ion

atog

raph

10/1

1 R

.

Ab

Ab

Chr

oma

WS

201

Abb. 11:Abb. 11: 3D3D--Plot einer chromatographischen TrennungPlot einer chromatographischen Trennung

6363IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 2IV 2 QuantitativeQuantitative AussagenAussagenIV.2 IV.2 QuantitativeQuantitative AussagenAussagen

DiDi Flä hFlä h ii P kP k i t di t dDie Die FlächeFläche eines eines PeaksPeaks ist der ist der eingespritzten Stoffmengeeingespritzten Stoffmenge proportionalproportional

Dadurch hat Dadurch hat jedejede Substanz für Substanz für jedejedeChromatographiebedingung ihren eigenen Chromatographiebedingung ihren eigenen

LC V

L) ProportionalitätsfaktorProportionalitätsfaktor..

Diese Proportionalitätsfaktoren können

hie

I (H

P

Vaso

ld

Diese Proportionalitätsfaktoren können durch Injektion von Kalibriergemischen, die die zu bestimmenden Substanzen in

atog

raph

10/1

1 R

.

bekannter Konzentration enthalten, ermittelt werden (Methode des Internen Standards -i h S i d P ktik )

Chr

oma

WS

201 siehe Seminar und Praktikum)

6464IV Das ChromatogrammIV 3 Kenngrößen des ChromatogrammsIV.3 Kenngrößen des Chromatogramms

tt tt ttRR (X)(X) SS(X)(X)

ttRR(X(X11))

ttRR(X(X22))tt tt ttRR (X)(X) SS(X)(X) mm

ttRR(X(X11))

LC V

L)

ttmm

hie

I (H

P

Vaso

ld

atog

raph

10/1

1 R

. Zeit [s]ttSS(X(X11))ttSS(X(X22))

Chr

oma

WS

201

Abb. 12:Abb. 12: Musterchromatogramm mit Musterchromatogramm mit ttSS(X)(X) als Aufenthaltszeit als Aufenthaltszeit der Komponente X in der stationären Phaseder Komponente X in der stationären Phase

6565IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 4 BerechnungsbeispieleIV 4 BerechnungsbeispieleIV.4 BerechnungsbeispieleIV.4 Berechnungsbeispiele

Beispiel:ttmm = 2 min= 2 min 120 s120 sttRR(X1)(X1) = 5 min= 5 min 300 s300 sRR( )( ) 300 s300 sttRR(X2)(X2) = 10 min= 10 min 600 s600 s

tt tt 300300 120120(X(X ))

LC V

L) kktt tt

tt11300300 120120

RR mm

mm

(X(X11)) ss ss120120 ss

11 55,,

hie

I (H

P

Vaso

ld

kktt tt

tt22600600 120120

RR mm(X(X22)) ss ss120120

44 00,,

atog

raph

10/1

1 R

. tt22mm 120120 ss

,,

Chr

oma

WS

201 Angabe der Flächenwerte in Angabe der Flächenwerte in [mAU s[mAU s--11]]

6666IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 5IV 5 BewertungBewertung derder RetentionsfaktorenRetentionsfaktorenIV.5 IV.5 BewertungBewertung der der RetentionsfaktorenRetentionsfaktoren

Optimale Trennung bei 1,5 < Optimale Trennung bei 1,5 < kk < 5 < 5

Zu wenig Wechselwirkung Zu wenig Wechselwirkung

LC V

L) zwischen Substanz und zwischen Substanz und stationärer Phasestationärer Phase

kk < 1,5< 1,5

hie

I (H

P

Vaso

ld

Z l A l itZ l A l it

atog

raph

10/1

1 R

. Zu lange AnalysenzeitenZu lange AnalysenzeitenZu breite PeaksZu breite Peakskk > 5> 5

Chr

oma

WS

201

6767IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 6 Das ProblemIV 6 Das Problem schlecht getrennterschlecht getrennter PeaksPeaksIV.6 Das Problem IV.6 Das Problem schlecht getrennterschlecht getrennter PeaksPeaks

LC V

L)hi

e I (

HP

Vaso

ld

atog

raph

10/1

1 R

.

ttRR(X1)(X1) ttRR(X2)(X2)Zeit [min]Zeit [min]

Chr

oma

WS

201

Abb. 14:Abb. 14: Chromatogramm mit Chromatogramm mit schlecht aufgelöstem Peakpaarschlecht aufgelöstem Peakpaar

6868IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 7 DieIV 7 Die Selektivität (Trennfaktor)Selektivität (Trennfaktor) ααIV.7 Die IV.7 Die Selektivität (Trennfaktor)Selektivität (Trennfaktor) αα

beschreibt die beschreibt die GüteGüte der Trennung zweier der Trennung zweier ggbenachbarterbenachbarter PeaksPeaks

Wird gebildet aus demWird gebildet aus dem QuotientenQuotienten der beidender beidenWird gebildet aus dem Wird gebildet aus dem QuotientenQuotienten der beiden der beiden RetentionsfaktorenRetentionsfaktoren kk22 und und kk11

LC V

L)

kkkk

tttt

mitmit kk kk2222 11

ss(X(X22 ))

(X(X ))

hie

I (H

P

Vaso

ld kk tt1122 11

ss(X(X11))

atog

raph

10/1

1 R

.

Keine TrennungKeine Trennung= 1= 1

Chr

oma

WS

201 1<1< < 5< 5 optimale Trennungoptimale Trennung

6969IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 8 DieIV 8 Die AuflösungAuflösung RRIV.8 Die IV.8 Die AuflösungAuflösung RRSS

Die Die geometrischegeometrische Definition lautet:Definition lautet:

tt tt(( ))RR (X(X 22 )) RR (X(X 11))

LC V

L) RRtt tt

tt ttSS

(( ))

,, (( ))RR (X(X 22 )) RR (X(X 11))

ww (X(X 11)) ww (X(X 22 ))00 55

hie

I (H

P

Vaso

ld

ww 11 ww 22

atog

raph

10/1

1 R

.

BasisbreiteBasisbreite vom Peakvom Peakder Komponente der Komponente X1X1

BasisbreiteBasisbreite vom Peakvom Peakder Komponente der Komponente X2X2

Chr

oma

WS

201 pp

7070IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 9 DasIV 9 Das GaußprofilGaußprofil

ttRR(X(X22))tt (X(X ))

IV.9 Das IV.9 Das GaußprofilGaußprofil

ttRR(X(X11))

hh11

22 (X(X ))

hh11pp

LC V

L)

22ττ(X(X11))

22ττ(X(X22))

hh22pp

hie

I (H

P

Vaso

ld ttmm0.61 h0.61 h11

pp0.61 h0.61 h22

pp

atog

raph

10/1

1 R

.

Zeit [s]Zeit [s](( ))

ttSS(X(X11))

ttww(x(x11) = ) = 44ττ(X(X11) ) tw(x2) = 4τ(X2)

Chr

oma

WS

201 ttSS(X(X22))ww(( 11)) ττ(( 11))

Abb. 13:Abb. 13: Musterchromatogramm mit Musterchromatogramm mit ttww als als Basisbreite Basisbreite undundττ(X) (X) alsals Diffuse BandenverbreiterungDiffuse Bandenverbreiterung

w( 2) τ( )

7171IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 10 Bewertung derIV 10 Bewertung der AuflösungAuflösung RRIV.10 Bewertung der IV.10 Bewertung der AuflösungAuflösung RRSS

P k li ihP k li ih

RRSS = 1= 1Peaks liegen um ihrePeaks liegen um ihremittlere Basisbreitemittlere Basisbreiteauseinander d.h.auseinander d.h.ÜÜÜberlappung 3%Überlappung 3%

1<1< RR < 1 5< 1 5 fast vollständige fast vollständige

LC V

L) 1< 1< RRS S < 1.5< 1.5 gg(meist ausreichende) (meist ausreichende) TrennungTrennung

hie

I (H

P

Vaso

ld

1.25 < 1.25 < RRS S < 1.5< 1.5vollständige, gute vollständige, gute TrennungTrennung

atog

raph

10/1

1 R

.

RRS S > 1.5> 1.5meist unnötig gute meist unnötig gute Trennung d.h. zu Trennung d.h. zu l R t ti itl R t ti it

Chr

oma

WS

201 lange Retentionszeitlange Retentionszeit

7272

LC V

L)hi

e I (

HP

Vaso

ld

atog

raph

10/1

1 R

.

Kapitel V: LiteraturKapitel V: Literatur

Chr

oma

WS

201 Kapitel V: Literatur Kapitel V: Literatur

7373V Literatur V Literatur HPLCHPLC

S d L R Ki kl d J JS d L R Ki kl d J JSnyder L.R., Kirkland J.J.,Snyder L.R., Kirkland J.J.,Introduction to Modern Liquid ChromatographyIntroduction to Modern Liquid Chromatography, John Wiley., John Wiley.

M V RM V RMeyer V.R.,Meyer V.R.,Praxis der HochleistungsflüssigchromatographiePraxis der Hochleistungsflüssigchromatographie,,Salle+SauerländerSalle+Sauerländer.

LC V

L) Unger K.K.,Unger K.K.,Handbuch der HPLCHandbuch der HPLC, GIT Verlag., GIT Verlag.

hie

I (H

P

Vaso

ld Scott R.P.W.,Scott R.P.W.,Chromatographic DetectorsChromatographic Detectors, Jack Cazes, Cherry Hill,, Jack Cazes, Cherry Hill,New JerseyNew Jersey

atog

raph

10/1

1 R

. New JerseyNew Jersey

Huber L., George,S.A.,Huber L., George,S.A.,Diode Array Detection in HPLCDiode Array Detection in HPLC, Jack Cazes, Cherry Hill,, Jack Cazes, Cherry Hill,

Chr

oma

WS

201 yy , , y ,, , y ,

NewJerseyNewJersey