380 BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA

BBA 95159

CHROMATOGRAPHIE VON SERYL-RNA UND CYSTEINYL-RNA AN

SAULEN AUS M E T H Y L I E R T E M ALBUMIN AUF K I E S E L G U R "

F. MELCHERS UND H. G. ZACHAU

Institut ]i~r Genetik der Universitiit K~ln (Deutschland)

(Eingegangen am 3. August, 1964)

SUMMARY

Chromatography o] seryl RNA and cysteinyl RNA on columns o[ methyiated albumin on kieselgur

Two seryl t -RNA's (I and II) were partially separated by chromatography of [14C~seryl s-RNA from yeast on 2.2 × 5o-cm columns of methylated serum albumin on kieselgur. [35S]Cysteinyl s-RNA from E. coli showed three peaks of radioactivity on these columns.

The relative amounts of seryl t -RNA I and I I were quite different between RNA samples from two yeasts of different origins, but were not influenced by the origin of the aminoacyl s-RNA synthetases (EC 6.1.1.) (yeast or rat liver) used in charging the s-RNA with serine. The slower moving serine t -RNA in counter-current distributions was identified with seryl t -RNA I from MAK-columns, the faster moving with seryl t -RNA II. The presence of a third serine t -RNA in yeast s-RNA is discussed. A partial loss of acceptor activity for serine was observed during chromatography on 2.2 ×5o-cm MAK-columns; this loss was more pronounced in the preparative sep- arations on 3.2 x IIO-Cm columns. Higher oligonucleotides containing E14C~serine were found as one class of decomposition products of the E14Clseryl t-RNA's.

EINLEITUNG

DNA und RNA lassen sich an S~iulen aus methyliertem Serumalbumin auf Kieselgur 1 nach Basenzusammensetzung, Sekund/irstruktur und Molektilgr613e trennen~, 3. SUEOKA UND YAMANE 4 verwendeten N_AK-S~iulen zur Chromatographie von s-RNA und Aminoacyl-s-llNAs. Sie konnten zeigen, dab die untersuchten 16

Abkiirzungen: MAK-SAule, SAule aus methyliertem Serumalbumin auf Kieselgur. Als s-RNA wird das unfraktionierte Gemisch der Transfer-RNAs (t-RNAs) bezeichnet, die ihrerseits molekulareinheitliche NucleinsAuren mit best immter Prim~rstruktur sind; so wird z.B. yon einer Serin-t-RNA bzw. mehreren Serin-t-RNAs gesprochen sowie yon angereicherten ,,Serin-t-RNA- Fraktionen". Die mit AminosAuren beladenen NucleinsAuren werden als Aminoacyl- (z.B. Seryl-) t-RNA, t-RNA-Fraktion oder s-RNA bezeichnet.

* Serinspezifische Transfer-Ribonucleinsi~uren IV, vorangehende Mitteilung siehe Lit. 9-

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Aminoacyl-s-RNAs charakteristische Elutionsmuster besitzen. Aus einigen der Elutionsprofile konnte auf die Existenz mehrerer fiir die gleicheAminos~iure spezifischer t-RNAs geschlossen werden, ein Befund, der im Zusammenhang mit der Degeneration des genetischen Codes von Interesse ist, und d e r m i t den Ergebnissen anderer Au- toren 5-7 im Einklang steht.

l~iir Strukturuntersuchungen an Serin-t-RNA 8-1° wurden in unserem Labor dutch Gegenstromverteilung von s-RNA mehrere RNA-Pr~iparate mit stark erh6hter Akzeptoraktivit~t fiir Serin hergestellt n. Ob lind wie weir bei der Anreicherung eine Trennung in zwei oder mehrerer Serin-t-RNAs gelungen war, wurde durch Chromato- graphie der ~Pfiiparate an MAK-S~itflen untersucht. In dieser Arbeit werden Chro- matograptlie-]3edingungen beschrieben, die eine eindeutige Trennung der Serin- t-RNAs gestatten. Diese Bedingungen wurden atlf unfraktionierte s-RNA ange- wendet, die mit L14ClSerin bzw. [35S~Cystein beladen war, und auf [14ClSeryl-t-RNA- 1Jr~parate aus angereicherten Serin-t-RNA-Fraktionen. t3ew/ihrt haben sich die Bedingungen auch bei der Chromatographie yon Phenylalanyl- und Valyl-t-RNA (Ref. 12,).

MATERIALIEN UND METHODEN

s -RNA s-RN_A_ aus Brauereihefe (Pr~iparat A aus einem Gemisch der Hefen der Braue-

reien Dom und Sester, K61n; Pfiiparat B aus Hefe der Brauerei Sester) und aus Gegenstromverteilungen dieser s-RNAs stammende Serin-t-RNA-Fraktionen wurcten eingesetzt. E14C~Seryl-RNA-Pr~parate wurden daraus nach Standardmethoden (z.B. Ref. 13) hergestellt (DL-II-14ClSerin, 2.37 und 4.0 mC/mMol).

MAK-St iu len MAK-Situlen wurden, wie beschrieben*, gestopft, nur wurde gesiebtes Kieselgur

(lOO-2OO mesh) verwendet. Auf die S~iulen (2.2 ×50 cm) wurden IO mg E14ClSeryl - RNA mit 25 000-30 ooo Imp./min in 200 ml 0.2 M NaCl-o.o5 M ~Phosphatpuffer (pH 6.8) aufgetragen. [14C~Seryl-t-RNA-Fraktionen mit erh6hter Akzeptoraktivit~it ffir Serin wurden entsprechend mit nicht radioaktiver s-RNA verdfinnt. Der Elutions- gradient wurde mit einem Varigrad 14 hergestellt, dessen Kammern mit je IOO ml 0.2 M, 0.6 M, 0.2 M, 0.7 M, o.2 M, 0. 7 M, 0.5 M, 0.5 M, 0. 7 M NaC1 in 0.05 M~ ~Phos- phatpuffer (pH 6.8), geffillt waren; anschliessend wurde mit einem linearen Gra- dienten (je 13o ml, 0. 7 und I .I M NaC1) eluiert (Abb. I). Die S~iulen wurden, wie angegeben 4, betrieben: Raumtemperatur, Flul3geschwindigkeit etwa I ml/min (Pumpe der Fa. Biihler, Tfibingen), 2.5 bzw. 5.0 ml Fraktionsvolumen, Bestimmung der Ultraviolett-Absorption bei 260 m/z. Die Dauer einer Chromatographie betrug 18-2o Std. Die S/iulen konnten vier- bis ffinfmal benutzt werden, bevor die Adsorptions- f~ihigkeit ffir RNA nachliel3; sie wurden vor jedem Gebrauch mit 0.2 M NaC1/o.o5 M Phosphatpuffer ~iquilibriert. IO -s IV[ MgC12 im Elutionspuffer itnderte alas ~Elutions- profil nicht.

Zur Bestimmung der Radioaktivitiit wurde die RNA aus je 2 ml ieder zweiten bis vierten Fraktion mit 1.5 mg Tr~iger-RNA und 2.5 ml IO %-Trichloressig-

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s~ure ausgef~llt, I Std. bei 4 ° stehen gelassen, abzentrifugiert, getrocknet und nach L6sen in konz. Ameisens~ture und Plattieren im Gasdurchflu6z~thler gemessen. Durchschnittlich wurden 80 % cler auf die S~ule gegebenen Radioaktivit~t wieder- gefunden, s-RNA aus MAK-S~ulen-Fraktionen "~a~rde zur weiteren Untersucbung an DEAE-Celluloses~ulen adsorbiert, mit einern steilen NaC1-Gradienten eluiert und dann gegen io -s M MgCI 2 dialysiert.

ERGEBNISSE

Verle ich mehrerer Gr~Ben yon M A K - S ~ u l e n

SUEOKA UND YAMANE 4 batten gefunden, dab bei der Chromatographie von [14C~Seryl-s-RNA aus E. coli an MAK-SAulen zwei Gipfel der Radioaktivit~t auf- traten, w~hrend sich aus Chromatographieversuchen mit einem entsprechenden Pr~parat aus Hefe kein Hinweis auf die Existenz zweier verschiedener Serin-t-RNAs ergab ~5. In Gegenstromverteilungen traten andererseits nicht nur bei s-RNA aus E. coli is, sondern auch bei s-RNA aus Hefen47 zwei Gipfel der Akzeptoraktivit~tt ffir Serin auf. An den yon SUEOKA UND YAMANE 4,15 verwendeten MAK-S~ulen (1.8 ×8 cm) konnten auch in cliesem Labor die beiden [14ClSeryl-t-RNAs der Hefe-

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Abb. I. Chromatographie mehrerer [14C]Seryl-s-RNA-Pri~parate an MAK-SAulen unter gleichen Elutionsbedingungen (s. MATERIALIEN UND METI-IODEN). (~L) s-RNA (Prltparat A), mit Hefeenzym beladen. (b) s-IRNA (Prgparat A), mit Rattenleberenzym beladen. (c) s-RNA (Pri~parat B), mit Rattenleberenzym beladen. (d) Mit Phenol erhitzte [14C~Seryl-s-RNA (Prliparat A; io mg in 3 ml o.I M NaC1 mit 3 ml wasserges~ttigtem Phenol unter gelegentlichem Schfitteln 3 ° min auf ioo ° erhitzt, in Eis abgeschreckt, ausgeAthert). (e) RNA der Elemente 84 und 85 der Ver- teilung IF (Abb. IF in 1Ref. i i ) . (f) RNA der Elemente 47-89 der Verteilung 2A (Abb. 2A in Ref. II). (g) RNA der Elemente 9O-ll 5 der Verteilung 2A. (f) und (g) wurden nacheinander auf derselben S~ule, wie in MATERIALIEN UND METHODEN beschrieben, chromatographiert.

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s-RNA nicht eindeutig und reproduzierbar getrennt werden. Mit gr613eren MAK- S~tulen (2.2 × 50 cm) und einem nicht linearen Gradienten hingegen wurden mindestens zwei [14C]Seryl-t-RNA-Gipfel gefunden (Abb. Ia). Diese S~ulen haben for die bier beabsichtigten Versuche mit Seryl-t-RNA-Fraktionen den Vorteil h6herer Trenn- sch~rfe; allerdings sind Ver~nderungen der s-RNA w~thrend der litnger dauernden Chromatographie m6glich (s. unten).

Wie die bisher untersuchten Aminoacyl-s-RNAs4, is ergab auch [~sSlCysteinyl- s-RNA aus E. coli ein charakteristisches Elutionsprofil (Abb. 2). Drei deutliche

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0.6"

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50

Abb. 2. Chromatographie von [85S]Cysteinyl-s-RNA aus E. coli an einer MAK-SAule mi t einem linearen Elut ionsgradienten von je 45 ° ml 0.2 M und I.O M NaC1/o.o 5 M Phospha tpuf fe r (pH 6.7).

Gipfe! der Radioaktivit~tt traten auf, von denen die ersten beiden (I und II) wahr- scheinlich verschiedenen Cystein-t-RNAs entsprachen. Bei Gipfel I I I k6nnte es sich um eine dritte Cystein-t-RNA oder um ein Umwandlungsprodukt von I u n d II handeln.

Die Trennung der Serin-t-RNAs liel3 sich auch pr/iparativ auswerten (7 ° mg [14ClSeryl-s-RNA), wenn man zu noch gr613eren MAK-S/iulen (3.2 ×IiO cm) tiber- ging. Hierbei konnten jedoch die RNA-Fraktionen nach Abspalten des [14ClSerins (o.I M Na2COs, pH IO, 37 °, 30 rain) nur zu weniger als IO % mit dieser Aminos~ure wieder beladen werden. Wurde die Chromatographie bei 4 ° ausgeftihrt, so war der Verlust an Akzeptoraktivit~t geringer. Um bei dieser Temperatur das gleiche Elutionsmuster wie bei Raumtemperatur zu erhalten, mul3te die Salzkonzentration im Gradienten auf etwa die H~tlfte herabgesetzt werden. Der s-RNA-Gipfel und die beiden [14C]Seryl-t-RNA-Gipfel wurden dann bereits bei o.31 M, 0.335 M bzw. 0.35 M NaC1 eluiert, d.h. bei der Bindung der Nucleins~uren an MAK-SAulen fiber- wiegen Prozesse mit negativem Temperaturkoeffizienten.

Chromatographie von [14C]Seryl-s-RNA Wurden zur Beladung von s-RNA aus Here Aminoacyl-s-RNA-Synthetasen

(EC 6.1.1.) aus HefO2,19 bzw. Rattenleber 2° verwendet, so zeigten die [14C]Seryl-

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s-RNA-Pr/iparate bei Chromatographie an MAK-S/iulen innerhalb der iiblichen Schwankungen (s. unten) gleiche Elutionsmuster (Abb. Ia und b). Die bei anderen Interspezies-Kombinationen yon s-RNA und Enzym beobachteten Unterschiede der Aminos~iure-Beladung bzw. des Elutionsprofilsaa, 2~ traten hier nicht aut. In den meisten bier beschriebenen Versuchen (Abb. Ib-g) wurde Aminoacyl-RNA-Syn- thetase aus Rattenleber eingesetzt.

Alle [laC]Seryl-s-RNA-Pr~tparate zeigten bei Chromatographie an MAK- S/iulen drei Gipfel der Radioaktivit~tt ( I - I I I ) . Gipfel I und I I entsprechen zwei verschiedenen Seryl-t-RNAs (s. unten), w~hrend Gipfel I I I wahrscheinlich einem Umwandlungsprodukt von I und I I zuzuordnen ist.

Das Mengenverh~tltnis von Seryl-t-RNA I und I I wurde durch Planimetrieren der F1/ichen unter den Radioaktivit~itskurven abgeschgttzt. Die Auswertung von 15 Elutionsprofilen ergab, dab in s-RNA-Pr/iparaten aus zwei verschiedenen Braue- reihefen das Verh~iltnis signifikant verschieden war (Seryl-t-RNA I/Seryl-t-RNA I I = 1.o/2.64-o.3 bzw. 1.o/o.84-o.3; Abb. Ib und c). Die angegebenen Schwankungs- breiten deuten an, dab die Bedingungen bei den einzelnen Ans~itzen der enzymati- schen Beladung tier s-RNA und bei den Chromatographieversuchen kaum v611ig identiscll sein k6nnen (Enzym aus mehreren Isolierungsans/ttzen usw.).

[14C]Seryl-t-RNA I und II , die durch Chromatographie an MAK-S/iulen von- einander getrennt worden waren, erschienen bei tier Rechromatographie unter gleichen Bedingungen wieder in denselben Bereichen des Elutionsprofils. Eine Umwandlung von I in I I bzw. umgekehrt konnte nicht beobachtet werden, jedoch t ra t bei jeder Rechromatographie yon I oder I I der Gipfel I I I auf.

Bei der Rechromatographie derjenigen MAK-S~tulen-Fraktionen, die Serin- t -RNA I bzw. I I enthielten, an einer Sephadex G-zoo-S~tule wurde I I vor I eluiert; das ist im Einklang mit der Vorstellung, dab beide S~tulen in verschiedener Weise nach der Molektilgr6Be trennen.

Nach dem [14C]Serin/RNA-Verh/iltnis war in den Fraktionen der MAK- S/iulen-Chromatographie Serin-t-RNA vier- bis ftinffach angereichert. Jedoch konnte die RNA nach Abspalten des Serins im enzymatischen Einbauversuch nur zu etwa 5o % wieder beladen werden. M6glicherweise waren also aus [liC]Seryl-t-RNA aul3er den Umwandlungsprodukten des Gipfels I I I Nucleins~turen entstanden, die ihre Akzeptoraktivit/ i t verloren batten, sich in ihrem chromatographischen Ver- halten aber nicht von dem Ausgangsmaterial unterschieden. Eine Nuclease-Aktivit~it des methylierten Serumalbumins als Grund ftir den Verlust an Akzeptoraktivit~it konnte ausgeschlossen werden: Nach I2-stiindiger Inkubation bei Raumtempera tur von IO mg s-RNA mit 5o mg Methylalbumin in 3 ml Elutionspuffer war die Ak- zeptoraktivit~tt f~ar Serin innerhalb der Fehlergrenzen nicht ver/indert.

Gipfel I I I war nur dann deutlich sichtbar, wenn nach Elution der Hauptmenge der s-RNA (o. 7 M NaC1) ein steiler NaC1-Gradient angelegt wurde. Das aus den Fraktionen dieses Gipfels isolierte Nucleotidmaterial enthielt I/IO bis 1/5 der Radio- aktivit/it der [14C]Seryl-t-RNA, besal3 aber nach Abspaltung der Aminosliure keine Akzeptoraktivit~tt mehr fiir Serin und fiir ein Algenproteinhydrolysat. Bei Rechro- matographie an MAK-SS, ulen wltrde das Nucleotidmaterial wieder erst bei etwa o.8 M NaC1 eluiert. Bei dieser Salzkonzentration wiirde man die Elution h6her- molekularer RNA erwarten*. Chromatographie der Substanz aus Gipfel I I I an einer Sephadex G-ioo-S~iule zeigte jedoch, dab es sich um Nucleotidmaterial von geringerer

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Molekiilgrbl3e als s-RNA handelte. Die Kettenl~nge dieser Oligonucleotide mul3 jedoch gr613er als 6-8 sein, da ein Pankreas-Ribonuclease-Hydrolysat von s-RNA zu etwa 95 % mit 0.2 M NaC1 yon MAK-S~ulen eluiert werden kann. Dutch Erhitzen von s-RNA in Gegenwart von Phenol nahm die Menge an Oligonucleotidmaterial des Gipfels I I I erheblich zu (Abb. Id). Aus diesem Experiment und arts dem Auftreten von Gipfel I I I bei Rechromatographie der [~4C]Seryl-t-RNA-Fraktionen I und II der MAK-Siiulen schliel3en wir, dab das Nucleotidmaterial des Gipfels III dutch Abbau yon s-RNA entsteht.

Chromatographie von [14C]Seryl-t-RNA-Fraktionen Durch eine Reihe von Gegenstromverteilungen im Butylaminsystem (Abb. I

in Ref. I I ) liel3 sich eine Serin-t-RNA-Fraktion gewinnen, die nut sehr geringe Mengen anderer t-RNAs enthielt n. Nach enzymatischer Beladung mit [14C]Serin ergab die Chromatographie an MAK-S~ulen zwei [14C]Seryl-t-RNA-Gipfel (Abb. Ie; I/II -- 1.o/2.5). Bei Serin-t-RNA-Fraktionen aus anderen Reihen yon Gegen- stromverteilungen war das Verh~ltnis I/II gr6i3er oder kleiner je nach der s-RNA des Ausgangsmaterials und nach der Art des Fraktionenschneidens bei den Ver- teilungen. Die Menge an Nucleotidmaterial des Gipfels III war bei einzelnen Seryl- t-RNA-Fraktionen stark verschieden.

In einer weiteren Reihe von Gegenstromverteilungen (Abb. 2 in Ref. II) wurde eine zweigipflige Kurve fiir die Serin-Akzeptoraktivit~.t erhalten. Die aus dem langsamer wandernden Gipfel stammende RNA enthielt nach MAK-S~ulen-Chro- matographie viel Seryl-t-RNA I und wenig n (Abb. if), w~Llarend in der RNA aus dem schneller wandernden Gipfel praktisch nur Seryl-t-RNA II gefunden wurde (Abb. Ig).

DISKUSSION

Von INGRAM UND SJ6QUIST z2 wurde diskutiert, dab die Zweigipfligkeit der AkzeptoraktivitAtskurve ftir Valin in der Gegenstromverteilung nicht nut durch die Existenz zweier Valin-t-RNAs mit unterschiedlicher Nucleotidsequenz erklArt werden k6nnte, sondern auch durch Sekund~reffekte (teilweiser Abbau der RNA, Anwesenheit mehrwertiger Metallionen). Nach NISHIMURA UND NOVELLI ~s k6nnte ein verAndertes Elutionsverhalten yon Aminoacyl-t-RNAs bei der M_AK-S~ulen- Chromatographie auch darauf beruhen, dab Internucleotidbindnngen ohne Verlust der Akzeptoraktivit~t der s-RNA gespalten wurden. Nach den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit ist es sehr wahrscheinlich, dab weder das Auftreten zweier Serin-t-RNA-Gipfel in der Gegenstromverteilung noch das Erscheinen zweier Seryl-t-RNA-Gipfel in der MAK-Siiulen-Chromatographie auf Sekund~reffekten beruht. In Hefe kommen danach wahrscheinlich mindestens zwei Serin-t-RNA's vor, die sich moglicherweise in der PrimAr- und/oder der Sekund~rstruktur unter- scheiden (vgl. auch Ref. IO). Dieses Ergebnis steht mit dem Befund von BENNETT, GOLDSTEIN UND LIPMANN ~4 im Einklang, die bei zwei durch Gegenstromverteilung getrennten Serin-t-RNA-Fraktionen aus E. coli eine unterschiedliche Polymer- abh~.ngigkeit des Aminos~ure-Transfers fanden. ~ber die Identifizierung yon zwei

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Leucin-t-RNA-Fraktionen der Gegenstrolnverteilung mit denen der MAK-S~ulen- Chromatographie ist von KELLER UND ANTHONY 25 berichtet worden.

Auffallend war, dab der zweite Seryl-t-RNA-Gipfel bei der MAK-S/iulen- Chromatographie (II in Abb. Ia-g) immer breiter war als der erste und manchmal sogar die Andeutung einer Zweigipfligkeit zeigte. Es ist daher m6glich, dab in den RNA-Pr/iparaten eine dritte Serin-t-RNA enthalten war (vgl. auch Ref. 12). An- dererseits soll nicht ausgeschlossen werden, dab diese Andeutung einer dritten Komponente auf einem der erw~ihnten SekundS.reffekte beruhen kann. Sicher auf einem der Sekund/ireffekte beruhte das Auftreten [14ClSerin-haltigen Oligonucleo- tidmaterials im Gipfel I I I der Ehltionsprofile (Abb. Ia-g).

DANK

Herrn Dr. F. CHAPEVILLE danken wit vielmals ftir die (3berlassung der [a~SJ- Cysteinyl-s-RNA. Die Deutsche Forschungsgemeinschaft, das Bundesministerium ftir wissenschaftliche Forschung und der Fond der Chemie haben die Arbeit in dankenswerter Weise durch Sachbeihilfen unterstfitzt.

ZUSAMMENFASSUNG

Durch Chromatographie von [14C~Seryl-s-RNA aus Hcfe an 2 .2X5ocm- S~iulen aus methyliertem Serumalbumin auf Kieselgur konnten zwei Seryl-t-RNAs (I und II) teilweise voneinander getrennt werden (Abb. I); bei [asS]Cysteinyl-s-RNA aus E. coli wurden drei Gipfel der Radioaktivit~it gefunden (Abb. 2).

Die relativen Mengen von Seryl-t-RNA I und II waren bei RNA-Pr/iparaten aus zwei Hefen unterschiedlichen Ursprungs stark verschieden, sie waren abet unabh/ingig yon der Herkunft der zur Beladung verwendeten Aminoacyl-s-RNA- Synthetase (EC 6.1.1.) (Hefe bzw. Rattenleber). Seryl-t-RNA I konnte mit der in der Gegenstromverteilung langsamer wandenaden Serin-t-RNA, Seryl-t-RNA lI mit der schneller wandernden identifiziert werden. Das Vorkommen einer dritten Serin- t-RNA in Hefe-s-RNA wird diskutiert. Ein teilweiser Verlust der Akzeptoraktivit~it ftir Serin wurde bei der Chromatographie an den 2.2 X 50 cm-MAK-S~iulen beobachtet und ein st~rkerer Verlust bei den zur priiparativen Trennung verwendeten 3.2 x IiO cm-S/iulen. Als Zersetzungsprodukte der [14C]Seryl-t-RNAs wurden unter anderem gr6Bere, [14CJSerin enthaltende 01igonucleotide identifizieri.

L I T E R A T U R

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