Das Hämocyanin des

"Molekulare Tierphysiologie"

F1-Praktikum

„Qualitativer Nachweis der

Hämocyanin-Expression bei Astacus

leptodactylus“

Das Hämocyanin des

Flusskrebses Astacus leptodactylus

Praktikum Molekularbiologie 2

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Astacus leptodactylus, Galizischer Sumpfkrebs, Galizierkrebs Klasse: Crustacea (Krebstiere) Ordnung: Decapoda (Zehnfußkrebse) Familie: Astacidae Gattung: Astacus

Gefährdung:

Keine Der Galizierkrebs nimmt eine Sonderstellung unter den eingeschleppten Krebsen ein. Da er eine europäische Art ist, ist er ebenfalls durch die Krebspest bedroht.

Beschreibung:

Die Grundfärbung ist meist hell sandfarben (hellbraun). Er ist schlanker wie unsere einheimischen Krebse gebaut. Das wichtigste Merkmal sind die beiden langgestreckten Scherenfinger. Die Scheren sind nicht eingebuchtet. Die Seiten des Carapax vor und hinter der Nackenfurche sind rauh und mit kleinen Dornen und Körnern besetzt. Er hat zwei Paar Augenleisten. Das hintere Paar trägt an der Spitze einen kleinen Dorn. Seitlich am Körper, direkt hinter den Nackenfurchen, ist mindestens ein spitzer Dorn vorhanden. In der Literatur werden Größen von 15 (- 30) cm angegeben.

Verbreitung:

Um die riesigen Bestandslücken, die die Krebspest Anfang des Jahrhunderts gerissen hatte, aufzufüllen, wurde er aus Osteuropa eingeführt. Er wird nur in wenigen Gewässern gefunden, in die er in der Regel als Ersatz für den Astacus astacus, Edelkrebs eingesetzt worden war. Im Bodensee und der Umgebung existiert schon seit relativ langer Zeit ein Bestand, der aber nicht gezielt genutzt wird.

Lebensweise:

Sein Lebensraum ist Kalt- und Süßwasser. Der Astacus leptodactylus, Galizierkrebs bewohnt meist klare Fließgewässer von Flüßen bis Seen. Krebse verbergen sich tagsüber in selbst gegrabenen Uferhöhlungen oder unter Steinen und kriechen zur Dämmerung hervor. Jungkrebse finden sich oft zwischen den Wasserpflanzen, die sie zur Nahrungsaufnahme abweiden.

Nahrung:

Die Hauptnahrung ist kleines Wassergetier. Er geht aber auch gerne an Aas wie kranke oder tote Fische und ist somit eine Art Gewässerpolizei, die für die Pflege der Gewässer sorgt. Im Aquarium kann an sie mit Lebendfutter, Kleintieren, Regenwürmern, Süßwasserfischfleisch (kleingeschnittene Streifen) oder Rinderherz füttern.

Fortpflanzung:

Die Weibchen tragen ihre Eier bis zur Entwicklung schwimmender Larven an den hinteren Gliedmaßen mit sich herum. Zoea-Larve.


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Allgemein:

Im Handel werden hauptsächlich diese Krebse aus Südeuropa eingeführt und als Speisekrebse angeboten. Überwiegend kamen sie aus der Türkei, bis auch dort die Krepspest über den Pacifastacus leniusculus, Signalkrebs eingeschleppt wurde und große Schäden in den Zuchtanlagen hervorrief. Auch bei uns wurden sie gezielt in stehende Gewässer eingesetzt. Erst in neuester Zeit wird bei uns wieder der einheimische Astacus astacus, Edelkrebs, Flußkrebs vermehrt gezüchtet und angeboten.

Haltung:

Die Temperaturen für diese verträglichen Krebse sollten in einem mittelgroßen Aquarium 14 - 18 Grad C betragen. Was im Sommer die meisten Probleme macht ! Es muß mit vielen Höhlen und Versteckmöglichkeiten eingerichtet werden. Eine große Pumpe für sauberes, sauerstoffreiches Wasser ist unbedingt nötig. Dann sind sie gut zu halten. Sie sind auch für Anfänger geeignet. Mit Kaltwasserfischen vertragen sie sich. Der Krebs hat fünf Paar Laufbeine, von denen das vorderste Paar zu einem Paar kräftiger Scheren umgebildet ist. Mit diesen Scheren erbeutet der Flusskrebs seine Beute oder vertreibt Artgenossen aus seinem Revier. Mit den Mundwerkzeugen und den sogenannten Kieferfüßen zerreißt der Flusskrebs die Beute, die er mit den Scheren gefangen hat.

Am Hinterkörper trägt der Flusskrebs weitere fünf Paar Beine (das Weibchen besitzt nur vier). Ein weiteres Paar sogenannte Schwanzbeine bilden zusammen mit dem Schwanz einen fünfblättrigen Schwanzfächer. Wird der Flusskrebs angegriffen (seine natürlichen Feinde sind Raubfische), dann schlägt er seinen Schwanzfächer unter den Bauch. Dadurch erzeugt er einen Rückstoß, der ihn rückwärts aus der Gefahrenzone bringt.


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Elektrophorese

Polymerase Ketten

Reaktion

Reverse Transkription


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Gefahrenhinweise Ethidiumbromid ist sehr giftig, mutagen und umweltgefährdend ! Deshalb: - jegliche Exposition mit Ethidiumbromid vermeiden - ordnungsgemäße Entsorgung EtBr- haltiger Abfälle Wie können Sie eine Exposition mit Ethidiumbromid vermeiden ? Vermeiden Sie den Umgang mit Ethidiumbromid in kristalliner Form! Das Einatmen von Stäuben lässt sich durch den Einsatz von Stammlösungen oder Tabletten vermeiden. Schützen Sie Ihre Hände ! Achtung! Bei Arbeiten mit Ethidiumbromid bitte keine Einmalhandschuhe aus Latex tragen. Einmal-handschuhe aus Latex werden von der Ethidiumbromid-Lösung in kurzer Zeit durchdrungen. (Ver-suchsergebnis der Abt. Arbeitssicherheit an der A. L. Universität Freiburg). Bei Arbeiten mit Ethidiumbromid sind Einmalhandschuhe aus Nitril zu tragen !! Sie besitzen eine höhere Beständigkeit und zusätzlich haben sie den Vorteil, mechanisch stabiler zu sein und kein allergenes Potential zu besitzen. Prinzipiell gilt: Einmalhandschuhe sind unmittelbar nach Kontakt mit Ethidiumbromid wegzuwerfen (Sondermüll !) Die Hände sind gründlich zu waschen! Arbeiten mit UV-Licht Photochemische Reaktionen, Betrachtung von Dünnschichtchromatogrammen unter einer UV-Lampe o.ä.

Gefahren für Mensch und Umwelt

Bezeichnung der Gefahren: UV-Strahlung reizt und schädigt die Augen (Gefahr der Erblindung) und kann Hautreizungen hervor-rufen. Hochleistungs-UV-Strahler erzeugen beim Betrieb unter Einwirkung von Sauerstoff Ozon.

Schutzmaßnahmen und Verhaltensregeln

UV-Lampen dürfen nur mit dem dazugehörenden Vorschaltgerät (Transformator) verwendet werden. UV-Lampen, bes. Hochleistungslampen, werden sehr warm und müssen daher mit einer effektiven Kühlung betrieben werden. Bei Arbeiten mit brennender Lampe UV-Schutzbrille tragen! Die Schutzbrille muss abgestimmt sein auf Leistung und Wellenlänge der verwendeten Lichtquelle. Nicht in die brennende Lampe schauen! Belichtungsapparaturen abdecken, lichtdichte Ummantelung (nicht brennbar) verwenden, wie z.B. Alufolie. Bei ozonentwickelnden Hochleistungslampen muss im Abzug oder mit einer wirksamen Quellenabsaugung gearbeitet werden.

Erste Hilfe

Nach Augenkontakt: Bei Verblitzen der Augen diese durch breite Binde ruhigstellen, Verletzten in die Augenklinik bringen lassen.


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Einleitung

Hämocyanine der Arthropoden

Hämocyanine sind große kupferhaltige Proteine, die in der Hämolymphe vieler Arthropoden Sauerstoff von den respiratorischen Epithelien zu den inneren Organen Transportieren (MARKL and DECKER, 1992; VAN HOLDE and MILLER, 1995). Die Hämocyanine der Arthropoden bilden stets Hexamere oder Oligohexamere (1 bis 8 x 6-Struktur) aus ähnlichen oder identischen Untereinheiten (Abb. 1). Jede Untereinheit umfasst etwa 620 bis 660 Aminosäuren (entspricht etwa 70 – 80 kDa). Jede Untereinheit kann ein O2-Molekül mittels zweier Kupferionen (Cu+) binden, die jeweils durch drei Histidine der Proteinkette koordiniert werden (Abb. 2). Aufgrund dieser Struktur des aktiven Zentrums werden die Hämocyanine den so genannten "Typ 3"-Kupferproteine zugerechnet. Hierzu gehören neben den Hämocyaninen der Arhtropoden, die Hämocyanine der Mollusken, verschiedene Tyrosinasen und Catecholoxidasen. Röntgenstrukturanalysen der Hämocyanine des Pfeilschwanzkrebses Limulus polyphemus (HAZES et al., 1993; MAGNUS et al., 1994) und der Languste Panulirus interruptus (GAYKEMA et al., 1984; VOLBEDA und HOL, 1989) ergaben, dass die Untereinheiten etwa nierenförmig sind und sich aus drei Domänen zusammensetzen (Abb. 3). Die erste Domäne (~150-180 Aminosäuren) besteht aus einem Bündel von α-Helices und ist wahrscheinlich wichtig für die Kooperativität der Sauerstoffbindung, weil sie das aktive Zentrum schützt. Domäne 2 (~220 Aminosäuren) besteht ebenfalls aus α-Helices, deren antiparallele Anordnung typisch für globuläre Proteine ist (PRESNELL und COHEN, 1989). Sie ist am stärksten konserviert und trägt das aktive Zentrum mit den beiden Kupferatomen. Domäne 3 (~260 Aminosäuren) enthält mehrere ß-Faltblätter, die ein siebensträngiges, antiparalleles "Beta-Barrel“ bilden, welches ein allgemeines Motiv einer stabilen Supersekundärstruktur darstellt, das in vielen globulären Proteinen vorkommt (GAYKEMA et al., 1984). Diese Domäne dient der Stabilisierung der gesamten Tertiärstruktur (MARKL and DECKER, 1992). Kontakte zwischen den Untereinheiten

Abb. 1 Quartärstruktur der Arthropoden-hämocyanine nach MARKL and DECKER (1992): (a) 2 × 6 Hämocyanin vieler dekapoden Crustacea (z.B. Homarus americanus), (b) 2 × 6 Hämocyanin vieler Spinnen (z. B. Cupiennius salei), (c) 4 × 6 Hämocyanin einiger Garnelen (z.B. Callianassa californiensis), (d) 4 × 6 Hämocyanin vieler Arachniden (z.B. Eurypelma californicum), (e) 2 × 6 Hämo-cyanin des Fangschreckenkrebses Squilla mantis, (f) 6 × 6 Hämocyanin der Myriapoden (z.B. Scutigera coleoptrata), (g) 8 × 6 Hämocyanin von Limulus polyphemus. Abb. 2: Struktur eines binukleären Typ 3-Kupferbindungszentrum.


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erfolgen in der Regel durch nichtkovalente Bindungen, obwohl einige Hämocyanine wie das der Spinne Cupiennius salei eine oder mehrere dimere Untereinheiten enthalten, die über Disulfidbrückenbindungen verbunden sind (MARKL, 1980; MARKL and DECKER 1992; VAN HOLDE and MILLER, 1995)

Obwohl Hämocyanine wohl vor allem wegen ihrer Funktion beim Transport von O2 bekannt sind, scheinen sie auch andere Rollen im Organismus zu übernehmen (Tabelle 1; vergl. BURMESTER, 2002). So wird Hämocyaninen eine Rolle als Speicherproteine (DEPLEDGE and BJERREGAARD, 1989), bei der Härtung der Kutikula (PAUL et al., 1994), als enymatische Phenoloxidasen (DECKER and TUCZEK, 2000; NAGAI et al., 2001; DECKER and JAENICKE, 2004), sowie als Quelle für antimikrobielle Peptide (DESTOUMIEUX-GARZON et al., 2001; LEE et al., 2003) zugeschrieben. In den letzten zehn Jahren konnte ferner gezeigt werden, dass andere Arthropoden-Proteine signifikante Sequenzübereinstimmungen mit den respiratorischen Hämocyaninen aufweisen, jedoch andere Funktionen im Organismus übernehmen (Tabelle 1; vergl. BEINTEMA et al., 1994; BURMESTER and SCHELLER, 1996; BURMESTER, 2001; Übersichtsartikel: BURMESTER, 2002). Gemeinsam mit den Hämocyaninen werden diese Proteine zur "Hämocyanin-Superfamilie" zusammengefasst (Übersichtsartikel: BURMESTER, 2002). Neben den Hämocyaninen umfasst diese Protein-Superfamilie die Phenoloxidasen (Monophenol, L-Dopa:O2 Oxidoreductase; EC 1.14.18.1) der Arthropoden. Phenoloxidasen sind sauerstoffumsetzende Enzyme des Melaninstoffwechsels (Tyrosinasen) und innerhalb der Arthropoden an der Sklerotisierung der Kutikula, der humoralen Immunantwort und der Wundheilung beteiligt (SÖDERHÄLL and CERENIUS, 1998; CERENIUS and SÖDERHÄLL, 2004). Wie die Hämocyanine bilden die Arthropoden-Phenoloxidasen Hexamere (JAENICKE and DECKER, 2003) und das Typ 3-Kupferzentrum ist konserviert (FUJIMOTO et al., 1995; KAWABATA et al., 1995; BURMESTER and SCHELLER, 1996). Die Primärstruktur der Phenoloxidasen der Arthropoden weist kaum Ähnlichkeiten mit den ebenfalls kupferhaltigen Tyrosinasen der übrigen Organismen auf (Übersichtsartikel: VAN GELDER et al., 1997; JAENICKE and DECKER, 2004). Auf der anderen Seite fehlen in den Arthropoden die entsprechenden Tyrosinasen, wie sich sonst in allen bisher untersuchten Pro- und Eukaryoten gefunden wurden.

Abb. 3. Untereinheitenstruktur der Hämo-cyanine. Schematisierte 3D-Struktur einer Hämocyaninuntereinheit der Languste Panulirus interruptus (GAYKEMA et al., 1984). Die Domäne 1 ist grün, die Domäne 2 rot, die Domäne 3 blau. Die beiden Kupferatome (Pfeil) sind dunkelblau einge-färbt.


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Ziel des Kurses

Sie sollen die mRNA für das Hämocyanin von A. fluviatus mittels RT-PCR nachweisen. Dafür wird zunächst Gesamt-RNA aus der Mitteldarmdrüse des Krebses gewonnen, eine spezifische reverse Transkription durchgeführt und die cDNa mittels PCR amplifiziert. Die Amplifikate werden dann gelektrophoretisch analysiert

Verwendete Techniken

• RNA-Isolation • Reverse Transkription • Polymerase-Kettenreaktion (PCR) • DNA-Gelektrophorese

Ablauf

• Vormittags:

o RNA-Präparation o Vorbereitung der RT-PCR

• Mittagspause • Nachmittags:

o RT-PCR o DNA-Gelektrophorese o Auswertung


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RNA-Präparation

RNA

Sie erhalten ein Gewebestück (Mitteldarmdrüse). Die RNA wird mit Hilfe des "E.Z.N.A. RNA Kit" der Firma PEQLAB gereinigt. Dabei wird das Gewebe lysiert. Die RNA wird an eine Säule (Glasmatrix) gebunden. Durch mehrmaliges Waschen wird diese von den übrigen Zellinhaltsstoffen getrennt und anschließend in sterilem Wasser eluiert. Das Kit der Firma PEQlab bietet gegenüber den "klassischen" RNA-Reinigungsmethoden den Vorteil, dass aufwendige Fällungsschritte vermieden werden können und keine teilweise hochtoxischen Sustanzen verwendet werden. Andererseits ist die Ausbeute im Allgemeinen deutlich geringer. Zur Vermeidung von RNase-Kontaminationen, die zum Abbau der RNA führen, ist bei Arbeiten mit RNA unbedingt auf abolute Sauberkeit zu achten!!!! Verwenden Sie Handschuhe und nur sterilisierte Pipettenspitzen und Lösungen. Halten Sie, wenn immer möglich, die RNA auf Eis. Arbeiten Sie zügig.

Lösungen

• "E.Z.N.A. RNA Kit" der Firma PEQLAB • Steriles, RNase-freies Wasser, • 70% EtOH werden zusätzlich gestellt.

Anleitung

Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt. In Einer für alle!

• Gewebestück (Mitteldarmdrüse, in flüssigem N2 Schock-gefroren) wiegen und in 800 µl komplettierten TRK Lyse-Puffer/30 mg Gewebe (20 µl β-Mercaptoethanol auf 1 ml MRL) lysieren (Ultrathurrax).

• Restliche Gewebebrocken werden durch kurzes Zentrifugieren (20 sec, 3000rpm) abgetrennt.

Aliquotierung der lysierten Probe: 9 Gruppen – 9 Proben

• Überführen Sie das lysierte Ggewebe in ein 2,0 ml Eppendorf-Röhrchen. Denken Sie daran, Ihre Probe stets zu beschriften.

• Geben Sie 800µl 70%iges Ethanol zu und mischen Sie die Probe durch Vortexen.

• Stellen Sie ein HiBind-Säulchen in eines der mitgelieferten 2 ml Sammel-Röhrchen und tragen Sie die Probe auf. Zentrifugieren Sie 15 sec bei Maximalgeschwindigkeit in der Tischzentrifuge. Das maximale Beladungsvolumen einer Säule beträgt 800µl. Durch mehrmaliges Zentrifugieren und nochmaliges Beladen können Sie das ganze Volumen durch die Matrix zentrifugieren. Die RNA bindet an die Säule. Der Durchfluß wird verworfen.

• Die gebundene RNA wird nun gewaschen. Stellen Sie dazu das Säulchen zurück und pipettieren Sie 750 µl Waschpuffer I (aus Kit) dazu und zentrifugieren Sie erneut 15 sec bei Maximalgeschwindigkeit. Der Durchfluß wird verworfen.

• Überführen Sie die Säule in ein neues 2 ml Röhrchen. Geben Sie 500 µl Waschpuffer II (aus Kit) hinzu und zentrifugieren Sie wie oben. Verwerfen Sie den Durchfluß und wiederholen Sie den Waschschritt. Der Durchfluß wird erneut verworfen.

• Stellen Sie die Säule in das geleerte Zentrifugenröhrchen zurück und zentrifugieren Sie 1 min bei maximaler Geschwindigkeit. Dieser Schritt dient zur Trocknung der Säule und Enfernung des restlichen Waschpuffers.


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• Zur Elution der RNA von der Säule stellen Sie zunächst das Säulchen in ein steriles 1.5 ml Eppendorf-Röhrchen und geben Sie 100 µl steriles H2O hinzu. Zentrifugieren Sie 1 min bei Höchstgeschwindigkeit.

• Die gereinigte RNA befindet sich nun in Wasser (Probe auf Eis halten!). Beschriften Sie die Probe.

• Quantifizierung der RNA durch Messung der optischen Dichte bei 260nm

RT-PCR

Die reverse Transkription

Für den Nachweis einer spezifischen mRNA sind im Allgmeinen zwei Methoden sehr gebräuchlich, Northern Blotting/Hybridisierung oder RT-PCR (reverse Transkription). Da RT-PCR äußerst sensitiv und schnell durchführbar ist, ist heutzutage diese Methode sehr weit verbreitet. Man kann hier entweder spezifisch „eine“ bestimmte mRNA in cDNA umschreiben oder allgemein einen Pool an mRNA in cDNA revers transkribieren. Diese enzymatische Reaktion wird durch virale reverse Transkriptasen, häufig MMuLV-RT, in vitro durchgeführt. Die synthetisierte cDNA wird dann in der PCR mittels eines zweiten Primers amplifiziert und kann so qualitativ nachgeiesen werden.

Die PCR Mit Hilfe der „polymerase chain reaction“ (PCR) ist es möglich, DNA-Abschnitte zu vervielfältigen. Hierzu benötigt man als "Starthilfe" sogenannte Oligonukleotidprimer. Dabei handelt es sich um kurze einzelsträngige DNA-Moleküle, die komplementär zu den Enden einer definierten Sequenz sind. Die Taq Poly-merase, eine thermostabile DNA-Polymerase, verlängert ausgehend von diesen Pimern in Anwesenheit von Nuk-leotiden und unter geeigneten Reaktionsbedingungen die

einzelstängige DNA-Matrize. Wiederholt man diese Reaktion mehrfach, so erhält man theoretisch z.B. nach 35-facher Wiederholung ca. 235 Kopien eines spezifischen DNA-Abschnittes.


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Lösungen QIAGEN OneStep RT-PCR Kit

• QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix: Omniscript Reverse Transcriptase, Sensiscript Reverse Transcriptase und HotStarTaq DNA Polymerase, in Lagerungspuffer: 20 mM Tris·Cl, 100 mM KCl, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 0,1 mM EDTA, 0,5 % (v/v) Nonidet® P-40, 0,5 % (v/v) Tween® 20, 50 % (v/v) Glycerol, Stabilisator; pH 9,0 (20 °C)

• QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer: 5x konzentriert; enthält Tris·Cl, KCl, (NH4)2SO4, 12,5 mM MgCl2, DTT; pH 8,7 (20 °C)

• Q-Solution: 5x konzentriert • dNTP-Mix: Jeweils 10 mM an dATP, dCTP, dGTP und dTTP; hochreine Qualität • RNase-freies Wasser: Hochreine Qualität, PCR-geeignet

Primer: Gen spezifische Primer RNase-Inhibitor (RNase-Inhibitor ist ein 50-kDa-Protein, das sowohl die RNasen A, B und C als auch RNasen aus humanem Plazentagewebe stark inhibiert. Durch RNase-Inhibitor wird das Risiko eines RNA-Abbaus während des Experiments minimiert).

Anleitung

Die Verteilung der PCR-Ansätze

Gruppen

PCR

1-3 4-6 7-9

Primer A +

Primer B

AlH for primer3 +

AlH rev primer3

AlH for nti +

AlH rev nti

PacifAstacus for1 +

PacifAstacus rev1 Q-Solution -

Denaturierung Zeit/Temp 10 Sekunden/94°C Annealing Zeit/Temp 30 Sekunden/58°C Elongation Zeit/Temp 2 Minuten/72°C

Zyklen 35 x

• Die im QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix enthaltene HotStarTaq DNA Polymerase benötigt eine initiale Aktivierung durch einen Inkubationsschritt von 15 min bei 95 °C (siehe


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Schritt 6 dieses Protokolls). Dieser Inkubationsschritt inaktiviert gleichzeitig die Reversen Transkriptasen. Beginnen Sie nicht eher mit dem Aktivierungsschritt, bevor die RT-Reaktion beendet ist.

• Der QIAGEN OneStep RT-PCR Kit ist für die Verwendung mit genspezifischen Primern in einer Endkonzentration von 0,6 µM vorgesehen. Der Gebrauch von Oligo-(dT)-Primern oder Random-Oligomeren wird nicht empfohlen, da dies zur Amplifikation unspezifischer Produkte führen könnte.

• Setzen Sie alle Reaktionen auf Eis an. • Stellen Sie sicher, dass der Thermocycler auf 50 °C vorgeheizt ist, bevor Sie die Proben

hineinstellen. • Durch den 5fach konzentrierten QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer wird eine

Endkonzentration von 2,5 mM MgCl2 im Reaktionsansatz eingestellt, was in den meisten Fällen zufrieden stellende Ergebnisse liefert.

• Stellen Sie sicher, dass während der RNA-Präparation und beim Ansetzen der RT-PCR RNase-freie Bedingungen gegeben sind.

Durchführung ohne Q- Solution

1. Tauen Sie Template-RNA, Primerlösungen, dNTP-Mix, 5x QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer und RNase-freies Wasser auf; stellen Sie alle Reagenzien auf Eis.

Es ist wichtig, die Lösungen vor Gebrauch gründlich zu mischen, um lokale Konzentrationsunterschiede der Salze zu vermeiden.

2. Stellen Sie einen Master-Mix gemäß Tabelle 1 her.

Der Master-Mix enthält typischerweise alle für die RT-PCR benötigten Komponenten außer der Template-RNA. Das Volumen des Master-Mix sollte 10 % größer sein als die für alle Reaktionsansätze benötigte Menge..

3. Mischen Sie den Master-Mix und pipettieren Sie entsprechende Volumina in PCR-

Reaktionsgefäße.

Mischen Sie gründlich, aber vorsichtig, z. B. durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren des Master-Mix.

4. Geben Sie die Template-RNA (= 2 µg/Reaktion) in die PCR-Reaktionsgefäße.


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Sie können den QIAGEN OneStep RT-PCR Kit mit Gesamt-RNA, Messenger-RNA oder viraler RNA als Template verwenden.

5. Wenn Sie einen Thermocycler mit beheizbarem Deckel benutzen, verwenden Sie kein Mineralöl und fahren Sie im Protokoll mit Schritt 6 fort. Ansonsten überschichten Sie den Ansatz mit ca. 50 µl Mineralöl.

6. Programmieren Sie den Thermocycler gemäß dem in Tabelle 2 wiedergegebenen Programm.

Das in Tabelle 2 wiedergegebene Programm ist ein typisches Thermocycler-Programm. Es beinhaltet Schritte sowohl für die Reverse Transkription als auch für die PCR. Berücksichtigen Sie beim Programmieren des Thermocyclers die Angaben des Herstellers. Der Amplifikations-Abschnitt des Programms muss mit einer initialen Inkubation von 15 min bei 95 °C beginnen, um die HotStarTaq DNA Polymerase zu aktivieren. Für neue Zielsequenzen oder Primerpaare müssen Annealingtemperaturen und Zykluszeiten angepasst werden, um maximale Spezifität und Ausbeute zu erzielen.

7. Starten Sie das RT-PCR-Programm, während die PCR-Reaktionsgefäße noch auf Eis stehen. Warten Sie, bis der Thermocycler 50 °C erreicht hat. Stellen Sie dann die PCR-Reaktionsgefäße in den Thermocycler.

QIAGEN OneStep RT-PCR


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Protokoll QIAGEN OneStep Protokoll für den QIAGEN OneStep RT-PCR Kit und Q-Solution

Dieses Protokoll ist für die Verwendung von Q-Solution in der One-Step-RT-PCR vorgesehen. Q-Solution verändert das Schmelzverhalten von Nukleinsäuren und kann zur Optimierung von RT-PCR-Reaktionen eingesetzt werden, die unter Standardbedingungen keine zufrieden stellenden Ergebnisse liefern.

und Q-Solution Wichtige Hinweise vor Reaktionsbeginn

• Die im QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix enthaltene HotStarTaq DNA Polymerase benötigt eine initiale Aktivierung durch einen Inkubationsschritt von 15 min bei 95 °C (siehe Schritt 6 dieses Protokolls). Dieser Inkubationsschritt inaktiviert gleichzeitig die Reversen Transkriptasen. Beginnen Sie nicht eher mit dem Aktivierungsschritt, bevor die RT-Reaktion beendet ist.

• Setzen Sie alle Reaktionen auf Eis an.

• Stellen Sie sicher, dass der Thermocycler auf 50 °C vorgeheizt ist, bevor Sie die Proben hineinstellen.


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• Stellen Sie sicher, dass während der RNA-Präparation und beim Ansetzen der RT-PCR RNase-freie Bedingungen gegeben sind.und Q-Solution

Durchführung mit Q- Solution

1. Tauen Sie Template-RNA, Primerlösungen, dNTP-Mix, 5x QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer und RNase-freies Wasser auf; stellen Sie alle Reagenzien auf Eis.

Es ist wichtig, die Lösungen vor Gebrauch gründlich zu mischen, um lokale Konzentrationsunterschiede der Salze zu vermeiden.

2. Stellen Sie einen Master-Mix gemäß Tabelle 3 her.

Der Master-Mix enthält typischerweise alle für die RT-PCR benötigten Komponenten außer der Template-RNA. Das Volumen des Master-Mix sollte 10 % größer sein als die für alle Reaktionsansätze benötigte Menge.

QIAGEN

3. Mischen Sie den Master-Mix und pipettieren Sie entsprechende Volumina in PCR-Reaktionsgefäße.

Mischen Sie gründlich, aber vorsichtig, z. B. durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren des Master-Mix.

4. Geben Sie die Template-RNA (= 2 µg/Reaktion) in die PCR-Reaktionsgefäße, die den Master-Mix enthalten.

5. Wenn Sie einen Thermocycler mit beheizbarem Deckel benutzen, verwenden Sie kein Mineralöl und fahren Sie im Protokoll mit Schritt 6 fort. Ansonsten überschichten Sie den Ansatz mit ca. 50 µl Mineralöl.

6. Programmieren Sie den Thermocycler gemäß dem in Tabelle 4 wiedergegebenen Programm.

Das in Tabelle 4 wiedergegebene Programm ist ein typisches Thermocycler- Programm. Es beinhaltet Schritte sowohl für die Reverse Transkription als auch für die PCR. Der Amplifikations-Abschnitt des Programms muss mit einer initialen Inkubation von 15 min bei 95 °C beginnen, um die HotStarTaq DNA Polymerase zu aktivieren.


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7. Starten Sie das RT-PCR-Programm, während die PCR-Reaktionsgefäße noch auf Eis stehen. Warten Sie, bis der Thermocycler 50 °C erreicht hat. Stellen Sie dann die PCR-Reaktionsgefäße in den Thermocycler.

IAGEN OneStep RT-PCR und Q-Solution


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Elektrophoretische Auftrennung von DNA im Agarosegel

Elektrophorese

Die Auftrennung von DNA-Fragmenten erfolgt aufgrund ihrer Größe. In einem elektrischen Spannungsfeld wandert die negativ geladene DNA in Richtung der Anode. Die Agarose fungiert hierbei als “Molekularsieb”, indem sie je nach Konzentration in einem Gel eine gewisse Porengröße erzeugt. Große Fragmente werden stärker zurückgehalten als kleinere. In einem Bereich zwischen 0,1-60 kb kann so eine sehr effiziente Auftrennung erreicht werden. Die aufgetrennte DNA wird durch Ethidiumbromid (EtBr) sichtbar gemacht. Dies interkaliert in die DNA und erzeugt bei UV-Beleuchtung eine intensiv orange-gelbe Fluoreszenz. Die aufgetrennten Fragmente können dadurch als Banden erkannt gemacht werden, die nur 20-50 ng DNA enthalten.

Ethidiumbromid-Stammlösung 10 mg/ml (Vorsicht mutagen!)

Lösungen und Vorbereitung eines Agarosegels

Die Agarose wird in 1x TBE durch Aufkochen gelöst, mit EtBr (Endkonzentration: 0,5 µg/ml) versetzt und in einen abgedichteten Gelschlitten gegossen. Nach Verfestigung der Agarose wird der Kamm entfernt, das Gel in eine Elektrophoresekammer gegeben und mit 1x TBE bedeckt.

Elektrophoretische Auftrennung von DNA Fragmenten im Agarosegel

Die aufzutrennenden Proben, versetzt mit 10x Probenpuffer (Endkonz. 1x), werden in die Taschen gefüllt und mit 8 V/cm Elektrodenabstand aufgetrennt.

Mit Hilfe eines UV-Transilluminators werden die aufgetrennten Fragmente sichtbar gemacht und zur Dokumentation fotografiert.

Als Größenmarker dienen:

% Agarose effiziente Auftrennung % Agarose effiziente Auftrennung 0,3% 5-60 kb 0,9% 0,5-7 kb 0,6% 1-20 kb 1,5% 0,2-3 kb 0,7% 0,8-10 kb 2,0% 0,1-2 kb

λ-DNA verdaut mit : Eco RI und HindIII

“100 bp Leiter”

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