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Das Cytoskelett eukaryotischer Zellen(ein dynamisches, filamentöses Netzwerk)

Vorlesung 2015

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

Netzwerk aus

fibrösen

Elementen(hier: nach Extraktion einer Karotten-Zelle in

Anwesenheit von Detergenz)

Struktur und Funktion von Cytoskelett-Komponenten

Mikrotubuli Mikrofilamente Intermediärfilamente

bei Tieren ! eventuell auch bei Pflanzen !

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Monomer: Protein mit endständigen globulären Bereichen und einem mittleren helikalen Bereich (ca. 300 Aminosäuren).

• Parallele Anordnung der Monomere im Dimer

• Antiparallele Anordnung zweier Dimere zum Tetramer

Intermediär-

filamente bilden

Netze aus!

Beispiel: Lamine

(nukleäre Lamina)

10-40 Kandidaten (in Arabidopsis!)

Intermediär-

filamente

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

Monomer

Dimer

Tetramer

Protofilament

Filament

Polarität!

Mitose

Nukleoplasma

Cytoplasma

EM-Aufnahme des Nukleus einer Tabak-Zelle mit Kernporen (Gefrierbruch-Technik).

Intermediärfilamente

Beispiel: Lamin-Netzwerk (und nukleäre Lamina)

From: Heese-Peck & Raikhel (1998). The nuclear pore complex. Plant Mol Biol. 38:145-162. Review.

Kernporen-Komplex

Netzwerk

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Aktin-Filamentestabilisieren und verändern die Zellform

geben Struktur (zusammen mit Microtubuli), steuern Bewegungen, vermitteln bei Zellteilung

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

„Plus“-Ende

„Minus“-Ende

„Plus“-

Ende

„Minus“-

Ende

G-Aktin

(offen)

F-Aktin

(geschlossen)

F-Aktin-

Filament

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

Mikrotubuli-

Struktur

Tubulin-Untereinheit

Dimere: α- und β-Tubuline bilden Heterodimere mit polarer Ausrichtung (haben dadurch plus und minus-Enden)

Vermitteln Zelluläre Bewegungen von Geißeln, Cilien und Organellen (via Motor-Proteine)

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• Cytoskelett-Elemente sind dynamisch(zeigen gleichzeitig Bildung und Zerfall)

• ihre Polymerisation/Depolymerisation wird durch Bindung und Hydrolyse von Nukleotiden vermittelt (ATP bei Aktin, GTP bei Mikrotubuli)

• Cytoskelett-Elemente wachsen polar (nur an einem Ende)

„Wachstumskurve“ eines

Cytoskelett-Elements

Dynamische Stabilität

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

Beispiele für „treadmilling“ (auf der Stelle treten - dynamische Stabilität)

Aktin-Filament

Mikrotubuli

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

WachsenGTP-gebundene Tubuliun-Dimere

SchrumpfenGDP-gebundene Tubuliun-Dimere

„Plus“-

Ende

„Minus“-

Ende

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Visualisierung des Cytoskeletts

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

HEUTE: stabile oder transiente Expression von Fusionsproteinen (GFP- oder RFP-Derivate)

Markierung mit fluoreszierenden Substanzen, die an polymerisiertes Aktin, Tubulin (oder deren freie Komponenten), bzw. assoziierte Proteine binden (wie MAPs = Microtubuli-Associated Proteins).

2. Direkt

Einbau markierter Komponenten

1. Indirekt

Mikro-Injektion markierter Komponenten

YFP-MAP4

Julia Frank, 2005

Micro-

tubuli

Transiente Expression in Tabak-Protoplasten (24 h)

chlorophyll merge Bright field merge

Protoplasten = Pflanzenzellen ohne Polarität (anders als im Gewebe)

MAP, Microtubule-

associated protein

YFP-mTalin

Actin

chlorophyll merge Bright field merge

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Die Orientierung der Mikrotubuli legt die Zellorientierung, Wandtextur und Dehnungsrichtung von wachsenden Pflanzenzellen fest.

Mikrotubuli und Wandtextur

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

Zur Erinnerung!

MOR1 (für Microtubule ORganization)

gehört zu einer evolutionär alten Gruppe von Microtubuli-assoziierten Proteinen (MAPs)

mor1-Mutanten zeigen kaum Zellstreckung!

From: Whittington et al. (2001) MOR1 is essential for organizing

cortical microtubules in plants. Nature 411: 610-613.

nur isotropes

Zellwachstum

Thermo-sensitiver

Phänotyp

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anti-Tubulin Immunfluoreszenz (nach 2 h bei 29°C)

Wildtyp mor1-1

mor1-Mutanten zeigen fragmentierte Mikrotubuli (Temperatur-abhängiger, konditionaler Phänotyp)

Nachweis: Fluorochrom-markierte Sekundär-

Antikörper nach Bindung an α-Tubulin Primär-Antikörper

MT

verkürzt

Signal

The microfibril length-regulation

hypothesis

Structural properties of cellulose microfibrils in

wild-type and microtubule-disrupted cells before

and during cell expansion (Wasteneys, 2004)

a, In wild-type, cortical microtubules are arranged parallel to each other at the cell periphery close to the PM. Cellulose microfibrils are produced by cellulose synthase complexes at the PM in a highly ordered arrangement parallel to cortical microtubules. Those microfibrils are long and strong enough to resist turgor pressure. Disrupted microtubules in the mor1

mutant (grown at 29°C). Although cortical microtubules are disorganized, cellulose synthase complexes continue to produce cellulose microfibrils parallel to one another. Structural anomalies result in relatively short microfibrils.

b, In wildtype, cellulose microfibrils are composed of long β1,4-linked glucan chains. Long microfibrils require a high

degree of cellulose polymerization and crystallization, and/or

a relatively long life span of cellulose synthase complexes. These long microfibrils move apart while remaining parallel to each other during expansion and cells undergo anisotropic growth. In case of microtubule-disrupted cells, cellulose microfibrils might be short due to: (1) reduced cellulose crystallinity, (2) a low degree of cellulose polymerization or (3) short life span of cellulose synthase complexes. Microfibrils produced in the absence of well-organized cortical microtubules may not have enough mechanical strength to resist turgor pressure during the expansion, leading to fragmentation of microfibrils. During expansion, short microfibrils move apart from each other both in the direction of their orientation as well in the normal longitudinal direction, causing cells to lose growth anisotropy.

From:

Wasteneys & Fujita (2006). Establishing and maintaining axial growth: wall mechanical properties and the cytoskeleton. J. Plant Res. 119: 5-10.

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Fig. 8. Lechner et al. (2012) J Cell Sci 125: 4812-4821

Putative microtubule-binding domain and interaction with microtubules. (A) The N-terminal sequence of MOR1 was aligned with three other representatives of the subgroup with five TOG domains of the XMAP215

family using ClustalW2. MOR1 has an additional insert of five amino acids containing a putative microtubule-binding motif ‘KLLK’ (red box). (B) (B) The model shows the interaction of the first two TOG domains (blue) with a protofilament (grey). The putative microtubule-binding

domain is shown in red. The N-terminal tag (purple) inhibits binding to the protofilament, whereas the wild-type construct has moderate affinity. The mor1-1 point mutation (red X) increases the affinity for microtubules. (C) The binding affinity of the TOG12 constructs has different effects on microtubule dynamics in vitro. At the microtubule plus-end, constructs with an N-terminal tag have no effect. The wild-type construct can promote microtubule growth and diffuse along the microtubule lattice. Constructs with the mor1-1 point mutation bind too strongly to microtubules and therefore do not diffuse along the microtubule lattice. TOG12mor1-1 is unstable when not bound to microtubules (faint version) but when strongly bound to microtubules it inhibits shrinkage.

Die N-terminale TOG-Domäne von MOR1 moduliert die Affinität für Microtubuli-Polymere

less dynamic = more staticless dynamic = more staticmasked

Organell-Verankerung (allgemein)

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

Migration

Cytoskelett-Faser

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Motor-Proteine:

vermitteln bei zellulären Bewegungen, bei Organellwanderung und Vesikel-Transport am Cytoskelett

Cytokinese (Zellbewegung)

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

„Motor-Proteine“ sind Cytoskelett-assoziierte, mechano-

chemische Enzyme, die chemische Energie (ATP, GTP) in

mechanische Arbeit konvertieren können.

Motor-Protein Superfamilien:

• Dynein & Kinesin

• Akto-Myosin

Cytokinese (Zellbewegung)

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• Kinesin ist ein „Plus“-Ende-Motor• Dynein ist ein „Minus“-Ende-Motor

Dynein und Kinesin bewegen sich an Mikrotubuli fort

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

kontrolliert in Pflanzen die Zellform und vermittelt beim Vesikel-Transport

Akto-Myosin II

(ähnelt dem Muskelsystem)

Myosin-Köpfe bewegen sich (angetrieben durch ATP-Spaltung) an Aktin-Filamenten entlang

Das Akto-Myosin-System

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

Aktin-

Verankerung an

der PM

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Chloroplasten-Bewegungen werden durch das Akto-Myosin-System vermittelt

Schwachlicht Starklicht

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

Zeigen Chloroplasten auch im Laserlicht des confokalen Mikroskops!

Im Schwachlichtrichten sich die Chloroplasten der fädigen Grünalge Mougeotia

horizontal zum Licht aus, bei Starklicht

dagegen vertikal.

Optimierung der Lichtausbeute, Vermeidung von Lichtschäden

(� Photosynthese).

Beispiel: Chloroplasten-Bewegungen einer Grünalge

Aktin-Filamente

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

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Einseitiges Wachstum als Resultat von gerichtetem Vesikel-Transport

Polarer Transport

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

Polarität

YouTube video:

„fantastic vesicle traffic“

http://www.youtube.com/watch?v=7sRZy9PgPvg&index=6&list=PL8C12803AFDAC2272

GFP-illuminated directional vesicle transport supporting polar root hair growth

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Beim polaren Wachstum von Pollenschläuchen bewegen sich Vesikel an Aktin-Filamenten (Transportbahnen) entlang zum wachsenden Pol.

Ähnliches geschieht beim polaren Wachstum von Wurzelhaaren.

� einseitige Sekretion von Zellwandmaterial an der Spitze

In Pflanzen: nur bei Pollenschläuchen und Wurzelhaaren!

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

„Pol“

weichhart

Vorgänge während des polaren Spitzenwachstums

Figure 1. Images of Living Lily Pollen Tubes Showing Different Structures or Activities.

From: Hepler et al. (2013) Control of cell wall extensibility during pollen tube growth. Mol Plant 6: 998-1017.

10 μm

DIC: Nomarski differential interference contrast

PI: propidium iodide, stains the cell wall

Life-act: GFP-based stain of F-actin

FM4-64: lipid dye (sterols), stains the PM and vesicles

(inverted cone)

Fura-2 dextran, stains free Ca2+

(steep, tip-focused gradient)

BCECF: labelled dextran, pH-reporterpH 6.8

pH 7.5

Mito-FM: Mitotracker, stains respiring mitochondria

NAD(P)H fluorescence can be imaged directly (strongest signal in the region of mitochondria)

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Periphere (cortikale) Mikrotubuli bestimmen:

• Wandtextur (Dehnungsrichtung), Zellstreckung

• Orientierung von Zellteilungen

Periphere Mikrotubuli

Mikrotubuli und Zellteilung

Tierische Zelle Pflanzenzelle

Ein

kontraktiler

Ring aus

Aktin-

Filamenten

schnürt die

Zelle in der

Mitte ein

Mikrotubuli

bilden den

Phragmoplasten

(organisieren die

neue Zellplatte)

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

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Mikrotubuli geben die Lage der neuen Zellwand vor

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

MT hinter-

lassen eine

unsichtbare

Markierung

Definierte

Zellteilungs-

ebene

Fluoreszenz-Aufnahmen der Zellteilung (fixierte Wurzelzellen). Entwicklung der mitotischen Spindel aus kortikalen Mikrotubuli in gelb bzw. grün (DNA in blau). (A-D) Ausbildung des Prä-Prophase-Bandes; (E-H) die Prophase-Spindel bildet sich beidseitig des (sich auflösenden) Nukleus aus; (G,H) das Prä-Prophase-Band verschwindet (Pfeile); (I-K) vollständige Ausbildung der Spindel nach Auflösen der Kernhülle und Anordnung der kondensierten Chromosomen in der Äquatorialebene (roter Pfeil).

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

Mikrotubuli – Stadien der Zellteilung in Pflanzen

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Mikrotubuli (MT) & Zellteilung (schematisch)

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

Re-

Arrangement

kortikale MT

Der Golgi-Apparat

liefert das Material für

die neue Zellwand

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

Pflanzenzelle

Phragmoplast

Zellplatte

Neue Zellwand

durchbrochene

Zellplatte

tubuläres Netz-

werk (TN)

Golgi-Vesikel

unsichtbare

Markierung

Verbindung

mit

bestehender

Wand

Vesikelfusion

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Die Orientierung der peripheren Mikrotubuli kann durch äußere Signale, die in zellulären Signalkaskaden münden (Ca2+-Verschiebungen, Protein-Kinase-Kaskaden) moduliert werden.

Die Orientierung der Mikrotubuli wird reguliert

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

C = Chloroplast

N = Nukleus

V = Vakuole

In Wurzelzellen sind die MT transversal

(quer zur Dehnungs-richtung) orientiert.

Protein-Kinasen gehemmt (mit Stauroporin)

⇒ „Streutextur“ der MT

Hemmung von Protein-Kinasen stört die MT-Orientierung

(Resultat: isotropes Wachstum)

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Beispiel:

In wachsenden Arabidopsis-Keimlingen strecken sich die Zellen in Richtung der Längsachse - festgelegt durch die transversale Orientierung der Mikrotubuli(und Cellulose-Stränge).

Das Phytohormon Ethylen verursacht eine 90o-Drehung der Mikrotubuli (aus der Quer- in die Längsrichtung).

Dadurch können sich die Zellen nur noch lateral zur Sprossachse dehnen – und die Keimlinge werden dick und kurz (bilden Hypocotyl-Haken).

Eine Ethylen-insensitive Mutante wächst dagegen normal!

Beispiel für ein Mutanten-Screening

Vorlesung 2016 Abb. 22.7 aus Taiz/Zeiger „Physiologie der Pflanzen“ Spektrum Verlag.

Phytohormon-Regulation der Mikrotubuli-Orientierung

Ethylen-Rezeptor-Kinase ETR1

Mikrotubuli-Rearrangement

H2C=CH2

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

Ethylen

C2H4 ist ein

hydrophobes Gas

und kann

Membranen leicht

passieren!

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Rezeptor-Dimerisierung über Disulfidbrücken

(zwischen zwei Cys-Resten, C) im ER-Lumen wird durch oxidierende Bedingungen begünstigt.

From: Ma et al. (2006) Subcellular localization and

membrane topology of the melon

ethylene receptor CmERS1.

Plant Physiol. 141: 587-597.

Ethylen-Rezepor (Topologie)

C-terminale Effektor-

Domänen

(für CTR1-Bindung)

N-terminale Cysteine(D & E, saure, K & R basische As)

⇒ negative inside rule

Beispiel: ERS (ETR und EIN mit ähnlicher Struktur)

Hypothetisches Modell der EIN2-Wirkung im Ethylen-Signalweg

Ji & Guo (2013) From Endoplasmic Reticulum (ER) to Nucleus: EIN2 bridges the gap in ethylene signaling.

Mol. Plant 6: 11-14 (RESEARCH HIGHLIGHT).

Welcher Zusammenhang besteht zwischen Ethylen und MT-Umlagerung ?!

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Mechano-Perzeption an der Zellwand (Modell)

Cellulose-Mikrofibrillen stehen in Kontakt mit transmembranen Proteinen, die auf der Innenseite mit peripheren Mikrotubuli verbunden sind (z.B. Cellulose-Synthase-Komplexe via CSI1 u.a.)

⇒ mechanische Zellwand-Verformung löst eine Cytoskelett-vermittelte Reaktion aus (z.B. bei Wind, Berührung, etc.)

Vorlesung 2016

Abb.: Buchanan et al. (2000) „Biochemistry & Molecular Biology of Plants“, Amer. Soc. of Plant Physiologists.

Figure 2. Working model for

microtubular function in the

decoding of stress signatures.

Microtubules with elevated

stability can act as (mechano-)

susceptors, and microtubules

with elevated dynamics can

directly perceive mechanical

stress. Osmotic stress, touch or

wounding stress and cold stress

are predicted to interact

differently with the susceptor

and perceptor populations of

microtubules, leading to different

temporal read-outs specific for

the respective quality of input.

From: Peter Nick (2013), The

Plant Journal (special issue).

Microtubules,

stress signaling

& responses

ROS (reactive

oxygen species)

Legend: CMF, cellulose microfibrils; TMP, transmembrane protein; MSC, mechano-sensitive (Ca2+) channel; PA, phosphatidic acid (from phosphatidylcholine by) PLD, phospholipase D; NADPox, NADPH oxidase; O2.

-, superoxide; H2O2, hydrogen peroxide.

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Zusammenfassung:

Kontrolle von:

• Zellform

• Zellbewegung

• Zellorientierung

Verankerung und Bewegung von Organellen

Vermittlung von gerichtetem Vesikel-Transport

Vermittlung bei Mechano-Perzeption (Außenreize)

Funktionen des Cytoskeletts