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Zielsetzung:Novasoy ist eine auf Soja basierende Nahrungsergänzungsmittel-Zutat, die reich an zwei wichtigen Isoflavonen Daidzein und Genistein ist. Isoflavone von Novasoy werden ausschließlich aus Soja extrahiert und zwar auf schonendste Weise, um das natürliche Profil und das Verhältnis der Isoflavone und
der anderen natürlichen Komponenten so zu erhalten, wie es in Sojabohnen vorhanden ist. Ziel dieser Arbeit ist es eine HPLC-Methode zur Isolierung, Trennung und Quantifizierung der Soja-Isoflavone Daidzein und Genistein im Novasoy-Extrakt- und Hydrolysat zu entwickeln. Mit der entwickelten
Methode werden die Kapseln (auf Basis von Novasoy 600) untersucht, die vom Lehrstuhl für Pharmazeutische Technik und Biopharmazie, Universität Würzburg für den Lehrstuhl für Lebensmittelchemie zum Zweck einer Interventionsstudie hergestellt wurden.
Entwicklung einer HPLC-Methode zur Isolierung, Trennung und Quantifizierung der Isoflavone Daidzein und Genistein im Novasoy-
Extrakt- und HydrolysatWissenschaftliche Abschlussarbeit von Olga Engel Betreuer: Dr. Harald Esch
Universität Würzburg, Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie , Lehrstuhl für Lebensmittelchemie, Am Hubland, 97074 Würzburg, Deutschland
Kalibriergerade von GEN bzw. von DAI mit IS (100 ng Apigenin). Links:
Kalibriergerade für GEN; gemessene GEN-Menge 5 – 15 ng,
Geradengleichung y = 0,11817x – 0,11163, R² = 0,999. Rechts:
Kalibriergerade für DAI; gemessene DAI-Menge 10-30 ng, Geradengleichung
y = 0,05062x – 0,04935, R² =0,998.
3. Kalibrierung mit internem Standard
1.Optimierung der Probenaufbereitung
4. Quantifizierung von Novasoy 600 sowie der Kapseln auf Basis von
Novasoy 600
Abb. 6
Übersicht der ermittelten DAI- und GEN-Gehalte von Novasoy 600 sowie der für die
Interventionsstudie hergestellten Kapseln auf Basis von Novasoy 600 nach der
Ultraschallextraktion mit Acetonitril/Wasser-Mischung (1:1) und saurer Hydrolyse mit konz.
Salzsäure.
Tab. 1
2. Optimierte Gradientenmethode
0 10 20 30 40 50 60
-1
0
1
2
3
4
5
Ab
so
rptio
n 2
60
nm
(m
AU
)
Zeit (min)
DAIGEN
IS
Hydrolyse, 1M HCl
0
10
20
30
40
50
0
10
20
30
40
50
DAIGEN
IS
Aceto
nitrila
nte
il (%)
Hydrolyse, konz. HCl
0 10 20 30 40 50 60
-1
0
1
2
3
4
5
Zeit (min)
HPLC-DAD Chromatogrammen von jeweils 130 ng Novasoy 400-Hydrolysat mit 100 ng
Apigenin als IS nach der Extraktion mit Acetonitril 50% (v/v) und anschließender
Hydrolyse mit 1M HCL (links) bzw. konz. HCl (rechts). HPLC: Agilent 1100, Säule:
Eurospher-100, RP-18, 250×4 mm i. D., 5 µm; Säulentemperatur: RT; Fließmittel: (A)
Wasser mit 0,1% (v/v) Ameisensäure, (B) Acetonitril mit 0,1% (v/v) Ameisensäure;
Gradient: 5 min 15% B, 36 min 29% B, 44 min 35% B, 60 min 15% B; Fluss: 1 ml/min;
Injektionsvolumen: 5 µl; Detektion: 260 nm.
Abb. 3
Vergleich der HydrolysenVergleich der Extraktionen
HPLC-DAD Chromatogrammen von jeweils 4,3 µg Novasoy 400-Extrakt mit 100 ng IS;
rechts: Extraktion mit Acetonitril 50% (v/v); links: Extraktion mit Methanol 80% (v/v). HPLC:
Agilent 1100, Säule: Eurospher-100, RP-18, 250×4 mm i. D., 5 µm; Säulentemperatur: RT;
Fließmittel: (A) Wasser mit 0,1% (v/v) Ameisensäure, (B) Acetonitril mit 0,1% (v/v)
Ameisensäure; Gradient: 5 min 15% B, 36 min 29% B, 44 min 35% B, 60 min 15% B; Fluss:
1 ml/min; Injektionsvolumen: 5 µl; Detektion: 260 nm.
Abb. 1
4 6 8 10 12 14 16
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
10 15 20 25 30 35
Flä
ch
en
ve
rhä
ltn
is G
EN
/ I
S
GEN-Menge (ng)
GEN
Flä
ch
en
ve
rhä
ltn
is D
AI
/ IS
DAI-Menge (ng)
DAI
0,0
0,5
1,0
1,5
Pe
akflä
ch
en
ve
rhä
ltn
is D
AI
bzw
. G
EN
/ I
S
MeOH 50% ACN 80%
HPLC-DAD Chromatogramme von 1,5 µg Novasoy 600-Acetonitril-Extrakt (links) und 63 ng
Novasoy 600-Hydrolysat (rechts) mit jeweils 100 ng Apigenin als IS. HPLC: Agilent 1100,
Säule: Eurospher-100, RP-18, 250×4 mm i. D., 5 µm; Säulentemperatur: RT; Fließmittel: (A)
Wasser mit 0,1% (v/v) Ameisensäure, (B) Acetonitril mit 0,1% (v/v) Ameisensäure; Gradient: 0
min 23% B, 30 min 35% B, 35 min 23% B, 40 min 100% B, 45 min 100% B, 50 min 23% B, 60
min 23% B; Fluss: 1 ml/min; Injektionsvolumen: 5 µl; Detektion: 260 nm.
Abb. 5
Peakflächenverhältnis DAI-bzw.
GEN / IS in Acetonitril-und
Methanol-Mischungen
Abb. 2
Ergebnis:
Die Extraktion der Soja-Isoflavone
mit Acetonitril/Wasser-Mischung
(1:1) wird bevorzugt
Ergebnis:
Die konzentrierte Salzsäure hat
im Vergleich zu 1M Salzsäure
eine stärkere Hydrolysekraft.
Peakflächenverhältnis DAI-bzw. GEN /
IS, erhalten nach der Hydrolyse mit
1M HCl bzw. konz. HCL
Abb. 4
0
10
20
30
40
50
ISGENDAI
MeOH-Extrakt
Zeit (min)
0
10
20
30
40
50
DAI GENIS
Aceto
nitrila
nte
il (%)
ACN-Extrakt
0 10 20 30 40 50 60
0
3
6
60
90
120
Zeit (min)
Absorp
tion 2
60 n
m (
mA
U)
0 10 20 30 40 50 60
0
3
6
60
90
120
0,0
0,6
1,2
1,8
Pe
akf
läch
en
verh
ältn
is D
AI b
zw.
GE
N /
IS
1M HCL konz. HCl
Extraktion
Methanol/Wasser (8:2) Acetonitril/Wasser (1:1)
Novasoy
Ultraschallbad (55°C, 2h)
Filtration (0,45 µm PVDF)
HPLC-DAD-Analyse
HydrolyseNovasoy-Extrakt
1M Salzsäure konz. Salzsäure
Wasserbad (85°C, 2h)
Neutralisation (mit 25% (v/v) Ammoniak)
Filtration (0,45 µm PVDF)
HPLC-DAD-Analyse
0 10 20 30 40
0
2
4
6
8
0 5 10 15 20 25 30 35
0
3
60
90
120
Zeit (min)
Ab
so
rptio
n 2
60
nm
(m
AU
)
ACN-Extrakt
10
20
30
40
50
DAIGEN
IS
Ace
ton
itrilan
teil (%
)
Zeit (min)
DAIGEN
IS
konz. HCl-Hydrolysat
10
20
30
40
50
Gruppe Extrakt Hyrolysat Extrakt Hydrolysat
DAI-Gehalt
(mg/Kapsel)
GEN-Gehalt
(mg/Kapsel)
1 1,67 ± 0,08 (4,7%) 36,08 ± 2,96 (8,2%) 0,79 ± 0,04 (5,1%) 30,83 ± 3,75
(12,2%)
2 0,80 ± 0,09 (11,3%) 16,23 ± 1,59 (8,9%) 0,39 ± 0,04 (10,3%) 13,17 ± 0,90 (6,8%)
3 kein IF kein IF kein IF kein IF
4 0,99 ± 0,06 (6,0%) 23,82 ± 3,43 (14,4%) 0,47 ± 0,03 (6,4%) 18,92 ± 0,90 (4,7%)
DAI -Gehalt
(mg/g)
GEN-Gehalt
(mg/g)
Novasoy 600 12,84 ± 0,32
(2,5%)
292,02 ± 16,23
(5,6%)
6,12 ± 0,10
(1,6%)
217, 71 ± 19,01
(8,7%)